Cyiipamoлekyлярные биохимиlfеские ciictemы в исследованиях биомембран и 1-tliологических жидкостей животных
На правах рукописи
ЗАЙЦЕВ СЕРГЕЙ 10РЬЕВИЧ CYIIPAMOЛEKYЛЯРНЫЕ БИОХИМИLfЕСКИЕ CIICTEMЫ В ИССЛЕДОВАНИЯХ БИОМЕМБРАН И 1-tliОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ЖИВОТНЫХ 03.00.04- Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой стеnени доtстора биологических наук
Москва 2007 www.sp-department.ru
Работа выnолнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная ака демия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», е Инс;
итуте биоорrанической химии им. аiСЗдемиков М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова Российеkой Академии Наук.
Официапьные оппоненты: докrор биолоrических наук Букова Наталья Константиновна, доктор биологических наук, nрофессор Карnенко Лариса Юрьевна;
доктор биологических наук, nрофессор Клоnов Михаил Иванович.
Ведущая организация - ГНУ iсВсероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства» РАСХН.
п!с ~ащита сос.тоится 23 мая 2007 года в -fC... часов на заседании д~1ссертационного совета Д 220.042.04 nри ФГОУ ВПО «Московская гЬсударСтее'нная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина» nо а Ар е с у: 109472, Москва, yn. Академика Скрябина,23,тел.З77-9383. ·
С диссертацией можно ознакомиться в библио1еке ФГОУ ВПО Мо сковская rосударственная академия ветеринарной медицины и биотех нологии им. К.И. Скрябина)).
11 »аnреля 2007 r.
Автореферат разослан«
Ученый секретарь Фомина В.Д.
.
диссертационного совета www.sp-department.ru
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1..
Актуальность проблемь1. Проблема создания, изучения и nри менения суnрамолеку.riярнЫх биохимических систем (СБС) с Зада~ ными свойствами, п~дстав,nяющих собой высокоорганизованные комплексы белков, лиnидов. и других биологически: аю:ивных. соед\+,, нений (БАС), является сQвременной и находится «на СТЪIКе» биоло гической и биоорганической химии;
био- и нанотехнолс;
rии;
фунда ментальной медицины и ветеринарии. Решение фундам~нтальных и прикладных асnектов этой комnлексной проблемы имеет важно.е зн.а чение для биохимических исследований биолоrиче~ких жидкостей животных, моделирования биомембран, создания бионаноматериа лов и т.д. [Афонский С.И.. 1966;
Овчи~:~ников ЮА, Иванов В.Т и др., Березин И.В., 1985;
Friedrich Р., 1986;
Kuhn Н., Moeblus 0., 1993;
1974;
Лен Ж-М., 1998;
Lvov У., Moehwald Н., 2009-2006 и др.].
Среди СБС наибольшее значение имеют комnлексы на основе белков, nрежде всего ферментов, nрименяющиеся в медицине;
сельском хозяйстве. ветеринарии, а таюке в nромышленности: nи щевой, фармацевтической, косметической, текстильно-кожевенной.
К настоящему времени накоnлен значительный экспериментальный материал и сформулированы теоретические nредставления о ме тодах _иммобилизации различных ферментов [Mosbach К., 1976;
Березин И.В. и др., 1987;
Кабанов ВА и др., 1987;
Вудворд Дж., 1988;
Варфаламеев С.С. и др., 1999;
Штильмэн М.И., 2006 и др.], однако исследований по направленному изменению ферментатив ной активности лиnаз в трехкомnонентных комnлексах на основе двух противоnоложно заряженных nолимеров до начала наших ра бот не nроводилось. Многие ферменты, детектируемые в nлазме крови и широко nрименяемые для диагностики физиолого биохимического статуса животных. можно рассматривать как «эндо генные» СБС высоких уровней организации, nоскольку они состоят из нескольких nолипептидных цеnей (субъединиц), которые, комби нируясь различными сnособами, образуют четвертичную струкrуру фермента. Так, лактатдеrидроrеназа (ЛДГ) состоит из 4 субъединиц типов (Н и М);
креатинкиназа (КК)- из 2 субъединиц 2 тиnов (В и М). Более того, у животных обнаружено 5 изоформ ЛДГ и 3 изофор мы КК. Все эти ферменты и их изОформы в крови животных состав ляют характерный набор ( «ферменТные• tБСФ или «ферментный профиль»), который зависит от nатологических изменений органов и тканей животных, чта.я~илось нашей базо~о~ моделью для био www.sp-department.ru химических исследований крови животных и совершенствования биохимИческих методов анализа. Новыми «интегральными» харак теристиками не только nлазмы крови. но и других биологических жидкостей являются данные их nоверхностному натяжению (ПН).
no которые в последние годы исnользуются в диагностике заболева ний человека в ряде научно-медицинских центров ФРГ и Украины Поэтому актУальным является клиническое исследование ПН плаз мы крови животных в сравнении с данными биохимических анали зов, которое. выполнено для животных в ФГОУ ВПО МГАВМиБ вnервые в мире.
Важную роль играют СБС на основе липидов. что обусловлено их зн.ачением в биоэнергетике. биомембранах. биологических )/{Идкостях животных. Известно, что биохимический (в т. ч. лиnидный) состав крови и молока претерnевает значительные изменения во время лак тации у коров. Однако детальные исследования изменений липидно го состава молозива и молока коров по семидесяти жирным кислотам nри различных состояниях животных до сих пор не nроводились. Эти исследования становятся все более актуальными в связи с воnросом о качестве и nодлинности вырабатываемых молочных продуктов.
Другим важным асnектом ~лиnидt\ьrх» СБСn является структурно функциональное моделирование биомембран. что nриелекает все большее внимание ученых [Singeг S.J., Nicolson G.L.. 1972: Бергель сон Л.Д., 1975, 1981;
Лев А.А., 1976;
Овчинников Ю.А., 1987;
de Kruijff В., 1987;
Moehwald Н, Moeblus D., 1991;
Chapman D., 1993;
Ген нис Р., 1997;
Аgге Р., MacKinnon R., 2003 и др.]. Актуальным является исследование фрагментов биомембран. комnлексов липидов, белков, БАС и их аналогов в монослоях, которые nредставляют собой «ЛИ· nидные» и «синтетические» СБСn. имеющие как фундаментальное (для моделирования биоnроцессов самоорганизации, молекулярного узнавания и т.д.), так и nрикладнее значение (для создания бионано матер1-1алов и т.д.).
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось созда ние и структурно-функциональное изучение суnрамолекулярных биохимических систем (СБС) с заданными свойствами и уровнями организации для моделирования ряда биологических процессов, совершенствования биохимических методов исследований биоло гических жидкостей животных, создания био- и наноматериалов.
.Для достижения этой цели былr,~~ nоставлены следующие задачи:
-разработать nринциnы систематизации СБС на основе фермен тов (СБСФ) и лиnидов (СБСn) no уровням структурной организации:
www.sp-department.ru разработать модель и определить константы гидролиза липазами лиnидаnодобных субстратов в монослое (как СБСФ уровня);
1' - изучить влияние поверхностно-активных веществ и полимерно ионного окружения на каталитические свойства СБСФ zro - 4'0 уров ней (на осмове лиnаз и трипсина) для создания биоматериалов;
выявить корреляцию «ферментного nрофиля» сыворотки крови (как СБСФ уровня) у собак старших возрастов с изменениями в 5' деятельности сердца;
разрабо·rать методику и nровести исследования поверхностного ··1атяжения модельных систем и сыворотки крови здоровых лошадей 1как СБС 6'0 уровня) в сравнении с биохимическим анализом крови;
изучить влияние «экзогенной» СБС (на nримере биологически активt-tой добавки на «эндогенную} СБС (на nримере из «Nurisol») менений жирнокислотного состава молозива и молока коров);
-- изучить изменения жирнокислотного состава молозива и молока {Как СБСn уровня) у tюров в течение первых недель лактации nри 1' сравнении здоровых и больных животных;
- nолучить и исследовать сБс" 2'0 и 3'0 уровней (различные тиnы монослоев на основе липидов с включенными белками и nеnтида ми) как 'модеiJей биомембран, б~о- и наноматериалов;
- nолучить и изучить монослоИ мембранных фракций клеток с раз личным содержанием П-гликоnротеина (как СБСn 4' уровня);
- nолучить и изучить монослои новых мембрано-активных соедине ний - амфифильных фотахрамных комnлексанов (АФК) как «синте lИческих» СБС, моделирующих оnределенные структурно функциональные nараметры СБСn 2ro - 4ro уровней.
Научная новизна работы. Разработаны принципы создания и изучения суnрамолекулярных биохимических систем с заданными свойствами и уровнями организации. На основании детального ис следования особенностей структурной организации «ферментных» L1 «липvодных} СБС предложена их систематизация по уровням с регулируемым составом. Разработана модель и оnределены кон •3анты гидролиза липазами новых лиnидаподобных субстратов в монослое на границе раздела фаз. Получены комплексы на основе липазы и двух nолиэлектролитов, nроявляющие повышенную ката литическую активность. Предложена схема формирования этих многокомnонентных СБСФ и nокаэано вли~ние nолимерно-ионного окружени1 на ферментативную активность липазы из nоДЖелудоч ной железы свиней, ба.rериаrsьных лиnаз и трипсина. · www.sp-department.ru Разработана методика оnределения nоверхностного натяжения модельных СБС и сыворотки крови ·животных (как «эндогенной» СБС высшего уровня). Вnервые оnреДеЛены характеристические значения ПН у здоровых лошадей и· обнаружень1 достоверные от лич~я у Же~бцов. и.кобыл. iiокаЗано, что статические (начальные) · энач~ия·· ПН ·'оnреДеЛяЮтся лиnИдным и солевым составом сыво ротки крови, а динамиЧеские значенИя ПН - nостеnенной адсорбци ей белков сыворотки крови из объ~ма на границу раздела фаз.
Вnервые nроведено сравнительное изучение «ферментного nрофиля» сыворотки крови (как СБСФ уровня) у собак старших 5' возрастов в норме и nри хронической сердечной недостаточности (ХСН) на основании: как оnределения активности аланинами v нотрансферазы (АЛТ), асnартатаминотрансферазы (АСТ) и глутамилтрансферазы (ГГТ), так и содержания изоферментных форм лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинкииазы (КК). Важно, что во всех контрольных груnпах nроисходит снижение активности этих ферментов с возрастом;
а во всех опытных груnпах (nри ХСН) nро исходит увеличение в раза активности АЛТ, дет и ГГТ;
в раз 2-4 активности ЛДГ (nреимущественно за счет фракций ЛДГ 1 и ЛДГ2 );
в раза активности КК (за счет фракций КК-МВ и КК-ММ).
Впервые детально исследовано изменение содержанИя большо го числа (71ой) жирных кислот (ЖК), в том числе зз• изомеров ЖК, в молозиве и молоке (как «ЖК nрофиль» илИ СБСn 1'0 уровня) у коров ~.nервые недели лактации в норме и ripи nатологии, а также nри введении в рацион добавки «Nurisol» (как «экзогенной» СБСn).
Изучены мембраны на основе липидов, nептИДв и белков (СБСn 2'0 4'0 уровней), перспективные для моделирования биомембран и создания биосенсоров. Определены условия получения монослоев мембранных фракций. клеток с различным содержанием (до 32%) П ГJ1икопротеина (ПГП): МаксИмальный эффект действия верапамила (модулятора ПГП) наблюдается, когда количество молекул верапа мила в субфазе сравнимо с количеством молекул ПГП в монослое, что указы~ает на ·специфические изменения в структуре мембран ··~·НЫХ фракций клеток. Детально изуЧены «синтетические» СБСn 2'0 4'0 уровней на основе новых мембранно-активных соединений. (АФК) и разработаны принциl)ы ёоЗданиЯ~ био- и наноматериалов с комnлексом заданных. свойств.
