Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей hansenula polymorpha и pichia stipitis

на правах рукописи

СИБИРНЫЙ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧ Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013 1

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и микробиологии биолого-почвенного факультета Жешовского университета (Жешов, Польша)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович

Официальные оппоненты:

Азизбекян Рудольф Рубенович, доктор биологических наук, профессор., зав. лабораторией биологически активных соединений Федерального государственного унитарного предприятия Государственный НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Мартыненко Николай Николаевич, доктор биологических наук, Московский государственный университет пищевых производств, кафедра биотехнологии, профессор кафедры Тишков Владимир Иванович, доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, кафедра химической энзимоогии, профессор кафедры

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Защита состоится «29» октября 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды наряду с исчерпанием нефти ставит перед биотехнологией задачи разработки современных методов анализа токсичных продуктов и поиска возобновляемых источников энергии. Все процессы биотехнологии, химической технологии, мониторинга окружающей среды и многих пищевых технологий базируются на методах анализа хода процесса и качества конечного продукта. Эти проблемы во многом могут быть решены с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis.

Мониторинг среды, включающий контроль воздуха, сточных вод, пищевых продуктов, почвы и питьевой воды, приобретает все большее значение в программах улучшения условий жизни и питания человека. Среди множества методов все большее внимание уделяется новейшим биоаналитическим методам (Reshetilov et al., 2010;

Троценко, Торгонская, 2011). В них используются высокоспецифичные ферменты, а также биосенсоры на основе ферментов, микробных клеток, либо иных биоэлементов. Для внедрения биосенсорных методов анализа в широкую практику необходимы исследования по конструированию биоэлементов с оптимальными параметрами, включая создание ферментных и микробных сенсорных элементов с необходимыми биоаналитическими характеристиками.

Современный этап развития цивилизации в значительной степени зависит от успешной разработки новых технологий производства биотоплива, особенно, топливного этанола из непищевыых источников. В настоящее время этанол производится в больших количествах (79 млрд. л в 2009 г.), причем около 75% этого вещества используется в качестве топлива для двигателей внутреннего сгорания и лишь 15% - для приготовления крепких спиртных напитков. Бензин в настоящее время зачастую используется в смесях с этанолом, который может быть получен из биомассы растений, причем в странах ЕС с 2010 г. введено требование, согласно которому бензин должен содержать не менее 5,5% этанола (Monique et al., 2003). Известно также положительное влияние биотехнологического производства этанола на глобальный парниковый эффект. Сжигание такого этанола не приводит к дополнительной эмиссии СО2 в атмосферу (Lynd, 1996). В настоящее время топливный этанол получают из пищевого и кормового сырья (крахмал, сахароза). Поэтому конструирование штаммов, способных к эффективной конверсии в этанол гидролизатов растительной биомассы, состоящих, в основном, из глюкозы и ксилозы, имеет первостепенное значение для увеличения производства этого биотоплива. Важной задачей является также усовершенствование методов анализа этанола.

Метанол играет важную роль в качестве исходного сырья для химического синтеза.

Значительная его часть используется в процессе получения формальдегида, а также для производства синтетических смол и лавсана, биотоплива, а также в качестве добавки к бензину. Случайное потребление метанола приводит к слепоте, необратимым неврологическим нарушениям и даже к смерти (Medinsky еt al., 1997;

Skrzydlewska, 1999). В связи с высокой токсичностью метанола (Skrzydlewska, Farbiszewski, 1997;

Andrews et al., 1998) важное значение имеет определение его содержания в алкогольных напитках, биологических жидкостях, при контроле промышленных отходов.

Одна из крупнейших по масштабу химическая технология заключается в производстве различных пластмасс с применением формальдегида. Поэтому определение формальдегида и сопутствующего метанола очень важно для мониторинга окружающей среды и контроля многих промышленных товаров, медицинских препаратов, пищевых продуктов. Особенно высокий уровень формальдегида, как натурального метаболита, в ряде рыбных продуктов семейства тресковых (Sotelo et al., 1995), содержание которого в процессе хранения в замороженном состоянии его содержание может достигать от 210 до 780 мг на 1 кг сырой биомассы, что представляет собой серьезную токсикологическую проблему (Rehbein, 1995).

Большинство известных методов определения этанола, метанола и формальдегида недостаточно селективны и чувствительны, либо слишком дорогостоящие. Блдее перспективн энзиматические методы с использованием алкогольоксидазы, выделенной из штаммов-сверхпродуцентов H. polymorpha. Алкогольоксидаза, способная in vitro окислять метанол, алифатические спирты, включая этанол, имеет важное биотехнологическое значение. Другим ферментом H. рolymorpha, имеющим биоаналитичесое значение, является формальдегиддегидрогеназа. Этот фермент также использовался в диссертационной работе.

Для эффективного производства биоэтанола необходим поиск и генно-инженерное улучшение дрожжей, способных сбраживать до этилового спирта гидролизаты лигноцеллюлозы. Важнейшее значение имеет исследование метилотрофных дрожжей H.

polymorpha, которые могут сбраживать как глюкозу, так и ксилозу, а также P. stipitis, дикие штаммы которых по характеристикам ферментации ксилозы не уступают лучшим рекомбинантным штаммам Saccharomyces cerevisiae. Такие дрожжи представляют интерес для разработки процесса одновременного энзиматического гидролиза лигноцеллюлозы с последующей ферментацией образуемых сахаров до этанола. Штаммы с улучшенными параметрами ферментации лигноцеллюлозного сырья могут сделать этот процесс более рентабельным (Дмитрук и др., 2010).

Цель и задачи исследования. Целью работы было использование нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha для разработки новых ферментативных и биосенсорных методов анализа формальдегида, метанола и этанола в окружающей среде, продуктах питания, сыворотках крови, а также конструирование штаммов H. polymorpha и Рichia stipitis с увеличенной продукцией этанола. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Использование высокоочищенного фермента алкогольоксидазы (АО), полученного из клеток бескаталазного штамма метилотрофных дрожжей H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией синтеза АО для разработки ферментных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида.

2. Анализ этанола в алкогольных и безалкогольных напитках и соках при помощи разработанного алкогольоксидазно-пероксидазного (АОП) метода.

3. Использование АОП-метода и препарата рекомбинантной формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ) для определения содержания формальдегида в рыбных продуктах, метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах.

4. Разработка нового энзимо-химического метода определения одновременного содержания формальдегида и метанола для анализа стоков.

5. Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих на метанол, этанол и формальдегид, с применением ферментных препаратов, выделенных из селекционированных штаммов нетрадиционных дрожжей.

6. Получение мутантных форм АО H. polymorpha с пониженным сродством к этанолу, разработка амперометрических биосенсоров на основе природных и мутантных форм АО H.

polymorpha.

7. Биоаналитическое использование ФАДГ H. polymorpha в разработке ферментативных и клеточных биосенсоров для анализа формальдегида в вакцинах.

8. Конструирование рекомбинантных штаммов Pichia stipitis с увеличенной продукцией этанола при алкогольной ферментации лигноцеллюлозного сырья.

9. Изучение взаимосвязи между внутриклеточным пулом GSH, повышением продукции этанола и устойчивости к этанолу у рекомбинантных штаммов пекарских дрожжей S.

cerevisiae и метилотрофных дрожжей H. polymorpha.

Научная новизна исследования. В работе представлены примеры использования нетрадиционных дрожжей Н. рolymorpha и их мутантов – сверхпродуцентов ферментов (АО – алкогольоксидазы, ФАДГ – формальдегиддегидрогеназы), мутантных форм АО с уменьшенным сродством к субстратам, выделение ферментов и их биоаналитическое применение в ферментно-химических и биосенсорных методах анализа формальдегида, метанола и этанола в промышленных сточных водах, продуктах питания и вакцинах.

Представлены примеры конструирования рекомбинантных штаммов дрожжей Pichia stipitis и H. polymorpha с улучшенными параметрами алкогольной ферментации.

Разработан новый ферментно-химический метод одновременного анализа формальдегида и метанола в их смесях, в котором определение метанола осуществляется с участием АО в условиях химического «маскирования» формальдегида в реакционной смеси (добавление веществ, связывающих молекулы формальдегида, делает невозможным его реакцию с АО). Метод использован для анализа промышленных сточных вод и коммерческих препаратов формалина. Порог чувствительности метода для обоих аналитов составляет 1 мкМ, что в 3,2 раза выше по сравнению с традиционным химическим методом.

Показана возможность применения АО, пероксидазы хрена (ПО) и ФАДГ при анализе этанола в спиртосодержащих напитках, метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах, а также формальдегида в рыбных продуктах. Использование таких методов значительно упроститло процедуру анализа этанола, метанола и формальдегида по сравнению с традиционными способами.

Сконструирован новый прототип двухферментного амперометрического биосенсора с применением АО метилотрофных дрожжей и ПО, способного к анализу этанола, метанола и формальдегида. Биоселективный элемент создан путем электроосаждения двух ферментов в различных слоях с использованием катионных и анионных полимеров. Эффективная коммуникация между окисленной формой ПО и поверхностью рабочего электрода достигнута путем введения во внутренний слой, контактирующий с электродом, полимера, содержащего осмиевый комплекс. Преимуществами биосенсора являются быстрый ответ на аналит, высокая чувствительность и стабильность. Это дает возможность примениеия разработанной конструкции биосенсора также в исследованиях других ферментов (ФдДГ, мутантной АО), а также для практического использования биосенсоров в анализах соответствующих аналитов.

