Эпигенетические модификации генома в эмбриональном периоде онтогенеза человека
На правах рукописи
ЛЕБЕДЕВ Игорь Николаевич ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА 03.00.15 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Новосибирск 2008 Диссертация выполнена в лаборатории цитогенетики Государственного учреж дения Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского на учного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.
Научные консультанты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Пузырёв Валерий Павлович член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Назаренко Сергей Андреевич
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Воевода Михаил Иванович доктор биологических наук, профессор Рубцов Николай Борисович доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич
Ведущая организация: ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва
Защита диссертации состоится “ ” 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.
тел. (383)333-12-78, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и гене тики СО РАН.
Автореферат разослан “” _ 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук А.Д. Груздев 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Для нормального индивидуального развития и реализации генетической программы онтогенеза существенное значение имеет эпигенетиче ская регуляция активности генов, обеспечивающая установление и поддержание их дифференциальной экспрессии (Holliday, 1991;
Голубовский, 2000;
Li, 2002;
Jablonka, Lamb, 2005;
Чураев, 2006). Согласно современным представлениям, под эпигенетическими процессами понимают наследуемые, стабильные, но по тенциально обратимые изменения экспрессии генов, не связанные с нарушения ми их нуклеотидной последовательности (Russo et al., 1996;
Bird, 2002;
Ваню шин, 2006). Молекулярной основой эпигенетических феноменов являются кова лентные модификации структуры хроматина, представленные метилированием ДНК и модификациями гистоновых белков. Подобные изменения ответственны за осуществление таких генетических процессов как дифференциальная экспрес сия генов, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, репрессия мо бильных генетических элементов (Robertson, Wolfe, 2000;
Costello, Plass, 2001).
Нарушение этих процессов через повреждение эпигенетических механизмов приводит к аномалиям развития организма человека, проявляющимся в виде особого класса патологии, который предложено называть эпигенетическими бо лезнями (Beaudet, 2002). Примерами таких заболеваний являются болезни ге номного импринтинга (Hall, 1990;
Баранов, 1991;
Пузырёв, 1995;
Reik, Walter, 2001), хроматиновые болезни (Johnson, 2000;
Hendrich, Bickmore, 2001;
Назарен ко, 2004;
Santos-Rebouas, Pimentel, 2007). Значительным является вклад абер рантных эпигенетических модификаций генома в развитие злокачественных но вообразований (Feinberg et al., 2002;
Немцова, Залетаев, 2004;
Киселёва, Киселёв, 2005). Обсуждается роль эпигенетических нарушений и в этиологии мультифак ториальных заболеваний (Petronis, 2001;
Pembrey, 2002;
Whitelaw, 2006).
Интенсивно накапливающаяся информация о патогенетической значимости аберрантных эпигенетических модификаций обусловливает актуальность иссле дований, направленных на изучение молекулярных и онтогенетических меха низмов возникновения эпимутаций (Holliday, 1987, 1991;
Horsthemke, 2006). По казано, что особенностью ранних этапов онтогенеза млекопитающих является тотальное эпигенетическое репрограммирование генома, заключающееся в зако номерном чередовании волн деметилирования и реметилирования ДНК в поло вых клетках и на начальных стадиях развития зародыша (Li, 2002;
Dean et al., 2003;
Sasaki, Matsui, 2008). Эпигенетическое репрограммирование обеспечивает удаление аберрантных эпигенотипов, последовательную индукцию тотипотент ности и дифференциальной экспрессии генов. Нарушения этих процессов могут вести к формированию аберрантных эпигенотипов, обусловливающих установ ление и долговременное поддержание аномальных профилей генной экспрессии, приводящих к патологии развития организма (Dolinoy et al., 2007;
Gicquel et al., 2008). Однако до сих пор остается неустановленным вклад аномальных эпигене тических модификаций генома в нарушение эмбрионального периода онтогене за, который у человека характеризуется высокой частотой репродуктивных по терь – около 60% зигот элиминируется на пре- и ранних постимплантационных этапах развития, а 15-20% клинически распознаваемых беременностей спонтан но прерывается в течение первого триместра (Macklon et al., 2002). Доминирую щим фактором, обусловливающим раннюю остановку эмбрионального развития у человека, являются геномные мутации, представленные в основном числовыми нарушениями хромосом (Назаренко, 1993;
Griffin, 1996;
Hassold, Hunt, 2001;
Ба ранов, Кузнецова, 2007). Что касается внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, то генетические причины прекращения их развития остаются, как правило, неустановленными.
Одной из групп генов, в обеспечении функций которых существенная роль отводится эпигенетическим механизмам, являются импринтированные гены. Их моноаллельная экспрессия определяется родительским происхождением актив ного аллеля и связана с дифференциальным метилированием регуляторных по следовательностей, формирующимся строго специфичным образом в гаметоге незе (Reik, Walter, 2001;
Solter, 2006;
Trasler, 2006). Нарушение функций им принтированных генов, большинство из которых вовлечены в регуляцию диф ференцировки плацентарных и плодных тканей, рассматривается как весомый фактор нарушений внутриутробного развития млекопитающих (Tycko, 2006). В экспериментах на мышах было показано, что однородительские дисомии хромо сом (ОРД), содержащих импринтированные локусы, как правило, несовместимы с нормальным прохождением эмбрионального развития (Cattanach, Jones, 1994).
В то же время попытки найти ОРД у внутриутробно погибших эмбрионов чело века пока не увенчались заметным успехом (Fritz et al., 2001;
Kondo et al., 2004;
Tsukishiro et al., 2005). Учитывая эпигенетический характер регуляции экспрес сии импринтированных генов можно предположить, что ожидаемый негативный эффект нарушений их дозы в эмбриональном периоде онтогенеза человека будет связан не только с формированием ОРД, но и с эпимутациями – аномалиями дифференциального метилирования регуляторных областей. Для изучения раз нообразия и эффектов эпимутаций возникает необходимость в их систематиза ции, учитывающей стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение на рушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических мо дификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов генома.
Следующим аспектом действия аберрантных эпигенетических процессов может оказаться возрастание частоты мутаций. Этот эффект наиболее изучен при злокачественной трансформации клеток, при которой глобальное деметили рование генома, с одной стороны, и аномальное метилирование промоторов ге нов репарации ДНК, регуляции клеточного цикла, апоптоза, с другой стороны, сопровождают появление микросателлитной и хромосомной нестабильности (Costello, Plass, 2001;
Feinberg, 2001;
Geigl, 2008). Что касается эмбрионального периода развития, то имеются сообщения о повышенной частоте мутаций мик росателлитных последовательностей ДНК в клетках погибших эмбрионов (Kiaris et al., 1996;
Spandidos et al., 1998), а также данные о высоком уровне хромосом ного мозаицизма при нарушениях пре- и постимплантационных стадий онтоге неза (Harper et al., 1995;
Griffin et al., 1997;
Delhanty, 2005;
Vorsanova et al., 2005).
Наличие высокой частоты мозаичных кариотипов свидетельствует о том, что на ряду с ошибками мейотической сегрегации хромосом, существенную роль в воз никновении летальных геномных мутаций могут играть и нарушения митотиче ского распределения хромосом в соматических клетках зародыша. Однако цито генетические и молекулярные механизмы индукции хромосомного нерасхожде ния и, как следствие, возникновения мозаицизма в эмбриональном периоде он тогенеза остаются неясными.
Отмечено, что максимальное накопление мозаичных нарушений кариотипа приходится на этап дробления бластомеров (Los et al., 2004), причем эта особен ность характерна и для других изученных видов млекопитающих (Shi et al., 2004). Поскольку преимплантационный период развития характеризуется интен сивной эпигенетической реорганизацией генома, то не исключено, что наруше ния этого процесса могут приводить к формированию аберрантных профилей экспрессии генов, ответственных за поддержание геномной стабильности, а так же тех локусов, функционирование которых является принципиально важным для обеспечения нормального эмбрионального развития организма.
Цель исследования заключалась в установлении вклада аномалий эпигенетиче ской регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека.
Задачи исследования:
1. Установить спектр и частоту хромосомных аномалий при эмбриональной гибели у человека и разработать подходы к оценке факторов, оказывающих влияние на достоверность регистрации цитогенетических показателей при анализе репродуктивных потерь.
2. Оценить вклад однородительского наследования хромосом во внутриутроб ную гибель эмбрионов с нормальным кариотипом.
3. Обосновать подходы к систематизации эпимутаций импринтированных ге нов и предложить их классификацию.
4. Определить роль эпимутаций импринтированных локусов генома в нару шении эмбрионального развития человека.
5. Провести сравнительный анализ частоты гаметических мутаций микроса теллитных последовательностей ДНК в семьях с нормальной репродуктив ной функцией и в супружеских парах с невынашиванием беременности.
6. Оценить частоту соматических мутаций микросателлитных повторов ДНК при нарушениях эмбрионального развития.
7. Изучить цитогенетические механизмы возникновения мозаичных форм на рушений кариотипа при ранней эмбриональной гибели.
8. Определить роль эпигенетической инактивации генов контроля клеточного цикла в формировании хромосомного мозаицизма при нарушении внутри утробного развития.
