Протеомные базы данных для поиска тканеспецифичных белковых маркеров мышечных органов
На правах рукописи
КОВАЛЕВА Марина Анатольевна Протеомные базы данных для поиска тканеспецифичных белковых маркеров мышечных органов 03.01.04 - Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена в лаборатории биомедицинских исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии им.
А.Н.Баха Российской академии наук.
Научный консультант: профессор, доктор биологических наук Шишкин Сергей Сергеевич
Официальные оппоненты: Лисица Андрей Валерьевич член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский ин ститут биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицин ских наук, заместитель директора по научной ра боте;
Левицкий Дмитрий Иванович доктор биологических наук, профессор, Федераль ное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской ака демии наук, заведующий лабораторией молеку лярной организации биологических структур;
Зезеров Евгений Гаврилович доктор биологических наук, профессор, Государ ственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский Государственный университет им.
И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биологической химии, профессор.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».
Защита состоится « 23» мая 2013 г. в 13 на заседании диссертаци ч.
онного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учре ждении науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект. д. 33 стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, стр.1.
Автореферат разослан « » 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы.
Для развития биохимии белков в начале 21-ого века принципиальное значе ние приобрело широкое применение протеомных и биоинформационных техно логий [Арчаков А.И. 2000, Anderson N.G. et al. 2001;
Шишкин С.С. 2002;
Прим роуз С., Тваймен Р. 2008 и др.]. Накапливающиеся результаты, представляющие собой совокупности взаимосвязанных сведений, подлежащих совместной обра ботке, рассматриваются как соответствующие информационные массивы, на основе которых формируются различные общие и специализированные базы данных, размещаемые в сети «Интернет». Среди них надо особо отметить в базе данных UniProt информационный ресурс, названный «Complete proteome of Homo sapiens», который к середине 2012 года включал более 70 000 аннотаций, однако из них только 25 000 аннотаций (35,2%) представляли результаты пря мых исследований соответствующего белка. Таким образом, очевидно, что большая часть (64,8%) созданных аннотаций нуждается в дополнительных экс периментальных материалах, при получении которых решающую роль могут сыграть протеомные технологии и дальнейшее развитие информационных ре сурсов, что свидетельствует о высокой актуальности подобных исследований.
В первой декаде 21-го века также поступательный импульс получили проте омные исследования, направленные на выявление полиморфных вариантов бел ков в мышечных органах и выяснение роли белкового полиморфизма при раз личных физиологических и патологических процессах [Yip Y. et al., 2008;
Wei Y.J. et al. 2009;
Manning A. et al., 2012 и др.]. Особое внимание при этом уделя лось аллельным изоформам, которые характеризуются единичными аминокис лотными заменами в аминокислотных последовательностях, поскольку такие замены могут приводить к изменениям функциональных свойств белка (от не значительных до полной потери функции) или не оказывать подобного влияния (так называемые «нейтральные» замены). Уже собранная обширная информация о белковом полиморфизме в различных базах данных (например, в UniProt) включает и сведения о большом числе спорных определений отдельных амино кислот в ряде позиций первичной структуры многих белков, так называемых «аминокислотных конфликтов в последовательности» (Sequence conflict). Соот ветственно, при исследованиях любого белка разрешение «аминокислотного конфликта» в пользу одного из вариантов представляет значительный интерес, поскольку итоговая детализация первичной структуры может оказать влияние на формирование представлений о пространственной упаковке его полипептид ной цепи и других свойствах, включая функциональные особенности.
Наряду с изучением разных аспектов белкового полиморфизма и других фундаментальных проблем биохимии белков мышечных органов протеомные технологии находят все более широкое применение в разработках биомедицин ских проблем, ориентированных на решение многих прикладных задач - от вы явления потенциальных диагностических белковых биомаркеров, мишеней фар макологических воздействий [Cummings J. et al. 2008;
Principe S. et al. 2012 и др.] до создания методов контроля за качеством различных пищевых продуктов, из готавливаемых из мышечных тканей животных [Zapata I. et al. 2009;
de Almeida AM, Bendixen E. 2012 и др.].
Таким образом, направленность данной работы на построение протеомных баз данных, предназначенных для изучения вопросов, относящихся к биохимии белков мышечных органов, а также для решения комплекса прикладных задач, включающих выявление потенциальных белковых биомаркеров различных форм патологии (в частности, рака простаты) в целом, определяет актуальность из бранной темы.
Цель и задачи исследования.
Основной целью данной диссертационной работы стало построение отечествен ных биоинформационных ресурсов (баз данных, размещённых в сети «Интер нет») о белках ряда мышечных органов для оптимизации поисков новых белко вых изоформ и определения тканеспецифичных белковых маркеров.
Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
1. Провести изучение протеомных профилей и анализ белкового полиморфизма в различных мышечных органах человека, а также некоторых культивируемых клеточных линиях, направленных на выявление изоформ с единичными амино кислотными заменами.
2. Изучить биохимические проявления дифференциальной генной экспресии при клеточной дифференцировке и в онтогенезе мышечных органов человека.
3. Разработать общие принципы построения многомодульных протеомных баз данных и создать на их основе отечественную базу данных «Протеомика мы шечных органов» для определения тканеспецифичных белков и анализа белко вого полиморфизма в различных мышечных органах человека.
4. Сформировать новую версию отечественной базы данных «Протеомика рака простаты», включающую комплексные модули, обобщающие результаты проте омного анализа отдельных белковых препаратов, для определения потенциаль ных биомаркеров этого заболевания 5. Провести с помощью построенных протеомных баз данных поиск так назы ваемых безымянных (unnamed), гипотетических (hypothetical) и других малоизу ченных белков в образцах тканей и культивируемых клеточных линиях челове ка.
6. Разработать на основе протеомных исследований метод, пригодный для кон троля качества мясной продукции по белковому составу с определением видовой специфичности мышечных белков и выявлением белковых добавок немышечно го происхождения.
Научная новизна.
В ходе протеомных исследований в тканях мышечных органов и культиви руемых клетках человека выявлены различные варианты биохимического поли морфизма белков, обусловленные единичными аминокислотными заменами (single amino acid substitution, SAAS), включая новый вариант триозофосфатизо меразы 1 (SAAS 233G D), определены частоты встречаемости в славянских выборках аллельных вариантов с SAAS 41E A 3,5- 2,4-диеноил-коэнзим А изомеразы и мышечной енолазы с SAAS 71 N S, а также разрешены в одну из сторон «конфликтные» определения (по 135 позициям) в аминокислотных по следовательностях 59 белков человека.
На основе специально разработанных общих принципов построения много модульных протеомных базы данных сформирована новая версия отечественной базы данных «Протеомика мышечных белков человека», содержащая новые комплексные модули «Белки миокарда» и «Белки миобластов», а также новая версия (2012 г.) отечественной базы данных «Протеомика рака простаты», со держащая новый комплексный модуль «Белки клеток DU-145», в котором обоб щены результаты протеомного анализа суммарных белков этих клеток и отдель ных белковых препаратов (ядерные белки, гистоны, фосфопротеины), включая сведения о 78 идентифицированных белках.
Получены новые данные, прямо подтверждающие существование пяти бе зымянных белков (продуктов локусов BAC05360, BAG63245, BAH11721, BAG53005, BAC05009, зарегистрированных в GenBank) в образцах ряда тканей и клеточных линиях человека.
В биоптатах предстательной железы человека, а также в культивируемых клетках линии DU-145 выявлено семь укороченных белковых продуктов, кото рые соответствуют белкам человека, предсказанным ранее по материалам иссле дований геномной ДНК и/или соответствующих мРНК;
таким образом, впервые обнаружено существование особых укороченных изоформ у некоторых извест ных белков (тропомиозина 3, поли (А) связывающего белка 1, фосфоглюкомута зы 3 и др.).
Научно-практическая значимость.
Сформированные отечественные информационные ресурсы «Протеомика мышечных белков человека» (версия 2012 г., http://mp.inbi.ras.ru) и «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г., http://ef.inbi.ras.ru) доступны пользователям сети Интернет и позволяют оптимизировать соответствующие протеомные исследо вания, направленные на поиски потенциальных белковых биомаркеров тканевой специфичности. База данных «Протеомика рака простаты» включена в Государ ственный реестр баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012). Результаты этой работы использованы в трех информационно методических письмах, которые нашли применение в учебном процессе при подготовке врачей-урологов (включены в курс последипломного образования по урологии, кафедра урологии РМАПО), а также в обучении студентов и аспиран тов кафедры биохимии РУДН (элективный курс «Клиническая биохимия»).
Показано, что исследования и анализ на основе протеомных баз данных по зволяет решать широкий круг биомедицинских вопросов, связанных с обнару жением полиморфных белков, а также с выявлением изменений протеомных профилей в ходе клеточной дифференцировки, онтогенеза мышечных тканей и органов. Обнаружен ряд изменений в протеомных профилях при старении и не которых формах патологии (злокачественные новообразования и др.) Проведенное изучение потенциальных белковых биомеркеров рака простаты создало научно-методические основы для организации клинических исследова ний с целью валидации некоторых из этих маркеров (AGR2, PRO2675, Dj-1, сер пин H1 и трансгелин). Получен патент на один из потенциальных биомаркеров рака простаты (№ 2360924, зарегистрированный в Государственном реестре изо бретений Российской Федерации 10 июля 2009 г., опубликован 10.07.2009, Бюл., №19. С.1-7.).
В ходе биомедицинских исследований, направленных на определение каче ства мясных продуктов, выявлены видоспецифические изоформы ряда мышеч ных белков и предложен метод, пригодный для контроля качества мясной про дукции по белковому составу и обнаружения белковых добавок немышечного происхождения, включая установление признаков фальсификаций.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Найдены различные варианты биохимического полиморфизма белков че ловека: а - обусловленные единичными аминокислотными заменами (single ami no acid substitution, SAAS), включая новый вариант триозофосфат изомеразы (SAAS 233G D), и разрешены в одну из сторон «конфликтные» определения первичной аминокислотной последовательности по 135 позициям 59 белков че ловека, б - в гладкомышечных тканях и органах, содержащих значительное ко личество гладкомышечных клеток, показана множественность и органоспеци фичность спектра изоформ трансгелина.