На основе селекции в среде с аллиловым спиртом впервые получены мутантные штаммы Н. рolymorpha СА2 и СА4 с пониженным сродством АО к этанолу. Проведено секвенирование мутантных аллелей структурных генов АО из мутантов Н. рolymorpha СА2 и СА4, идентифицированы точечные мутации в гене АОХ, которые приводят к уменьшению сродства фермента к субстрату. Изучены некоторые структурно-функциональные свойства мутантных форм АО. Разработана технология иммобилизации ферментов на поверхности рабочего электрода биосенсора. Показано, что биосенсор на основе мутантной формы АО обладает расширенным спектром линейного ответа на аналиты по сравнению с сенсором на основе АО дикого типа.

Оптимизированы условия культивирования рекомбинантного штамма H. polymorpha с повышенным синтезом термостабильной ФАДГ, выделен фермент из рекомбинантных клеток, изучены некоторые свойства очищенной ФАДГ. Удельная активность очищенных препаратов ФАДГ превышала активность коммерческих препаратов ФдДГ из Ps. putida.

Разработан ФАДГ-метод анализа формальдегида и показана возможность его использования в анализе сточных вод. Ферментативный метод на основе ФАДГ рекомендован к практическому использованию вместо химических методов, которые трудоемки, требуют дистилляции проб или дополнительных исследований (в случае содержания фенола).

Разработаны два типа селективных к формальдегиду амперометрических биосенсоров (ферментный и клеточный) с использованием зависимой от НАД+ и глутатиона ФАДГ, выделенной из рекомбинантных клеток дрожжей H. polymorpha, с высоким содержанием ФАДГ. Сконструированные биосенсоры использованы для анализа содержания формальдегида в промстоках и вакцинах (АДТ-М, антигеморрагическая вакцина кроликов, вакцина Imovax Polio). Установлена корреляция между результатами биосенсорного и химического определения.

Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей P. stipitis XYL1m9 с увеличенной продукцией этанола при ферментации ксилозы. В полупромышленной среде на основе кислотных гидролизатов опилок и отрубей штамм характеризовался существенным улучшением параметров алкогольной ферментации. Так, при ферментации гидролизатов пшеничных отрубей штамм продуцировал в 1,5 раза больше этанола по сравнению с дрожжами S. cerevisiae дикого типа. Использование смеси рекомбинантного штамма P.

stipitis и штамма дикого типа S. cerevisiae увеличивало синтез этанола в 1,6 раза по сравнению с параметрами ферментации рекомбинанта.

Рекомбинанты H. polymorpha с повышенным пулом внутриклеточного GSH в связи с гиперэкспрессией первого гена биосинтеза GSH, гамма-глутамилцистеинсинтетазы, или центрального регуляторного гена метаболизма серы MET4 (мультикопийная интеграция генов GSH2 и MET4) накапливали почти в два раза больше этанола при сбраживаении глюкозы по сравнению со штаммом дикого типа, тогда как штамм S. cerevisiae с повышенным внутриклеточным пулом GSH не увеличивал продукцию спирта.

Трансформанты S. сerevisiae, и H. polymorpha с повышенным пулом GSH более чувствительны к экзогенному этанолу, чем соответствующие штаммы дикого типа.

Практическое значение полученных результатов. Предложенные модификации ферментных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида с использованием АО и ФАДГ из мутантов - сверхпродуцентов этих ферментов использованы для анализа содержания этанола в винах, формальдегида и метанола в промышленных сточных водах, формальдегида - в рыбных продуктах. Показаны их преимущества по сравнению с традиционными химическими методами. Сконструированный биосенсор на основе АО использован для определения содержания метанола в промстоках.

Разработан новый ферментно-химический метод позволяющий определять метанол и формальдегид в смесях этих веществ и, в отличие от химических методов, не требует использования агрессивных химических веществ, прост в реализации и используется для контроля аналитов в промстоках и различных продуктах, содержащих формальдегид и метанол.

Показана возможность применения сконструированного двухферментного амперометрического биосенсора, содержащего АО и ПО с использованием раздельного электроосаждения двух ферментов в различных слоях, применением катионных и анионных полимеров для анализа метанола, этанола и формальдегида.

С использованием предложенного нами метода селекции мутантов дрожжей H.

polymorpha получены препараты АО с пониженным сродством к субстратам, которые иммобилизованы на поверхности трансдукторов амперометрических биосенсоров и показана возможность их применения для анализа этанола в широком диапазоне концентраций.

Сконструированные на основе рекомбинантного штамма H. polymorpha со сверхпродукцией термостабильной ФАДГ энзиматические и клеточные биосенсоры для анализа формальдегида использованы для определения содержания формальдегида в промышленных сточных водах и в сыворотках.

Рекомбинантные штаммы дрожжей Pichia stipitis XYL1m9 с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы и H. polymorpha с увеличенным внутриклеточным содержанием глутатиона перспективны для получения этанола из гидролизатов растительной биомассы и традиционного сырья.

Предложенные нами методы используются при анализе метанола и формальдегида в сточных водах фабрики по производству пластмасс в Пусткове (Польша), в учебном процессе на практических занятиях по биотехнологии и при выполнении дипломных работ во Львовском университете им. Ивана Франко (Украина) и Жешовском университете (Польша).

Основные положения, выносимые на защиту Нетрадиционные дрожжи Н. рolymorpha и их мутанты – сверхпродуценты АО и ФАДГ впервые использованы для анализа этанола и метанола в биогенных пробах (вино, пиво, соки, безалкогольные напитки), метанола и формальдегида в модельных растворах и промстоках, а также формальдегида - в пищевых рыбных продуктах.

Разработан и использован в аналитической практике новый ферментно-химический метод определения метанола и формальдегида в смесях этих веществ, основанный на применении химического анализа формальдегида с гидразоном 3-метил-2-бензотиазолина без АО и последующей реакции с участием АО, что позволяет определять общее содержание метанола и формальдегида в промстоках.

Разработаны новые типы амперометрических биосенсоров с использованием ферментов дрожжей Н. рolymorpha (АО, мутантная АО, ФАДГ) и осмий-содержащих катионных и анионных полимеров для получения быстрого отклика на аналит при высокой чувствительности и стабильности биосенсора. Сконструированные биосенсоры использованы для анализа метанола, этанола и формальдегида.

Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей XYL1m9 P. stipitis с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы и гидролизатов растительного сырья. Обнаружена способность рекомбинантных штаммов H. polymorpha с увеличенным внутриклеточным содержанием глутатиона к сверхсинтезу этанола в среде с глюкозой.

Работа выполнялась на кафедре Биотехнологии и микробиологии Биолого-почвенного факультета Жешовского университета (Жешов, Польша). Часть исследований проведена на основе Отдела молекулярной генетики и биотехнологии и Отдела аналитической биотехнологии Института биологии клетки НАН Украины (Львов, Украина), Института инжинерии окружающей среды Ченстоховского Технологического университета (Ченстохова, Польша), кафедры Технологии воды и сточных вод Свентокшыского Технологического университета (Кельце, Польша), Лаборатории аналитической химии – электроаналитики и сенсорики Рурского Университета (Бохум, Германия), кафедры Экологии микроорганизмов Брюссельского свободного университета (Брюссель, Бельгия).

Исследования выполнялись также в рамках международных научных грантов: KBN PO4B 003 23 «Новые ферментативные и биосенсорные методы анализа формальдегида, метанола и этанола в окружающей среде и клеточные системы детоксикации формальдегида», KBN N N302 1385 33 «Мутанты дрожжей Hansenula polymorpha с нарушенной катаболитной репрессией и их использование с целью конструирования сверхпродуцентов собственных и чужих белков с биотехнологическим значением», P-W CG „Interaction between glutathione and аlcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae and non conventional yeasts”.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на XXI Международном специализированном симпозиуме по дрожжам «Биохимия, Генетика, биотехнология и экология ннетрадиционных дрожжей» (Львов, Украина, 2001), на ХХII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам „Yeast Fermentations and other Yeast Bioprocesses” (Пиланесбург, ЮАР, 2002), на II Конгрессе по биотехнологии (Лодзь, Польша, 2003), на VI Международной конференции „Role of Formaldehyde in Biological Systems” (Печ, Венгрия, 2003), на Первом (Инаугурационном) Украинском Конгрессе по биологии клетки (Львов, Украина, 2004), на Украинско-Германском Симпозиуме по нанобиотехнологии "Current State and Prospects for Future Cooperation" (Киев, Украина, 2006), на II Украинско Польской Вайглевской конференции "Microbiology of the XXI century" (Варшава, Польша, 2007), на XII Международном Конгрессе по дрожжам (Киев, Украина, 2008), на III Украинско-Польской Вайглевской конференции «Микробиология на службе человека» (Одесса, Украина, 2009), на X Международной научной конференции “Risk factors of food chain” (Нитра, Словакия, 2010), на XXVIII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам „Metabolic and Bioprocess Engineering for Sustainable Development” (Бангкок, Таиланд, 2010), на IV Украинско-Польской Вайглевской конференции "От микробиологии к синтетической биологии" (Вроцлав, Польша, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ, среди которых 17 статей, в российских журналах, рекомендуемых ВАК, и в приравниваемых к ним периодических изданиях, входящих хотя бы в одну из библиографических баз цитирования (PubMed, Scopus, Web of Knowellege и др.), в том числе с международным импакт-фактором (IF);

монографии;

10 статей в других журналах и сборниках, а также 16 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 7 глав результатов исследований, выводов, списка литературы (361 источник). Основной текст диссертации изложен на 279 страницах, включая 69 рисунков и 13 таблиц.

Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в формулировании проблемы, постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов, в обобщении и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований В работе использовали следующие штаммы дрожжей:

Hansenula polymorpha 22 (leu 10) – штамм дикого типа.

Hansenula polymorpha 33 (leu 10 gcr1) – штамм, неспособный к конститутивному синтезу АО в среде с глюкозой.

Hansenula polymorpha 7-4A (GCR1 EAO) – штамм с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией и увеличенным конститутивным синтезом АО, полученный из Hansenula polymorpha 33 (leu 10 gcr1).

Hansenula polymorpha C-105 (gcr1 catX) – лишенный каталазной активности мутант метилотрофных дрожжей с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией (конститутивный синтез АО при росте на среде с глюкозой).

Hansenula polymorpha NCYC 495 – исходный штамм для получения зависимого от НАД+ и глутатиона сверхпродуцента ФдДГ.

Hansenula polymorpha 356 (линия DL1) – штамм дикого типа, исходный штамм для получения мутантов CA2 и CA4.

Hansenula polymorpha CA2 и CA4 – штаммы с уменьшенным сродством продуцируемой АО к субстратам (этанолу).

Hansenula polymorpha Tf 11-6 – сверхпродуцент ФАДГ.

Pichia stipitis PLU20 (ura3 leu2) – штамм, использованный в исследованиях по конструированию продуцента этанола.

Saccharomyces cerevisiae BY4742 (his3 leu2 lys ura3) (Euroscarf, Frankfurt) - штамм, использованный в исследованиях по конструированию продуцента этанола.

Перечень штаммов H.polymorpha и S. cerevisiae дикого типа и рекомбинантов с увеличенным уровнем внутриклеточного глутатиона представлен в соответствующих главах «Результатов исследований».

Условия культивирования. Клетки H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) культивировали до средней логарифмической фазы роста на качалке при постоянной аэрации в минеральной среде (г/л): КH2PO4 – 1;

(NH4)2SO4 – 3,5;

MgSO4 x 7H2O – 0,5;

CaCl2 – 0,1. Среда содержала дрожжевой экстракт „Difco” (0,2%) в качестве источника микроэлементов и витаминов.

Источником углерода служила 1% (в/о) глюкоза. Подробные условия культивирования микроорганизмов и среды приведены в соответствующих разделах работы.

Определение биомассы клеток. Биомассу клеток дрожжей (в мг/мл суспензии) определяли, измеряя оптическую плотность разведенных суспензий при 540 нм в 3 мм кювете.

Пермеабилизация клеток. Клетки дрожжей суспендировали в 50 мМ K, Na-фосфатном буфере, pH 7,5, содержащем 2 мМ ЭДТА (20-50 мг клеток/мл). К суспензии добавляли такой же объем дигитонина или цетилтриметиламмоний бромида (2 мг/мл). Смесь инкубировали на водяной бане при 30 oС в течение 15 мин. с встряхиванием через каждые 2-3 мин. По окончании пермеабилизации клетки трижды промывали соответствующим буфером.

Получение бесклеточного экстракта (БЭ). Выращенные клетки дрожжей промывали водой и K, Na-фосфатным буфером, pH 7,0. К осадку добавляли 50 мМ K, Na- фосфатный буфер с 2 мМ ЭДТА до получения конечной концентрации клеток 90 – 100 мг/л и ингибитор протеиназ 0,4 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF). К полученной суспензии в гомогенизационных стаканчиках добавляли стеклянные шарики (диаметром 0,45 – 0,50 мм) в количестве 3/4 выходного объема суспензии и замораживали. Клетки разрущали на планетарном гомогенизаторе в течение 5 мин. (1000 об./мин.) при +4 оС. Гомогенизат центрифугировали (20 мин, 15000 об./мин, +5 оС). Супернатант использовали для дальнейших определений.

Определение содержания белка. Концентрацию белка в бесклеточных экстрактах определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Определение активности оксидаз. Активность оксидаз определяли на основе количества перекиси водорода, образуемого в течение 1 мин. в пересчете на 1 мг белка или клеток.

Перекись водорода анализировали фотометрически, измеряя количество окрашенного продукта окисления о-дианизидина в присутствии пероксидазы (Сибирный и др., 1987).

Определение активности алкогольдегидрогеназы (АдГ). Активность алкогольдегидрогеназы определяли по продукции НAДH, измеряя прирост оптической плотности при длине волны 340 нм (Steinman, Jakoby. 1967).

Определение активности формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ). Активность глутатион-зависимой ФАДГ определяли спектрофотометрически на основе скорости образования НАДН при длине волны 340 нм (Schutte et al., 1976).

Определение активности пероксидазы (ПО). Активность ПО определяли путем измерения количества образованного окрашенного продукта окисления о-дианизидина при длине волны 525 нм.

Единицы определения активности ферментов, формула расчетов. Удельная активность ферментов приведена в микромолях субстрата (продукта) использованного (образованного) в течение 1 мин в перерасчете на 1 мг белка или сухой массы клеток в стандартных условиях реакции (мкмоль.мин-1.мг-1). Если не указаны другие, специальные условия, инкубацию реакционной смеси проводили при 30 oС в водяной бане или в термостатированной кювете спектрофотометра.

Определение формальдегида и метанола в промышленных стоках с использованием АО и 4-амино-5-гидразино-3- меркапто-1,2,4-триазола (АГМТ). В опытах использовали АГМТ и параформ „Sigma". Препарат АО получали из БЭ H. polymorpha C-105. Образцовый раствор формальдегида (1 моль/дм3) получали путем гидролиза параформа в течение 4 часов при 105 °C в герметично запаянных ампулах. В качестве стандартного раствора метанола использовали реактив фирмы „Merck” с концентрацией 0,25 мМ. Анализ формальдегида проводили в соответствии с предложенной нами методикой (Bie et al., 1999).

Одновременное определение содержания метанола и формальдегида с использованием АО и гидразона 3-метил-2-бензотиазолинона (МБТГ) проводили в соответствии с разработанным нами методом (Sibirny et al., 2008).

Анализ содержания этанола с использованием АдГ проводили в соответствии с методикой фирмы „Boehringer Mannheim“.

Определение содержания этанола в алкогольных напитках проводили, добавляя вместо раствора этанола 0,1 мл пробы алкогольного напитка в соответствующем разведении.

Анализ содержания этанола с алкогольоксидазой и пероксидазой (метод АОП).

Содержание этанола АОП-методом проводили согласно методике Гончара (Гончар и др., 1994а).

Определение содержания этанола в соках и плодово-ягодных винах проводили с использованием аналитического набора «Алкотест» по методу (Gonchar et al., 2001;

Sibirny et al., 2010).

Биосенсорные методы анализа этанола.

Разработка амперометрического биосенсора на основе алкогольоксидазы.

Ферментативный биосенсор конструировали на основе стандартного амперометрического потенциостата с использованием трех электродов: серебряно-хлорсеребряного электрода сравнения Ag/AgCl/KCl (3 M), дополнительного электрода и рабочего электрода.

Амперометрические исследования проводили с использованием биопотенциостата (ЕЗ 30, „Biometra”, Геттинген, Германия), соединенного с компьютером для регистрации и обработки результатов. Рабочим электродом служил графитовый стержень (RW диаметром 3,05 мм, „Ringsdorff Werke”, Бонн, Германия), находящийся в стеклянной трубке, герметично залитый эпоксидной смолой.

Формирование чувствительной мембраны. Чувствительную мембрану формировали путем иммобилизации АО H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) в слое катодного полимера CP59, синтезированного в Лаборатории аналитической химии – электроаналитики и сенсорики Рурского университета (Бохум, Германия. На поверхность рабочего электрода наносили мкл суспензии AO (200 Ед./мл с удельной активностью 25 Ед./мл), pH 7,6. После высыхания суспензии АО наносили 40 мкл раствора полимера CP59 методом электроосаждения.

Иммобилизация происходила в результате копреципитации молекул белка и полимера CP59.

Формирование амперометрического АОП биосенсора. Двухслойный биферментный элемент биосенсора формировали как описано (Гончар и др., 2006).

Ферментативное определение формальдегида.

Определение формальдегида методом АОП. Образцовый раствор формальдегида получали путем гидролиза параформа. В дальнейшем анализ проводили в соответствии с методикой определения этанола с той разницей, что добавляли 5-кратную концентрацию ферментов.

Определение содержания формальдегида в рыбе проводили в соответствии с описанными методами (Sibirny et al., 2011).

Использование электрохимического биосенсора для определения метанола в промышленных сточных водах осуществляли согласно разработанной нами методике (Bie et al., 1999).

Выделение из мутантов дрожжей Hansenula polymorpha AO c пониженным сродством к субстратам проводили по предложенному методу (Dmytruk et al., 2007).

Определение аминокислотных последовательностей проводили с применением программ MultAlin и BOXSHADE 3.21. Последовательности нуклеотидов AO штамма дикого типа H. polymorpha (DL-1-356), мутантных аллелей CA2 и CA4 депонированы в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США под номерами AM690088, AM690089 и AM690090.

Выделение, очистку и биотехнологическое использование ФАДГ осуществляли в соответствии с нашими разработками (Demkiv et al., 2007).

Конструирование рекомбинантного штамма дрожжей Рichia stipitis с улучшеной алкогольной ферментацией ксилозы и изучение его свойств проводили по описанным методикам в (Дмитрук и др., 2010).

Изучение алкогольной ферментации у диких и рекомбинантных штаммов H.

polymorpha и S. cerevisiae и методы их конструирвания проводили в соответствии с нашими методиками (Grabek-Lejko et al., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка ферментативных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида.

Наряду с химическими и физико-химическими методами все большее значение приобретают ферментативные методы определения спиртов и альдегидов. Ферментативный метод определения этанола был известен еще в пятидесятых годах прошлого века. Этот метод основан на окислении этанола до уксусного альдегида при помощи алкогольдегидрогеназы (АДГ). В этой реакции образуется НАДН, который определяется фотометрически при 340 нм:

CH3CH2OH + НАД+ CH3CHO + НАДH(H+) Применяемые до сих пор методы, использующие другой фермент – альдегиддегидрогеназу (АдДГ), имеют ряд недостатков, которые были частично устранены в наших исследованиях. Альтернативой методу дегидрогеназного анализа этанола является использование алкогольоксидазы (АО) метилотрофных дрожжей, которая в качестве кофермента содержит крепко связанный с белком ФАД. Катализируемая АО реакция необратима. Способность АО к образованию перекиси водорода в присутствии спиртов, в том числе этанола, используется для количественного определения спиртов:

СН3СН2ОН + О2 СН3СН=О + Н2О2.

На этой реакции основано аналитическое использование АО в наборах по определению этанола и других спиртов, в которых анализируется количество образуемой перекиси водорода. Существуют различные колориметрические методы определения этанола с использованием АО. В Институте биологии клетки АН Украины разработаны и запатентованы новые, чувствительные методы количественного определения перекиси водорода (метод АОП), что послужило основой для использования в диагностическом наборе «Алкотест»:

Oксидаза + O AH2 A + H2 O Субстрат оксидазы Окисленный субстрат Пероксидаза SH2 + H2O2 S + 2 H2O.

Хромоген Свободная или генерированная Краситель В наши задачи входила оптимизация методики АОП определения этанола в пробах алкогольных и безалкогольных напитков, разработка новых методов анализа формальдегида, метанола, а также смеси различных аналитов с использованием АО H. polymorpha.

1.1. Анализ этанола в плодово-ягодных винах, напитках и соках. Использован АОП метод на основе аналитического набора «Алкотест» и его модификация в виде метода стандартных добавок для количественного определения этанола в ряде плодово-ягодных вин, безалкогольных напитков и соков. В опытах использовали АО, полученную из мутанта H. polymorpha C-105 (gcr1 catX). Набор «Алкотест» был ранее применен для анализа содержания этанола в пиве, вине, крепких напитках. Анализ содержания этанола проведенный тремя методами: газо-жидкостной хроматографией, методом с алкогольдегидрогеназой (набор фирмы ”Sigma”, США) и алкогольоксидазой (набор „Алкотест”) показал высокую корреляцию всех трех методов (r0,98).

На рис. 1 и рис. 2. представлено содержание алкоголя в плодово-ягодных красных и белых винах, соответственно, в зависимости от их разведения. Как видно из этих данных, не выявлено существенного отрицательного влияния химического состава вина на расчитанное содержание алкоголя, так как в случае Вино земляничное „Special” Wino poziomkowe "Specjal" / Wild strawberry wine "Special" меньшего разведения, когда можно было Вино вишневое „Special” Wino wisniowe "Special" / Cherry wine "Special" Вино вишневое „Cezar” Wino wisniowe "Cezar" / Cherry wine "Cezar ожидать наибольшего отрицательного Вино земляничное „Waldwein” Wino poziomkowe "Waldwein" / Wild strawberry wine "Waldewein" 110 Вино клубничное „Beczka truskawkowa” Wino "Beczka truskawkowa" / Wine "Beczka truskawkowa" влияния компонентов напитков на ход ферментативного определения, эти концентрации почти не уменьшаются во всех Stezenie / Concentration (g/l) Концентрация, г/л исследованных пробах. Наоборот, наблюдается уменьшение рассчитанного количества этанола по мере разведения.

Рис. 1. Определяемая концентрация этанола в красных плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб 400 600 800 1000 1200 Разведение Rozcienczenie / Dilution Это может быть следствием ошибки при малых значениях оптической плотности в разведенных пробах с очень низким содержанием этанола.

Вино „Nalewka babuni” (Бабушкина наливка) Wino "Nalewka babuni" / Wine "Nalewka babuni" Вино персиковое „Canelli” Wino brzoskwiniowe "Canelli" / Peach wine "Canelli" Вино „Lipa z miodem” (Липа с медом) Wino "Lipa z miodem" / "Lime and honey" wine Stezenie / Concentration (g/l) Концентрация, г/л Рис. 2. Определяемая концентрация этанола в белых плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб 400 600 800 1000 1200 Разведение Rozcienczenie / Dilution В дальнейшем был проведен анализ содержания алкоголя в изучаемых пробах газовой хроматографией (ГХ), которая показала незначительные различия данных о концентрации этанола по сравнению с результатами, полученными ферментативным методом. Содержание этанола, определенное ГХ, в пробах плодово-ягодного красного и белого вин составляло, соответственно, 8,52% и 9,02 %, тогда как в модификации Метода стандартных добавок (МСД) для красного вина составляло 9,94%, a для белого - 8,63% (таблица 1). В таблице приведены все использованные методы определения концентрации этанола в красных и белых плодово-ягодных винах.

Таблица 1. Определение этанола в плодово-ягодных винах различными методами Содержание этанола, % Разница Вино Метод Газовая Стандарт- Стандарт стандартных хромато ный метод ный АОП- MСД-ГХ добавок графия АОП ГХ Метод (MСД) (ГХ) Вино персиковое 9,80+0,50 8,63+0,43 9,02+0,11 +0,72 -0, „Canelli” Вино земляничное 9,22+0,46 9,94+0,53 8,52+0,11 +0,70 +1, „Specjal” Для определения содержания этанола в соках и безалкогольных напитках с целью увеличения чувствительности метода проводили анализ с применением 5-кратно увеличенного содержания ферментов. При использовании классического варианта метода АОП, линейность калибровочной кривой сохранялась до концентрации аналита 0,9 г/л. При 5-кратном увеличении содержания ферментов (АО и ПО) в реакционной смеси отмечалось также 5-кратное увеличение наклона калибровочной кривой (8,02 по сравнению с 1,61), что можно было ожидать на основании прекращения ферментной реакции на этапе 5 - 10% аналита. При использовании такого варианта метода обнаруживались следовые количества алкоголя, что не представляется возможным при использовании стандартной методики.

Следовательно, этот вариант метода, несмотря на использование большего количества ферментов, в 5 раз более чувствителен (таблица 2).

Таблица 2. Содержание этанола в соках и безалкогольных напитках, определенное стандартным методом АОП и с использованием 5-кратной концентрации ферментов Соки и безалкогольные напитки Клубничный Яблочный Малиновый Пиво напиток сок „Fortuna” сок „Karmi” безалкогольное „Cappy” „TESCO” Содержание этанола – стандартный метод 0,035+0,003 0,024+0,002 0,009+0,001 0,005+0, АОП (%) Содержание этанола с 5-кратной 0,068+0,004 0,043+0,003 0,022+0,002 0,049+0, концентрацией ферментов (%) Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования метода АОП для анализа этанола в алкогольных и безалкогольных напитках, соках и вине. Использование этого метода облегчает анализ этанола по сравнению с традиционными методами рефрактометрическим и ареометрическим.

2. Энзиматическое определение формальдегида (ФА) в рыбных продуктах с использованием АО и ФАДГ.

Высокая токсичность ФА вызывает необходимость его контроля в окружающей среде, промышленных продуктах, медицинских препаратах, а также в некоторых продуктах питания. Особенно высок уровень ФА в некоторых рыбных продуктах. В тканях мороженной морской рыбы определенных видов при неглубокой заморозке (tо -30 оС) в результате эндогенных метаболических реакций образуются высокие концентрации формальдегида, что приводит к ухудшению вкусовых качеств пищевых продуктов и даже к отравлению. Мясо рыбы становится сухим, жестким, что объясняется денатурацией белков мышц. Такие процессы наиболеее характерны для рыб семейства тресковых (Gadidae) – трески (Gadus morhua), сайды (G. virens), пикши (G. aeglefinus), мерлана (G. merlangus), хека (Merluccius sp.) или мерлузы (Merluccius sp.). Содержание ФА в такой рыбе может достигать 210 и даже 780 мг на 1 кг массы. ФА наряду с диметиламином (ДМА) являются продуктами одной и той же реакции энзиматического разложения природного компонента многих видов рыбы – N-окись триметиламина (ТМАО):

(СH3)3N+-O- (CH3)2NH + CH2O.

ТМАО ДМА ФА ТМАО вместе с бетаином (СН3)3N+-CH2-COO- играют важную роль в регуляции осмотического давления в клетках морских рыб. Следует отметить, что потребление замороженных рыбных продуктов, в частности, рыбы семейства тресковых (Gadidae) с высоким уровнем ФА приводит не только к быстрому снижению пищевых и органолептических качеств рыбной продукции, но и к токсическому влиянию ФА на организм человека.

Ниже представлены результаты применения двух разработанных ферментных методов для анализа ФА в рыбных пищевых продуктах. В обоих методах использованы сконструированные продуценты ферментов. Один из методов основан на использовании АО и пероксидазы (метод АОП) тогда как во втором методе используется рекомбинантная дрожжевая NAD+ - и глутатион-зависимая формальдегиддегидрогеназа (ФАДГ). Оба фермента выделены из клеток H. polymorpa: мутанта С-105 (gcr1 catX) со сверхпродукций АО и рекомбинантного штамма Т-11-6 гиперэкспрессией гена FLD1, кодирующего ФАДГ.

Также была показана возможность использования АО для ферментативного анализа ФА в сточных водах даже в присутствии природного субстрата АО – метанола. Изучали возможность использования обоих ферментов, АО (с пероксидазой) и ФдДГ для анализа ФА в рыбных продуктах. В опытах использовали образцы мороженной рыбы семейства тресковых (Gadidae) (хек, треска), которые чаще всего продаются на европейском рынке, а также свежего (немороженного) карпа. Полученные результаты сравнивали с данными четырех химических методов: Нэша и методов с использованием хромотроповой кислоты, 4 амино-3-гидразино-5-меркапто-1,2,4-триазола (Purpald) и MБТГ.

На рис. 3 представлены калибровочные кривые для двух энзиматических методов по сравнению с лучшими химическими методами. Из данных следует, что АОП-метод имеет максимальную чувствительность: наклон соответствующей калибровочной кривой равен 59,3, что соответствует милимолярной экстинкции образованного окрашенного продукта (в мМ-1. см-1). Действительно, наблюдаемое значение наклона – это милимолярная экстинкция исчезновения (мM), умноженная на коэффициент преобразования для ферментативной реакции (к): наклон = мM к. Величина мM для окисленного ТМБ равна 81,7 мМ-1 см-1.

Таким образом, коэффициент преобразования аналита для АОП-метода при использованных экспериментальных условиях составляет 72,6%. Для ФАДГ- метода, коэффициент преобразования аналита составляет 32,9%, предполагаемая милимолярная экстинкция для НБТ-формазана равна 10,2 мМ-1 см-1 при 570 нм в кислой среде (собственные данные).

Рис. 3. Сравнительный анализ различных методов определения 1) AOP АОП 0,9 1 2) MBTH МБТГ ФА: АО-пероксидазный (АОП), 3) Purpald Пурпальд 0, метод с использованием 4) chromotropic acid Хромотроповая кислота 5) Nash's Нэш «Пурпальда», метод Нэша, метод Оптическая плотность 0,7 6) FdDH-based ФдГ с использованием МБТГ 0, Optic density (гидрохлорид 3-метил-2-бензо 3 тиазолин гидразона), метод с 0, 2 использованием хромотроповой 0, кислоты и формальдегид 0, дегидрогеназный метод (ФАДГ).

1 - Наклон 59.34;

R 0. Slope 2 - Наклон 24.92;

R 0. Slope Наклон калибровочных кривых 0,2 3 - Наклон 23.33;

R 0. Slope 4 - Наклон 9.88;

R 0. характеризует чувствительность Slope 6 5 - Наклон 4.46;

R 0. 0,1 Slope методов. Значения наклона и 6 - Наклон 3.36;

R 0. Slope 0, коэффициенты линейной 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0, регрессии показаны для каждой Концентрация ФА в реакционнойmixture,мМ FA concentration in reaction смеси, mM калибровочной кривой.

Линейность калибровочной кривой для АОП-метода сохранялась даже при высокой оптической плотности - до 0,9 что соответствует 15 мкМ ФА в реакционной смеси (15 нмоль на 1 мл), и порог чувствительности метода составлял около 0,8 нмоль/мл. Эти аналитические параметры наилучшие по сравнению с четырьмя химическими методами, даже с использованием MБTГ или Пурпальдa.

Метод на основе ФАДГ показывает линейность (при ферментативной конверсии более 33%), по крайней мере до 100 мкМ ФА, и его чувствительность, близкую к методу Нэша (наклоны 3,36 и 4,46, соответственно). Метод на основе использования ФдДГ почти в 18 раз менее чувствителен по сравнению с АОП-методом. Аналитические параметры предлагаемых ферментативных методов и известнымх химических методов представлены в таблице 3.

На основании анализа данных можно сделать вывод о том, что АОП-метод и метод с использованием MБТГ имеют наилучшие характеристики. АО может катализировать окисление только ФА, хотя распознает первичные спирты, в первую очередь, метанол и этанол. Принимая во внимание отсутствие спиртов в тканях рыб, можно заключить, что лучше всего для определения ФА в рыбных продуктах подходит АОП-метод по сравнению с анализом этого альдегида методом с использованием MБТГ. Чтобы проверить обоснованность предлагаемых энзиматических методов для анализа ФА в рыбных продуктах, была проанализирована мышечная ткань образцов, взятых из замороженного хека и трески.

Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5. Было выявлено, что проанализированные образцы хека и трески, содержат высокие концентрации токсичного ФА, до 100 мг/кг влажной массы ткани. Как можно было предвидеть, содержание ФА в мышцах карпа ничтожно мало. Данные, представленные в таблице 4, показывают существенное различие между содержанием ФА при его определении различными методами. Для сравнения надежности действия обоих ферментных методов и оценки возможного интерферирующего влияния химического фона реальных образцов на результаты анализов, было проанализировано содержание ФА в ТХУ-экстрактах с помощью традиционной методики (с внешней калибровкой), а также с использованием метода стандартных добавок (МСД). Одновременно, содержание ФА было проанализировано двумя химическими методами (с использованием хромотроповой кислоты и MБТГ).

Таблица 3. Биоаналитические характеристики различных методов анализа формальдегида Лимит Диапазон Стабиль- Время max,, -1 - Метод определения, линейности, ность анализа, нм мM cм мкM мM цвета, ч мин МБТГ 670 65,0 0,9 0,0025-0,015 Химический Хромотроповая 578 15,7 2,5 0,005-0,05 кислота Пурпальд до 0, 548 28,2 1,5 - Метод Нэша до 0, 400 4,4 6,9 10,2 (3, Ферментативный при 8,9 На основе ФАДГ 570 0,01-0,06 неполной конверсии) ФАДГ и до 0,1 500 11,0 1,7 Диафораза 0,001-0,015 На основе AOП 450 59.3 0,80 Как видно из таблицы 4, существует хорошая корреляция между всеми аналитическими данными, полученными в МСД-варианте методики, в отличие от результатов, полученных в традиционном варианте с внешней калибровкой. Это явление можно объяснить интерферирующим влиянием некоторых компонентов, которые совместно экстрагировались ТХУ из тканей рыб. Данное предположение подтверждается данными, полученными методом на основе ФАДГ (рис. 4).

Таблица 4. Результаты определения ФА (в мг на 1 кг влажной массы мышечной ткани) в безбелковых экстрактах рыбы с использованием трех различных методов: на основе АО, метода Нэша и реактива «Пурпальд» Рыба Хек Треска Карп Метод На основе АО 90,02,6 74,11,1 0, Mм Нэш 121,60,9 96,83.1 0, Mм «Пурпальд» 100,61,6 59,73,1 0, Mм Рис. 4. Метод стандартных добавок 0,25 для определения ФА с использованием A=0.0015 +/- 0. ФдДГ- метода. Кривая 1 соответствует B=2.951 +/- 0. 0, калибровочному методу, проведенному R=0.999 +/- 0. 3для водных растворов ФА (внешняя обычная калибровка);

кривые 2 и 0, соответствуют методу стандартных A добвок (ФА добавляли в различных концентрациях к растворам 0, анализируемых проб). На рисунке 2 представлены некоторые Dilution: 20 Dilution: Разведение: 20 Разведение: 0, статистические данные: параметры A=0.056 +/- 0.001 A=0.020 +/- 0. B=1.821 +/- 0.012 B=1.942+/- 0. линейной регрессии (коэффициенты R=0.999 +/- 0.001 R=0.989 +/- 0. уравнения Y=A+BX, где Y – оптическая плотность, Х – -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0, [FA] added, mM концентрация ФА (мМ), А – оптическая Добавленный ФА, мМ плотность для проб без добавления экзогенного ФА, и В – значение наклона);

R – коэффициент линейной регрессии.

Наклон калибровочных кривых, выполненных при анализе экстрактов ткани рыбы, зависит от фактора разведения: чем больше разведение, тем сильнее наклон (меньше интерферирующее влияние). Для внешней калибровки (без наличия фона реального образца, что соответствует бесконечному разбавлению), наклон был наибольшим: 2,95 по сравнению с 1,94 (60-кратное разведение образца) и 1,82 (20-кратное разведение). Для АОП-метода, подобно как и для химических вариантов, не выявлена существенная разница между традиционным и MСД-вариантом анализа.

Рыбные продукты являются важным источником пищевого белка. Рыба семейства тресковых (Gadidae) занимает в рейтинге второе место по размеру промышленного улова после семейства сельдевых рыб (Clupeidae), занимающих первое место, но последние чаще используются в сельском хозяйстве и промышленности, тогда как тресковые более предпочтительны в качестве продуктов питания.

Таблица 5. Результаты определения ФА (в мг на 1 кг влажной массы мышечной ткани) в безбелковых экстрактах рыбы хек при использовании четырех различных методов:

на основе ФдДГ, АО, МБТГ и хромотроповой кислоты Метод стандартных Стандартная Метод добавок (МСД) методика На основе ФдДГ 101,83,2 64,38, Mм (p0,05)* На основе АО 95,33,7 98,03, Mм (p0,05)** МБТГ 104,35,6 106,47, Mм (p0,05)** Хромотроповая кислота 100,51,2 102,87, Mм (p0,05)** *Разница между стандартной методикой и МСД статистически достоверна;

**Разница между стандартной методикой и МСД статистически недостоверна.

Итак, показана возможность успешного применения ферментных методов анализа ФА (с использованием АО и ФАДГ) в пищевых рыбных продуктах. Были разработаны оптимальные методики для проведения определений, а аналитические параметры ферментных методов сравнивали с соответствующими параметрами нескольких химических методов. Показана корреляция результатов анализа для обоих ферментных методов по сравнению с химическими методиками, хотя анализ на основе АО более предпочтителен благодаря его высокой чувствительности, хорошей линейности, устойчивости к интерферирующему влиянию компонентов анализируемых проб и возможности использования без предварительной обработки образцов, а также отсутствию агрессивных реагентов.

АОП метод может быть использован для определения формальдегида в замороженной рыбе семейства тресковых - треска, хек, и другие. Полученные результаты свидетельствуют о высоком содержании данного токсиканта в исследованных образцах рыбы, что указывает на необходимость постоянного мониторинга этого параметра при оценке качества пищевых продуктов.

3. Использование энзимо-химического метода для определения содержания формальдегида и метанола в промышленных сточных водах.

В данном разделе описан новый ферментно-химический метод для одновременного определения метанола и формальдегида в смеси обоих соединений, основанный на окислении метанола в формальдегид, опосредованного алкогольоксидазой (АО), с последующим определением образованного формальдегида при помощи 3-метил-2 бензотиазолидингидразона (MБТГ). Содержание ранее присутствовавшего в пробе ФА определяется без воздействия АО на исследуемые образцы.

В аэробных условиях при 20 оС для разложения формальдегида требуется около 30 часов, в анаэробных - 48 часов. ФА конденсируется с аминами в воде, образуя уротропин. ФА классифицирован в качестве токсичного, едкого и канцерогенного вещества (категория 3).

Среди новых аналитических подходов предложены ферментативные и биосенсорные методы, которые могут получить широкое распространение при наличии доступных, стабильных и дешевых ферментов с требуемой селективностью.

Использование АО для ферментного определения метанола и формальдегида (в пробах, содержащих оба вещества) не создает проблем для образцов, которые не содержат других субстратов АО, например, таких как этанол. Однако, стандартное использование такого метода для проб, содержащих как метанол, так и формальдегид, невозможно, так как АО окисляет оба субстрата. Для предотвращения спонтанной полимеризации ФА, в промышленности применяется метанол, содержание которого в техническом формалине составляет 4–8%. Мы показали возможность использования АО для ферментативного анализа ФА в сточных водах и даже в присутствии природного субстрата АО – метанола.

Для одновременного анализа метанола и формальдегида разработан оксидазно химический метод с использованием АО и селективного реагента для альдегида - MБТГ.

Метод основан на окислении метанола в ФА, катализируемого АО и на последующей колориметрической реакции полученного продукта - ФА с использованием селективного реагента для альдегида (MБТГ). Формальдегид, присутствующий в образце, определяется посредством колориметрической реакции с MБТГ, без воздействия АО на исследуемые пробы (CD0) в реакции:

FeCl [CH2O]0 + MБТГ [MБТГ-CH2O]0 цианиновый краситель, (CD0), азин (max=670 нм) а содержание метанола определяется по образованию окрашенного продукта (CD) после предшествующей реакции окисления метанола с участием АО:

МБТГ AO FeCl CH3OH + O2 [CH2O] [MБTГ-CH2O] CD.

-H2O Метанол в присутствии АО окисляется до формальдегида:

АО CH3OH + O2 H2C=O + H2O2.

В присутствии MБТГ и АО, формальдегид вступает в реакцию с MБТГ образуя азиновый аддукт, что предотвращает окисление формальдегида АО. Таким образом, MБТГ в предложенном методе играет двойную роль: действуя как химическая ловушка - агент, маскирующий наличие формальдегида, а также в качестве субстрата для следующей реакции формальдегида с Fe (III), в которой образовавшийся азиновый аддукт преобразуется в цианиновый краситель тетраазопентаметиновой природы.

С целью доказательства надежности предлагаемого ферментно-химического метода одновременного определения метанола и формальдегида в смеси, были подготовлены образцовые растворы, содержащие анализируемые соединения отдельно и в смеси.

Проверена способность образования цветных продуктов с MБТГ в присутствии ионов Fe3+ без добавления АО, а также в присутствии этого фермента на первом этапе реакции. На рис.

5 показана связь между оптической плотностью реакционной смеси и концентрацией аналитов без добавления АО.

На основании этих данных можно сделать вывод, что только формальдегид (кривая А) образует окрашенный продукт с МБТГ в отсутствие АО, но ни метанол, ни муравьиная кислота не образуют (кривые B и C, соответственно). Добавление этого фермента в первой стадии реакции, в присутствии MБТГ, приводит к окислению метанола в формальдегид, который образует окрашенный продукт (рис. 6). Очень схожие результаты этих значений указывают на практически полное окисление метанола до формальдегида в реакции, катализируемой АО. Как видно, АО может окислять, кроме метанола, также формальдегид с образованием муравьиной кислоты, которая не образует окрашенного продукта в реакции с ионами железа (III) (см. рис. 4.14, кривая C).

А 0, Рис. 5. Зависимость оптической - formaldehyde (А) - формальдегид (А) 0, A - метанол (В) (B) - methanol плотности от концентрации - формиат (С) - formate (C) аналитов (без добавления АО).

0, Положительную цветную 0, реакцию в системе "метанол + B, C MБТГ+ АО" + Fe3+” (рис. 6) 0, можно рассматривать как 0 5 10 15 [Analyte], М [Аналит], мкМ свидетельство формирования в ферментной реакции формальдегида, который затем не окисляется АО до муравьиной кислоты. Этот факт может быть объяснен образованием на первом этапе реакции азинового аддукта формальдегида с MБТГ который, в отличие от свободного формальдегида, не может быть окислен АО, но принимает участие в последующей колориметрической реакции с ионами железа в кислой среде.

0, Рис. 6. Зависимость между концентрацией метанола и 0, оптической плотностью проб (в присутствии АО).

A 0, Этот вывод полностью 0, подтвержден сравнением следующих опытов: 1 - инкубация 0, формальдегида с АО в течение 0 5 10 15 мин. в присутствии МБТГ вариант [Methanol], М [Метанол], мкМ 3+ "формальдегид + АО +МБТГ Fe ” (рис. 7, кривая А);

2 - инкубация формальдегида с АО в буферным растворе, а затем добавление смеси МБТГ с ионами железа, вариант "формальдегид + АО МБТГ + Fe3+ (рис. 7, кривая B). Как показано на рис. 7, реакция положительная (формирование цветного продукта) для варианта № 1 и отрицательная для варианта № 2. Такие же реакции наблюдали для метанола: для варианта "метанол + АО +МБТГ Fe3+” (рис. 7, кривая С), реакция образования цветного соединения положительная, тогда как при втором варианте -"метанол + АО МБТГ + Fe3+” (рис. 7, кривая D) - реакция отрицательная.

A, C - -формальдегид (A, С) formaldehyde (А, C), - -метанол (В, D) D), methanol (B, Рис. 7. Зависимость между оптической 0, плотностью и концентрацией аналитов в пробе (в присутствии АО) в зависимости от этапа 0, добавления МБТГ. А, С – МБТГ вместе с АО A добавлен на первом этапе реакции;

В, D – МБТГ добавлен на втором этапе реакции (в 0, растворе с FeCl3) после предварительной инкубации пробы с АО 0, На основании полученных результатов B, D сделан вывод о том, что MБТГ на первом этапе 0, 0 5 10 15 [Аналит],[Analyte], M реакции выступает как соединение, мкМ связывающее формальдегид и тем самым предотвращающее окисление формальдегида с участием АО. МБТГ также используется в качестве субстрата для этого аналита в последующей колориметрической реакции с ионами железа. Это означает, что добавление АО к смеси MБТГ не влияет на результаты определения формальдегида, уже присутствующего в тестируемых пробах. Эти выводы подтверждает анализ содержания метанола и формальдегида в модельных растворах (общая концентрация обоих аналитов - мкМ) без добавления АО и в присутствии этого фермента (рис. 8, кривые А и B, соответственно).

Из полученных результатов следует: во-первых, в отсутствие АО, увеличение концентрации метанола не влияет на результаты определения формальдегида, во-вторых, в присутствии АО наблюдали практически те же значения оптической плотности смеси этих двух аналитов в различных молярных соотношениях, но в той же суммарной концентрации.

Об этом свидетельствует увеличение оптической плотности, возникающее при анализе формальдегида уже присутствующего в пробе и формальдегида, вновь образованного из метанола в реакции, катализируемой АО.

B Рис. 8. Зависимость между 0, оптической плотностью проб и реальным содержанием формаль дегида и метанола в 10 мкМ смеси 0, A этих аналитов (в молярных A процентах). А – без добавления АО;

0, В – с добавлением АО. В обоих случаях МБТГ добавляли на первом 0, этапе реакции.

0, Разработанный ферментно 100 % of formaldehyde % формальдегида 0 20 40 60 I I I I I I химический метод определения 0 % of methanol % метанола 80 Относительное содержание аналитов, молярные % Relative content of the analytes, mole % формальдегида и метанола в смеси был использован для определения этих соединений в образцах различного происхождения промышленных сточных водах (после кислотной дистилляции) и коммерческом продукте формалине, который содержит формальдегид и метанол (как стабилизатор для предотвращения полимеризации формальдегида). Результаты определений в сточных водах показаны в таблице 6. На основании этих данных можно утверждать, что результаты, полученные ферментативно-химическим методом аналогичны результатам, полученным с помощью химических методов и ГХ.

Таблица 6. Определение метанола и формальдегида в разбавленных промышленных стоках после кислотной дистилляции, а также в техническом формалине Содержание метанола (МеОН) и формальдегида (ФA), мг/л (M±m, n=4) Газовая Образцы Ферментативно- Химический метод хромато химический метод (хромотроповая кислота) графия МеОН ФA МеОН МеОН ФA I 2,59±0,19 4,36±0,23 3,30±0.5 2,70±0,13 4,62±0, II 4,61±0,34 7,15±0,37 5,39±0,5 4,72±0,27 7,27±0, III 3,29±0,38 6,95±0,23 3,40±0,5 3,01±0,08 6,49±0, ІV 2,80±0,32 6,23±0,25 3,53±0,5 2,70±0,05 6,58±0, V 0 1,72±0,20 0 0 1,85±0, VI 0 1,48±0,13 0 0 1,73±0, VII 3,77±0,30 2,66±0,16 3,13±0,2 3,79±0,12 3,82±0, VIII 4,15±0,32 2,14±0,27 3,06±0,5 3,93±0,31 4,11±0, Технический 60,24±6,88 417,6±29,5 53,8±5,35 56,5±4,95 391± формалин или или или или или (37,2% ФA;

4- 5,59±0,64% 38,72±2,74% 5,0±0,5% 5,25±0,46% 36,3±3,7% 8% МеОН) Новый метод дает возможность реализации отдельных определений метанола и формальдегида в смеси и может быть использован для определения как в модельных растворах, так и в промышленных стоках и в коммерческих препаратах формалина. Порог чувствительность этого метода для обоих аналитов составляет 1 мкМ, что соответствует 30 32 нг аналита в 1 мл реакционной смеси, что в 3,2 раза выше по сравнению с химическим методом с использованием перманганата калия и хромотроповой кислоты (рис. 9). Следует подчеркнуть, что чувствительность предлагаемого ферментно-химического метода анализа значительно выше (1000х) по сравнению с рН-SFET биосенсорами. Линейность калибровочной кривой является - EC, 670 nm;

formaldehyde - ФХ 670 нм;

670 nm;

methanol - EC, формальдегид достоверной (p0,0001) и стандартное Slope 0,0435;

R 0, 1, - ФХ 670 нм;

метанол nm;

formaldehyde - Chemical, Наклон Slope 0,043;

R 0,99769 - Химимческий 570 570 формальдегид - Chemical, нм;

nm;

methanol отклонение определений в реальных Наклон - Химический 570 нм;

метанол 0, образцах не превышает 7%.

Оптическая плотность Optical density 0, Рис. 9. Сравнение чувствительности 0, химических и ферментативно-химических (ФХ) методов определения формальдегида Slope 0,014;

R 0, 0,2 Наклон и метанола. Наклон калибровочных кривых Slope 0,013;

R 0, Наклон характеризует чувствительность методов 0, 0 5 10 15 20 25 30 35 [Analyte], M [Аналит], мкМ На рис. 10 представлены линии регрессии корреляции данных, полученных предложенным методом, и двумя референтными методами. Более низкий коэффициент корреляции с хроматографическим методом можно объяснить сложностью процесса анализа метанола и формальдегида методом ГЖХ.

А В Ферментативно-химический метод, мг/л Ферментативно-химический метод, мг/л Enzymo-chemical method, mg/l Gas chromatography 3 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 Enzymo-chemical method Газовая хроматография, мг/л Химический метод, мг/л Chemical method, mg/l Рис. 10. Корреляция между результатами определения метанола (мг/л) полученными методом газовой хроматографии (А), химическим методом (В) по отношению к результатам ферментно-химического метода Таким образом, разработан новый ферментно-химический метод для одновременного определения метанола и формальдегида в образцах, содержащих оба этих вещества, с использованием АО и MБТГ. Фермент АО окисляет метанол до формальдегида, а MБТГ играет двойную роль: на первом этапе реакции образуется бесцветный азиновый аддукт с присутствующим ранее и ФА, образованным в результате ферментной реакции, предотвращая его окисление под влиянием АО;

на втором этапе реакции происходит окисление азинового аддукта в окрашенный продукт под влиянием Fe+3 в кислой среде. Возможность одновременного определения метанола и формальдегида предложенным методом доказана как на модельных смесях, так и для проб сточных вод фабрики по производству пластмасс в Пусткове (Польша), а также для технического формалина Предлагаемый метод, в отличие от химических методов, не требует использования вредных, агрессивных химических веществ (серная, фосфорная или хромотроповая кислоты, перманганат калия), проще в реализации и может быть использован для контроля аналитов в промышленных сточных водах и различных продуктах, содержащих формальдегид.

4. Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих на метанол, этанол и формальдегид.

Возможность использования мутантных клеток метилотрофных дрожжей для разработки биосенсоров, селективных для спиртов (метанол, этанол) и формальдегида, была предметом экспериментальных исследований, изложенных в данной главе. План опытов включал:

селекцию мутантов метилотрофных дрожжей с генетически модифицированным физиологическим ответом на целевые аналиты - метанол, этанол и формальдегид по следующим параметрам: 1) потребление кислорода, 2) выделение перекиси водорода;

химическую модификацию мутантных клеток в целях повышения селективности аналитического ответа клетки: снижение проницаемости мембран (пермеабилизация) клеток дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония;

конструирование биораспознающих элементов путем иммобилизации генетически или химически модифицированных дрожжевых клеток на поверхности трансдуктора;

изучение аналитических характеристик лабораторных прототипов биосенсоров для анализа метанола, этанола или формальдегида.

Для анализа спиртов разработаны микробные амперометрические биосенсоры на основе сконструированных мутантов дрожжей с модифицированной физиологической реакцией на аналит. До сих пор предложено много биосенсоров с использованием амперометрических трансдукторов. В большинстве из них используются селективные электроды: кислородный и перекисный. Для повышения селективности сенсоров использованы методы метаболической инженерии. Нами целенаправленно введены мутации, которые тормозили реакции, связанные с использованием кислорода (кислородный биосенсор) или продукцию других электрохимически активных веществ, способных взаимодействовать с электродом (например, перекись водорода с перекисным электродом). С другой стороны, мы использовали химическую модификацию клеток для повышения проницаемости клеточной мембраны для веществ с низкой молекулярной массой.

Мутантный штамм H. polymorpha 7-4А (gcr1 EАО) с нарушенной катаболитной репрессией и повышенным конститутивным синтезом АО был выделен после мутагенеза УФ из штамма H. polymorpha 33 (gcr1). Колонии с повышенной активностью фермента обладали активностью АО в присутствии ингибитора АО - азида натрия. Другой мутант H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) с неактивной каталазой был селекционирован из штамма 33 с нарушенной катаболитной глюкозной репрессий АО. Он неспособен к разложению экзогенной перекиси водорода до кислорода. Изучение дыхательной селективности клеток штамма 7-4А в отношении различных субстратов показало, что зависимое от этанола использование кислорода клетками мутанта 7-4А при росте на глюкозе было на порядок выше по сравнению с диким типом.

Увеличение дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония проницаемости мембраны мутантов незначительно усиливаало их зависимое от алкоголя потребление кислорода. Фермент АО, который использует кислород для непосредственного окисления алкоголя, имеет высокую молекулярную массу (около 600 кДа) и содержит нековалентно связанный ФАД в качестве простетической группы. Эти особенности вызывают неспособность АО диффундировать через мембраны клеток, что позволяет использовать их в качестве естественной формы "инкапсулированной АО”.

Отсутствие каталазы у мутанта С-105 вызывало выделение перекиси водорода во время инкубации клеток с метанолом. Увеличение проницаемости мембран, вызванное дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония мутантных клеток увеличивает в 4 раза секрецию клетками H2O2. Это связано с облегченной диффузией перекиси водорода через клеточные мембраны и, возможно, «вытеканием» из клеток некоторых ферментов. Как показано на рис. 11, мутанты 7-4А, и С-105 при росте на глюкозе имели высокую активность АО - с 4,5 до 6,0 Ед./мг белка в бесклеточных экстрактах.

Активность АО, Ед./мг Рис. 11. Активность АО в бесклеточных экстрактах селекционированных мутантов H.

polymorpha 22 wt (дикий тип), 7-4A и C-105 при росте на среде с глюкозой (Glc) и метанолом (Mth) Клетки этих мутантов, иммобилизованные в геле альгината кальция и помещенные на поверхности O2- и H2O2- селективных электродов, были использованы в качестве биоэлементов алкоголь-специфичных сенсоров. Типичные кривые времени отклика для обоих микробных сенсоров показаны на рисунке 12. Сигнал для электрода «клетка/кислород» (1) возрастал быстрее, чем для электрода «клетка/перекись водорода» (2). Оба амперометрических биосенсора показывали высокую чувствительность нижняя граница чувствительности составляла 0,2 мМ для этанола и 0,03 мМ для метанола.

Сконструированные микробные биосенсоры проявляли подобную селективность к спиртам.

Наибольший отклик наблюдали в отношении метанола (100%), меньший - для этанола и формальдегида;

очень слабый сигнал был зарегистрирован для глюкозы и глицерина, в отличие от других микробных сенсоров (рис. 13).

Амперометрический ответ, % Рис. 12. Кривые ответа микробных сенсоров на этанол. 1 – мутант H. polymorpha 7-4A (со сверхэкспрессией AO) – O2 электрод, 0,05 мM этанол;

2 – мутант H. polymorpha C-105 (лишенный каталазной активности) – H2O2 электрод, 2 мM этанол Время, мин Амперометрический 90 Amperometryczna ответ, % odpowied, % Рис. Селективность амперо 80 13.

метрического биосенсора на основе пермеабилизованных мутантных клеток H.

polymorpha, иммобилизованных на O2 электроде. Eth – этанол, Meth – метанол, Form – формальдегид, Glicer – глицерин, Glc – глюкоза Eth Meth Form Glicer Glc Очевидно, некоторые физиологические характеристики клеток метилотрофных дрожжей, таких как секреция H2O2 или потребление O2, могут быть использованы как специфичный сенсорный ответ на метанол, этанол или формальдегид.

5. Биосенсорное определение метанола в промышленных сточных водах.

В опытах по изучению возможности использования амперометрического биосенсора для определения метанола в окружающей среде использовали ферментный тип биоэлемента препарат АО H. polymorpha C-105 очищенный посредством осаждения сульфатом аммония и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

АО использует кислород в процессе окисления метанола согласно реакции:

CH3OH + O2 HCHO + H2O2.

В присутствии метанола в ячейке сенсора, каталитическое действие АО, иммобилизованной в геле альгината кальция между тефлоновой и поликарбонатной мембранами, приводит к локальному снижению концентрации кислорода на чувствительной поверхности датчика, уменьшая ток в электроде Кларка. Сигнал достигал стационарного уровня после достижения в биомембране равновесия процессов диффузии кислорода и метанола. Разработанный биосенсорный метод был использован для анализа промышленных сточных вод крупного химического предприятия «Кендзежин» в городе Кендзежин-Козле (Польша). В пробах сточных вод, взятых на очистных сооружениях, показано наличие метанола (рис. 14). Для сравнения был использовали предложенный нами ранее ферментно химический метод фотометрического определения метанола.

Представленный биосенсорный метод позволяет определять метанол в присутствии формальдегида, хотя формальдегид может также окисляться в реакции с АО. Это можно объяснить гораздо более низким сродством АО к формальдегиду по сравнению со сродством АО к метанолу. Даже 3-кратный избыток формальдегида по сравнению с метанолом не влияет на точность определения последнего. Как видно из данных, приведенных на рис. 14, результаты анализа метанола в промышленных сточных водах биосенсорным методом были схожи с данными, полученными при помощи ферментно-химического метода с использованием AГMT. Биосенсорный метод прост в использовании, требует только кислородный электрод и АО. Поскольку он подходит для непрерывного мониторинга содержания метанола в окружающей среде, его использование имеет большое будущее в химической, фармацевтической, промышленности, технологии очистки воды и сточных вод промышленных предприятий.

Биосенсорный Ферментативно химический Рис. 14. Содержание метанола (ммоль/л) в сточных водах очистных сооружений азотного комбината полученное «Кендзежин», биосенсорным и ферментно-химическим методами Очищенные Первичный Вторичный Аэротэнк стоки отстойник отстойник 6. Разработка амперометрических биосенсоров на основе АО с использованием новых технологий.

В исследованиях по улучшению амперометрических биосенсоров использовали новые технологии:

иммобилизацию фермента на поверхности электрода путем электроосаждения в присутствии катодных/анодных полимеров;

дополнительное введение в структуру биоселективного слоя пероксидазы хрена;

включение в структуру электродного полимера осмий-содержащего переносчика.

Иммобилизация АО методом электроосаждения и изучение 6.1.

возможности использования АО в беспероксидазном биосенсоре. Использовали АО с удельной активностью 23 мкM.мин-1.мг-1. Биосенсоры конструировали в трех- электродной конфигурации. В качестве сравнительного электрода был использован Ag/AgCl/3М KCl (серебро-хлорид серебра), а в качестве дополнительного (вспомогательного) электрода был применен платиновый электрод, тогда как рабочий электрод был сформирован на основе графитового стержня. Матрицей для электроосаждения ферментов и химической "прививки" осмий-содержащего медиатора служили анодные и катодные полимеры.

6.2. Конструирование двухферментного биосенсора на основе АО и ПО. Изучена возможность введения в состав сенсорного элемента пероксидазы хрена (ПО). ПO в процессе пероксидазного восстановления перекиси водорода может принимать электроны от анода с участием медиатора, содержащего осмий. Образующаяся в результате оксидазной реакции H2O2 может негативно влиять на стабильность АО, поэтому важно было создать условия для быстрого разложения H2O2.

Оптимальная структура двухферментного электрода имела конфигурацию ПО/Os AР59//AO/СР9 и состояла из двух слоев: первый содержал пероксидазу хрена, введенную в состав полимера Os-АР59 путем электроосаждения, а второй (внешний) – алкогольоксидазу, иммобилизованную путем катодного электроосаждения в присутствии аминосодержащего полимера (СР9). Такая структура биоэлемента обеспечивает быстрый перенос электронов с поверхности электрода на окисленный активный центр ПО при участии осмий-содержащего полимера.

На рис. 15. показана схема конструкции двухферментного биосенсора на основе АО и ПО.

Электроосаждение Адсорбция + 2200 мВ смеси ПО ФБpH 7. и ap9Os Рис. 15. Схема строения двухферментного Сушка биосенсора на основе АО и ПО Электроосаждение - 1200 мВ В этой конфигурации окисление этанола, Адсорбция AO cp катализируемое АО в наружном слое, связано с Сушка окислением пероксидазой комплекса Os2+ в составе анодного полимера второго слоя и заканчивается восстановлением осмий-содержащего посредника на рабочей поверхности электрода. Чувствительность сконструированного биосенсора была более высокой по сравнению с описанными ранее амперометрическими аналогами на основе АО. Стабильность биосенсоров изучали путем повторного определения сенсорного ответа на 4 мМ этанол при хранении биоэлектрода в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,5 (+4 оС).

Стабильность оказалась достаточной, поскольку при 50%-ном уменьшении сигнала за 7 суток сенсорный ответ практически оставался неизменным в течение продолжительного времени (pис. 16).

- Вносився 4 мM EtOH Добавлен 4 мМ этанол Рис. 16. Стабильность двухферментного - биосенсора структуры ПО/Os-AP59//AO/CP - - I, нA - Данный биосенсор применялся в - дальнейшем в опытах по изучению использования - природных и мутантных форм АО с уменьшенным - сродством фермента к субстрату в биосенсорных технологиях.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Время, дні Час, сут.

7. Мутантные формы AO H. polymorpha в качестве селективного элемента амперометрического биосенсора.

Выявление и количественное определение спиртов с высокой селективностью и точностью требуется в самых различных областях. Ферментативный и биосенсорный подходы относятся к числу наиболее подходящих аналитических методов в этой области.

Алкогольоксидаза дрожжей широко используется для количественного определения первичных спиртов и формальдегида, достигнут значительный прогресс в выборе оптимального трансдуктора, иммобилизации и стабилизации фермента. Однако, сродство АО к этанолу достаточно высокое, и прямое измерение целевого аналита на основе АО, например, этанола в реальных образцах вин, пива или бродильных культур, является сложным и экономически невыгодным из-за необходимости многократного трудоемкого разведения образцов. Для преодоления этого недостатка необходимо получение модифицированных форм АО со сниженным сродством к субстрату и широким диапазоном линейного отклика.

Нашей задачей была селекция штаммов метилотрофных дрожжей Н. polymorpha с уменьшенным сродством к этанолу, идентификация изменений в мутантных аллелях структурных генов АО у полученных штаммов, препаративное выделение мутантных форм белков, а также изучение возможности их использования в биосенсорных технологиях.

7.1. Мутагенез и селекция мутантных штаммов, скрининг мутантов по активности АО. Для выделения мутантов клетки исходного штамма дикого типа H.

polymorpha DL-1-356 культивировали в жидкой среде с глюкозой до середины логарифмической фазы роста, промывали дистиллированной водой, разводили до концентрации 106 клеток/мл и подвергали облучению УФ до 10%-ной выживаемости клеток.

Клетки после облучения высевали на агаризованную среду Беркхольдера, содержащую метанол (0,5%) и аллиловый спирт (0,3 мМ). Аллиловый спирт использовали в качестве селективного агента.

В случае окисления аллилового спирта алкогольоксидазой образуется токсичный для дрожжей акролеин. Это вещество вызывает гибель клеток с высокой активностью АО. С другой стороны, активность АО необходима для роста в среде с метанолом в качестве единственного источника углерода. Таким образом, среда, содержащая смесь метанола и аллилового спира, обеспечивает рост клеток с уменьшенной активностью АО и/или с уменьшенным сродством АО к спиртам. Путем разработанного нами метода селекции были получены три мутантных штамма - СА2, СА4 и СА5 с уменьшенным сродством АО к этанолу. Штамм СА5 обладал низкой активностью АО, поэтому в дальнейших исследованиях использовали штаммы СА2 и СА4.

Сродство АО к этанолу определяли путем кинетических исследований активности фермента в БЭ исходного (Shleev et al., 2006) и полученных мутантных штаммов H.

polymorpha СА2 и СА4 в присутствии различных концентраций этанола (0-100 мМ) используя реакцию окисления ABTS [2,2'-азинобис(3-этилобензотиазолинон-6-сульфонат)] пероксидазой. Было обнаружено, что мутантные штаммы CA2 и CA4 отличаются сродством к субстрату: значение КМ по отношению к этанолу для АО исходного и мутантных штаммов составляли, соответственно, 0,41;

1,95 и 1,00 мМ (таблица 7). Это показывает, что селекция клеток в соответствии с критерием устойчивости к акролеину позволяет получить мутанты дрожжей Н. polymorpha со пониженным сродством АО к субстрату.

Таблица 7. Значения KM по отношению к этанолу для АО исходного и мутантных штаммов Н. polymorpha Штамм Стандартная Коэффициент линейной Км, мМ ошибка, регрессии R для графика H. polymorpha Лайнуивера-Берка 356 (исходный) 0,411 0,084 0, СА2 1,949 0,040 0, СА4 1,002 0,130 0, 7.2. Определение нуклеотидной последовательности мутантных аллелей структурных генов АО штаммов CA2 i CA4 H. рolymorpha и идентификация мутаций.

Мутантные аллели гена АО амплифицировали в реакции ПЦР с использованием праймеров: