Вирусные и невирусные методы введения в организм рекомбинантных нуклеиновых кислот
На правах рукописи
РИЗВАНОВ Альберт Анатольевич ВИРУСНЫЕ И НЕВИРУСНЫЕ МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ В ОРГАНИЗМ РЕКОМБИНАНТНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
Казань 2010
Работа выполнена в Казанском государственном университете им В.И.
Ульянова-Ленина
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Исламов Р.Р.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чернов В.М.
доктор медицинских наук, профессор Скороходкина А.В.
доктор биологических наук, профессор Купраш Д.В.
Ведущее учреждение: Учреждение Российской Академии Наук Институт общей генетики им. Н.И.
Вавилова РАН г. Москва
Защита состоится 14 октября 2010 г. в 1300 часов на заседании диссертациолнного Совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук Д 212.081.08 в Казанском государственном университете им В.И. Ульянова-Ленина по адресу:
г. Казань, ул. Кремлевская, 18.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.
Автореферат разослан «_» _ 2010 г.
Учёный секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова ВВЕДЕНИЕ Одна из актуальных задач современной биологии — направленный контроль экспрессии генов с изменением отдельных признаков организма.
Перспективным направлением для решения этой задачи считают генную терапию, т.е. введение в организм рекомбинантных генов с заданными свойствами. Актуальность генной терапии для практического применения очевидна, но существующие на сегодняшний день методы генетической модификации клеток имеют ряд существенных недостатков, связанных с биобезопасностью и малой эффективностью классических технологий.
Принцип генной терапии состоит во введении рекомбинантного генетического материала для коррекции генетического дефекта (мутации) или для влияния на отдельные свойства клетки, такие как синтез биомолекул.
Методы генной терапии позволяют экспрессировать рекомбинантные гены, кодирующие терапевтические белки для лечения различных заболеваний либо с целью иммунизации организма, снижать уровень экспрессии или полностью подавлять экспрессию генов (нокдаун и нокаут, соответственно от «knokdown» и «knockout») при генетических или соматических заболеваниях, таких как онкологические, нейродегенеративные и инфекционные (Seow and Wood 2009). Первые клинические исследования по генной терапии были проведены в девяностые годы прошлого столетия (Anderson 1990). С тех пор в мире зарегистрировано более 1537 клинических исследований с применением методов генной терапии (http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/).
Существует два основных методических подхода для введения генетического материала в клетку-мишень — вирусный и невирусный.
Вирусный подход основан на способности вирусов взаимодействовать с клетками организма, что приводит к введению вирусной генетической информации внутрь клеток и экспрессии вирусных генов. Миллионы лет эволюции привели к тому, что процесс вирусного инфицирования стал чрезвычайно эффективным. Главный недостаток данного подхода — высокая биологическая опасность вирусной инфекции. Опасность может быть связана с особенностями жизненного цикла вирусов. Например, интеграция ретровирусов в геном клетки-хозяина несёт риск вставочного мутагенеза и изменения экспрессии клеточных протоонкогенов, что может привести к опухолевой трансформации клетки. Кроме того, многие вирусные белки обладают сильным иммуногенным действием, что может привести к нежелательным побочным эффектам и снизить эффективность применения подобных генетических векторов. Более того, многие вирусы не обладают выраженной видоспецифичностью, что может привести к попаданию рекомбинантных генов в биосистему с неконтролируемыми последствиями для экологии и здоровья.
Невирусные методы доставки генетического материала основаны на введении рекомбинантных генов в клетку-мишень с помощью различных физических (электропорация, соникация, баллистика и т.д.) или химических (липофекция, катионные наночастицы и полимеры и т.д.) методов. Общий недостаток, присущий данным методам, — относительно низкие специфичность и эффективность введения генетической информации.
Цель работы: разработка биологически безопасных систем доставки нуклеиновых кислот для использования в генной терапии.
В соответствии с целью работы определены следующие экспериментальные задачи:
1. Разработка нового видоспецифичного вирусного вектора на основе цитомегаловируса для введения генетического материала в клетки оленьих хомячков Peromyscus maniculatus.
2. Анализ экспрессии рекомбинантных белков с помощью цитомегаловируса P. maniculatus in vitro и анализ иммунного ответа у хомячков P. maniculatus при инфицировании рекомбинантным вирусом.
Анализ репликативной активности рекомбинантного 3.
цитомегаловируса in vitro и особенностей вирусной инфекции in vivo у хомячков P. maniculatus.
Анализ внутриклеточного взаимодействия и созревания 4.
гликопротеинов хантавирусов с помощью невирусных методов генной доставки.
5. Разработка плазмидных генетических конструкций, экспрессирующих различные терапевтические гены и их комбинации.
6. Разработка методов комбинированной генно-клеточной терапии на основе трансфицированния мононуклеарных клеток пуповинной крови человека плазмидными векторами для лечения бокового амиотрофического склероза.
7. Разработка методов доставки короткой интерферирующей РНК (siRNA) для терапии бокового амиотрофического склероза и оценка эффективности подавления экспрессии мутантного гена с помощью РНК интерференции у трансгенных мышей G93A.
Научная новизна. Впервые создан видоспецифичный вектор на основе цитомегаловируса из для экспрессии Peromyscus maniculatus рекомбинантных белков с целью исследования иммунного ответа в организме хомячков на хантавирусные антигены. Впервые исследован эффект делеции гена р33 цитомегаловируса на вирусную инфекцию in vitro и in vivo. Впервые получены данные о взаимодействии гликопротеинов вирусной оболочки различных хантавирусов Южной и Северной Америки.
Получены данные о внутриклеточном созревании хантавирусных белков.
Впервые получены генетические конструкции, одновременно и независимо экспрессирующие нейропротекторные терапевтические белки VEGF и L1CAM. Показано, что клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека (ядросодержащие клетки пуповинной крови, включая стволовые кроветворные клетки), генетически модифицированные нейропротекторными генами, способны к миграции в очаги нейродегенерации у трансгенных мышей G93A (модель бокового амиотрофического склероза) и дифференцировке в эндотелиальные клетки, участвующие в формировании новых кровеносных капилляров. Впервые показано, что аппликация короткой интерферерирующей РНК (специфичной к мутантной форме гена супероксиддисмутазы 1 человека) на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва у трансгенных мышей G93A, экспрессирующих данный мутантный ген, приводит к снижению количества мРНК супероксиддисмутазы 1 в поясничном отделе спинного мозга мышей.
Положения, выносимые на защиту:
1. Цитомегаловирус хомячков Peromyscus maniculatus может служить эффективным вектором для создания генетических вакцин.
2. Внутриклеточная локализация и модификация гликопротеинов G1 и G2 хантавирусов зависит от характера экспрессии вирусных белков.
3. Невирусные методы генной и клеточной терапии эффективны для лечения бокового амиотрофического склероза.
Теоретическая и научная значимость. Создание видоспецифичного генетического вектора на основе цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus позволяет исследовать механизмы иммунного ответа организма хозяина на компоненты вируса. Полученные данные создают основу для создания биологически безопасных вакцин против хантавирусной инфекции как для человека, так и для видоспецифичной иммунизации естественного носителя вируса. Исследование взаимодействия и внутриклеточной модификации хантавирусных гликопротеинов вирусной оболочки позволяет глубже понять биологию данного семейства вирусов и оценить возможность межвидового генетического обмена в природе, что может привести к появлению вирусов с новыми инфекционными свойствами. Создание невирусных генетических векторов и разработка методов их применения для генетической модификации клеток пуповинной крови человека позволяет получить новый класс биологически безопасных генно-клеточных препаратов для лечения широкого спектра заболеваний человека, в том числе нейродегенеративных. Демонстрация активирования механизмов РНК интерференции при периферической аппликации siRNA на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва у трансгенных мышей демонстрирует возможность ретроградного транспорта siRNA и открывает новые возможности в использовании генной терапии на основе siRNA для лечения наследственных форм нейродегенеративных заболеваний.
Связь работы с базовыми научными программами. Исследования по теме работы проведены в период с 1996 по 2009 г. в соответствии с НИР Казанского государственного университета 01200850995 и 01200952944.
Работа поддерживалась грантами Национального Института Здоровья AI36418, HL63470, AI45059 и HLBI 63470. Работа поддерживалась грантами:
молодёжный грант Академии Наук Республики Татарстан, №11-9/2009(Г) «Разработка современных биомедицинских методов лечения хронической артериальной недостаточности нижних конечностей с использованием клеточных, генно-клеточных и генных технологий»;
грант НАТО NR.RIG.983007 «Combination gene and stem cell therapy for treating neurodegenerative diseases»;
грант РФФИ 07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксимедона»;
грант Правительства Республики Татарстан по подготовке и переподготовке кадров в зарубежных научных центрах;
государственный контракт ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.512.11.2052 «Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных мышей G93A, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза»;
грант РФФИ 06-04-49396-a «Состояние аксонного транспорта и внутриаксонного синтеза белка в условиях гравитационной разгрузки»;
молодёжный грант Академии Наук Республики Татарстан, №11-9/2009(Г) «Разработка современных биомедицинских методов лечения хронической артериальной недостаточности нижних конечностей с использованием клеточных, генно клеточных и генных технологий»;
государственный контракт ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.740.11. фундаментальных механизмов патогенеза «Исследование нейродегенеративных заболеваний и разработка современных технологий для их лечения»;
грант РФФИ 09-04-05079-б «Развитие МТБ для проведения исследований по области знаний 04»;
государственный контракт ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 02.552.11. “Проведение поисковых научно-исследовательских работ в области физико химии наноматериалов и молекулярных систем, включая биологические, в центре коллективного пользования научным оборудованием «Федеральный центр коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов»”. В 2009 году работа на тему «Вирусные и невирусные методы генетической терапии» отмечена премией Правительства Республики Татарстан для государственной поддержки молодых учёных.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на American Society for Virology, 17th Annual Meeting (Ванкувер, Канада, 1998), на ежегодных естественно-научных конференциях Университета Штата Невада, г. Рено (Лейк Тахо, США, 1999, 2000, 2002, 2006), Keystone Symposia (Cellular and Molecular Biology — Genetics, Pathogenesis and Ecology of Emerging Viral Diseases) (Таос, США, 2000), 8th International Cytomegalovirus Conference (Monterey, США, 2001), American Society for Virology, 20th Annual Meeting (Мэдисон, США, 2001), 27th Internationsl Herpesvirus Workshop (Cairns Convention Centre, Австралия, 2002), American Society for Virology, 22nd Annual Meeting, (Дэвис, США, 2003), American Society for Virology, 23rd Annual Meeting, (Монреаль, Канада, 2004), 6th International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses (Сеул, Южная Корея, 2004), American Society for Microbiology Meeting: Viral Immune Evasion (Акапулько, Мексика, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2007, 2008, 2009), Международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007), Gene Therapy Symposium (Стамбул, Турция, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007– 2012 годы" (Москва, 2007), 14th International Biomedical Science and Technology Symposium (Мугла, Турция, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 3rd International Congress of Molecular Medicine (Стамбул, Турция, 2009), 13th Annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» (пленарная лекция, секционный доклад, ведущий круглого стола) (Казань, 2009), International conference on nanomaterials and nanosystems (NanoMats 2009) (Стамбул, Турция, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ, в том числе 16 отечественных и зарубежных работ в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций, 32 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах.