Теорети-tеская И ·nрактическая Значимость работы. Опреде лены оnтимальные усЛовия для иммобилиз'ации лиnаз в комnлексы www.sp-department.ru с nолиэлектролитами, nозволяющие nолучить биоматериалы на основе СБСФ с заданными.свойствами.. На основе сравнительного исследованиs:. различных комплексов лиnаз микробного и животного nроисхождения nолучены ферментные nреnараты с реrулируемой активностью в широком темnературном- интервале, что nредСтавле но в заявках автора и др. и N!22006111372, N на nолучение nатентов РФ на изобретения (nоложи N тельные решения от 13.02.2007 г. с nриоритетом от 14.06.2006 г.).
Разработана методика nроведения исследований ПН сыворотки крови лошадей и nоказана nерсnективность внедрения в nрактику ветеринарии, зоотехнии и биологии достаточно nроС'Того и удобного метода эксnресс-диагностики физиолого-биохимического статуса животных. Результаты изучения биохимических nоказателей крови у собак nри ХСН nоказали возможность комnлексной диагностики ХСН и разработки эффективных методов коррекции возникших из менений, что исnользуется в работе ветеринарных клиник г. Моск вы.
Вnервые получен «ЖК nрофиль» по 71ой жирной кислоте молоJа и молозива коров черно-пестрой nороды в зависимости от nериода лактации, состава рациона и состояния здоровья животных, что имеет огромное значение nри разработке nроцессов nолучен11Я диетических молочных nродуктов и необходимо для раЗработки нормативных документов на молочную nродукцию (ГОСТ Р 52253 и др.), где ЖК состав является одним из nоказателей, nозво ляющих выявить фальсификат и недоброкачественную nродукцию.
Изучены различные тиnы лиnид-белковых монослоев и nоказана их эффективность для моделирования nроцессов молекулярного узнавания и трансnорта в биомембранах, что важно для ряда био химических методов анализа. Разработаны методики и nолучены серии образцов нанакомnозитных материалов на основе новых мембранно-активных соединений (АФК) для детекции катионов ме таллов и диаминов: акты N!!З от г. nри сдаuе N21, N22, 06. 11. темы ИН-12.1 1015/027 Минобрнауки РФ по гос. контракту от г., выnолненной совместно с учены Nsi02.434.11.2039 09.11. ми ЦФ РАН с nолучением nатентаРФ на изобретение с N!! приоритетом от г.
27.12.2005 • Результаты и основные научно-методические nоложения дис сертации исnользуются в лекционных курсах и лабораторных nрак тикумах для студентов курсов nри nодготовке сnециалис~ов 2- www.sp-department.ru высшей· квалификации no сnециальности 012300- Биохимия. а так Же для ·подготовки аспирантов, докторантов и соискателей в ФГОУ ВПО МГАВМиБ по специальности 03.00.04- Биохимия.
·.·Основные положения и резуnьтать1, выносимые на защиту:
.;
..:. ·nринципы систематизации и особенности струК1Урной организа ции СБС «На. основе ферментов» (СБСФ) и «липидов» (СБСn);
разработанная модель и nолученные константы гидролиза лиnа зами липидаnодобных субстратов в монослое (СБСФ 1ro уровня);
- данные по влиянию nоверхностно-активных веществ и пол~1мерно ионного окружения на каталитические свойства СБСФ уров 2ro- 4' ней (из лиnаз и триnсина) и созданные на их основе биоматер11алы;
закономерности изменения «ферментного профиля» сыворотки крови (как СБСФ уровня} собак старших возрастов в норме и nри sro хронической сердечной недостаточности;
разработанная методика и данные исследования поверхностного натяжения модельных систем и сыворотки крови здоровых лошадей (как СБС 6ro уровня) в сравнении с биохимичвским анализом крови;
данные по влиянию «экзогенной» СБС (на nримере биологически активной добавки «Nurisol») на «эндогенную» СБС (на nримере из менений жирнокислотного состава молозива и молока коров);
- закономерности изменения жирнокислотного состава молозива и молока (как СБСn уровня) у коров в течение первых недель лак 1 ro тации при сравнении здоровых и больных животных;
- данные по СБСn 2ro и 3'0 уровней (различные тиnы монослоев на основе лиnидов с включенными пептидами и белками) как моделей биомембран и nерспективных материалов для биосенсоров:
данные по монослоям мембранных фракций клеток с различным содержанием П-гликоnротеина (как СБСn 4ro уровня);
закономерности структурно-функциональных изменений для но вых мембранно-активных соединений (АФК) в модельных мембра нах (как «синтетических» СБСn 2ro- 4ro уровней) и нанакомnозитные материалы на их основе с сенсорными свойствами.
Апробация работы. Материалы диссертации доvладыв.злись с годы на 32 всероссийских и международных съездах.
1996 no конференциях, симnозиумах и семинарах по актуальным nробле мам биохимии, физико-химической биологии, nолимеров. коллои дов,· ветеринарии и зоотехнии: 2nd, 31d, 4th lntemational Symposium "Molёcular Order and Mobllity in Polymer Systems" (Russia, St. PeterSЬurg 1996;
1999, 2002);
XVI и XVII Менделеевекие съезды по www.sp-department.ru общей ~1 nрикладной химии, (С-Петербург, Казань, 2-я и 1998;
2003};
3-я Международные конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы наноте~нолоrии· (С-Петербург •. J~.~~· 2001);
7th. 81 glh;
10th Eur~pean Conferences on Thin Organized Fitrn~ h, (Potsdam, Germany 1998, Otranto, ltaly, 2001, Valladolid, Spain, 2004, Riga, Latvia, 2006);
·rnterriational Symposium "Lipid and surfactant di.s persed systems";
(Moscow, Russia, 1999);
g!h lnternational conferenc~ of Organized Molecular Films (Potsdam, Germany, 2000};
Всероссий ская конференция с международным участием «Сенсор-2000» (С. Петербурr, 2000);
3-я Национальная конференция РСНЭ (Москва, 2001);
ХХ lnternational Conference оп Photochemistry (Moscow, 2001);
3-ий СЪезд биохимическоГо общества РФ (С-Петербург, 2002);
Все российская научно-nроизводственная конференция no актуальным nроблемам ветеринарии и зартехнии (Казань, 2002);
lnternational Conference "Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and Ьiotechnology· (St. Petetsburg, Russia, 2002);
2nd, З'd lnternational Symposium "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Archi tectures" (Kazan, Russia, 2002, 2004);
XIXth IUPAC Symposium on Pho tochemistry (Budapest, Hungary,. 2002);
XVI1h, XVIIth European Confer~ ence Chemistry at lnterfaces Conference (VIadimir, Russia, 2003, Loughborough, UK, 2005);
XXVIII, ХХХ lnternational Symposium on Macrocycr:c Chemistry (Gdansk, Poland, 2003, Dresden, Germany, 2005): Всероссийская научно-техническая конференция (Мурманск, 2003): IX lntemational conference "The proЬiems of solvation and com plex formation in solution" (Piyos, Russia, 2004);
2, З и 4 Всероссий ские Каргинекие Конференции (Черноголовка, 2000;
МГУ, Москва, 2004 и 2007);
European Polymer Congress (Moscow, Russia, 2005];
Х international. seminar on inclusion compounds (Kazan, Russia, 2005): · Моск:о~ские международные ветеринарные конгрессы (Москва, Международная научно-nроизведетвенная конферен 2004-2006);
ция агробиологической nромышленности (Курск, Междуна 2006);
родная научно-nрактическая конференция болезням лошадей no (Москва, 2006);
Научно-nрактические конференции ИБХ РАН (Моск ва, 1996-.2004) и ФГОУ ВПО МГАВМиб (Москва, 2001-2006).
пv'бЛикаuии результатов исследований. По теме диссертации оnубликовано nечатных работ, из них:~3 книги, статей в жур 180 налах и 1::1аучных сборниках (из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ: статьи в российских ~ статей в международных ре 24 26.
цензируемых журналах), тезисов докладов;
а таюке патент и з.
89 положительных решения на nатенты РФ, 9 методических работ_ www.sp-department.ru -Личный вКлад автора. Автором предложены основные наnрав леi:1ИЯ исследований ~ разработаны важнейшие методики для экс nериментального nодтверЖДениЯ nf)едложенных им идей. Все клю ч"ееьlе эксперименты выполненЫ лично автором и лишь второсте nенные- асnИрантами и сотрудниками nри участии автора. Лично автором провеДена'основная работа riq обработке ·И· оформлению nолученных резуЛьтсiТов, по наnисанию всех ·научных nроектов и публикаций. В исслеДованиях, выnолненных совместно с другими лабораториями в России и за рубежом, вклад автора заключался в обсу~ении и постановке задач, в ·nроведении экспериментов са мим· автором в период его регулярных внутренних и заграничных комЭндЙровок в ЭТИ лабораториИ, в обработке и оформлении ре зультатов в виде печатных работ.· Объем и ст а иссе та ии. Материалы диссертационной работы изложены на страницах машинописного текста. В ра • боте приведено & рисунков и li_ таблиц. Диссертация со стоит из введения, обзора литературы (глава 1), результатов экспе риментов и· их обсуждения (rлавы 2, 3 и 4), выводов, сnиска литера туры и приложений·. в список л!hературь1 включено.:/!:2_ отечест венных и JJQ!f_ зарубежных ИсfО.~нiilков., ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования проведены в 1995-2006 rr. по темам НИР ФГОУ ВПО МГАВМиБ и ИБХ РАН;
по научным проектам российского фон да· фундаментальных исследований (РФФИ) N2N2 95-03-08496, 98 о 03.;
33318, 98-03-04135, 01-03-33287, 02-03-04004, 04-03- (1995~2006 г.г.);
по проекту РФФИ ориентированные фундаменталь ные,исследования 05-03-08162 (2005-2006 г.г.);
грантам 436 RUS 11 3/6861/i\11 3/697 Немецкого научно-исследовательского общества (ННИО 1998-2005);
гранту ИНТАС 2001-0267 Европейского сообще ства· (2001-2005 гг.);
по теме ИН-12.1/015/027 Минобрнауки РФ на 2005-2006 гr: 'rio ФНТЦП «Исследования и разработки по приоритет ным наnравлениям развития науки и техники» Минобрнауки РФ.
. Материалы: Работа по созданию и исследованию nолиэлектро литНых ·ком~iсов с иммобилизованными липазами (ПЭЛК);
по меЖфа3н()йrтензиометрии и ИсСледованию nоверхностного натяже ния· (ПН) белок-лИпидных систем и крови животных проводилась как в РоссИи;
так и·е Макс-Планк-Институте коллоидной химии (МПИ-КХ) www.sp-department.ru в ФРГ. Изготовлены 340 образцов ПЭЛК различных тиnов;
изучены их структурно-механические и каталитические свойства;
выданы рекомендации.nо выбору оnтимальных комnозиций ПЭЛК. В работе Pseudomonas ffuorescens ·t испольэовались лиnазы, выделенные из:
начальной активностью 36 Е/мг и 2998 Е/мг (обозначены как npen~ раты Л-1 и Л-2);
nоджелуДочной ·железы свиней· (Hog pancreas) с активностью 42 Е/мг {обозначена как Л-3);
Мисог javanicus с актив::
ностью 696 Е/мг (обозначена как Л-4), а также триnсин из nоджелу дочной железы свиней с активностью 2·104 БАЕЕ Е/мг. Исnользова ны синтетические nолиэлектролиты - 3 образца nоЛианионов: nо листиролсульфонат натрия (ПСС} с ММ = 6,6'10 ;
1,83·105 или 1,0·10 г/моль;
2 образца поликатионов: nолидиаллилдиметиламмо" = ний хлорид {ПАМА) с ММ 2,4·105 г/моль или саnолимер ПАМА/акриламида с ММ = 1,44-10 г/моль и содержанием ПАМА звеньев в 47 мол. % (СОП-47}.
Исследованы nроб сьrворотки крови, отобранных на Цен тральном московском иnnодроме от здоровых лошадей разного nола и возраста. Исследованы nроб сыворотки крови, взятых на базе ветеринарной клиники «Центр» от 37 собак (nудели-кобели), которых разделили на груnnы: 1) здоровые животные {15), 2} собаки страдающие хронической сердечной недостаточностью. Соба (22}, ки всех групп были разделены на три nодгруnnы в зависимости от возраста: лет, лет, лет. Все животные подбирались по 6-7 8-9 10- nринциnу аналогов. Кровь у всех животных брали в утренние часы натощак и получали сыворотку стандартным центрифугированием.
Работы изучению особенностей жирнокислотного состава мсr no лозива и молока в nервые недели лактации у коров черно-nестрой породы в норме и nри nатологии, а также nри добавлении в рацион NuгisoJ», выполнены совместно с ГУ НИИПХ (г. Москва), МУП ГПЗ «Петровское» (Московская область), Аграрным университетом Хо энхайм (ФРГ): Всего исследовано nроб молозива и молока - 647, в каждой из которых определено по 71""' жирной кислоте. Пробы от бирались у коров, подобранных в груnnы по nринциnу аналогов: в 1~й серии оnытов -10 коров, во 2"" -19 коров. во зей- 16 коров.
Эксnерименты по моДелированию мембран nроводились ·как в ФГОУ ВПО МГАВМиБ, так и в ИБХ РАН, ЦФ РАН и в Макс-Планк Институте биофизической химии (г. ГетТинген,'ФРГ) с получением и исследованием 620 образцов 20 тиnов модельных мембранных сис тем и480 образцов 40 тиnов комnозитных материалов.
www.sp-department.ru Методы.·относйтельную активность триnсина в nолиэлеt7ролит ных комплеlс~х оnределяли в % к активности контрольного раствора трипсина (в нормальных условиях), которую измеряли сnеКтР,?~~6ме!fИчески по субстрату {1 мМ раствор БАЕЕ) nри н.м е;
,~о м1V1 TifЗ~HCI буфере с рН 7,5. Относительную активность липазы е ПЭЛК определяли в % к активности раствора данной липаЗы (в н. ·у.), которую измеряЛи методом потенциометрического (0,1 М раствор триацетина) в смеси 0,05 М титрования субстрата и 0,05 М NaCI nри рН 7,0. Данные обработаны с помощью CaCI nрограммы «Stat Talk». Измерения светорассеяния ПЭЛК проводили в МПИ-КГ (ФРГ) на nриборе «Sofica» (Франция};
центрифугирование П~ДК. на. «Optima L 70» {С.ША). Измерение динамического J., •• \..IJ...........·"''...
поверхностного ··на-rяжения белок-липидных систем и сыворотки кРви лошадей nроводилось с помощью приборов «ВРА-1Р» и «РАТ» (ФРГ) методами падающей капли и максимального давления е пуЗырьке. Биохимический анализ крови животных проводился на nриборах КФК-2-УХЛ (РФ) и «Helios» (ФРГ) с использованием биохимических наборов фирм и «диаком». Исследования «Human» активности АЛТ, АСТ, ГГТ, ЛДГ и КК в крови собак проводили фотометрическим методом;
изоферментный спектр ЛДГ и КК определяли методом электрофореза в ПМГ. Оnределение жирнокиСЛотного состава молозива и молока производили по их метиловьlм эфирам методом газажидкостной хроматографии на хромэтографах «Varian Star 3400 СХ» и «Varian 3900» (США) по 1 ~:.. t,.tl :
методике ГУ НИИПХ. Для исследования биологических и.. i..
~.
модельных мембран (моно-. би- и мультислоев, тонких пленок) использоваЛИсь методы: рефлектометрия и микроскопия Брустеровскоrо рассеивания {БАР и БАМ) на установках «BAR и --SAM-1» · (ФРГ), спектроскопия резонансного NFT» комб~наЦИонн6rо рассеяния (РКР) и гигантского комбинационного рассёяниЯ ·(ГКР) на установках «РНО douЬie Raman Spectrometer» {Франция), сканирующая туннельная микроскопия (СТМ) и микроскоnия атомнЫх сил (АСМ) на установках.и «Nanoscope 3» «Nanoscope 4» (ФРГ) и «СММ-2000» (РФ) в сочетании с методами · изотерм поверхностного давления и nотенциала на изучения установКах «Lau~a 2FW» (ФРГ) и «NFT-NIMA» (ФРГ-Англия).
сnектров флуоресценцИ\11 на сnектрофлуориметре «Shimadzu RF 5001 » {Япония) · и ·спектров nоглощения на сnектрафотометрах «Beckman» (CWA),«Hitachi 330» (Яnония). Только сочетание этих www.sp-department.ru современных методов позволяет получить адекватную структурно функциональную информацию о таких сложных СБС.
Статистическую обработку данных nроводили с помощью nакета nрограмм для Оnределены критические значения Windows.
критерия достоверности на основе расnределения Стъюдента с учетом nринятых для· научных эксnериментов величин уровня значимости 0,05 (*);
0,01 (**);
0,001 (***).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..
Структурная организация и свойства суnрамолекулярных 3.1.
ферментных систем и биоматериалы на их основе Ферментативный гидролиз липидоnодобных субстратов в моно ~лоях n.QД действием rипаз является nримером функционирования простейшей структурной организации суnрамолекулярной био no химичесtой системы (ферментной СБСФ 1' уровня). В работах Ver и сотр. изучался гидролиз в моно ger R., de Haas G.H. (1973-1990) слоях nод действием лиnаз, но только традиционных липидов и ки нетические nараметры оnределены в «двумерных» величинах, не nриемлимых для сравнительного анализа. Нами nредложена мо дель межфазного ферментативного гидролиза новых липидаnодоб ных субстратов (Вал-ПГ, Лей-ПГ, Фен-ПГ) в монослое липазой (Л-1).
----------,.-- --·· ------··-..
Рис. Строение новых лv.nидопо Рис. Модель ферментативного гидро 1. 2.
, лиза лиnидаnодобных субстратов в мо добных субстратов: производных ' глицерина, жирных кислот и амино нослое, где 1- объем субстрата в моно l -~о!JВал-ПГ, Лей-ПГ, Фен-П Вnервые покаэанС\, что Вал-ПГ, Лей-ПГ, Фен-ПГ (рис. "j) способ ны образовывать монослои на границе раздела фаз (р'и.с:· ~У с Дав www.sp-department.ru лениями их коллаnса (33-34 мН/м) и nлощадями на молекулу (0,85, 0,76 и 0,68 нм2}, указывающими на достаточно nрочную и nлотную уnаковку молекул в монослое. Для оnисания кинетики фермента тивного гидролиза nредложена· модель: субстрат (S) находится в монослое на nоверхности водной фазы (обЪем моносnоя фер 1);
мент (Е) расnределен между водной фазой (объемом и моносло V) ем субстрата;
nричем молекула.Фермента. контактирующая с моно слоем. немедленно образует фермент-субстратный комnлекс (рис.2). По нашей модели на основании уравнений материального баланса для фермента, субстрата и условия стационарности nолучим уравнение скорости реакции в виде ([ES}=const.) (v0 ) (1 ).
где [Е] 0 концентрация [ES)= k..... [E).[S)u v =k (1) k +k о --=-\..
.....
фермента;
кон (S]o 2!'. +[Е),,+ [S)0 j~ центрация субстрата.
В выбранных нами условиях [Е] 0 варьируется от 0,75·10- до 3.40-10' М, а отношение IN составляет 1,4-1,8·10', т.е. вкладом 10 [Е]о в знаменателе уравнения следует nренебречь. Однако даже (1) в таком случае из (1) можно nолучить только отношения констант.
Для оnределения отдельно каталитической константы (kкат) разра ботан новый эксnериментально.теоретический nодход (описанный в диссертации), уnрощающий уравнение (1) до (2):
v (2) Для оnределе =k_"[E}o(l- k) ''о 1 ния Км(каж) nри. ;
.
.._. "~:
' равняем nравые части уравнений (3) и и nолучим 1 уравнение (3):
Эффективные константы гидролиза лиnазой в монослое лиnофиль ных субстратов (Вал-ПГ. Лей-ПГ и Фен-ПГ) составляют k.ат (13,0;
7, o-s и 11,0 с' );
КМ{каж) (2,0;
1,9 и 1,7* М). Полученные значения kкат свидетельствуют о более высоких скоростях прев.Rащения этих суб стратов по сравнению с трилаури_ном (kосат 4,0 с·). Таким образом, супрамолекулярная организация субстрата в монослое nозволяет создаватЬ высокоЭффективные ферментные СБСФ 1ro уровня.
ВзаимодейсТвие лиnазы с поверхностно-активными веществами на гоаниuе раздела Фаз и его влияние на каталитические проuессы следует р~ссматривать как структурно-функциональное исследова..... www.sp-department.ru ние СБСФ 2' уровня организации. Предложен новый метод иммо билизации липазы из P.fluoгescens (Л~1) путем ее включения в ряд поверхностно-активных веществ (ПАВ), содержащих алифатические радикалы от -C1 2H2s до -С 1 еНз7· Найдены оптимальные соотношения компонентов, обеспечивающие высtжую эффективность включения фермента в ПАВ (СБСФ уровня) и увеличение активности иммо 2ro билизованной лиnазы до раз относительно исходного фермен~ 12, та. Найдена корреляция между активацией фермента в СБСФ и па раметрами смешанных монослоев липазы с ПАВ. Получение высо коактивных СБСФ 2' уровня на основе липазы требует наличия «Жидко-растянутого» состояния монослоя ПАВ и расширения ero nри адсорбции фермента. Данные результаты делают перспектив ным использование таких бионаноматериалов для nолучения важ ных оnтических изомеров биологически-активных со.единений.
.Qвухкомпонентные комnлексы из nолиэлектролита с иммобили зованными липазами из различных источников пример фермент ных СБСФ 3' уровня, в которых фермент взаимодействует с одним заряженным полимером. При эквимолярных количествах nолианио на (ПСС) активность Л-2 увеличивается на а Л-4 на 26%, - 52% (табл. что связано с активацией этих лиnаз на границе раздела 1), фаз, сформированной полимерными клубками псе. При избытке пес активность Л-2 и Л-3 меняется незначительно (табл. 1).
Табnица Оntосительная активность (А, липаз из поджелудочной железы %) 1.
свиt~ь~о~ (Л-3), Mucor javaпicus (Л-4) и Pseudomonas fluorescens (Л-2) в комплексах с ПАМА и ПСС n~и соотношениях nо.n111мер:лиnээа от 11 до 100 ~ д nри о/о д nри 100:1, о/о д nри 10:1, 1:1,% тав коммексов 90±7* -'--- ЛиnазаЛ·2 102±7* 95±2** l:.~-~-· ЛиnазаЛ-3 44±4* 94±7* д 73±8* 108:t7* 116±8* ЛиnазаЛ-4 96±5* Лиnаза Л-2 111±7* 94±6* 126±2** l_ :~~ Лиnаза Л-3 115±9* 117±9* 23± - ЛиnазаЛ-4 63:1:7* 108±5* 152±7* - В присутствии ПАМА активность Л-1 изменяется незначительно, а активность Л-3 существенно снижается. Такое уменьшение актив ности липазы (заряженной отрицательно при нейтральных рН) в nрисутствии nоликатиона (ПАМА) можно объяснить их сильным электростатическим взаимодействием, приводящим к конформаци онным изменениям бе.nка. Таким образом, а~ивность лиnазы суще ственно зависит как от природы ·и.~ар~а nолимера, так и от его www.sp-department.ru концентрации относительно фермента. В присутствии солей (типа КН 2 РО 4 ) активность Л-3 в комплексе с.одним nолиэлектролитом (ПСС или [JАМА). увеличивается nри молярных соотношениях nо лимер:лиnаэа=10:1 (142% или 127%), но мало изменяется - nри 100:1 (100% или 104%) и 1:1 (98% или 102%). Такой «солевой» эф фект nри ·действии Л-3 на триацетИн в nрисУтствии nолиэлектроли тов свидете:Пьствует о возможности уnравления активностью фер мента путем изменения его nолимерно-ионного окружения. Этот вывод подтверtЩается данными изучения этих комnлексов при ВЫ·· соких 1емnературах. поскольку nри 80°С активность комплекса ли паза:ПАМА увеличивается в 4,5 раза, а при 60°С активность ком nлекса· липаза:ПСС увеличивается в 7,6 раза по сравнению с кон· тролем при 25°С. Это свидетельствует о создании новых эффек тивных ~талитических биоматериалов с заданными свойствами.
Трехкомnонентные комплексы из двух полиэлектролитов и Фер:
мента - уникальный пример СБСФ 4' уровня для моделирования гидролитических nроцессов в желудочно-кишечном тракте живот ных. В ряде работ [Кабанов В.А., Зезин А.Б. и др., 1987;
Даутцен берr Х. и др., 1994;
Штильмэн М.И., 2006 и другие] были детально изучены механизмы электростатического взаимодействия между синтетическими nолиионами, ПАВ и ферментами. Однако nолуче ние и изучение комnлексов лиnаз с двумя nолиэлектролитами (ПЭЛК) до начала наших работ не проводилось. Активность лиnазы Л-2 в ПЭЛК была наивысшей nри рН 9,0 (66%), что согласуется с рН-оптимумом липазы (рН а при рН 3,0 или 10,0 - значи 8,0-9,0), тельно уменьшается. Соотношение полимеры:липаза=100:1 дае наилучшие результаты как по активности Л-2 в ПЭЛК, так и по структурным nараметрам самого комnлекса (по сравнению с соот ношениями и По-видимому, nри увеличении концентрации 10:1 1:1).
липазы в ПЭЛК nроисходит конкуренция меtЩу белком и полиме ром, в результате которой белок вытесняется из комплекса. Эти же эффекты характерны для других лиnаз (табл. 2).
Таблица 2. Активность: общая (до}. в суnернатанте (Ас}. эффективная в ПЭЛК (АЭФ} лиnазы (в % от исходной} из nоджелудочной железы сsиньи (Л-3) в трех комnонентных комnлексах с ПСС и ПАМА (N2 ПЭЛК) при соотношении нее nоли меры: лиnаза= 100:1 (М/М): 11 - ПСС с ММ=1.0·10 г/моль:.. - только раствор Л- приготовлен в 10 мМ Na~HPO.;
- все растворы сделаны в 1О мМ Na 2HPO.
-., 4... 5....
3... 6 N2 пэлк 1 2 1,о•.
ПЭ1:ПЭ2 0,6 · 0, 0,3 0,6 0,3 0,3 0, _ptf 9, 9, 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 11, 1str 14:t2* 72:t4.. 72:t4"" 180:t6• 180:t6• 177±6* 38±3* Д.,% д.,% 135:t:6• 140:1:6* 116±5" 14:t2• 1,0±0,5 6±1" 9±1" 4:1:1" 14±2" 8:t2" 63:t4•• 68:t4*" д,ф,% 45±6" 40±6" 61±6* 24±3* www.sp-department.ru Комnлексы, в которых лиnаза nриготовпена в фосфатном буфе ре, а растворы ПЭ - в воде, nроявляют вЫсокУЮ обЩуЮ и эффек тивную активность (ПЭЛК 3 и 4). Наивысшую актИвность Л-3 в сис теме (дисnерсии и суnернатанте) наблl()дали nри· образовании ПЭЛК и где все растворы были nриготовлены в 10 мМ Na2 HP04, 5 6, но эффективная активность сохраняется в ПЭЛК только на уровне 45-40%. Несмотря на высокую эффективную активность Л-3 в слу чае ПЭЛК 7, коэффициент мольнаго соотношения ПАМА:ПСС=1: нриводv.т к агрегации частиц и нестабильности комnлексов. При ::ном соотношение полимеры:лиnаэа=100:1 яеляется.IU1ючееым для nриготовпения ПЭЛК с высокой активностью. Таким образом, ПЭЛК и являются наиболее nерспективными для nолучения каталити 3 ческих биоматериалов с заданной структурой и свойствами.
Таблица 3. 1\ктивность триnсина: общая (Ао). в суnернатанте (Ас). эффективная е ПЭЛК (А~~) в комnлексах nолимеры-фермент различного состава: обрээцы nоли(стиролсульфонатаJ следующих молекулярных масс: 66000 (ПСС), (ПССr) и 1000000 (ПССt) или его саnолимера (СОП47}, nолимеры (ПЭ) рН Комnлекс ПЭ: триn- д,;
, А,Ф, N2, д., 1 о/о 1- Полимеры син, М/М % % f_1, ПСС-ПАМА 1()j;
1* 3,0 42±2* 5:1 52±2* ПСС-ПАМА 2, 12±1* 62±3* 3,0 10:1 74±3* ПСС-ПдМА 3, 74±3* 3,0 20:1 8:t1* 82±3* ПСС-ПАМА 23t1• 4, 49±2* 7,5 10:1 72±2* 5,ПАМА-ПСС 10t1• 10:1 St1* 11,0 15t1* !- 6, ПССЕ·ПАМА 10:1 7:1:1* 82:1:3* 3,0 89t3* ~-7, ПССн-ПдМА 3,0 10:1 93±3* 9±1* 84:!:3* i- 8, ПСС-СОП47 · 41±2.
10:1 28±2* 3,0 13±1* : э. ncct.con47 10:1 68±3· 10±1* 58±3* 3, ~ 10. nёё:-ёоn47 16±2* 7,5 10:1 53±2* 37:t1* Разработанные nодходы и методы были исnользованы для по лучения СБСФ 4' уровнА с другими ферментами. Так. получены комnлексы nолимеры-триnсин с сохранением более активности 80% триnсина (табл. З). Оnределены оnтимальные условия смешивания комnонентов nри соотношении триnсин:(ПСС-ПАМА)=1:10 (рН 3,0).
причем ПСС с ММ=106 • Полученные СБС... nерсnективны для моде лирования гидролитических nроцессов как in vitro, так и in vivo.
.
.,_·\ ·~:·.
www.sp-department.ru Суnрамолекулярные системы на основе белков и лиnидов 3.2.
в исследовании биолоrи'fеских жидкостей животнь•х и совершенствовании биохими'fеских методов анализа «Ферментный nроФиль» крови собак следует рассматривать как один из Примеров _СБСФ sro уровня, nосколькУ nри характеристике физИо.riоiО-бй~SС\..!мического статуса животных и многих заболевани ях треб}t$тсЯ ·ис:Сл~Дование совокуnности основных· ферментов в крови ·животi-i't::.х.. которые составляют характерный набор («фер J: Зависящий 6т нормальноГо состояния или nа ментный nрофИЛь» тологических измененИй орrанов ~.,.Ткане·~. к6нкр_етного животного.
Кроме того, у животных об'Нар}'Жено 5 изоформ'ЛДГ из изоформы кк (исnользуемые в клиниЧеской диагностике). которые усЛожняют характерный «ферментный nрофилы крови животных, что является доnолнительным nодтверждение;
-.А nравильиости его рассмотрения как СБС высокого уровня организации. Для оnытов (с nомощью сотр. ветклиники «Центр») взяты nуделя (кобели), страдающие хронической сердечной недостаточностью различной этиологии, для контроля- здоровых nуделей. Всех собак раздел"'ли на З 15 nодгруnпы по возрасту и изучали «ферментный nрофиль» крови по активности ферментов АСТ, АЛТ, ГГТ, ЛДГ и КК (табл. 4).
Таблица 4. Активность (А, Е/л} аланинаминотрансфераэы (АЛТ) аслартатамино трансфераэы (АСТ);
у-глутамилтрансфераэы (ГГТ) лактатдегидрогенаэы (ЛДГ) и атинкмнаэы'(КК) в кровм собак лет): здоровые (конт.);
больные (ХСН) (6- к А (Ein), 10-11 nет n n n А (Ein), 8-9 лет ' А (Ein), 6-7 nет 26,6±1,7* (АЛТ) 16,2±1,7** (АЛТ) 34;
6±1,9 (АЛТ) Конт~ 32,4±1,1 (АСТ) 24,5±1,4** (АСТ) 16,1±1,2** (АСТ) роль 5 4,7±0,2 (ГГТ) 4,1±0,3* (ГГТ) 3,5±0,2** (ГГТ}.120±9 (ЛДГ) 113±8 (ЛДГ) 116±12 (ЛДГ) i 61±5JКК~ 55±5 (КК)_ 52±5 (KJ)_ с...
!
54!;
2....,. (АЛТ) 52!;
2*** (АЛТ) (АЛТ) 53,7±1,8** 63,t3*** (АСТ) 62!2*** (АСТ) 60!2**~ (~СТ) !
12,6!0,4*** (ГГТ) 12,6!;
0,9*** (ГГТ) 11,7!;
0,7,..* (ГГТ) хсн 9 837!76*** (ЛДГ) 965!65*** (ЛДГ) 1009!;
79... (ЛДГ) ' i 226+19*** (КК) 213+17- (КК) 204!14"* (КК) У здоровых собак (контрольная групnа) отмечено снижение ак тивности, ряда ферментов в крови с возрастом: у собак лет 10- активность АЛТ была ниже на 53%, активность АСТ - на 50%, ак тивность ГГТ- на по сравнению с nодгруnпой собак лет, 26%, 6- тогда как активность ЛДГ и КК изменялась мало (табл. У собак с 4).
ХСН выявлено достоверное nовышение активности всех изученных www.sp-department.ru ферментов, причем наиболее значительно это проявляется для ЛДГ (В -8 раз) И КК (В -4 раза) у собак всех возраСТНЫХ групп.
Для более ·nолного анализа· состоЯния «ферментных• •СБС кро ви, стеnени влияния на них возраста и nроявления ХСН, определе ны не только общая активность ЛДГ и КК крови собак, но и их «изо ферментный сnектр» (табл. Наибольшая активность среди всех 5).
изоферментых форм ЛДГ у здоровых собак присуща фракции ЛДГ4 :
для лет- Е/л;
лет- Е/л;
лет- Е/л, 6-7 45±3 8-9 42±2 10-11 44± причем у всех собак отсутствуют достоверные отличия с возрастом для всех изоферментых форм ЛДГ. У собак всех возрастов с ХСН отмечали значительное достоверное увеличение активности фрак ций ЛДГ: ЛДГ 1 в -15 раз, ЛДГ2 - в -14 раз, ЛДГ3 - в -2 раза, ЛДГ4 - в раза. Активность КК при ХСН увеличивается в основном за счет 1, фракций КК-МВ и КК-ММ (табл. 5).
Таблица 5. Акrивность (А, Е/л) креатинкиназы (КК) по фракциям (ВВ, МВ, ММ) в крови собак (6-11 лет): здоровые (контроль) и больные (ХСН) А (Е/л), А (Еiл), N А (Е/л), n n 10-11 лет 6-7 лет 8-9лет Конт- 15,1±1,6 (ВВ) 16,8±1,4 (ВВ) 15,6±1,2 (ВВ) 10,3±0,9 (МВ) 12,1±1,2 (МВ) 11,9±1,1 (МВ) роль 5 22,1±2 (ММ) 25 3±2 (ММ) 23,5±2 (ММ) 15±2 (ВВ) 16±2 (ВВ) 17±2 (ВВ) хсн 69±7*** (МВ) 67±3*** (МВ) 81±6*** (МВ) 7 9 123±9*** (ММ) 111±9*** (ММ) 120±11 *** (ММ) --- Таким образом, у больных собак в крови отмечено значительное увеличение активности всех исследуемых ферментов и оnределен ных изоферментов (табл. 4 и 5, СБСФ 5го уровня) no сравнению с контролем для собак всех возрастов.
МежФазная тензиометрия в исследовании поверхностного натя жения крови животных и модельных систем предполагает изучение интегральных характеристик «Сверхсложных эндогенных)) СБС 6го уровня. Это особенно важно сейчас, учитывая приоритетное значЕ~ ние разработки новых (более эффективных) и совершенствование имеющихся биохимических методов и средств для ранней диагно стики и контроля лечения заболеваний жи~отных. Совместные ра боты nроф. Р. Миллера и др. (ФРГ) и nроф. В.Б.Файнермана и др.
(Украина) по изучению nоверхностного натяжения (ПН) [1996-2006] биологических жидкостей у людей позволили установить общую зависимость между изменением ПН и nатологическими nроцессами 19...
www.sp-department.ru в организме (в том числе- изменениями в белковом, углеводном.
жировом, минеральном обменах). Однако для животных, работ та кого уровня (до наших исследований в ФГОУ ВПО МГАВМиБ) в ми ре не 'nровоДилось. Вnервые nроведены исследования nоверхност ного' ·натяжения (ПН) крови здоровых лошадей Центрального мос ковско'Го иnnодрома. Поскольку nолученные кривые (тензиограммы) имеЮт..ёЛожНую форму, то выделяли значения пн за о.о1 сек.
(ПН1), 1 сек. (ПН2) и 100 сек. (ПНЗ) существования nоверхности.
а также проводили экстраnоляции начального (ЭН) и конечного (ЭК) участков, что nозволяет количественно сравнивать кривые лю бой сложности. Значения мН/м (ПН1) и мН/м 75,0-75,1 72,4-73, (ПН2) могут служить общими критериями нормы для всех лошадей, тогда как заметные отличия в ПНЗ связаны с полом у молодых жи вотных (табл. Значения ЭН и ЭК для кобыл более низкие по 6).
сравнению с жеребцами одного возраста (табл. Эти эффекты 6).
объясняются различиями в содержании ряда белков и лиnидов в крови лошадей в зависимости от nола и возраста. Полученные дан ные биохимического анализа крови в целом соответствуют физио· логическим нормам для лошадей данного возраста и пола. При сравнительном анализе выявлены сильные и средние корреляци онные связи у показателей тензиометрии с уровнем общего белка.
альбумина, триглицеридов, глюкозы, кальция, калия, натрия. Это связано с наличием в крови животных БАС и ПАВ. образующих ад сорбционные слои, ПН которых зависит от конкретного биохимиче ского состава жидкости.
Таблица 6. Значения nоверхностного натяжения (ПН1, ПН2 и ПНЗ) и данные экстраполяции тенэиоrрамм (ЭН и ЭК) для лошадей разного nола и возраста Параметры Жеребцы Кобьtnы Жеребць1 Кобылы 2-3 лет 2-3 лет 4·6 лет 4-6 лет j 15 5 -'-· 13 n ПН1, мН/м 75,1±1,1** 75,0±1,0** 75,0±0,9** 75,0±1,0**..
ПН2, мН/м 72,7±1,1** 72,4±1,0** 72,5±1,0** 73,5±1,1** ПНЗ, мН/м 65,0±1,2.. 69,2±1,2** 62,2:!:1,2** 62,5±1,2** ·:
~-~э,.,.н-=--=.~ (•м.:..н.еt""м:..,:•).-rс_:,·".,.,...'+-~6.""О:t~1,""'4••---~--=4-"-,s'=":t~1C-.!,1.:•..,...-+-·.:,:s::.c,o=:t:o.:12.:s=---··----+-...:-з~3±1,4•• ' :
:.., ЭК, (мН/м)· с"~ {о,-1~;
9,0:!:1,5** 4,5:1:1,3** 11,3:1:1,3...
.для обобщения результатов, nолученных nри ~зучении крови жи~Jр;
ГНьrх, вnервые изучено ПН водных диспер~ий белков (БСА, лиnаЗ), ·тригЛицеридов и фоефатидилхолина (ФХ), их комnлексов в раЗЛичных концентрациях и условиях среды, моделирующих nлаз ::·-,. -. - '. www.sp-department.ru му крови животных. При добавлении БСА и к дисnерсии ФХ NaCI наблюдаются значения ПН1 дисnерсий в среднем мН/м, ПН 71- мН/м, ПНЗ мН/м в зависимости от состава (табл.
- 64-66 - 55-58 7), что существенно отличается от ПН для исходных комnонентов.
Таблица 7. Поверхностное натяжение (ПН1, ПН2, ПН3) воднЫх дисnерс19й леци т~на {Л) с белком_(БСА}_в nрисутствии conи_{NaCI) и_~анные экстj)аnоляuии (ЭН) rиnид+Белок+Соnь ПН1 ПН2 пнз эн (мН/м)·t с" мМ+r/л+ мМ мНfм мнtм м Н/м :1Л+бОБСА+140NаСI 7~0.2** 57,0±0,4..
71,1:to,s- 65,3±0,4** 2Jf+60БCM140NaCI 57,2±0,4- 10,7:1:0,3** 73,4±0,5"* 66,1:t0,4** 'ЗЛ+60БСА •140NaCI 65~5:t0,4** 11,3:t0,3** 73,7±0,5** 58,1±0,4** -4Л+6оБСА+-140NаСI 65,1±04- 58,3±0,4** •. 10,3±0,3** 73,4±0,5** 4Л+406CA+140NaCI 9,5±0,3** 72,0±0,5** 65,3±04** 58,4±0,4** '4ii+зббёд +140NaCI 74,3±0,5- 65,4±0,4** 58,0 ±0,4** 9,9±0,3** 4h+4оБёд+120NаСI 8,2±0,3** - 55,4±0,4 71,.4±0,5** 64,6:t0,4** i4Л+40БCA+130NaCI 54,5±0,4 72,7±0,5** 6,2±0,3** 66,4±0,4**,_ i~Л+40Б~A+150NaCI 8,9±0,3** 70,5±0,5"* 63,9±0,4** 57,8±0,4** В целом, значения ПН1 и ПН2 определяются солевым и лиnид ным составом сыворотки крови, а значения ПНЗ nостеnенной ад сорбцией белков из объёма на границу раздела фаз. Из получен ных данных следует nерсnективность nростого и удобного экспресс метода измерения поверхностного натяжения крови животных.
Влияние биологически активных добавок на биохимические по казатели_ биологических жидкостей, что можно рассматривать как влияние ((экзогенных» СБС на основные nараметры «эндоrенных» СБС (крови, молока и т.д.). Одним из новых и важных примеров этому является nроведенное nод руководством автора исследова ние влияния биологически активной добавки на жирнокис «Nurisol» лотный состав молозива и молока коров. В оnытном хозяйстве Аг рарного университета Хоэнхайм (ФРГ) были сформированы 2 груn пы коров:1) nолучавших в рационе «Nurisol» ("эксперимент) 2) стандартного кормления (контроль) - подробности в диссертации.
Обнаружено, что массовая доля С18:0 увеличивается в молози ве #эксn. груnпы коров (относительно контрольной), однако к 21" суткам ее содержание становится практически одинаковым в обеих группах. Это наблюдается и для С4:0, С20:0, тогда как для CS:O, С12:0, С14:0, С16:0 характерно небольшое уменьшение содержа ния к 21" суткам у коров обеих груnп-. Показательным для мононе насыщенных ЖК (табл 8) являются изменения С18:1: несмотря на ее большое содержание в nодкормке (37,9%), в молозиве ее содер жание снижено (17,9%) по сравнению с контролем (21,8%). · www.sp-department.ru Таблица 8. Содержание ряда ·моно-· и nолиненасыщенных жирных кислот.(%) в молозиве и молоке коров, получавwих cNцrisol» (эксперимент) к контролю.
...
С16:1~·,.. 'С18:1 С18:2 С18: Cyr Конт. 'эксП.
'Эксn. 'эксn.
Конт. 'Эксn.
и Конт. Конт.
1"утро, 0, 2,25 1,86 21,8 17,9 2,61 3,41 0, ~ :1:0, :1:0,11. :1:0,09"* :t0;
7*" :1:0,17*" ±0, ±0,7 ±0, ~. 2,13 1,73 19,0 0, 2,42 3,11 0,..
% :1:0,11 :t0,6** :1:0 16** :1:0,04* ±0,09** :1:0,6 :1:0,12 ·:1:0, 2,11· 1,70 22,6 21,0 2,63 0,52 0, 3, 3..
Уо :1:0,11 ±0,09** :1:0,7** :1:0,15** :1:0,04* :1:0,13 :1:0, ±0, 6", 2,31' 2,01 1,56 24,0 21,2 0,59 0, 2, Уо :1:0,10 :1:0,08** ±0,6** :1:0,14** ±0,7 :1:0,11 :1:0,04 ±0,04* ~2·, 2,08 1,59 26,7 24,2 2,24 0, 2,77 0, ~ :1:0,10 :1:0,08** ±0,7** :1:0,04* :1:0,8 :1:0,11 ±0,14** ±0, 21", 2,40 1,95 28,1 2,14 2,96 0,51 0, 25, у., ±0,12 ±0,10** ±0,13** ±0,04* ±0,8 ±0,8** :1:0,11 ±0, В молозиве nервого удоя у коров (•эксn.) обнаружен высокий уровень С18:2 (3,41%), который енижался (до 2,96%) к 21м суткам, но оставался выше ее уровня в молоке контрольной груnnы. Эта тенденция характерна для всех полиненасыщенных ЖК, nри неко торых количественных отличиях (табл. Поскольку недостаток 8).
nолиненасыщенных ЖК в организме приводит к негативным nо следствиям у телят, то необходимо поддерживать организм матери и новоро~Щенноrо соответствующим рациональным кормлением, что решается добавкой к рациону (он является nоставщи «Nurisol» ком кalf комnлекса ЖК, так и метаболитов для их биосинтеза в орга низме лактирующих'животных). Таким образом, npenapaт «Nurisol» служит· ярким примерам nоложительного · влиs:~нИя «Экзогенных» СБС на биохимические nараметры «Эндогенных» СБС, что приво д~1т·к улучшению всех·основных nоказатеitей жИвотных.
СравнитеЛьное исследование жирнокислотного состава молози ва·:и· молока коров в nервые недели лактации (как «липИдной» СБСл 1ropYPOBf:I.Я) исключительно важно для nонимания биохимических ме~анИЗм9в;
с~~теза э-.:их сложнЫх nриродных СБС. Изучение жир ных кИ(;
Ро;
(QКi).~оло~~Ва~tоров в первый день лактации у здоро выхжиВ;
О:rны~.свид.етельствуе:r о высоком содержании насыщенных ЖК С-16:0С.14:9С18:0С12:0С8:0:С4:0С20:0 (табл. 9).
www.sp-department.ru Таблица 9. Содержание ряда «КЛючевых.- жирных кисЛот'(%) в'молоэмве и мо локе JАоровых (конт. rp~nna) и больных ро~ ильным nарезом (nареэ) коров С14: Сут- С16:0.. С18:0 С18: ' i КМ Конт. Пареэ Па рез Конт. Конт. Па рез ·КоНТ. Па рез 1", 9,8 16,3' • 11, 16,8 '7, 30,6 32,8 6, :t0,9.
t0,2 :t0,5** % t1,0** :t0,3 :t0,3* :t0,8.'. :t0,6** 2". 20,5... 16, 11,3 31,4.
13,4. 9, 26,5 10, :t0,3 :t0,3** % :t0,9** t0,4* t0,8** :t08 :tO 4 tOt.
. 3", 9,3 14,5 25,9 10, 26,8 14,8 24,8 19, i% :1:0,4 t0,6** :t0,8* :t0,4 :t0,6** :t0,8** :1:0,8 t0, 8, 6", 10,1 13, 25,0 25,3 13,5 27,1 23, ±0,2 t0,2* :1:1,0** % ±0,8 :t0,8 :1:05 :tO,S :1:1,. 10~. • 28, 8,9 10,2 24,2 13,3 13,1 23, 25, ±0,2 :t0,2* % :1:0, ±0,7 :1:0,5 t1,2 ±1,0** ±0,8* На 10~ сутки лактации отмечено увеличение содержания ~К С18:0 (на 72%), С4:0 (на 92%) и сниЖение С16:0 (на 21%), С14:0 (на 9%) по сравнению с 1.... сутками, однако суммарное содержание на сыщенных ЖК в молоке изменяется мало. За этот nериод содержа ние ЖК С18:1 увеличивается (на а остальных мононенасы 72%), щенных ~к- уменьшается. в молозиве первого удоя содержался достаточно высокий уровень лИноЛевой кИслоты (4,1%), который к 10"' суткам снизился до 3,7%. Поскольку уровень каждой из полине насыщенных ЖК (С18:З, С20:3, с26:.( С20:5) быii всегда менее 1%, то снижение их содержания к 10"' суткам было значительным (в 2- раза). Все эти эффекты объясняются изменениями в биохимиче ском метаболизме у коров в процессе лактации, что особенно заметно при патологических процессах, типа родильного пареза.
Массовая доля насыщенных ЖК с 1х по 1оые сутки в молоке здо ровых животных возрастает с 61,4% до 62,3%, а у больных родиль ным парезом снижается с 75,5% до 65,2%, но остается достоверно выше, чем у здоровых животных. За этот период массовая доля мононенасыщенных ~К в молоке возрастает с до у 23,8% 35,4% здоровых и с до у больных коров. Отмечено низкое 18,7% 30,1% содержание С18:1 в nробах молозива, взятого у больных коров (табл.9). Суммарная массовая доля nоЛиненасыщенных ~К в мо локе с 1' по 10.... сутки уменьшаетсЯ с 6,9°~ да,5,4% у здоровых;
с 5,3% до 4,7% у больных коров. Таким образом, общее количество ненасыщенных ЖК в молозиве и малоке бЪльных животных нИже, чем у здоровых, что может служить характеристическим показате лем Протекания патоЛогических процессов в молочной железе.
www.sp-department.ru Многофункциональные супрамолекулярные системы в 3.3.
моделировании биомембран и создании био- и наноматериалов еылеление и исследование различных тиnов лиnидов. их смесей с nеnтидами и белками в монослоях. Среди множества nримеров структурно-функционального изучения СБСn zro и зrо уровней, наи более удачным является иселедование изменений состава тилако идных лиnидов мембран М. nод воздействием света polymorpha высокой интенсивности, которое было nроведено совместно с кол легами в ФРГ. Кnючевым в этом nримере является доказательство того, что nоведение белковых комnонентов фотосистемы (ФCII) зависит от взаимодействий с этими лиnидами. На nервом этаnе усовершенствована методика выделения лиnидов из тилакоидных мембран М. и установлен их базовый лиnидный состав polymorpha (как СБС.n 2' уровня), который под действием света высокой интен сивности nретерпевает.количественные, но не качественные изме нения. Особо ценным явилось оnределение состава ненасыщенных ЖК для каждой фракции лиnидов. Выявлено nерерасnределение двойных связей в ЖК остатках липидов в результате воздействия на клетки света высокой ·интенсивности. Показано, что тилакоидные лиnиды участвуют в регуляции биохимических процессов в мембра не, nосредством изменений жирнокислотного состава их липидов.
:1 • ~ i..
о 1. р " • : ! • 1 и [;
! и 1 е ис. 4. Кривые отражения nуча от иосенсорной мембраны: А) кон ль;
В) с монослоем ФCII;
С) с онослоем ФCII nри детекции рас во в 1•10-е М динит енола Впервые изучены смешанные монослои тилакоидных липидов и белковых комплексов ФCII (рис. 3), как СБСn 3' уровня. Площадь www.sp-department.ru лиnидноrо монослоя значительно увеличивалась в nрисутствиИ не больших количеств ФCII при низких значениях давnения (рис. 3), что связано со встраиванием молекул ФCII в лиnиДнЫй монослой.
При давлениях выше 30 мН/м изотермы для. монОСЛ~в ФИ и ФИ:ФСI/=1:100 (кривые 1 и 3 на рис. 3) становятся праКТИчесКи оди:..
наковыми, что обьясняется «выдавливанием» белка иЗ ЛйnИдноrо монослоя в водную субфазу при «сверхсжатии» монослоя: Напро тив, nлощадь для монослоев ДГДГ в присутствии молекул· ФCII ос тается при 30 мН/м в -3,5 раза больше, чем для монослоя дrдг без ФCII (кривые и на рис. что свидетельствует о сохранении мо 4 2 3), лекул ФCII в монослое ДГДГ вмоть до коллаnса моно~Лоя. Наличие белка в смешанном монослое с ДГДГ при всех давлениях была nо казана методом микроэлектрофореза с додецилсульфатом натрия.
Это служит прямым свидетельством образования nрочных и сnе цифических комплексов ФCII только с ДГДГ и аналогами, как сnе цифическими лиnидами тилакоидных мембран. Вnервые получены моно- и мультислои ФCII на твердых nодложках (золото, кварц) с сохранением функциональной активности этих комnлексов и пока зана их персnективность для создания биоматериалов и биосенсо ров на биоорганические вещества (рис. Показано, что по своим 4)..
сnектральным и фотоэлектрическим свойствам такие СБСn nер сnективны как фоточувствительные мембраны биосенсорных уст ройств.
.QQ.авнительное исследование монослоев мембранных Фракций клеток с разным содержанием П-гликоnротеина важно как пример СБСл 4' уровня. Производство клетками «оnухолей» мембранного белка П-гликопротеина (ПГП) в ответ на действие токсичных.проти вооnухолевых соединений является одной из основны~ nричин nо явления фенотиnа так называемой «множественной лекарственной устойчиВОСТИ» клеток. Функция пгп по вЫводу лекарств из клетки' может быть блокирована рядом соединений-модуляторов, которые конкурируют с лекарственными соединениями за места связывания на ПГП. Главной проблемой в разработке эффективных модулято ров ПГП является недостаток информации о молекулярных меха низмах взаимодействия белка с его модуляторами и липидами. По этому, главной задачей и достижением рабQ.ты являлось nолученйе и изучение монослоев из мембранных фракций клеток с раЗЛ~чным содержанием ПГП;
изучение воздействия на структуру этих моно слоев наиболее известного модулятора ПГП - вераnамила.
www.sp-department.ru Получ~нные нами монослои мембранных фракций без ПГП. а ~JЖе. фракц!"Й с 32% содержанием ПГП (относительно остальных белков), имеЮт. наибольшее давление коллапса (рис. 5). Найден QI11JIII\II~HЫ~ состав субфазы для монослоев мембранных фрак~ цИй:.10 мМ Tris:-HCI, 'рн 6,5. Зависимость nлощади монослоя от с~ держания ПГП имеет нелинейный характер, а эта зависимость для nотенциала линейна (рис. что nозволяет оценить nлощадь на :.... 5), молекулу ПГП в монослое. Исnользуя значения Аnиnмдов=5,5 см" /м кг и nолученные нами результаты изменения площади монослоев мем бранных фракций с различным содержанием ПГП, nолучим для мо леlf}'ЛЫ ПГП в растянутом состоянии значение Anгn=39±5 см 2 /мкг.
Среднее расстояние между молекулами ПГП в монослое неизменно.и равно 30±2 нм, т.е. молекула nгп организует вокруг себя молеку лы лиnидов в виде ПГП~лиnидного домена (СБС). Плотность упа ковки молекул лиnидов в такой СБС растет в присутствии ПГП.
---------- г- г-о------.,. ~ ~ • •... \ i ·~--.~-' :·~\~·- l ' ·~\ \-····-г: ~ тt !
i \~J \::=:- о 30 '-····--- \"'-.
1.. '\:· f· ' \~:·· ·~~-:\.
J !
j-.1- ' \~··~ "··..'•;
-;
..о-/------.---,-\::.:.::::~~···&~----;
· 20 ••:.... :
\~%: о ~·....
,. 1 '..,....- tO 20 JC '. 10 nnoщ--....o...oCJ"iol!' cw?,.._, {беn•а) ----· 1:::::--::-""::-:-------~:-:----Г:::----=--:7"---------- l ис. 5. Изотермы давление (Jt) - пло Рис.6. Изотермы давление (л)- nno· адь· (А) (кривые 1-4) и потенциал щадь (А) (кривые 1-5) и потенц.. аn -.
лощадь (кривые 5-8) для монослое nлощадь (кривые 6-10) в эав.tсимости ембранных фракции нормальны от содержания вераnамила в субфаэе еток (кривые и и резистентнь~ к содержанию ПГП в моно::лое: !
1 5) (11 %) еток с nовышенным содержание О- (кривые 1 и 6);
0.2- (кривые 2 и 7): !
ГП : 11% (кривые 2 и 6), 24% (кривы 0.5- (кривые 3 и 8), 1.0- (кривые 4 и !
и 7, 32% ~ ивые 4 и 8 1 9), 100- (кривые 5 и 10)., Влияни~ верапамила на формирование· монослоев мембранных. фракций резистентных клеток, содержащих ПГП, характеризуется увелИ'f~нием площади монослоя, потенциала и Давления коллапса (рис. 6). Наибольшие измененИя· наблюдаются в сЛуЧае;
когда коли чество молекул верапсilмИЛа' в субфазе сравнимо с количеством www.sp-department.ru молекул ПГП в монослое (рис. Значения мощадей монослоев 6).
nри (скачке» nотенциала и мН/м, изменяется на-15-35%. В n=15± случае избытка вераnамила, его влияние на свойства монослоев · снижается. По-видимому, молекула ПГП содержит несколько сайтов связывания вераnамила, взаимодействие с которыми зависит от тоnологического состояния молекулы белка и влияет на' «множест венную лекарственную устойчивость» клеток.
Qу.!]2амолекvлярные системы на основе новых мембранно ~@ивных соединений. лиnидаnодобных мономеоов· ·и nолимеров ':ак nримеры «синтетических» СБСn 4-4ro уровня). Среди всех СБСn монослои амфифильных фотохромных комплексоное (АФК) слу ··~ат наилучшими моделями для исследования nроцессов самоорга,.;
изации и молекулярного узнавания на границе раздела фаз, кото ··н~;
е характерны для биомембран, а в nрактическом асnекте nер ~:nею·ивны как хемосенсорные наноматериалы. В свяЗи с этим нами ·юлучены и исследованы моносЛои новых АФК, синтезИрованных в.'1аб. nроф. С. П.' Громова (ЦФ РАН). Наличие краун-эфнрного фраг 'VIента в АФК сnособствует их селектИвному связываниЮ· с катиона ми металлов. Фотохромныв свойства АФК обусловлены возможно ~тью nревращений их молекул в ходе двух «фотореакций»: mранс цис~изомеризации двойной связи и [2+2)-циклоnрисоедИнения.
Вnервые nокаЗано, что для АФК-Iа, АФК-IЬ и АФК-Iс (рис.. 7) nло щадь (д);
nрйходЯiцаяся на молекулу в монослое, минимальна на поверхности воды и возрастает с увеличением концентрации солей э водной субфазе, что указывает на образование комnлексов АФК с катионами этих металлов. Наnример, nри давлении 20 мН/м для.-'\ФК-Iа в монослое А составляют 0,65 нм 2 и 0,78 нм2 ;
для АФК-IЬ J,55 нм 2 и 0,57 нм 2 ;
для АФК-Iс - 0,38 и 0,44 нм2 (на воде и 1 мМ KCI, соответственно). Примерно в 2 раза меньшие значения nлоща ди. занимаемой в монослое молекулой АФК-Iс, по сравнению с АФК !а и АФК-IЬ, свидетельствуют о существенном изменении организа ции монослоя мембран за счет наnравленных изменений в структу ре исходных АФК. Методом атомно-силовой микроскоnии nоказано, что структура монослоев АФК-IЬ, nеренеСЕtнных с -~~~ерхности во ды, nредставляет собой образование большого количества круnных агрегатов неnравильной формы с размерами в плоскости 2,5-3, мкм и высотой нм. В присутствии солей картина для монослоев 1, АФК-IЬ существенно изменяется: образуется сnлошная, без види :о.1ых дефектов пленка. Такая структура монослоев характерна и для www.sp-department.ru других АФК, что является nрямым свидетельством образования комnлексов АФК с катионом.
Важная информация об уnаковке АФК и их комплексообразова нии в монослоях на границе разделов фаз получена из данных аб сорбционной спектроскопии (рис. Обратимые изменения интен 8).
сивности поглощения при фотооблучении обнаружены для моно споев АФК на поверхности растворов солей (рис. что обьясняет 9), ся транс-цис-транс-изомеризацией молекул АФК в комплексах с катионами. Таким образом, комбинацией методов измерения изо терм давления, АСМ, БАМ, БАР и спектроскопии nоказано, что мо нослои АФК (nример «синтетических)} СБСn) nерспективны как хе мосенсоры на заданные катионы металлов.
~· :~~.
:·~ 1:
0.12~ (4) ~ он o.osr ··-~ 0.06~ f UOo\ J. 0. lO l.C,, 6 8 \0 ·~ 10 14 16 1& 20 Рис. Обратимые изменения интенсивности логлощения (Аце) nри л.н для 9.
дФI-IЬ в монослое от времени (мин.) облучения сsетом с ~эе и темновой релак сации (.J,- включение света, i- выключение света): а) 10 мМ раствор KCI, З мН/м 1) и 9 мН/м Ь) мМ раствор З м Н/м и 14 мН/м (2) (2);
10 NaCI (1) www.sp-department.ru При изучении монослоев АФК, содержащих два атома серы вме сто кислорода в циклоnолиэфирном кольце молекул (АФК-1/а, AФK AФK-IIc), nокаэано, что эти АФК селективны на катионы тяжелых IIb.
металлов. однако претерпевают необратимые изменения интенсив ности поглощения nри фотооблучении. что затрудняет их nримене нив как хемосенсоров. На основании исследований смешанных мо нослоев AФK-IIa, AФK-IIb, AФK-IIc с липидаподобными мономерами и nолимерами. найдены два типа смесей этих АФК, которые сnо собны к обратимому связыванию Hg2•. что делает эти пленки nрото типом наноматериалов. перспективных дnя хемосенсоров на катио ны тяжелых металлов. Разработанные выше процес::ы nозволили получить высокоселективные нанакомnозитные материалы для де текции не только катионов щелочно-земельных и тяжелых метал лов, но и биогенных диаминов.
выводы Сформулированы принципы создания и изучения суnрамоле 1.
кулярных биохимических систем (СБС) на различных уровнях структурной организации. На основании изучения «ферментных» СБСФ 1' уровня разработана модель гидролиза лиnаза~.. новых лиnидаnодобных субстратов (производных глицерина, жирных ки слот и аминокислот) в монослое и определены кинетические кон станты данного ферментативного nроцесса: k..ет от 7 до 11 с·1;
·Км(t(ЗЖ) от 1,7 до 2,Q'10.o М. Полученные значения констант свидетельству ют о высоких скоростях nревращения этих субстратов, что nодтвер ждает влияние строения субстратов и уровня их организации на границе раздела фаз на каталитические свойства СБСФ.
Установлены оптимальные соотношения компонентов, обес 2.
nечивающие высокую эффективность включения лиnаз в ряд· nо верхностно-активных веществ (ПАВ) с радикалами от -C12H2s до С1 8 Н 37 и увеличение актИвности иммобилизованной липазы до ~2, раз относительно исхоДного фермента. Показана корреляция меж ду активацией фермента в таких ПАВ и параметрами их смешанных монослоев с лиnазами. Такие СБСФ 2 уровня являются nерсnек тивными бионаноматериалами для nолучения важных биологически активных соединений заданного строения и евойств.
3. Установлены оптимальные условия nолучения. многокомпо нентных комплексов (СБСФ зrо и 4 уровней) на основе раэнозаря~ www.sp-department.ru женных nолиэлектролитов и ферментов (триnсина, лиnаз из бакте рий и поджелудочной железы свиней) с высокой ферментативной активностью, что реализуется только при заданных мольных соот ношениях между полимерами и ферментами в этих сложных ком nлеkсах и определенных условиях среды. Изучение этих СБСФ nри высоких темnературах nоказало увеличение активности иммобили зованной лиnазы в 4,5-7,5 раз nри 60-60°С no сравнению с контро лем при 25°С. Обнаруженное nовышение активности липаз после иммобилизации в nолимерное окружение является основой созда ния новых бионаноматериалов с уникальными свойствами.
· 4.· Изменения в «ферментном nрофиле nлазмы крови (СБСФ 5'" уровня) nроявляются nри старении организма и имеют важl-'ое зна чение для диагостики хронической сердечной недостаточносr~-1.
Показано, что активность асnартатаминотрансферазы, ала 4.1.
нинаминотрансферазы, v-глутамилтрансферазы, лактатдегидро геназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК) уменьшается с возрастом у здо ровых животных, тогда как у собак с сердечной недостаточностью nроисходит увеличение активности этих ферментов: особенно для ЛДГ (в раз) и КК (в раза) у собак всех возрастных групn.
-8 - Характерные изменения в «изоферментном nрофиле» nлаз 4.2.
мы крови собак nроявляются у собак всех возрастов с хронической сердечной недостаточностью. Обнаружено увеличение активности лдг фракций: лдг1 в раз, лдг2- в раз, лдrз- в раза, -15 -14 - ЛДГ4 - в раза. Активность КК nри этом увеличивается в основ 1, ном за счет фракций КК-МВ и КК-ММ у собак всех возрастов.
Разработана методика динамической тензиометрии крови жи 5.
вотных и модельных белок-лиnид-солевых систем, которая являет ся «Интегральной» характеристикой СБС 6го уровня.
Установлены как общие параметры nоверхностного натяже 5.1.
ния (ПН) сыворотки крови для всех лошадей: мН/м (ПН1) и 75,0-75, мН/м (ПН2), так и сnецифические возрастные:
72,4-73,5 62,2-62. мН/м (ПНЗ, для животных лет);
мН/м (ПНЗ. для живот 4-6 65,0-69, ных лет). Путем экстраnоляции начального (ЭН) и конечного 2- (ЭК)· участков удалось количественно охарактеризовать сложные тензИограммы для оnределенных групn лошадей: для 2-3-летних кобыл (ЭН и ЭК... 4,5 мН/м) и жеребцов (ЭН и ЭК - 6,0 и 9,0 мН/м), для 4~летних кобыл (ЭН и ЭК- 3,3 и 10,1 мН/м) и жеребцов (ЭН и ЭК -'..S;
IJ'й-.·11.,3 мН/м).' Доказана корреляциояная связь между этими nараметрами ··и· биохимическимi-t nоказателями крови лошадей www.sp-department.ru (уровнем общего белка, альбуминов, триглицеридов, глюкозы, хло ридов, кальция, натрия). Показана nерсnекТивность данного метоДа для оценки физиолого-биохимического статуса лошадей. · 5.2. Установлены значения ПН сложных водных дисnерсий бел кое: бычьего сывоточного альбумина (БСА) и лиnаз из разлИчных источников;
лиnидов: триглицеридов, фосфатидалхолина. (ФХ) в различных концентрациях и условиях среды, моделирующих nлазму крови животных. Показано, что nри включении БСА и солей в дис nерсию ФХ наблюдаются значения мН/м (ПН1), мН/м 71-74 64- (ПН2), мН/м (ПНЗ) в зависимости от состава дисперсии, что 55- существенно отличается от ПН для исходных компонент;
в. В це лом, значения ПН1 и ПН2 оnределяются солевым и липидным со ставом сыворотки крови, а значения ПНЗ nостепенной адсорбцией белкое из объ~ма на границу раздела фаз. Показана важность этих nараметров для интерnретации биохимических данных крови жи вотных.
Установлено влияние «экзогенной» СБС на «эндогенную» 6.
СБС на nримере изменения жирнокислотного состава молозива и молока при введении в рацион коров биологически активной добав ки «Nurisol», содержащей «nротективные липиды». Показательным для ненасыщенных жирных кислот (ЖК) является содержание С18: (17,9%) в молозиве nервого удоя у коров эксnериментальной груn nы;
таюке как и содержание С18:2 (3,41%), которое снижается (до 2,96%) к 21м суткам, но остается выше ее содержания в молоке кон трольной груnnы. Эта тенденция характерна для всех моно- и nоли ненасыщенных ЖК, nри отдельных количественных отличиях, что демонстрирует положительное влияние npenapaтa на со «Nurisol» держание ненасьtщенных ЖК в молозиве и молоке коров.
7. Показано биохИмиЧеское значение изменений содержания 71°" ЖК, ·в том числе ззх изомеров ЖК (nредставляющих собой «Жирнокислотный профиль» или «лиnидную» СБСn 1ro уровня) в молозиве и молоке коров в первые недели лактации в норме и nри родильно'м Гrарезе. Массовая доля насыщенных ЖК с 1х по 10ые су тки 'В МОЛОКе ЗДОрОВЫХ ЖИВОТНЫХ ВОЗрастает С 61,4% ДО 62,3%, а у больньiХ' - сниЖаеТСя с 75,5% до 65,2%;
доля мононенасыi.ценных s ЖК молоке у здорОвых коров возрастаt!т с 23,8о/о до 35,4%, у бОЛЬНЬIХ...;
_С 18,7% АО 30, 1%;
ДОЛЯ nОЛИНеНаСЫЩеННЫХ ЖК В МОЛОКе уменьшается с·6,9%.до. 5,4% у здоровых коров и с 5,3% до 4,7% у больных kоров:·..оТНосйтельное понижение дол~ моно- И nолинена- · www.sp-department.ru еьtщенных ЖК в молозиве больных животных может служить nока зателем пратекания nатологических nроцессов у коров.
Установлены особенности лиnидноrо состава («лиnидные» 8.
СБСn 2'0 уровня) тилзкоидных мембран. Показано, что изменения в жирнокислотном составе липидов являются одним из факторов эффективной адаnтации бисмембран к сложным фотохимическим nроцессам. Установлено, что монослои на основе лиnидов с вклю ченными nеnТ\о1дами и белками (СБСn 3' уровня) являются уни кальными инструментами для количественной характеристики меж молекулярных взаимодействий в биомембранах, nрежде всего молекулярного узнавания и самоорганизации на границе раздела фаз. Обнаружена возможность наnравленного изменения структур но-функциональных характеристик фоточувствительных белков в моно- и мультислоях с лиnидами. Установлено, что своим сnек no тральным свойствам такие монослойныв мембраны перспективны как фоточувствительные элементы биссенсорных устройств.
Оnределены условия nолучения стабильных монослоев мем 9.
бранных фракций (СБСn 4' уровня) клеток с различным содержа нием П-гликоnротеина (ПГП), ответственного за вывод ряда лекар ственных соединений из клеток. Обнаружено, что максимальный эффект действия вераnамила (модулятора трансnортной функции ПГП) наблюдается, когда количество молекул вераламила в субфа зе сравнимо с количеством молекул ПГП в монослое. Это доказы вает сnецифические изменения в структуре монослоев мембранных nrn.
фракций клеток с высоким содержанием Установленные зако номерности открывают nерсnективы для совершенствования био химических методов анализа биомембран и лекарственных средств.
Показано, что монослои новых мембранно-активных соеди 10.
нений амфифильных фотохромных комnлексоное (АФК) являются «синтетическими» СБСn 2' 3'0 и 4'0 уровней в зависимости от учета, оnределенных структурно-функциональных nараметров. Так, в раза меньшие значения nлощади, занимаемой в монослое молеку лой АФК-Iс, по сравнению с АФК-Iа и АФК-IЬ (как и ряд других струк турных nараметров), свидетельствуют о существенном изменении организации монослоя мембран за счет наnравленных изменений в химическом строении исходных АФК, что является оnределяющим для.·моделирования СБСn 2ro уровня. Установлена высокая селек тивность оnределенных тиnов АФК по каТ\о1онам щелочных, щелоч но-земельных или тяжелых металлов, а таюке их сnособность к www.sp-department.ru mранс-цuс-изомеризации при фотоактивации, что моделирует СБСл зrо уровня. Комбинацией современных методов впервые nоказано · взаимное влияние фоточувствительных и ионоселективных свойств АФК в монослоях, а таюке возможность наnравленного изменения характеристик АФК при встраивании в моносЛои лиnидов, лиnидо подобных мономеров и полимеров («синтетические» СБС,. 4 уров ня). Разработанные выше nроцессы nозволили получить высокосе лективные нанокомnозитные материалы, nерспективные дnя детек ции катионов щелочных, щелочно-земельных и тяжелых металлов, а также аналогов биогенных диаминов.
Сведения о практическом использовании и рекомеRдации по использованию результатов исследования.
Данные по биохимическому изучению крови собак внедрены в практику ветеринарных клиник г. Москвы. Показана nерсnективность внедрения в практику метода измерения ПН крови лошадей.
Полученные nолиэлектролит-лиnазные комnлексы nерсnективны для исnользования как каталитические биоматериалы, что nредставлено в заявках и N22006111 372, N22006111 Зайцева С.Ю. и сотр. на nолучение nатентов РФ с N nоложительным решен111ем от г. и приоритетом от 13.02. г. Полученные данные по жирнокислотному составу 14:06. молока исnользуются при разработке нормативных документов на молочную nродукцию, в которых одним из обязательных параметров исследования является 'Жирнокислотный состав (например, ГОСТ Р «Масло и паста масляная из 52253- коровьего молока. Общ~е технические условия»). Данные об изменениях жирнокислотного состава молока при включении в рацион коров «Nurisol» и разработанные методики оnределения транс-изомеров nолиненасыщенных жирных кислот nерсnективны для использования в технологии nолучения диетических nродуктов с повышенным содержанием nолиненасыщенных жирных кислот.
Разработаны методики и получены образцы высокоселективных нанакомпозитных материалов (НКМ) на основе новых биоорганиче ских соединений для детекции катионов ме.таллов: акты исnытаний от г. при сдаче темы 2005-ИН-12.11015/ N21, N22, N23 06.11. по nроекту Минобрнауки РФ гос.контракт от N202.434.11. www.sp-department.ru 09.11.2005 г. Получен nатент РФ на изобретение N!!2292368 Громо всt С.П, Зайцева С.Ю. и др. с nриоритетом от 27.12.2005 г.
~. е~зуnьта.т.Ь• диссерт~ции исnольЗуются дЛЯ nодготовки студен тов, аспир~нтрв, соискателей ФГОУ ВПО МГАВМиБ no сnециально сти ~6иохи.мия», в частности no слеДуЮЩим метоДическим работам:
·1. ФЙэикО..хммичесiие методы в биологии 1 Зайцев С.Ю., Фролова ЛА, Жир нd~ к:r и друn.е 1/ Методические указанм1'1 к учебной nраiСТИке для студентое ВбФ. -М.;
МГАВМиб мм.-К.И.- Скрябина.- 2002. - 33 с.
2. Зайцев С.Ю. Биологические мембраны 1 Зайцев С.Ю. 11 Лещия для сту дентов ВБФ.- М.: МГАВМиБ им. К. И. С~рябина -2003.- 12 с.
3 3аi4цев С.Ю. Методьi исспедования биологических мембран 1 Зайцев С.Ю 11 Лекция для студентов ВБФ.- М.: МГАВМиБ и'-1. К. И. Скрябина.- 2004 - 12с 4. Зайцев С.Ю. Биологические мембраны и модельные мембранн",е системt.;
1 Зайцев С.Ю., Царькова М. С. 11 Лекция для студентое ВБФ.- М.: МГАВМиБ им К. И. Скряб14на.- 2004.-12 с.
Еремеев· Н.Л. Энзимология. Кинетика и термодинамика ферментативны.
5.
реакций 1 Еремеев Н.Л., Зайцев С.Ю. 11 Учебно-методическое nособие (rpиrt.
УМО ВУЗов РФ). -М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И. Скрябина. - 2004. - 4аС1ъ - 26 с.;
2004. -Часть 2. - 36 с.
6. Зайцев С.Ю. Основы биоэнергетики. Дыхательная цепь и АТФ-синтаза Зайцев С.Ю., Гарбуз Д. Г.. Прыгунова Е.В. 11 Учебное пособие (гриф МСХ РФ). М.: МГАВМиб им. К.И.Скрябина.- 2005.-44 с.
7. Еремеев Н.Л. Особенности кинетического nоведения иммобилизованных ферментов 1 Еремеев Н.Л., Зайцев С.Ю. 11 Учебно-методическое nособие (гриф УМО ВУЗов РФ). -М.: ФГОУ ВПО МГАВМиб им. К. И. Скрябина.- 2007. - 43 с.
8. Биологическая химия с основами физической и коллоидной хим1111 i Зайцев С.Ю., белоновекая О.С., Жирнова К.Г и др. 11 Учебно-методическое nособие (rриф УМО ВУЗов РФ). М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина - - 2007 146с.
Сnисок работ, оnубликованных no теме диссертации Книги Зайцев С.Ю. биохимия животных. Фундаментальные и клиничесн1е асnекты 1.
1 С.Ю. Зайцев, Ю.В. Коноnатое. - 2-е изд.- СПб Лань, 2005. - 384 с.
2. Зайцев С.Ю. Супрамолекулярные системы на границе раздела фаз ~ак мо· дели бисмембран и t4аноматериалы 1 С.Ю. Зайцев. - Донецк, Москоа Норд Комnьютер, 2006.-189 с.
3. Зайцев С.Ю. Мембранные структуры на основе синтетических и nрирсдных полимерев 1 С.Ю. Зайцев -М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2006. -190 с.
Статьи в журналахи сборниках научных трудов 4. Zaitsev S.Yu. X-ray reflectivity analysis of Langmuir-Biodgett films of reaction center proteins fгom photosynthetic bacteria 1 Zaitsev S.Yu., Lvov Yu.M. 11 Thin Solid Films. • 1995. • Vol. 254. • Р.257·262..
5. Zaitsev S.Yu. Mixed monolayers of valinanyciп апd dlpalmitoylphosphatidic acid Zaitsev S.Yu., Zubov V.P., Moeblus D. 11 Colloids & Surfaces. • 1995., Vol. 94.
Р.75-83.
www.sp-department.ru s. Zaitsev S.Yu. Effect of aqueous subphase exchange Qn the monolayeг chaгacteг istics of valinomycin 1 Zaltsev S.Yu., Kalmer U., MoeЬius о: 11 Colloids & Surfaces. 1995. • Vol. 94.- Р.137-143.
1. Zaitsev S.Yu. Polymeric Langmuir films with glucose oxidase as prototype blo sensors 1 Zaltsev S.Yu./1 Sensoгs &Actuators.-; 1995.- Vol.24-25.- Р.177-179.
s. Зайцев С.Ю. Исследованиемоно-м мультисnойных мембран на основе бел :ов реакционных центров из фотосистемы 11 шnината 1 Зайцев С.Ю. 11 Биолоrи ческие мембраны. -1996.- N21.- С. 50-56.
9. Смешанные лилид-белковые менки на основе фотосинтетических реакци онt-iЫХ центро~;
~. !.Исследование смешанных монослоев на nоверхности раздела оода/еоздух 1 Калабина Н.А., Зайцев С.Ю., Лукашее В.П., Кононенко А.А., Заха r;
Jsa Н И.. ~убое В.П. !1 Био.'1огические мембраны.- 1996.- N24.- С. 410-422.
10. СмеuJанные лиnид-белкоеые nленки на основе фотосинтетических реакци·.;
нных центров. II.Исследование смешанных мультислоев на твёрдых nодложках : Лукашее В.П., Зайцев C.IO., Калабина Н.А., Кононенко АА, Сейфулина Н.Х..
'-убuв ВЛ. Jl Биологические мембраны.- 1996.- N25.- С. 497-503.
11. Образование комnлексов включения nлюроник-циклодекстрин в монослоях ~а границе раздела вода-воздух 1 Клямкин А.А., Тоnчиева И.Н., Зайцев С.Ю., '.у-5ов B.ll. /1 Биологические мембраны.- 1996.- N23.- С. 339-347.
12. Кинет Аческие особенtiОСТИ nолимеризации лиnидаnодобных мономеров в ·.•онослоях 1 Зайцев С.Ю., Клямкин А.А., Плясова ЕЛ., Верещетин В.В., Зубов •;
n. Jl Высокомолекулярные соединения -1996.- Т.З7. N210.- С.1762-1764.
13. Агрегация и фотоизомеризация амфифильноrо краун-содержащего стири.·Jвого красителя в моносnоях на границе раздела фаз 1 Крюков Е.Ю., Феофа ·св А. В., Олейников В.А., Верещетин В.В., Зубов ВЛ. Зайцев С.Ю. 11 Известия.:,кадемии наук.- 1996.- N2. 10.- С. 2490-2496.
14. Zaitsev s:v.u. Polymeгization and moleculaг гecognition in the monolayeгs of the !urface-active derivatives of cгown-ethers 1 Zaitsev S.Yu., Vereschetin V.P., Zubov V.
'" 11 MacroГr.olecular Symposia.- 1996- Vol. 106.- Р. 379-386.
1S. Polymer u/tгathin films \Vith immobllized photosynthetic гeaction center pгoteins v,alablna N.A., Zaitsev S.Yu., Zubov V.P., Lukashev Е.Р.• Kononenko А.А. 11 Bio chimica Biophysica Acta.- 1996,- Vol. 1284,- Р. 138-142.
16. Study of blochemical reactions in thin oгganic films Ьу means of evanescent op ~IC31 \\·ave 1 Ksenevich T.l., Beloglazov А.А., Nikitin P.l., Ka/ablna N.A., Zaitsev S..Yu.
:;
Applied S~.:rface Science. • 1996.- Vol. 92.- Р. 426- 17. Polymer films with immobllized pгoteins 1 Zaitsev S.Yu.• Zubov V.P., Lukashev ::: Р. Konor.E!nko АА, Kalablna N.A./1 Macromoleculaг Symposia. -1996- Vol. 100. ~ Р 193-203.
18. lonic selectivity of valinomycin in the dipalmitoy/phosphatidylchoПne monolayers. Zaitsev S.Yu., Vereschetin V.P., Zubov V.P.. Zeiss W., Moeblus D. " Thin Solid ;
-"ilms • 1996.- Vol. 284·285.- Р. 667-670.
19. Compзrative study of the mixed monolayeгs of valinomycin with dioctadecyl ·.;