Метил-днк связывающие белки с доменами цинковые пальцы: молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута.

На правах рукописи

Прохорчук Егор Борисович Метил-ДНК связывающие белки с доменами «цинковые пальцы»: молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаута.

03.01.03- молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва- 2011

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии клеток млекопитающих Центра «Биоинженерия» РАН и в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института биологии гена РАН Оффициальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Арчаков Александр Иванович Доктор биологических наук, профессор, член-кор РАН Деев Сергей Михайлович Доктор биологических наук Купраш Дмитрий Владимирович Ведущая организация- Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ РАН).

Защита состоится 23 декабря 2011 года в 13.00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.

Ломоносова Автореферат разослан «_» _2011 года Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Полная идентичность двух молекул ДНК не может обеспечить одинаковую реализацию кодируемой ими генетической информации. Примером такого феномена могут служить две женские половые Х хромосомы, имеющие практически идентичную первичную последовательность ДНК, но кардинально отличающиеся с точки зрения транскрипции их генов:

лишь одна из двух хромосом будет на большем своем протяжении содержать активные гены, в то время, как гены второй Х хромосомы будут молчать. В последнее время ученые получают все новые и новые доказательства того, что надгенетические (эпигенетические) механизмы контроля генетической информации играют важнейшую биологическую роль в таких процессах как развитие эмбриона, дифференцировка клеток, дозовая компенсация половых хромосом, развитие онкологических и нейродегенративных заболеваний. Сложности и относительные неудачи в клонированни позвоночных организмов связаны с удивительной стабильностью эпигенетического профиля, в первую очередь гистоновых модификаций и метилирования ДНК, в процессе перепрограммирования терминально дифференцированной клетки в плюрипотентную. Однако, несмотря на прогресс, достигнутый в понимании роли эпигенетического контроля генной экспрессии в биологических процессах, остается открытым целый ряд вопросов о механизмах реализации эпигенетической информации. В частности, метилирование ДНК является необходимой модификацией для нормального эмбрионального развития мыши. Животные с генетическим нокаутом гена, кодирующего поддерживающую метил ДНК трансферазу, погибают во время эмбриогенеза сразу после гаструляции. Однако, предполагаемые белки-интерпретаторы метилирования ДНК, а именно метил ДНК связывающие белки семейства MBD ни по отдельности, ни совокупно не являются необходимыми для нормального прохождения эмбриогенеза. Таким образом, либо метилирование ДНК напрямую может ингибировать взаимодействие транскрипционных или иных белковых факторов с их участками узнавания, или же необходимо предположить существование отличного от MBD семейства метил ДНК узнающих белков, которые могут переводить сигналы метилирования ДНК, к примеру, в подавление транскрипции метилированных генов. После полной расшифровки генома человека появилась возможность поиска новых метил ДНК связывающих белков по гомологии с MBD доменом, однако, ни один из найденных таким образом новых белков специфически не связывал метилированную ДНК. В данной работе будут описано обнаружение и характеристика функциональных свойств белков, которые объединены в одно семейство за счет способности имеющихся в их составе трех доменов «циноквые пальцы» C2H2 типа специфически связывать метилированную ДНК. Существование второго семейства метил ДНК связывающих белков существенно расширяет наши представления о механизмах интерпретации метилирования ДНК.

Тот факт, что белок Каизо потенциально может быть вовлечен через белок-белковые взаимодействия в передачу сигналов от клеточной мембраны клетки в ядро, открывает новое направление в изучении эпигенетических механизмов контроля генетической информации как последствия межклеточных контактов.

Цель работы Проверить гипотезу о существовании у позвоночных организмов метил ДНК связывающих белков, отличных от белков MBD семейства. В случае обнаружения нового семейства таких белков провести их функциональную характеристику с помощью современных методов молекулярной биологии, в частности с использованием технологии генетического нокаута.

Основные задачи исследования Первой задачей исследования стала характеристика гена, ответственного за метил ДНК специфическое взаимодействие, которое было детектировано in vitro в экспериментах по задержке подвижности ДНК-белковых комплексов, образованных энхансерным элементом гена S100A4 и ядерными эксрактами многих клеточных линий, органов и тканей мыши и человека.

После получения достаточных доказательств о том, что описанные ДНК белковые комплексы образованы с участием белка Каизо, встал целый ряд задач по опредеднию биологической роли Каизо у позвоночных:

- получить и охарактеризовать мышей, у которых проведен генетический нокаут гена Каизо.

- определить гены мишени, с регуляторными участками которых Каизо взаимодействует in vivo и уровень транскрипции которых чувствителен к падению Каизо.

- определить морфологические и молекулярные последствия транзиентного понижения уровня Каизо в оплодотворенных ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus.laevis.

- выяснить, как катенин р120 может влиять на ДНК связывающие и транскрипционные свойства Каизо при их взаимодействии.

- определить функциональную значимость взаимодействия Каизо с неметилированными последовательностями CTGCNA в составе некотрых генов, вовлеченных в канонические и неканонические сигнальные пути wnt.

- провести биоинформатический поиск гомологичных белков, используя в качестве референсной последовательность аминокислот трех доменов типа «цинковый палец» белка Каизо. В случае нахождения существенных гомологичных молекул провести их детальную характеристику, уделив особое внимание их способности специфически связывать метилированную ДНК.

Научная новизна работы Свойство белков ZBTB33 (Каизо), ZBTB4 и ZBTB38 специфически связывать метилированную ДНК было открыто впервые мире в процессе получения основных результатов данной диссертационной работы. Впервые показано, что мышь с удаленным геном Каизо проявляет устойчивость к развитию рака кишечника. Также пионерскими являются все результаты, указывающие на важность Каизо в процессе эмбрионального развития шпорцевой лягушки.

Проведение полногеномного картирования участков связывания Каизо было превым примером использования технологии ChIP-Seq в Российской Федерации. Помимо технической новизны следует обратить внимание на то, что данный экспреримент позволил выделить метил ДНК связывающую активность Каизо, как доминирующую in vivo, в то время как связывание неметилированных последовательностей CTGCNA было детектировано на уровне фона.

Последнее обстоятельство является убедительным аргументом в споре с рядом лабораторий (Dr Juliet Daniel, Dr Pierre McCrea), которые считают что реализация основной биологической функции Каизо проистекает через связывание участков CTGCNA, а не метилированных ЦфГ динуклеотидов. Таким образом, данная работа не только открывает новое направление в изучении доменов типа «цинковые пальцы», но и позволяет более точно сфокусировать исследования в этой области на интерпретации сигналов метилирования.

Практическая ценность работы Способность трех доменов типа «цинковый палец» белка Каизо связывать in vitro метилированную ДНК с высокой плотностью динуклеотидов ЦфГ выгодно отличает их от MBD метил ДНК связывающего домена, который способен узнавать и одиночные метилированные ЦфГ динуклеотиды. Более того, проведенные эксперименты показывают, что ДНК аффинные сорбенты, полученные с использованием «циноквых пальцев» Каизо преимущественно связывают метилированные ЦфГ островки (до 75% все связавшейся ДНК), в то время, как доля метилированных ЦфГ островков в элюированных фракциях сорбента на основе MBD домена белка MBD2 составляет не более 5%. Таким образом использование аффинных сорбентов на основе белка Каизо может существенно снизить расходы по определению профиля метилирования ЦфГ островков лини клеток, органа или ткани. Это особенно важно при характеристике новообразований. Известно, что метилирование ЦфГ островков в промоторных областях генов раковых супрессоров явлется одним из молекулярных механизмов, приводящих к трансформации клеток. Конечно же, аффинные сорбенты на основе Каизо не способны привести к определению статуса метилирования геномной ДНК с нуклеотидной точностью, однако для клинических применений это редко требуется. При использовании технологии определения первичной нуклеотидной последовательности нового поколения (Solexa, SOLiD) для анализа связанной Каизо сорбентом геномной ДНК объем такого секвенирования будет на порядок меньше, а значит и дешевле и доступнее для клинических исследователей, чем при использовании MBD сорбентов и тем более при так называемом «бисульфитном секвенировании». Другим направлением практического применения результатов работы может стать лечение онкологических заболеваний.

Мышь с удаленным геном Каизо проявляет устойчивость к развитию рака кишечника, вызванного аномальным уровнем активности сигнального пути wnt. Малые молекулы, которые бы ингибировали активности Каизо (транскрипционную или ДНК связывающую), вероятно, могут стать хорошими кандидатами для создания противоопухолевых препаратов, действие которых можно нужно будет проверять на модельных организмах, а потом и в клинических испытаниях.

Причем в последнем случае вполне вероятно важным окажется генотип опухоли и наибольший эффект препаратов следует ожидать у пациентов с опухолями с активным сигнальным путем wnt.

Апробация работы Основные результаты докладывались на конференциях Американской ассоциации по изучению рака (AACR) в 2001 и 2008 годах в США, в 2005 году на конференции по эпигенетическим механизмам пеперпрограммирования генома (Капри, Италия), а также на российских конференциях, в частности, на третьем международном съезде Биохимического общества (Санкт Петербург 2002, на конференции, посвященной 40-летию журнала «Молекулярная биология» (Москва, 2007 год) и на седьмой международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (Новосибирск, 2010).

Публикации По результатам работы имеется 22 публикации в реферируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих BTB/POZ домен и домен “цинковые пальцы” Первая часть работы посвящена обнаружению новых метил-ДНК связывающих белков, структурно отличающихся от белков MBD семейства.

1.1 Обнаружение метил-ДНК зависимого связывания белковых комплексов с энхансерным элементом гена S100A4 в экспериментах in vitro.

Во многих тканеспецифичных и дифференциально экспрессирующихся в процессе развития генах, гиперчувствительные к обработке панкреатической дезоксирибонуклеазой I (ДНКазаI) участки, связаны с областями, участвующими в транскрипционном контроле. Чаще всего они коррелируют со связыванием регуляторных белков с прилегающими последовательностями. С целью выявления новых регуляторных областей гена S100A4 был произведен поиск гиперчувствительных участков к обработке ДНКазойI. Анализ их распределения в различных линиях клеток, показал, что три гиперчувствительных участка присутствуют внутри EcoRI рестрикционного фрагмента геномной копии мышиного гена S100A (рис. 1). Один из гиперчувствительных участков расположен в районе промотора гена (далее ДГУ1) и связан с транскрипционной активностью гена S100A. Второй (ДГУ2) наблюдается в районе с координатами (+700;

+900) (за 0 принят старт транскрипции гена).

Рисунок 1. Картирование участков, гиперчувствительных к обработке ДНКазойI, расположенных в области с координатами (-2. т.п.н.;

+2.0 т.п.н.) мышиного гена S100A4. Ядра, полученные из клеток линии КСМЛ-100 (дорожки с по 9) и Rac34E (дорожки с 10 по 14), обрабатывали увеличивающимся количеством ДНКазыI (обозначено треугольниками). Геномную ДНК ферментативно гидролизовали рестриктазой EcoRI и гибридизовали с радиоактивно меченой пробой ExIII (ПЦР фрагмент третьего экзона, размером 200 п.н). Серые прямоугольники обозначают сis-действующие элементы мышиного гена S100A4: 1-16 п.н.

последовательность;

2 - метилзависимый АР- участок;

3 - kB-подобный участок;

4 микросателлитная последовательность ДНК. Экзоны обозначены черными прямоугольниками.

Гиперчуствительные участки к обработке ДHКазойI обозначены стрелками.

Третий (ДГУ3) расположен во втором интроне в области с координатами + 1300 п.н. ДГУ2 и ДГУ3, в отличие от ДГУ1 присутствуют во всех протестированных клеточных линиях вне зависимости от транскрипционной активности гена S100A4 и имеют разную чувствительность к увеличивающимся количествам ДНКазыI (таблица 1).

Разница в структуре гиперчувствительных областей может быть отражением спектра ДНК белковых взаимодействий в этих районах.

1.2 Об бнаружени ие белков вого факт тора, связыва ающегося с ме етилированной Таблица 1. Представленность гиперчувс ствительных х последо овательнос стью ДНК, Д участков в гене S1000A4 к обр работке ДН НКазой l в мышиных и человечесских клеточн линиях.

ных.

располо оженной с 3' конца ДГУ2.

Д Уровеень экспреессии А Анализ нуклеоти идной мРНKK Тип клеток к ДГУl ДГ ГУ2 ДГУ3 3 последо овательност ти протяжен нного гена S S100A КСМЛ-100 0 +++ +++.+ +++ +++ гиперчу увствительн ного участ тка с 3'-к конца КСМЛ-0 - - + + VMR-Liv - - + + ДГУ2 мышиного гена S100A4 вы о S ыявил VMR-0 - - + + коротки ий CpG-остр ровок c Rac34E +/- +/- ++ + ++ Racl0P - - + + последо овательност тью СG GСGСССАА АСG, Jurcat - - + + содержа ащий три и СрG динуклео отида.

Molt-4 ++ ++ ++++ ?

СЕМ + + ++ + ?

Посколь ьку ранее е было показано, что К562 - - + ++ ?

эпигенети ический кон нтроль явл ляется важн ным при тр ранскрипци S100A4 (Sonnenbe Daams et al.

ии erg, 1986), бы определ ыл лен статус метилирования ук с казанного CpG-остро овка в линиях клет ток с различным уровнем активности гена S100A4. С помощь эндону м м ью уклеаз, чу уствительны к ых метилиров ванию ДНК было ус К, становлено методом Саузерн бл гибрид о лот дизации, чт этот уча то асток ге ена S100A мыши в клеточн A4 ных линиях КСМЛ Л-0 и К КСМЛ-100 неметили ирован, а в Rac 34E и Racl0P R м метилирова (рис.2).

ан Рисун нок 2. Опрееделение ха арактера ме етилировани Sm ия п последователльности в пе ервом интро мышино гена S оне ого 00A4 в различных линиях клет л ток. После в выделения геномную ДН из г НК кл леток линий КСМЛ-0, КССМЛ-100, Raac34E и Racl0P гидролиз зовали рестриктазами HindIII и HhaI и ги и ибридизовали с радиоак и ктивно меченой проб м бой. Фрагме енты ДНК H HindIII-НindI и HindIII III II-НhаI имели размер 5 и 1.2 кп.н. соответственно. Эк ры кзоны обозн начены черными пряммоугольникам ми.

Таки образом, уровень т им транскрипц гена S ции 100A и статус метилиро ования и изучаемой GС бог гатой п последовате ельности н коррелир не ровали дру с другом. Для уг выяснения факта вз заимодейст твия in vitro белк v ковых ф факторов с этой посл ледовательностью, бы ыли прове едены экспериме енты по зад держке ДН -белковы комплек НК ых ксов в геле с ядерным белковыми экстрак ми ктами из клеточн линий КСМЛ-0 и КСМЛ-10 При ана ных 00. ализе связы ывания ядер рных белко овых экстра актов из клеток КСМЛ-0 было выя явлено обр разование двух ДНК К-белковых комплексо МКl и МК ов (рис.3, до орожка 1). Образующ щийся МК комплек не исче К2 кс езает при добавлени немечен ии нного метилиров ванного кон нкурента (рис.3, доро ожка 2). На апротив, ко омплекс МК является специфич Кl я чным к метилир рованию ДН (рис.3, дорожки 3 и 4). В фо НК ормировани МК2 комплекса уч ии частвуют белки, связывающ NF-kВ подобные последова щие В е ательности и микроса ателлитную ДНК.

ю Рисунок 3 Электрофо 3. оретическая задержка Д я ДНК-белков вых комплек ксов в 4%-ном ПА ААГ, образованных ядерными б белковыми экстрактам из ми к клеточной л линии КСМЛ Л-О и радио оактивно ме еченым про ометилирова анным фрагментом первого инт ф м трона гена SS100A4 с кооординатами (+685;

+890) МК ).

- неспецифич чный компле МК1-ком екс. мплекс специффичный к меетилированию всех ю трехх CpG-п пар в изуч чаемой последовательно ости. Пробу П ф ферментативно модифици ировали SssI метилтранс I сферазой (доррожки 1, 2, 3, 4), H HhaI ( 6 доро ожка), FnuDII ( 7 дорожка и HhaI+Fпu I а) uDII (5 дорож жка). Для про оверки специфичнос с сти связыва ания в реак кцию добав вляли 100 кратный из збыток н немеченого ДНК конку урента: (+68 85;

+890) фраагмент, мети илированный SssI й м метилтрансф феразой (2 дорожка);

(+685;

+89 90) фрагмен (3 дорожка);

нт н неспецифичн последова ная ательность ДДНК (4 дорож жка).

П Представля яет интере тот фа ес акт, что м метилирова ание трех CpG динуклеоти д идов проис сходит в ра айоне откр рытого хром матина (ДГ ГУ2).

Это может предпола т агать вовлеч ченность м метил-специ ифического фактора в молекуля о ярные проц цессы несвязанн с транс ные скрипцией. Сам факт наличия ДГУ2 вне зависимос от акти. т Д сти ивности S100A мог лишь подтвержд дать данное предполож е жение.

Сп помощью экспериме ента по и интерферец ции метил лирования было по оказано, чт в то образован МКl ко ние омплекса н непосредств венно вовл лечены гуа анин перво CpG ди ого инуклеотид на да кодирующ цепи (с координа щей с атой +839) и гуанин второго Cp динукл pG леотида на некодирую ющей цепи ( с к координатой +840) ( р рис.4). Исх ходя из все полученн ех ных данны был сде ых, елан вывод что д, последова ательность, узнаваема и связыв, ая ваемая белк ком, m5СGm m5СGССС СААm5СG (далее Sm) ( ).

Рисунок 4. Экспе к еримент по интерференции мети илирования ДНК-белк я кового ком мплекса МК Двуцепоче Кl. ечный фрагммент ДНК из первого инт трона мышин ного гена S 00A4 с коо ординатами (+685;

+89 90) обрабаты ывали ДМC после че C, его использо овали в кач честве рад диоактивно м меченой проб для эксперимента элек бы ктрофоретической задерж ДНК-бел жки лковых ком мплексов в ге На дорож еле. жках 1 и 2 пооказана кодир рующая цепь фрагмента ДНК;

на дор ь рожках 3 и 4 - некодирующая цепь. Последовате ельности ДН не вошедш в ДНК-б НК, шей белковый коммплекс МK показаны н дорожках 1 и 4;

а на 2- и 3-й доро Kl на -й ожках, та ДНК с которой образовался МKl К, й я ком мплекс. На ддорожках 2 и 3 указаны остатки гуани на кодир о ина рующей цепи (+839, обоз и значен чер рным овалом и на нек м) кодирующей цепи (+840 обозначен звездочкой) защищенные от 0, ), дей йствия пипе еридина. Зннаком вопро оса обознач чена возможжная область защиты G на ь нек кодирующей цепи (+837) однако сте ), епень его защ щиты в пять раз ниже ур ровня защиты G в ы пол ложениях +839 и +840.

1.2 Кл лонирован нового специфич ние о чного к метилирован нию ДНК б белка Каи изо.

Для я иденти ификации белка, связывающ щего мет тилированн ную посл ледовательн ность CGCGCCC CAACG мы ышиного ге S100A4 (Sm) был реализов ена 4 ла вана следую ющая схема эксперим а мента:

гельфильт трационное фракцион е нирование ядерных белковых э б экстрактов из клеток линии К5 с к использов ванием с смолы Sephacryl S S-300;

анализ собранны ых фракц ций мет тодом электрофо оретической задержки ДНК-белк и ковых комп плексов в г геле с испо ользованием радиоакт м тивно меченой метилиров ванной Sm послед m довательнос сти;

аффи инная хро оматографи отобран ия нных фракций, д дающих об бразование специфич е чного МК1 комплекса, на колонк с Sm-сеф ке фарозой (ри ис.5).

Анализ аф ффинных ф фракций эл люированны с колон ступенч ых нки чатым соле евым гради иентом пок казал, что специ ифичный к метилированию Д ДНК белок присутств вует во ф фракции с концентра ацией хлорида кальция 0-400мМ (р рис.5).

Рисунок 5. Анализ аффинных белковых фракций на присут тствие спе ецифичного к метилиро ованию ДНК белка мет К тодом задерж жки подвиж жности ДННК-белковых комплекс х сов в 4% ПААГ. Рад диоактивно меченая пр роба дву уцепочечный олинонукле й еотид, содерж жащий ферм ментативно модифицирова м анную Sss метилтран sI нсферазой Sm последова m ательность. Н l-й дорож для кон На жке нтроля обр разования сп пецифичного МКl комп о плекса в ре еакцию связыывания с ппробой доб бавляли ядеррные белковы экстракты из клеток л ые ы линии К562 и 0.4М фрак кция в дор рожки 15 и 16 в присут тствии 100 ккратного мол лярного избы ытка специфиичного кон нкурента ДН метилиро НК: ованной и ннеметилирова анной Sm пооследовательнности, соо ответственно На дорожк о. ках с 4-й п 14-ю в р по реакцию доббавляли аффи инные фракции, собранные в пр рисутствии 00.1M-l.5М ККCl в буфер Комплекс МКl ре. с обо означен стрел лкой.

Фр ракциониро ование 0.4М аффинно фракции в денатур М ой и рирующем полиакрил ламидном г геле и покраска геля сереб бром показ зали, что она содерж смесь белков, о жит основными компонен нтами которой я являлись белки с мо олекулярной массой 100- 120 к й кДа. Белки были оха и арактеризо ованы методом масс-спект трометрии в сотру удничестве с Докто ором Матиасом Ма анном (EM MBL, Heidelberg g). Одним м из опр ределенных х белков оказался я белок Каизо. При П сравн нении аминокисл лотной по оследовател льности бе елка Каизо с после едовательностями из базы дан з нных выяснилос что он является человеческим гомол сь, н логом гена мыши, от ткрытого по способн п ности связыватьс с катени ся ином р120 практичес одновр ски ременно (п состояни на 1999 год) с да по ию 9 анной работой, н независ но симо, проф фессором Рейнольдс сом из уни иверситета Вандербил (Нэшвилль, льт США А)(Daniel a Reynold 1999). Основные д and ds О домены бел Каизо: на С-конце три лка ДНК К-связывающих домен "цинковы пальцы" типа С2Н а на N конце домен под на ые " Н2, к н назва анием BTB B/POZ (по сокращен о нному наз званию Рох viruses и Zinc fin nger).

Анал баз дан лиз нных показ зал, что бе елок Каизо представл во многих органи лен измах (рыбах, земново одных, мле екопитающ щих).

Рисун нок 6. Мон ноклональны антител к Каизо суперсдви ые ла о игают мети ил-ДНК-белк ковый компллекс, подтв верждая уча астие Каизо в его об о бразовании. Метилирова анную Sm пробу инкуб бировали с яд дерными экстрактами из клеток лини К562. К об ии бразовавшим ДНК-белк мся ковым компл лексам добаввляли: на 22-й дорожке - моноклон нальные ант титела к Каи изо 6F;

на 3-й неспе ецифические антитела (к поли АДФ рибозил поли р имеразе, PAR не суперс RP) сдвигали комплекс;

на пе ервой дорожк в реакцию связывани антитела не добавлял инкубиро ке ю ия ли;

овали и раздделяли проду укты реакции в неденату и урирующем 4% ПААГ. К 4 Комплекс с ККаизо обозна ачен стрелкой c С.

й Супер рсдвинутый аантителами к комплекс обоззначен стрелкой с SS. Зве ездочка со ст трелкой обозн начает ДНК-белковый коммплекс с прод дуктами дегр радации белко ковой фракции.

Моно оклональны ые антит тела (кло он 6F, Upstate), полученны ые к эп питопам К Каизо, с высокой эффективностью суперсдви игают мети ил-специфи ичный комп плекс МКl в эксперим менте по электрофо оретической задержк ДНК-бе ке елковых комплексов в геле к (рис.6).

Рисунок 7. Анализ ра аспределения Каизо в тканях мыш с помощ я ши щью блот Нозерн блоот-гибридиза ации. Блот-г гибридизация тотальной РНК, выде я еленной из из разных органов мы ыши, с [32P]дАТФ меченой ДН гена Каиз человека.

Ф НК зо Экс спрессия К Каизо была изучена в различны органах мыши. М а ых х Максималь ьная экспре ессия гена обна аруживается в печени селезенк и в почк я и, ке ках. Однак мРНК К ко, Каизо разм мером 5-6 кп.н.

присутств вует во всех рассмотре х енных мыш шиных орга анах (рис. 7).

1.3 Изучен ДНК с ние связывающ свойст рекомбинантного белка Каизо щих тв о Чтобы отв ветить на в вопрос, мож ли бел Каизо узнавать м жет лок у метилирован нную посл ледовательн ность ДНК, и к какой име енно домен ответств н венен за это узнаван э ние и свя язывание, был поста авлен экспериме ент по задержке ДНК-белк ковых ко омплексов в геле с метил лированной и неметилир рованной п последоват тельностью Sm очищ ю щенных рекомбинан нтных белк ков GST-К Каизо, полученны за счет трансфо ых т ормации в бактерии различны фрагмен ых нтов кДНК Каизо. Б К Было показано ( (рис.8), что рекомбин о нантный бе елок GST-К Каизо (1-672 а.о.) обра азует метил л-специфич чный ДНК белк ковый комп плекс с сим мметрично метилиров ванной пос следователь ьностью Sm Удалени N m. ие концевого домена BT о TB/POZ не изменяет метил-ДНК-связываю е ющих свой йств Каизо. Минимальный.

размер белка, б кот торый спе ецифично связывал метилир рованную последова ательность Sm соответств вовал амин нокислотам белка К м Каизо с координата к ами 480-58 которые содержат три 82, е т “цинковых пальца”. Следовате х ельно, впер рвые было показано, ч п что домен типа «цин н нковые пал льцы» способен с специфичн узнавать симметри но ь ично метили ированную ДНК.

ю Рисунок 8. Изуччение ДННК-связываю ющих св войств рекомбинаантного белк Каизо (rК ка Каизо). В реакцию связыывания добавляли различное к количество ррекомбинанттных белков GST Каизо (1-67 а.о.) и G 72 GST-Каизо (113-672 а.о.) 10, 3 и 1 н что нг, указано трреугольником над доро м ожками. Спе ецифичный ДНК белковый комплекс о образуется ллишь с мет тилированной Sm й последоватеельностью ДДНК. На пр равой панели рекомбинан и нтный белок GST-Каизо (410-6 а.о.) обра 672 азует метил сппецифичные ДНК белковые комплексы с последоват к тельностями ДНК Sm, A Asm и AASm. Вид дно, что введ дение допол лнительного нуклеотида м н между CpG парам 1 и 2 приводит к ослаблению ДНК-белк ми ю кового комплекса.

Из зменится ли сро одство рекомбинан нтных цинковых пальцев белка К х Каизо к метилирова м анной последова ательности если CpG пары бу и, удут разде елены дополнит тельными нуклеотид дами? Дл ля выясн нения предпочти ительного расстояния между тремя Cp парами в Sm п я pG и последовате ельности и их нуклеотид дного окру ужения бы провед ыл ден экспер римент по задержке в геле ДНК-белк о е ковых комплексо образов ов, ванных ре екомбинант тным белк ком GST-К Каизо (410 -672 а.о.) и различн ными модифика ациями в Sm последовательност (таблица 2). Показ m ти а зано, что 3- CpG пар не важна для -я ра связывани белок К ия, Каизо связы ывает после едовательн ности ДНК, содержащ лишь две CpG па, щие д ары, в то время как расст тояние ме ежду 1-й и 2-й CpG парами не должн превыш G но шать двух-трех нуклеотид Замена метилиро дов. а ованного ци итозина на тимин при иводит к по отере связы ывания (таб блица 2). Таким образом, показано, что рекомбинантный белок Каизо проявляет свои метил ДНК связывающие свойства через “цинковые пальцы”.

Таблица 2. Связывание рекомбинантных “цинковых пальцев” белка Каизо с метилированными последовательностями ДНК.

Проба Последовательность ДНК Связывание Sm CAGCAGCMGMGCCCAAMGCTGGGA ++++ Sm-A CAGCAGCMGAMGCCCAAMGCTGGGA +++ Sm-AA CAGCAGCMGAAMGCCCAAMGCTGGGA ++ VIRTUAL CAGCAGCMGAAAMGAAAMGCTGGGA + ASm CAGCAGCMGMGCCCAAAMGCTGGGA +++ AASm CAGCAGCMGMGCCCAAAAAMGCTGGGA +++ CCSm CAGCAGCMGMGCAAMGCTGGGA +++ CG3SM CAGCAGCMGMGCCCAACTGGGA +++ 1A2Sm CAGCAGCMGAMGCCCAACTGGGA +++ 2A2Sm CAGCAGCMGAAMGCCCAAGCTGGGA + Sm-TG CAGCAGCTGTGCCCAATGCTGGGA AACG-Sm CAGCAGCAAMGCCCAACTGGGA +/ TGCG-Sm CAGCAGCTGMGCCCAACTGGGA + CGTG-Sm CAGCAGCMGTGCCCAACTGGGA CGCA-Sm CAGCAGCMGCACCCAACTGGGA CACG-Sm CAGCAGCCAMGCCCAACTGGGA Константа диссоциации ДНК-белкового комплекса полноразмерного рекомбинантного белка Каизо и последовательности ДНК Sm, измеряемая в эксперименте по задержке ДНК-белковых комплексов в геле, равна 1 микромолю для неметилированной Sm последовательности и наномолю для метилированной Sm последовательности. Для сравнения, домен MBD связывается с единственной CpG парой в пределах 10 наномолей (Free, Wakefield et al. 2001). То есть Каизо демонстрирует наибольшее сродство к метилированной ДНК из всех известных метил ДНК связывающих белков.

1.4 Белок Каизо является метилзависимым транскрипционным репрессором in vivo.

Большинство белков BTB/POZ семейства являются репрессорами транскрипции. Будет ли Каизо подавлять транскрипцию репортерных генов в клетках млекопитающих, и будет ли репрессия зависеть от статуса метилирования последовательности ДНК промотора репортерного гена? Чтобы избежать эффекта молчания метилированной ДНК конструкции репортерного гена за счет эндогенных метил-ДНК зависимых репрессоров, таких как MBD1, MBD2 и других, были использовали клетки мышиных фибробластов с генетическим нокаутом гена Mbd2 (в дальнейшем используется обозначение Mbd2(-/-) клетки). В клетках Mbd2 (-/-) уровень репрессии метилированных репортерных генов значительно снижен, по сравнению с диким типом клеток (Hendrich, Guy et al. 2001). Репортерная конструкция несла в себе ген светлячковой люциферазы (firefly) под контролем SV40 промотора, а также 11 консенсусных участков связывания белка Каизо. Как и ожидалось, уровень транскрипционной активности полностью метилированной репортерной конструкции в клетках Mbd2 (-/-) составил 30-35% от уровня транскрипции неметилированной репортерной конструкции в тех же клетках.

Риcунок 9. Белок Каизо in vivo подавляет транскрипцию метилированных репортёрных генов. В эксперименте по временной трансфекции совместно трансфецировали в мышиные клетки Mbd2 (-/-) (серые столбики) и клетки Mbd2 (+/-) (используются в качестве контроля как дикий тип, белые столбики) репортёрная конструкция с геном репортёром светлячковой люциферазы под контролем SV40 или Pgk промоторов и конструкция, экспрессирующая различные формы белка Каизо. Относительная активность репортера представляет из себя процент уровня экспрессии репортёрного гена с метилированной конструкции относительно уровня экспрессии репортёрного гена с неметилированной конструкции.

Представленные результаты являются усреднением как минимум трех независимых экспериментов.

Экспрессия в клетках полноразмерного белка Каизо понизила уровень экспрессии репортёрной конструкции приблизительно в 6 раз до 5-7% от уровня неметилированного контроля (рис.9). Усиления уровня репрессии репортерного гена не было замечено в случае коэкспрессии в клетках форм белка Каизо без BTB/POZ домена (КаизоPOZ), без “цинковых пальцев” (КаизоZF) и без всех функциональных доменов (КаизоPOZ+ZF). Таким образом, Каизо может восстановить репрессию метилированных генов в дефектных Mbd2 (-/-) клетках, но для этого белку Каизо необходимы одновременно все его функциональные домены, т.е. BTB/POZ домен и “цинковые пальцы”.

Чтобы проверить способность Каизо репрессировать промотор, который метилирован в природных условиях, был выбран промотор мышиного гена фосфоглицерат киназы (Pgk), который молчит и метилируется в клетках благодаря инактивации Х хромосомы. Этот промотор содержит консенсусные участки связывания белка Каизо и связывается с ним in vitro при наличии метилирования CpG пар в последовательности ДНК Коэкспрессия Каизо в Mbd2 (-/-) клетках заметно снижает уровень транскрипции репортерного гена, находящегося под контролем промотора гена Pgk, в случае метилирования репортерной кострукции с 7% до 2% (рис.9). Схожие результаты по восстановлению репрессии метилированных репортерных конструкций, находящихся под контролем SV40 и Pgk промоторов, в Mbd2 (-/-) клетках были получены для белков Mbd2 и MeCP2 (Guy, Hendrich et al. 2001;

Hendrich, Guy et al. 2001). Таким образом, Каизо является метил зависимым репрессором транскрипции со свойствами, сравнимыми с другими метил-ДНК связывающими белками, такими как Mbd2 и MeCP2.

1.5 Белок Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом H19 DMR.

Для определения потенциальной способности Каизо участвовать в основных процессах, связанных с метилированием ДНК, были выбраны в качстве модели импринтные гены.

Импринтные гены могут быть использованы как уникальная система для изучения эпигенетических процессов: отцовский и материнский аллели отличаются как уровнями метилирования ДНК, экспрессии генов, так и модификациями гистонов. В случае H19/Igf2-локуса материнский (неметилированный) аллель DMR является внутренним контролем при исследовании процессов, связанных с метилированием ДНК. Для изучения метилспецифичности связывания Каизо с районом H19 DMR в данном участке был картирован рестрикционный полиморфизм между подвидом Mus. musculus domesticus и видом Mus. spretus (рис.10а). ПЦР-продукт, соответствующий данному участку может быть полностью расщеплён рестриктазой HaeIII только в том случае, если в качестве матрицы для ПЦР была использована ДНК подвида Mus. musculus domesticus.

Рисунок 10. Взаимодействие Каизо с метилированным аллелем H19 DMR.

А. Картирование рестрикционного полиморфизма в районе H19 DMR.

ПЦР с последующей рестрикцией продукта HaeIII эндонуклеазой. В качестве матрицы использована ДНК следующих видов мышей: Dom. – Mus.musculus domesticus;

Spr. – Mus.

spretus;

Dom.xSpr. – Mm.domesticus x M.spretus. Б. Иммунопреципитация хроматина с антителами к белку Каизо и CTCF с последующей ПЦР и рестрикцией продукта HaeIII. «-Ab» – контроль без антител;

«+» – положительный контроль для ПЦР. МГ – в метилированной форме;

ЦГ – в неметилированной форме.

В случае, если была использована ДНК вида Mus. spretus или гибрида Mus. musculus domesticus/Mus. spretus ПЦР-продукт, соответственно, не может быть расщеплён вообще или может быть расщеплён только частично. В экспериментах по иммунопреципитации хроматина был использован хроматин, полученный из печени гибридной мыши Mus. musculus domesticus/SD7, причём при скрещивании самец принадлежал линии C57Black (Mus. musculus domesticus), а самка – линии SD7. Данная линия была искуственна получена в лабораторных условиях на основе линии C57Black (Mus. musculus domesticus) и характеризуется тем, что в её хромосомном наборе обе 7 хромосомы частично заменены на хромосомы, принадлежащие виду Mus. spretus. Таким образом, потомство от скрещивания особей линий C57Black и SD7 имеет тот же точечный полиморфизм между отцовским и материнским аллелями, что и потомство от скрещивания особей, принадлежащих к видам Mus. spretus и Mus. musculus domesticus (рис.10а).

Иммунопреципитационный и алелль сецифический рестрикционный анализ показал, что белок Каизо взаимодействует только с отцовским метилированным аллелем H19 DMR, тогда как CTCF можно было детектировать только на неметилированном материнском аллеле (рис. 10б).

Таким образом, показано, что Каизо in vivo связывается с метилированными последовательностями.

1.6 Семейство Каизо-гомологичных белков 1.6.1 Два новых белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Каизо, узнают метилированную ДНК in vitro.

Белок Каизо связывается с метилированной ДНК за счет цинковых пальцев, поэтому было предположено, что существуют и другие аналогичные белки с цинковыми пальцами, которые смогут узнавать метилированную ДНК. На основе поиска по базе данных данных NCBI, RefSeq проект были найдены два белка, гомологичные Каизо: ZBTB4 и ZBTB38 (рис.11). Эти белки имеют три гомологичных цинковых пальца и похожую доменную структуру всего белка : на N конце все три белка содержат BTB/POZ домен. ZBTB4 и ZBTB38 более схожи друг с другом, чем с Каизо.

Рисунок 11. ZBTB4 и А ZBTB38 содержат цинковые пальцы, гомологичные Каизо. А. Выравнивание участка Каизо, содержащего три цинковых пальца, с B ZBTB4 и ZBTB38. Три цинковых пальца выделены.

Аминокислоты, совпадающие у трёх белков, отмечены звездочками. В. Структура Каизо, ZBTB4, ZBTB38.

Белки выровнены по трем гомологичные цинковые цинковым пальцам.

цинковые Глутамин-богатый домен пролин-богатый Эксперименты по задержке комплексов белок-ДНК показали, что ZBTB4 и ZBTB38, также как и Каизо, обладает сродством к метилированным последовательностям ДНК in vitro(рис.12а).

Рисунок 12. ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированной ДНК in vitro и in vivo. ZBTB4 и ZBTB38 подавляют транскрипцию in vivo на метилированных матрицах ДНК. А,-Цинковые пальцы Каизо, ZBTB4, ZBTB38 были экспрессированы в кроличьих ретикулоцитных лизатах.

Полученные белки инкубировали с меченой (А.метилированной или неметилированной пробой) и разделяли полученные комплексы в 6% ПААГ.Б Метил-специфичное связывание Каизо, ZBTB4 и ZBTB38 c метилированным участком DMR локуса Igf2/H19. Верхняя панель: хроматин иммунопреципитация с антителами, указанными на рисунке. Нижняя панель:

ДНК была выделена из агарозного геля (см. верхнюю панель) и рестрицирована HaeIII. В-метилчувствительный экспрессионный анализ.Конструкции, с которых экспрессировались белки, были совместно транзиторно трансфецированы с метилированной, либо неметилированной SV-40 репортёрной конструкцией.

Относительная репортёрная активность рассчитывалась следующим образом:

уровень экспрессии с метилированного репортёра/уровень экспрессии с неметилированого репортёра*100. На диаграмме приведены усредненные данные трёх экспериментов.

Используя импринтный локус Н19/Igf2 как модельную систему (как было описано раннее), удалось показать, что in vivo ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированным отцовским аллелем Н19 (рис.12б). Метил-чувствительный эксперимент подтвердил, что оба гомолога Каизо являются метил-зависимыми репрессорами (рис.12в).Таким образом, ZBTB4 и ZBTB38 ведут себя также как и белки MBD семейства и белок Каизо: связывают метилированные CpG in vitro и in vivo (рис.12а,б), подавляют транскрипцию с метилированной матрицы (рис.12в).

Рисунок 13. ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированной ДНК в клетках.. А-ZBTB4 и ZBTB38 были транзиторно трансфецированы в NIH3T3. Трансфецированые клетки были зафиксированы и окрашены либо преиммуной сывороткой (PI), либо антителами к данным белкам:

-ZBTB4 и -ZBTB38. Затем клетки были обработаны вторичными антителами, конъюгироваными с Alexa Fluor® 488, которые флуоресцируют в том же диапазоне, что и GFP.

Сигнал после окрашивания антителами к ZBTB4 и ZBTB38 совпадает с хромоцентрами, окрашенными DAPI.Б- RFP-ZBTB4 и RFP ZBTB38 были транзиторно трансфецированы в dnmt1-/-,p53-/- клетки, в которых нарушено метилирование. Трансфецированые клетки были зафиксированы и окрашены DAPI.

представлены по два типа клеток I тип клеток:

ZBTB4 и ZBTB38 уходят с хромоцентров в клетках с нарушенным метилированием ДНК.

II тип клеток, в которых ZBTB4 и ZBTB38 по прежнему остаются на хромоцентрах.

Известно, что в ядрах мышиных клеток области различных хромосом, содержащие большие и малые сателлитные повторы, которые метилированы, агрегируют и образуют структуры, называемые хромоцентрами. Эти структуры хорошо детектируются с помощью микроскопа, поскольку они хорошо окрашиваются специальным красителем DAPI. Оба белка ZBTB4 и ZBTB38 при трансфекции в мышиные клетки были локализованы в хромоцентрах (рис.13а). Для того чтобы понять, за счёт чего ZBTB4, ZBTB38 в клетках оказываются на хромоцентрах, а именно, влияет ли то, что ДНК в хромоцентрах метилирована на локализацию данных белков, были использованы клетки с нарушением метилирования. Это мышиные эмбриональные фибробласты, у которых удалён каталитический домен ДНК-метил трансферазы 1. В данных клетках значительно понижен уровень метилирования ДНК (но всё же остаточное метилирование присутствует благодаря de novo метилтрансферазам DNMT3a,3b). Но, поскольку, удаление Dnmt-1 летально для клеток, так как клетки умирают по p53 зависимому пути (Jackson Grusby et al., Nat. Genetics,2001), то были использованы клетки, в которых отсутствуют и Dnmt-1 и p53 (клетки были любезно предоставлены/ профессором Бёрдом (Adrian Bird), которые жизнеспособны, в качестве контроля использовали мышиные эмбриональные фибробласты с удаленным геном p53. При трансфекции в контрольные клетки RFP-ZBTB4 и RFP-ZBTB38 эти белки были локализованы в хромоцентрах. При трансфекции в (dnmt1-/-,p53-/-) клетки ZBTB4 и ZBTB38 в примерно 60% клеток оказываются распределенными диффузно по всему ядру и только в 30-40% клеток по-прежнему локализованы в хромоцентрах (рис.13б). Аналогичная ситуация наблюдалась при трансфекции в эти же клетки другого метил-ДНК связывающего белка MeCP2.

Возможно, что данные белки могут также узнавать саму структуру гетерохроматина, а не только статус метилирования ДНК. Тем не менее, данный эксперимент позволяет сделать вывод, что ZBTB4 и ZBTB38 связывается с метилированой сателлитной ДНК in vivo.

Таким образом, было обнаружено новое семейство белков, узнающих метилированную ДНК и являющихся метил-зависимыми репрессорами.

2. Удаление гена Каизо в различных организмах Для выяснения биологической функции белка Каизо в живых организмах было решено произвести удаление гена, кодирующего белок Каизо, из геномов различных видов организмов:

лягушки (хКаизо), рыбы (dКаизо) и мыши.

2.1 хКаизо необходим для нормального развития лягушки Хenopus Laevis Для изучения возможного участия Каизо в регуляции развитии лягушки были проведены инъекции антисмысловыми олигонуклеотидами морфолино хКаизо (КМО), соответствующими 5’ нетранслируемому району и первым шести кодонам, в эмбрионы лягушки на стадии деления двух клеток. Это привело к эффективному подавлению трансляции белка Каизо (рис. 14). Инъекция 10нг контрольных олигонуклеотидов морфолино не повлияла на развитие эмбрионов (см. таблицу 3, рис. 14а).

Таблица 3. Эксперимент по микроинъекции олигонуклеотидов морфолино в эмбрионы лягушки MO/РНК инъецированная Фенотип на стадиях 15-21 Фенотип на стадиях 33/ Успешная Гибель во Гибель Spina bifida Нормальны нейруляци время после (незакрытая й фенотип я нейруляци нейруляци нервная на стадии и и трубка и 33/ короткая ось) Контрольное MO 10 нг 46 (92%) 0 2 (4%) 4 (8%) 44 (88%) KMO 10 нг 0 97 (100%) 0 KMO 5 нг 0 0 25 (50%) 24 (48%) 1 (2%) spina KMO 0.5 нг 72 (72%) 0 4 (4%) bifida 44 (44%) 28 (28%) spina bifida 24 (24%) короткая ось KMO 5 нг/750 пг дикий тип hКаизо 28 (61%) 11 (24%) 16 (35%) 7 (15%) 12 (26%) KMO 5 нг/375 пг дикий тип hКаизо 22 (44%) 26 (52%) 17 (34%) 5 (10%) 2 (4%) KMO 5 нг/750 пг C31 мутантный 0 0 25 (50%) 23 (46%) 2 (4%) hКаизо 750 пг дикий тип hКаизо 58 (97%) 0 2 (3%) 8 (13%) 50 (83%) Инъекция КМО в количестве от 0.5нг до 10нг привела к потере способности эмбрионов к дальнейшему развитию и возникновению различных, зависящих от дозы КМО, фенотипических изменений эмбрионов (cм. таблицу 3, рис. 14,б-д). Характерной чертой инъекции 5нг КМО является появление белых апоптотических клеток вблизи бластопора в стадии нейруляции (рис.14). На стадии 21-22 КМО развитие останавливается, и поверхность эмбрионов покрывается белыми апоптотическими клетками, которые связаны с эффектом сшелушивания клеток с поверхности эмбрионов (рис.14в). Введение меньших доз КМО приводит к появлению менее значительных фенотипических отклонений с задержкой закрытия бластопора на стадии (рис.14г). Большинство из развившихся инъецированных КМО эмбрионов до стадии головастика короче в длину или имеют нарушения верхних дорсальных структур (spina bifida) (рис. 14д).

Фенотипически эффект введения в эмбрион КМО похож на картину развития эмбрионов, у которых снижен уровень ДНК-метил трансферазы1 (xDnmt1) (Stancheva and Meehan 2000) (рис. 14е).

Рисунок 14. Фенотип эмбрионов лягушки с пониженным уровнем белка хКаизо. А- введение в эмбрион 10нг контрольных МО (СМО), стадия 15;

Б,В после введения в эмбрионы 5 нг КМО, стадия 15 и 21соответсвенно;

Г- после введения в эмбрион 0.5 нг КМО, стадия 15;

. Д- набор фенотипов у эмбрионов с введенным КМО (0.5нг): 44% эмбрионов выглядят нормальными на cтадии 38 (верхний эмбрион), 29% неспособны развить нормальные дорсальные структуры (spina bifida, нижний эмбрион). Другие фенотипы являются промежуточными между приведенными двумя случаями;

Е- фенотип эмбрионов с введенным 10нг МО к хDnmt1. Стрелками указаны апоптотические клетки;

Ж Имунноблот ядерных белковых экстрактов из эмбрионов лягушки дикого типа и инъецированных 5 нг КМО с использованием специфических антител к хКаизо. Сверху указаны стадии развития эмбрионов.

Картина при удалении хКаизо и хDnmt похожа, а ранее было показано, что снижение общегеномного уровня метилированной ДНК в эмбрионах лягушки приводит к активации транскрипции генов приблизительно на два цикла развития раньше нормы (Stancheva and Meehan 2000;

Stancheva, El-Maarri et al. 2002).

Рисунок 15. Снижение уровня белка хКаизо ведет к преждевременной активации транскрипции генов, регулируемых xDnmt1. А- Детекция активации транскрипции генов путем измерения включения радиоактивномеченного [35S] УТФ в эмбрионах дикого типа (WT) и в эмбрионах, иньецированных 0,5 нг КМО;

Б- Анализ методом ПЦР в реальном времени РНК из эмбрионов, собранных на стадии 8, дикого типа (WT), инъецированных 5нг КМО и 5нг ДМО, на наличие транскриптов генов xOct-25, xBef, xDrak1, регулируемых хКаизо и хDnmt1. Ген xODC был выбран в качестве контроля.

Поэтому наличие преждевременной активации генов в эмбрионах лягушки со сниженным уровнем белка хКаизо в результате введения КМО было решено проверить путем измерения включения на стадиях бластулы и гаструлы радиоактивно меченного изотопом серы [35S]-УТФ в эмбрионах лягушки дикого типа и в инъецированных КМО. Как и ожидалось, в контрольных эмбрионах дикого типа активное включение УТФ начиналось после стадии сдвига в средней бластуле (МidВlastulaТransition). Однако, в эмбрионах с введенными КМО, у которых был снижен уровень белка хКаизо активное включение радиоактивно-меченного [35S]-УТФ начался на два цикла раньше (рис.15), в полной аналогии с эффектом снижения уровня Dnmt1 в эмбрионах лягушки(Stancheva and Meehan 2000).

Полученные данные позволяют предположить, что xDnmt1 и хКаизо принимают участие в одном и том же пути, подавляя экспрессию генов в эмбрионах лягушки до стадии МВТ.

2.2 dКаизо является необходимым для развития Danio Rerio Для определения роли белка Каизо в развитии рыб был поставлен эксперимент, аналогичный проведенным на лягушке. Были использованы флуоресцентно меченые морфолино к dКаизо, которые имеют ту же специфичность действия, что и немеченые. Морфолино dKMO инъецировали в эмбрионы на стадии 1-4 клеток. По прошествии 24 и 48 часов развития проводился анализ морфологии и проводился подсчет выживших эмбрионов (рис.16). Эмбрионы с введенными морфолино имели значительно больший процент смертности к 48 часам развития:

89% по сравнению с 17% у эмбрионов с введенными контрольными неспецифическими морфолино.

Рисунок 16. Белок Каизо Danio rerio необходим для развития рыб. Фенотип КМО инъецированных эмбрионов сравнивался с контрольными через 24 часа после оплодотворения. На нижней панель приведен флуоресцентный анализ через 24 часа после введения флуоресцентно меченых морфолино к dКаизо.

Большинство эмбрионов с введенными контрольными морфолино (83%) развивались нормально, однако среди dKMO эмбрионов лишь 2.5% развились нормально, остальные имели различные дефекты развития:

отставание в развитии (8.5%), осевые дефекты и неполное формирование головы. 2.5% нормально развившихся dKMO эмбрионов, однако, имели ненормальные нервные ответы, по сравнению с контрольными эмбрионами (данные не приведены). Эти эффекты введения dКМО в эмбрионы рыб аналогичны ранее описанным эффектам истощения белка dDnmt1(Stancheva and Meehan 2000), что повторяет картину, которая наблюдалась в экспериментах у лягушки, описанных выше.

2.2 Создание и анализ мыши с генетическим нокаутом по гену Каизо 2.2.1. Генетический нокаут гена Каизо в мыши не приводит к проявлению патологического фенотипа Генетический нокаут гена Каизо в мыши был осуществлен методом кондиционного нокаута. Для подтверждения делеции гена Каизо использовали методы иммуноблота и Нозерн-блот гибридизации (рис. 17). Анализ ядерных белковых экстрактов из печени мыши дикого типа и с нокаутом по гену Каизо методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле показал, что метил специфичный комплекс KGB не образуется в случае ядерных белковых экстрактов из печени мыши с нокаутом по гену Каизо.

Рисунок 17. Поодтверждение наличия нокаута по гену, кодирующему Каизо.

А. Нозерн-блот анализ тотальной РНК из тканей (мозг, печень, почки, селезенка) животных дикого типа и нокаутных по гену Каизо. EtBr – агарозный гель, прокрашенный бромистым этидием перед блотированием. Б. Иммуноблот ядерных экстрактов ткани (печени) животных дикого типа и нокуатных по Каизо. WT – ткани животных дикого типа;

KO – нокаутных по гену Каизо. Полоса Каизо соответствует молекулярному весу 100кД. Нижняя панель демонстрирует иммуноблот на IkB-альфа белок как внутренний контроль.

Антитела к белку Каизо эффективно сдвигают KGB, но не оказывают влияния на другие ДНК-белковые комплексы, образующиеся в случае мутантных по Каизо экстрактов (рис. 18).

Несмотря на то, что у лягушки и у рыбы отсутствие Каизо приводило к остановке развития эмбрионов, мыши, мутантные по гену Каизо, не показали ни какого патологического фенотипа и могут поддерживаться в виде устойчивой линии более 10 поколений.

Рисунок 18. Анализ ядерных белковых экстрактов из печени мыши дикого типа и с нокаутом по гену Каизо методом задержки ДНК белковых комплексов в геле. В качестве радиоактивно меченой пробы использовали фрагменты ДНК либо с метилированной (M+CG11), либо неметилированной (CG11) последовательностью ДНК. Нижний ДНК белковый комплекс, образованный M+CG11 и белковыми экстрактами дикого типа, является метил-специфичным комплексом, образованным Каизо (KGB). На дорожках альфа-Каизо нанесены реакции связывания с добавленными в реакцию специфическими антителами к белку Каизо (ZFH6).

Мыши имели нормальный вес, давали жизнеспособное потомство нормального размера. В работе (Yoon, Chan et al. 2003) было показано, что в клетке Каизо взаимодействует с корепрессором N-CoR. Известно, что N-CoR участвует в процессах регуляции развития центральной нервной системы, эритроцитов и тимоцитов. Было решено проверить влияние отсутствия белка Каизо на функции этих тканей. Однако анализ кровяных телец мыши с удаленным Каизо не выявил серьезных отличий от крови мыши дикого типа по составу фракций белых и красных кровяных телец и их морфологии.

Для определения роли Каизо в поддержании плюрипотентности стволовых клеток и их воспроизведении были получены клеточные линии нейрональных стволовых клеток из Каизо +/y и -/y Каизо ЭС клеток. Нейрональные стволовые клетки нокаутные по гену Каизо не отличаются по морфологии и эффективности пролиферации от стволовых клеток нейронов мыши дикого типа.

Дифференцировка полученных нейрональных стволовых клеток в постмитотические нейроны и астроциты показала, что обе клеточные линии были неотличимы друг от друга. Значит, функция Каизо не важна для нейрональной специализации, Каизо не влияет на выживаемость стволовых клеток нервной системы, а также на дифференцировку нейрональных и астроглиальных клеток ex vivo.

2.2.2. Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctex1.

Методом гибридизации на микрочипах был проведён глобальный анализ изменения уровня экспрессии 30 тыс. генов у Каизо-нокаутных мышей. Идентифицирован ряд генов, транскрипция которых оказалась изменена при отсутствии Каизо. Геном с наиболее выраженным увеличением уровня экспрессии оказался ген Tctex1, кодирующий лёгкую цепь динеинового комплекса (Tai, Chuang et al. 1998). Данные гибридизации были подтверждены Нозерн-блот анализом, для которого была использована РНК, полученная из органов (печени и мозга) мышей дикого типа и нокаутных по Каизо (рис. 19). Уровень экспрессии Tctex1 оказался в 4,4±0,6 раза выше в печени нокаутных животных, чем в печени животных дикого типа и в 2,6±0,2 раза выше в мозге животных с делецией гена, кодирующего Каизо, чем в мозге животных дикого типа (рис. 18б).

Рисунок 19. Увеличение уровня экспрессии гена Tctex1 в тканях мышей, нокаутных по Каизо. А.

Нозерн-блот анализ тотальной РНК, выделенной из печени животных дикого типа и Каизо-нокаутных. Верхняя панель – гибридизация с зондом к мРНК гена Tctex1, нижняя панель – гибридизация с пробой к 26S рРНК. Б. Статистический обсчет результатов Нозерн-блот гибридизации РНК, выделенной из печени и мозга животных дикого типа и нокаутных по Каизо. ЕЛ/мм2 – удельная интенсивность радиоактивности геля в районе специфического транскрипта. WT – ткани животных дикого типа, KO – нокауных по Каизо.

При анализе базы данных Entrez Map Viewer было установлено, что в геноме мыши содержится два гена Tctex1: на 17 и 6 хромосомах. При этом ген, находящийся на 17 хромосоме имеет более сложную интрон/экзонную структуру и включает 5 экзонов, тогда как кодирующая часть гена, расположенного на 6 хромосоме состоит из одного экзона (рис.20а). Анализ последовательностей генов Tctex1 позволил идентифицировать рестрикционный полиморфизм в последовательностях мРНК (в гене, расположенном на 17 хромосоме, сайт узнавания рестриктазой MspI отсутствует, рис.20в).С помощью иммунопреципитации хроматина было показано, что Каизо взаимодействует только с CpG-островком гена Tctex1, расположенного на 17 хромосоме. Интересно отметить, что ацетилирование гистонов Н3 и Н4, являющееся маркером активного хроматина, было детектировано в той же области одновременно со связыванием Каизо.

При этом ни взаимодействия Каизо, ни ацетилирования гистонов в районе промотора гена, расположенным на 6 хромосоме детектированно не было (рис. 20б). ОТ-ПЦР рестрикционный анализ показал, что в препаратах тотальной РНК, полученной как из органов животного дикого типа, так и из органов Каизо-нокаутной мыши не содержится транскрипт, соответствующий гену Tctex1, расположенному на 6 хромосоме (рис. 20в, нижняя панель). Таким образом, можно заключить, что Каизо взаимодействует только с геном Tctex1, расположенным на 17 хромосоме, тогда как на 6 хромосоме, вероятно, находится нетранскрибируемый псевдоген.

Рисунок 20. Каизо взаимодействует с геном Tctex1 на 17, но не на 6 хромосоме. А. Схематическое изображение двух генов Tctex1, расположенных на 17 и 6 хромосомах. Стрелками обозначены экзоны;

направление стелки – направление транскрипции. Б. Взаимодействие Каизо с CpG-островком гена Tctex1 in vivo. Иммунопреципитация хромати-на с антителами ZFH6 – поликлональными к Каизо;

anti-Ac H3 – к ацетилированному гистону Н34 anti-Ac H4 – к ацетилированному гистону Н4;

PI – сыворотка крови кролика;

«-Ab» – контроль без антител;

«-/+» – отрицательный и положительный контроли для ПЦР, соответственно. В. В тканях животных как дикого типа, так и с делецией Каизо экспрессируется только ген, расположенный на 17 хромосоме.

Верхняя панель – полиморфизм в последователь-ностях мРНК двух генов. Заштрихованный нуклеотид – полиморфизм, нарушающий сайт узнавания рестриктазой MspI. Нижняя панель – ОТ-ПЦР и расщеплением ПЦР-продукта ферментом MspI Поскольку Каизо взаимодействует с метилированной ДНК, то было решено проверить статус метилирования участка в районе CpG островка гена Tctex1методом бисульфитного секвенирования. Для исследования была использована ДНК, полученная из печени мышей дикого типа и с делецией гена, кодирующего Каизо. Были проанализированы две области: «-189;

-57» и «+160;

+460» по отношению к точке старта транскрипции. В области «-189;

-57» метилирование ДНК детектировано не было (проанализировано по 10 клонов для ДНК животных дикого типа и Каизо-нокаутных). Область «+160;

+460» характеризуется малым процентным содержанием метилированных CpG динуклеотидов (проанализировано 20 клонов для ДНК животных дикого типа и 21 – для Каизо нокаутных), причем уровень метилирования ДНК не зависит от присутствия Каизо (рис. 21).

Рисунок 21. Анализ CpG-островка гена Tctex1.

Делеция гена Каизо не приводит к изменению метилирования ДНК в районе CpG-островка гена Tctex1.

Верхняя панель – плотность метилирования ЦфГ динуклеотидов на 17 хромосоме в районе гена Tctex1. Серые прямоугольники – экзоны;

стрелка – направление транскрипции. Районы 1 и 2 – участки, для которых был исследован статус метилирования.

Поскольку ген Tctex1 экспрессируется и в нормальном организме, можно предположить, что Каизо является модулятором активности гена Tctex1, взаимодействуя с остаточным метилированием ДНК в промоторной области. Таким образом, в результате проведенных исследований продемонстрирована возможность взаимодействия Каизо-содержащего белкового комплекса с последовательностями ДНК, подвергающимися метилированию в результате таких процессов, как геномный импринтинг, опухолеобразование и подавление транскрипции мобильных элементов. То, что нокаут Каизо не приводил к изменению в экспрессии большинства исследованных генов, может быть объяснено наличием «избыточного» количества метил-ДНК связывающих белков.

2.2.3. Делеция гена Каизо в мыши приводит к изменению структуры хроматина в районе H19 DMR, но не влияет на уровень экспрессии Н19 и IGF Как было показано выше (см. рис.10б) Каизо может связываться in vivo с метилированным отцовским аллелем в районе Н19 DMR. Для изучения функциональной роли Каизо в районе H DMR были проведен анализ структуры хроматина в районе Н19 DMR (ацетилирование и метилирование гистона Н3, убиквитинирование гистона Н2А) с помошью хроматин иммунопреципитации в животных дикого типа и нокаутных по гену Каизо.

Рисунок 22. Взаимодействие Каизо с метилированным аллелем H DMR. Делеция Каизо приводит к исчезновению убиквитинирования на отцовском аллеле H19 DMR. А. верхняя панель - картирование рестрикционного полиморфизма в D3-районе H19 DMR. А (нижняя панель),Б. Иммунопреципитация хроматина с указанными на рисунке антителами с последующей ПЦР и рестрикцией продукта HaeIII. «-Ab» – контроль без антител;

«+» – положительный контроль для ПЦР ЦфГ динуклеотид, содержащий цитозин: МГ – в метилированной форме;

ЦГ – в неметилированной форме.

При использовании антител к метилированному по остатку К либо К27 гистону Н3 или к ацетилированному по остатку К гистона Н3 разницы в распределении модификаций хроматина между отцовским и материнским аллелями для нокаутных по гену Каизо животных и животных дикого типа детектировано не было (рис.22). Также было исследовано убиквитинирование гистона H2A в районе H19 DMR. Показано, что данная модификация характерна только для отцовского метилированного аллеля. При этом делеция Каизо приводила к полному исчезновению данной эпигенетической модификации в районе H19 DMR (рис.22б). Таким образом, можно заключить, что Каизо способен привлекать убиквитинирование гистона Н2А к метилированным последовательностям ДНК.

Полученные при анализе распределения модификаций хроматина данные позволяют предположить, что Каизо играет важную роль в регуляции экспрессии генов H19 и Igf2.

Поскольку эпигенетические маркёры импринтных генов образуются во время гаметогенеза, можно было ожидать, что отсутствие Каизо во время спермато- или оогенеза приведёт к нарушению импринтинга в исследуемом локусе. Для проверки данного предположения было проанализировано потомство от скрещивания Каизо-нокаутного самца с самкой дикого типа, а также реципроктного скрещивания самца дикого типа с Каизо-нокаутной самкой. В обоих экспериментах животные дикого типа принадлежали к линии SD7. Поэтому потомство от данных скрещиваний имело рестрикционный полиморфизм между отцовским и материнским аллелями как в кодирующей последовательности гена H19, так и в кодирующей последовательности гена Igf2 (рис. 23).

Рисунок 23. Рестрикционный полиморфизм в кодирующих последовательностях генов H19 и Igf2.Делеция Каизо не влияет на уровень экспрессии H19 и Igf2.А.Схематическое изображение ОТ-ПЦР амплифицированных фрагментов с указанием рестрикционного полиморфизма.

Б.Обратная транскрипция с последующим расщеплением рестриктазами NlaIII либо BsaAI. В качестве матрицы для ОТ-ПЦР взята тотальная РНК, выделенная из ткани мышей, полученных от скрещиваний M.spretus () x M.m.domesticus () и ш () x M.spretus ().В.Аллель-специфичная ПЦР в реальном времени. В качестве матрицы для ОТ-ПЦР взята тотальная РНК, выделенная из тканей печени мышей, полученных от скрещивания Каизо-нокаутной самки и самца линии SD7.

При анализе мРНК, выделенной из тканей этих мышей не было детектированно разницы в содержании транскриптов генов H19 и Igf2 между нокаутными животными и животными дикого типа либо гетерозиготными по Каизо (рис. 23в). Таким образом, отсутствие Каизо во время гаметогенеза не влияет на формирование эпигенетических маркёров импринтинга.

2.2.4 Задержка развития рака кишечника в Apc Min/+ мыши с удаленным геном Каизо Ряд фактов привел к мысли о возможном участии Каизо в процессах неопластической трансформации кишечника. Во первых, накоплено много данных об участии метилирования ДНК в подавлении экспрессии генов в процессе патогенеза рака кишечника (Kondo and Issa 2004). Во-вторых, белок Каизо может взаимодействовать с белком р120-катенином, который в 25% опухолей кишечника перестает экспрессироваться и в 40% опухолей он ненормально экспрессируется или ненормально распределен в клетке Рисунок 24. Удаление гена Каизо приводит к уменьшению размера опухолей и увеличению продолжительности жизни Apc Min/+ мышей. А Диаграмма Каплана –Майера кривых выживания Каизо -/y Apc Min/+ мышей (пунктирная линия) и Каизо +/y Apc Min/+ мышей (непрерывная линия). Мыши Каизо -/y Apc Min/+ живут значительно дольше (в среднем 317 дней, серая вертикальная линия) мышей Каизо +/y Apc Min/+ (в среднем 217 дней, черная вертикальная линия, Р=0.006 [log шкала] ).

Б- Количество опухолей не изменяется с удалением гена Каизо. Прямоугольники показывают количество аденом на мышь, возникающих к 180 дню и к моменту гибели животного. Горизонтальная линия в прямоугольнике обозначает среднее количество по мышам. Серые прямоугольники – Каизо +/y Apc Min/+ мыши, незакрашенные - Каизо -/y Apc Min/+ мыши. Ни каких существенных различий между Каизо -/y Apc Min/+ и Каизо +/y Apc Min/+ мышами не было обнаружено ни на 180 день (Р= 0.10 [Манн-Витней], n20 ), ни в момент гибели (Р= 0.62 [Манн-Витней], n20). С- Размер опухолей, измеряемый по плошади, меньше в мышах Каизо -/y Apc Min/+ на 180 день (Р= 0.001 [Манн-Витней], n114), но не к моменту гибели (Р= 0.55 [Манн-Витней], n239). Серые столбики – Каизо +/y Apc Min/+ мыши, незакрашенные – Каизо -/y Apc Min/+ мыши. Указаны стандартные отклонения от среднего значения.

(Thoreson and Reynolds 2002;

Kelly, Spring et al. 2004). В третьих, Каизо вовлечен в Wnt сигнальный путь (Kelly, Otchere et al. 2004;

Kim, Park et al. 2004;

Gregorieff and Clevers 2005;

Park, Kim et al. 2005;

Spring, Kelly et al. 2005), который часто нарушен в опухолях кишечника. Чтобы проверить участие Каизо в образовании рака кишечника, была использована мышиная модель Min/+ Min/+ человеческой болезни familial adenomatous polyposis Apc (Su, Kinzler et al. 1992). Apc мыши страдают от образования множественных полипов кишечника, возникающих в течении Min/+ первых шести месяцев их жизни. Мышь, с удаленным геном Каизо, была скрещена с Apc мышью. Изучение выживаемости и частота возникновения опухолей проводили в их потомках самцах Каизо-/y Apc Min/+.

-/y Min/+ Было зафиксировано значительное увеличение выживаемости Каизо Apc самцов, по +/y Min/+ сравнению с мышами Каизо Apc (рис. 24а). Опухоли возникали на 180 день, к моменту гибели животных их количество было сравнимо между мышами обоих генотипов (рис. 24б), но размер полипов был значительно меньше на 180 день у мышей с удаленным геном Каизо (рис.24в).

Рисунок 25. Недостаток уровня белка Каизо не изменяет уровень апоптоза или скорость митоза ни в нормальном эпителии кишечника, ни в эпителии аденом мыши. а- отсутствие значимых различий в уровне апоптоза в нормальном эпителии (4.18±0.96 v 4.66±0.84, n=3 р=0.51 Манн Витней) или в эпителии аденом (3.93±0.14 v 0.30±0.31, n=3 р=0.65 Манн Витней) мышей дикого типа и мышей с удаленным геном Каизо. б- Отсутствие значимых различий в скорости митоза в нормальном эпителии (0.69±0.26 v 0.91±0.24, n=3 р=0.38 Манн Витней) или в эпителии аденом (0.389±0.06 v 0.379±0.06, n=3 р=0.10 Манн Витней) мышей дикого типа и мышей с удаленным геном Каизо. Уровень апоптоза в эпителии аденом значительно ниже уровня апоптоза в эпителии нормальной слизистой ( р=0.04, Манн Витней, как показано ранее в Bedi et al, 1995, Cfncer Res 55: 1811-1816). Черные столбики – Каизо +/y Apc Min/+ мышь, незакрашенные столбики – Каизо -/y Apc Min/+ мышь. Указаны стандартные отклонения.

Анализ полипов мышей с и без гена Каизо не выявил существенных различий в митотических индексах или в уровне апоптоза ни в нормальном эпителии ни в аденомах (рис. 25), доказывая тем самым, что уменьшение скорости роста полипов в мышах без гена Каизо не вызвано уменьшением потенциала клеточного деления или усилением клеточной гибели. Для дальнейшего изучения вопроса вовлечения Каизо в процессы неопластической трансформации кишечника, был проверен уровень экспрессии гена Каизо в опухолях кишечника мышиной модели MUC2-/-, у которой развиваются злокачественные опухоли кишечника, как у человека при болезни хронического воспаления брюшины.

Рисунок 26. Уровень экспрессии Каизо выше в опухолях кишечника мыши.а Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей кишечника и нормальной антителами к Каизо 6F Muc2-/- мышей с указанным слизистой увеличением. б- Иммуноблот анализ двух пар опухолей кишечника Muc2-/ мышей и соответствующих нормальных слизистых, взятых в качестве контроля. Блот гибридизовали с антителами к белку Каизо 6F и к белку актин, для нормализации количества нанесенного в лунку общего количества белков.

Было проведено иммуногистохимическое окрашивание срезов MUC2-/ и иммуноблот анализ опухолей, нормальную слизистую этих же мышей использовали в качестве контроля.

Оба метода показали значительное увеличение содержания белка Каизо в клетках опухолей, по сравнению с контролем (рис. 26). Полученные данные предполагают участие Каизо в неопластической трансформации кишечника, так как отсутствие Каизо приводит к сдерживанию роста опухолей в Min/+ APC мышах, и в опухолях кишечника мыши повышен уровень экспрессии белка Каизо. Это предполагает, что Каизо может метил-зависимо подавлять экспрессию генов. На этом этапе исследования важным является обнаружение реальных генов мишеней Каизо в клетках кишечника, вовлеченных в раковую трансформацию.

2.2.5. Каизо является метил-чувствительным регулятором генов опухолевых супрессоров в раковых клетках кишечника.

Для определения роли Каизо в репрессии генов опухолевых супрессоров в раке кишечника были выбраны две линии клеток: Colo320 и HCT116, представляющие данный вид рака. Было показано, что Каизо экспрессируется в этих клеточных линиях (данные не приведены). С помощью methylight assay был проанализирован статус метилирования промоторных участков генов. Эта выборка генов включала в себя те локусы, для которых показано гиперметилирование в различных видах рака. Гиперметилирование было характерно для 57% генов в Colo320 и 24% генов в HCT116. Для дальнейшего анализа были выбраны три гена, гиперметилированные в обеих клеточных линиях: CDKN2A, HIC1, MGMT. CDKN2A является опухолевым супрессором, который инактивирует комплекс циклин D-cdk4/6, блокирует гиперфосфорилирование Rb, что приводит к остановке клеточного цикла (Sherr and Roberts 1995). HIC1 является транскрипционным репрессором и может регулировать SIRT1 при различных повреждениях (Chen, Wang et al. 2005). Подавление транскрипции MGMT приводит к нарушению в системе репарации и приводит к геномной нестабильности(Esteller 2002). Для определения взаимодействия Каизо с промоторами CDKN2A, HIC1, MGMT in vivo была проведена количественная иммунопреципитация хроматина, в результате которой продемонстрировано, что Каизо взаимодействует in vivo с промоторами выбранных генов в Colo320 и HCT116 клеточных линиях (рис.27а,в). Известно, что в клеточной линии HCT116 ген CDKN2A инактивируется благодаря гиперметилированию одного аллеля и мутации другого аллеля (Myohanen, Baylin et al.

1998). Для того чтобы определить, с каким аллелем взаимодействует Каизо, полученный пул ДНК в результате иммуноперципитации хроматина был проанализирован с помощью метил чувстительной рестрикцией. Оказалось, что Каизо в HCT116 связывается с метилированным аллелем промотора гена CDKN2A (рис.27с,д).

Рисунок 27. Каизо связывается с метилированными промоторами в раковых клетках кишечника. Количественный ChIP анализ был проведен на Colo320 (А) и HCT (B) для определения связывания Каизо с промоторами CDKN2A, MGMT, HIC1.По оси Y отложено обогащение имуннопреципиации с антителами к Каизо или к IgG относительно ДНК до иммунопреципитации. С-СhIP с антителами к Каизо был выполнен на клетках HCT116, в которых промотор CDKN2A полуметилирован (1 дорожка).2 и 3 дорожки ПЦР после рестрикции MspI и HpaII соотвественно фрагментов ДНК после ChIP (Каизо связывается только с метилированным аллелем).Д –После ChIP был проведен ПЦР в реальном времени после обработки фрагментов ДНК рестриктазами MspIи HpaII.

Далее, необходимо было определить, зависит ли подавление транскрипции выбранных гиперметилированных генов от Каизо.

Рисунок 27. Каизо подавляет транскрипцию 8метилированных генов раковых клетках кишечника.После обработки клеток Colo320 (a), HCT116 (B) siRNA1 (черные) и siRNA2 (серые) на Каизо был определен уровень мРНК генов CDKN2A, MGMT, HIC1 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

Для этого, используя 2 разных siRNA на Каизо (siRNA1 и siRNA2), был понижен уровень клеточного белка Каизо. С помощью количественного ОТ-ПЦР было показано, что снижение уровня Каизо приводит к повышению уровня, как мРНК (рис.28), так и белка (данные не приведены) для CDKN2A, HIC1, MGMT в обеих клеточных линиях. Таким образом, удаление Каизо приводит к реактивации данных локусов. Для того чтобы определить, каким образом удаление Каизо оказывает влияние на транскрипцию генов опухолевых супрессоров, был проверен статус метилирования промотора CDKN2A в Colo320 и НСТ116 в присутствии и отсутствии Каизо. Для этого был использован MassArray анализ, который позволяет определить количество метилированных CpG в заданной последовательности. Были выбраны два участка в промоторе гена CDKN2A: один из участков содержал два консенсусных сайта для Каизо (Сhr9 21,964,659-21,964,922), второй участок (Chr 21,966,178-21,966,699), в состав которого не входят сайты для Каизо. Было показано, что удаление Каизо не приводит к каким-либо изменениям в статусе метилирования промотора CDKN2A. Эти данные были также подтверждены с помощью бисульфитного сиквенса (данные не приведены).

Таким образом, метилирования промоторов генов, которые связаны с опухолеобразованием, недостаточно для подавления их транскрипции, более того их уровень экспрессии частично зависит от присутствия Каизо. Подобная ситуация наблюдалась при удалении другого метил ДНК-связывающего белка MBD2(Sansom, Berger et al. 2003).Также известно, что гистон деацетилазы вносят свой вклад в снижении уровня транскрипции метилированной ДНК. Таким образом, в подавлении транскрипции генов с метилированным промотором могут участвовать несколько механизмов.

Поскольку Каизо может оказывать влияние на экспрессию генов супрессоров опухолевого роста, то было решено проверить, оказывает ли влияние удаление Каизо на чувствительность клеток рака кишечника к различным видам раковой терапии. Для этого клеточные линии Colo320 и HCT116 трансфецировали двумя видами siRNA на Каизо или контрольными siRNA. Через 24 часа после трансфекции клетки были синхронизированы с помощью сывороточного голодания. После синхронизации было изучено влияние Каизо на клеточный цикл: через 24 и 48 часов после синхронизации была произведена оценка, на какой стадии клеточного цикла находятся клетки.

Для клеток нетрансфецированных или трансфецированных контрольными siRNA в Colo320 через 24 и 48 часов 51% и 57% клеток соответственно находилось в G1 фазе клеточного цикла. В клетках с siRNA на Каизо в Colo320 через 24 часа было 68% и 62% клеток в G1 фазе (данные приведены для двух разных siRNA), а через 48 часов – 71% и 76%. В случае линии клеток HCT116, для нетрансфецированных клеток и контрольных клеток через 24 и 48 часов процент клеток в G1 фазе составил 51%. В случае использования siRNA на Каизо через 24 часа после сывороточного голодания процент клеток в G1 фазе был 61% и 66%, а через 48 часов – 78% и 56%. Для определения влияния противораковых препаратов на клетки с пониженным уровнем Каизо был использован этопозид в концентрации 50mol/L. После трансфекции siRNA на Каизо клетки обрабатывали этопозидом и оценивали смертность клеток с помощью окрашивания acridine orange/этидиум бромидом через 48 и 72 часа. Для контрольных и нетрансфецированных Colo320 было показано, что смертность клеток составляет 10% и 11% через 48 и 72 часа после обработки. Для клеток с siRNA на Каизо смертность через 48 часа составила 20-23%, а через часов – от 25 до 35%. Для линии клеток НСТ116 были получены следующие данные: для контрольных и нетранcфециро-ванных клеток смертность была замечена менее чем у 5% клеток (через 48 и 72 часа), тогда как при siRNA на Каизо смертность составила 22-28% через 48 часов и 24-27% через 72 часа. При использовании нормальных фибробластов из кишечника удаление Каизо не оказывало какого-либо влияния на уровень экспрессии генов CDKN2A, MGMT, HIC1 и не приводило к изменению в клеточном цикле или смерти клеток при использовании этопозида.

Таким образом, удалось показать, что Каизо участвует в подавлении транскрипции метилированных генов, которые вовлечены в регуляцию клеточного цикла и выживание клеток.

Каизо способствует пролиферации раковых клеток и устойчивости к противораковым реагентам.

3. Две функции домена “цинковые пальцы” белка Каизо Как было сказано выше, белок Каизо был определен одновременно в лаборатории доктора Рейнольдса как партнер р120 катенина в дрожжевой двугибридной системе (Daniel and Reynolds 1999). Им же было показано, что Каизо может специфически взаимодействовать и с неметилированной ДНК- CTGCNA, названной Каизо связывающим сайтом (КСС). Таким образом, белок Каизо может взаимодействовать как с метилированной ДНК, так и с неметелированными последовательностями, содержащими КСС. И если предположить существование некоторого сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поверхности клетки в ядро, приводящего к выключению генов, то изучение функциональной значимости взаимодействия Каизо с р120 катенином особенно важно.

Взаимодействие катенина р120 с Каизо опосредованно через Arm домен, таким образом, катенин р120 может формировать белковый комплекс либо с Е-кадхерином, либо с белком Каизо.

Исходя из возможности связывать как метилированную ДНК, так и неметилированную, Каизо может влиять на транскрипцию как генов, содержащих метилированные регуляторные элементы, так и генов, для промоторов которых характерно наличие последовательности КСС. Так КСС последовательность характерна для промоторов таких генов например, как Matrilysin, Siamois и Wnt11(Daniel and Reynolds 1999;

Daniel, Spring et al. 2002). Данная часть работы посвящена определению функциональной значимости как взаимодействия Каизо с р120 катенином, так и взаимодействия Каизо с метилированной ДНК и последательностями, содержащими КСС.

3.1 Взаимодействие белка Каизо с р120 катенином и метилированной ДНК носят взаимоисключающий характер 3.1.1. Ядерная и цитоплазматическая локализация белка Каизо в клетках млекопитающих.

Влияние р120 катенина на клеточную локализацию Каизо.

Для метил-ДНК-связывающего белка Каизо определена ядерная локализация в клетках млекопитающих, однако способность его к взаимодействию с р120 катенином в цитоплазме, предполагает возможность цитоплазматической локализации Каизо (Daniel and Reynolds 1999;

Daniel, Spring et al. 2002). Используя метод иммунофлуоресцентного анализа на различных клеточных линиях, трансфецированных Каизо-GFP, было показано, что Каизо находится в ядре, однако и в цитоплазме наблюдается незначительное количество Каизо. Таким образом, метил ДНК-связывающий белок Каизо может находиться в клетках млекопитающих не только в ядре, но и в цитоплазме.

Используя метод имммунофлуоресцентного анализа, было решено оценить влияние высокого уровня экспрессии р120 катенина на локализацию Каизо в клеточных линиях HeLa. При высоком уровне экспрессии р120 в клетках наблюдается «ветвящийся» фенотип, связанный с инактивацией RhoA и/или активацией Rac1 белков (Reynolds, Daniel et al. 1996;

Anastasiadis and Reynolds 2001). Каизо-FLAG и р120-GFP были совместно трансфецированы в клеточную линию человека HeLa. В результате повышенного уровня экспрессии р120 катенина, полноразмерный Каизо делокализовался из ядра в цитоплазму (рис. 29а). Исходя из того, что домен «цинковые пальцы» Каизо отвечает за связывание белка с ДНК, было решено проверить, как будет локализоваться Каизо в клетке без этого домена.

Рисунок 29. Локализация белка Каизо при повышенной экспрессии р120 катенина. а Совместная трансфекция поноразмерного Каизо (конструкция Каизо(1-672)-FLAG) с р120 катенином (конструкция р120-GFP) в клеточную линию HeLa.. б - Совместная трансфекция конструкции Каизо без домена «цинковые пальцы» (Каизо(1-490)-FLAG) с р120 катенином (р120-GFP) в клеточную линию HeLa. Для идентификации Каизо в иммунофлуорисцентном анализе использовались антитела на FLAG пептид.

При совместной трансфекции р120-GFP с Каизо (аа 1-490)-FLAG в линию клеток HeLa наблюдалась четко выраженная ядерная локализация белка, несмотря на сохранение ветвящегося фенотипа клеток (рис. 29 б).

На основе полученных данных можно предположить, что р120 катенин, несущий сигнал ядерной локализации способен взаимодействовать с Каизо и приводить к делокализации белка из ядра в цитоплазму, тем самым, понижая его транскрипционную активность и вовлекая Каизо в другие молекулярные механизмы жизнедеятельности клетки.