Место выполнения работы. Основные экспериментальные данные получены автором за время работы в лабораториях профессора Стива Ст.
Джоура в Университете штата Невада, г. Рено, США (1996–2006), на кафедре генетики биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета (2006–2010) и в Казанском государственном медицинском университете (2006–2010).
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, заключения, выводов, приложения и списка литературы (302 ссылки). Работа содержит 62 рисунка и 25 таблиц.
ГЛАВА 1. Новый вектор на основе цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus для видоспецифичной экспрессии рекомбинантных белков хантавирусов 1.1 Выделение и филогенетический анализ цитомегаловируса из Peromyscus maniculatus (PCMV) Во время экспериментов по выделению эндогенных вирусов из тканей Peromyscus maniculatus с помощью эмбриональных клеток P. maniculatus (PMEC), мы наблюдали характерные патологические изменения в клетках, напоминающие инфекцию цитомегаловирусами (McAllister, Filbert et al.
1967). При электронной микроскопии найдены вирусные капсиды, напоминающие капсиды группы герпесвирусов (Berezesky, Grimley et al.
1971).
Для подтверждения принадлежности выделенного вируса к CMV, мы провели анализ тотальной ДНК, выделенной из инфицированных клеток, на присутствие гомологов ДНК-полимеразы и гена ul33 вируса HCMV. Эти гены были выбраны потому, что ген полимеразы высоко консервативен среди герпесвирусов (Chadwick, Yogev et al. 1989;
Langan, Gautier et al. 1989;
Pardee 1989;
Capps and Zuniga 1990), и гомологичные формы гена ul33 HCMV описаны у многих вирусов CMV. UL33 не участвует в вирусной репликации в культуре клеток (Hartwell and Weinert 1989;
Taylor 1989), что позволяет встраивать рекомбинантные гены в этот регион.
Амплификацию фрагмента гена р33 (аналог гена ul33 цитомегаловируса человека) вируса PCMV провели методом обратной транскрипции с последующей ПЦР-амплификацией с использованием в качестве матрицы общей мРНК, выделенной из инфицированных клеток РМЕС. Продукты ПЦР-амплификации клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование фрагмента гена р33 в полученной рекомбинантной плазмиде показало отсутствие интронной области.
Частичную нуклеотидную последовательность гена р33 использовали для синтеза короткой 31-мерной пробы для скрининга серии плазмидных клонов геномной библиотеки вирусной ДНК. Нуклеотидная последовательность, полученная в результате секвенирования геномного фрагмента BamHI размером 3000 п.н., содержала последовательность гомолога гена ul33 цитомегаловируса человека. Сиквенс показал высокую степень гомологии к гену m33 вируса MCMV и гена r33 цитомегаловируса крысы (RCMV). Известно, что ul33 и r33 не содержат интронов, тогда как гомолог вируса MCMV — m33 содержит один интрон в кодирующей последовательности (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997). Анализ первичной нуклеотидной последовательности гена р33 показал его прерывистую структуру, что предполагает необходимость сплайсинга. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) проведена с использованием праймеров на противоположных концах предполагаемого донорного и акцепторного сайтов. Эксперимент подтвердил присутствие интрона размером 85 п.н. в составе гена размером 1333 п.н., состоящего из двух экзонов размером 33 и 1215 п.н. Когда тотальную РНК из инфицированных клеток PMEC использовали в качестве матрицы для ОТ ПЦР, были выявлены две полоски на геле, соответствующие процессированной и непроцессированной копиям мРНК гена р33. Гены m33, r33 и ul33 гомологичны рецептору, сопряжённому с G-белком (гомологичность аминокислотной последовательности 62,5, 59,9 и 39,1% соответственно). Транскрипционный анализ в присутствии фосфорномуравьиной кислоты (PFA) в концентрации 50 мкг/мл показал ингибирование транскрипции гена р33, что подтверждает его принадлежность к поздним генам.
Фрагмент гена ДНК-полимеразы ПЦР-амплифицировали с применением прямого праймера 5'-C/G-CG-C/T-GGCGTG-A/T-T-A/G-TA-C/TGA-C/T-GG 3' и обратного праймера 5'-GATCTG-C/T-TG-T/G-CC-C/G-TCGAAGATGAC 3'. Нуклеотидную последовательность гена ДНК-полимеразы сравнили с соответствующими регионами описанных ранее ДНК-полимераз других видоспецифичных вирусов CMV. Как и ожидалось, открытая рамка считывания ДНК-полимеразы наиболее близко соответствовала уже описанным вирусам CMV грызунов;
при этом ДНК-полимераза вируса MCMV показала наибольшую степень гомологии, в то время как второй по уровню гомологии была ДНК-полимераза вируса RCMV. Иные гомологи ДНК-полимеразы были сгруппированы в других кластерах: HCMV и вирус CMV макаки резус (RhCMV) в одной группе, а вирус CMV морской свинки и два других герпесвируса рода тупаи — в другой группе. Этот анализ и тот факт, что PCMV не реплицировал в клетках NIH 3T3, подтверждают, что PCMV — новый вирус CMV, гомологичный вирусам MCMV и RCMV.
1.2 Получение рекомбинантного цитомегаловируса для экспрессии гликопротеинов хантавирусов Клонирование фрагмента геномной ДНК цитомегаловируса Peromyscus maniculatus, содержащего ген р33. Вирус PCMV выращивали на эмбриональных клетках Peromyscus maniculatus (PMEC). Вирусные маточные растворы получены инфицированием клеток PMEC в роллерных бутылях со средой Дульбекко (модифицированная Исковым — IMDM). Вирусный титр определяли методом бляшек. Выделенную геномную ДНК вируса PCMV гидролизовали с помощью эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) NotI и полученные фрагменты ДНК клонировали в плазмиду pET29c.
Нуклеотидная последовательность, полученная в результате секвенирования одного из концов продукта ПЦР-амплификации гена р33, использовали для синтеза праймера 31-мерного 5' TGGGACGTCACCTGCGAATCTATCAACAACA-3'. В олигонуклеотид ввели концевую метку [-32Р]АТФ (NEN Life Sciences) с помощью Т4 полинуклеотидкиназы (Life Technologies). Скрининг NotI-геномной библиотеки PCMV на наличие гена р33 провели с помощью Саузерн блоттинга. На основании авторадиографических результатов Саузерн-блота установлено, что NotI-клон №121 содержит ген р33 PCMV. Плазмидную ДНК NotI-клона №121 гидролизовали ферментом BamHI и после очистки BamHI-фрагмент размером 3 т.п.н. клонировали в линейный вектор pPUR (Clontech), что привело к созданию плазмиды pPUR3kb. Ген р секвенировали с помощью специфичных праймеров, созданных на основе нуклеотидной последовательности ранее секвенированного ПЦР-фрагмента р33. Полное секвенирование всего гена р33 было проведено методом праймерной «прогулки» в обоих направлениях.
Создание рекомбинантного цитомегаловируса Peromyscus maniculatus (РCMV Р33:G1EGFP). Несмотря на то, что гомологи гена цитомегаловируса человека ul33 у цитомегаловирусов крысы (r33) и мыши (m33) не играют значимой роли при репликации вируса в культуре клеток, рекомбинантные RCMV и MCMV, у которых отсутствовал гомолог гена ul33, демонстрировали аттенуированный фенотип, что выражалось в понижении тропизма к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997) и повышенной на 50% LD50 (Beisser, Vink et al. 1998). Таким образом, мы выбрали ген р33 для гомологичной замены на экспрессионную кассету, кодирующую химерный белок, состоящий из полного гена гликопротеина G хантавиркуса Sin Nombre (snv-g1) (плюс нуклеотидная последовательность, кодирующая первые 50 аминокислот гена G2) с egfp на С-конце. Для этого фрагмент М-сегмента вируса Sin Nombre (SNV) длиной 2116 нуклеотидов ПЦР-амплифицировали с помощью Pwo-полимеразы. Полученный фрагмент перекрывал кодирующую область snv-g1 и часть snv-g2. Продукт ПЦР амплификации клонировали в плазмиду pCRII (Invitrogen) с последующим субклонированием в экспрессионный плазмидный вектор pEGFP-N1-BHI (Clontech) с использованием сайтов рестрикции EcoRI, помещая ПЦР фрагмент snv-g1 с 5'-конца по отношению к гену egfp с сохранением открытой рамки считывания. Правильность сборки конструкции, начиная с транскрипционного старта и захватывая всю область генов snv-g1 и egfp, подтверждена секвенированием. Уникальный рестрикционный сайт AseI в плазмиде pEGFP-N1G1 конвертировали в EcoRV расщеплением AseI, достраиванием липких концов фрагментом Клёнова и лигации EcoRV линкера (5'-GGGATATCCC-3') в плазмиду.