2. Сформированы двуязычная база данных «Протеомика мышечных орга нов», содержащая 7 модулей и информацию по 510 идентифицированным бел кам и новая, расширенная версия (2012 г.) отечественного информационного ресурса - база данных «Протеомика рака простаты», включающая 9 модулей (570 идентифицированных белков), в том числе комплексный модуль «Белки клеток DU-145», обобщающий результаты протеомного анализа суммарных бел ков этих клеток, а также отдельных белковых препаратов (ядерные белки, гисто ны, фосфопротеины).
3. Выявлено и охарактеризовано несколько безымянных и других малоизу ченных белков человека.
4. На основе количественной денситометрии из потенциальных белковых онкомаркеров для рака простаты отобрана панель наиболее перспективных бел ков для дальнейшего использования.
5. Определены видоспецифичные белковые биомаркеры мышечных тканей, а также белки различных немышечных пищевых добавок, позволяющие харак теризовать качество мясной продукции, включая выявление нарушений норма тивов ГОСТ и ТУ.
Апробация работы.
Материалы данной работы на протяжении докладывались на международ ных и российских конференциях, а также на научных съездах и конгрессах, в том числе: II Моск. междун. конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2003. Москва;
Intern. Confer., «Chemical and Biological Problems of proteomics», 2004. Novosibirsk;
IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск;
10 ESC Meeting, Leuven, Belgium, 2008;
XXXVII Eur. Muscle Conference, Oxford, England, 2008;
VII Съезд онколо гов России 2009, Москва;
25th Anniversary EAU Congress, Barcelona, 2010;
III межд. научно-практ. конф. «Постгеномные методы анализа в биологии, лабора торной и клинической медицине». Казань, 2012;
Proc. 58th Congr. Meat Science and Technology, Montreal, Canada 2012 и др.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 79 научных работ, среди которых одна монография, две главы в коллективных монографиях, 24 статьи в рецензируе мых российских и международных журналах, 5 статей в тематических сборни ках, один патент, три информационно-методических письма, 44 тезисов докла дов на различных конференциях.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 299 страницах, состоит из введения, обзора лите ратуры, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (708 на именований). Работа содержит 56 таблиц и 114 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В соответствии с целью работы для изучения белкового полиморфизма в мышечных органах человека, включая простату, построения протеомных баз данных и поиска тканеспецифичных белковых маркеров использовали в основ ном биопсийные образцы и операционные материалы, а также различные аутоп сийные материалы. Параллельно исследовали белки нескольких культивируе мых клеточных линий человека.
Биопсийные образцы скелетных мышц (m. vastus lateralis n=23) были полу чены методом игольчатой биопсии под местной анестезией в ИМБП РАН от практически здоровых молодых добровольцев-спортсменов (20 - 24 лет). Био псийные образцы миокарда (n=40) были предоставлены сотрудниками Институ та экспериментальной кардиологии Минздрава России, проводивших хирурги ческие или диагностические вмешательства у лиц с сердечно-сосудистой пато логией, включая 16 больных с хронической ишемической болезнью сердца (ХИБС). Биоптаты предстательной железы (n=167) от больных злокачественны ми и доброкачественными новообразованиями (рак и гиперплазия), которым выполнялись диагностические биопсии и различные хирургические операции, были получены от сотрудников кафедры урологии РМАПО.
Аутопсийные образцы миокарда (n=90), а также некоторых других мышеч ных органов (n = 34 – m. vastus lateralis, n = 3 – простата и n = 5 - миометрий, от лиц, погибших в результате несчастного случая) были получены из Бюро судеб но-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы с мини мальными сроками аутолиза, который не превышал 12 часов. Образцы миокарда эмбрионов и плодов человека (биоптаты, n=95) были предоставлены Республи канским медико-генетическим центром г. Минск. Образцы средней оболочки аорты были предоставлены к.м.н. И.А. Собениным («Российский кардиологиче ский научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ). До нача ла исследований все аутопсийные образцы хранились при температуре -70°C.
Были исследованы также образцы скелетной мышцы (m. vastus lateralis) от больных медленными нейродегенеративными заболеваниями, включая пациен тов с боковым амиотрофическим склерозом (суммарно n=29), диагнозы которым устанавливали в соответствии с критериями Всемирной Федерации неврологов сотрудники НИИ неврологии РАМН. Пациенты включались в исследование в том случае, если они давали на это письменное или засвидетельствованное ин формированное согласие. Параллельно были проанализированы биопсийные материалы от ряда пациентов с другими нервно-мышечными заболеваниями митохондриальные миопатии (n=10) и болезни экспансии тринуклеотидных по второв (n=6). Эти биоптаты любезно предоставили к.б.н. Е.Ю. Захарова (МГНЦ РАМН) и к.м.н. В.В. Полищук (НИИ неврологии РАМН).
В работе использовались культивируемые миобласты человека, любезно предоставленные к.б.н. Т.Б. Крохиной и выведенные, как описано ранее [Крохи на Т.Б. и др., 1996], а также три линии культивируемых клеток рака простаты (РП) (LNCaP, РС-3, DU-145) и линия ДГПЖ (BPH-1) человека. Клетки линий РС-3, DU-145 и BPH-1 были закуплены в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Германия), а образец LNCaP-FGC – линии из американской клеточной коллекции ATCC (№.CRL-10995) – был получен от д.б.н. И.Г. Шемя кина (ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск). Кроме того, в ряде экспериментов исследовали клетки двух линий рабдомиосаркомы человека (линии А-204 и RD) и линии карциномы почки OKP-GS, приобретен ные в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и Институте цитологии РАН, соответственно.
В отдельном цикле исследований был изучен ряд образцов мясной продук ции: 10 образцов вареной колбасы «Докторская» от разных производителей, об разцы мясного сырья (свинина и говядина) и белковых добавок (соевый белок, изолят соевого белка, соевый текстурат и коллагеновый гидролизат говяжий, сухое молоко), используемых согласно нормативной документации. Все образцы были предоставлены сотрудниками ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхоза кадемии.
В типичных протеомных исследованиях к 100 мг измельченной ткани до бавляли в 2 мл лизирующего раствора (9 М мочевины, 5% меркаптоэтанола, 2% тритона Х-100, 2% амфолинов рH 3,5 – 10) и гомогенизировали в системе теф лон-стекло. Гомогенат осветляли центрифугированием (800g 5 мин) и надоса дочную фракцию, содержащую солюбилизированные белки (суммарный экс тракт), использовали для фракционирования. Суммарные белковые экстракты культивируемых клеток человека получали таким же методом, а для изучения ядерных белков клетки разрушали в мягких условиях (добавление неионного детергента и проведение нескольких циклов «замораживания – оттаивания»), затем центрифугированием осаждали клеточные ядра, после чего из препаратов ядер экстрагировали суммарные ядерные белки, гистоны и остаточные белки ядерного матрикса [по Green G.R., Do D.P. 2009]. Получение препаратов «Сум марные фосфопротеины» из культивируемых клеток осуществляли с помощью аффинной хроматографии, используя набор реагентов фирмы «Qiagen» по про токолу фирмы-производителя.
В качестве основных протеомных технологий применяли различные моди фикации двумерного электрофореза по O`Farrell (с изоэлектрофокусированием в амфолиновом или иммобилиновом градиентах pH) [Ковалева М.А. с соавт. 2008;
Shishkin et al 2011]. Детекция белков на гелевых пластинах проводилась окраши ванием Кумасси R-250, а также с использованием азотнокислого серебра, колло идным кумасси G-250 или SYPRO Ruby. Полученные цифровые изображения редактировали в графическом редакторе из пакетов программ ImageMaster 2D Platinum версий 6 и 7 («GE Healthcare», Швейцария). Идентификацию белков с помощью масс-спектрометрии проводили согласно протоколам «Центра проте омных исследований» при НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. Масс-спектрометрия методом MALDI-TOF MS выполнялась в НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, а также в НИИ физико химической медицины Росздрава и ИНБИ РАН. При идентификации некоторых белков уточнение структуры триптических пептидов проводили методом MALDI-TOF MS/MS.
Для подтверждения существования полиморфных вариантов у некоторых белков проводили анализ однонуклеотидных замен в соответствующих генах. С этой целью из культивируемых клеток получали препараты ДНК с помощью набора DNeasy Plant Handbook («QIAGEN», США), которые использовали для амплификации соответствующих сайтов. Определение и оптимизацию последо вательности олигонуклеотидных праймеров проводили с помощью программ OligoAnalyser 3.1 и Bioedit 7.0.0. Секвенирование всех полученных ДНК осуще ствляли в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН, используя набор реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (совместно с к.б.н.Черкашиным Е.А).
Сбор и обработку данных для формирования многомодульных протеомных баз данных (далее БД), представляющих собой интерактивные web-ресурсы на основе СУБД MySQL, выполняли с использованием программ MapThis!, Molly Pinguin Software и пакета программного обеспечения Mozilla Firefox, а также других программных средств, в частности, входящих в набор Microsoft Office.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использо ванием пакетов программ: BIOSTAT, MS Office Excel 2010. Сравнение количе ственных признаков в независимых группах проводили с использованием t критерия Стьюдента или U- критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Результаты с уровнем значимости менее 0,05 рассматривали как статистически значимые.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Протеомное изучение биохимического полиморфизма белков, обуслов ленного аминокислотными заменами в некоторых тканях и культивируе мых клетках человека. Проблема «конфликтов» в аминокислотных после довательностях некоторых белков.
