Фактор viii: биохимические взаимодействия

На правах рукописи

Саенко Евгений Львович ФАКТОР VIII: БИОХИМИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2012 1

Работа выполнена в Центре Теоретических Проблем Физико-Xимической Фармакологии РАН

Научный консультант:

Атауллаханов Фазоил Иноятович, доктор биологических наук, профессор, директор ЦТП ФХФ РАН

Официальные оппоненты:

Васильев Сергей Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий научно-клинической лабораторией клинической коагулологии, Гематологический научный центр МЗСР РФ Ягужинский Лев Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией структуры и функции биологических мембран, Научно исследовательский институт физико химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ Александр Максимович Дудченко, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией функциональной геномики и липидомики, ФГБУ Научно исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН Ведущее учреждение: ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится2012 г. в_часов_минут на заседании диссертационного совета Д208.135.02 по защите докторских диссертаций при ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра МЗСР РФ по адресу: г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

Автореферат разослан "" _ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Зыбунова Елена Евгеньевна кандидат медицинских наук Актуальность темы. Фактор VIII (FVIII) является критически важным белком системы свёртывания крови. Генетический дефицит или дефект фактора VIII является причиной гемофилии А, наиболее распространенного наследственного заболевания свёртывания крови, поражающего одного из мужчин. Болезнь сопровождается тяжелыми кровотечениями, нередко со смертельным исходом, и спонтанными кровоизлияниями в суставах [Plug et al.

2006]. Изучение молекулярных механизмов ключевых взаимодействий FVIII с компонентами системы свёртывания крови, несомненно, является фундаментальной задачей биохимии человека. В настоящей работе были исследованы молекулярные механизмы принципиально важных взаимодействий FVIII на разных стадиях его жизненного цикла. В частности, мы установили механизм взаимодействия FVIII c фактором фон Виллебранда (vWf), происходящего сразу же после секреции FVIII в кровоток и критически важного для выживания FVIII в циркуляции, механизмы активации FVIII тромбином и активированным фактором Х (FXa), а также механизмы протеолитической инактивации FVIII активированным протеином С (APC) и плазмином. Мы также впервые установили механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровотока, идентифицировали сайты и критически важные аминокислотные остатки FVIII и рецептора, участвующие во взаимодействии.

Главным способом лечения гемофилии А является заместительная терапия больных гемофилией А концентратами FVIII, приготовленными из плазмы крови доноров, или более безопасными и современными, но весьма дорогостоящими, рекомбинантными препаратами FVIII [Lee 2002]. Наиболее обещающим подходом для увеличения эффективности и доступности терапии гемофилии А является создание рекомбинантного полноразмерного FVIII со свойствами, улучшенными по сравнению с природным диким типом. Полученные нами фундаментальные данные о расположении функционально важных сайтов FVIII создают основу для модулирования ключевыx взаимодействий FVIII в направлении увеличения времени жизни в кровотоке, большей чувствительности FVIII к активации, большей стабильности активированной формы FVIII и её большей устойчивости к протеолитической инактивации. В свою очередь, модулирование ключевых биохимических взаимодействий FVIII перспективно для создания терапевтических препаратов FVIII нового поколения.

Цель работы. Изучить критически важные молекулярные механизмы, ответственные за поддержание уровня FVIII в кровотоке, его функциональную активность, инактивацию и клиренс из циркуляции.

Задачи исследования:

1. Установить молекулярные механизмы связывания FVIII c vWf и диссоциации этого комплекса в результате протеолитической активации.

2. Изучить молекулярные основы узнавания и протеолиза FVIII важнейшими физиологическими активаторами – тромбином и фактором Xa.

Определить механизмы протеолитической инактивации FVIII 3.

активированным протеином С и плазмином и регулирования этих процессов протеином S и vWf.

Установить важнейшие эпитопы связывания гемофилийных 4.

ингибиторных антител на молекуле FVIII и механизмы ингибирования функциональной активности FVIII.

5. Изучить молекулярный механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровообращения.

Научная новизна. Установлены молекулярные механизмы, взаимодействия FVIII с важнейшими физиологическими лигандами на различных стадиях его жизни – от секреции в кровоток до клиренса из циркуляции. Эти механизмы определяют поддержание уровня FVIII в кровотоке, его протеолитическую активацию, инактивацию и клиренс из циркуляции. В частности, были локализованы сайты FVIII, отвечающие за связывание FVIII с vWf, необходимое для защиты FVIII от протеолитической деградации, преждевременного связывания с фосфолипидами и клиренсными рецепторами. Изучение механизма активации FVIII, необходимого для диссоциации его комплекса с vWf, позволило установить молекулярные механизмы взаимодействия FVIII c двумя важнейшими протеазами-активаторами:

фактором Xa и тромбином. Были локализованы сайты связывания тромбина и FXa на молекуле FVIII и идентифицированы отдельные аминокислоты в этих сайтах, играющие ключевую роль в связывании.

В ходе изучения молекулярных механизмов инактивации FVIII нами было впервые показано, что протеин S, являющийся классическим кофактором активированного протеина С, способен ингибировать функциональную активность FVIII путём ингибирования связывания FVIII c активированным фактором IX (FIXa) в теназном комплексе. Эта способность протеина S определяется перекрыванием сайта связывания FIXa и идентифицированного нами сайта связывания протеина S на молекуле FVIII. Нами был открыт и ещё один механизм регулирования протеолитической инактивации FVIII, обусловленный прямой конкуренцией vWf и активированного протеина С (APC) за общий сайт связывания на молекуле FVIII.

Поскольку серьезным осложнением при заместительной терапии гемофилии А является образование антител, связывающих FVIII и ингибирующих его функциональную активность, мы установили важнейшие эпитопы связывания антител больных гемофилией A на молекуле FVIII и установили молекулярные механизмы инактивации FVIII этими антителами.

Одним из ограничений заместительной терапии при лечении гемофилии А является относительно короткое время полужизни FVIII. Мы изучили механизмы, отвечающие за регулирование уровня FVIII в кровотоке и определяющие клиренс FVIII из циркуляции. Открытие молекулярных основ этого метаболического пути FVIII позволило разработать концепцию создания рекомбинантного FVIII c улучшенными фармакокинетическими характеристиками для более эффективной терапии гемофилии А.

Научно-практическое значение. Главное направление лечения гемофилии А заместительная терапия, заключающаяся в периодическом введении дорогостоящих концентратов FVIII, которые получены либо из плазмы крови доноров, либо рекомбинантным путём. Поскольку в настоящее время наблюдается устойчивый сдвиг в сторону использования в клинике более безопасных рекомбинантных препаратов FVIII, стоимость которых выше препаратов FVIII из плазмы крови, возникает необходимость создания препаратов FVIII нового поколения с повышенной терапевтической эффективностью. Наши исследования, в ходе которых были впервые установлены молекулярные механизмы и важнейшие сайты FVIII, ответственные за его активацию, стабильность, инактивацию и клиренс из циркуляции, служат основой для создания FVIII, обладающего улучшенными терапевтическими свойствами. Такой FVIII необходим для улучшения качества и удешевления терапии больных гемофилией А.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Локaлизованы сайты FVIII, ответственные за связывание с vWf, и установлены механизмы образования комплекса FVIII c vWf, а также механизмы диссоциации комплекса при его активации и последующего связывания FVIII c фосфолипидом.

2. Локализованы сайты связывания FVIII, участвующие во взаимодействии с важнейшими активаторами – тромбином и активированным фактором X и установлены соответствующие молекулярные механизмы активации 3. Установлены новые механизмы, регулирующие инактивацию FVIIIa, такие как непротеолитический механизм инактивации протеином FVIIIа S, протеолитическая инактивация плазмином, а также прямое vWf-зависимое регулирование инактивации FVIII активированным протеином С.

4. Определены важнейшие эпитопы FVIII, связывающие различные классы ингибиторных антител больных гемофилией, и установлены механизмы инактивации FVIII этими антителами.

5. Установлен механизм клиренса FVIII из кровотока, опосредованный рецепторами семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, и установлены механизмы контроля уровня и активности FVIII четырьмя различными рецепторами этого семейства.

Апробация работы. Работа прошла апробацию 14 февраля 2012 г. на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Материалы диссертации доложены автором на следующих конференциях и съездах: XVIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Florence, Italy, June 6-12, 1997;

41st Annual Meeting of the American Society of Hematology, New Orleans, Louisiana, USA, December 3-7, 1999;

XVIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Washington, DC, USA, September 15-21, 1999;

International Congress on Thrombosis, Porto, Portugal, May 5-8, 2000;

XVIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis, Paris, France, July 6-12, 2001;

XXV International Congress of the World Federation of Hemophilia, Seville, Spain, May 19-24, 2002;

XXXV Nordic Conference on Coagulation, Reykjavik, Iceland, August 10-13, 2002;

XIX Congress of the International Society of Thrombosis and Haemosytasis, Birmingham, UK, July 12-18, 2003;

45th Annual Meeting of the American Society of Hematology, San Diego, CA, December 6-9, 2003;

Hemophilia 2004 World Congress, Bangkok, Thailand, October 17-21, 2004;

Fifth Bari Interantional Conference on Hemophilia and Allied Disorders, von Willebrand Factor and Platelet Glycoproteins, Pizzomunno, Vieste del Gargano, Italy, May 22-25, 2005;

XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, 5-13 August, 2005;

47th Annual Meeting of the American Society of Hematology, Atlanta, Georgia, USA, December 10-13, 2005;

State of the Art International Symposium on Pharmacokinetics of Factor Concentrates in Hemophilia, Toronto, Canada September 29-30, 2005;

36th Haemophilia Symposium, Hamburg, Germany, November 18-19, 2005;

XXth Hemophilia Forum, Telfs, Austria, 16-19 March, 2006.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 91 работа, в том числе статей в реферируемых научных изданиях и 31 работа в материалах конференций и съездов.

Личное участие автора в получении результатов. Автором полностью выполнены эксперименты по изучению взаимодействия FVIII c фактором фон Виллебранда, синтетическими фосфолипидами и тромбоцитами. Автором были проведены эксперименты по картированию эпитопов ингибиторных антител, выделенных из крови больных гемофилией А, установлению механизмов ингибирования активности FVIII этими антителами, а также по изучению влияния мутаций в молекуле FVIII на время полужизни активированной формы FVIII.

Сайты связывания тромбина, фактора Xa, плазмина, протеина C и S были установлены и охарактеризованы в ходе совместных исследований автора с группой учёных Медицинского Университета города Нара, Япония. В этих исследованиях автор провёл измерения кинетики ключевых белок-белковых взаимодействий в реальном времени методом плазмонового резонанса. В ходе изучения рецептор-опосредованного клиренса FVIII автор руководил группой сотрудников и разрабатывал дизайн всех экспериментов. Кроме того, на начальной стадии этих исследований автором были проведены ключевые эксперименты, показывающие, что гепато-рецептор (LRP) из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности связывает FVIII в очищенной системе и осуществляет его эндоцитоз и клиренс in vitro и in vivo.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырёх глав, 27 таблиц, 84 рисунков, выводов и библиографического указателя, включающего 346 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана важность исследуемой темы для понимания гемостаза и для лечения гемофилии А, сформулированы цели и задачи и дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. В этой главе описаны внешний и внутренний пути гемостаза и показано, почему отсутствие или дефект FVIII приводит к нарушению свёртываемости крови - гемофилии А. Проводится обзор методов лечения больных гемофилией А, главным из которых в настоящее время является заместительная терапия путём повторных внутривенных инъекций препаратов FVIII, полученных из плазмы крови или рекомбинантным путём.

Поскольку одним из наиболее серьёзных осложнений при заместительной терапии FVIII является образование ингибиторных антител к FVIII примерно у 30% больных гемофилией А, в главе 1 были рассмотрены иммунологические механизмы формирования ингибиторных антител к FVIII и подходы к лечению пациентов c ингибиторами FVIII.

Обсуждены основные аспекты биологии FVIII: структура FVIII и его связывание с vWf, активация FVIII и сборка теназного комплекса, значение центрального В домена FVIII для поддержания уровня и функциональной активности FVIII в плазме крови, стабильность активированного FVIII, непротеолитический и протеолитический механизмы инактивации теназного комплекса. Поскольку в настоящей работе была впервые установлена роль рецепторов из семейства LDL в регулировании уровня и активности FVIII кровообращении, нами проведён обзор семейства LDL рецепторов и их лигандов.

На Рис. 1 показана доменная структура нативного FVIII и его активированной формы, играющей ключевую роль в активации фактора X во внутреннем пути свёртывания крови.

NH2 COOH A2 B A3 C1 C A 1 372 740 1649 1689 2019 2173 Тромбин или FXa 1 372 1690, 1722 Me2+ + A2 A3 C1 C A 373 740 50 kDa 73 kDA Рис. 1. Структура FVIII и его активированной формы. FVIII, гликопротеин с молекулярной массой около 300 кДа, состоит из трёх гомологичных А доменов, двух гомологичных С доменов и уникального центрального В домена. Тяжелая цепь FVIII, состоящая из A1-A2-B доменов, и лёгкая цепь из A3-C1-C2 доменов соединены через ион металла. Для выполнения своей роли кофактора активированного фактора IXa, FVIII должен быть протеолитически активирован тромбином или активированным FX. Активированный FVIII является гетеротримером (A1/A2/A3 C1-C2), в котором А1 домен и активированнaя лёгкая цепь (А3-С1-С2) сохраняют прочную связь через ион металла, а димер A1/A3-C1-C2 удерживает А2 за счёт непрочных ионных взаимодействий.

Из Рис. 2 следует, что FVIII является ключевым компонентом свёртывания крови, так как по внутреннему пути, включающему активированный FVIII, FX активируется примерно в 50 раз эффективнее, чем по внешнему пути.

В главе 2 описаны материалы и методы работы, в том числе методы выделения белков из плазмы крови и из других источников, методы экспрессии и очистки рекомбинантных белков, методы исследования белок-белкового взаимодействия, локализации эпитопов антител, исследования кинетики реакций протеолитической активации FVIII, протеолитической и непротеолитической инактивации, кинетики эндоцитоза FVIII в клеточных моделях in vitro и in vivo в мышах.

Приводится описание очистки и характеризации фактора фон Виллебранда, приготовления и очистки его протеолитических фрагментов. Описана иммуноаффинная очистка FVIII и приготовление его важнейших субъединиц и фрагментов. Были использованы следующие важнейшие методы и экспериментальные процедуры: приготовление cинтетических пептидов (состоящих из последовательностей FVIII) с помощью пептидного синтезатора 9050 Milligen (Millipore, USA), изучение белок-белковых взаимодействий в реальном времени с помощью плазмонового биосенсора Biacore 3000 (Biacore, Sweden), приготовление фосфолипидных везикул, меченых биотином, и их иммобилизация на коммерческих чипах, покрытых биотином (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden), приготовление ангидро-тромбина и ангидро-FXa, представляющих собой каталитически неактивные производные тромбина и FXa.

Внешний путь, путь, Внутренний путь, путь, TF-зависимый комплекс Теназый комплекс TF VIIIa VIIa HCh X Xa TF X VIIIa IX LCh IXa IXa Va Xa HCh Xa в 50-раз 50 II Va эффективнее LCh Xa Протромбиназный комплекс Рис. 2. Роль внутренней теназы в кровесвёртывании. FX активируется примерно в 50 раз эффективнее по внутреннему пути теназным комплексом, состоящим из связанных на фосфолипиде активированного FIX и активированного FVIII, который является кофактором FIX и ускоряет реакцию активации FX примерно в 100 раз. В свою очередь, активированный FX в протромбиназном комплексе активирует протромбин в тромбин, являющийся ключевым ферментом свёртывания крови.

Описано получение рекомбинантных белков и их мутантов, использованных в работе. Рекомбинантный дикий тип А2 домена (wt-A2) и панель А2 мутантов были сконструированы и экспрессированы с помощью бакуловирусной системы.

Белок был экспрессирован в клетках насекомых (Sf9) и очищен с помощью иммуноаффинной хроматографии. Варианты С2 домена, содержащие амино терминальные, карбокси-терминальные и внутренние делеции экспрессировали в E.coli и работали с экстрактами клеточной среды.

Мутагенез FVIII проводили, используя экспрессионный вектор pMT2, содержащий ДНК FVIII. Мутированные и разрезанные по требуемым сайтам фрагменты были легированы в конструкцию FVIII c удалённым В доменом (BDD FVIII). Клетки обезьян COS-1 были трансфецированы плазмидами BDD-FVIII, BDD-Glu694Ile, ВDD-Arg698Leu, BDD-Arg698Trp, BDD-Arg531His, BDD-Ala284Glu, с помощью диэтил-аминоэтилдекстранового метода.

BDD-Ala289Leu Конструирование гибридных форм FVIII, содержащих свиные последовательности, производилось на базе ВDD-FVIII. Картирование эпитопов антител с помощью пептидных библиотек проводилось с помощью пептидного набора фаговых дисплеев Ph.D.-7 (New England Biolabs, USA), представляющего собой библиотеку случайных гептамеров.

Описано также получение четырёх использованных в работе рецепторов из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDL). Рецептор LRP был выделен из человеческой плаценты, растворимая форма человеческого VLDLR была получена с помощью дрозофильной экспрессионной системы (Invitrogen, USA) и иммуноаффинно очищена, мегалиновый рецептор (gp330) был выделен из бычьих почек, а растворимая форма рекомбинантного человеческого LDLR была любезно предоставлена доктором Мертенcом (Coagulation Laboratory, Amsterdam, Netherlands).

Расчёт кинетических параметров из кинетических кривых, полученных в реальном времени с помощью плазмонового биосенсора, проводился согласно одно- или двух- сайтовой модели связывания с помощью компьютерных программ Ligand, Sigmaplot 1.02, Sigmaplot 3.0 и Sigmaplot 8.0 (Systat Software, USA).

Глава 3 содержит результаты работы и их обсуждение.

3.1. Молекулярные основы взаимодействия FVIII c vWf и фосфолипидами.

3.1.1. Локализация центра связывания фактора фон Виллебранда на факторе VIII. Для поддержания нормального уровня фактора FVIII в кровотоке необходимо образование его комплекса с vWf, происходящее сразу после секреции FVIII в кровоток и предотвращающее связывание FVIII c фосфолипидами. В процессе коагуляции комплекс протеолитически активируется, FVIII диссоциирует с vWf и участвует в сборке теназного комплекса, активирующего фактор Х. К началу наших исследований сайты FVIII, вовлечённые в связывание с vWf, и механизм диссоциации FVIII c vWf после активации комплекса не были установлены. Мы показали, что экспрессированный нами рекомбинантный C домен FVIII (остатки 2170-2232) связывается с vWf. Поскольку синтетический пептид 2303-2332, задающий ранее локализованный фосфолипид-связывающий сайт С2 домена, в отличие от контрольных пептидов, ингибировал связывание FVIII c vWf (Рис. 3), мы заключили, что взаимоисключающее связывание FVIII c vWf и фосфолипидами обусловлено вовлеченностью аминокислотных остатков 2303-2332 С2 домена FVIII в оба этих процесса. Таким образом, мы впервые показали наличие сайта связывания vWf на молекуле FVIII и объяснили молекулярный механизм конкуренции фосфолипида и vWf.

Связывание FVIII (%) Пептид (мк) Рис. 3. Влияние синтетического пептида на связывание FVIII с vWf определенное методом ELISA. Возрастающие концентрации пептида были добавлены на этапе связывания FVIII с vWf. Связывание FVIII в присутствии пептида выражено как процент связывания в отсутствии пептида. Символы на рисунке соответствуют пептидам из следующих областей FVIII:, 2303-2332;

, случайный пептид из аминокислот 2303 2332;

, пептид 351-365, х, пептид 2218-2233.

3.1.2. Механизм ингибирующего действия vWf на связывание FVIII c фосфолипидами. Для определения минимальной структурной единицы vWf, способной блокировать связывание FVIII с фосфолипидами, мы приготовили минимальный протеолитический фрагмент vWf (остатки 1-272), способный связывать FVIII, и больший фрагмент vWf (остатки 1-1365).

Было обнаружено, что минимальный FVIII-связывающий фрагмент vWf (1 272) способен полностью предотвращать взаимодействие FVIII с фосфолипидными поверхностями. Хотя больший по размеру фрагмент vWf (остатки 1-1365) также обладает этой способностью, остатки vWf 273-1365, очевидно, не являются необходимыми для защитного действия. Мы также показали, что минимальный фрагмент узнает аминокислотную FVIII-связывающий vWf 1- последовательность С2 домена FVIII, вовлеченную в связывание фосфолипида.

Таким образом, vWf предотвращает взаимодействие FVIII с фосфолипидами в результате связывания сайта, образованного остатками 1-272 vWf, с фосфолипид связывающим сайтом 2303-2332 С2 домена FVIII.

3.1.3. Роль области 1649-1689 легкой цепи FVIII в формировании сайта связывания для vWf. Для выполнения своей роли кофактора активированного фактора IX в теназном комплексе, FVIII должен быть протеолитически активирован. При активации FVIII тромбином или активированным фактором X происходит удаление области 1649-1689 А3 домена FVIII, что приводит к резкому понижению аффинности FVIII по отношению к vWf, диссоциации комплекса FVIII с vWf и последующему связыванию активированного FVIII на фосфолипидной поверхности [Lollar et al. 1988]. Важность области 1649-1689 для связывания FVIII c vWf может быть объяснена либо тем, что эта область и сайт С2 домена находятся в непосредственной пространственной близости и вместе образуют высокоаффинный центр связывания для vWf, либо тем, что область 1649- необходима для поддержания оптимальной vWf-связывающей конформации сайта в С2 домене FVIII. Для того, чтобы определить истинный механизм взаимодействия FVIII с vWf, мы приготовили протеолитические фрагменты лёгкой цепи FVIII, позволившие разделить индивидуальные вклады области 1649 1689 и С2 домена в связывание FVIII с vWf. С помощью V8 протеазы из S. Аureus был приготовлен протеолитический фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1672-1794 А3 домена, и фрагмент, состоящий из остатков 1795-2332 и включающий в себя часть А3 домена и полностью С1 и С2 домены.

Фрагмент 1672-1794 связывается с vWf, хотя и с существенно более низкой аффинностью, чем FVIII. Удаление области 1672-1689 путем обработки фрагмента тромбином приводит к полной потере связывания этого фрагмента с vWf, что доказывает участие области 1672-1689 FVIII в связывании с vWf. Фрагмент 1795 2332 также связывается с vWf c низкой аффинностью, в то время как реассоциация фрагментов 1672-1794 и 1795-2232 восстанавливает аффинность полученного димера до аффинности FVIII. Исследование конформации C2 домена с помощью конформационно-чувствительного антитела, узнающего область 2170-2327 С домена FVIII, показало, что конформация С2 домена в этом фрагменте отличается от конформации С2 домена в FVIII. Эти данные позволяют предположить, что область 1672-1689 не только напрямую участвует в связывании vWf, но и требуется для поддержания оптимальной vWf-связывающей конформации сайта в С2 домене, так как только в присутствии N-концевого фрагмента 1672-1794, фрагмент 1695-2332, содержащий С2 сайт, был способен связываться с vWf с максимальной аффинностью. Мы также показали, что конформационные изменения в С2 домене, происходящие при протеолитической активации FVIII, приводят к потере оптимальной конформации vWf-связывающего сайта в С домене и снижению аффинности активированного FVIII по отношению к vWf более чем в 1000 раз.

3.1.4. Влияние активации FVIII на его взаимодействие с vWf и фосфолипидами. Поскольку после активации FVIII связывается на фосфолипиде, мы изучили влияние конформационных изменений в С2 домене на аффинность FVIII по отношению к фосфолипидам. Поскольку С2 домен претерпевает конформационные изменения при удалении области 1649-1689, мы использовали производную FVIII, не содержащую эту область. Нами было обнаружено, что аффинность производной FVIII по отношению к синтетическим фосфолипидным везикулам и к активированным тромбоцитам примерно в 10 раз выше по сравнению с нативным FVIII. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что удаление области 1649-1689 лёгкой цепи FVIII приводит к конформационным изменениям в С2 домене, выражающимся не только более чем в 1000-кратном уменьшении аффинности по отношению к vWf, но и в 10-кратном увеличении аффинности FVIII к фосфолипиду.

Мы показали, что увеличение аффинности FVIII к фосфолипиду при активации тромбином связано с конформационными изменениями в С2 домене.

Нами была использована уникальная способность моноклонального антитела ESH фиксировать конформацию С2 домена. Как показано на Рис. 4, ранее установленный эпитоп ESH8 не является непрерывным и состоит из двух участков С2 домена, остатков 2227-2241 и 2259-2279 [Villard et al. 2001].

Связывание моноклонального антитела ESH8 с этими разными, но пространственно близкими участками С2 домена выражается в уникальной способности этого антитела блокировать конформацию С2 домена и полностью предотвращать конформационные изменения С2, вызванные удалением активационного пептида 1649-1689 (Рис. 4). В то же время антитело ESH8 не влияет на взаимодействие FVIII с vWf и фосфолипидом.

Мы установили, что когда конформация FVIIIа была зафиксирована антителом ESH8, его связывание с фосфолипидом характеризовалось аффинностью близкой к аффинности неактивированного FVIII. В то же время, аффинность активированного FVIII по отношению к фосфолипиду в отсутствие антитела ESH была в 10 раз выше, чем интактного FVIII. Таким образом, конформационные изменения, происходящие в С2 домене при активации FVIII ведут к уменьшению его аффинности по отношению к vWf на три порядка и к увеличению сродства к фосфолипиду на один порядок.

3.2. Молекулярные основы взаимодействия FVIII с физиологическими активаторами – тромбином и активированным фактором X.

3.2.1. Локализация сайтов связывания тромбина, ответственных за активацию фактора VIII. Активация FVIII тромбином является важнейшим механизмом регулирования внутреннего пути свертывания крови. При протеолизе, катализируемом тромбином, по остаткам Arg740, Arg372 и Arg1689 FVIII превращается в активную форму (FVIIIа) [Eaton et al. 1986]. Сайты связывания тромбина, ответственные за два важнейших места расщепления на молекуле FVIII по остаткам Arg372 и Arg1689, не были прежде известны. Как было показано в разделе 3.1, протеолиз FVIII по Arg1689 приводит к быстрой диссоциации FVIII из его комплекса с vWf и последующему связыванию с фосфолипидом. Мы установили, что С2 домен FVIII содержит сайт связывания тромбина, ответственный за протеолиз по Arg1689. Исходной точкой в исследовании послужило наблюдение, что антитело, узнающее С2 домен FVIII, подавляет тромбин-катализируемый протеолиз FVIII по Arg1689.

PL C1 C A3 C C2 A Thrombin a a vWf vWf ESH8 ESH Thrombin a vWf vWf Рис. 4. Конформация С2 домена FVIII была зафиксирована антителом ESH8 с эпитопом, состоящим из остатков С2 домена 2231-2248 и 2269-2274. Это антитело препятствует изменению конформации С2 при удалении активационного пептида a3 (1649-1689), сохраняя vWf-связывающую конформацию С2. В отсутствии антитела ESH8 конформация С2 изменяется, что сопровождается уменьшением его аффинности к vWf и возрастанием аффинности к фосфолипиду (PL).

Для того чтобы исследовать взаимодействие между FVIII и тромбином, мы использовали тромбин с модифицированным активным центром (ангидро тромбин). Ангидро-тромбин был иммобилизован на пластике и последующее связывание фрагментов FVIII с ангидро-тромбином было детектировано с помощью ELISA. Было показано, что С2 и А2 домены связывались с ангидро тромбином. Эти данные означают, что тромбин имеет как минимум два сайта связывания на молекуле FVIII, один из которых расположен в С2 домене, а другой в А2 домене. Поскольку предотвращение связывания тромбина с С2 доменом не вело к уменьшению скорости расщепления по Arg372 в FVIII, мы заключили, что связывание тромбина на сайте С2 домена отвечает только за протеолиз по Arg1689.

Нами были предприняты попытки локализации сайта связывания тромбина в А2 домене, ответственного за протеолиз FVIII по Arg372. Было обнаружено, что моноклональное антитело 413 с эпитопом в области 484-509 блокирует связывание А2 домена с тромбином (Рис. 5). Это означает, что эпитоп антитела перекрывается с центром связывания тромбина. Мы также проверили способность синтетического пептида 484-509 ингибировать связывание А2 домена с ангидро тромбином. Как видно из Рис. 5, пептид 484-509 частично ингибировал связывание А2 домена с ангидро-тромбином.

Индивидуальные остатки области 484-509 А2 домена, играющие ключевую роль в связывании тромбина, были идентифицированы с помощью ряда рекомбинантных мутантов А2 домена, в которых положительно заряженные остатки были замещены на Ala. Пять мутантов А2 домена, в которых Arg484, Arg489, Arg490, His497 и Lys499 были заменены на Ala, связывали ангидро-тромбин с аффинностью в 2-5 раз ниже по сравнению с диким типом А2 домена.

(Б) Связанный А2 домен (%) на длине волны 492 нм Абсорбция Связанный А2 домен (%) Ангидротромбин (нМ) Моноклональное антитело 413 (нМ) Субъединица А2 (нМ) или пептид А2 (мкМ) Рис. 5. Измерение связывания А2 домена с иммобилизованным ангидро тромбином с помощью ELISA. На панели А показано связывание рекомбинантного дикого типа А2 домена с ангидро-тромбином. Расчётная кривая получена с помощью односайтовой модели связывания. Во вставке, ангидро-тромбин и дикий тип А домена (80 нМ) были инкубированы с иммобилизованным ангидротромбином.

Значение абсорбции, показывающее связывание А2 домена с ангидро-тромбином в отсутствии конкурентного белка, было принято за 100%. На панели Б показано ингибирование связывания А2 с иммобилизованным ангидро-тромбином моноклональным антителом 413 с эпитопом 484-509 (), А2 пептидом 484-509 (), или мутантным пептидом 484/489/490/497/499/Ala484-509().

3.2.2. Роль С2 домена в связывании FVIII с активированным фактором X. К моменту начала нашего исследования оставался открытым вопрос о локализации сайта связывания FXa на молекуле FVIII. Локализация сайта связывания FXa во многом аналогична вышеизложенной локализации сайтов связывания тромбина.

Используя моноклональное антитело с эпитопом среди остатков 2248-2285 С домена, нам удалось установить, что эта область критична для связывания FXa.

Более детальная локализация центра связывания среди аминокислот 2253-2270 С домена была проведена с использованием перекрывающихся синтетических пептидов из области 2248-2285 С2 домена. Мы показали, что локализованный нами центр связывания FXа ответственен за расщепление FVIII по Arg1689 или Arg1721, которые одинаково важны при активации FVIII активированным фактором X. Активация FVIII была подавлена в присутствии 100 мкМ пептида 2253-2270. В отличие от прежде разработанных антикоагулянтов, таких как антикоагулянтный пептид клеща и антистатин, которые ингибируют ферментативную активность FXа за счет связывания с его активным центром, механизм ингибирования пептидом 2253-2270 заключается в предотвращении связывания FXа с FVIII, которое необходимо для успешного катализа.

3.2.3. Ингибиторные антитела к FVIII, предотвращающие его активацию фактором Ха. Мы показали, что ингибирование связывания FVIII с FXa является механизмом подавления активности FVIII антителами-ингибиторами FVIII, присутствующими в крови больных гемофилией. Четыре ингибиторных антитела, ингибирующих активацию FVIII фактором Xa были получены из крови больных тяжелой формой гемофилии А. Эпитопы этих антител были локализованы в С терминальной области С2. Интересно, что ингибирование связывания FVIII с активатором, фактором Ха, являлось единственным ингибиторным механизмом для четырёх исследованных нами антител, так как они не ингибировали связывание FVIII с фосфолипидом и активацию FVIII другим физиологически важным активатором – тромбином.

3.2.4. Влияние мутаций, обнаруженных в FVIII при гемофилии А, на время жизни активированного FVIII. Малое время полужизни активированной гетеротримерной формы FVIII (A1/A2/A3-C1-C2) связано с быстрой спонтанной диссоциацией А2 субъединицы и димера A1/A3-C1-C2. Мы экспрессировали и охарактеризовали следующие точечные мутанты FVIII, встречающиеся у больных гемофилией А: Arg531His, Ala284Glu, Ser289Leu, Asp694Ile, Arg698Leu и Arg698Trp. С помощью разработанного нами анализа кинетики диссоциации А2 домена в реальном времени было оценено влияние мутаций на стабильность активированной формы FVIII. Время полужизни активированных форм мутантов FVIII было в 2- раз короче по сравнению с активированным диким типом FVIII. Поскольку, как показал анализ трёхмерной модели FVIII, все исследованные мутации расположены на границе соприкосновения A1 и A2 доменов, проведённое нами выявление аминокислот, имеющих критическое значение для стабильности активированного FVIII, создает условия для разработки терапевтического рекомбинантного FVIII, обладающего повышенной стабильностью за счёт увеличения энергии взаимодействия А2 и А1 доменов.

3.3. Молекулярные основы протеолитической инактивации FVIII. В этом разделе были описаны новые механизмы инактивации теназного комплекса активированным протеином C (APC) и протеином S, а также плазмином.

3.3.1. Защитное действие ингибиторных антител при инактивации FVIII активированным протеином С. Мы обнаружили, что антитела из крови трёх больных гемофилией А ингибируют связывание с APC и последующую инактивацию FVIIIa, катализируемую APC. Было показано, что эти антитела ингибируют взаимодействие FVIII c APC за счёт блокирования ранее локализованного сайта связывания APC (остатки 2009-2018 А3 домена FVIII).

Поскольку в присутствии антител комплекс FVIII c vWf диссоциирует, естественно предположить что область 2009-2018 вовлечена во взаимодействие с vWf. Мы также впервые показали присутствие комплексов FVIII c ингибиторными антителами у пациентов с гемофилией А. Присутствие таких комплексов обусловлено антителами, предотвращающими протеолитическую инактивацию FVIII активированным протеином С.

3.3.2. Защитное действие vWf при инактивации FVIII активированным протеином С. Мы предположили, что ингибирование антителами взаимодействия vWf с FVIII и ингибирование протеолиза FVIII катализируемого APC может объясняться перекрыванием сайтов связывания vWf и APC на FVIII. В этом случае vWf защищает FVIII от протеолиза катализируемого APC благодаря блокированию сайта связывания APC, ранее локализованного в А3 домене среди остатков 2009 2018. Для проверки этой гипотезы мы синтезировали перекрывающиеся пептиды 1996-2007, 2001-2011, 2005-2014, 2009-2018, 2013-2022 и 2018-2028 и изучили их влияние на связывание FVIII с иммобилизованными ангидро-APC и vWf. Было установлено, что пептиды 2009-2018 и 2013-2022 максимально ингибировали связывание FVIII c ангидро-APC и vWf, тогда как эффект остальных пептидов был слабее. Кроме того, кроличье антитело к пептиду 2009-2022 полностью ингибировало связывание FVIII с иммобилизованными ангидро-APC и vWf и APC катализируемую инактивацию FVIII. Таким образом, область 2009-2022 важна для связывания FVIII как с APC, так и с vWf. Мы заключили, что vWf способен защищать FVIII от APC, блокируя сайт связывания APC на молекуле FVIII.

3.3.3. Механизм ингибирования внутренней теназы протеином S, независимый от активированного протеина С. Протеин S служит кофактором для APС при протеолитической инактивации FVIIIa и FVa на фосфолипидных мембранах [Walker 1980]. Мы впервые показали, что протеин S связывается с FVIIIa и препятствует сборке теназного комплекса путём конкуренции с фактором IXa за связывание на FVIIIa.

Прямое доказательство взаимодействия FVIII c протеином S было получено при изучении связывания FVIII и его фрагментов с иммобилизованным протеином S. Мы показали, что высокоаффинные сайты связывания протеина S находятся на A2 и А3 доменах FVIII. Поскольку сайты связывания FIXa также находятся на A2 и А3 доменах FVIII, мы предположили, что протеин S может ингибировать связывание FIXa c FVIII за счёт конкурирования за общие сайты связывания. Было показано, что протеин S, действительно, конкурирует с FIXa за связывание на FVIIIa, так как каталитически неактивная производная FIXa (EGR-FIXa) полностью ингибирует связывание А2 и А3 доменов с иммобилизованным протеином S.

Поскольку сайт связывания FIXa был ранее локализован среди остатков 484-509 А домена FVIII, эти остатки могут быть важны и для связывания протеина S.

Экспериментальное подтверждение было получено нами при ингибировании связывания А2 домена FVIII c иммобилизованным протеином S моноклональным антителом с эпитопом 484-509 и синтетическим пептидом 484-509.

Перекрывающиеся синтетические пептиды из области 484-509 использовались для более детальной локализации сайта связывания протеина S. Поскольку укороченный пептид 484-497 ингибировал связывание А2 домена с протеином S почти так же эффективно, как пептид 484-509, мы заключили что остатки 484- наиболее важны для связывания протеина S. Нами было также показано, что рекомбинантные мутанты А2 домена Ser488Аla, Arg489Аla и Arg490Аla связываются с протеином S с аффинностью примерно в 4 раза ниже, чем дикий тип A2 домена или контрольный А2 мутант Tyr487Ala. Таким образом, три последовательных остатка Ser488, Arg489 и Arg490 наиболее важны для связывания протеина S на сайте 484-509 А2 домена FVIII.

3.3.4. Роль центрального В домена при инактивации FVIIIа активированным протеином С и активированным фактором X. Анализ данных, накопленных за время клинического применения с 1999 года укороченной версии рекомбинантного фактора FVIII, не содержащей центрального 120 кДа В домена, показал, что вероятность эпизодов кровотечения при использовании укороченного FVIII (BDD FVIII) в 2.5 раза выше в сравнении с полноразмерным FVIII (FL-FVIII) [Gruppo et al. 2003;

Gruppo et al. 2004]. Эти данные свидетельствуют, что В домен играет функционально важную роль в биохимии FVIII и, в частности, может влиять па протеолитическую устойчивость FVIII.

Как видно из Рис. 6, APC- и FXa-катализируемая инактивация BDD-FVIII протекает намного быстрее, чем рекомбинантного FL-FVIII и полноразмерного FVIII, выделенного из плазмы крови (PD-FVIII). Действительно, скорость инактивации BDD-FVIII в присутствии APC и FXa соответственно в 3 и 5 раз выше, чем FL-FVIII и PD-FVIII (Рис. 6, панели Б и В). В присутствии APC и его кофактора протеина S скорость инактивации BDD-FVIII в 2 раза выше, чем FL FVIII и PD-FVIII (Рис. 6, панель А). Таким образом, FVIII лишённый В домена инактивируется протеазами существенно быстрее, чем полноразмерный FVIII.

начального значения) начального значения) Б А начального значения) Активность (% от Активность (% от В Активность (% от Время (мин) Время (мин) Время (мин) Pис. 6. Кинетика инактивации FVIIIa выделенного из плазмы (), полноразмерного рекомбинантного FVIII () и рекомбинантного FVIII c удалённым В доменом ().

Инактивация проводилась АPC в присутствии протеина S (панель А), отдельно взятым APC (панель Б) и FXa (панель В). Остаточную активность FVIIIa определяли с помощью АPTT анализа.

3.3.5. Механизм инактивации FVIIIа плазмином. Плазмин является не только ключевым ферментом фибринолитической системы, но и напрямую инактивирует активированный FVIII [Nogami et al. 2007]. Скорость катализируемой плазмином инактивации FVIIIа в 12 и 4 раза выше, чем скорость инактивации FVIIIа, катализируемой FХа и АРС, соответственно. Плазмин инактивирует FVIIIа за счет тех же расщеплений молекулы по Arg336 и Lys36, что и FХа. В результате наших исследований мы локализовали сайты связывания плазмина на молекуле FVIIIа.

Поскольку FIХа и плазмин конкурируют за связывание с А2 доменом FVIIIа, мы предположили, что сайт связывания FIXa (остатки 484-509) может быть важен и для связывания плазмина. Блокирование связывания А2 домена с иммобилизованным ангидро-плазмином антителом, узнающим эпитоп 484-509, и синтетическими пептидами 479-504 и 484-509 показало, что область А2 домена, включающая остатки 479-509, действительно, представляет собой сайт связывания плазмина. Использование панели рекомбинантных аланиновых мутантов А домена позволило установить ключевую роль остатков Lys377, Lys466, Arg471 и особенно Arg484 в докинге плазмина на сайте 484-509 и значение этого докинга для инактивационного расщепления FVIIIа по остатку Arg336.

Ещё одно расщепление FVIIIа, катализируемое плазмином и приводящее к необратимой инактивации кофактора, происходит по остатку Lys36 в А1 домене лёгкой цепи FVIII. Поскольку протеолитические производные лёгкой цепи FVIII A3-C1-C2 и 1690A3-C1-C2 связывались с ангидро-плазмином с близкими аффинностями, тогда как аффинность 1722A3-C1-C2 была примерно в 3 раза ниже, мы заключили, что остатки 1690-1721 вовлечены в формирование центра связывания плазмина на лёгкой цепи молекулы FVIII. Учитывая, что плазмин связывается с кластерами положительно заряженных аминокислот, мы нашли такие кластеры в областях 1690-1705 (Lys1693 и Lys1694) и 1804-1818 (Lys1804, Lys1808, Lys1813 и Lys1818), синтезировали соответствующие пептиды и показали, что каждый из них в отдельности и, в особенности, их эквимолярная смесь ингибируют связывание с иммобилизованным ангидро-плазмином и A3-C1-C инактивационный протеолиз FVIII по Lys. Таким образом, плазмин связывается с сайтом 484-509 тяжёлой цепи FVIII, отвечающим за расщепление по Arg336 и с сайтами 1690-1705 и 1804-1818 лёгкой цепи FVIII, отвечающими за протеолиз по Lys36.

3.4. Молекулярные основы инактивации FVIII ингибиторными антителами больных гемофилией: картирование эпитопов антител на молекуле FVIII и установление механизмов ингибирования активности FVIII.

Одним из наиболее серьёзных осложнений заместительной терапии гемофилии А является образование ингибиторных антител к FVIII примерно у 30% больных гемофилией A. Ингибиторные антитела блокируют важнейшие сайты FVIII, вовлечённые во взаимодействие с vWf, активаторами, FIXa, фосфолипидом и делают кровоточивость невосприимчивой к введениям FVIII, что в свою очередь усиливает тяжесть заболевания, уменьшает продолжительность жизни и является основной причиной смерти таких больных.

Антитела, вырабатывающиеся к FVIII у больных гемофилией А, имеют поликлональную природу и узнают эпитопы в различных доменах FVIII. Мы исследовали распределение эпитопов антител, выделенных из плазмы больных гемофилией А. В этом исследовании было использовано 23 плазмы больных гемофилией, которых лечили концентратами FVIII, приготовленными из плазмы крови, и плазмы 11 пациентов, которых лечили рекомбинантными препаратами FVIII.

Мы показали, что все ингибиторные плазмы содержат антитела, нейтрализуемые А2 доменом и лёгкой цепью FVIII (домены A3-C1-C2). Во многих случаях, степени нейтрализации плазм легкой цепью (А3-С1-С2) и рекомбинантным С2 доменом сравнимы между собой, что свидетельствуют о том, что основная популяция ингибиторных антител узнаёт эпитопы в А2 и С2 доменах, но не в А3 и С1 доменах. Данные иммунопреципитации с использованием А2 и С доменов также показали присутствие соответствующего кросс-реактивного материала во всех исследованных плазмах. Мы заключили, что иммунный ответ при лечении тяжёлых форм гемофилии A имеет сложный характер и выражается в вырабатывании поликлональных антител к А2 и С2 доменам.

Первое систематическое картирование эпитопов антител в С2 домене проводилось нами с использованием перекрывающихся фрагментов FVIII экспрессированных в E.coli. Мы сконструировали плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность лёгкой цепи FVIII 1974-2332, включающую 47 С-терминальных остатков А3 домена, С1 и С2 домены. На основе этой плазмиды были сконструированы 20 делеционных мутантов, в которых прогрессивно удалялись остатки N-терминальной области (остатки 2179-2293) и С терминальной области (остатки 2279-2232) С2 домена. Детекция связывания ингибиторов с этими фрагментами производилась с помощью иммуноблота. Было показано, что общая часть эпитопов ингибиторов включает аминокислоты 2248 2312 С2 домена. Поскольку эпитопы ингибиторов перекрываются с ранее локализованным сайтом связывания фосфолипидов 2303-2332 и vWf, ингибирование связывания FVIII c этими двумя важнейшими лигандами является общим свойством ингибиторных антител, узнающих С2 домен.

Вышеописанные методы детального картирования эпитопов ингибиторных антител с использованием рекомбинантных фрагментов FVIII, экспрессированных в E.coli, имели тот существенный недостаток, что конформация использованных рекомбинантных пептидов может отличаться от нативной и потому давать ошибочное представление о положении эпитопа. Более передовая стратегия картирования эпитопов основана на тестировании действия ингибиторных антител на функционально-активные гибриды FVIII, полученные путём комбинации генов человека и свиньи. Эта стратегия использует тот факт, что человеческие ингибиторы практически не реагируют со свиным FVIII.

Минимально необходимая замена аминокислотной последовательности в человеческом FVIII на гомологичную последовательность свиного FVIII, которая полностью предотвращает взаимодействие гибридной молекулы с данным ингибитором, позволяет идентифицировать остатки, формирующие эпитоп ингибиторного антитела. Этот метод был применён нами для картирования эпитопа ингибиторных антител в А2 домене. Было экспрессировано 13 полностью активных молекул FVIII cо свиными вставками в А2 домене.

На Рис. 7 показано ингибирование рекомбинантного человеческого FVIII и четырёх человеческо-свиных гибридов ингибиторными антителами четырёх больных гемофилией (SC, JM, NS и RC) и моноклональным антителом 413, узнающим А2 домен.

Остаточная активность Рис. 7. Ингибирование человеческого (%) FVIII и гибридного человеческо-свиного FVIII ингибиторными антителами с эпитопами в А2 домене. SC, JM, NS и RC – ингибиторные антитела четырёх больных гемофилией A, а Mab413 – Антитело (нг/мл) Aнтитело (нг/мл) моноклональное мышиное антитело, Остаточная активность узнающее А2 домен. Остаточная коагуляционная активность FVIII после инкубирования с указанным антителом определялась в Бетезда анализе. На (%) графиках показана остаточная активность FVIII в зависимости от концентрации антитела. Использовался человеческий рекомбинантный FVIII () и гибридные варианты FVIII содержащего следующие Антитело (нг/мл) Антитело (нг/мл) свиные вставки в А2 домене: 387-468 (), 484-509 (), 489-508 (), 484-488 ().

Остаточная активность (%) Антитело (нг/мл) Как видно из Рис. 7, дикий тип FVIII и гибрид со свиной вставкой 367- одинаково ингибируются всеми антителами. Ингибирование гибридов со свиными вставками 484-508, 489-508 и 484-488 было менее 50% при самой высокой использованной концентрации антител. Это означает, что все антитела узнают сходный эпитоп на А2 домене, минимально соответствующий замещению на свиные остатки 484-488.

Впоследствии было показано, что этот класс ингибиторов инактивирует FVIIIа путём непосредственного блокирования взаимодействия остатков 484- А2 домена с протеазным доменом FIXa, что дестабилизирует FVIIIa в теназном комплексе и уменьшает его кофакторную активность [Fay et al. 1999].

Существует ещё один, более современный метод картирования эпитопов антител, основанный на использовании библиотек случайных пептидов. Этот метод позволяет картировать сайт связывания антитела на молекуле FVIII путём быстрого скринирования связывания изучаемым антителом более чем случайных пептидов. Мы применили стратегию использования случайных пептидных библиотек фаговых дисплеев для картирования эпитопов ингибиторных антител. Результаты проведённого нами картирования эпитопов ингибиторных антител с использованием всех вышеописанных методов суммированы на Рис. 8.

Тяжёлая цепь Лёгкая цепь Тромбин, FXa Тромбин, A1 A2 C1 C B A a a1 a 1 NH2 COOH vWf FIXa vWf, PL vWf, PL 1649- 1649 484- 484- 2303- 2303 2181- 2181 Диссоциация FIXa 1811- 1811- vWf (2248-2285) 2248- 2285) Сайт связывания FXa (2253-2270) 2253-2270) Рис. 8. Важнейшие обнаруженные нами эпитопы FVIII, блокируемые ингибиторными антителами. Показаны доменная структура FVIII и сайты активации тромбином и FXa (372, 740 и 1689). В A2 домене тяжёлой цепи FVIII антитела блокируют сайт связывания FIXa (остатки 484-508). В лёгкой цепи антитела блокируют сайт 1818-1818 в А3 домене, участвующий в связывании активированного FIX (FIXa) и сайты в С2 домене, участвующие в связывании фосфолипида (PL), vWf и активированного FX (FXa). Блокирование сайта 2248-2285 препятствует конформационному изменению в С2 домене, происходящему при активации FVIII, и вследствие чего антитела узнающие этот сайт препятствуют диссоциации комплекса FVIII/vWf.

3.5. Молекулярные механизмы рецептор-опосредованного клиренса FVIII из циркуляции и регулирования активности FVIII.

3.5.1. Идентификация рецептора, ответственного за клиренс FVIII. К началу наших исследований наименее изученным процессом жизненного цикла FVIII был, несомненно, клиренс. Мы предположили, что комплекс FVIII c vWf выводится из плазмы крови клиренсным рецептором, и показали, что таким рецептором является рецептор белка, ассоциированного с липопротеинами низкой плотности (LRP). Ранее было показано, что LRP-опосредованный клиренс является механизмом удаления из кровотока ряда белков, принимающих участие в коагуляции и фибринолизе. Уникальное место среди лигандов LRP занимает 39 кДа рецептор-ассоциированный белок (RAP), который связывается с LRP с высокой аффинностью и ингибирует связывание всех известных лигандов LRP.

LRP входит в семейство эндоцитозных рецепторов липопротеинов низкой плотности, включающее у человека также рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR), рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR), гликопротеин 330 или мегалиновый рецептор (gp330/megalin) и рецептор аполипопротеина E (ApoER2). LRP экспрессирован в высокой концентрации на гепатоцитах печени.

Остатки Радиоактивность, остающаяся в плазме (%) Время, мин.

Рис. 9. Влияние RAP на клиренс 125I-FVIII (нижняя панель) из плазмы мыши. Мышам вводили образцы, содержащие 125I-FVIII (15 нМ) и vWf (750 нМ) в отсутствии RAP () или в присутствии RAP в концентрациях 50 мкМ (), 150 мкМ () и 250 мкМ () в общем объёме мкл. Клиренс 125I-FVIII при каждой концентрации RAP изучался в 4 мышах. За 100% принималось количество 125I-FVIII в кровотоке через 1 мин после инъекции. Кривые получены согласно биэкспоненциальной модели клиренса. Отклонения экспериментальных измерений от расчётной кривой клиренса показаны в верхней панели для экспериментов проведённых в отсутствии RAP () или в присутствии 250 мкМ RAP ().

Ключевым экспериментом, доказывающим роль LRP (одного или в сочетании с другим RAP-зависимым клиренсным рецептором из семейства LDL), явился эксперимент, проведённый нами in vivo (Рис. 9). В этом эксперименте в каждую мышь внутривенно вводили 125I-FVIII в комплексе с vWf в присутствии или в отсутствии RAP.

Как видно из Рис. 9, при концентрации RAP 150 мкМ или выше наблюдалось максимальное 3.3-кратное пролонгирование времени полувыведения 125I-FVIII.

Кроме того, в отсутствие RAP большая часть радиоактивности была найдена в печени, а не в почках, что хорошо согласуется с высокой экспрессией LRP в гепатических тканях. В дальнейших экспериментах, используя антитело с эпитопом среди остатков 484-509 А2 домена и синтетический пептид 484-509, было установлено, что область 484-509 А2 домена FVIII является сайтом связывания LRP. Этот участок А2 домена FVIII содержит 6 положительно заряженных аминокислотных остатков: Lys493, Lys496, Lys499, Arg484, Arg489 и Arg490.

3.5.2. Выявление аминокислотных остатков А2 домена FVIII, формирующих центр связывания для LRP. Поскольку ранее было показано, что положительно заряженные остатки других лигандов играют ключевую роль во взаимодействии с LRP, мы провели аланиновый сканирующий мутагенез остатков области 484— и прилежащих областей, расположенных на поверхности A2 домена. Мы генерировали в бакуловирусной системе ряд аланиновых мутантов А2 домена и измерили их взаимодействие с LRP. Наши исследования показали, что аминокислотные остатки Lys, Arg, Arg, Ser488, Arg489, Arg490, His497 и Lys 466 471 критичны для формирования сайта связывания LRP на молекуле FVIII.

Эти данные были подтверждены in vivo. Мы сравнили клиренс 125I-меченого A2, двойного мутанта A2 Arg471Ala/Arg484Ala, аффинность которого к LRP была наиболее низкой, и контрольного двойного мутанта Lys380Ala/Lys523Ala, чья аффинность к LRP не отличалась от А2 дикого типа. Время полужизни A2 мутанта Arg471Ala/Arg484Ala (30±7 мин) в мышах было примерно в 2 раза больше, чем время полужизни контрольного мутанта Lys380Ala/Lys523Ala (18±4 мин), практически не отличающееся от времени полужизни А2 дикого типа. Эти данные подтверждают значение остатков Arg471 и Arg484 для клиренса FVIII.

Наши данные позволяют предположить, что мутации Arg484Ala, Ser488Ala, Arg489Ala, Arg490Ala и His497Ala, уменьшающие аффинность LRP сайта в А2 домене и при этом не влияющие, как мы показали, на кофакторную активность FVIIIa, перспективны для введения в молекулу рекомбинантного FVIII с целью продления его полужизни в циркуляции.

3.5.3. Локализация областей LRP рецептора, участвующих в связывании с А2 доменом FVIII. Для того, чтобы определить область LRP, содержащую сайт связывания А2, мы изучили влияние фрагментов LRP на связывание 125I-A2 с иммобилизованным LRP методом конкурентного анализа. Используя отдельные кластеры LRP и перекрывающиеся триплеты, составляющих эти кластеры комплемент-повторов (СR), показанные на Рис. 10, мы установили, что сайт связывания A2 находится среди комплемент-повторов 3-8 и 23-29 кластеров II и IV LRP рецептора, соответственно.

Использование мутантов А2 привело к более детальному пониманию механизма связывания FVIII, позволив идентифицировать комплемент повторы, вносящие основной вклад в связывание с остатками А2 (Lys466, Arg471, Arg484 и Arg489) играющими ключевую роль во взаимодейcтвии с LRP. Так например, мы показали, что триплеты CR 23-25 и СR 27-29 играют ключевую роль во взаимодействии с остатками Lys466 и Arg471 A2 домена, а триплет 7-9 вносит важный вклад во взаимодействие с остатками Arg484 и Arg489 A2 домена.

Функциональное значение областей LRP, ответственных за связывание A домена, было подтверждено клиренсными экспериментами in vivo, продемонстрировавшими способность ключевых триплетов CR удлинять время полужизни А2 домена в мыши примерно в два раза. Это наблюдение может являться исходной точкой для разработки препаратов, избирательно блокирующих область LRP, участвующую в клиренсе FVIII, и значительно пролонгирующих жизнь этого дорогостоящего лекарственного препарата в крови больных гемофилией А.

Молекула LRP: Гепатическая клеточная мембрана Экспрессированные фрагменты Рис. 10. Схематическое представление LRP, кластеров II, III и IV и перекрывающихся триплетов комплемент-повторов (CR) из кластеров II и IV. LRP кластеры и триплеты CR были получены в бакуловирусной экспрессионной системе. Анализ очищенных кластеров II, III и IV и триплетов был проведён в градиентном геле 4-12% с последующей окраской Кумаcси. Номера полос на геле соответствуют номерам фрагментов (1-12), показанных на схеме.

3.5.4. Роль гепаран-сульфат протеогликанов в LRP-опосредованном катаболизме FVIII. Эндоцитоз многих лигандов LRP рецептора происходит с участием гепаран-сульфат протеогликанов (HSPGs), одного из компонентов формирующих внешнеклеточный матрикс. В большинстве случаев HSPGs могут также функционировать как независимые от LRP эндоцитозные рецепторы. Все лиганды LRP, взаимодействующие с HSPGs, связывают гепарин. Поскольку FVIII также является гепарин-связывающим белком, мы предположили, что HSPGs участвует в клиренсе FVIII.

Мы провели исследования клиренса FVIII в мышах в присутствии протамина, блокирующего участие HSPGs в клиренсе. Клиренсные кривые были описаны с помощью биэкспоненциальной модели, предполагающей наличие быстрой и медленной компонент клиренса FVIII. Мы уcтановили, что при насыщающей концентрации RAP, блокирующего LRP, быстрая фаза клиренса была полностью подавлена, что приводило к пролонгированию времени полужизни FVIII в 3.5 раза. Введение протамина, блокирующего HSPGs, увеличивало время полужизни FVIII в 1.6 раза, уменьшая скорости как быстрой, так и медленной фаз клиренса. Это наблюдение означает, что HSPGs участвует как в LRP опосредованном, так и в LRP-независимом пути клиренса FVIII. Примечательно, что одновременное введение RAP и протамина приводило к 5.5-кратному продлению времени полужизни FVIII, указывая на одновременное участие LRP и HSPGs в клиренсе FVIII.

Рециркулирование LRP рецепторов Клатриновая капсула LRP-независимый LRP-зависимый путь путь Рис. 11. Молекулярная модель эндоцитоза FVIII. Начальное связывание комплекса FVIII/vWf происходит за счёт взаимодействия с HSPGs, после чего происходит LRP-опосредованный эндоцитоз через клатриновые капсулы или HSPGs-зависимый эндоцитоз. Поскольку vWf не подвергается эндоцитозу, мы предположили, что комплекс FVIII/vWf диссоциирует прежде, чем FVIII попадает в эндосомы.

Впоследствии нам удалось локализовать сайт связывания HSPGs на FVIII среди аминокислотных остатков 558-565 А2 домена, причём оказалось, что HSPGs связывающий сайт не перекрывается с LRP-cвязывающим сайтом (484-509) А домена. Поскольку клиренсные эксперименты показали, что одновременное подавление LRP- и HSPGs-зависимых компонент клиренса FVIII приводит к существенному продлению времени полужизни FVIII, одновременное введение мутаций в LRP и HSPGs может быть перспективно для создания рекомбинантного FVIII нового поколения с пролонгированным терапевтическим действием.

Мы заключили, что клиренс FVIII происходит как по LRP-зависимому, так и частично по HSPGs-независимому пути (Рис. 11). Поскольку, как мы показали на LRP-экспрессирующих клетках печени, vWf не подвергается LRP опосредованному эндоцитозу, мы предположили, что комплекс FVIII-vWf диссоциирует перед вхождением FVIII в эндосомы (Рис. 11).

3.5.5. Регулирование активности внутренней теназы VLDL рецептором. В то время как LRP экспрессирован в больших количествах в печени, что хорошо сочетается с его ролью гепатического клиренсного рецептора для FVIII, структурно родственный рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR) не присутствует в печени, но в больших количествах экспрессирован в сердце и скелетных мышцах, на эндотелиальных клетках капиллярных кровеносных сосудов, а также на макрофагах внутри артерий человека. Используя растворимый рекомбинантный эктодомен VLDLR мы показали, что FVIII связывается с VLDLR и что сайты связывания VLDLR и LRP рецепторов на молекуле FVIII перекрываются. Мы также показали, что возможная функциональная роль VLDLR заключается в регулировании активности внутренней теназы.

В начальных экспериментах мы показали, что лёгкая цепь FVIII состоящая из А3, С1 и С2 доменов связывается с VLDLR с аффинностью близкой к FVIII.

Рекомбинантный фрагмент антитела, узнающий эпитоп 1811-1818, полностью ингибировал связывание FVIII c иммобилизованным VLDLR.

В то время как лёгкая цепь FVIII (LCh) хорошо связывалась с VLDLR, экспонирование сайта связывания VLDLR на тяжёлой цепи (HCh), состоящей из доменов А1 и А2 доменов, происходило только после активации FVIII тромбином, протеолизующим тяжёлую цепь по остаткам 373 и 740. Близкие значения аффинностей, определённые для тромбин-активированной тяжёлой цепи и для А домена, а также отсутствие связывания VLDLR с А1 доменом позволяют предположить, что взаимодействие активированной тяжёлой цепи c VLDLR полностью определяется сайтом находящимся в А2 домене. Мы обнаружили, что сайт связывания VLDLR в А2 домене перекрывается или совпадает с сайтом связывания LRP (остатки 484-509). Таким образом, один сайт связывания VLDLR расположен в области 1811-1818, а второй сайт связывания VLDLR расположен в среди остатков 484-509 А2 домена и экспонируется при активации FVIII.

Как было показано в работе других исследователей, VLDLR не участвует в клиренсе FVIII [Bovenschen et al. 2004]. Мы получили доказательства того, что функциональное значение взаимодействия FVIII c VLDLR может сводиться к регулированию активности внутренней теназы. Это заключение подтверждается, во-первых, тем, что растворимый фрагмент рецептора (sVLDLR) оказывает ингибиторное действие на генерирование FXa теназным комплексом, собранным на фосфолипидных везикулах (Рис. 12, панель а). Во-вторых, в экспериментах, проведённых в клеточной культуре, мы детектировали значительно более высокую активность теназы, собранной на диком типе клеток почек эмбриона человека (НЕК 293), которые не эспрессируют VLDLR, по сравнению с активностью теназы на НЕК 293, экспрессирующих VLDLR (Рис. 12, панели в и с).

Рис. 12. Влияние рецептора VLDLR на активность теназого комплекса. (A) FIXa (2 нМ) и FVIII (1 нМ) инкубировали с фосфолипидными везикулами и указанными концентрациями VLDLR в присутствии () или отсутствии 1 мкМ RAP ().

После активации FVIII тромбином, реакцию инициировали добавлением FX (200 нМ). (B) теназный комплекс был собран на монослое НЕК 293 клеток дикого типа () и трансфецированных Эксперименты были проведены в VLDLR ().

присутствии 1 мкМ RAP (, ) и в отсутствии RAP (,). Контрольный эксперимент (---) был проведён в отсутствии FVIII. (С) Скорости активации FX в отсутствии и присутствии RAP на диком типе НЕК 293 и на трансфецированных клетках. Данные взяты из панели В.

Мы предположили, что VLDLR регулирует активность внутренней теназы как путём уменьшения при помощи VLDLR-опосредованного эндоцитоза локальной концентрации FVIIIа на поверхности клетки, так и путём блокирования взаимодействия FVIIIa c FIXa в теназном комплексе.

Регуляторная роль VLDLR хорошо согласуется с экспрессией VLDLR на клетках, поддерживающих сборку внутренней теназы, таких как макрофаги, гладкомышечные клетки стенки сосуда и эндотелиальные клетки, образующие внутреннюю выстилку капиллярных сосудов [Multhaupt et al. 1996].

3.5.6. Молекулярные механизмы взаимодействия FVIII c другими рецепторами из семейства липопротеинов низкой плотностью. В предыдущих главах мы описали взаимодействие FVIII c LRP и VLDLR и охарактеризовали функциональное значение этих взаимодействий. Чтобы определить является ли связывание FVIII общим свойством рецепторов семейства LDL, мы исследовали взаимодействие FVIII c мегалином и рецептором липопротеинов низкой плотности (LDLR). Мы установили, что как и для VLDLR, активация FVIII тромбином является условием экспонирования высокоаффинного сайта для связывания мегалина и LDLR. Полное ингибирование связывания A2 домена с LRP, LDLR, VLDLR и мегалином антителом 413 (эпитоп 484-509) означает, что эта область А домена содержит последовательность, узнаваемую всеми четырьмя рецепторами.

Чтобы определить, какие остатки из области 484-509 ответственны за взаимодействие с рецепторами, мы изучили связывание панели 20 точечных мутантов рекомбинантного А2 домена и дикого типа А2 домена с иммобилизованными LDLR, VLDLR и мегалином. Тестирование связывания панели точечных мутантов A2 домена с LRP, LDLR, мегалином и VLDLR показало, что положительно заряженные аминокислотные остатки Lys466, Arg471, Arg489 и Arg490 и незаряженные гидрофобные остатки Tyr487 и Ser488 образуют общий рецептор-связывающий сайт А2 домена.

Интересно, что другие исследователи нашли функциональную роль LDLR в метаболизме FVIII. Было показано, что LDLR кооперирует с LRP в регулировании уровня FVIII в крови [Bovenschen et al. 2005]. Одновременное исключение LRP и LDLR вело к 4.2-кратному повышению уровня FVIII в крови, в то время как у генетически дефицитных мышей, у которых были исключены LDLR или LRP рецепторы в отдельности, обнаруживали лишь 1.6-кратное повышение уровня FVIII. Более того, среднее время полужизни FVIII в мыши с исключёнными LRP и LDLR было в 4.8 раз больше, чем в нормальной мыши и значительно выше, чем в мышах с отдельно исключёнными LRP и LDLR. Эти эксперименты позволили предположить, что LDLR наряду с LRP участвует в клиренсе FVIII. Данное утверждение вполне согласуется с высокой экспрессией этих рецепторов в гепатических тканях.

Возможны и другие механизмы, благодаря которым LDL рецепторы могут регулировать активность FVIII. Во внутренней теназе А2 домен ответственен за кофакторную функцию активированного FVIII, поскольку А2 модулирует протеолитический сайт FIXa, повышая энзиматическую активность FIXa примерно в 100 раз [Fay et al. 1998]. Высокая аффинность А2 домена, содержащего сайт связывания LDL рецепторов LRP, VLDLR, LDLR и мегалина, позволяет предположить, что эти рецепторы конкурируют с FIXa за связывание с FVIIIа.

Глава 4 содержит заключительные положения работы.

Целью данного исследования явилось установление молекулярных механизмов взаимодействия FVIII c физиологически важными лигандами на разных стадиях жизненного цикла.

Поскольку сразу после секреции в кровоток FVIII образует прочный нековалентный комплекс с vWf, необходимый для обеспечения нормального времени жизни FVIII в циркуляции, мы изучили механизм взаимодействия FVIII c vWf. Мы установили сайты FVIII, ответственные за связывание c vWf, и показали, что конформационные изменения, происходящие в лёгкой цепи FVIII при его активации приводят более чем к 1000-кратному понижению аффинности по отношению к vWf и 10-кратному повышению аффинности к фосфолипиду, что способствует диссоциации комплекса FVIII с vWf и связыванию активированного FVIII на фосфолипидной поверхности, необходимому для сборки теназного комплекса.

Установив механизм взаимодействия FVIII c vWf, мы перешли к изучению молекулярного механизма активации FVIII двумя важнейшими активаторами – тромбином и активированным FX. Нам удалось локализовать сайты связывания тромбина и активированного FX и отдельные аминокислотные остатки этих сайтов, наиболее существенные для взаимодействия. При изучении причин нестабильности активированного FVIII мы установили аминокислотные остатки принципиально важные для его устойчивости, что заложило основы для создания FVIII с повышенной устойчивостью к спонтанной инактивации. При изучении протеолитической инактивации FVIII плазмином, мы идентифицировали сайты связывания плазмина в А2 и А3 доменах FVIII и ключевые аминокислоты этих сайтов. Эти данные могут стать основой для создания FVIII, устойчивого к инактивации плазмином.

Одним из серьёзных осложнений при лечении гемофилии А является развитие ингибиторных антител к FVIII, наблюдаемое примерно у 30% больных. В ходе систематического картирования эпитопов антител несколькими независимыми методами мы установили, что важнейшие эпитопы антител расположены в А2 и С2 доменах FVIII. Знание этих эпитопов позволяет делать их менее узнаваемыми для ингибиторных антител путём мутирования ключевых аминокислот эпитопа, не влияющих на кофакторную активность FVIII. Так например, одновременная мутация Arg484, Arg489 и Pro494 из эпитопа А2 домена привела к существенному снижению чувствительности мутантного FVIII к инактивации антителами, не нарушая функциональной активности FVIII. Таким образом, локализация эпитопов ингибиторных антител и выявление ключевых аминокислот в эпитопе открывает возможность создавать рекомбинантный FVIII, с пониженной иммуногенностью, перспективный для терапии больных гемофилией А, осложнённой образованием ингибиторных антител.

Мы изучили ранее не исследованную фундаментальную проблему биологии FVIII – молекулярный механизм клиренса кофактора из циркуляции. Было установлено, что клиренс FVIII является рецептор-опосредованным процессом, происходящим при участии LRP и LDLR рецепторов из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности. Мы показали, что рецептор LRP, экспрессированный в высокой концентрации в печени и являющийся клиренсным рецептором для различных лигандов, участвует также в клиренсе FVIII. Наши коллеги из Нидерландов показали, что, помимо LRP, ещё один гепатический рецептор (LDLR) из семейства LDL рецепторов участвует в клиренсе FVIII. Роль LRP и LDLR была впоследствии подтверждена в генетически дефицитной мыши, у которой отсутствовали LRP и LDLR [Bovenschen et al. 2005]. В таких мышах среднее время полужизни FVIII было почти в 5 раз больше, чем в нормальной мыши. Один из сайтов FVIII, участвующий во взаимодействии с этими рецепторами, был локализован нами среди остатков 484-509 А2 домена. Методом точечного мутагенеза мы идентифицировали отдельные аминокислотные остатки в сайте 484-509 и вблизи от него, играющие ключевую роль в связывании FVIII c LRP и LDLR. Этими остатками явились Lys466, Arg471, Arg484, Ser488, Arg489 и Lys523.

Мы предположили, что мутирование остатков, не влияющих на функциональную активность FVIII, приведёт к значительному снижению аффинности мутантного FVIII по отношению к клиренсным рецепторам LRP и LDLR и вследствие этого к увеличению времени полужизни FVIII в кровотоке.

В заключение, наши данные могут служить основой для создания усовершенствованного рекомбинантного FVIII пролонгированного действия за счёт модулирования его взаимодействий с важнейшими физиологическими лигандами.

Выводы 1. Исследован механизм взаимодействия фактора VIII c фактором фон Виллебранда:

-установлена минимальная структурная единица vWf, способная стабилизировать FVIII и предотвращать его преждевременное связывание с фосфолипидом;

-локализованы два сайта FVIII, участвующие в связывании vWf, расположенные в N-терминальной и С-терминальной областях лёгкой цепи среди аминокислотных остатков 1672-1794 и 2170-2327, соответственно;

-показано, что при протеолитической активации лёгкой цепи FVIII происходит полная потеря связывания vWf с cайтом 1672-1795 и изменение конформации сайта 2170-2327, приводящее к резкому снижению его аффинности по отношению к vWf и увеличению аффинности к фосфолипиду.

2. Установлен молекулярный механизм активации FVIII двумя важнейшими физиологическими активаторами - тромбином и активированным фактором X:

-локализованы сайты связывания тромбина на молекуле FVIII, расположенные в С2 домене и среди остатков 484-509 А2 домена, отвечающие за катализируемый тромбином протеолиз FVIII по остаткам Arg1689 и Arg372, соответственно;

-установлен сайт связывания активированного фактора X, расположенный среди аминокислотных остатков 2253-2270 С2 домена лёгкой цепи FVIII;

-выявлены причины, определяющие короткое время полужизни активированного FVIII вследствие быстрой спонтанной диссоциации А2 домена;

-идентифицированы гемофилийные мутации Asn694Ile, Arg698Trp, Arg698Leu, Ala284Glu, Ala284Pro, Ser289Leu, Arg531His и охарактеризовано их влияние на стабильность активированной формы FVIII.

3. Изучен молекулярный механизм инактивации FVIII активированным протеином С и плазмином:

-установлен механизм защитного действия vWf на FVIII при протеолизе активированным протеином С, обусловленный конкуренцией vWf и APC за общий сайт связывания, локализованный среди аминокислот 2009-2022 в С2 домене FVIII;

-установлено, что APC-независимое ингибирование активности теназного комплекса протеином S обусловлено конкуренцией протеина S с FIXa за сайт 484 509 в А2 домене FVIII;

-показано, что центральный В домен FVIII ингибирует протеолитическую инактивацию FVIIIa активированным протеином С и FXа.

4. Установлены молекулярные механизмы инактивации FVIII ингибиторными антителами, вырабатывающимися у больных гемофилией А при заместительной терапии концентратами FVIII:

-обнаружено, что одной из причин, вызывающих образование антител является изменение конформации С2 домена FVIII при пастеризации концентрата FVIII;

картирование эпитопов ингибиторных антител больных -проведено гемофилией А и локализованы важнейшие эпитопы антител среди остатков 484 509 и 2248-2312 А2 и С2 доменов;

-установлены молекулярные механизмы ингибирования FVIII антителами, включающие ингибирование связывания FVIII c vWf, фосфолипидом, FIXa, а также с активаторами – тромбином и FXa;

-исследован протеолитический механизм инактивации FVIII антителами больных гемофилией А и установлены сайты FVIII, наиболее подверженные протеолизу.

5. Открыт механизм клиренса FVIII из кровотока и регуляции его функциональной активности в циркуляции рецепторами из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности:

-исследован молекулярный механизм взаимодействия FVIII с двумя рецепторами (LRP и LDLR) семейства рецепторов LDL, принимающими участие в клиренсе FVIII из кровотока;

-локализованы сайты FVIII, участвующие в связывании с этими рецепторами и отдельные аминокислотные остатки, играющие важную роль в этом взаимодействии;

-определён сайт LRP рецептора, участвующий в связывании FVIII;

-охарактеризован молекулярный механизм взаимодействия FVIII c мегалином и рецептором липопротеинов очень низкой плотности, принимающими участие в регуляции активности теназного комплекса.

Список сокращений и обозначений APC – активированный протеин С APTT – активированное частичное тромбопластиновое время BDD-FVIII – фактор FVIII, не содержащий В домена CR – лиганд-связывающие комплемент повторы, входящие в состав LRP рецептора и других рецепторов семейства LDL E.coli – кишечная палочка Escherichia coli EGR-FIXa – каталитически неактивная производная активированного фактора IX ELISA – метод иммуно-ферментного твердофазного анализа FV – коагуляционный фактор V FVa – активированный фактор V FVII – коагуляционный фактор VII FVIIa – активированный фактор VII FVIII – коагуляционный фактор VIII FVIIIa – активированный фактор VIII FIX – коагуляционный фактор IX FIXa – активированный фактор IX FX – коагуляционный фактор X FXa – активированный фактор X FL-FVIII – полноразмерный FVIII gp330 – рецептор семейства LDL, мегалин 293HEK – клетки почек человеческого эмбриона дикого типа HCh – тяжелая цепь FVIII HSPGs – гепаран сульфат протеогликаны IgG – иммуноглобулин G LCh – легкая цепь фактора FVIII LDL – липопротеины низкой плотности LDLR – рецептор липопротеинов низкой плотности LRP – рецептор белка, связанного с липопротеинами низкой плотности из семейства LDL PCR – полимеразная цепная реакция PD-FVIII – препараты FVIII, очищенные из плазмы PL – фосфолипид RAP – человеческий рекомбинантный рецептор ассоциированный белок, антагонист рецепторов семейства LDL sVLDLR – растворимый лиганд-связывающий фрагмент VLDLR VLDLR – рецептор липопротеинов очень низкой плотности vWf - фактор фон Виллебранда wt-A2 – рекомбинантный дикий тип А2 домена Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в реферируемых научных изданиях 1. Saenko, E.L., Shima, M., Rajalakshmi, K.J., Scandella, D. A role for the C domain of factor VIII in binding to von Willebrand factor. J. Biol. Chem., 269: 11601 11605 (1994).

2. Saenko, E.L., Scandella, D. A mechanism for inhibition of factor VIII binding to phospholipid by von Willebrand factor. J.Biol. Chem., 270: 13826-13833 (1995).

3. Scandella, D., Gilbert, G., Shima, M., Nakai, H., Eagleson, C., Felch, M., Prescott, R., Rajalakshmi, K, Hoyer, L.W., Saenko, E.L. Some factor VIII inhibitor antibodies recognize a common epitope corresponding to C2 domain amino acids 2248 2312 which overlap a phospholipid binding site. Blood, 86: 1811-1819 (1995).

4. Healey, J.F., Lubin, I.M., Nakai, H., Saenko, E.L., Hoyer, L.W., Scandella, D., Lollar, P. Residues 484-509 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the A2 domain of human factor VIII. J.Biol.Chem., 270: 14505-14509 (1995).

5. Saenko, E.L., Shima, M., Gilbert, G.E., and Scandella, D. Slowed release of thrombin cleaved factor VIII from von Willebrand factor by monoclonal and a human antibody is a novel mechanism for factor VIII inhibition. J.Biol.Chem., 271: 27424 27431 (1996).

6. Prescott, R., Nakai H., Saenko, E.L., Scharrer, I., Nilsson, I.M., Hurst, D., Bray, G., and Scandella, D. The inhibitor antibody response is more complex in hemophilia A patients that in most nonhemophiliacs with factor VIII autoantibodies. Blood, 89: 3663 3671 (1997).

7. Saenko, E.L., and Scandella, D. The acidic region of the factor VIII light chain and the C2 domain together form a high affinity binding site for von Willebrand factor.

J. Biol. Chem., 272: 18007-18014 (1997).

8. Zhong, D., Saenko, E.L., Shima, M., Felch, M., and Scandella, D. Some human inhibitor antibodies interfere with factor VIII binding to factor IX. Blood, 92: 136- (1998).

9. Saenko, E.L., Scandella D., Yakhyaev, A.V., and Greco, N. Activation of factor VIII by thrombin increases its affinity for binding to synthetic membranes and activated platelets. J. Biol. Chem., 273: 27918-27926 (1998).

10. Laub, R., Di Giambattista, M., Fondu, P., Branckmann, H.-H., Lenk, H., Saenko E.L., Felch, M., and Scandella, D. Inhibitors in German hemophilia A patients treated with a double virus inactivated Factor VIII concentrate bind to the C2 domain of FVIII light chain. Thromb. Haemost., 81: 39-44 (1999).

11. Pipe, S.W., Eickhorst, A.N., McKinley, S.H., Saenko, E.L. and Kaufman, R.J.

Mild hemophilia A caused by increased rate of factor VIII A2 subunit dissociation:

evidence for non-proteolytic inactivation of factor VIII in vivo. Blood, 93: 176- (1999).