Ген р33 расположен в середине BamHI-фрагмента размером 3 т.п.н. в клоне №121 геномной библиотеки PCMV и содержит два удобных сайта XhoI, расположенных в 575 нуклеотидах друг от друга (со стартом трансляции в 378 нуклеотидов выше от первого сайта и стоп-кодоном в нуклеотидах ниже второго сайта). Плазмида pN1G1-fl получена вставкой XhoI-фрагмента, содержащего фланкирующие участки гена р33, в сайт EcoRV плазмиды pEGFP-N1G1.
Полученную плазмиду использовали для гомологичной рекомбинации с вирусом PCMV дикого типа (wtPCMV). При этом XhoI-фрагмент гена р размером 575 п.н. заменили с помощью гомологичной рекомбинации на экспрессионную кассету описанной выше плазмиды pN1G1-fl.
Рекомбинантный вирус получили с помощью селекции в присутствии G418.
Последующая очистка рекомбинантного вируса проведена с помощью флуоресцентно-активируемой клеточной сортировки (FACS) (Beckman Coulter). ПЦР-анализ места вставки показал отсутствие загрязнения препарата рекомбинантного вируса вирусом дикого типа. Саузерн-блот анализ с применением р33-специфичной пробы показал увеличения геномного фрагмента с 3 т.п.н. у wtPCMV до 10 т.п.н. у рекомбинантного PCMV. Рекомбинантный PCMV получил название РCMV (Р33:G1EGFP).
1.3 Анализ вирусной инфекции рекомбинантным цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus (РCMV Р33:G1EGFP) in vitro Анализ экспрессии рекомбинантных белков. Клетки, инфицированные рекомбинантным РCMV, экспрессировали улучшенный ген зелёного флуоресцентного белка (EGFP), что показано флуоресцентной микроскопией. Для того, чтобы показать экспрессию G1 в инфицированных клетках, мы провели иммуноцитохимическую реакцию с помощью АТ к SNV-G1. Иммуноцитохимический анализ клеток PMEC, инфицированных PCMV, выявил положительную реакцию с рекомбинантными АТ человека к SNV-G1. Белковые лизаты клеток PMEC, инфицированные РCMV (Р33:G1EGFP), анализировали с помощью вестерн-блоттинга и моноклональных АТ к GFP. Интересно, что вестерн-блот обнаружил выраженную полоску, соответствующую ожидаемой молекулярной массе EGFP (27 кДа). Полученная молекулярная масса белковой полоски была меньше, чем ожидаемая молекулярная масса химерного белка G1-EGFP (106 кДа). Анализ экспрессии EGFP с помощью вестерн-блотинга в клетках PMEC, инфицированных рекомбинантным PCMV, показал экспрессию низкомолекулярной формы EGFP через 72 часа после добавления вируса к клеткам. Анти-пептидные АТ к SNV-G1 выявили наличие белка размером 75 кДа на поздних сроках после инфицирования клеток. Экспрессионная кассета G1-EGFP находится под транскрипционным контролем непосредственно-раннего промотора HCMV, но экспрессия EGFP не установлена на ранних (до 48 часов) стадиях после инфицирования клеток.
Анализ репликации рекомбинантного цитомегаловируса.
Накопление инфекционных вирусных частиц в культуральной среде определяли титрованием вируса методом бляшек. Результаты титрования вируса показывают, что wtPCMV присутствует в культуральной среде через 48 часов после инфицирования клеток. По мере протекания инфекции титр wtPCMV в культуральной среде возрастал и достигал 1,8х108 PFU/мл через 192 часа после инфицирования клеток. Присутствие рекомбинантного вируса PCMV наблюдали в культуральной среде через 144 часа после инфицирования. Титр рекомбинантного PCMV в культуральной среде возрастал по мере протекания инфекции, достигая 6х108 PFU/мл через часа после инфицирования клеток.
Количественный анализ репликации рекомбинантного РCMV (Р33:G1EGFP) проводили с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Общую ДНК выделили из клеток PMEC, инфицированных wtPCMV или рекомбинантным PCMV. ПЦР-РВ с применением TaqMan MGB-проб проводили для определения количества копий геномов PCMV в клетках.
Количество копий гена интерферона INF- P. maniculatus использовали для определения числа копий клеточных геномов Peromyscus в образце. Ген 18S рибосомной РНК применяли в качестве внутреннего контроля для подтверждения точности количественного определения с помощью гена INF P. maniculatus. Количество геномной ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV в культуральной среде через час после инфицирования клеток (фоновый уровень) составил приблизительно 1х104 геномов/мл.
Первоначальное увеличение количества геномной ДНК wtPCMV в культуральной среде наблюдали через 48 часов после инфицирования клеток, в то время как рекомбинантный PCMV показал увеличение количества геномной ДНК через 72 часа после инфицирования. Внутриклеточное количество ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV достигало плато через 144 часа после инфицирования, а через 192 часа количество геномной ДНК PCMV в культуральной среде достигло 9,2х106 геномов/мл для wtPCMV и 4,2х106 геномов/мл для рекомбинантного PCMV. Анализ ПЦР-РВ внутриклеточной ДНК PCMV показал сравнимые концентрации wtPCMV и рекомбинантного PCMV через 1 час после инфицирования. Мы наблюдали снижение внутриклеточного количества ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV в 10-15 раз через 24 часа после инфицирования. Количество ДНК внутриклеточного wtPCMV значительно возросло через 48 часов после инфицирования, в то время как увеличение количества ДНК рекомбинантного PCMV наблюдалось через 72 часа после инфицирования.
Внутриклеточное количество ДНК wtPCMV в клетках PMEC достигло плато при 447 вирусных генома на клеточный геном (или 1,4х104 геномов PCMV/нг тотальной ДНК) через 96 часов после инфицирования, тогда как количество рекомбинантного PCMV достигало плато при 491 вирусных генома на клеточный геном через 120 часов после инфицирования. Мы не наблюдали существенных различий во внутриклеточном количестве ДНК wtPCMV и рекомбинантного PCMV на поздних этапах инфекции. Нормализация результатов ПЦР-РВ по отношению к количеству копий генов INF- и 18S рибосомной РНК P. maniculatus показали сопоставимые между собой результаты.
1.4 Анализ инфицирования хомячков Peromyscus maniculatus рекомбинантным цитомегаловирусом (РCMV Р33:G1EGFP) Инфицирование хомячков рекомбинантным цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus (РCMV Р33:G1EGFP): эксперимент 1.
Эксперименты на животных проводили в соответствии с разрешением этического комитета Университета штата Невада, г. Рино, США. Оленьи хомячки Peromyscus maniculatus sonoriensis (в возрасте 6–7,5 месяцев) приобретены в виварии Университета Штата Южная Каролина. Для того, чтобы определить, может ли рекомбинантный вирус РCMV (Р33:G1EGFP) инфицировать хомячков P. maniculatus и вызывать иммунный ответ к SNV G1 и EGFP, двум группам хомячков сделали внутрибрюшинные инъекции колониеобразующих единиц (PFU) wtPCMV (8 хомячков), либо 10 PFU рекомбинантного РCMV (Р33:G1EGFP) (8 хомячков). Через год 3 хомячкам из wtPCMV-инфицированной группы и 6 хомячкам из РCMV (Р33:G1EGFP)-инфицированной группы сделали повторную инъекцию 10 000 PFU РCMV (Р33:G1EGFP). У хомячков производили систематический отбор крови для определения серологического статуса методом иммуноферментного анализа (ИФА). Рисунок 1 демонстрирует ранний иммунный ответ (15 дней после инфицирования) к PCMV и EGFP у хомячков, инфицированных рекомбинантным вирусом PCMV. Через недели после инфицирования рекомбинантным PCMV хомячки показали слабый, но статистически достоверный (р=0,018) иммунный ответ к PCMV, ответ увеличивался на протяжении 12 месяцев. Реинфицирование хомячков, предварительно инфицированных рекомбинантным PCMV, новой дозой рекомбинантного PCMV, привела к значительному увеличению титра АТ к PCMV- и SNV-антигенам. Можно предположить, что уровень экспрессии G рекомбинантным вирусом достаточен для индукции гуморального иммунного ответа. Кроме того, введение хомячкам, предварительно инфицированных рекомбинантного привела к wtPCMV, PCMV значительному содержанию АТ к SNV (р=0,003).
Инфицирование хомячков рекомбинантным цитомегаловирусом Peromyscus maniculatus (РCMV Р33:G1EGFP): эксперимент 2.
Хомячкам P. maniculatus делали внутрибрюшинные инъекции 5500 PFU wtPCMV (18 хомячков) или рекомбинантного PCMV (10 хомячков).
Повторное инфицирование тем же количеством вируса провели через дней после первичного инфицирования. Группа животных, инфицированных только wtPCMV, состояла из 7 особей, рекомбинантным PCMV — 10 особей, и группа животных, одновременно инфицированная вирусами wtPCMV и рекомбинантным PCMV, — 11 особей. При этом 11 из 18 хомячков, первоначально инфицированных реинфицировали wtPCMV, рекомбинантным PCMV. Образцы крови инфицированных хомячков получены из ретроорбитального венозного синуса. Все животные были ИФА серонегативны по PCMV перед проведением экспериментов.