Научная новизна работы. Основным научным результатом исследования яви лось определение роли аберрантных эпигенетических модификаций генома в де терминации нарушений эмбрионального развития человека. Получены новые данные об эпигенетических механизмах, изменяющих дозу импринтированных генов при патологии внутриутробного периода онтогенеза. Впервые показано, что нарушения геномного импринтинга связаны с аномалиями поддержания дифференциального метилирования импринтированных генов в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах развития. Предложена клас сификация эпимутаций импринтированных локусов в геноме человека.
Продемонстрировано увеличение мутационной изменчивости генома сома тических клеток при внутриутробной гибели эмбрионов, проявляющейся в фор ме мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, а также мозаичных вариантов нарушений кариотипа. Впервые исследован вопрос о связи аномаль ного метилирования генов контроля клеточного цикла с возникновением хромо сомного мозаицизма в эмбриональных клетках. Установлено, что нарушения эпигенетического репрограммирования генома зигот с нормальным хромосом ным набором ведут к формированию аберрантных эпигенотипов, ассоциирован ных с тканеспецифичным хромосомным мозаицизмом, тогда как у эмбрионов, развивающихся из зигот с анеуплоидным кариотипом, эпигенетическая инакти вация исследованных генов клеточного цикла может сопровождать коррекцию анеуплоидии и также приводить к возникновению хромосомного мозаицизма.
Обоснованы теоретические подходы к анализу цитогенетических механизмов формирования мозаичных вариантов хромосомного набора в эмбриональном пе риоде онтогенеза, основанные на учете закономерностей возникновения и рас пределения клеток с числовыми нарушениями хромосом в производных различ ных зародышевых листков.
Практическая значимость работы. В ходе выполнения исследования проведе на оценка факторов, оказывающих влияние на достоверность цитогенетического анализа хромосомных нарушений в клетках внутриутробно погибших эмбрио нов человека. Предложен подход к оценке уровня полиплоидизации эмбрио нальных фибробластов при длительном культивировании in vitro. Разработана математическая модель оценки эффектов контаминации культур клетками мате ринского организма. С её использованием становится возможной коррекция час тоты регистрируемых хромосомных нарушений и показателя «соотношение по лов» у эмбрионов с нормальным кариотипом при проведении цитогенетического анализа. Предложенная модель может быть использована в качестве одного из элементов контроля качества лабораторных цитогенетических исследований.
Разработанные подходы к анализу механизмов формирования хромосомно го мозаицизма могут представлять ценность для оценки риска таких клинически значимых феноменов в репродукции человека, как ограниченный плацентарный мозаицизм, гонадный мозаицизм, однородительские дисомии хромосом. Резуль таты исследования могут способствовать повышению эффективности медико генетического консультирования супружеских пар с невынашиванием беремен ности. Полученные данные представляют интерес для специалистов в области цитогенетики, генетики развития, молекулярной генетики, пренатальной и пре имплантационной генетической диагностики, акушерства и гинекологии. Мате риалы исследования используются в курсах лекций для студентов биологиче ских и медицинских специальностей ВУЗов, а также в циклах постдипломной подготовки специалистов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Предложена классификация эпимутаций импринтированных генов, учиты вающая стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модифи каций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов.
2. Нарушение функций импринтированных генов при патологии эмбриональ ного развития человека связано с изменениями дифференциального характе ра метилирования их регуляторных областей. Возникновение эпимутаций обусловлено аномалиями поддержания геномного импринтинга в соматиче ских клетках эмбрионов на постимплантационных этапах онтогенеза.
3. Однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормаль ным хромосомным набором.
4. Индукция хромосомного нерасхождения в клетках эмбрионов с нормальным кариотипом ассоциирована с аберрантным метилированием промоторных регионов генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Возникновение эпимутаций приходится на преимплантационный период развития и связано с нарушением деметилирования родительских геномов при их эпигенетиче ском репрограммировании.
5. Аномальное метилирование генов контроля клеточного цикла на постим плантационных этапах развития сопровождает коррекцию анеуплоидии мей отического происхождения с возникновением хромосомного мозаицизма.
6. Мутационный процесс в тетрануклеотидных повторяющихся последователь ностях ДНК в половых клетках родителей не оказывает заметного влияния на нарушение эмбрионального развития потомства, тогда как в клетках внут риутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором обна руживаются мутации микросателлитных последовательностей ДНК постзи готического происхождения.
7. Контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнско го организма оказывает влияние на частоту регистрируемых аномалий ка риотипа и на величину показателя «соотношение полов» в группе внутриут робно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены в форме уст ных докладов на 3 Европейской конференции по количественной молекулярной цитогенетике (Стокгольм, 2002);
38 конференции Европейского общества гене тики человека (Амстердам, 2006);
22-24 Ежегодных конференциях Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (Прага, 2006;
Лион, 2007;
Барсе лона, 2008);
конференциях Фонда Марии Кюри «Молекулярное профилирование генома» (Амстердам, 2007) и «Взаимодействие генетики, эпигенетики и некоди рующих РНК» (Мадрид, 2008);
III Международной конференции «Проблемы ви да и видообразования» (Томск, 2004);
XV Международной конференции Россий ской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Чебоксары, 2005);
Международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007);
Международной молодежной научно методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007);
VII и VIII научных конференциях ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН «Генетика человека и патология» (Томск, 2004;
2007);
IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008);
Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» (Новосибирск, 2008);
научно-практических конференциях «Молекулярно-биологические диагностические технологии в практическом здравоохранении» (Новосибирск, 2002);
«Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» (Новоси бирск, 2003);
«Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний:
возможности и перспективы» (Москва, 2006);
«Молекулярная генетика наслед ственных заболеваний и нарушений репродукции» (Новосибирск, 2008);
школе семинаре «Актуальные вопросы цитогенетики» (Москва, 2007). Результаты дис сертационной работы были доложены и обсуждены на заседаниях Президиума Томского научного центра СО РАМН (Томск, 2005) и Президиума СО РАМН (Новосибирск, 2007), а также на межлабораторных семинарах в ГУ НИИ меди цинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2008) и в Институте цитологии и ге нетики СО РАН (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме исследования опубликовано 62 работы, в том числе статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени док тора наук.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 372 страницах машинопис ного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и ме тодов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Библиографический указатель включает 569 источников, из них 81 – публикации в отечественной литературе, 488 – в за рубежной печати. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и содержит таблицы.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом настоящего исследования явились группы спонтанно абортиро ванных эмбрионов человека, медицинских абортусов первого триместра бере менности, супружеские пары с невынашиванием беременности, а также семьи с нормальной репродуктивной функцией, имеющие живорожденных детей. Про ведение исследования было одобрено Комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (протокол № 7 от 31.03.2006).
Для работы были использованы внезародышевые ткани 1986 спонтанных абортусов, полученные после оперативного или самопроизвольного прерывания беременности от женщин с диагнозами анэмбриония, неразвивающаяся бере менность или собственно спонтанный аборт. Ультразвуковая диагностика нару шений внутриутробного развития проводилась в Генетической клинике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Плацентарные ткани медицинских абор тусов были получены от женщин, отказавшихся сохранить нормально протекав шую беременность.
Фрагменты плодных оболочек были введены в культуры с целью получе ния препаратов метафазных хромосом. Образцы экстраэмбриональной мезодер мы (ЭМ) и цитотрофобласта хориона (ЦХ) от каждого эмбриона хранились при -70°С для проведения последующих молекулярно-генетических и молекулярно цитогенетических исследований, а также для анализа статуса метилирования ДНК. Выбор данных тканей для проведения исследования был обусловлен их происхождением из производных различных эмбриональных и внезародышевых листков (ЭМ – производная эпибласта, дифференцирующегося из внутренней клеточной массы бластоцисты;
ЦХ – производное трофэктодермы), что позволи ло определить механизмы и стадии возникновения мозаичных хромосомных аномалий и нарушений характера метилирования ДНК в изученных локусах.
Ретроспективный анализ частоты тетраплоидных клеток у эмбрионов с тет раплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме, установленным в ходе цитогенетического исследования, был проведен с помощью двухцветной флюо ресцентной in situ гибридизации (FISH) на интерфазных ядрах некультивирован ных клеток с центромероспецифичными ДНК-зондами D11Z1 и D17Z1. Присут ствие тетраплоидного клона подтверждали, если его частота статистически зна чимо превышала верхнюю границу доверительного интервала предела обнару жения мутации при интерфазном FISH-анализе. Определение предела и его до верительного интервала проводили при обследовании некультивированных тка ней контрольной группы 12 медицинских абортусов с нормальным кариотипом в соответствии с формулами, предложенными Ломакс с соавторами (Lomax et al., 1994). Средняя продолжительность внутриутробного развития зародышей в ана лизируемой и контрольной группе не имела статистически значимых отличий.
Для исследования эффектов контаминации культур клетками материнского организма был проведен анализ содержания последовательностей ДНК Y хромосомы у 112 эмбрионов с кариотипом 46,ХХ, установленным в ходе куль тивирования клеток. Анализ был выполнен с использованием образцов ДНК, выделенных из некультивированных тканей зародышей, с помощью ПЦР с праймерами на гомологичный локус хромосом X и Y – ген амелогенина AMELX (Xp22.3)/AMELY (Yp11.2) (Sullivan et al., 1993). Для регистрации возможных чи словых нарушений хромосом, невыявленных у 60 эмбрионов вследствие конта минации, использовался анализ наследования 16 полиморфных тетрануклеотид ных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21.
Анализ однородительского наследования хромосом был проведен в семьях, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом. Исследование выполняли с помощью анализа сегрегации 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21. Кри териями отбора хромосом являлись: локализация в них импринтированных ге нов, участвующих в регуляции роста и развития плода и плаценты;
наличие ор тологичных с хромосомами мыши участков, ОРД по которым ведет к ранней эм бриональной гибели животных;
отсутствие ОРД по исследуемой хромосоме у живорожденных индивидов;
регистрация ОРД у спонтанных абортусов в других исследованиях;
частое вовлечение хромосомы в мейотическое нерасхождение, увеличивающее риск формирования ОРД.
Поиск эпимутаций импринтированных локусов (SNURF-SNRPN, H19, KCNQ1OT1, CDKN1C) осуществляли у 84 спонтанных абортусов с нарушениями клеточной пролиферации: 30 эмбрионов имели морфологически определяемую гиперплазию ворсин трофобласта, у 54 зародышей клетки оказались неспособ ными к нормальной пролиферации в культуре. В качестве контрольной группы были обследованы экстраэмбриональные ткани 24 медицинских абортусов.
Средний возраст родителей и продолжительность внутриутробного развития эм брионов в сравниваемых группах не имели статистически значимых отличий.
После бисульфитной конверсии геномной ДНК была проведена метилспецифич ная ПЦР локусов SNURF-SNRPN, H19, CDKN1C с использованием праймеров, предложенных в работах Kubota et al., 1997, Poon et al., 2002, Li et al., 2002. Ис следование метилирования центра импринтинга KCNQ1OT1 было выполнено с помощью метилчувствительной ПЦР после обработки геномной ДНК метилчув ствительной эндонуклеазой NotI в течение 16 час при 37°С (Engel et al., 2000).
Анализ гаметических мутаций 15 микросателлитных последовательностей ДНК, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 16, 17, 19 и 21, был проведен в супружеских парах, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом. В качестве контрольной группы обследовано 95 семей с нормальной репродуктив ной функцией (мать, отец, ребенок). Средний возраст родителей в семьях с не вынашиванием беременности и в контрольной выборке на момент рождения ре бенка статистически значимо не отличался. Критерием регистрации мутации га метического происхождения являлось наличие у потомка аллеля, несовпадающе го по своему размеру ни с одним из родительских аллелей исследуемого локуса.
При этом вероятность биологического родства определялась при анализе насле дования аллелей как минимум 10 других информативных микросателлитных ло кусов и составляла во всех случаях не менее 99,99%.
Анализ соматических мутаций был проведен через исследование сегрега ции аллелей 10 микросателлитных локусов в 95 семьях с невынашиванием бере менности, а также в контрольной группе, представленной 51 медицинским абор тусом и 102 родителями. Продолжительность развития эмбрионов и средний возраст родителей в сравниваемых группах не имели значимых отличий. Нали чие соматической мутации в исследуемом локусе предполагалось в случае выяв ления у зародыша с нормальным кариотипом дополнительного третьего аллеля, отличающегося по размеру от двух других аллелей, наследованных от родите лей. Присутствие мутации принималось после исключения с помощью интер фазного FISH-анализа триплоидии или трисомии, невыявленных вследствие контаминации культур клетками матери или хромосомного мозаицизма. Крите риями отбора ДНК-маркеров для анализа мутаций являлись: тетрануклеотидная повторяющаяся последовательность;
гетерозиготность не менее 0,70;
размер продуктов амплификации не более 300 п.н. Информация о локализации ДНК маркеров в геноме, последовательностях праймеров и условиях амплификации была получена из баз данных: www.genome.ucsc.edu и www.gdb.org. Частоты ал лелей и генотипов, а также их соответствие ожидаемому распределению при равновесии Харди-Вайнберга вычисляли с помощью программы «RC», осно ванной на алгоритме, предложенном Рольфом и Бентзеном (Rolf, Bentzen, 1989).
Сравнение частот мутаций проводили с использованием -критерия Фишера для значений частот, близких к нулю (Лакин, 1973).
Изучение частоты и межтканевого распределения анеуплоидных клеток у 39 эмбрионов с аномальным кариотипом, установленным в ходе цитогенетиче ского исследования, проводили в некультивированных тканях с помощью ин терфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на соответствующие хромосомы. Исследуемая выборка была дополнена 11 спонтанными абортусами из архивного материала лаборатории цитогенетики, мозаичный кариотип кото рых был установлен с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на все хромосомы набора. Анализ достоверности межтканевых различий по частотам анеуплоидных клеток проводили с помощью критерия 2.
Исследование статуса метилирования генов контроля клеточного цикла (RB1, CDKN2A, CDKN2B, P14ARF) было выполнено в экстраэмбриональных тканях 50 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, 20 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и 23 медицинских абортусов. Средняя продолжительность развития эмбрионов в исследованных группах не отлича лась. Метилспецифичную ПЦР проводили с использованием праймеров и усло вий, предложенных в работах Herman et al., 1996, Esteller et al., 2001, Gonzalez Gomez et al., 2003. В гене CDKN2A характер метилирования был определен в эк зоне I с помощью метилспецифичной и метилчувствительной ПЦР (Herman et al., 1996;
Xing et al., 1999), а также в промоторе с помощью метилчувствитель ной ПЦР (Землякова с соавт., 2004), при этом объем контрольной выборки был увеличен до 36 эмбрионов. Частоту эпимутаций определяли как отношение чис ла метилированных аллелей к общему числу проанализированных последова тельностей исследуемого локуса.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Цитогенетическое исследование спонтанных абортусов человека Первым этапом работы явился цитогенетический анализ внутриутробно по гибших эмбрионов с целью выделения групп зародышей с нормальным карио типом и с хромосомными аномалиями для проведения дальнейших разделов ис следования. Успешное культивирование клеток и стандартный метафазный ана лиз выполнены для 717 из 1986 спонтанных абортусов, клетки которых были введены в культуры. Нормальный хромосомный набор определен у 42,9% эм брионов: 116 зародышей имели кариотип 46,XY, а 191 – 46,XX. Нормальное число хромосом было определено также у 19 из 47 спонтанных абортусов с пу зырным заносом, что составило 2,6% от общего объема выборки.
Хромосомные нарушения выявлены у 391 эмбриона (54,5%). Наиболее час тыми аномалиями кариотипа оказались трисомии аутосом – их частота состави ла 35,8% от всех выявленных хромосомных аберраций. Далее следовала тетрап лоидия, частота которой (23,8%) заметно превышала известные в литературе значения – от 1,7% (Takahara et al., 1977) до 14% (Kalousek, 1993). Наиболее ве роятными причинами такого отличия могут служить полиплоидизация эмбрио нальных фибробластов в длительных культурах in vitro, а также учет тетрапло идно-диплоидного мозаицизма. Так, 73 из 93 эмбрионов с тетраплоидным карио типом по результатам цитогенетического анализа имели дополнительную эупло идную клеточную линию, тогда как только у 20 спонтанных абортусов (22%) были выявлены исключительно тетраплоидные клетки. Таким образом, среди всех спонтанных абортусов с хромосомными аномалиями только 5% эмбрионов имели немозаичный вариант тетраплоидного кариотипа. Интерфазный FISH анализ некультивированных тканей 30 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме позволил зарегистрировать тетраплоидные клет ки только у 13 зародышей (43%). У всех этих эмбрионов частота тетраплоидных клеток статистически значимо превышала верхнюю границу предела обнаруже ния мутации (1,40% для ЦХ и 0,99% для ЭМ). Экстраполируя полученные дан ные на всю обследованную выборку спонтанных абортусов можно заключить, что частота тетраплоидии в группе эмбрионов с нарушениями кариотипа сни зится с 23,8 до 10,2%, что находится в соответствии с данными литературы.
Частота триплоидии в проведенном исследовании составила 20,5%. Нару шения числа половых хромосом найдены в 11,7% случаев, при этом на долю мо носомии по Х-хромосоме (в чистой и мозаичной форме) пришлось 6,6% выяв ленных аномалий кариотипа. Частота структурных перестроек хромосом соста вила 2,8%. В целом полученные данные по спектру и частоте основных типов хромосомных аномалий (с учетом коррекции частоты тетраплоидии) соответст вуют результатам наиболее масштабных цитогенетических исследований спон танных абортусов (Boue et al., 1975;
Hassold et al., 1980;
Kline et al., 1987;
Ka lousek, 1993;
Griffin et al., 1997;
Menasha et al., 2005).
Необходимо отметить, что полиплоидизация клеток является не единствен ным феноменом, влияющим на достоверность цитогенетического исследования при анализе репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития. Еще одним заметным фактором может выступать контаминация культур клетками материнского происхождения, затрагивающая, по разным оценкам, от 15 до 40% культур спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ (Griffin et al., 1997;
Bell et al., 1999). Предполагается, что материнская контаминация (МК) может приво дить к занижению частоты регистрируемых нарушений кариотипа, а также к уменьшению показателя «соотношение полов» в исследуемой выборке. Учиты вая необходимость анализа спонтанных абортусов с нормальным кариотипом для решения задач, связанных с изучением эпигенетических феноменов, нами была разработана математическая модель для оценки частот кариотипов и дос товерности цитогенетического исследования с учетом риска МК. Для построе ния модели предложено использовать коэффициент материнской контаминации (k), равный вероятности обнаружения последовательностей ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ, уста новленным после культивирования клеток. В таблице 1 приведены итоговые формулы для расчета ожидаемых частот кариотипов и определения достоверно сти проведенного цитогенетического анализа с учетом материнской контамина ции. Полное математическое обоснование модели изложено в тексте диссерта ции, а также в публикациях (Никитина и др., 2004;
Nikitina et al., 2005).
С помощью анализа локуса амелогенина у 18 из 112 эмбрионов с кариоти пом 46,ХХ, установленным в результате цитогенетического исследования, было обнаружено наличие ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях (k = 16%). Отмечено, что продолжительность пролиферации клеток этих спонтанных абортусов до момента фиксации культур и приготовления хромосомных препа ратов оказалась статистически значимо выше, чем продолжительность культи вирования клеток эмбрионов, не продемонстрировавших наличие последова тельностей Y-хромосомы в некультивированных тканях (35,08±3,98 и 24,05±1, дней, соответственно, p = 0,02). Таким образом, позднее вступление клеточных культур в фазу активной пролиферации, на которой обычно получают препараты метафазных хромосом, может являться маркером МК и требует особого внима ния в случае установления повышенной частоты эмбрионов с кариотипом 46,ХХ в исследуемой выборке и при уменьшении показателя соотношения полов.
С целью определения пропорций кариотипов, маскируемых МК, к части цитогенетически обследованной группы эмбрионов (N=450) была применена предложенная модель. Показано, что с учетом МК частота хромосомных анома лий среди зародышей женского пола в исследованной выборке увеличилась с 51,5 до 62,2% (p = 0,01). Также была отмечена тенденция к возрастанию частоты нарушений кариотипа в общей выборке – с 51,8 до 57,8% (p = 0,07). Кроме того, наблюдалось увеличение показателя «соотношение полов» в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом – с 0,66 до 1,02 (p = 0,03). Необходимо от метить, что статистическая значимость всех регистрируемых изменений опреде ляется величиной коэффициента k и объемом исследуемой выборки N.
Верификация предложенной модели была проведена с помощью анализа наследования аллелей 16 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-локусов, рас положенных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21, в 60 семьях, имевших спонтан ный аборт с кариотипом 46,ХХ, установленным после культивирования клеток.
Согласно модели, ожидаемая частота нарушений кариотипа при k = 16% должна составлять 20,7% (табл. 1), т.е. у 12 эмбрионов можно предполагать наличие не выявленных вследствие МК хромосомных аберраций. Использованный набор микросателлитных ДНК-маркеров позволяет детектировать как триплоидии, так и наиболее частые у спонтанных абортусов трисомии по хромосомам 16 и 21. В среднем, эти аномалии составляют около 40% регистрируемых нарушений ка риотипа. Следовательно, с помощью данного подхода могли бы быть выявлены Таблица 1. Моделирование частот кариотипов и вероятности ошибки цитогене тического анализа спонтанных абортусов с учетом риска контаминации эмбрио нальных культур клетками материнского организма.
Показатель Наблюдае- Ожидаемое значение мое значение ABk A(1 k ) C + D / N Частота кариотипа 46,XX A/N Ak C 1 + C + D / N Частота кариотипа 46,XY C/N Частота эмбрионов женского по- Ak B 1 + C + D / N B/N ла с хромосомными аномалиями Частота эмбрионов мужского Ak D 1 + C + D / N пола с хромосомными D/N аномалиями Ak Частота хромосомных аномалий ( B + D)1 + C + D / N (B+D) / N в общей выборке k ( B + D) Частота хромосомных аномалий в группе «46,XX» C+D Ak Соотношение полов у эмбрионов ABk C 1 + C + D / A(1 k ) C + D C/A с нормальным кариотипом Вероятность обнаружения любого из вариантов хромосом- Ak ного набора (B, C или D), про Ak + C + D пущенного при цитогенетиче ском анализе вследствие МК (Q) Доля эмбрионов с истинным кариотипом 46,ХХ в выборке ABk спонтанных абортусов с карио- A(1 k ) типом 46,ХХ, установленным C+D после культивирования клеток (Afn - female normal) Доля кариотипов «46,ХХ», A A fn (1 Q) выявленных при анализе A материнских клеток (М) Частота эмбрионов с иным Ak ( B + C + D) хромосомным набором N (C + D) в исследованной выборке (вероятность ошибки, E) Ak ( B + C + D) Точность цитогенетического W = 1 E = N (C + D) анализа (W) Примечание: А – число абортусов с кариотипом 46,ХХ в обследованной выбор ке;
В – число абортусов женского пола с хромосомными аномалиями;
С – число абортусов с кариотипом 46,XY;
D – число абортусов мужского пола с хромо сомными аномалиями;
N – объем выборки (N = A+B+C+D).
не менее 5 из 12 ожидаемых эмбрионов с хромосомными аберрациями. В дейст вительности числовые нарушения хромосом были найдены у 9 спонтанных абортусов (4 случая триплоидии, 4 трисомии по хромосоме 16 и двойная трисо мия по хромосомам 16 и 20). Все аномалии были подтверждены интерфазным FISH-анализом с центромероспецифичными ДНК-зондами. У двух эмбрионов женского пола с трисомией по хромосоме 16 был установлен мозаицизм с нали чием нормальной клеточной линии (с частотой 24% и 92%). Клетки с нормаль ным кариотипом могли иметь преимущество при длительном культивировании in vitro, поэтому ошибочный результат цитогенетического анализа мог быть свя зан как с МК, так и с мозаицизмом. У остальных 7 эмбрионов хромосомные аномалии присутствовали в немозаичном состоянии, свидетельствуя о том, что цитогенетический анализ этих зародышей был выполнен на материнских клет ках, случайным образом попавших в культуры. Таким образом, числовые нару шения хромосом, невыявленные вследствие МК, были обнаружены как минимум у 7 из 60 абортусов с кариотипом 46,ХХ (11,7%), что хорошо согласуется часто той 8,3%, предсказанной моделью и дизайном экспериментальной проверки (p = 0,54). В целом, точность цитогенетического анализа (W) при использованных в настоящей работе условиях культивирования клеток составила 91,8%.
Мутации импринтированных локусов генома при патологии эмбрионального развития С целью изучения вклада однородительского наследования хромосом в ран нюю эмбриональную гибель в настоящем исследовании был проведен анализ на следования 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализован ных на хромосомах 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21, в 100 семьях с невынашиванием беременности при нормальном кариотипе в клетках спонтанного абортуса. В хо де анализа из дальнейшего исследования были исключены четыре семьи, в кото рых было выявлено несоответствие аллелей микросателлитных локусов у отца и эмбриона («ложное» отцовство), а также 9 зародышей, продемонстрировавших отклонения от нормального числа хромосом, причиной которых послужила кон таминация культур клетками матери, либо хромосомный мозаицизм. Таким об разом, анализ ОРД был проведен у 87 эмбрионов. Ни одного случая ОРД по исследованным хромосомам при информативности анализа, варьировавшей по отдельным локусам в пределах от 55,8 до 89,5%, обнаружено не было.
К настоящему времени опубликованы результаты 7 исследований, направ ленных на поиск ОРД у спонтанных абортусов (Henderson et al., 1994;
Shaffer et al., 1994;
Smith et al., 1998;
Евдокимова, Назаренко, 2000;
Fritz et al., 2001;
Kondo et al., 2004;
Tsukishiro et al., 2005). При обследовании в общей сложности 392 эм брионов, с учетом настоящей работы, было найдено 7 абортусов с ОРД: по од ному случаю ОРД по хромосомам 7 и 9, три случая ОРД по хромосоме 21, из ко торых у одного эмбриона ОРД сочеталась с двойной трисомией по хромосомам и 9. У одного зародыша была выявлена сегментная ОРД хромосомы 14. Еще один эмбрион имел сегментную ОРД хромосомы 16. Во всех случаях ОРД имела материнское происхождение, что указывает на ведущую роль хромосомного не расхождения в мейозе у матери в формировании первично анеуплоидных зигот.
В целом, проанализировано 6156 событий наследования хромосом, из которых найдено только 6 случаев ОРД, не сочетающейся с другими типами хромосом ных аномалий. Таким образом, частота формирования ОРД составила 1:1000 со бытий наследования хромосом и оказалась сопоставимой с ожидаемой частотой (1,65:1000), рассчитанной на основании данных о хромосомном нерасхождении в мейозе (Engel, DeLozier-Blanchet, 1991). Вместе с тем, только лишь 2 случая (ОРД хромосомы 7 и сегментная ОРД хромосомы 14) могут рассматриваться в качестве доказательства возможной ассоциации нарушений дозы импринтиро ванных генов с ранней эмбриональной гибелью. Что касается хромосом 9, 16 и 21, то до настоящего времени отсутствует информация о локализации в них им принтированных генов. Таким образом, частота абортусов с вариантами ОРД, затрагивающими непосредственно импринтированные гены, составляет только 0,5% (2/392). Более того, в части исследований (Henderson et al., 1994;
Shaffer et al, 1994) поиск ОРД проводился без предварительного цитогенетического анали за, что не исключает попадания в обследованные выборки эмбрионов с хромо сомными нарушениями и еще более снижает полученную оценку вклада одно родительского наследования хромосом в раннюю эмбриолетальность.
Необходимо отметить, что ОРД является только лишь одним из механиз мов, нарушающих дозу импринтированных генов. Поэтому решение вопроса о вкладе мутаций импринтированных локусов генома в нарушение эмбрионально го развития человека, решаемое до настоящего времени через поиск ОРД, не должно ограничиваться анализом этого редкого, с цитогенетической точки зре ния, феномена. Действительно, образование ОРД зависит от целого ряда мута ционных событий, связанных с последовательными нарушениями сегрегации хромосом в мейозе и при последующих митотических делениях эмбриональных клеток. Тот факт, что геномный импринтинг является эпигенетическим феноме ном и его молекулярные основы связаны с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей генов позволяет выдвинуть предположение о том, что нарушение экспрессии импринтированных локусов в раннем эмбрио генезе человека может быть связано в большей степени с их эпимутациями, чем с ошибками сегрегации хромосом, ведущими к формированию ОРД. Очевидно, что в отношении затрагиваемого гена эффекты эпимутаций будут функциональ но эквивалентны однородительскому наследованию хромосом, содержащих им принтированные гены. Эпимутации импринтированных локусов были описаны при биродительском полном пузырном заносе (Van den Veyver, Al-Hussaini, 2006), онкологических заболеваниях (Plass, Soloway, 2002), у пациентов с болез нями геномного импринтинга (синдромы Видемана-Беквита, Энгельмана, Рассе ла-Сильвера), в том числе и у детей с данными заболеваниями, родившихся в ре зультате применения методов искусственного оплодотворения (Cox et al., 2002;
DeBaun et al., 2003;
Kagami et al., 2007). Однако разнообразие и закономерности возникновения аберрантных эпигенетических модификаций импринтированных генов при нарушениях эмбрионального развития остаются неизвестными.
В настоящем исследовании была предложена классификация эпимутаций импринтированных генов. В основу систематизации было положено 3 критерия.
Так, предложено выделять эпимутации, затрагивающие все или отдельные им принтированные локусы генома, а также центры импринтинга. Следующим кри терием явилось происхождение эпимутаций, которое может быть связано либо с нарушениями установления импринтинга в гаметогенезе родителей, либо с по терей устойчивости импринтированных локусов к волне эпигенетического ре программирования генома в соматических клетках эмбриона на самых ранних этапах развития (рис. 1). Соответственно, было предложено выделять гамети Рис. 1. Динамика эпигенетического репрограммирования генома.
- материнский и отцовский геномы;
- импринтированные гены, метилируемые на отцовских хромосомах;
- отцовский геном (неимпринтированные локусы);
- импринтированные гены, метилируемые на материнских хромосомах;
- материнский геном (неимпринтированные локусы);
- импринтированные гены, неметилируемые на материнских хромосомах;
- импринтированные гены, неметилируемые на отцовских хромосомах.
Цифрами обозначены критические периоды репрограммирования импринтированных генов.
ческие и соматические эпимутации. Наконец, третий критерий дифференцирует эпимутации по их функциональной значимости: гипер- либо гипометилирование импринтированных локусов, приводящее к потере импринтинга. В таблице представлен спектр теоретически ожидаемых эпимутаций, основанный на ком бинации двух критериев (происхождение и функциональная значимость), а так же приведены примеры некоторых наследственных и онкологических заболева ний, в этиологии которых была продемонстрирована роль нарушений характера метилирования импринтированных генов.
С целью установления вклада эпимутаций импринтированных локусов в нарушение эмбрионального развития был проведен анализ статуса метилирова ния трех центров импринтинга (SNURF-SNRPN, H19, KCNQ1OT1), координи рующих экспрессию кластеров импринтированных генов на хромосомах 11 и 15, а также импринтированного гена CDKN1C, вовлеченного в контроль дифферен цировки плацентарных тканей. В обоих типах внезародышевых тканей (ЭМ и ЦХ) у всех эмбрионов был выявлен дифференциальный характер метилирования SNURF-SNRPN, H19 и CDKN1C. На электрофореграммах выявлялось два про дукта метилспецифичной ПЦР, соответствующих неметилированному отцовско му и метилированному материнскому аллелям SNURF-SNRPN, либо неметилиро ванному материнскому и метилированному отцовскому аллелям H19 и CDKN1C.
Таблица 2. Классификация эпимутаций импринтированных генов.
Тип эпимутаций Аберрантное Аберрантное гипометилирование гиперметилирование материнского отцовского материнского отцовского аллеля аллеля аллеля аллеля Ошибки стира- ЦИ-СПВ IGF2/H ния импринтин- (СВБ) (СПВ);
га с сохранени- PEG1/MEST ем метильных (СРС) групп (КП 1).
Гаметические эпимутации Отсутствие ме- БППЗ;
IGF2/H тилирования ЦИ-СПВ (СЭ);
(СРС) аллелей, кото- LIT1 (СВБ, рые должны ТНСД);
подвергаться ZAC (ТНСД, метилированию СВБ) (КП 2).
Аберрантное ЦИ-СПВ IGF2/H метилирование (СВБ) (СПВ);
аллелей, кото- PEG1/MEST рые не должны (СРС) метилироваться (КП 2).
Нарушение за- ЦИ-СПВ (мо- частичное щиты метили- заичные вари- гипомети рованных алле- анты СЭ);
лирование лей от демети- «синдром ма- IGF2/H лирования при теринского ги- (СРС) репрограммиро- пометилирова Соматические эпимутации вании генома ния»;
мозаич (КП 3). ные варианты ТНСД Нарушение LIT1 (карци- P73 (карци ЦИ-СПВ IGF2/H поддержания нома пищево- нома почек, (опухоль (мозаичные дифференци- да, рак пече- рак легкого) Вильмса, ге- варианты ального мети- ни);
патобласто- СПВ);
лирования им- PEG3 (хорион мы, рак лег- PEG3 (рак принтирован- карцинома)ких, почек);
шейки матки ных генов в со- P73 (острая и эндомет матических лейкемия, рия);
клетках лимфома Бер- ZAC (рак (КП 4). китта);
яичников) GTL2 (карци нома почек) Примечание: БППЗ – биродительский полный пузырный занос;
СВБ – синдром Видема на-Беквита;
СПВ – синдром Прадера-Вилли;
СРС – синдром Рассела-Сильвера;
СЭ – син дром Энгельмана;
ТНСД – транзиторный неонатальный сахарный диабет;
ЦИ-СПВ – центр импринтинга хромосомы 15, мутации которого ответственны за формирование синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана;
КП – критические периоды репрограммирова ния в соответствии с рис. 1;
прочерками обозначены несуществующие типы эпимутаций.
Что касается центра имприн тинга KCNQ1OT1, то у 8 из 84 спонтанных абортусов - KCNQ1OT - (9,5%) было зарегистрирова контрольный - но его гипометилирование на локус KvL - материнском гомологе. Сви - детельством гипометилиро - вания явилось отсутствие на - электрофореграмме продукта п.н.
метилчувствительной ПЦР 1 2 3 4 5 pUC19/ размером 400 п.н., соответст MspI вующего материнскому ме Рис. 2. Электрофореграмма продуктов метил- тилированному аллелю чувствительной ПЦР локуса KCNQ1OT1. KCNQ1OT1 (рис. 2). Ампли 1 – материнский метилированный аллель в ЦХ эм- фикация нативной ДНК, не бриона с низкой пролиферативной активностью обработанной рестриктазой клеток in vitro;
NotI, приводила к синтезу 2 – гипометилирование материнского аллеля в ЭМ продукта, исключая возмож того же эмбриона;
ность делеции данного локу 3 – гипометилирование материнского аллеля в ЦХ са на материнской хромосо эмбриона с гиперплазией трофобласта;
ме. Теоретически аналогич 4 – материнский метилированный аллель в ЭМ того ная картина результатов ме же эмбриона;
5 – материнский метилированный аллель в ЦХ ме- тилчувствительной ПЦР мог ла наблюдаться и при одно дицинского абортуса.
родительском наследовании хромосомы 11 от отца, по скольку в этом случае на электрофореграмме также отсутствовали бы метилиро ванные аллели материнского происхождения. Однако у всех эмбрионов наличие ОРД представляется маловероятным событием, поскольку статус метилирования двух других импринтированных генов в регионе 11p15.5 (H19 и CDKN1C) являл ся нормальным. Таким образом, выявленные изменения характера метилирова ния KCNQ1OT1 следует рассматривать как эпимутации.
При сравнительном анализе метилирования KCNQ1OT1 в разных тканях было отмечено, что у 7 из 8 абортусов обнаруженные эпимутации затрагивали производные только одного зародышевого листка, т.е. регистрировались либо в ЭМ (5 эмбрионов), либо в ЦХ (2 зародыша). Ещё у одного абортуса для обследо вания оказалась доступной только ЭМ. Учитывая, что обособление и дифферен цировка ЦХ и ЭМ происходит уже после этапа имплантации бластоцисты и за вершения тотального деметилирования генома, полученные в ходе исследования данные о тканеспецифичности эпимутаций указывают на их соматическое про исхождение. Наиболее вероятным механизмом возникновения таких эпимутаций является потеря эмбриональными клетками способности к поддержанию роди тельского импринтинга через нарушение воспроизводства характера метилиро вания ДНК в регуляторных последовательностях импринтированных генов на постимплантационных этапах развития (критический период № 4, рис. 1).
Гипометилирование KCNQ1OT1 на материнском гомологе является одной из наиболее частых форм молекулярной патологии, выявляемой у 50% пациентов с синдромом Видемана-Беквита (DeBaun et al., 2003). Более того, оно отмечено практически у всех детей с данным синдромом, родившихся в результате приме нения методов искусственного оплодотворения (Maher, 2005). Обсуждаемый в современной литературе вопрос о возможном влиянии вспомогательных репро дуктивных технологий на увеличение риска рождения детей с болезнями геном ного импринтинга (Niemitz, Feinberg, 2004;
Дыбан А.П., Дыбан П.А., 2006) дела ет актуальными исследования механизмов и факторов, вызывающих эпимутации импринтированных генов. Доминирующей гипотезой является предположение о том, что используемые для культивирования гамет и эмбрионов среды, а также протоколы гормональной гиперстимуляции яичников, могут не обеспечивать нормального установления и поддержания геномного импринтинга в период то тальных эпигенетических модификаций генома половых и соматических клеток (Khosla et al., 2001;
Lucifero et al., 2004). Полученные в ходе проведенного нами исследования данные указывают на то, что эпимутации, по крайней мере в локу се KCNQ1OT1, могут регистрироваться и при спонтанном прерывании беремен ностей, наступивших естественным путем. Эти результаты свидетельствуют в пользу альтернативной гипотезы, согласно которой технологии искусственного оплодотворения, позволяя преодолевать некоторые репродуктивные барьеры, могут приводить к проявлению у потомства скрытой генетической (или эпигене тической) изменчивости, в том числе и несовместимой с нормальным течением эмбриогенеза (Horsthemke, Ludwig et al., 2005). Возможно, что некоторые супру жеские пары с нарушениями фертильности или невынашиванием беременности имеют предрасположенность к эпигенетической нестабильности, что делает ге ном их потомства подверженным эпигенетическим изменениям, независимо от того, использовались или нет методы искусственного оплодотворения.
Анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК при нарушении эмбрионального развития С целью характеристики уровня мутационной изменчивости генома при ранней остановке внутриутробного развития в настоящем исследовании был проведен анализ частот гаметических и соматических мутаций микросателлит ных последовательностей ДНК, а также хромосомного мозаицизма в клетках спонтанных абортусов первого триместра беременности. Для изучения вопроса о вкладе гаметических мутаций микросателлитных локусов ДНК в этиологию на рушений внутриутробного развития нами был выполнен анализ сегрегации ал лелей 15 тетрануклеотидных повторяющихся последовательностей в семьях с невынашиванием беременности (при нормальном кариотипе у спонтанного абортуса) и в супружеских парах с нормальной репродуктивной функцией. В ис следованных выборках гетерозиготность всех изученных локусов варьировала от 0,80 до 0,94, а число выявленных по каждому локусу аллелей колебалось от 6 до 17. Распределение частот генотипов не отличалось от ожидаемого при равнове сии Харди-Вайнберга (p 0,05).
В семьях с невынашиванием беременности было проанализировано информативных результатов мейоза и обнаружено 10 мутаций – две мутации в локусе D16S2624, по одной мутации – в 8 локусах. Средняя частота мутаций со ставила 4,3610-3 на локус/гамету/поколение. В семьях с нормальной репродук тивной функцией было изучено 1725 событий передачи аллелей микросателлит ных локусов от родителей потомкам и выявлено 4 мутации в 4 разных локусах D17S1185, D19S394, D21S11 и D21S1435. Средняя частота мутаций всего ком плекса изученных микросателлитных ДНК-маркеров составила 2,3210-3 на ло кус/гамету/поколение. Достоверных различий по частоте гаметических мутаций между исследованными группами семей не обнаружено (p = 0,25). Полученные данные свидетельствуют о том, что мутации в микросателлитных локусах ДНК в половых клетках родителей потомства с остановкой внутриутробного развития и у родителей живорожденных детей возникают с одинаковой частотой.
Следующим разделом работы явился анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, возникающих непосредственно в соматических клет ках самих эмбрионов. При обследовании 95 спонтанных абортусов с нормаль ным кариотипом у 13 зародышей было обнаружено наличие дополнительного аллеля микросателлитного локуса, отличающегося по размеру от двух родитель ских аллелей, что указывало на возможные соматические мутации. Однако до полнительный интерфазный FISH-анализ показал, что в 4 случаях эмбрионы имели триплоидный кариотип, невыявленный вследствие материнской контами нации. Еще у 5 зародышей были найдены трисомии по хромосомам 16 или 20, в том числе и в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией. Таким об разом, наличие соматических мутаций было подтверждено только у 4 из 95 эм брионов (4,2%). Из 10 изученных локусов мутации были зарегистрированы в че тырех, при этом в локусе D20S168 было выявлено два мутационных события, по одной мутации найдено в локусах D16S2624, D16S685 и D21S1413. Один эмбри он имел соматические мутации в двух локусах.
В среднем частота соматических мутаций тетрануклеотидных повторов ДНК у спонтанных абортусов составила 5,9610-3 на локус/поколение (5 мута ций в 839 обследованных генотипах). В то же время в 504 проанализированных генотипах эмбрионов контрольной группы ни одной мутации постзиготического происхождения обнаружено не было (p = 0,01). При сравнительном анализе час тот гаметических и соматических мутаций в обследованных выборках достовер ных отличий между ними не наблюдалось (p = 0,57). Этот факт, с одной сторо ны, подчеркивает то, что в основе возникновения мутаций микросателлитных последовательностей в половых и соматических клетках, по-видимому, лежат повреждения общих механизмов репарации ДНК. С другой стороны, наличие соматических мутаций исключительно у внутриутробно погибших эмбрионов свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной измен чивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах развития.
Как правило, появление мутаций микросателлитных последовательностей слу жит индикатором функциональных нарушений в системе репарации ошибочного спаривания оснований ДНК. Полученные данные подтверждают гипотезу об ас социации нарушений мисс-матч репарации ДНК в соматических клетках с ран ней эмбриолетальностью у человека (Kiaris et al., 1996). Возможно, что неста бильность генома, выявляемая на уровне повторяющихся последовательностей ДНК, затрагивает не только генетически нейтральные локусы, но и участки ге нома, играющие существенную роль в раннем развитии организма.
Эпигенетические модификации генов клеточного цикла у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом Хромосомный мозаицизм, определяемый как наличие у организма, развив шегося из одной зиготы, двух или более клеточных линий с разным кариотипом является следствием нарушений сегрегации хромосом при митотическом деле нии клеток. Согласно результатам стандартных цитогенетических исследований, около 13-20% спонтанных абортусов имеют мозаичные нарушения кариотипа, ограниченные производными различных зародышевых листков (Kalousek et al., 1992;
Lombardi, Dev, 1992;
Griffin et al., 1997). Однако наиболее существенное возрастание частоты мозаицизма наблюдается на преимплантационных этапах дробления бластомеров, когда около 60% зародышей на стадии 8-клеточной мо рулы демонстрируют мозаичную хромосомную конституцию (Los et al., 2004).
Столь высокая частота хромосомного мозаицизма позволяет рассматривать его в качестве одной из форм нестабильности эмбрионального генома. Следует отме тить, что увеличение частоты мозаичных кариотипов приходится на период то тального эпигенетического репрограммирования генома на преимплантацион ных стадиях развития. Возможно, что деметилированное состояние гетерохро матина негативным образом сказывается на точности хромосомной сегрегации, а нарушения последующих этапов установления метилирования ДНК могут при водить к аберрантной эпигенетической инактивации генов, ответственных за контроль клеточного цикла и распределение хромосом.
Существенная часть мозаичных эмбрионов элиминирует уже на преим плантационных этапах развития, однако некоторые из них могут проходить им плантацию и продолжать свое развитие. Вероятность такого события зависит от типа хромосомной аномалии, вовлеченной в мозаичное состояние, от частоты аномальных клеток, а также от их локализации в производных различных заро дышевых листков. Кроме того, возникновение мозаицизма возможно и на пост имплантационных этапах развития. В рамках настоящего исследования был про веден анализ особенностей распределения анеуплоидных клеток в тканях эм брионов с мозаичной хромосомной конституцией. На основе разработанной мо дели формирования хромосомного мозаицизма (Лебедев, Назаренко, 2001) было определено, что в подавляющем большинстве случаев (90%) возникновение мо заичного кариотипа являлось следствием коррекции анеуплоидии мейотического происхождения в одной или обеих обследованных тканях. У остальных эмбрио нов возникновение мозаицизма было связано с аномалиями сегрегации хромо сом в соматических клетках зародышей, развивающихся из эуплоидных зигот.
Далее спонтанные абортусы с хромосомным мозаицизмом были обследова ны на предмет характера метилирования генов RB1, CDKN2A, CDKN2B и P14ARF, вовлеченных в RB- и P53-зависимые пути регуляции клеточного цикла.
Анализ проводили в ЦХ и ЭМ с целью определения тканеспецифичности эпиму таций и периодов их наиболее вероятного возникновения. У 9 из 45 эмбрионов (20%) впервые было зарегистрировано метилирование промоторной области ге на RB1 (рис. 3). При этом у 5 зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы как в ЭМ, так и в ЦХ, что свидетельствовало о возник новении эпимутаций ещё до обособления исследованных тканей (табл. 3).
Аберрантное метилирование промотора гена P14ARF (рис. 4) было выявле но у 4 из 45 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, что составило 9%. При этом у 2 эмбрионов оно оказалось ограниченным ЦХ, у одного эмбрио на – ЭМ, еще у одного зародыша метилированные аллели выявлялись в обеих тканях (табл. 3). При анализе статуса метилирования гена CDKN2B у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом ни одной эпимутации обнаружено не было. Мети лирования генов RB1, P14ARF и CDKN2B также не было найдено в тканях спон танных абортусов с нормальным кариотипом и в контрольной группе.
500 - 404 331 - - 242 - - 190 - 147 111 - - - - п.н. п.н.
pUC19/ U M U M U M U M U pUC19/ M U M U M 1 2 3 4 5 6 7 MspI 6 MspI 1 2 3 4 Рис. 3. Электрофореграмма продуктов Рис. 4. Электрофореграмма продуктов метилспецифичной ПЦР промоторного метилспецифичной ПЦР промоторного региона гена RB1. региона гена P14ARF.
U – неметилированный аллель (172 п.н.);
U – неметилированный аллель (132 п.н.);
M – метилированный алелль (172 п.н.);
M – метилированный алелль (122 п.н.);
1 – геномная ДНК из лимфоцитов перифе- 1, 2 – геномная ДНК из ЦХ эмбриона с рической крови здорового индивида;
хромосомным мозаицизмом с метилиро 2 – геномная ДНК из лимфоцитов перифе- ванным и неметилированным аллелями;
рической крови, обработанная CpG- 3, 4 – геномная ДНК из ЭМ абортуса с метилазой M.SssI;
мозаицизмом и неметилированными ал 3, 4 – геномная ДНК из ЭМ медицинского лелями;
абортуса;
5 – геномная ДНК из лимфоцитов пери 5, 6 – геномная ДНК из ЭМ эмбриона с мо- ферической крови здорового индивида, заицизмом и метилированными аллелями;
обработанная CpG-метилазой M.SssI;
7, 8 – геномная ДНК из ЦХ эмбриона с мо- 6 – геномная ДНК из лимфоцитов пери заицизмом с неметилированным и метили- ферической крови здорового индивида.
рованным аллелями.
При исследовании характера метилирования гена CDKN2A с помощью ме тилспецифичной ПЦР у 22 из 36 эмбрионов контрольной группы (61%) были выявлены метилированные последовательности в составе экзона I. Для уточне ния эпигенетического статуса этого гена в плаценте нормально развивающихся эмбрионов нами были проведены дополнительные исследования. С помощью метилчувствительной ПЦР после предварительного гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой HpaII, метилированные аллели были выяв лены у всех 36 эмбрионов. Отличия между результатами исследования, полу ченными с помощью двух различных подходов, могут быть объяснены анализом 8 потенциальных сайтов метилирования (CpG-динуклеотиды) в составе экзона I в случае применения метилспецифичной ПЦР и только одного из этих 8 сайтов при использовании метилчувствительной ПЦР.
Имеются противоречивые данные относительно влияния метилирования последовательности экзона I гена CDKN2A на уровень его экспрессии. С одной стороны, сообщается о значимом снижении экспрессии гена при метилировании экзона (Huang et al., 2002;
Xue et al., 2004). С другой стороны показано, что ме тилирование CpG-динуклеотидов в составе экзона I ассоциировано с присоеди нением метилцитозин-связывающего белка MeCP2, запускающего каскад реак ций компактизации хроматина, однако это не препятствует транскрипции. Су щественное снижение транскрипции наблюдается только в том случае, если ме тилирование затрагивает промоторный регион, где наряду с присоединением Таблица 3. Профили метилирования генов контроля клеточного цикла у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом.
№ Цитотрофобласт хориона Экстраэмбриональная мезодерма Механизм Механизм возникновения возникновения статус метилирования статус метилирования Кариотип Кариотип мозаицизма эпимутаций RB1 P14 P15 P16exI RB1 P14 P15 P16exI 1 47,XY,+7/46,XY Митотическое Нарушение М/U М/U U/U М/U 46,XY М/М М/U U/U М/U (3:97) нерасхождение в ЦХ деметилирования 2 47,XX,+8/46,XX Митотическое Нарушение М/U М/U U/U М/U 46,XX М/U U/U U/U М/U (3:97) нерасхождение в ЦХ деметилирования 3 45,XY,-15/46,XY Анафазное Нарушение М/U U/U н/о М/U 46,XY М/U U/U н/о М/U (18:82) отставание в ЦХ деметилирования 4 47,XX,+16/46,XX 47,XX,+16/46,XX Коррекция Нарушение М/U U/U U/U М/U М/U U/U U/U М/U (52:48) (65:35) трисомии деметилирования 5 47,XY,+16/46,XY 47,XY,+16/46,XY Коррекция Аномальное метили U/U U/U U/U М/U М/U U/U U/U М/U (24:76) (5:95) трисомии рование RB1 в ЭМ 6 47,XX,+16/46,XX 47,XX,+16/46,XX Коррекция н/о U/U U/U U/U М/U U/U U/U U/U (74:26) (81:19) трисомии 7 47,XY,+16/46,XY 47,XY,+16/46,XY Коррекция Аномальное метили U/U М/U U/U М/U н/о U/U U/U М/U (67:33) (82:18) трисомии рование P14 в ЦХ 8 47,XX,+9/46,XX 47,XX,+9/46,XX Коррекция Аномальное метили U/U U/U U/U М/U М/U U/U U/U М/U (72:28) (60:40) трисомии рование RB1 в ЭМ 9 47,XX,+10/46,XX 47,XX,+10/46,XX Коррекция Нарушение М/U U/U U/U М/U М/М М/U U/U М/U (18:82) (30:70) трисомии деметилирования 10 47,XYY/46,XY Коррекция Аномальное метили М/U н/о н/о н/о 47,XYY U/U н/о н/о н/о (68:32) анеуплоидии в ЦХ рование RB1 в ЦХ Примечание: в скобках указано соотношение клеточных клонов в %, установленное с помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток;
н/о – не обследован;
M (Methylated) – метилированный аллель;
U (Unmethylated) – неметилированный аллель;
P14 – промоторный регион гена P14ARF;
P15 – промоторный регион гена CDKN2B (P15INK4B);
P16exI – экзон I гена CDKN2A (P16INK4A).
MeCP2 происходит деацетилирование гистонов и ремоделирование хроматина (Nguyen et al., 2001). Нами был проведен анализ характера метилирования про моторной области гена CDKN2A с помощью метилчувствительной ПЦР. У всех 36 эмбрионов контрольной группы были выявлены метилированные последова тельности. Таким образом, метилирование наблюдалось как в экзоне I, так и в промоторном регионе.
Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о значимости эпигенетической регуляции активности гена CDKN2A в плацентарных тканях.
Следует отметить, что в литературе имеются сообщения о метилировании ряда опухолесупрессорных генов (PTEN, RASSF1A) в плаценте человека на протяже нии нормально протекающей беременности (Chen et al., 2005;
Chiu et al., 2007).
Высказывается гипотеза, что такой эпигенетический статус генов может обеспе чивать необходимый инвазивный и пролиферативный потенциал клеток плацен ты (Chiu et al., 2007). Что касается гена CDKN2A, то его метилирование описано в 20,4% случаев пузырного заноса и в 40% хорионкарцином (Xue et al., 2004), а также у 14% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом (Park et al., 2008).
Однако, при анализе 10 плацент нормально развивающихся эмбрионов I триме стра беременности в одном из исследований (Xue et al., 2004), 5 плацент I-го и плацент III-го триместров в другой работе (Chiu et al., 2007) метилирования дан ного гена обнаружено не было. Необходимо отметить, что во всех этих работах на небольших по объему выборках анализировался исключительно экзон I и только с помощью метилспецифичной ПЦР. Что касается частоты метилирова ния последовательности из 8 CpG-динуклеотидов в составе экзона I гена CDKN2A у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, то в нашем ис следовании она составила 76% и статистически значимо не отличалась от соот ветствующего показателя (61%) в контрольной группе (p = 0,28).
Таким образом, информативными для анализа связи аберрантного метили рования генов клеточного цикла с возникновением мозаицизма оказались гены RB1 и P14ARF, эпимутации которых были обнаружены у 10 из 50 спонтанных абортусов с мозаичным кариотипом (табл. 3). Отсутствие или недостаток про теина pRB в клетке приводит к изменению уровня основных белков-регуляторов клеточного цикла (CDC20, MAD2, циклины B и E) и, как следствие, к появлению разрывов хромосом, мостов, анеу- и полиплоидии (Knudsen, Knudsen, 2006).
Кроме того, нарушение взаимодействий pRB c хроматин-ремоделирующими факторами (HDAC1-3, DNMT, BRC1) обусловливает дефекты центромерного гетерохроматина и нерасхождение хромосом (Gonzalo et al., 2005). Белковый продукт гена P14ARF связывает P53 и RB-зависимые пути регуляции клеточного цикла, препятствуя взаимодействию Mdm2 и pRB белков, что приводит к накоп лению последнего и остановке клеточного цикла. Уменьшение количества или полное отсутствие р14 приводит к снижению уровня pRB (Chang et al., 2007).
С целью определения характера связи между метилированием исследован ных генов и возникновением мозаицизма нами были изучены особенности рас пределения клеток с эпимутациями и с хромосомными нарушениями в произ водных различных зародышевых листков (трофэктодермы и эпибласта), обособ ляющихся в период имплантации бластоцисты и характеризующихся разной ди намикой установления метилирования. Геном клеток трофэктодермы подверга ется незначительному метилированию на постимплантационных этапах разви тия, тогда как уровень метилирования ДНК в производных эпибласта, из которо го впоследствии будут развиваться все эмбриональные структуры, существенно возрастает (рис. 1).
Известно, что анеуплоидия в эмбриональных клетках может являться след ствием нерасхождения гомологичных хромосом в гаметогенезе у родителей, ли бо возникать при митотическом делении соматических клеток зародыша. Однако появление мозаицизма всегда является результатом митотических ошибок на по стзиготических этапах развития. При этом если зигота имеет нормальный карио тип, то митотическое нерасхождение хромосом будет продуцировать два клона клеток – с трисомией и моносомией. Поскольку клетки с моносомией аутосом обычно не жизнеспособны, то в дальнейшем в организме будут присутствовать только два типа клеток - с нормальным кариотипом и с трисомией. Маркером митотического нерасхождения в этом случае будет являться невысокая доля анеуплоидного клона, ограниченного, как правило, одним типом ткани. Альтер нативным механизмом возникновения мозаицизма может являться анафазное от ставание хромосомы, приводящее к появлению моносомных клеток, что и было обнаружено в одном из обследованных нами случаев (№ 3, табл. 3).
В случае наличия трисомии в зиготе, мозаицизм может быть следствием анафазного отставания дополнительной хромосомы на постзиготических этапах развития. Этот механизм, известный как «коррекция трисомной зиготы» (Ka lousek, 2000), также приводит к формированию двух клеточных клонов – с три сомией и с нормальной хромосомной конституцией. Нерасхождение в случае трисомного кариотипа зиготы даст нормальный клеточный клон и тетрасомию, которая обнаруживается в эмбриональных клетках достаточно редко. Маркером коррекции выступает небольшой процент эуплоидных клеток, присутствующих в одном или в нескольких типах тканей. Однако частота таких клеток в опреде ленной степени зависит и от стадии развития, на которой произошла коррекция, а также от пролиферативной активности нормальных и анеуплоидных клеток.
В проведенном нами исследовании суммарная частота эпимутаций генов RB1 и P14ARF статистически значимо возрастала от 2,610-2 на аллель в группе спонтанных абортусов с высоким уровнем анеуплоидных клеток до 32,510-2 на аллель у абортусов с низким уровнем анеуплоидных клеток в обследованных тканях (p 0,05). Кроме того, эпимутации обнаруживались у абортусов с пре имущественной локализацией анеуплоидных клеток либо в экстраэмбриональ ной мезодерме, либо в цитотрофобласте хориона. При этом ни одного случая аберрантного метилирования промоторных регионов исследованных генов у абортусов с равномерным распределением анеуплоидных клеток в производных двух зародышевых листков зарегистрировано не было. Полученные данные сви детельствуют об ассоциации тканеспецифичного хромосомного мозаицизма с аномальным метилированием генов контроля клеточного цикла.
У эмбрионов с тканеспецифичными хромосомными нарушениями, ограни ченными цитотрофобластом (№ 1-3, табл. 3), возникновение мозаицизма было связано с ошибками митотической сегрегации хромосом на постимплантацион ных этапах дифференцировки трофэктодермы. При этом у всех зародышей ме тилирование RB1 было выявлено как в цитотрофобласте, так и в экстраэмбрио нальной мезодерме, что свидетельствовало о возникновении эпимутации еще до выделения трофобласта и внутренней клеточной массы, и, соответственно, до появления хромосомного нарушения. Поскольку обособление трофэктодермы и внутренней клеточной массы происходит во время имплантации бластоцисты на фоне гипометилированного состояния генома, полученные данные указывают на нарушение процесса деметилирования родительских геномов при эпигенетиче ском репрограммировании в преимплантационном периоде.
У 7 из 10 зародышей возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения до или после обособления цито трофобласта и экстраэмбриональной мезодермы. У эмбрионов с мозаичными трисомиями по хромосомам 16 и 10 в обеих тканях (№ 4 и № 9, табл. 3) метили рование промоторного региона гена RB1 также присутствовало в производных обоих зародышевых листков, что может свидетельствовать о потенциальной значимости такого эпигенетического статуса данного гена в механизме коррек ции трисомии. Ассоциация тканеспецифичного метилирования RB1 с коррекци ей анеуплоидии прослеживалась и для эмбрионов № 5, 8 и 10: у всех этих заро дышей метилированные последовательности были зарегистрированы в ткани с более интенсивными процессами коррекции трисомии, приводящими к значи мому увеличению частоты эуплоидных клеток, по сравнению с другой тканью.
При рассмотрении всех возможных случаев формирования мозаицизма за счет коррекции трисомии частота эмбрионов с метилированными последовательно стями RB1 в экстраэмбриональной мезодерме составила 27,8%, тогда как в цито трофобласте хориона – только 5,7% (p = 0,04). Полученные данные указывают на то, что метилирование промоторного региона гена RB1 у анеуплоидных зароды шей может являться одним из эпигенетических механизмов, который повышает шансы коррекции трисомии с восстановлением нормального числа хромосом.
При этом вероятность такого события оказывается выше для клеток производ ных внутренней клеточной массы, из которой впоследствии формируются все эмбриональные ткани. Не исключено, что подобный механизм может обеспечи вать выживание некоторой части зародышей с аутосомными трисомиями за счет коррекции анеуплоидии непосредственно в эмбриональных клетках на ранних этапах развития с формированием ограниченного плацентарного мозаицизма.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Настоящее исследование было направлено на оценку вклада аномалий эпи генетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального разви тия человека. Предпосылками к его проведению явились, с одной стороны, дан ные об интенсивных процессах эпигенетической реорганизации генома эмбрио нальных клеток на начальных этапах онтогенеза, а с другой стороны, отсутствие концепций, удовлетворительно объясняющих высокую частоту внутриутробной гибели зародышей с нормальным хромосомным набором. Исследование было сфокусировано на анализе изменчивости характера метилирования промоторных регионов генов, как одного из основных эпигенетических механизмов контроля их экспрессии. Предметом изучения явились импринтированные локусы генома, в регуляции экспрессии которых существенное значение отводится эпигенетиче ским механизмам, а также ряд генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла.
Исследование проводилось на выборке спонтанных абортусов, кариотип которых был установлен и верифицирован с использованием комплекса цитоге нетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических мето дов анализа. В работе были предложены подходы, позволяющие учитывать воз можность возникновения ошибок при проведении цитогенетического анализа клеток внутриутробно погибших зародышей человека, связанных с полиплоиди зацией эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro, а также с контаминацией культур клетками материнского организма. В то же время необходимо отметить, что у части спонтанных абортусов с нормальным кариотипом могут иметься микроструктурные аберрации хромосом, выявить ко торые с использованием стандартного метафазного анализа не представляется возможным. Согласно результатам исследований, выполненных с помощью мат ричной сравнительной геномной гибридизации, доля таких эмбрионов может со ставлять 4-5 % (Schaeffer et al., 2004;
Shimokawa et al., 2006).
Изменение баланса дозы родительских геномов вследствие наличия фено мена геномного импринтинга признается весомым фактором, нарушающим ран ние этапы онтогенеза млекопитающих. Вместе с тем, молекулярные и цитогене тические механизмы, приводящие к нарушению такого баланса в эмбриональ ном периоде развития человека, за исключением случаев пузырного заноса, до настоящего времени оставались практически неизученными. В настоящем ис следовании был проведен поиск ОРД у спонтанных абортусов с нормальным ка риотипом, однако ни одного случая ошибочного наследования хромосом выяв лено не было. При обобщении полученных данных с результатами аналогичных исследований было показано, что частота внутриутробно погибших эмбрионов с ОРД по хромосомам, несущим импринтированные гены, не превышает 0,5%.
Полученные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии заметного влияния ОРД на нарушение эмбрионального развития человека. Однако данный вывод не снимает вопроса о роли мутаций импринтированных локусов генома в этиологии нарушений эмбрионального периода онтогенеза.
Учитывая, что экспрессия импринтированных генов контролируется эпиге нетическими механизмами, в настоящей работе был проведен анализ дифферен циального метилирования ряда импринтированных локусов хромосом 11 и 15.
Впервые у эмбрионов с нарушениями клеточной пролиферации обнаружено ги пометилирование центра импринтинга KCNQ1OT1 на материнской хромосоме 11. Получены данные, свидетельствующие о возникновении эпимутаций на постимплантационных этапах развития. Принимая во внимания тот факт, что аналогичные эпимутации в локусе KCNQ1OT1 зарегистрированы практически у всех детей с синдромом Видемана-Беквита, родившихся в результате примене ния методов искусственного оплодотворения, результаты выполненного иссле дования подтверждают гипотезу о проявлении у потомства супружеских пар с репродуктивными проблемами скрытой генетической (или эпигенетической) из менчивости, несовместимой с нормальным развитием организма.