Проведенные исследования показали, что в протеомных профилях скелет ных мышц, миокарда и других мышечных органах человека, а также в различ ных культивируемых клетках присутствует ряд полиморфных белков, среди ко торых практически везде удавалось идентифицировать изоформы енолазы, од ного из ключевых гликолитических ферментов (Рис. 1).
Известно, что у человека имеется полилокусный полиморфизм енолазы, вследствие чего этот белок представлен тремя основными изоформами:
енолаза (ген ENO1), -енолаза (ген ENO3) и -енолаза (ген ENO2). При этом в образцах скелетных мышц человека были выявлены две белковые фракции (H и L), являющиеся продуктами гена ENO3 (мышечная енолаза, -енолаза).
Рис. 1. Области ДЭ белков скелетной мышцы у разных лиц (А, Б, В), на которых ло кализованы фракции, идентифицированные как -енолаза. Стрелками обозначены 1,2 – полиморфные варианты -енолазы, 3 – -АТФ синтаза.
Эти белки характеризовались одинаковыми значениями pI (6,94), но разли чались по молекулярной массе. При анализе образцов от разных лиц было пока зано, что эти изоформы образуют три варианта распределения белковых фрак ций, принадлежащих -енолазе (Рис. 1).
Из 57 проанализированных биопсийных и аутопсийных образцов скелетных мышц в 10 случаях выявлялась только изоформа L, у 32 человек присутствовали обе изоформы, и у 15 человек наблюдалась изоформа H (Табл.1). Таким образом, эти варианты можно рассматривать как соответствующие альтернативным гомо зиготным состояниям и гетерозиготному состоянию гена ENO3.
Таблица 1. Частоты встречаемости аллельных вариантов SAAS 71 N S в -енолазе у обследованных жителей г.Москвы.
Выборка 71N 71S г. Москва (n=57) x =0, 0,456 0, Для подтверждения предположения о том, что H и L изоформы -енолазы являются аллельными продуктами экспрессии одного и того же гена ENO3, был проведен анализ спектров их триптических пептидов методом MALDI-TOF масс – спектрометрии. В результате удалось прямо охарактеризовать структурные различия между H и L изоформам фермента, которые заключаются в двух ами нокислотных заменах 71 N S и 85 V A.
В проанализированных пробах все образцы H изоформы содержали серин в положении 71, тогда как в образцах L изоформы в этой позиции определялся только аспарагин. Другой высокочастотный вид SAAS 85 V A выявлялся про извольно как в форме L, так и H, в обследованных нами выборках.
Далее, при протеомном изучении белков в образцах тканей простаты в од ном случае из 150 около типичной фракции -енолазы была зарегистрирована дополнительная фракция, которая характеризовалась большим значением pI, а по результатам MALDI–TOF MS также идентифицировалась как -енолаза.
Сравнительное изучение двух указанных белков позволило идентифицировать SAAS в дополнительной электрофоретической изоформе енолазы 1. Сначала по результатам анализа спектров триптической фрагментации, полученных для обычной и дополнительной изоформы енолазы 1, удалось установить различие по двум пикам масс, а именно у обычной изоформы присутствовал триптиче ский пептид, дающий пик с m/z 1939.96/, а у дополнительной - пик масс с m/z 1649.85. Тандемная масс-спектрометрия пика с m/z 1649.85 показала, что в его структуре имеется аминокислотная последовательность LAMQEFMILPVGAAK.
Иными словами, различие между обычной и электрофоретической изоформами енолазы 1 представляет собой SAAS 177N K. Эти результаты являются первым свидетельством о существовании варианта енолазы 1 с SAAS 177N K в обсле дованной выборке граждан РФ.
При изучении 115 образцов мышцы левого желудочка сердца у 72 человек было выявлено присутствие в одном из участков ДЭ (Рис. 2, а) белковой фрак ции с координатами Мм/pI - 29,7 кДа/6,75 (№ 4472675, здесь и далее по ранее предложенной номенклатуре [Kovalyov L. et al., 1995]). У 8 других человек (Рис.
2, в) рядом располагалась белковая фракция с координатами 29,7 кДа/6,57 (№ 4472657).
В 35 случаях (Рис. 2, б) присутствовали обе указанные белковые фракции № 4472675 и № 4472657. Эти данные позволили предположить, что отмеченные варианты распределения белков отражают два вида гомозиготных и гетерози готное состояние продуктов одного гена.
Указанные белки идентифицировали с помощью масс-спектромерии, и при этом оказалось, что все они являются продуктами одного гена - ECH1, который кодирует 3,5- 2,4-диеноил-коэнзим А изомеразу (ДКАИ) человека. Выявлен ные триптические пептиды покрывали 82% аминокислотной последовательно сти предполагаемого продукта гена ECH1 (Рис. 3).
Рис. 2. Фрагменты ДЭ белков мио карда человека с полимофными вари антами белкового продукта гена ECH1:
а – гомозиготность по аллелю № 4472675, б – присутствие обоих аллелей (гете розиготность) – оба белка с коорди натами 29,7 кДа/6,75 и 29,7 кДа/6,57, соответственно, в - гомозиготность по аллелю № Ранее по материалам секвенирования кДНК, было обнаружено существова ние полиморфизма продуктов гена ECH1 [FitzPatrick D. et al., 1995;
Strausberg R.
et al., 2002] с различием между изоформами в виде единичной аминокислотной замены в 41 позиции (E A). В базе данных «NCBI protein» соответствующие записи представлены под номерами 11433007 и 16924265.
Рис. 3. Аминокислотная последовательность 3,5- 2,4-диеноил-коэнзим А изомеразы человека (NCBI protein» записи 11433007 и 16924265), прямоугольниками выделены идентифицированные триптические пептиды по результатам масс-спектрометрии.
С этими данными хорошо согласовывались наши результаты масс спектрометрии, которые позволяли считать, что в гидролизатах соответствую щих белков присутствуют пептиды с такой же аминокислотной заменой: это выражалось как сдвиг массы триптического пептида 33-59 последовательности.
При исследовании образцов скелетных мышц человека, которые представ ляют другой тип поперечнополосатой мышечной ткани, в них так же, как и в миокарде, были выявлены белковые фракции, принадлежавшие ДКАИ со сход ными свойствами, включая относительное содержание (Рис. 4).
Рис. 4. Фрагменты (зона 3,5- 2,4 диеноил-коэнзим А изомеразы) ДЭ белков разных поперечнополосатых мышц: а скелетная мышца человека, б – коэлектро форез скелетной мышцы и миокарда, в – миокард человека.
Стрелками обозначены идентифицирован ные белки: 1 – малатдегидрогеназа, 2, 3 изоформы медленного скелетномышечного тропонина Т1, 4 - 3,5- 2,4-диеноил коэнзим А изомераза Представленные данные о встречаемости двух аллельных вариантов этого полиморфизма в гомозиготных и гетерозиготном состояниях для изученной выборки из жителей г. Москвы (n = 115) дали следующие частоты аллелей: для № 4472657 - 0,222, а для № 4472675 - 0,778, что близко к ожидаемым частотам из равновесия Харди-Вайнберга и хорошо согласуется с данными, полученными для европейской выборки.
На ДЭ различных биопсийных материалов и культивируемых клеток чело века среди других белков была идентифицирована методом MALDI-TOF MS с покрытием 70% триозофосфатизомераза 1 (ТФИ). Вместе с тем оказалось, что в клетках LNCaP, рядом с основной фракцией ТФИ присутствует дополнительная фракция (Рис.5), которая также характеризовалась методом MALDI-TOF MS как ТФИ. Отмеченная фракция по Мм соответствовала основной (27 кДа), но отли чалась меньшим значением pI ( 0,3), и была расценена предварительно как элек трофоретическая изоформа ТФИ (ТФИ-ei).
Рис. 5. Сравнительный протеомный анализ участков расположения ТФИ на ДЭ белков из разных культур клеток: а – линия LNCaP, б – линия PC-3. Основная фракция ТФИ и ТФИ-ei показаны сплошными стрелками, а пунктирной стрелкой - реперная фрак ция, идентифицированная как пероксиредоксин 1 (ПР-1).
Это предположение подтвердил анализ масс-спектров, полученных после триптического гидролиза ТФИ и ТФИ-ei методом MALDI-TOF MS («пептидные фингерпринты»). При значительном сходстве было выявлено и существенное различие между этими белками: у ТФИ присутствовал пик m/z 3029.5, соответ ствующий С-концевой последовательности ТФИ (220-248), тогда как в масс спектре ТФИ-ei данного пика не было, но имелся другой пик с m/z 3087.7. Масс спектр фрагментации соответствующего триптического пептида из ТФИ-ei по зволил выявить в нем участок из С-концевой последовательности ТФИ, в кото ром присутствовала аминокислотная замена - остаток глицина в 233 позиции был заменен на остаток аспарагиновой кислоты (233G D).
Для получения прямого доказательства у линии LNCaP гетерозиготности за счёт полиморфизма, вызванного единичной аминокислотной заменой 233G D, было проведено изучение соответствующего участка нуклеотидной последова тельности гена TPI1 в препаратах ДНК, выделенных из клеток LNCaP. С помо щью подобранных праймеров удалось синтезировать ПЦР-продукт, секвениро вание которого показало его полное совпадение с соответствующей последова тельностью гена TPI1 за исключением того, что в положении 2765 были выявле ны два пика, указывающие на равновероятное нахождение в данной позиции G или А (Рис. 6, график 1).
Присутствие в анализируемой ДНК однонуклеотидного полиморфизма (SNP) 2765G/A удалось установить путем клонирования ПЦР-продуктов и сек венирования участков плазмид, выделенных из отдельных клонов. По результа там секвенирования плазмид из 6 клонов, у четырех образцов в 2765 положении нуклеотидной последовательности гена TPI обнаружено основание G, а в двух – A (Рис. 6 графики 2 и 3).
Рис. 6. Результаты секвенирования суммарного (график 1) и клонированных (графики 2 и 3) ПЦР-продуктов. Голубым цветом выделены нуклеотидные остатки, находящиеся в позиции 2765.
Эти данные позволили сделать вывод о том, что ген TPI в клеточной линии LNCaP содержит SNP G/A в позиции 2765, и такая нуклеотидная замена приво дит к аминокислотной замене 233G D в изоформе ТФИ-ei, обнаруженной при протеомном исследовании. В результате проведенной работы выявлен новый аллельный вариант ТФИ человека, который может рассматриваться как белко вый биомаркер клеток линии LNCaP.
Учитывая большое количество спорных определений позиций отдельных аминокислот в первичной структуре многих белков человека, так называемых «аминокислотных конфликтов в последовательности» (Sequence conflict), были суммированы полученные экспериментальные протеомные данные. Полученные результаты идентификации белков различных биообъектов человека позволили однозначно подтвердить присутствие одного из вариантов наличия аминокис лотных остатков, соответствующий только одному из «конфликтных» вариантов определений аминокислотной последовательности.
При этом в нескольких случаях один и тот же SAAC выявлен при анализе структуры белка, полученного из разных источников, но идентифицированного как один и тот же продукт генной экспрессии. Например, в препаратах, иденти фицированных как -енолаза (ENO1) из скелетных мышц человека, был обна ружен пептид с mz 1143.60 с SAAC 187 E/G, и тот же SAAC 187 E/G отражен по пику масс при идентификации -енолазы из коры мозга, миобластов, ткани про статы и культивируемых клеток простаты. Сходная ситуация оказалась при ана лизе белка, идентифицированного как триозофосфатизомераза 1 (TPI1), для SAAC 167 P/N в пептидах с экспериментальными значениями mz 1602.71 и 1602.89. Такое многократное определение одного и того же SAAC, очевидно, позволяет разрешить однозначно «конфликт» в пользу варианта, выявленного протеомными технологиями.
Кроме того, прямое подтверждение результата определения SAAC в некото рых белках было получено с помощью метода MALDI-TOF MS/MS.
В целом, проведенный протеомный анализ, охвативший более 500 белков из ряда тканей, органов и клеток человека, позволил уточнить первичные структу ры 59 белков и по 135 конфликтным определениям и выявить у некоторых из них полиморфные варианты. Соответственно, можно ожидать, что расширение подобных исследований будет способствовать развитию представлений о белко вом полиморфизме человека и возможности его использования при решении различных биомедицинских задач.
2. Биохимические проявления дифференциальной генной экспрессии в не которых мышечных органах человека, а также при клеточной дифферен цировке и в онтогенезе.
Расширение сведений о полиморфных изоформах мышечных белков челове ка (особенно специфичных для сердечной мышцы) представляет значительный интерес для решения ряда биомедицинских задач, включая поиск новых потен циальных биомаркеров различных видов патологии.
При сравнительном анализе белковых профилей у образцов сердечной и скелетной (m. vastus lateralis) мышц человека с помощью протеомных техноло гий удалось отметить ряд известных мажорных белков, проявляющих опреде ленную тканеспецифичность для соответствующих мышечных органов. Выяв ленные особенности носят как качественный, так и количественный характер.
Так, выраженные количественные различия наблюдались для фракций тропомиозина, -АТФ синтазы. Особенности в наборах легких цепей миозина и тропомиозиновых белков использовались далее при анализе белковых профилей различных мышечных клеток и образцов тканей.
На протяжении ряда лет в литературе обсуждаются возможности биомеди цинского использования изоформ карбоангидраз, включая идентифицированную мышечную карбоангидразу 3. В данной работе были проведены целенаправлен ные сравнительные исследования изоформ карбоангидраз в нескольких мышеч ных органах, в частности, в миокарде, скелетной мышце и ткани простаты (Рис.
7.).
Рис. 7. Фрагменты ДЭ, на которых идентифицированы изоформы карбоангидраз и триозофосфатизомераза. А – миокард, Б – скелетная мышца, В – простата. Стрелками отмечены 1 - триозофосфат изомераза, 2 - карбоангидраза 1, 3 - карбоангидраза 3. Пунк тирными прямоугольниками показаны участки возможной локализации карбоангидразы на ДЭ миокарда и простаты.
Как видно из представленных данных, карбоангидраза 1 присутствовала в трех обследованных мышечных органах. При этом в скелетных мышцах явно доминировала другая изоформа фермента – карбоангидраза 3. Однако карбоан гидраза 3 не детектировалась в миокарде, но фракция с подобными электрофо ретическими характеристиками имелась на ДЭ белков простаты.
Известно, что сердечная мышца человека претерпевает сложные преобразо вания в ходе индивидуального развития, которые иногда сопровождаются опре деленными нарушениями и могут приводить к различной патологии, например, к порокам сердца и кардиомиопатиям. При этом для сердца высших млекопи тающих (включая человека) в онтогенезе обычно выделяют, как минимум, два принципиально разных этапа: период эмбрионального развития и послеродовые возрастные изменения. В следующем цикле исследований из собранных коллек ций двумерных электрофореграмм (ДЭ), полученных из образцов миокарда эм брионов, начиная с 6-7 недель развития до рождения, выделили 13 мажорных белковых фракций, для которых ранее были показаны изменения в пренатальном периоде развития, и провели их масс-спектрометрическую идентификацию (Табл. 2).
Таблица 2. Результаты масс-спектрометрической идентификации 13 мажорных бел ковых фракций миокарда человека, для которых были показаны изменения в пренаталь ном периоде развития.
№ Наименование белка, неко- № по Иденти- % пере- Мм/pI Мм/pI торые синонимы (символ фикация* кры- (эксп.) (расчет.) Protein гена) тия NCBI Белок теплового шока 60, 1 77702086 239/24 46 58,0/5,25 58,0/5, шаперонин 60, (HSPD1) Десмин (DES) 2 55749932 468/39 62 54,0/5,20 53,4/5, АТФ-синтаза -изоформа 3 338/37 66 51,0/5,00 51,8/5, митохондр. (ATP5B) Тропомиозин 1 - вариант 4 89954539 199/6 16 28,0/4,70 28,5/4, 6 (TPM1) Тропомиозин 1 - изофор 5 63252900 59/7 21 33,0/4,70 32,9/4, ма 4 (TPM1) Трансферрин (TF) 6 115394517 131/20 24 76,0/6,60 75,2/6, Аконитаза 2 (ACO2) 7 49168620 206/23 39 84,0/6,90 82,4/6, -субьединица АТФ син 8 4757810 203 / 19 43 55,0/7,70 55,2/8, тазы (ATP5A1) 9 Миозин, легкая цепь 2 21411329 205/19 94 19,0/4,90 18,8/4, (MYL2) 10 Белок теплового шока 27, 662841 163/13 76 23,0/6,00 22, 8/5, HspB1 (HSPB1) 11 Белок теплового шока 27, 662841 207/14 78 23,0/5,70 22, 8/5, электрофоретическая изо форма 1 (HSPB1) 12 Белок теплового шока 27, 662841 166/6 24 23,3/5,50 22, 8/5, электрофоретическая изо форма 2 (HSPB1) 13 Белок теплового шока 27, 662841 139/8 37 22,5/5,50 22, 8/5, электрофоретическая изо форма 3 (HSPB1) * Вероятностный коэффициент достоверности/количество совпадающих масс пептидов Онтогенетические изменения этих белков были оценены сравнительным ко личественным анализом с использованием компьютерной денситометрии и по строены соответствующие 3D-модели. (Рис. 8). Как видно из рисунка, фракция № 1, идентифицированная как белок теплового шока 60, характеризовалась зна чительным содержанием в интервале 7-16 недель развития, а затем содержание этого белка к 21 неделе развития выходило на уровень, близкий к наблюдаемому в миокарде взрослых лиц. Фракция №2, принадлежащая по результатам иденти фикации десмину, практически не регистрировалась на ДЭ в образцах миокарда на 8 нед. развития, однако содержание этого белка постепенно увеличивалось к 15 неделе, а к 30-32 нед. пренатального периода развития достигало уровня, имевшегося в образцах миокарда взрослых лиц.
Нескоординированная экспрессия отмечалась также для нескольких изо форм белков, относящихся к семейству легких цепей миозина. С 5-6 недели раз вития детектировались только фракции эмбриональной желудочковой/ пред сердной ЛЦМ1 (ген MYL4) и желудочковой ЛЦМ1 (ген MYL3), тогда как про дукт гена MYL2 (ЛЦМ2, №9) на 5-6 неделях присутствовал в следовых количе ствах с повышением только к 8 неделе развития (Рис. 9).
Рис. 8. Фрагменты ДЭ белков миокарда (I) и соответствующие 3D-изображения (II) белковых фракций №1 (красные стрелки) и №2 (синие стрелки), которые изменялись в пренатальном онтогенезе и были идентифицированы как шаперонин 60 и десмин.
Как видно из Табл. 2, в списке идентифицированных белков присутствуют две субъединицы митохондриальной АТФ-синтазы (№ 3 и 8). Проведенный ана лиз выявил нескоординированную продукцию двух этих белков в пренатальном периоде, подобно той, что наблюдалось для различных ЛЦМ (Рис. 9).
Так, -изоформа АТФ-синтазы (№3) на ранних этапах была представлена ярко выраженной мажорной фракцией, которая к 24 нед. развития уменьшалась (по сравнению с близлежащими реперными белками) до уровня, характерного для зрелого миокарда. Другая идентифицированная субъединица (, №8) мито хондриальной АТФ-синтазы уверенно детектировать только на сроке 19-21 нед., затем наблюдалось значительное увеличение этой фракции с выходом к зрелому уровню на 24-26 нед. Таким образом, можно предположить, что в миокарде че ловека функционально активный комплекс митохондриальной АТФ-синтазы формируется постепенно к 24 нед. развития.
Рис. 9. Результаты протеомного анализа количественных изменений в пренатальном онтогенезе белков миокарда, представляющих семейство легких цепей миозина. Красная стрелка – желудочковая ЛЦМ1 (ген MYL3), синяя стрелка – регуляторная ЛЦМ2 (ген MYL2), зелёная стрелка - эмбриональная желудочковая/предсердная ЛЦМ1 (ген MYL4).
Вверху – фрагменты ДЕ, внизу - 3D модели.
Полученные данные идентификации позволили сформировать таблицу по тенциальных белковых биомаркеров некоторых этапов в пренатальном онтоге незе миокарда человека (Табл. 3).
Таблица 3. Результаты протеомного изучения некоторых идентифицированных бел ков миокарда человека в пренатальном онтогенезе (молекулярные маркеры стадий эм бриогенеза миокарда человека).
Название белка Маркируемый Срок выхода содержания (символ гена) этап гестации белка на уровень в зрелом миокарде ЛЦМ 2 (MYL2) До 8 нед 8 нед и далее Белок теплового шока 60 кДа (HSPD1) 7-16 нед 21 нед АТФ-синтаза -субъединица (ATP5B) 7-20 нед 21 нед Альфа тропомиозин 1 вариант 6 (TPМ1) До 18 нед 19 нед Альфа тропомиозин 1 (TPМ1) До 18 нед 19 нед Белок теплового шока 27 кДа (HSPB1) До 19 нед 21 нед Трансферрин (TRFE) До 20 нед 21 нед АТФ синтаза -субьединица (ATP5A1) До 21 нед 21 нед Десмин (DES) 8-30 нед 30 нед ЛЦМ эмбриональная желудочко- До 40 нед 1-3 года вая/предсердная (MYL4) Постнатальное исследование белков левого желудочка сердца человека про водилось на 90 образцах миокарда, полученных от лиц, погибших в результате несчастного случая, без явных признаков сердечной патологии, учитывая их распределение по полу и возрасту. Все образцы были сформированы в 5 групп:
10-20 лет, 21-30 лет, 31-40, 41-50 лет, старше 51. В анализируемой выборке в спектре белков миокарда наблюдались качественные различия, коррелировав шие с возрастом, по пяти белковым фракциям, располагавшимися на ДЭ в виде двух различных групп, которые по результатам масс-спектрометрической иден тификации оказались продуктами гена -актина (ген ACTC1) и альбумина (ген ALBU) соответственно (Рис. 10). Как видно из представленных данных, две фракции, составившие группу I, характеризовались одинаковой рI (5.60), но раз ной Мм (33.2 и 37.3 кДа). Они выявлялись даже у некоторых представителей из возрастной категории 21-30 лет (почти 25% случаев) с постепенным увеличени ем пропорции с возрастом. Проведенная идентификация показала, что указанные фракции представляют собой продукты гена ACTC1, но отличаются меньшими Мм от полноразмерного - актина (41.7 кДа.).
При этом во фракции с Мм 37 кДа были выявлены только те пептиды, кото рые соответствовали области от 53 а.о. до 374 а.о. из полной последовательности -актина, содержащей 377 а.о, а. во фракции с Мм 33 кДа - от 87 а.о. до 374 а.о.
Таким образом, можно считать, что эти возраст – зависимые белковые фракции являются укороченными производными - актина, лишившимися N-концевых участков, имеющиеся в полной последовательности -актина.
Возраст-зависимая группа II была представлена белковыми продуктами гена ALBU. Анализ результатов масс-спектрометрической идентификации показал, что в каждом из белков группы II обнаруживаются пики масс пептидов, пере крывающих только часть аминокислотной последовательности альбумина, на чинающуюся с 237 а.о. (для фракций с Мм 44,2 кДа и 44,1 кДа) или с 250 а.о.
(для фракции с Мм 43,2 кДа) и практически до С-конца молекулы.
Рис. 10. Фрагменты ДЭ с распо ложенными на них белковыми фракциями группы I (продукты гена ACTC1), которые изменя лись с возрастом. А – 10-20 лет, Б – 21-30 лет, В – 31-40, Г – 41 50 лет, Д – 51 и более. Е,Ж,З – случаи ХИБС в возрасте до лет.
Стрелками без номеров показа ны возраст-зависимые фракции.
Стрелками с номерами обозна чены реперные фракции: 1 сердечная изоформа тропонина Т, 2-полноразмерный -актин, - -тропомиозин, 4 – легкая цепь миозина 1.
Различия в значениях pI у белков группы II дают основание думать, что они могут быть и следствием посттрансляционных модификаций (Рис. 11).
Рис. 11. Фрагменты двумерных электрофореграмм зоны белков, коррелирующих с возрастом (про дуктов гена ALBU). А – 10-20 лет, Б – 21-30 лет, В – 31-40, Г – 41- лет, Д – 51 и более.
Стрелками без номеров обозначе ны возраст-зависимые фракции производные альбумина,. стрелкой с номером 1 – референсная фрак ция (полноразмерный -актин) В целом, результаты выполненных протеомных исследований белков мио карда человека в постнатальном онтогенезе суммированы в Табл. 4.
Таблица 4. Распределение образцов по возрасту и найденным возраст-зависимым белкам.
Возрастные Количество Число лиц, имевших Число лиц, имевших группы лиц в группе фрагменты альбумина фрагменты -актина 10 - 20 лет 8 0 21 - 30 лет 15 4 31 - 40 лет 35 21 41 - 50 лет 18 14 более 51 года 14 14 Всего 90 63 Следует отметить также, что в контрольной группе все 5 указанных возраст зависимых белков вместе не были обнаружены ни у кого из лиц с возрастом ме нее 35 лет, тогда как в группе из 10 больных с ХИБС при возрасте менее 35 лет имели полный набор этих белков (Табл. 5).
Таблица 5. Распределение по найденным возраст-зависимым белкам в контроле и при ХИБС в возрастной группе до 35 лет.
Количество лиц в Число лиц, имевших Число лиц, имевших Группы группах фрагменты -актина фрагменты альбумина Контроль / ХИБС до 35 лет 40/10 14/10 3/ Таким образом, полученные данные позволяют думать, что указанные воз раст-зависимые белки, могут быть каким-то образом вовлечены в патогенез хро нической ишемии миокарда.
3. Разработка общих принципов построения многомодульных протеомных баз данных и создание базы данных «Протеомика мышечных органов» (версия 2012 года).
Выполнявшиеся на протяжении ряда лет протеомные исследования белков различных мышечных органов в норме и при патологии привели к накоплению значительного информационного массива из соответствующих эксперименталь ных данных. Для оптимизации работы с собранными информационными мате риалами предпринималось несколько попыток к созданию обобщающей отече ственной базы данных [Шишкин С.С. с соавт. 2004;
Ковалева М.А. с соавт. 2008, 2009 и др.]. При этом удалось сформулировать ряд принципов и подходов, кото рые были использованы в настоящей работе для создания отечественной базы данных «Протеомика мышечных органов» (БД «ПМО») и версии 2012 года спе циализированной базы данных «Протеомика рака простаты» (БД «ПРП») (пп.4).
Эти принципы включают в себя:
Принцип многомодульности – создание отдельных информационных мо дулей для каждого вида изучавшихся объектов.
Принцип многоуровневости - возможность под визуальным контролем помечать различные белки на картах, создавая специальные ссылки («кнопки») для перехода на следующие информационные уровни – второй, третий и четвер тый, предназначающиеся для различных сведений об отдельных изучавшихся белках.
Принцип комплексности – возможность перехода от одного модуля к дру гому.
Принцип повышения эффективности фракционирования БПГЭ – возмож ность создания дополнительных модулей или наложений синтетических изобра жений различных модификаций фракционирования белков.
Принцип возможности постоянной детализации информации - возмож ность создания новых полей для записей информации.
Принцип оптимизации – возможность совершенствования дизайна ин формационной базы.
БД «ПМО» выполнена в виде интерактивного web-ресурса на основе СУБД MySQL, который позволяет исследователям в режиме on-line просматривать, вводить и редактировать данные о белках, имеющихся в тканях и мышечных органах в норме и при патологических состояниях. БД «ПМО» расположена по адресу http://mp.inbi.ras.ru и существует в двух версиях – на русском и англий ском языках.
Программная оболочка БД обладает широкими функциональными возмож ностями: создание последующих и корректировку существующих модулей, соз дание новых и редактирование имеющихся карточек белков;
редактирование информационных полей в карточке белка и доступ к карточке белка под визу альным контролем (с помощью «мыши»);
включение гиперссылок в карточку белка;
возможности поиска белков по выбранным модулям и др.
БД «ПМО» состоит из пяти основных и двух дополнительных взаимосвя занных модулей. Основные модули содержат протеомную информацию о мы шечных органах человека, а дополнительные несут информацию о культивируе мых мышечных клетках. Каждый из модулей наряду с протеомной информацией содержит и определенные биомедицинские данные о белках соответствующего биообъекта. Основой модулей являются синтетические двумерные карты, пред ставляющие собой обобщенные результаты фракционирования двумерным элек трофорезом белков соответствующих объектов. На каждой карте показаны бел ки, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии и других методов (первый информационный уровень), обеспечивается доступ к карточке белка под визуальным контролем. В карточке белка представлены данные, полученные при изучении свойств каждого из идентифицированных белков (второй уро вень), собраны различные литературные сведения об этом белке (третий уро вень) и представлены гиперссылки, связывающие описание белка в БД с соот ветствующими записями в публичных базах данных NCBI и UniProt (четвертый уровень). Общие сведения о модулях в БД «ПМО» приведены в Табл. 6, два из этих модулей являются комплексными, общее количество идентифицрованных фракций превысило 500.
Таблица 6. Модули в БД «ПМО» и количество идентифицированные в них белков.
Основные и дополнительные модули (синтетические карты белков Идентифициро для исследуемых объектов) ванные белки Белки миокарда (комбинированный модуль) Белки скелетной мышцы (m. vastus lateralis) Основ- Белки миометрия ные Белки средней оболочки аорты Белки биоптатов предстательной железы (гиперплазия, рак) Белки недифференцированных и дифференцированных Дополни- миобластов человека (комбинированный модуль) чело тельные века Белки клеток рабдомиосаркомы (линия А-204) Принципиальное значение сердечной мышцы для жизнеобеспечения и ши рокая распространённость патологических процессов, захватывающих миокард, во многом предопределили особую заинтересованность в использовании БД «ПМО» для комплексного изучения белков миокарда человека. С этой целью сначала с использованием описанных ранее результатов и компьютерных техно логий при формировании модуля «Белки миокарда» в качестве основы были вы браны ДЭ белковых экстрактов из аутоптатов миокарда человека, получены их компьютерные изображения и построена соответствующая синтетическая дву мерная карта. На этой карте среди идентифицированных фракций оказались изоформы миозиновых легких цепей, актин, изоформы тропомиозинов, тропо нинов, десмин, мышечная креатинфосфокиназа и некоторые другие известные мышечные белки, в частности, некоторые ферменты метаболизма углеводов (изоформы аконитазы, енолазы, триозофосфатизомераза 1 и др.) Далее существенной составляющей при формировании данного модуля ста ли также результаты протеомных исследований белков миокарда человека в пренатальном онтогенезе, которые были представлены в пп. 2. Как и ранее, по лученные цифровые изображения для построения комплексной (обобщенной) двумерной карты редактировали в графическом редакторе из пакета программ ImageMaster 2D Platinum (версия 7), а также с помощью метода компьютерного «наложения изображений», применяя опцию «Слой» графического редактора Adobe Photoshop. При этом в качестве реперных точек были использованы спе циально выбранные белковые фракции с одинаковыми электрофоретическими свойствами, часть из которых являлась и по результатам масс спектрометрической идентификации одними и теми же белками. В частности, для указанных целей применяли следующие фракции: аконитазы, шаперонина 60, десмина, актина, тропомиозинов, легких цепей миозина и др. Построенную таким образом комбинированную синтетическую двумерную карту белков при менили в качестве основы при создании первого информационного уровня в комплексном модуле «Белки миокарда» (Рис. 12).
Кроме комплексного модуля «Белки миокарда», в процессе работы анало гичным способом был сформирован дополнительный комплексный модуль «Белки недифференцированных и дифференцированных миобластов человека».
При этом использовались ранее полученные совместно с А.А. Макаровым ре зультаты протеомного изучения белков из недифференцированных и дифферен цированных in vitro миобластов человека [Макаров А.А. с соавт. 2009].
Рис. 12. Первый уровень в комплексном модуле «Белки миокарда» человека;
черным цве том показаны белковые фракции, полученные при анализе белковых экстрактов взрос лых;
другими цветами – белковые фракции четырех участков ДЭ эмбриональных образ цов (8,5 недель) со специфическими особенностями: на участке легких цепей миозина фиолетовым цветом;
на участке тропомиозиновых белков – красным;
на участке шаперо нина-десмина – синим;
на участке HSP 27 – оранжевым.
Соответствующие данные удалось обобщить и детализировать (включая масс-спектрометрическую идентификацию различных белковых фракций). Так, в качестве основы при формировании первого уровня для указанного модуля были выбраны ДЭ белковых экстрактов из недифференцированных миобластов человека. Компьютерные изображения этих ДЭ использовались для построения начальной синтетической двумерной карты. Затем полученные цифровые изо бражения для построения комплексной (обобщенной) двумерной карты совме щали, как описано выше, с цифровыми изображениями ДЭ белков из дифферен цированных in vitro миобластов.
В качестве реперных точек использовались общие белковые фракции, иден тифицированные как изоформы белков теплового шока (HSPA9), митохондри альной АТФ-синтазы;
актина, тропомиозинов, трансгелина, белка S100A10 и др. Кроме того, на обобщенную синтетическую карту были нанесены фракции гистоновых белков (дополнительной реперной точкой служила фракция, иден тифицированная как пептидилпролилизомераза В;
PPIB). На итоговой ком плексной карте белки, полученные из недифференцированных миобластов, ок рашены в различные оттенки серого цвета, а белки, полученные из клеток диф ференцированных миобластов, обозначены красным цветом (Рис. 13).
Рис. 13. Первый уровень в комплексном модуле «Белки недифференцированных и дифференцированных миобластов человека». Формирование комплексного модуля «Бел ки миобластов». Красным цветом показаны фракции препарата «Ядерные белки миобла стов»;
голубым цветом в пунктирном овале обозначена фракция -тропомиозина, появ ляющаяся в процессе дифференцировки.
В ходе работы по формированию данного модуля удалось выявить сущест венные различия по 12-и белковым фракциям. Среди изменявшихся белков ока зались два белка S100A11 и изоформа 1 -тропомиозина, которые привлекли особое внимание. Для подтверждения изменений в ходе клеточной дифференци ровки указанных белковых фракций дополнительно с использованием компью терной денситометрии был проведен их сравнительный количественный анализ.
Полученные результаты представлены на Рис. 14.
Из приведенных данных видно, что содержание белка S100A11 (по сравне нию с соседними реперными белками) сразу после индукции дифференцировки кратковременно увеличивалось, а затем к четвертому дню дифференцировки эта фракция практически переставала детектироваться. В отличие от белка S100A изоформа 1 -тропомиозина только появилась на шестой день дифференциров ки. Как следствие, указанные белки можно рассматривать в качестве участников и потенциальных биомаркеров миогенной дифференцировки.
А Б Рис. 14. Фрагменты ДЭ (I) и соответ ствующие 3D-изображения (II) бел ков, экстрагированных из пролифе рирующих и дифференцирующихся миобластов человека на разных сро ках до и после индукции дифферен цировки. А - зоны белка S100A11;
Б зоны тропомиозинов. Вверху указан срок инкубации клеток в дифферен цировочной среде (день –2 – за два дня до начала индукции дифферен цировки).
Другие модули строились без комбинирования синтетических изображений.
В частности, при формировании модуля «Белки скелетной мышцы (m. vastus lateralis)» данные протеомного анализа образцов этой мышцы (полученные ранее совместно с Ивановым А.В. и другими соавторами [Ковалева М.А. с соавт.
2009]) дополнялись и уточнялись.
Параллельно модуль «Белки скелетной мышцы (m. vastus lateralis)» был ис пользован для анализа протеомных изменений в скелетных мышцах при некото рых заболеваниях, проявляющихся тяжелым поражением мышечной ткани. Так, при протеомном анализе белковых экстрактов из биоптатов скелетных мышц от больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС) удалось обнаружить оп ределенные количественные и качественные изменения. В частности, у больных генерализованной формой БАС практически полностью отсутствовали или ха рактеризовались резким снижением содержания четыре близко расположенных на ДЭ белковых фракции (Рис. 15). Три из них обладали одинаковыми Мм ( кДа) и различались по величинам рI (5.96, 6.01 и 6.04), а четвертая - характери зовалась отношением Мм/pI 32 кДа / 6.34.
Рис. 15. Фрагменты ДЭ белков из биоптатов скелетной мышцы, где были локализованы зоны, изменяю щиеся при БАС белковые фракции. А – норма (пациент без БАС), Б – боль ной БАС в начальной стадии заболе вания, В – стадия генерализации БАС. Стрелками отмечены исчезаю щие белки Результаты масс-спектрометрической идентификации показали, что все от меченные белки являются продуктами гена TNNT1, который детерминирует об разование медленных изоформ скелетномышечного тропонина Т1. Среди наиболее представленных мышечных белков на долю четырёх исчезающих фракций из общего содержания белка, зарегистрированного на ДЭ, приходится 0,1%, 0,2%, 0,3% соответственно. При этом у пациентов, находящихся в началь ной стадии БАС, отмечалось динамическое снижение представленности указан ных фракций до следовых количеств, тогда как у пациентов с генерализованной формой БАС зарегистрировать соответствующие белки не удавалось.
Таким образом, зависимое от стадии развития болезни постепенное сниже ние содержания в мышцах больных БАС четырех электрофоретических вариан тов медленной изоформы скелетномышечного тропонина Т1 указывает на воз можную их вовлечённость в патогенез БАС.
Результаты параллельно проводившегося протеомного анализа трех мышеч ных органов, содержащих гладкомышечные волокна (миометрий, средняя обо лочка аорты и простата), нашли применение при формировании соответствую щих модулей в БД «ПМО». При этом изучение белковых профилей этих органов позволило выявить необычайную множественность электрофоретических изо форм трансгелина 1, общее количество которых после масс-спектромерической идентификации достигло 22. В образцах миометрия человека удалось зарегист рировать 11 электрофоретических изоформ трансгелина 1, в медиальном слое аорты – 14, а в биоптатах простаты – 15. Полученные результаты обобщены на Рис. 16 и в Табл. 7.
Известно, что в геноме человека имеется как минимум три гена, кодирую щих трансгелиновые белки. Основной трансгелин человека (или трансгелин 1), названный сначала SM22-alpha, присутствует в гладкомышечных клетках раз личных органов и тканей, кроме того, этот белок выявлялся и в культивируемых фибробластах. Этот трансгелин кодируется геном TAGLN, экспрессия которого происходит с альтернативным сплайсингом, приводящим к образованию двух транскриптов, различающихся по размерам, но обеспечивающих синтез одного и того же белка из 200 а.о. Был найден ещё один родственный транскрипт, коди рующий последовательность из 184 а.о. (трансгелин-вариант) [по UniProt]. С учетом этих литературных данных среди обнаруженных электрофоретических изоформ фракция № 2 (Рис. 16), идентифицированная как трансгелин из 200 а.о.
и наибольшая по количественной представленности, в БД «ПМО» была обозна чена как Tgn1, а четыре родственные ей фракции – как её изоэлектрические изо формы (ei – ei3).
Рис.16. Множественность электрофоретических изо форм трансгелина 1 в трех органах человека, содержа щих гладко-мышечные во локна. А - фрагменты ДЭ, на которых локализованы электрофо-ретические изо формы трансгелина 1: a миометрий, б - медиальный слой аорты, c – простата. Б результаты сравнительного компьютерного анализа (методом «наложения») соответствующих фрагмен тов ДЭ с изоформами транс гелина :
a - миометрий, б – медиаль ный слой аорты, в – проста та.
Таблица 7. Электрофоретические изоформы трансгелина 1, идентифицированные в трех органах человека, содержащих гладкомышечные волокна.
№ Наименование белка и его Простата Миометрий Аорта (tunica pI/Mw обозначение в БД ПМО»* экспер. media) Трансгелин, Tgn1-ei (T200) 1 22,5/8,40 + + + «--»Tgn 2 22,5/7,80 + + + «--»Tgn1-ei 3 22,5/7,45 + + + «--»Tgn1-ei 4 22,5/6,95 + + + «--»Tgn1-ei 5 22,5/6,75 + - + Трансгелин вариант (T184) 6 21,0/6,95 - - + aTgn-v «--» Tgn-v 7 20,0/7,25 + + + «--» amTgn-v 8 18,3/7,50 - + + «--» amTgn-v 9 18,3/7,40 - + + «--» amTgn-v 10 18,3/6,75 - + + «--» amTgn-v 11 18,3/6,70 - + + «--» apTgn-v 12 18,3/6,50 + - + «--» mTgn-v 13 18,1/6,46 - + «--» Tgn-v 14 18,0/6,55 + + + «--» aTgn-v 15 17,8/6,55 - - + «--» pTgn-v 16 21,0/6,42 + - «--» pTgn-v 17 20,5/7,15 + - «--» pTgn-v 18 20,2/6,85 + - «--» pTgn-v 19 18,7/6,88 + - «--» pTgn-v 20 20,0/6,42 + - «--» pTgn-v 21 18,06,30 + - «--» pTgn-v 22 17,8/6,88 + - * aTgn-v - трансгелин-варианты, специфичные для аорты, amTgn-v - трансгелин варианты, обнаруженные в аорте и миометрии;
apTgn-v трансгелин-варианты, обнару женные в аорте и простате;
mTgn-v трансгелин-вариант, специфичный для миометрия;
pTgn-v - трансгелин-варианты, специфичные для простаты.
Tgn1 и практически все родственные ему фракции присутствовали в каждом из изучавшихся трех мышечных органов, содержащих гладкомышечные волок на, но в разных количественных соотношениях (Рис. 16, Табл. 7). В отличие от этого среди остальных электрофоретических изоформ трансгелина (которые бы ли идентифицированы как трансгелин-варианты, Т184) только фракции № (Tgn-v1) и 14 (Tgn-v2) удалось выявить в каждом из изучавшихся органов. Ос тальные проявляли различную тканеспецифичность.
Таким образом, сравнительный анализ результатов протеомного анализа трех мышечных органов, содержащих гладкомышечные волокна (миометрий, средняя оболочка аорты и простата), обобщенных в соответствующих модулях БД «ПМО», позволил установить, что в этих органах имеется множественность изоформ трансгелина, и указанные изоформы могут рассматриваться как потен циальные тканеспецифичные биомаркеры.
4. База данных «Протеомика рака простаты» и её новая версия (2012 г.).
Параллельно с информационным наполнением БД «ПМО» проводились циклы исследований, направленные создание и развитие специализированной БД «Протеомика рака простаты» (БД «ПРП»), предназначавшейся для оптими зации поисков потенциальных белковых биомаркеров указанного заболевания, размещенной по адресу http://ef.inbi.ras.ru.
Основой БД «ПРП» стал модуль «Белки биоптатов предстательной железы (гиперплазия, рак)», который в первых версиях (2009-2010 гг.) дополняли моду ли, содержащие информацию о белках нескольких культивируемых клеточных линий человека, включая LNCaP и РС-3 (моделирующие рак простаты), а также BPH-1 (моделирующая доброкачественную гиперплазию) [Шишкин С.С. с соавт.
2010].
В период 2011-2012 гг. БД «ПРП» была расширена за счет увеличения числа идентифицированных белковых фракций в разных модулях и включения двух дополнительных модулей – комплексного модуля «Белки клеток DU-145» (мо делирующих рак простаты) и обычного модуля «Белки клеток OKP-GS» (моде лирующих рак почки).
Сначала при получении белкового профиля клеток линии DU-145 были оп робованы три варианта протеомного фракционирования экстрактов суммарных белков и собрана коллекция ДЭ суммарных белковых экстрактов c различным содержанием белка, которая использовалась при построении синтетического изображения. С помощью масс-спектрометрии на ДЭ суммарных белковых экс трактов клеток линии DU-145 были идентифицированы 52 белковые фракции.
Расположение этих фракций на ДЭ показано на Рис 17.
Параллельно, используя набор реагентов фирмы «Qiagen» по протоколу фирмы-производителя, получали препараты фосфопротеинов из клеток DU- и анализировали эти белки протеомными технологиями. Проведенная компью терная денситометрия изображений таких ДЭ позволила выявить более 150 бел ковых фракций (Рис. 18). Подавляющее большинство этих белков обладали Мм в диапазоне от 12 до 100 кДа и широко различались по изоэлектрическим точ кам, располагаясь практически по всей ширине ДЭ. Девять фосфопротеинов из клеток DU-145 (в частности, изоформу гетерогенного ядерного рибонуклеопро теина C1/C2, кальретикулин, ядерный белок В1 группы высокой подвижности и др.) удалось идентифицировать с помощью масс-спектрометрии, они показаны фиолетовыми стрелками на Рис. 18.
Кроме того, в соответствии с общей стратегией протеомных исследований далее были проведены работы по системному исследованию ядерных белков, включающих средне- и низкокопийные белки. Для указанных целей использова лась разработанная ранее схема предварительного фракционирования клеточных гомогенатов, полученных в условиях мягкого разрушения клеток с помощью процедуры «замораживание - оттаивание» в присутствии неионного детергента Тритона Х-100.
Рис. 17. Типичная ДЭ суммарного экстракта белков из клеток линии DU-145. Окра ска азотнокислым серебром. Синими стрелками и номерами (1-52) обозначены фракции белков, идентифицированных с помощью масс-спектрометрии.
Рис. 18. Результаты протеомного анализа (IEF-2DE) фосфопротеинов, сорбирован ных на колонке фирмы «Qiagen», Окраска азотнокислым серебром. Фиолетовыми стрел ками и цифрами обозначены фракции, для которых проводилась масс спектрометрическая идентификация. Справа на ДЭ показаны белки – маркеры Мм.
Эта схема, включающая дифференциальное центрифугирование, позволила получить для дальнейшего протеомного исследования три препарата ядерных белков – «суммарные белки ядер», «гистоны» и «белки ядерного матрикса». Ре зультаты протеомного анализа препаратов «Суммарные белки ядер» показаны на Рис. 19.
Рис. 19. ДЭ препарата «Суммарные ядерные белки» DU-145., окраска азотнокислым се ребром. Стрелками и цифрами обозначены белковые фракции, идентифицированные масс-спектрометрическими методами. Пунктирными прямоугольниками выделены изо формы некоторых представителей семейства гетерогенных ядерных рибонуклеопротеи нов (hnRNP).
Суммированием описанных выше результатов протеомного изучения цель ного белкового экстракта из раковых клеток линии DU-145, а также препаратов фосфопротеинов и ядерных белков, было осуществлено построение обобщенно го протеомного профиля (синтетического изображения) с помощью пакета про грамм ImageMaster 2D Platinum 7.0. Существенным условием для обеспечения этого построения стало то, что на ДЭ различных белковых препаратов оказались белковые фракции с одинаковыми электрофоретическими свойствами, часть из которых являлась и по результатам масс-спектрометрической идентификации одними и теми же белками. Такие фракции (в частности, изоформы представи телей семейства hnRNP) были использованы в качестве реперных точек для обеспечения совмещения анализируемых изображений. (Рис. 20).
Построенная карта была загружена в БД «ПРП» и стала основой для форми рования принципиально нового модуля «Белки клеток DU-145».
Рис. 20. Итоговая обобщенная синтетическая двумерная карта белков культивируемых клеток линии DU-145, черным цветом показаны белковые фракции, полученные при ана лизе суммарных белковых экстрактов, зеленым – фосфопротеинов, жёлто-коричневым – «Суммарные ядерные белки», красной окантовкой – «Гистоны» В целом, в новой версии БД «ПРП» (2012г.) общее число идентифицирован ных фракций составило 570 по сравнению с 359 в первых версиях (2009- гг.). Общая информация о БД «ПРП» представлена в Табл. 8.
Таблица 8. Модули в обновленной БД «ПРП» (версия 2012 г.) и идентифицированные в них белки (для сравнения включены соответствующие данные о более ранних версиях).
Модули – синтетические карты белков в исследуе- Идентифицированные мых объектах (метод фракционирования) белки Версия 2010 Версия Белки биоптатов предстательной железы (рак и ги- 165 перплазия) Белки клеток LNCaP (IEF-PAGE) 60 Белки клеток LNCaP (IPG-PAGE) 18 Белки клеток PC-3 (IEF-PAGE) 25 Белки клеток DU-145 (комплексный модуль, вклю- - чающий фософопротеины, ядерные белки, белки фракции гистонов и остаточные белки ядерного матрикса) Белки клеток BPH-1 (IEF-PAGE) 24 Белки клеток рабдомиосаркомы (IEF-PAGE) 29 Белки нормальных миобластов человека (IEF-PAGE) 38 Белки клеток OKP-GS - Кроме того, версия 2012 г. БД «ПРП» представлена на двух языках (на рус ском и на английском).
С помощью БД «ПРП» было определено несколько потенциальных биомар керов этого заболевания [Шишкин С.С. с соавт. 2010]. Дальнейшая детализация показала, что один из таких белков – AGR-2 представляет особый интерес. Про веденные исследования в биоптатах рака простаты и доброкачественной гипер плазии, а также клеточных линий, показали, что AGR-2 содержится в раковых клетках простаты, а в образцах «гиперплазия» практически не детектируется (Рис. 21). Выявленные биомаркерные свойства AGR-2 при раке простаты в соче тании с имеющимися сведениями о появлении AGR-2 в биологических жидко стях позволяют рассматривать этот белок как перспективный кандидат для раз работок соответствующих диагностических тест-систем и начала клинических исследований по их валидации.
Белок Биоптат Биоптат LNCaP PC-3 BPH- (биомаркер) (гиперплазия) (рак) (рак) (рак) (гиперплазия) Cyclophiflin 511,4 281,3 519,4 262,2 327, Не выявлен Не выявлен AGR-2 202,6 266,7 409, Рис. 21. Обобщенные данные сравнительной компьютерной денситометрии биомаркера AGR-2 в разных биообразцах «рак» и «гиперплазия» простаты. Красными стрелками по казаны фракции AGR-2, голубыми – реперного белка циклофилина B. В таблице даны результаты количественного определения соответствующих белковых фракций.
В рамках данной работы была также выполнена идентификация фракции № 4716560, которая оказалась белковой дисульфидизомеразой изоформой А3. Сде ланные к настоящему времени количественные оценки содержания белковой дисульфидизомеразы А3 (по отношению к реперному белку десмину) по анализу построенных 3D моделей в образцах раковой ткани (1,64 0,72) достоверно пре вышали аналогичные оценки в образцах «гиперплазия» (0,47 0,12, p0,05) (Рис. 22).
Рис. 22. Фрагменты ДЭ разных биообразцов «гиперплазия» (слева) и «рак» (справа) про статы, на которых локализова на белковая дисульфидизоме раза А3, а также обобщенные данные сравнительной ком пьютерной денситометрии (2D и 3D модели) этого биомарке ра. Красными стрелками пока заны фракции белковой ди сульфидизомеразы А3, голу быми – реперного белка изо формы десмина.
Таким образом, созданный в результате проведенных протеомных исследо ваний специальный отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты» позволил оптимизировать работу по изучению белковых профилей в тканях простаты при ДГП и РП, а также в нескольких клеточных линиях челове ка.
5. Протеомные технологии для выявления «безымянных» (unnamed), «ги потетических» (hypothetical) и других малоизученных белков.
С началом постгеномной эры так называемые «безымянные» (unnamed) и «гипотетические» (hypothetical) белки фактически стали особыми категориями в общей белковой номенклатуре. Построение БД «ПМО» и особенно «ПРП» стали предпосылками для целенаправленного поиска белков, которые можно было бы отнести к указанным категориям.
Так, ещё на стадии формирования начальной версии базы данных «ПРП» удалось выявить в биоптатах простаты с раковыми опухолями фракцию, резуль таты идентификации которой свидетельствовали, что по первичной структуре это «безымянный белок», зарегистрированный в базе данных Protein NCBI под номером 21758704 (66% покрытия триптическими пептидами предсказанной аминокислотной последовательности) (Рис. 23).
Сведения о возможном существовании данного «безымянного белка» пред ставили японские исследователи [08-JUL-2002;
Sugano,S. and Suzuki,Y. по 21758704 Protein NCBI], выявившие при изучении кДНК-библиотеки (получен ной из образцов тканей яичка человека) клон с соответствующей кодирующей последовательностью. В нашей базе данных «ПРП» этот белок получил обозна чение – NEDO (Рис. 23).
Рис. 23. Результаты протеомного выявле А ния и масс-спектрометрической идентифи кации безымянного белка NEDO. А фрагмент синтетической карты в модуле «Белки биоптатов предстательной желе зы», пунктирным фиолетовым овалом по казан безымянный белок NEDO;
Б – рас пределение выявленных триптических пептидов (красный шрифт) по предсказан ной аминокислотной последовательности «безымянного белка 21758704 Protein NCBI Б Обобщенные данные об определении «безымянных» и «гипотетических» белков человека в биоптатах тканей простаты с раковыми опухолями представ лены в Табл. 9.
Таблица 9. Белки, охарактеризованные как «безымянные» (unnamed protein product, Homo sapiens) и «гипотетические» при протеомном изучении биоптатов тканей простаты с ра ковыми опухолями.
№ Наименование белка и Номера в Идентифи- % сов- Мм/pI Мм/pI обозначения в БД кация падения (эксп.) (расчет) Protein «ПРП» NCBI/ локус * Genbank «Безымянный белок», 1 21758704 / 66 18,0/8,80 18,1/9, NEDO BAG «Безымянный белок», 2 194377764 / 38 / 10 50 30,5/8,80 31,2/9, pUP-1 BAG «Безымянный белок», 3 221039916 / 34 / 8 60 21,0/9,20 21,5/11, pUP-2 BAH «Безымянный белок», 4 193787802 / 94 / 10 16 76,5/7,05 70,6/9, сходный с полиадени- BAG лат-связывающим бел ком 1, pUP- «Безымянный белок», с 5 21757066 / 110/7 16 52,8/6,57 51,8/8, иммуноглобулиновыми BAC доменами, pUP- Гипотетический белок, 6 51476663 / 27 52,5/6,59 55,0/10, HP-MA-1 CAH При протеомном изучении в образцах тканей простаты была обнаружена ещё одна интересная, но непостоянно встречающаяся фракция. Из 144 исследо ванных образцов (37 – ДГПЖ, 107 – рак) её удалось выявить в 8 случаях (5,6%).
При масс-спектрометрической идентификации методом MALDI-TOF был полу чен масс-спектр триптических пептидов, который по результатам анализа был расценен как принадлежащий белку PRO2044, содержащему альбуминовый до мен. Выявленные триптические пептиды покрывали 44% предполагаемой ами нокислотной последовательности PRO2044. Вместе с тем электрофоретические свойства указанного белка явно отличались от расчетных значений (Мм/pI экс периментальные - 14,5/6,75;
Мм/pI расчетные - 29,2/6,97 по 6650826 Protein NCBI). При этом в других протеомных исследованиях экспериментальные зна чения Мм PRO2044 были близки к расчетным. Практически в два раза меньшая молекулярная масса у белка, выявленного при раке простаты, позволяет думать, что этот белок, возможно, является фрагментом (или резко укороченной фор мой) PRO2044. Ещё один малоизученный белок, содержащий альбуминовый домен (PRO2675), достаточно специфично выявлялся при РП, не обнаруживался у больных доброкачественной гиперплазией, а также у здоровых лиц, что позво лило запатентовать его как биомаркер данного заболевания [Ковалев Л.И. с со авт. 2009].
Среди малоизученных белков, идентифицированных при анализе изучав шихся биообъектов, отдельную группу образовали так называемые укороченные формы. В целом, было выявлено и идентифицировано 7 укороченных изоформ у различных белков, в частности, у поли (А) связывающего белка 1 цитоплазмы, тропомиозина -3, гуанин-нуклеотид связывающего белка, фосфоглюкомутазы 3, пероксиредоксина 6, виментина, ламинина -1.
6. Использование протеомных технологий для изучения белковых биомар керов у некоторых лабораторных животных и в мясных продуктах.
Создание БД «ПМО» позволило организовать ещё один цикл исследований, направленных на выявление некоторых ткане- и видоспецифичных белков для их применения при решении определенных практических задач, связанных с обеспечением эффективного контроля за качеством мясного сырья и мясных продуктов (на примере образцов вареных колбас сорта «Докторская»).
На ДЭ белковых экстрактов, полученных из образцов мясного сырья (говя дины и свинины), а также образцов конечных продуктов (колбас сорта «Доктор ская»), стандартно детектировались сотни белковых фракций, окрашиваемых Кумасси R-250. Полученные протеомные профили характеризовались опреде ленным сходством. На Рис. 24 в качестве примера представлен результат анализа образца колбасы сорта «Докторская». При этом масс-спектрометрическими ме тодами было идентифицировано более 34 мажорных белков, среди которых ока зались: ряд основных сократительных белков (актин, тропомиозины, легкие це пи миозина, тропонины Т и I), а также другие известные белки мышечных орга нов (мышечная креатинфосфокиназа, В кристаллин, енолаза, карбоангидраза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, альдолаза А, миоглобин и пр.).
Рис. 24. Типичная ДЭ, полученная при анализе белкового экстракта докторской кол басы. Окраска Кумасси R-250. Стрелками с номерами обозначены все белковые фракции, идентифицированные масс-спектрометрией, при этом красным цветом указаны белки, идентифицированные как свиные (Sus scrofa), синим цветом белки коровьего происхож дения (Bos taurus), фиолетовым – казеины молока, черным цветом – белки животного происхождения, общие для свинины и говядины.
Далее, используя в качестве эталона образцы колбасы сорта «Докторская», приготовленной в строгом соответствии с ГОСТ, были количественно характе ризованы шесть групп легко узнаваемых и хорошо воспроизводимых белковых фракций, которые были идентифицированы как мажорные мышечные белки - и -тропомиозины, структурные и фосфорилируемые легкие цепи миозина, изо формы мышечной енолазы, креатинфосфокиназы, альдолазы А и глицеральаль дегид-3-фосфатдегидрогеназы и миоглобины. Полученные количественные по казатели рассматривались как референсные значения и послужили основой для последующего определения общего количества мясного сырья в коммерческих образцах колбасных изделий (Рис. 25).