Рис. 1. Титр антител против вирусных и рекомбинантных антигенов у инфицированных цитомегаловирусами хомячков Peromyscus maniculatus. Панель А. Титр АТ к PCMV и EGFP у 6 хомячков, 15 дней после инфицирования рекомбинантным PCMV (Р33:G1EGFP). Группы столбцов от 1 до 6 — сыворотка крови индивидуальных животных. К — контроль, моноклональные АТ к GFP и смесь сывороток инфицированных в естественных условиях диких хомячков. Панель Б. Титр АТ к PCMV антигенам. 1 — неинфицированный контроль (n=3);
2 — 4 недели после инфицирования рекомбинантным PCMV (n=8);
3 — 12 недель после инфицирования рекомбинантным PCMV (n=6);
4 — 12 недель после инфицирования wtPCMV (n=5). Панель В. Титр АТ к SNV-G1. Разведение сывороток крови хомячков 1:100. 1 — неинфицированный контроль (n=3);
2 —12 недель после инфицирования рекомбинантным PCMV (n=6);
3 — недели после инфицирования рекомбинантным PCMV и реинфицирования рекомбинантным PCMV (n=6);
4 — 3 недели после инфицирования wtPCMV и реинфицирования рекомбинантным PCMV (n=3).
Рис. 2. Иммуноферментный анализ титра антител против рекомби нантных белков у хомячков, инфицированных цитомегаловирусом Pero myscus maniculatus. Стрелкой отмечено повторное инфицирование через день после первичного. Панель А. Титр АТ к PCMV у инфицированных хомячков. — wtPCMV (n=7);
— рекомбинантный PCMV (n=10);
— животные, инфицированные wtPCMV и реинфицированные рекомбинантным PCMV. Панель Б. Титр АТ к EGFP у хомячков, инфицированных ре комбинантным PCMV. Р-значения даны для изменения титра АТ к EGFP между 128-160, и между 160- 192 днями после инфицирования. Панель В.
Титр АТ к SNV-G1 у хомячков, инфицированных wtPCMV (n=7), ре комбинантным PCMV (n=8) или wtPCMV с реинфицированием рекомбинант ным PCMV (n=11). Р-значения даны для изменения титра АТ к SNV-G1 по отношению к соответствующему wtPCMV контролю.
Для исследования иммунного ответа у P. maniculatus, инфицированных wtPCMV или рекомбинантным PCMV, мы применили ИФА с антигенами PCMV, EGFP и SNV. АТ к PCMV обнаружены у хомячков, инфицированных как wtPCMV, так и рекомбинантным PCMV (Рис. 2). Кроме того, АТ к EGFP обнаружены у 7 из 10 животных, инфицированных рекомбинантным PCMV через 128 дней после инфицирования. Реинфицирование этих животных рекомбинантным PCMV не привело к увеличению титра АТ к EGFP в сыворотке крови. Наоборот, титр АТ к EGFP уменьшался со временем.
Животные, первоначально инфицированные wtPCMV, но не инфицированные рекомбинантным PCMV, не показали наличия АТ к EGFP.
Анализ титра специфичных АТ к SNV-G1 в сыворотке проводили через 28, 160 и 355 дней после инфицирования. ИФА не обнаружил присутствия АТ к SNV-G1 через 28 дней после инфицирования рекомбинантным PCMV, но мы наблюдали значительное увеличение титра АТ к SNV-G1 в сыворотке через 160 и 355 дней после инфицирования по сравнению с контролем (через дней после инфицирования р=0,0015;
через 355 дней р=0,015). Интересно, что животные, первоначально инфицированные и wtPCMV реинфицированные рекомбинантным PCMV, показали наличие АТ к SNV G1, что свидетельствует о том, что предварительная инфекция wtPCMV не предотвратила реинфицирования рекомбинантным вирусом (Рис. 2).
Другой показатель вирусной инфекции — накопление вирусного генетического материала в различных органах хозяина. Общую ДНК из разных органов хомячков (4 особи из каждой группы) выделили через дней после инфицирования. Количественный анализ вирусной ДНК проводили методом ПЦР-РВ. Статистически достоверных различий количества вирусной ДНК в разных органах хомячков, инфицированных wtPCMV или рекомбинантным PCMV, не выявлено. Исключением стало повышение количества вирусной ДНК в сердечной ткани у животных, инфицированных рекомбинантным PCMV (р=0,04), и более высокое количество вирусной ДНК в селезёнке животных, инфицированных wtPCMV (р=0,05).
Реактивация латентного вируса Peromyscus maniculatus. Важным признаком цитомегаловирусов служит их способность к установлению латентной инфекции. Иммуносупрессия зачастую вызывает реактивацию CMV, что может привести к серьёзным последствиям у пациентов с ослабленной иммунной системой (Peckham 1991). Чтобы определить, может ли проходить реактивация рекомбинантного PCMV у латентно инфицированных животных, мы подвергли хомячков (3 особи) сублетальному гамма-облучению (Geginat, Ruppert et al. 1997). Тотальную ДНК из образцов крови до и через 12 дней после облучения анализировали с помощью ПЦР-РВ. Все 3 хомячка (одна особь, первоначально инфицированная wtPCMV и реинфицированная рекомбинантным PCMV, и две особи, инфицированные рекомбинантным PCMV) показали значительное увеличение (в 6–68 раз) количества вирусной ДНК в крови после облучения.
1.5 Обсуждение В данной работе мы описываем новооткрытый цитомегаловирус (CMV) из P. maniculatus. Вирус классифицирован как CMV на основании следующих критериев: (i) цитопатология, типичная для CMV;
(ii) электронная микроскопия, характерная для CMV;
(iii) ДНК-полимераза и ген ul33 гомологичны MCMV;
(iv) репликация вируса проходит исключительно в клетках, выделенных из P. maniculatus. Филогенетический анализ показал принадлежность данного вируса к группе, включающей MCMV и RCMV. ДНК-полимераза гомологична по аминокислотной последовательности на 60,2% и 56,9% соответствующим регионам ДНК полимераз MCMV и RCMV.
Эволюционное родство PCMV с MCMV подтверждает наличие 85 нуклеотидного интрона, разделяющего 5'-конец кодирующей области первого экзона от 1215-нуклеотидного второго экзона, в гене р33 (гомолог гена ul33 вируса CMV человека). Для гена m33 сайт сплайсинга описан в той же позиции. Подобную структуру гена не описана у RCMV (ген r33) и HCMV (ген ul33), для которых характерна безинтронная структура генов. Ген р33 принадлежит к группе настоящих поздних генов, отличительная особенность которых – отсутствие транскрипции в присутствии PFA (ингибитора репликации вирусной ДНК, блокирующего экспрессию ICP36) (Everett and Dunlop 1984). Несмотря на то, что эти гомологи сопряжённого с G-белком рецептора не критичны для вирусной репликации в культуре клеток, они явно играют ключевую роль в патогенезе вируса, что видно из уменьшения тропизма к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997;
Beisser, Vink et al. 1998) и увеличения на 50% LD50 вирусов CMV, дефектных по ul33.
Рекомбинантный вирус PCMV получен путём вставки экспрессионной кассеты, содержащей ген химерного белка SNV-G1 и EGFP, в ген р33.
Химерный белок создан таким образом, что он сохраняет сайт расщепления G1-G2 между кодирующими регионами генов G1 и egfp. Подобный подход применён для достижения экспрессии G1 в его нативной форме, что может быть важным фактором для получения адекватного иммунного ответа против G1, в тоже время позволяя проводить детекцию белка EGFP для наблюдения за экспрессией рекомбинантных белков и селекции рекомбинантного вируса.
Экспрессия EGFP подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии.
Иммуноцитохимический анализ с применением специфичных рекомбинантных АТ человека к SNV-G1 подтвердил экспрессию SNV-G1 в клетках PMEC, инфицированных рекомбинантным PCMV. Анализ лизатов инфицированных клеток методом вестерн-блотинга показал присутствие на ранних стадиях инфекции значительного количества белка с молекулярной массой 27 кДа, что соответствует мономерному EGFP. Вестерн-блотинг тех же образцов с использованием анти-пептидных АТ к SNV-G1 показал наличие белка G1 (75 кДа) на более поздних стадиях инфекции. Эти результаты подтверждают экспрессию и расщепление G1 и EGFP в результате процессинга пребелковой формы. Эффективная экспрессия G1 EGFP-кассеты происходила только на поздних этапах инфекции, что также наблюдалось при экспрессии EGFP-G1 с плазмиды при транзиторной трансфекции. Несмотря на то, что промотор HCMV принадлежит к группе непосредственно-ранних промоторов, этот процесс происходит в контексте жизненного цикла CMV и его позиции в вирусной ДНК. Вероятно, когда промотор присутствует в геноме PCMV и клетках из P. maniculatus, его времення регуляция претерпевает изменение. Экспрессия белков G1 и EGFP происходит в виде независимых полипептидных цепей, при этом в инфицированных клетках не обнаружен химерный белок G1-EGFP. Это свидетельствует об эффективном процессинге пребелка, скорее всего в районе сайта расщепления между G1 и G2 в гликопротеине SNV, сохранённым в химерной конструкции G1-EGFP.
Для инфицирования P. maniculatus вирусом РCMV (Р33:G1EGFP) было достаточно внутрибрюшинного введения 10 PFU вируса на животное. Когда хомячков инфицировали рекомбинантным вирусом, мы наблюдали иммунный гуморальный ответ на SNV-G1 и EGFP, что служит доказательством того, что экспрессируемые формы G1 и EGFP способны вызывать иммунный ответ с образованием АТ, реагирующих с SNV-G1 и EGFP в инфицированных клеточных лизатах Vero-E6 (Рис. 1). Интересно, что существующий иммунный ответ против wtPCMV не мешает индукции иммунного ответа против рекомбинантного белка, экспрессируемого с рекомбинантного вектора.
Данные наблюдения согласуются с исследованиями, показывающими возможность одновременного инфицирования диких мышей множественными штаммами MCMV (Moro, Lloyd et al. 1999). Подобное не наблюдают при HCMV-инфекции у людей. Показано, что предварительное инфицирование здоровых людей вирусом HCMV дикого типа или вакцинным штаммом вызывает, по крайней мере частичную, защиту от последующих инфекций (Adler, Hempfling et al. 1998;
Plotkin 1999;
Plotkin 1999). Полученные нами данные демонстрируют преимущество системы на основе цитомегаловируса P. maniculatus, для которого иммунный ответ против вирусного вектора скорее всего не повлияет на эффективность экспрессии трансгена in vivo при многократном введении в организм, что происходит у других часто используемых вирусных систем генной доставки (Engelhardt, Litzky et al. 1994;
Smith, White et al. 1996). Тот факт, что титр АТ у хомячков, инфицированных wtPCMV, выше, чем у животных, инфицированных рекомбинантным PCMV, можно объяснить тем, что последний имеет аттенуированный фенотип. По-видимому, делеция гена р и вставка экспрессионной кассеты G1-EGFP приводит к аттенуации рекомбинантного PCMV. Несмотря на аттенуацию, вирус был способен инфицировать хомячков при малых дозах порядка 10 PFU на животное.
Однако, иммунный ответ против PCMV у хомячков, инфицированных рекомбинантным PCMV, был ниже, чем у животных, инфицированных wtPCMV.
Наши эксперименты показали, что PCMV не приводит к выраженной патологии у инфицированных животных и, по всей видимости, не оказывает эффекта на продолжительность их жизни, так как животные, инфицированные wtPCMV или рекомбинантным PCMV, выживали более месяцев после инфицирования. Дальнейшие эксперименты определили характер распределения рекомбинантного PCMV и wtPCMV в различных тканях инфицированных хомячков P. maniculatus. Мы подтвердили, что иммунный ответ против рекомбинантного PCMV не так сильно выражен, как против wtPCMV. Мы провели дополнительные эксперименты по изучению аттенуации рекомбинантного вируса. Накопление внутриклеточной ДНК PCMV, а также накопление инфекционных вирусных частиц и накопление ДНК рекомбинантного PCMV в культуральной среде шли с задержкой по сравнению с wtPCMV. Эти данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный PCMV имеет замедленный репликационный цикл по сравнению с wtPCMV. Однако, несмотря на более медленную репликацию рекомбинантного PCMV, он достигал приблизительно одинакового плато количества внутриклеточной вирусной ДНК на поздних этапах инфекции.
Механизмы аттенуации вирусной репликации могут иметь мультифакторную основу. Ген р33 — гомолог гена ul33 HCMV, следовательно — гомолог сопряжённых с G-белком рецепторов. Ранее было показано, что этот ген не участвует в вирусной репликации в культуре клеток, но может играть важную роль в тропизме вируса к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997;
Beisser, Vink et al. 1998). Недавно была предложена гипотеза, что белок М33 MCMV может играть роль в раннем репрограммировании клеток хозяина для поддержания CMV-репликации во время вирусной инфекции (Waldhoer, Kledal et al. 2002). Одним из возможных функциональных гомологов Р33 служит белок US28 HCMV — трансмембранный рецептор, сопряжённый с G-белком. Было показано, что US28 играет роль в слиянии клеток, демонстрируя свою потенциальную важность в межклеточном распространении CMV (Pleskoff, Treboute et al.
1998). Делеция гена р33 может привести к нарушению межклеточного распространения PCMV, приводя в конечном итоге к развитию более медленно прогрессирующей инфекции. Дополнительным фактором, оказывающим негативное влияние на вирусную репликацию, служит присутствие экспрессионной кассеты SNV-G1-EGFP, конститутивно экспрессирующей рекомбинантные белки под контролем сильного промотора цитомегаловируа человека.
Для определения эффективности использования PCMV в качестве экспрессионного вектора, мы изучили иммунный ответ против PCMV и рекомбинантных антигенов у оленьих хомячков. Животные, инфицированные wtPCMV или рекомбинантным PCMV, демонстрировали иммунный ответ против антигенов PCMV уже через 2 недели после первоначального инфицирования (Рис. 2). Титр АТ против wtPCMV и рекомбинантного PCMV продолжал расти по мере развития инфекции.
Реинфицирование хомячков соответствующим вирусом привело к увеличению титра АТ к PCMV у животных, инфицированных рекомбинантным PCMV (р=0,041), но это не влияло на титр АТ к PCMV у хомячков, инфицированных wtPCMV, что можно объяснить тем, что высокий титр АТ к PCMV у инфицированных wtPCMV животных предотвращал дополнительную репликацию вируса. Хотя мы наблюдали статистически значимое увеличение титра АТ к PCMV у хомячков, инфицированных рекомбинантным PCMV, после реинфицирования, это обстоятельство можно также объяснить продолжением развития иммунного ответа на первоначальное инфицирование wtPCMV. При этом рекомбинантный PCMV имеет аттенуированный фенотип, что может приводить к менее выраженному иммунному ответу против PCMV антигенов. Отличие в иммунном ответе между EGFP и SNV-G1 можно объяснить различной иммуногенностью этих белков и более высоким уровнем экспрессии EGFP.
Наши данные свидетельствуют о том, что цитомегаловирус P. maniculatus – эффективный метод доставки рекомбинантных генов с целью иммунизации организма хозяина. Несмотря на обнадёживающие результаты, необходимы дополнительные исследования для определения эффективности вектора на основе PCMV в защите P. maniculatus от инфицирования патогенным SNV. В настоящее время мало что известно о значимости гуморального или клеточного иммунных ответов в защите от SNV-инфекции. Кроме того, неизвестна роль белков G1, G2 и нуклеокапсидного белка в создании иммунитета против SNV. Информация, полученная ранее в нашей лаборатории, показывает, что материнские АТ могут защищать молодняк P. maniculatus при инфицировании вирусом SNV (Borucki, Boone et al. 2000).
Известно, что слюнные железы выступают органом-мишенью для репликации цитомегаловируса мыши (MCMV) (Cheung and Lang 1977;
Mims and Gould 1979). Вирус можно обнаружить в слюнных железах животных на протяжении первых 3 месяцев после инфицирования. В крови, селезёнке, лёгких и костном мозге локализация вируса происходит в течение первых нескольких недель после инфицирования. Исследование по персистенции вируса и определению количества вируса в различных органах было в основном ограничено ко-инкубацией суспензии органов с культурами клеток.
Наши результаты показывают, что wtPCMV и рекомбинантный PCMV присутствуют в относительно малых количествах во всех исследованных органах (за исключением крови и мозга). Наибольшие отличия в количестве wtPCMV от рекомбинантного PCMV выявлены в сердце (повышенный уровень рекомбинантного PCMV), в почках и селезёнке (повышенный уровень wtPCMV). Только следовые количества геномов PCMV обнаружены в слюнных железах. Предварительные результаты, полученные с использованием 2 хомячков на сроках 3 и 4 недели после инфицирования wtPCMV, показывают присутствие высокого количества PCMV в слюнных железах, в то время как вирус не обнаруживали у хомячков спустя 3 месяца после инфицирования рекомбинантным PCMV. Наши результаты согласуются с сообщениями о том, что MCMV присутствует в высоких концентрациях в слюнных железах только на ранних стадиях инфекции и не обнаруживается через несколько месяцев после инфицирования (Mims and Gould 1979), а делеция гена m33 вируса MCMV снижает тропизм MCMV к слюнным железам (Davis-Poynter, Lynch et al. 1997).
Известно, что MCMV может устанавливать латентную инфекцию у мышей (Reddehase, Podlech et al. 2002). В ответ на определённые раздражители может происходить реактивация вируса. Генотоксичный стресс в результате гамма-облучения — один из методов исследования латентности у мышей (Balthesen, Messerle et al. 1993). Мы решили применить гамма-облучение для определения возможной реактивации PCMV у латентно-инфицированных хомячков P. maniculatus. Мы наблюдали значительное увеличение количества вируса в крови облучённых (4,12 Gy) животных, одновременно инфицированных вирусами wtPCMV и рекомбинантным PCMV или инфицированных только рекомбинантным PCMV. Эти наблюдения подтверждают предположение о том, что PCMV способен устанавливать латентную инфекцию у P. maniculatus наподобие латентной инфекции MCMV у мышей, и что делеция гена р33 вируса PCMV не влияет на способность устанавливать латентную инфекцию с последующей реактивацией после генотоксического стресса организма хозяина.
*** Итак, в ходе работы из хомячков P. maniculatus выделен новый цитомегаловирус, получивший обозначение Проведён PCMV.
морфологический и молекулярно-генетический анализ PCMV. Молекулярно генетическими методами создан рекомбинантный PCMV, экспрессирующий рекомбинантные белки SNV-G1 и EGFP. Полученные результаты свидетельствуют о том, что wtPCMV и рекомбинантный PCMV устанавливают латентную инфекцию у P. maniculatus. Рекомбинантный PCMV имеет аттенуированный фенотип в культуре клеток и вызывает более слабый иммунный ответ против PCMV-антигенов у хомячков по сравнению с wtPCMV. Однако мы не наблюдали статистически достоверных различий в титре или количестве геномной ДНК вируса между wtPCMV и рекомбинантным PCMV у персистентно инфицированных животных. Нами показано, что гамма-облучение хомячков, инфицированных PCMV, приводило к реактивации рекомбинантного PCMV у персистентно инфицированных хомячков. Инфицирование рекомбинантным PCMV приводило к сильному иммунному ответу против рекомбинантных белков EGFP и SNV-G1. Предварительный иммунный ответ против wtPCMV не предотвращал реинфицирование хомячков рекомбинантным PCMV и приводил к иммунному ответу против SNV-G1, что показывает перспективность применения векторов на основе PCMV для создания видоспецифичных генетических вакцин.
ГЛАВА 2. Особенности локализации и взаимодействия рекомбинантных гликопротеинов хантавирусов Создание рекомбинантных плазмид для экспрессии гликопротеинов хантавирусов. Гены гликопротеинов G1 и G2 хантавирусов Andes (ANDV) и Sin Nombre (SNV) амплифицировали методом ОТ-ПЦР и клонировали в плазмиду pcDNA3 (Invitrogen) c помощью специфичных праймеров.
Открытая рамка считывания (ORF) сегмента М вируса ANDV получена асимметричным ПЦР из независимо клонированных генов G1 и G2 и клонирована в плазмиду pcDNA3. Далее гены гликопротеинов субклонировали в экспрессионный вектор pTM-1 (Fuerst, Niles, Studier and Moss, 1986). В результате были получены плазмиды pTM-1-AndG1, pTM-1 AndG2, pTM-1-SNVG1, pTM-1-SNVG2 и pTM1-AndM. Также была создана плазмида pTM-1-SNVG1tr, кодирующая урезанную форму гликопротеина SNV-G1 без цитоплазматического хвоста. Анализ полученных плазмид проводили методами рестрикционного анализа и ДНК-секвенирования.
Локализация хантавирусных гликопротеинов при независимой экспрессии. Первый этап работы был направлен на выяснение возможности независимой экспрессии гликопротеинов G1 и G2 c применением вектора pTM1 (Fuerst, Niles et al. 1986). Клетки CV-1 инфицировали рекомбинантным вирусом вакцинии vTF7-3 и трансфицировали плазмидами pTM-1, экспрессирующими гликопротеины G1 или G2. В установленное время клетки собирали, ресуспензировали в буфере для нанесения проб в системе Лэмли и наносили на 10% SDS-PAGE. Анализ экспрессии проводили методом вестерн-блоттинга с применением специфичных АТ. Полученные данные показывает экспрессию SNV-G2 в клетках через 6, 12, 24 и 48 часов после трансфекции. Рекомбинантный SNV-G2 мигрирует в геле так же, как и нативный белок в инфицированных клетках SNV Vero-E6.
Неинфицированные и инфицированные только вирусом vTF7-3 клетки CV- применяли в качестве отрицательного контроля. Показана экспрессия усечённого белка лишённого трансмембранного и SNV-G1tr, цитоплазматического доменов, которые, как считалось, содержат сигнал транспорта комплекса G1/G2 в аппарат Гольджи (АГ). АТ к SNV-G окрашивали 2 полоски с различными молекулярными массами. Похожую картину наблюдали ранее и для других хантавирусов (Spiropoulou 2001).
Гликопротеин G1 содержит 3 потенциальных сайта гликозилирования. Для подтверждения того, что две полоски соответствуют различным гликозилированным формам SNV-G1, клетки обработали различными концентрациями тунакомицина перед трансдукцией и трансфекцией плазмидой рТМ1-SNV-G1tr. Согласно вестерн-блоттингу, негликозилированная форма SNVG1Tr имеет мньшую молекулярную массу (49 кДа) в отличие от гликозилированной формы (57 кДа).
Рис. 3. Ко-иммунопреципитация гликопротеинов хантавирусов.
Клетки Vero-E6 инфицировали вирусом вакцинии vTF7-3 и трансфицировали плазмидами pTM1, экспрессирующими ANDV-G1 и SNV-G2. Клеточные лизаты использовали для иммунопреципитации с помощью анти-пептидных АТ кролика к SNV-G2, мембраны инкубировали с моноклональными АТ мыши к ANDV-G1. Панель А. 1 — ANDV-G1 и SNV-G2 ко трансфицированные клетки;
2 — клетки, инфицированные только вирусом вакцинии vTF7-3;
3 — клетки, трансфецированные плазмидой pTM1, не кодирующей рекомбинантных белков;
4 — клеточные иммунопреципитаты с помощью АТ кролика к ANDV-G2 и визуализированными на мембране моноклональными АТ к ANDV-G1. Панель Б. Авторадиография иммунопреципитата с помощью моноклональных АТ мыши к ANDV-G1 из лизата радиоактивно меченых клеток, инфицированных ANDV.
Чтобы показать, что G1 и G2 из двух различных штаммов хантавирусов обладают нативной конформацией и взаимодействуют друг с другом при ко экспрессии, мы провели эксперименты по ко-иммунопреципитации гликопротеинов. Результаты иммунопреципитации и вестерн-блоттинга показывают прочные взаимодействия между молекулами гликопротеинов из различных вирусов (Рис. 3).
Клеточная локализация гликопротеинов G1 и G2 хантавирусов при независимой экспрессии и ко-экспрессии. Мы исследовали внутриклеточную локализацию гликопротеинов ANDV и SNV с применением маркёра АГ — зоны Гольджи, и маркёра ЭР — кальнексина.
Иммунофлуоресцентный анализ показал, что при независимой экспрессии локализация G1 и G2 происходит не в АГ, а преимущественно в ЭР. При ко экспрессии гликопротеинов с применением двух плазмид или плазмиды, экспрессирующей GPC, локализация гликопротеинов происходит в АГ.
Аналогичную картину наблюдали и для внутриклеточной локализации гликопротеинов SNV. Полученные данные свидетельствуют о том, что транспорт и локализация гликопротеинов ANDV происходят по аналогии с вирусами HNTV и SNV и что экспрессия обоих гликопротеинов необходима для их правильной транспортировки в АГ (Pensiero, Jennings et al. 1988;
Pensiero and Hay 1992).
Ко-экспрессия гликопротеинов хантавирусов. Предыдущие результаты показывают, что для правильного транспорта хантавирусных гликопротеинов и для формирования гетеродимера необходимы их одновременная экспрессия и функциональное взаимодействие. Таким образом, у нас появился инструмент, позволяющий оценить взаимодействие гликопротеинов из различных хантавирусов. Мы провели ко-трансфекцию плазмид, экспрессирующих гликопротеины SNV-G1+ANDV-G2 и ANDV G1+SNV-G2. Аминокислотная гомология гликопротеинов G1 вирусов ANDV и SNV составляет 72%, а гликопротеинов G2 — 85%. На рисунке 4 показаны результаты иммуногистохимического анализа внутриклеточной локализации гликопротеинов из различных хантавирусов при их ко-экспрессии. На рисунке видно, что обе комбинации гликопротеинов приводят к правильной внутриклеточной локализации, а именно — в АГ. Полученные данные подтверждают ранее высказанные предположения Shi and Elliott и Spiropoulou et al., что сигнал локализации хантавирусных гликопротеинов в АГ, скорее всего, носит конформационный характер и строго не зависит от специфичной аминокислотной последовательности (Shi and Elliott 2002;
Spiropoulou, Goldsmith et al. 2003).
Рис. 4. Ко-экспрессия и внутриклеточная локализация рекомбинант ных белков разных хантавирусов. Гликопротеины хантавирусов окрашены зелёным, специфичные антигены АГ и ЭР — красным цветом. Ряды АБВ, ЁЖЗ — клетки, ко-трансфицированные плазмидами pTM1-SNV-G1 и pTM1 ANDV-G2. Ряд ГДЕ — клетки, ко-трансфицированные плазмидами pTM1 ANDV-G1 иpTM1-SNV-G2.
Обсуждение. Цель работы — исследование процессирования и транспорта гликопротеинов хантавирусов Нового Света. Также проведено исследование взаимодействия гликопротеинов G1 и G2 и роль конформационных взаимодействий при их транспортировке в АГ. В работе применяли гликопротеины G1 и G2 двух различных хантавирусов для доказательства гипотезы, что транспорт комплекса G1/G2 из ЭР в АГ зависит от конформации гликопротеинового комплекса. Для начала мы исследовали характер локализации гликопротеинов при экспрессии с отдельных кДНК.
Иммунофлуоресцентный анализ с применением АТ к хантавирусным антигенам и АТ к специфичным антигенам ЭР и АГ показал локализацию обоих гликопротеинов G1 и G2 хантавирусов ANDV и SNV при их независимой экспрессии в ЭР и отсутствие их дальнейшего транспорта в АГ.
При одновременной экспрессии двух гликопротеинов в результате ко трансфекции двух экспрессионных плазмид (для вирусов ANDV и SNV) или в результате экспрессии полного предшественника гликопротеинов GPС, кодирующего оба гликопротеина (для вируса ANDV), гликопротеины обнаружены в АГ. В общем, наши результаты исследования внутриклеточной локализации гликопротеинов ANDV и SNV подтвердили опубликованные ранее данные для вирусов SNV и HNTV (Ruusala, Persson et al. 1992;
Shi and Elliott 2002;
Spiropoulou, Goldsmith et al. 2003).
Большинство вирусов семейства Bunyaviridae созревают в АГ, но до сих пор нет согласия о типе сигнала локализации в АГ у данного семейства вирусов, хотя и достигнут значительный прогресс в картировании сигнальной последовательности для некоторых представителей семейства. В ранних работах, посвящённых транспорту гликопротеинов G1 и G2 вируса Bunyamwera, было выдвинуто предположение, что сигнал локализации в АГ находится в N-концевом участке GPC, соответствующего в данном случае G (Lappin, Nakitare et al. 1994). Та же сигнальная последовательность локализации в АГ обнаружена в трансмембранном домене и первых аминокислотных остатках цитоплазматического хвоста G1 вируса Punta Toro (Matsuoka, Chen et al. 1994). Для вируса Uukuniemi АГ-сигнал был картирован в первых 50 аминокислотных остатках цитоплазматического хвоста G1 (Andersson, Melin et al. 1997). Относительно недавно для вируса Hantaan было показано, что транспорт гетеродимера G1/G2 в АГ, по видимому, зависит от конформационных взаимодействий этих гликопротеинов, а не от специфичной аминокислотной последовательности (Shi and Elliott 2002).
Так как в дальнейшем мы планируем получение сегментных геномных гибридов (реассортантов) между патогенными и непатогенными хантавирусами с целью изучения механизмов, обусловливающих их патогенность, мы решили выяснить, могут ли гликопротеины из разных хантавирусов (ANDV и SNV) взаимодействовать и замещать друг друга.
Гомология аминокислотных последовательностей гликопротеинов G исследуемых вирусов составляет 72,2%, а гликопротеинов G2 — 85%. Мы показали, что гликопротеины G1 и G2 этих хантавирусов могут взаимодействовать в любых комбинациях с образованием транспортируемых в АГ комплексов (Рис. 4). Полученные данные свидетельствуют о том, что конформация образуемого комплекса G1/G2, скорее всего, отвечает за правильную транспортировку и удержанию комплекса в АГ. Важно, что транспорт и локализация гликопротеинов G1 и G2 при экспрессии с различных плазмид соответствует локализации гликопротеинов ANDV и SNV в инфицированных клетках Vero-E6, обычно применяемых для культивирования хантавирусов (Zaki, Greer et al. 1995), а также в первичной культуре клеток эндотелия лёгких человека.
*** Итак, присутствие обоих гликопротеинов G1 и G2 необходимо для их транспорта и накопления в АГ. Показано, что экспрессия отдельных гликопротеинов приводит к их локализации в ЭР, что подтверждает данные, опубликованные ранее Spiropoulou et al. (Spiropoulou, Goldsmith et al. 2003).
Впервые показано, что гликопротеины разных хантавирусов (ANDV-G1 + SNV-G2 или SNV-G1 + ANDV-G2) при ко-экспрессии могут взаимодействовать между собой с последующим транспортом в АГ, что свидетельствует об их конформационном взаимодействии. Полученные данные могут быть использованы при создании рекомбинантных вирусов, содержащих компоненты хантавирусов.
ГЛАВА 3. Невирусные системы доставки нуклеиновых кислот для терапии бокового амиотрофического склероза 3.1 Разработка рекомбинантных генетических конструкций Клонирование генов в экспрессионные плазмидные векторы.
Исходя из нуклеотидных последовательностей, полученных из базы данных GeneBank (http://ncbi.gov/GeneBank), были разработаны специфические праймеры для ПЦР-амплификации полных открытых рамок считывания генов сосудистого эндотелиального фактора роста человека (vegf), нейральной адгезии L1 мыши (mL1cam) и egfp. 5'- и 3'-праймеры содержат адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции, применяемые при клонировании генов в экспрессионный плазмидный вектор pcDNA3. Сайты рестрикции выбраны на основе анализа (Invitrogen).
последовательностей кДНК, полученных из GeneBank. В результате клонирования были получены плазмиды pcDNA-mL1CAM, pcDNA-VEGF и pcDNA-EGFP. Фрагменты ДНК, содержащие кДНК генов vegf, mL1cam и egfp субклонировали в двукассентый экспрессионный вектор pBudCE4. (Invitrogen). Отличительной особенностью этой плазмиды служит наличие двух независимых экспрессионных кассет, каждая под контролем эффективного конституционно активного промотора (промотор цитомегаловируса человека CMV и промотор фактора транскрипции человека EF1), позволяющих одновременно и независимо экспрессировать два рекомбинантных гена с одного плазмидного вектора. В результате субклонирования получены плазмиды pBud-EGFP-mL1CAM, pBud-VEGF EGFP и pBud-VEGF-mL1CAM (Рис. 3). Конечное подтверждение получения интересующих нас плазмид осуществляли с помощью секвенирования.
Приготовление образцов siRNA. Последовательность siRNA, специфичная для гена супероксиддисмутазы 1 человека (sod1), и соответствующий неспецифичный контроль созданы на основе результатов Raoul с соавторами (Raoul, Abbas-Terki et al. 2005). Синтез рибоолигонуклеотидов был проведён фирмой Синтол (г. Москва). Отжиг рибоолигонуклеотидов проводили в буфере (10 мМ Трис с рН 8,0, 10 мМ NaCl) инкубацией 1 мин при 90 °С с последующей инкубацией 1 час при 37 °С. Полученные дуплексы siRNA хранили при -20 °С.
3.2 Получение генетически модифицированных клеток мононкулеарной фракции пуповинной крови человека Выделение клеток мононкулеарной фракции из пуповинной крови человека. Заготовку пуповинной крови (ПК) проводили после получения информированного согласия у беременной и после тщательного дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток (в соответствии с Приказом Минздрава РФ от 14.09.2001 №364 об утверждении порядка медицинского обследования доноров крови и её компонентов).
Проведен сравнительный анализ выделения клеток мононкулеарной фракции ПК человека с помощью седиментации гидроксиэтилкрахмалом по Рубинштейну (Rubinstein, Dobrila et al. 1995), седиментация в градиенте плотности фиколла (Hawley, Hawley et al. 2004) и автоматическим выделением на сепараторе клеток “Sepax” фирмы Biosafe в соответствии с инструкциями производителя.
Рис. 3. Рестрикционная карта плазмиды pBud-VEGF-mL1CAM.
Во всех полученных образцах количество жизнеспособных клеток было не менее 97%. При исследовании образцов ПК (n=15) средним объёмом 67,8±8,5 мл мы установили, что количественный выход ядросодержащих клеток, выделенных методом седиментации гидроксиэтилкрахмалом, в среднем составил 4,4х108, а эритроцитов 4х1010 в образце. Количество ядросодержащих клеток при выделении методом седиментации в градиенте плотности фиколла (n=15, средний объём ПК 73,4±9,6 мл) в среднем составил 1,2х107, а эритроцитов 4х106 в образце. Количество ядросодержащих клеток при выделении автоматическим методом (n=15, средний объём ПК 70,1±10,4 мл) в среднем составил 5,6х108, а эритроцитов 2х1010 в образце.
Исходя из полученных нами данных, можно заключить, что — несмотря на то, что все три метода процессинга пуповинной крови широко применяют в банках пуповинной крови при заготовке концентрата стволовых клеток — для дальнейшего применения этих клеток в генной терапии лучше применять метод получения фракции мононуклеаров в градиенте плотности фиколла. В этом случае мы получали минимальное количество эритроцитов, присутствие которых может снизить эффективность трансфекции.
Выбор метода трансфекции клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека. Для выявления оптимальных условий генетической модификации стволовых клеток пуповинной крови нами были оценены 3 принципиально разных метода трансфекции.
1. Escort V (Sigma) трансфекционный реагент представляет собой полиэтилениминный (PEI) препарат, сорбирующий молекулы ДНК на поверхности положительно заряженных PEI наночастиц (Godbey, Wu and Mikos, 1999).
2. TransFast (Promega) трансфекционный реагент — представитель липосомного метода трансфекции, при котором молекулы плазмидной ДНК упаковываются в липидные визикулы (Felgner, Holm and Chan, 1989, Felgner and Ringold, 1989). При контакте ДНК-содержащих липосом с клеточной мембраной происходит слияние липидных слоев и внедрение генетического материала внутрь клетки.
3. Электропорация служит одним из физических методов трансфекции клетки (Shigekawa and Dower, 1988). При пропускании электрического разряда через среду, содержащую смесь клеток и ДНК, происходит образование временных пор в клеточной мембране и транслокация генетического материала. В работе применяли прибор Gene Pulser Xcell Total System (BioRad, USA).
Оптимизацию трансфекции мононуклеарных клеток ПК проводили в соответствии инструкциями производителей для суспензионных культур. Во всех проверенных методах процент выхода трансфицированных клеток был в диапазоне от 20 до 30%. В связи с тем, что электропорация не требует применения дополнительных химических препаратов и является наиболее биологически безопасным методом трансфекции клеток, применяемым в клинических приложениях, мы приняли решение использовать этот метод для дальнейшей работы по генетической модификации мононуклеарных клеток ПК человека.
3.3 Трансплантация генетически модифицированных клеток мононуклеарной фракции ПК человека трансгенным мышам G93A Трансгенные мыши. Линия мышей B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J создана в лаборатории Mark E. Gurney при Северо-западном университете США (Northwestern University, USA). B6SJL-TG(SOD1-G93A)dl1Gur/J (далее трансгенные мыши G93A) приобретены у компании Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). По договору с Казанским государственным медицинским университетом питомник при филиале института «Пущино» биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А.
Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН) отвечает за поддержание линии и производство трансгенных мышей B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J в РФ.
Ветеринарное свидетельство, выданное питомником лабораторных животных «Пущино», подтверждает качество полученных животных и их пригодность для экспериментальных исследований. Полугодовых пресимптоматичных мышей доставляли в Казанский государственный медицинский университет и содержали в стандартных условиях.
Рис. 5. Схема эксперимента по генетической модификации и трансплантации клеток пуповинной крови человека трансгенным мышам.
Трансплантация генетически модифицированных клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека трансгенным мышам G93A. Трансгенным животным (самки и самцы) на начальном этапе развития заболевания в стерильных условиях путём ретроорбитальной инъекции (1 миллион клеток в 200 мкл среды RPMI 1640) трансплантировали клетки пуповинной крови человека. Группе 1 вводили нетрансфицированные клетки мононуклеарной фракции из пуповинной крови человека;
группе вводили мононуклеарную фракцию клеток из пуповинной крови человека, трансфицированную плазмидой группе вводили pEGFP-N2;
мононуклеарную фракцию клеток из пуповинной крови человека, трансфицированную плазмидами, экспрессирующими нейрональную молекулу адгезии L1 и сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF.
Общая схема эксперимента представлена на рисунке 5.
Рис. 6. Имммуногистохимичес-кий анализ тканей поясничного отдела спинного мозга трансгенных мышей G93A. Иммуно гистохимическая реакция с АТ к HN. А — контрольная группа мышей через 2 недели;
Б — группа мышей через 2 недели после трансплантации генетически модифицированных клеток;
В — группа мышей через 2 месяца после трансплантации генетически немодифицированных клеток;
Г — группа мышей через 2 месяца после трансплантации генетически модифицированных клеток;
Д — группа мышей через 3 месяца после трансплантации генетически модифицированных клеток.
Гистологические исследования тканей трансгенных животных.
Перед проведением иммуногистохимического анализа мышей наркотизировали и перфузировали через большой круг кровообращения сначала холодным фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем — холодным 4% раствором параформальдегида, растворённого в PBS. Далее был проведён забор головного мозга, поясничного отдела спинного мозга и чувствительных ганглиев. Для гистологического исследования ткани мыши фиксировали в растворе параформальдегида. Препараты для иммуногистохимических исследований приготовили 2 методами: заливали в парафин и готовили фронтальные срезы головного мозга и продольные срезы поясничного отдела спинного мозга толщиной 10 мкм;
насыщали 30% раствором сахарозы, замораживали в заливочной среде TBS (Triangle Biomedical Science, Durham, NC) и готовили продольные срезы (25 мкм) поясничного отдела спинного мозга мышей на криостате при температуре 25 °С. Для исследования трансплантированных клеток применяли АТ к HLA АВС (HLA АВС, DAKO, Denmark), моноклональные АТ мыши к ядерному антигену человека (англ. human nuclei, HN) и к антигену CD34 человека (Novocastra). Результаты окрашивания показали присутствие клеток человека в головном и спинном мозге мышей. Иммунопозитивные клетки преимущественно локализовались в эндотелии сосудов. Однако часть клеток мигрировала через сосудистую стенку в нервную ткань.
В ходе иммуногистохимического анализа поясничного отдела спинного мозга были изучены процессы миграции, пролиферации, а также фенотипические характеристики трансплантированных клеток. С этой целью применяли АТ к HN, маркёру клеток человека, и к антигену CD34, маркёру эндотелиальных клеток. Иммунопозитивные по HN клетки были обнаружены вдоль стенок кровеносных сосудов поясничного отдела спинного мозга. При этом плотность HN-позитивных клеток была выше при трансплантации генетически модифицированных клеток, по сравнению с трансплантацией генетически немодифицированных клеток. Более того, через 2 и 3 месяца после приживления трансплантированных клеток плотность HN-позитивных клеток значительно возрастала по сравнению с плотностью клеток, отмеченной на сроке 2 недель после трансплантации (Рис. 6).
Иммуногистохимическая реакция с АТ к CD34 выявила, что HN позитивные клетки, локализованные в стенке кровеносных сосудов, экспрессируют молекулы CD34, что свидетельствует о дифференциацировке генетически модифицированных клеток в эндотелиальные клетки.
Клиническая оценка трансгенных животных. Тест силы хватки (англ.
grip strength test) проводили по описанной методике (Weydt, Hong et al. 2003).
Мышам, удерживая их за хвост, позволяют вцепиться всеми лапками в горизонтально расположенную металлическую решётку. После этого решётку медленно переворачивают таким образом, что мыши оказываются перевёрнутыми вниз головой, и фиксируют период времени до тех пор, пока животное не отцепится от решётки. Тест состоит из трёх попыток, из которых выбирают наибольший результат. Каждую мышь тестируют 2 раза в неделю с момента трансплантации до окончания эксперимента. Перед тестированием животных обучали проведению теста в течение двух недель.
В течение первых двух недель тестирования по результатам теста силы хватки не было выявлено различий в показателях экспериментальной нетрансфицированных клеток и трансплантация (трансплантация трансфицированных VEGF +L1 клеток) и контрольной групп животных. На данном этапе исследования анализ теста выявил уменьшение мышечной силы животных по сравнению с первоначальной на 34% в группе контрольных, на 41,4% в группе мышей с трансплантацией трансфицированных VEGF+L1 клеток, и на 36% в группе мышей с трансплантацией нетрансфицированных клеток.
3.4 Трансфекция siRNA в аксоны седалищного нерва трансгенных мышей G93A Эксперименты проводили на 36-недельных мышах с признаками паралича задних конечностей. Хирургические процедуры проводили под общим наркозом. Мышам перерезали левый седалищный нерв в средней трети бедра и на центральный отрезок нерва надевали силиконовую трубку длиной 5 мм. Трубку заполняли siRNA (специфичной к мРНК гена sod человека или соответствующей контрольной siRNA), а свободный конец трубки запечатывали вазелином. Трубку приклеивали к окружающим мышцам при помощи биологического клея (3M Vetbond), а затем рану зашивали. Экспериментальной группе мышей (n=3) вводили siRNA, специфичную к мРНК гена sod1 человека. Контрольной группе мышей (n=3) вводили неспецифичную siRNA, содержащую 2 нуклеотидные замены по отношению к последовательности гена sod1 человека. Схема эксперимента представлена на рисунке 7.
Рис. 7. Схема эксперимента по перерезке седалищного нерва мышей и введения препарата siRNA.
Через 24 часа после операции поясничный отдел спинного мозга извлекали для количественного анализа экспрессии генов с помощью ПЦР РВ. Аппликация sod1-специфичной siRNA приводила к снижению количества матричной РНК sod1 в соответствующей части спинного мозга на 48% в сравнении с контралатеральной (контрольной) стороной (n=3, p=0,032) (Рис. 8). Подавление экспрессии мРНК гена sod1 человека не оказывало влияния на экспрессию генов chat и snap25. После аппликации контрольной siRNA количество мРНК sod1 на оперированной и контралатеральной стороне не отличался.
Рис. 8. Количественный анализ экспрессии мРНК различных генов в правом и левом седалищных нервах оперированных трансгенных мышей G93A. siRNA: SOD1 — специфичная siRNA, подавляющая экспрессию гена sod1 человека;
SOD1mis — неспецифическая siRNA, содержащая 2 нуклеотидных замены относительно последовательности гена sod1 человека. Анализ проводили для правого (П) и левого (Л) фрагментов седалищного нерва. ПЦР-РВ проводили с применением праймеров и проб TaqMan, специфичных к мРНК гена sod1 человека, а также генов chat и snap25 мыши. Уровень экспрессии специфичных мРНК приведён по отношению к уровню экспрессии в правом седалищном нерве трансгенных мышей.
3.5 Обсуждение Нейротравма, ишемические инсульты, нейродегенеративные заболевания сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов, нарушением коммуникаций в нейронных сетях и контролируемых ими функций. Молекулярно-генетические и клеточные технологии — перспективные направления для предотвращения вторичной дегенерации и поддержания роста нервных волокон. Вирусные векторы широко применяют для доставки нейротрофических факторов для стимулирования нейрорегенерации. В настоящее время для повышения эффективности доставки в область повреждения нервной ткани факторов, поддерживающих выживание нейронов и стимулирующих рост нервных волокон, активно исследуют возможность применения генетически модифицированных клеток, трансфицированных генами нейротрофических факторов (BDNF, NT 3, GDNF), эритропоэтина и молекул адгезии (Chen, Hung et al. 2005).
Трансплантированные клетки, экспрессирующие клонированный ген, могут значительно усилить регенераторный потенциал органа-мишени.
Основанием для трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови для стимуляции регенерации нервной ткани служит их пригодность как для алло-, так и для аутотрансплантации у человека, их низкая иммуногенность, доступность, простота получения и хранения. Кроме того, в пуповинной крови присутствуют стволовые клетки, способные давать начало специализированным клеткам разных тканей. Так, стволовая кроветворная клетка может выходить из красного костного мозга, присутствовать в общем кровотоке и заселять, например, сердце, головной мозг, печень или скелетные мышцы. Далее, в зависимости от микроокружения, стволовая кроветворная клетка может дифференцировать в миобласты скелетной и сердечной мышечной ткани, гепатоциты, эндотелиальные клетки сосудов, нейроны, олигодендроциты, астроциты. Эффективность внутривенной инъекции клеток крови пуповины была исследована на модели бокового амиотрофического склероза у мышей. Клетки были обнаружены в местах дегенерации мотонейронов в спинном и головном мозге, при этом трансплантированные клетки экспрессировали нейральный фенотип (Garbuzova-Davis, Willing et al. 2003). Анализ первых клинических исследований по трансплантации больным боковым амиотрофическим склерозом стволовых клеток, выделенных из периферической крови, показал безопасность трансплантации и толерантность больных к трансплантированным клеткам (Mazzini, Fagioli et al. 2003). Следует, однако, отметить, что предварительные клинические испытания по трансплантации кроветворных стволовых клеток больным с боковым амиотрофическим склерозом не выявили явного терапевтического эффекта. В настоящее время существуют единичные экспериментальные работы по трансплантации генетически модифицированных клеток пуповинной крови для стимуляции регенерации сердечной мышцы и сосудов.
Наибольшее внимание уделяется возможности трансплантации клеток крови, генетически модифицированных геном Например, vegf.
трансплантация клеток пуповинной крови, трансфицированных геном vegf человека, стимулирует ангиогенез в тканях при моделировании хронической ишемии конечностей у крысы (Ikeda, Fukuda et al. 2004) и инфаркта миокарда у мышей (Chen, Hung et al. 2005).
Таким образом, с целью нейропротекции и стимулирования нейрорегенерации, получение и испытание генетически модифицированных клеток крови пуповины можно считать перспективным направлением генно клеточной терапии. При этом возможно тестирование множества конкретных подходов — применение различных клеточных популяций пуповинной крови, разные генетические модификации клеток перед трансплантацией, варианты по срокам, количеству и способу введения клеток (непосредственно в область травмы, в кровоток, в составе биоматрикса).
Данная работа была связана с получением генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека для лечения трансгенных B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза.
Для усиления терапевтического эффекта мононуклеарные клетки пуповинной крови были подвергнуты генетической модификации путём трансфекции плазмидными векторами, экспрессирующими гены нейральной молекулы адгезии L1 и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF.