Авторефераты диссертаций >> Авторефераты по Биологии

Pages: |

| 2 |

Посттрансляционная регуляция цитохромов р450 подсемейства 2в

-- [ Страница 1 ] --

на правах рукописи

ЗГОДА ВИКТОР ГАВРИЛОВИЧ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450 ПОДСЕМЕЙСТВА 2В 03.01.04 – БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК МОСКВА - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук

(ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Арчаков Александр Иванович Официальные Егоров Алексей Михайлович, доктор оппоненты: биологических наук, профессор, академик РАМН, МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, зав. лабораторией Ярыгин Константин Никитич, доктор биологических наук, профессор, член корреспондент РАМН, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией Сычев Дмитрий Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, профессор кафедры

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Научно исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства

Защита состоится 14 ноября 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу 119121, Москва, Погодинская ул., д.10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.

Автореферат разослан ”” июля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.010. кандидат химических наук Карпова Е.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Цитохромы Р450 (CYP) являются ключевыми ферментами первой фазы метаболизма и относятся к наиболее важными катализаторам окисления лекарственных препаратов. Р450 широко распространены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В настоящее время известны геномные последовательности более чем 18500 цитохромов Р450, составляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно.

Изоферменты цитохрома Р450 – представители разных семейств и подсемейств отличаются субстратной специфичностью и регуляторами их активности (ингибиторами и индукторами). В настоящее время у человека идентифицировано 57 форм цитохрома Р450 и 15 из них участвуют в метаболизме ксенобиотиков, включая 90% реакций I фазы метаболизма лекарств [Nelson et al, 2013].

Активность монооксигеназной системы в отношении того или иного лекарственного препарата определяется, главным образом, концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохрома Р450. Поэтому, индивидуальные особенности метаболизма лекарственных соединений определяются персональным профилем - концентрацией и активностью цитохромов Р450 [Арчаков и соавт., 2008].

Белки подсемейства CYP2B составляют 0,2-10% от содержания всех цитохромов Р450 в печени, при этом наблюдается высокая межиндивидуальная вариабельность концентрации данных белков [Hesse, 2004]. Согласно современным данным, активность CYP2B6 в микросомах печени человека варьирует в 80 раз [Wang et al, 2008]. Такие межиндивидуальные различия в концентрации CYP2B6 в печени и его ферментативной активности могут приводить к значительной вариабельности терапевтического действия множества лекарств, которые метаболизируются CYP2B6.

Благодаря достижениям молекулярной биологии, механизмы индукции генов, кодирующих СYP2B, изучены достаточно хорошо. Однако, концентрация белка и его активность определяются после синтеза полипептидной цепи на рибосомах. Такие посттрансляционные события, как фолдинг, модификации первичной структуры и, наконец, деградация белка являются определяющими для реализации монооксигеназной функции Р [Aguiar, 2005]. Однако данные механизмы исследованы значительно хуже.

Для определения сложных, многокомпонентных изменений, которые происходят в посттрансляционной судьбе белков, необходимо использовать методические подходы, при которых возможно регистрировать сотни и тысячи белков. Одним из таких подходов является протеомика, которая позволяет идентифицировать и выявлять количественные и качественные изменения в белковом составе клеток и тканей.

В настоящей работе для изучения посттрансляционной регуляции P использовался экспериментальный подход, основанный на комбинации протеомных высокопроизводительных методов и последующей верификации полученных данных с использованием модельных экспериментальных систем.

Цель работы: определение молекулярных механизмов посттрансляционной регуляции микросомальных цитохромов Р450 и взаимодействий белков монооксигеназной системы печени с клеточными компонентами, отвечающими за фолдинг, окислительную модификацию и деградацию белков на примере ферментов подсемейства CYP2B Основные задачи исследования:

1. Провести экспериментально обоснованный выбор метода протеомного анализа мембранных белков и их количественной оценки.

2. Исследовать влияние индукторов Р450 на изменение в белковом составе клеток печени.

3. Определить роль цитозольных факторов и микросомальных белков клеток печени в встраивании гема в апобелок CYP2B.

4. Исследовать молекулярные механизмы посттрансляционной окислительной модификации CYP2B.

5. Исследовать механизмы протеолитической деградации нативного и модифицированного СYP2B.

Научная новизна.

С использованием разработанного высокопроизводительного протеомного метода установлено, что введение индукторов цитохромов Р (фенобарбитала и 3-метилхолантрена) приводит значительному изменению белкового профиля в ходе индукции цитохрома Р450 в печени мыши.

Установлен молекулярный механизм сборки полипептидной цепи и гемовой части CYP2B в структурно- и функционально-активный фермент.

Изучены окислительные посттрансляционные изменения цитохрома Р и возможное влияние этих изменений на время жизни белка. Предложен механизм, по которому проходит деградация белков подсемейства цитохромов CYP2В, и показана роль определенных участков аминокислотной последовательности белка в механизме определении пути деградации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фармакологическая индукция Р450 сопровождается увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы;

шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы;

антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

2. В сборке функционально активного холофермента Р450 участвуют эндогенный восстановленный глутатион и шаперон GRP94.

3. Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода (АФК), которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых CYP2B.

4. В реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома CYP2B с АФК приводит к химической модификации трех из четырех остатков цистеина цитохрома и образованию белковых агрегатов. Данные модификации являются сигналом для протеаз, ответственных за деградацию белков надсемейства.

5. Катаболизм CYP2В в модельных дрожжевых системах включает протеасомный либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. В дрожжах, дефицитных по вакуольным (лизосомным) ферментам скорость деградации CYP2B значительно снижается. При внесении мутаций в первичную структуру CYP2B скорость его деградации значительно увеличивалась за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.

Научно-практическая значимость работы. Разработанные методические подходы протеомного анализа могут быть использованы в работах по поиску маркеров заболеваний и анализу белкового состава биологических объектов.

Поскольку цитохромы Р450 активно участвуют в окислении ксенобиотиков (в том числе лекарственных соединений), знание посттрансляционных молекулярных механизмов, контролирующих функцию монооксигеназной системы, может быть использовано при разработке лекарственных соединений и для оптимизации и персонализации фармакотерапии.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях:12-th International symposium on microsomes and drug oxidations (Montpellier, France, 1998);

International workshop “From Sequence to function: Experimental and Bioinformatic Studies of Cytochrome P450 Superfamily” (Moscow, 2000);

12-th International Conference on Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology (France, 2001);

International Meeting on Proteome Analysis (Munchen, 2001);

International Conference Genomics and Bioinformatics for Medicine (St.Peterburg-Moscow, 2002);

13-th International Conference on Cytochromes P450 (Prague, 2003);

2nd International Сonference “Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine” (Moscow-Ples-Moscow, 2004);

14th International conference on Cytochromes P450: biophysics and bioinformatics (Dallas, USA, 2005);

HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (КНР) в 2004 г;

3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., HUPO 7th Annual World Congress в Амстердам (Нидерланды) в 2008 г., 4-ая международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., HUPO 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г.;

HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., Taiwan-Russia Research Cooperation Symposium “New mass spectrometry methods in proteomics” в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 научных работ в российских и иностранных научных изданиях, в том числе 46 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, и 23 публикации в докладах научных конференций. Индекс Хирша составляет 12 по данным систем «Scopus» и «Web Of Science».

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 293 страницах печатного текста, содержит 8 таблиц и 35 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассмотрены методические подходы протеомного анализа и особенности анализа белков клеточных мембран. Описаны основные достижения в области протеомики белков монооксигеназной системы печени, а также количественной оценки их содержания методами масс-спектрометрии. Обсуждены вопросы активации Р450 посредством сборки апобелка с гемовой частью. Описаны данные по посттрансляционной окислительной модификации белков и влияние этих изменений на деградацию белков надсемейства Р450.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Среда для культивирования дрожжей была получена в «BD Biosciences Clontech» (США). Реагенты для клонирования, ферменты рестрикции, лигазы, полимеразы приобретены в «New England BioLabs» (США). Поликлональные антитела кролика (IgG) заказаны коммерчески и получены против очищенного препарата CYP2B1 и выделены из сыворотки иммунизированных животных с использованием иммуноафинной хроматографии на Protein A-Sepharose («SigmaAldrich», США) по методике, рекомендованной производителем. Affigel-10 получали от «Bio-Rad» (США).

Гелданомицин предоставлен «Drug Synthesis and Chemical Branch, Developmental Therapeutics Branch, NCI». 7-Пентоксирезоурфин и резуорфин от «Molecular Probes» (Eugene, США). Очищенный человеческий Hsp90, крысиные моноклональные анти-GRP94 IgG антитела и кроличьи поликлональные анти-GRP78 IgG антитела получены от «StressGen Biotechnologies» (Victoria, BC, Канада). Мышиные и крысиные моноклональные анти-Hsp90 IgG антитела любезно предоставлены проф.

David O. Toft (Mayo Clinic, Rochester, США) и проф. William Welch (UCSF, США), соотвественно. Очищенный GRP94 предоставлен проф. Christopher Nicchita (Duke University, Durham, США). Дрожжевые штаммы были любезно предоставлены профессором Randy Hampton (University of California, San Diego, CA).

Индукция белков микросомальной системы, выделение микросомальных фракций. Крысам (Sprague–Dawley, самцы) или мышам (Albino mice, самцы) вводили внутрибрюшинно раствор натриевой соли фенобарбитала (80 мг/кг веса) или раствора 3-метилхолантрена в кукурузном масле из расчета 50 мг/кг веса, ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным вводили изотонический раствор или масло, соответственно. Через 24 часа после последней инъекции животных забивали декапитацией.

Выделенную печень перфузировали холодным (40С) изотоническим KCl и готовили гомогенаты с использованием гомогенизатора Даунса в 2-х кратном объеме калий фосфатного буфера 0.1 M, pH 7.4. Выделение микросом и цитозольной фракции из гомогенатов использовали дифференциальное центрифугирование по методу, описанному в [Zgoda et. al., 2002].

Очищенный препарат цитохрома P450 2B4 получали по методу (Karuzina et al. 1999). НАДФН-цитохром-P450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi и Masters [Yasukuchi, Masters, 1976].

Протеомные методы анализа. Одномерный денатурирующий электрофорез. Разделение белков микросом проводили с помощью одномерного электрофореза в редуцирующих условиях в градиентном 9– 16%-ном ПААГ (концентрирующий гель содержал 4% акриламида) длиной 20 см и Tris-глициновом буфере по Лэммли. Электрофорез проводили в следующих условиях: 10 мА – в концентрирующем геле, 20 мА – в разделяющем геле при водяном охлаждении камеры до 100С.

Двумерный электрофорез фракции микросом. Перед постановкой двумерного электрофореза осадки микросом осаждали смесью метанол/хлороформом и растворяли в буфере, содержавшем 8 М мочевины, М тиомочевины, 2% амфолинов (рН 3–10), 100 мМ ДТТ, 16,7% раствора (30% СHAPS + 10% NP 40) для полного растворения белков, находящихся в образце. Образцы центрифугировали при 15 000 g 15 мин. Разделение в первом направлении проводили по методу, описанному в [Zgoda et al, 2006].

После проведения разделения белков ПААГ визуализировали по методу, описанному [Shevchenko, 1996]. Полученные данные анализировались с помощью программы Mellanie II («GeneBio», Швейцария). Гидролиз и экстракцию белков микросом из геля проводили по протоколу, описанному в [Jensen, et. al., 1999]. Масс-спектрометрический анализ с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра проводили в условиях, описанных в [Zgoda et al, 2006].

Масс-спектрометрический анализ с использованием SDS-PAGE LC ESI –MS/MS. Из одномерного геля вырезали полосы, гидролиз и экстракцию пептидов из геля проводили по протоколу, описанному в [Jensen et. al., 1999].

Обращенно-фазовую жидкостную хроматографию и тандемную масс спектрометрию осуществляли на приборе Agilent 1100 nanoflow HPLC-Chip Cube в сочетании с Agilent 1100 XCT Ultra Series MSD ионной ловушкой (Agilent, США).

Обработку тандемных масс-спектров и идентификацию белков проводили с помощью программы Spectrum Mill MS Proteomics Workbench Rev A.03.03.078 (Agilent), с использованием базы данных Swiss-Prot. Были заданы следующие поисковые параметры: расщепляющий фермент - трипсин, точность определения масс моноизотопных пептидов ±200 ppm, точность определения масс в спектрах MS/MS ±0,5 Да и возможность пропуска двух сайтов расщепления. Окисление метионинов было учтено как возможная модификация пептидов. Были выбраны следующие критерии положительной идентификации: минимум два пептида, идентифицированных со счетом 7 и суммарный счет по белку 14.

Трехмерную жидкостную хроматографию (3D-LC) проводили, используя устойчивую к нагреванию mRP-колонку как первый шаг разделения. Разделение белков проводили на хроматографе LC 1100 Agilent, используя mRP-C18 колонку (4.6 мм 50 мм, Agilent). Разделения проводили с помощью линейного градиента ацетонитрила при 80°C. Скорость потока составляла 0,75 мл/мин, детекцию проводили по поглощению при 280 нм.

Каждую фракцию белков упаривали, используя вакуумный концентратор 5301 (Eppendorf, Германия). Белки растворяли в 50 мМ гидрокарбонате аммония и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение минут при 4°С. После трипсинолиза (1 мкг фермента/100 мкг белка, 37°С в течение часа, затем 2 мкг/100 мкг белка, 37°С на всю ночь) к приготовленным растворам добавляли муравьиную кислоту до конечной концентрации 1%. Затем приготовленные растворы упаривали, используя вакуумный концентратор 5301 (Eppendorf, Германия), растворяли в 0,1% муравьиной кислоте и анализировали с помощью 2D LC-MS/MS, как описано в [Zgoda et.al, 2009] Структурное и функциональное восстановление CYP2В1 in vitro.

В экспериментах по изучению роли Hsp90 в восстановлении 2В1 для удаления балластных белков препараты микросом обрабатывали 0.075% холатом натрия [Zgoda et. al., 2002]. Гомогенаты печени или микросомы инкубировали с 50 мкМ гемином. Активность восстановленного гемином Р450 в микросомах определяли по маркерным субстратам CYP2B1: 16 окисление тестостерона (нмоль 16-OHT/мг белка/мин) и пентокси резоруфин-о-деметилирование (PROD) (нмоль резоруфина /мг белка/мин), как описано ранее [Zgoda et. al., 2002].

Обработка цитозоля GA-агарозой.

Гелданомицин (GA) дериватизировали и иммобилизировали на Affigel- агарозе по методике, описанной ранее [Whitesell et al, 1999]. Аликвоты супернатанта инкубировали с GA-агарозой (50 µl, 50% цитозоль, 50% агароза) на качающейся платформе при 40C в течение 1 часа. Агарозу осаждали центрифугированием при 5000g в течение 1 мин. Аликвоты полученного супернатанта использовали для реконструкции 2В1, SDS– PAGE-электрофореза и для проведения иммуноблотинга с анти-Hsp90 IgG антителами.

Связанные с агарозой белки элюировали Лемли буфером и анализировали с использованием SDS–PAGE и окрашиванием серебрением.

Супернатант фракционировали на C18 Dynamax-100A колонке (250х4. мм) (Varian, США) уравновешенной 0.1% TFA в H2O (буфер А). Регистрацию вели на проточном спектрофотометре при длине волны 214 нм. Разделение соединений достигалось градиентом буфера Б (80% ацетонитрил в H2O, содержащий 0.1% TFA) от 0 до 70% в течение часа при потоке 1 мл/мин.

Фракции собирали по 1 мл и высушивали на центрифужном испарителе.

Восстановленные в 0.1 M калий фосфатном буфером (pH 7.4) хроматографические фракции использовали для исследования гемин зависимого восстановления активности Р450. Фракции, инкубация с которыми восстанавливала активность CYP2В1, анализировали на ЯМР спектрометре в дейтерированном хлороформе на приборе Varian Unity 400 по методике, описанной в [Correia, 1984].

Эффект GA и GSH на гемин-зависимое восстановление CYP2B1.

GA (0–200 мкМ, конечные концентрации) растворяли в DMSO или использовали только DMSO (контроль) и инкубировали с супернатантом (SN) (15 мг белка/мл) на качающейся платформе при 40С в течение 1 ч.

Микросомы печени (10 мг белка/мл;

20 мкл) полученные от PB индуцированных или PB/AIA-крыс, инкубировали в присутствии или в отсутствии гемина в водяной бане при 370C в течение 15 мин. Активность CYP2B1 после гемин-зависимого восстановления измеряли по скорости образования 16-гидрокситестостерона в контрольных и гемин восстановленных образцах микросом по методике, описанной выше.

Вестерн Блот Hsp90, GRP94, GRP78, ERp29, СYP2B1.

Микросомы печени или цитозоль (5 мкг белка) полученные от PB и PB/AIA-крыс подвергали SDS–PAGE-электрофорезу. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом электропереноса при 100V в течение 1 ч. Мембраны блокировали 3% желатином в TBS;

pH 7,5 в течение 1 ч и затем инкубировали с моноклональными анти-Hsp90, анти-GRP94, анти GRP78, анти-ERp29, анти-2В1, моно- или поликлональными антителами (первичные антитела) в TBS, содержащем 0,05% Tween 20 (TBST) и 1% желатин. После двух часов инкубации с первичными антителами нитроцеллюлозные мембраны отмывали дважды TBST и добавляли АР конъюгированные вторичные антитела в 1% желатине в TBST. Блоты визуализировали и набором для окрашивания (Био-Рад).

Окрашенные блоты сканировали на денситометре и оценивали количественно с использованием стандартного программного обеспечения.

Мономеризацию CYP2B4 и НАДФН-цитохром-P450 редуктазы проводили по методу Bachmanova и соавт [Bachmanova et al, 1986].

Концентрацию цитохрома P450 и b5 измеряли на спектрофотометре «Hewlett Packard» 8451A (США) по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО-комплекса при длинах волн 450 и 490 нм [Omura and Sato, 1964]. При расчетах использовали коэффициенты молярной экстинкции 91 и 165 мМ-1 см-1, соответственно.

Скорость реакции N-деметилирования бензфетамина в мономерной реконструированной системе измеряли по накоплению конечного продукта реакции – формальдегида [Nash, 1953]. Концентрацию перекиси водорода измеряли тиоцианатным методом [Thurman et al, 1972]. Содержание общего гема определяли пиридингемохромогеновым методом [Omura, Sato, 1964].

Содержание гема, связанного с цитохромом P450, измеряли методом гель проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке BioSil Sec250 фирмы «BioRad», США. Содержание гема в элюате регистрировали с помощью спектрофотометра с проточной кюветой Waters 991 при 418 нм.

Молекулярную массу цитохрома P450 измеряли в процессе проведения гель-фильтрации на колонке Biosil Sec250 (0,75х60 см) фирмы «BioRad» (США). Колонку уравновешивали 100 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 7,4), содержащим 0,025% эмульген 913, и наносили на колонку 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 3,3 мкМ цитохром P450. Элюцию белков МРС проводили в условиях, описанных в [Згода и соавт., 1997].

Образование карбонильных групп регистрировали по методу Levine и Federici. [Levine, Federici, 1982].

Определение содержания SH-групп цистеинов проводили с использованием пиренмалеимида в качестве флюоресцирующей метки с применением метода пептидного картирования [Weltman, 1973].

Плазмиды для экспрессии CYP2B1. cDNA CYP2B1 крысы амплифицировали с использованием ПЦР и клонировали в pYES2/CT (URA меченные, под контролем дрожжевого GAL1-промотора) и pYcDE-2 (TRP меченные, под контролем дрожжевого ADH1-промотора). В результате клонирования были получены дрожжевые экспрессионные плазмиды pYES2 и соответственно. Экспрессионный вектор 2B1 pYcDE-2B1, pKKCYP2B1(His)4, кодирующий полноразмерную последовательность гемопротеина CYP2B1 с заменами Glu2 на Ala для оптимизации экспрессии любезно предоставлены профессором J. R. Halpert (University of Texas, Galveston, TX).

Трансформация дрожжевых клеток плазмидами. Трансформацию проводили по протоколам, описанным в Gietz и Schiestl (Gietz, Schiestl, 1995).

Условия ведения культуры дрожжей описаны ранее в [Murray et al., 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнение методов протеомного анализа мембранных белков.

Основной задачей протеомики является инвентаризация белков, которые экспрессируются в клетке. Согласно современным представлениям, более 30% всех белков являются мембранными. Интерес исследования мембранных белков обусловлен не только их широкой представленностью в клетке, но также важностью функций, которые они выполняют. Межклеточные взаимодействия, рецепторные функции, передача сигнала от внешнего воздействия внутрь клетки - это лишь незначительный перечень функций белков мембран.

Для определения наиболее эффективного протеомного метода для анализа мембранных белков использовали препараты микросом печени. Часть препарата использовалась для проведения 2D-электрофореза (2DE) и последующей идентификацией белков методом MALDI-TOF. Другая аликвота микросом использовалась для предварительного разделения белков методом SDS-PAGE с последующим вырезанием полос, гидролизом белков в геле и анализом экстрагированных пептидов посредством жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS).

Для выполнения безгелевых протеомных исследований методом двумерной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (2D LC-MS/MS) гидролизованные трипсином белки микросомальной фракции анализировали последовательным разделением смеси пептидов. На первом этапе разделение достигалось методом хроматографии на сильном катионнообменном носителе. На втором этапе с разделением методом обращенно-фазовой хроматографии и одновременной детекцией тандемных масс-спектров пептидов.

Для анализа методом трехмерной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (3D LC-MS/MS) белки, соллюбилизированные из мембран, хроматографировали при 800С на термостабильной mRP колонке.

Собранные в ходе разделения четыре белковые фракции гидролизовали трипсином и анализировали методом 2D LC-MS/MS. Идентификацию белков проводили c использованием программного обеспечения SpectrumMill со значением оценочного параметра равного 14, обеспечивающего уровень ложно-положительных идентификаций менее 0.01%. Кроме того, согласно рекомендациям комитета HUPO, идентификация считалась достоверной, при использовании двух и более протеотипических пептидов. Общее число белков, идентифицированных во всех экспериментах по анализу протеома микросомальной фракции печени, составило 4142. Сравнительный анализ данных, полученных при использовании всех четырех протеомных подходов, показал, что большая часть белков (3703) была идентифицирована при использовании метода 3D LC-MS/MS (табл. 1). Применение методов 2-D LC MS, SDS-PAGE-LC-MS и 2DE позволили идентифицировать 1410, 519 и белков, соответственно.

Воспроизводимость результатов имеет важное значение для сравнительной протеомики, т.к. только повторяющиеся белковые идентификации могут быть использованы для сопоставления данных. Как видно из таблицы 1, с точки зрения воспроизводимости наилучший показатель оказался у метода, основанного на 3D-LC-MS/MS, для которого абсолютное число белков, идентификация которых совпала во всех трех повторениях, составила 964, что превышает значения данного показателя у SDS-PAGE-LC-MS/MS и 2D LC MS/MS (213 и 451 белков, соответственно) (см. табл. 1).

Таблица 1. Эффективность протеомных методов анализа.

Способ Число Число белков, Число белков, идентифици- Число идентифици разделения идентифициро идентифи- рованных с предсказан- рованных СYP ванных цированных в ными трансмембранными спиралямиа) (доля) белков трех повторах каждого метода 125 -- 11 (9%) 2DE 519 213 138 (27%) SDS-PAGE 1410 451 295 (21%) 2D-LC 3703 964 659 (18%) 3D-LC а) Трансмембранные спирали предсказывали посредством http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/.

При анализе мембранных фракций клетки всегда встает вопрос о способности того или иного протеомного метода идентифицировать гидрофобные белки. Поэтому следующим параметром, по которому проводилось сравнение протеомных методов, явилась их способность идентифицировать белки с трансмембранными фрагментами. Поскольку аннотации белков в доступных публичных ресурсах содержат, главным образом, данные о внутриклеточной локализации белков без указания на то, является белок трансмембранным или прикрепленным к мембранам, мы использовали методы предсказания трансмембранных фрагментов белков.

Данные методы основаны на анализе первичной структуры белка и точность предсказания достигает 90-95% (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM 2.0/).

Так, наибольшая доля мембранных белков наблюдалась при использовании метода SDS-PAGE (табл. 1). При этом абсолютное число мембранных белков, обнаруженных при использовании этой технологии, равно 138-ми, а при применении безгелевых методов анализа 2D-LC-MS/MS и 3D-LC-MS/MS, соответственно 295 и 659. Среди мембранных белков цитохромы Р450 занимают особое место вследствие важности выполняемой ими функции биотрансформации эндогенных и экзогенных субстратов. Всего в геноме мыши расшифровано 55 последовательностей белков надсемейства Р450. При этом для 46 из них показана экспрессия генов в печени. С использованием 3D-LC-MS/MS-подхода удалось идентифицировать изоформ P450 или 83% от числа цитохромов Р450 печени (табл. 1).

Таким образом, наиболее информативным методом анализа сложных смесей, содержащих мембранные белки, является 3D-LC-MS/MS.

Влияние индукторов Р450 на изменение белкового состава клеток печени мыши.

Как было показано выше, использование метода 3D-LC-MS/MS предоставляет наиболее полную информацию о белках, экспрессированных в клетках печени. Протеомный анализ с использованием данного подхода проводили на девяти образцах микросом и цитозольных фракций ( контрольных, 3 индуцированных фенобарбиталом (ФБ) и 3 индуцированных метилхолантреном (МХ)), при этом каждый из образцов являлся результатом объединения трех гомогенатов ткани печени мышей.

В ходе протеомного анализа гидролизованных трипсином фракций удалось идентифицировать 3234 и 2854 белка в микросомальной фракции и цитозоле, соответственно. Из них только белки, которые встречались во всех трех повторах, использовали для дальнейшего анализа.

По результатам общего протеомного профилирования количественная оценка может быть проведена путем непосредственного сравнения интенсивности масс-спектрометрических сигналов (площади под хроматографическими пиками). Для достоверного проведения количественного анализа белков или пептидов без применения изотопных меток необходимо использовать среднее значение интенсивностей минимум 4-х протеотипических пептидов, идентифицирующих белок [А. Копылов и соавт., 2009]. В ходе статистического анализа было выявлено 18 белков микросом и 26 белков в цитозольной фракции, содержание которых достоверно изменялось более чем 2 раза при введении индукторов Р450. При этом 9 белков с измененным содержанием относились к белкам монооксигеназной системы печени. На рисунке 1 представлены результаты количественной оценки содержания Р450 в микросомах контрольных и индуцированных образцов. Видно, что при введении мышам ФБ наблюдалось увеличение концентрации CYP 2B10, 2B19, 2C29, 2C32, 3A11 и 3А13 от двух до семи раз. При использовании МХ в качестве индуктора, наблюдалось статистически значимое увеличение содержания только двух цитохромов Р450 1A1 и 1A2 в 3,2 и 5 раз, соответственно. При этом для NADPH-редуктазы наблюдалось двукратное увеличение концентрации в ФБ индуцированных пробах, а для цитохрома b5 это увеличение было незначительно (менее 30%).

Проведенный анализ количественных изменений белков монооксигеназной системы в ходе индукции показал совпадение полученных результатов с литературными данными, что подтверждает эффективность разработанного метода количественного протеомного анализа без использования изотопных меток [Москалева и соавт., 2011].

Рис 1. Количественная оценка содержания Р450 в контрольных микросомах ( ) и индуцированных МХ ( ) или ФБ ( ) образцах.

Наряду с ожидаемыми результатами изменения содержания белков монооксигеназной системы, также наблюдалось значительное увеличение концентраций белков с шапероновой функцией. В таблице 2 представлены белки, которые участвуют в сворачивании белков и уровень которых статистически значимо изменялся при введении индукторов Р450 более чем в 2 раза.

Как видно из таблицы, в ходе индукции ФБ и МХ наблюдалось увеличение концентрации для пяти из шести белков шапероного ряда, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и только для одного белка - ERP57 зарегистрировано снижение содержания. При этом наибольшее увеличение зарегистрировано для GRP-94 – 6,2 и 4,4 раза по сравнению с контролем в образцах ФБ и МХ, соответственно. Для двух шапероновых белков цитоплазмы содержание изменялось разнонаправлено: HSP 90 - снижение в 2,1 раза в МХ пробах, а концентрация Stress-induced-phosphoprotein повышалась в 4,1 и 1,3 раза в ФБ- и МХ-образцах, соответственно.

Таблица 2. Список шапероновых белков, содержание которых изменялось при введении индукторов Р450 более чем в 2 раза.

№ Название белка, ID Локализация ФБ/Контроль* МХ/Контроль 2.50.5 2.50. ЭР 1 Grp170 Q9JKR 6.20.15 4.40. ЭР 2 GRP-94, P 2.10.21 1.40. ЭР 3 GRP-78, P 2.10.31 1.80. ЭР 4 CRP55, P 2.800.76 2.020. ЭР 5 Protein disulfide-isomerase P 3.10.03 0. 30. ЭР 6 ERP57 protein P 2.10. Цитоплазма 7 Heat shock protein HSP 90, 1.10. P 4.1 0.5 1.3 0. Цитоплазма, 8 Stress-induced-phosphoprotein Q60864 (цит, ядро) ядро *Средние значения и стандартные отклонения получены по результатам 3-х независимых экспериментов протеомного профилирования цитоплазменной фракции и теней микросом клеток печени.

Среди белков с измененной экспрессией можно выделить ряд белков, выполняющих функцию защиты клетки от окислительного стресса. Так, содержание каталазы, СОД и пероксидоксина увеличивалось более чем в раза при введении индукторов. Также наблюдалось увеличение содержания белков, восстанавливающих или защищающих SH-группы белков от окисления (Таблица 3, номера 1-9), а также ряда других белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки (Таблица 3, номера 9-27).

Таким образом, с использованием разработанного протеомного 3D LC MS/MS-метода показано, что индукция Р450 ФБ-лом или МХ-ном сопровождается увеличением содержания белков 4-х групп:

1. собственно белков монооксигеназной системы;

2. шаперонов, потенциально участвующих в фолдинге белков монооксигеназной системы;

3. белков, защищающих клетку от окислительного стресса (каталаза, СОД, пероксидазы);

4. белков домашнего хозяйства, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

Таблица 3. Список белков, содержание которых изменялось более чем в 2 раза при введении индукторов Р450.

Название белка, ID Локализация PhB/Контроль 3-MC/Контроль № 2.40.6 3.60. Цитоплазма Catalase, P 61.5 8. 31. Цитоплазма SOD I, P 2.40. Цитоплазма peroxiredoxin 6, O 3 1.70.5 3.11. Цитоплазма glutathione peroxidase, P 1.80.3 2.10. Цитоплазма Thioredoxin 1, Q8VBT0.

2.90.3 30. Цитоплазма Glutathione S-Transferase, Q5RL 5.1 0.3 0.10. Мethionine sulfoxide reductase Q9JLC3 Цитоплазма 20. Цитоплазма Selenium binding protein 2 (AP56) Q63836 10. 20. Цитоплазма Selenium binding protein 1 (SP56), P17563 0.90. 0.150. Цитоплазма Fatty acid synthase, O89060 10. 0.320.04 0.490. Цитоплазма Phosphoglucomutase2, B0LAB UDP-glucose pyrophosphorylase 2, 0.060. Цитоплазма 0.170. 12 Q91ZJ 0.390. Цитоплазма Enolase1,alpha non-neuron, Q5FW 13 1.080. S-adenosylhomocysteine hydrolase, 0.360. Цитоплазма 0.530. 14 Q5M9P 0.380. Цитоплазма Sorbitol dehydrogenase, Q64442 0.570. 0.500.05?

Цитоплазма Glycine N-methyltransferase Q9QXF8 0.710. esterase D/formylglutathione hydrolase;

0.420. Цитоплазма 0.270. 17 Q9R0P 2.170. Цитоплазма Carbonic anhydrase 3, P16015 0.970. 1.540.17 0.570. Цитоплазма Fthfd protein, Q8CIF Цитоплазма malate dehydrogenase 1, P08249 0.630.12 0.770. 0.120. Цитоплазма Lactoylglutathione lyase Q9CPU0 0.490. 3.280. Цитоплазма Fatty acid binding protein 1, liver P12710 1.190. 0.50. ЭР 23 Interferon-inducible GTPase, Q9QZ85 10. 2.90.5 1.80. ЭР 24 progesterone receptor membrane component, O 6.41.1 3.90. ЭР 25 Major urinary proteins, P 2.10.7 0.50. Цитоплазма Cytosol aminopeptidase Q9CPY 2.10.5 0.30. Цитоплазма Dpys protein Q8K0X *Средние значения и стандартные отклонения получены по результатам 3-х независимых экспериментов протеомного профилирования цитоплазмы и теней микросом клеток печени.

Роль цитозольных факторов и мембранных белков клеток печени в встраивании гема в апобелок CYP2B.

Из представленных выше результатов следует, что увеличение синтеза белков моноксигеназной системы сопровождается увеличением концентрации целой группы белков, выполняющих шапероновую функцию и локализованных в ЭР. Поэтому можно предположить, что данные белки участвуют в фолдинге и сборке гемовой части и полипептидной цепи индуцированных Р450.

С целью проверки данной гипотезы использовали экспериментальную модельную систему обратимой инактивация цитохрома Р450.

Ранее было показано, что введение суицидного ингибитора цитохромов Р450 аллилизопропилацетамида (AIA) крысам ведет к инактивации изоформы 2В1. Кроме того, инактивированный Р450 может быть структурно и функционально восстановлен in vitro при инкубации экзогенного гемина с гомогенатами печени [G.C. Farrell, M.A. Correia, 1980]. Однако, если раствор гемина добавляли к выделенными микросомам, содержащим инактивированный CYP2B1, данного восстановления не происходило. Из этого следует, что для восстановления характерных спектральных свойств и активности белка необходимы факторы, локализованные в гомогенате печени, но отсутствующие в выделенных центрифугированием микросомах.

Таким образом, инактивация цитохрома CYP 2В1 может служить моделью для изучения механизмов фолдинга и сборки гемовой и апочасти данного фермента.

Гемин-зависимое структурное и функциональное восстановление AIA инактивированного микросомального CYP2B1.

Разрушение гема Р450 проводили посредством внутибрюшинного введения крысам, предварительно прошедших индукцию AIA фенобарбиталом в течение 5 дней. Как видно из данных, представленных на рис. 2А, инактивация Р450 выражалась в потере 80% спектрально регистрируемого Р450 и пропорциональном снижении 16-тестостерон гидроксилазной (16-TOH) и пентокси-резурофин О-диметилазной (PROD) активностей Р450. При инкубации инактивированных гомогенатов печени с экзогенным гемином наблюдалось восстановление 70% спектрально регистрируемых цитохромов Р450. При этом, функциональная активность Р450, измеренная с использованием маркерных специфичных реакций, для 2В1 (16-TOH и PROD) восстанавливалась полностью (рис. 2A). Кроме того, доля спектрально-восстановленного цитохрома Р450 совпадала с содержанием иммунорегистрируемой формы 2В1 апобелка микросом. Таким образом, можно предположить, что основной изоформой Р450, которая восстанавливается после внесения эндогенного гемина, является CYP2В1.

При выделении микросом из гомогенатов ткани печени и при дальнейшей их инкубации в калий-фосфатном буфере (КФБ) в присутствии 50 мкМ гемина восстановление CYP2B1 не происходило (рис. 2Б).

В случае, когда КБФ заменяли цитозольной фракцией, которую получали дифференциальным центрифугированием постмитохондриального супернатанта, опять наблюдалось восстановление содержания Р450 и восстановление 16-гидроксилазной активности на 75% от значений, полученных в контрольных экспериментах (рис. 2Б). Данные факты являются доказательством того, что цитозоль содержит некий фактор(ы), который(е) участвует(ют) в гемин-зависимом восстановлении спектральных свойств и активности Р450 2В1.

Рис. 2. Гемин-зависимое восстановление структуры и функции инактивированного АIA CYP2B1.

(A) восстановление в гомогенате печени, (Б) восстановление в изолированных микросомах.

(A) Гомогенаты печени контрольных или инактивированных животных инкубировали с гемином (50 мкМ). Обозначения: ( ) контрольные микросомы печени;

( ) инактивированные AIA микросомы, выделенные после инкубации гомогенатов печени с 50 мкМ гемином и ( ) инактивированные AIA микросомы выделенные из гомогенатов ткани. (Б) Микросомы печени контрольных или инактивированных AIA препаратов инкубировали с гемином или без гемина в SN или КФБ. Обозначения: ( ) контрольные микросомы печени;

( ) инактивированные AIA микросомы после инкубации с супернатантом печени и 50 мкМ гемином ( ) инактивированные AIA микросомы после инкубации с супернатантом без добавления гемина и ( ) инактивированные AIA микросомы после инкубации с КФБ и 50 мкМ гемином. Измерения содержания P450 (нмоль/мг белка) и 16-TOH активности (нмоль/мг белка/мин) измеряли по методам, представленным в МиМ.

Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

*обозначает статистически достоверные различия с P 0:01 от значений, полученных при измерении активности CYP2В1 или содержания Р450 без добавления гемина в среду инкубации.

Роль Hsp90/GRP94 в гемин-зависимом восстановлении CYP2B1, инактивированного суицидным ингибитором.

Ранее было показано, что шаперон Hsp90 участвует в сборке апобелка и гема nNOS, тем самым активируя фермент [A. Bender et al, 1999]. Учитывая структурное сходство nNOS и Р450, мы проверили возможность участия Hsp90 в встраивании гема в апобелок CYP2B1. С этой целью использовали гелданомицин (GA) - специфичный ингибитор белков шапероной группы Hsp90 и его аналога в эндоплазматическом ретикулуме - GRP94. На рисунке 3 представлена зависимость степени восстановления AIA-инактивированного CYP2В1 от концентрации добавленного в среду инкубации GA. Как видно из рис. 3, происходит зависимое от концентрации GA ингибирование процесса восстановления 16-TOH активности 2В1. При этом добавление GA не влияло на 16-TOH активность CYP2B1 в контрольных образцах (неинактивированные микросомы). Таким образом, можно заключить, что замедление процесса восстановления инактивированного цитохрома CYP2B не связано с ингибированием монооксигеназной активности Р450 и указывает на возможность участия Hsp90/GRP 94 в сборке CYP2B1.

Рисунок 3. Ингибирующий эффект гелданомицина (GA) на процесс гемин-зависимого восстановления функции инактивированного AIA CYP2B1. Цитозоль клеток печени инкубировали с контрольными микросомами ( ) или инактивированными микросомами в присутствии разных концентраций GA ( ).16-TOH активность измеряли по методике, описанной в МиМ. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.*обозначает статистически достоверные различия с P 0.01 от значений, полученных при измерении активности 2В1 без добавления GA в среду инкубации.

В дальнейшем, для исследования роли Hsp90 в сборке гема и белковой части Р450 было проведено удаление Hsp90 из цитозольной фракции методом аффинной хроматографии. Для этого GA химически сшивали с агарознами микрочастицами и инкубировали с цитозольной фракцией клеток печени. Эффективность удаления HSP90 контролировали с использованием SDS-PAGE электрофореза и иммунохимического анализа HSP90 (рис 4). Как видно из представленного рисунка 4, двукратная последовательная инкубация аффинного сорбента эффективно удаляла большую часть HSP из цитозоля, что подтверждалось иммунохимическими исследованиями с использованием Вестерн блот с антителами против HSP90 (рис. 4С). При этом удаление HSP90 из цитозоля не оказывало заметного влияния на степень восстановления инактивированного CYР2В1 (Рис. 4B), что подвергает сомнению участие данного белка в восстановлении Р450. Другим белком, на который GA оказывает ингибирующее воздействие, является GRP 94 - белок, прикрепленный к ЭР.

Рис. 4. Аффинное удаление Hsp90 из цитозоля клеток печени мыши и влияние цитозоля на восстановление 16-тестостерон гидроксилазной активности инактивированного AIA микросомального CYP2B1. (A) Электрофореграмма удаления Hsp90 из цитозольной фракции клеток печени с использованием микрочастиц Affigel-10, модифицированных GA. Стандарты молекулярных масс (сверху вниз (kDa): 209, 124, 80, 49, 39, 28;

полоса 1);

стандарт HSP90 (полоса 2) интактный цитозоль (5 мкг белка;

полоса 3);

1-ая инкубация цитозоля с GA-связанными микрочастицами (5 мкг белка;

полоса 4);

2-ая инкубация цитозоля с GA-связанными микрочастицами (5 мкг белка;

полоса 5);

Hsp90, элюированный с микрочастиц после первой и второй инкубации с цитозолем (полосы 6 и 7, соответственно) (B) Действие интактного цитозоля и фракций, полученных после удаления HSP90 на гемин-зависимое восстановление 16-TOH функции инактивированного AIA CYP2B1. (С) Изменение содержания иммунохимически регистрируемого Hsp90 в интактном цитозоле (полоса 2) и после двух раундов удаления HSP90 с GA-связанными микрочастицами, соответственно (полосы 3 и 4), в микросомах (полоса 5).

Полосы 1 и 6 – молекулярный стандарт с массой 101 kDa. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.*обозначает статистически достоверные различия с P 0.01 от соответствующих значений полученных при измерении активности микросомального 2В1 инкубированного с гемином.

Для выявления роли GRP94 в гемин-зависимом восстановлении активности CYP2B1 проводили исследования по определению изменения содержания GRP94 в ходе инактивации цитохрома Р450 2В1 суицидным ингибитором AIA. Результаты иммунохимического определения содержания GRP94 в ходе AIA инактивации представлены на рисунке 5. Как видно из представленных данных, введение AIA крысам одновременно с инактивацией Р450 приводило к существенному увеличению содержания GRP94 по сравнению с контрольными неинактивированными микросомами.

Согласно полученным данным, иммунохимически-регистрируемое увеличение содержания GRP94 начиналось уже через 15 мин после введения суицидного ингибитора и достигало максимального двукратного увеличения концентрации через час после введения крысам AIA. (рис. 5Б). При этом концентрация других исследованных белков шапероновой группы в ЭР, таких как GRP78 и ERp29 не изменялась (Рис. 5Б).

Рис. 5. Исследование роли микросомального GRP94 в гемин-зависимом восстановлении активности инактивированного суицидным ингибитором цитохрома CYP2B1. (A) Вестерн-блот анализ GRP94 в микросомах печени контрольных крыс (полоса 2), микросомах печени крыс через час после введения AIA (полоса 3), полосы 1 и 4 стандарт GRP94 (Б) Содержание иммунохимически детектированного GRP94 в контрольных микросомах ( ) и микросомах печени крыс через час после введения AIA ( ) *Обозначает статистически достоверные различия с P 0.01 от соответствующих значений полученных при измерении в контрольных микросомах.

Наряду с GRP94, локализованным в микросомальной фракции, существует также фактор в цитозольной фракции, без которого сборка гемовой и белковой частей невозможна. С целью определения роли цитозоля в восстановлении структурных и функциональных свойств инактивированного AIA цитохрома Р450 2В1 проводили систематическое фракционирование цитозольной фракции клеток печени. При проведении фракционирования методом разделения на молекулярных мембранах с размером пор, непроницаемым для белков ( 500 Да), было показано, что активный компонент является низкомолекулярным соединением. В дальнейшем полученная низкомолекулярная фракция анализировалась с использованием обращенно-фазовой хроматографии. Хроматограмма разделения низкомолекулярной фракции цитозоля представлена на рисунке 6А. Как видно из рисунка, в ходе разделения низкомолекулярных соединений цитозоля было выделено 5 фракций. В дальнейшем, каждая из фракций (после упаривания и восстановления в исходном объеме КФБ) инкубировалась с AIA инактивированными микросомами в присутствии гемина.

Рис. 6. HPLC фракционирование соединений низкомолекулярной фракции цитозоля клеток печени (а) и роль фракций в восстановлении 16 тестостерон гидроксилазной активности инактивированного 2B1 (б). HPLC фракционирование. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

*обозначает статистически достоверные различия с P 0.01 от соответствующих значений полученных при измерении активности 2В1 инкубированных с КФБ или гемином.

Как видно из данных, представленных на рисунке 6Б, фракции 3 и участвовали в гемин-зависимом восстановлении инактивированного CYP 2B1. Фракции, обладающие активностью в гемин-зависимом восстановлении цитохрома Р450, были выделены в препаративном режиме и подвергнуты структурному анализу с использованием протонного ЯМР. Полученные спектры показали, что фракция 3 представлена восстановленным глутатионом (GSH), в то время как фракция 4 содержит смесь GSH и пальмотоил-глицерида. Тестирование данных соединений на возможность участия в процессе гемин-зависимого восстановления Р450 показало, что внесение экзогенного GSH к инактивированным микросомам в концентрации 3 мМ восстанавливало активность и спектральные свойства Р450 в той же мере, как это происходило в случае использования цитозоля (рис. 6). С другой стороны, использование 1-10 мМ пальмиотил-глицерида не оказывало восстанавливающего действия.

Полученные данные указывают на роль эндогенного GSH как кофактора, участвующего в сборке гемовой части и апобелка цитохрома Р450.

Дополнительная верификация роли GRP94 проводилась с использованием GA, но в реконструированной системе, содержащий инактивированные микросомы крысы и GSH вместо цитозоля (рис. 7). Как видно из представленных данных, ингибирующее действие GA зависело от дозы в одинаковой мере как для микросом, восстановленных гемином в присутствии цитозоля, так и в присутствии GSH.

Таким образом, в модельной системе было показано, что для сборки гемовой части с апобелком CYP2B1 необходимо участие минимум составляющих: эндогенного восстановленного GSH в цитозоле и GRP94 в микросомах.

Рисунок 7. Ингибирующий эффект GA на процесс гемин-зависимого восстановления функции инактивированного AIA CYP2B1 в реконструированной системе. GSH (3 mM) и 5 мМ гемин инкубировали с контрольными микросомами ( ) или инактивированными микросомами (( )) в присутствии разных концентраций GA (0–200 мкМ). Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

Результаты, показывающие увеличение содержания GRP94 в ЭР в течение короткого времени после введения суицидного инактиватора, а также в ходе индукции CYP2B1 фенобарбиталом (более чем в 5 раз), указывают на участие этого шаперона в поддержании апобелка в конформации, позволяющей встраивание гема.

H2O2-зависимая инактивация цитохрома P450 в реконструированной монооксигеназной системе.

Как было показано выше, увеличение синтеза белков моноксигеназной системы сопровождается повышением концентрации целой группы белков, выполняющих функцию защиты клетки от активных форм кислорода (табл.

3). Так, согласно протеомным данным, в ходе индукции Р450 наблюдалось увеличение содержания каталазы и супероксидисмутазы в 3 и 7 раз, соответственно. Кроме того, наблюдалось значительное увеличение концентрации глутатионпероксидазы – фермента катализирующего восстановление перекисей липидов в соответствующие спирты и восстановление пероксида водорода до воды. Это может быть обусловлено тем, что различные формы P450 катализируют частично сопряженные монооксигеназные реакции и продуцируют перекись водорода (H2O2), образующуюся в активном центре P450 при распаде пероксикомплекса. При этом активные формы кислорода (АФК) являются причиной самоинактивации белка. Для выяснения молекулярного механизма окислительной модификации P450 и роли ферментов, утилизирующих АФК, исследовали инактивацию CYP2B4 в реконструированной монооксигеназной системе (МРС), состоящей из очищенных препаратов CYP 2В4 и НАДФН цитохром-P450 редуктазы в присутствии неионного детергента Эмульген 913.

Как показано на рисунках 8A и Б, скорость инактивации P450 (уменьшение пика спектрального поглощения при 450 нм) в реакции N-деметилирования бензфетамина (N-ДМБ) зависит от концентрации P450 и редуктазы в МРС.

Самую высокую скорость обесцвечивания P450 наблюдали при молярном соотношении P450:редуктаза равном 1:1 (рис. 8A). В данном случае содержание P450 снижалось на 70% во время инкубации в течение первых минут при 30°C. При молярном соотношении P450:редуктаза равном их молярному соотношению в микросомах (1:0,05) инактивации проходила медленнее - почти полное обесцвечивание P450 наблюдали только через часов инкубации при 300С (рис. 8Б). В отсутствие НАДФН обесцвечивание P450 не превышало 10%, что говорит о том, что процесс инактивации в МРС является НАДФН-зависимой реакцией. Уменьшение содержания A сопровождалось потерей N-ДМБ активности и коррелировало с увеличением концентрации перекиси водорода в среде инкубации.

Для реконструированных систем с использованием молярных соотношений P450:редуктаза 1:1 и 1:0,05 наблюдали схожие величины соотношения концентрации образованной перекиси водорода к концентрации инактивированного CYP 2B4 (рис. 8). Как видно из рисунка 8, более высокие скорости обесцвечивания P450 при равных молярных соотношениях белков коррелируют с повышенным образованием H2O2, которое было приблизительно в 10 раз больше, чем образование перекиси водорода, наблюдаемое при молярном соотношении 1:0,05. Близкие уровни инактивации для обеих реконструированных систем указывают на участие H2O2 в обесцвечивании P450.

Рисунок 8. Снижение содержания P450, накопление H2O2 и образование формальдегида при N деметилировании бензфетамина в МРС. Реконструированная система содержала P450 и редуктазу в молярном соотношении 1:1 (A) и 1:0,05 (B). Снижение содержания P450 в отсутствие () или в присутствии () НАДФН;

образование H2O2 в отсутствие () или в присутствии () НАДФН;

образование формальдегида (). Результаты представляют собой средние значения для 3– независимых измерений, для которых SE составляла менее чем 10%. FA, формальдегид.

Дополнительное доказательство того, что обесцвечивание P450 при N деметилировании бензфетамина связано с образованием H2O2, образующейся в активном центре цитохрома, получили в эксперименте с использованием каталазы. Как показано на рисунке 9, 50 ед./мл каталазы, добавляемой к реакционной смеси, ингибирует обесцвечивание P450 приблизительно на 40%. При этом дальнейшее увеличение концентрации каталазы до Ед./мл не замедляло инактивацию P450. Такая ограниченная защита действия каталазы позволяет предположить, что в реакцию обесцвечивания P вовлечена H2O2, образующаяся в активном центре P450 и, следовательно, недоступная для каталазы. Предположительно, каталаза изменяет градиент концентраций H2O2 между активным центром фермента и основным объемом раствора. Она расщепляет H2O2 в среде, тем самым увеличивая градиент концентраций и способствуя более активной диффузии H2O2 из активного центра P450. Таким образом, снижение уровня равновесной концентрации H2O2 около гема приводит к замедлению скорости обесцвечивания белка.

Рисунок 9. Эффект каталазы на скорость инактивации P450. Реакционная смесь (1,5 мл) содержала мономеры P450 (3,3 мМ) и редуктазы (0,16 мМ), бензфетамин (1 мМ) и КФБ (100 мМ, pH 7,35) с 0,025% Эмульгеном 913. Реакционную смесь инициировали, добавлением 1 мМ НАДФН и инкубировали при 30°C. Снижение содержания P450 без НАДФН ();

с 1 мМ НАДФН ();

тоже самое в присутствие 50 Ед./мл каталазы (). Величины приведены в виде средних значений трех независимых измерений, для которых SE всегда составляла менее 10%.

Окислительная модификация гема в P Спектральные измерения, проведенные в МРС, показали, что инактивация P450 в монооксигеназных реакциях сопровождается уменьшением интенсивности пика поглощения при 450 нм. Изменение интенсивности поглощения может быть следствием либо потери, либо разрушением гема P450. Анализ с использованием гель-фильтрационной ВЭЖХ показал, что при окислении бензфетамина происходит потеря 90% связанного с белком гема (рис. 10A). При этом в контроле без добавления в систему НАДФН потеря связанного с P450 гема в течение 8 часов инкубации составляла только 5%.

Для более детального исследования механизма модификации гема P измеряли общее содержание гема, содержащегося в среде инкубации (рис.

10B) при помощи методики, регистрирующей гем независимо от того, связан он с белком или нет [Omura and Sato, 1964].

Было обнаружено, что снижение содержания общего гема коррелировало со снижением связанного с P450 гема (рис. 10), что позволяет предположить, что обесцвечивание P450 можно объяснить разрушением гема.

На основании данных, полученных в экспериментах с использованием каталазы (рис. 11B) мы предположили, что образование перекиси водорода H2O2, образующейся в активном центре цитохрома P450, и перекиси водорода H2O2, накапливаемой в среде инкубации, играют различную роль при разрушении гема.

Рисунок 10. Снижение содержания связанного и общего гема при обесцвечивании цитохрома P450. Реакционная смесь и условия инкубации такие же, как описано на рисунке 8. (A) Потерю связанного с P450 гемом определяли при помощи гель-фильтрационной ВЭЖХ. Нативный P ();

инкубация без НАДФН ();

инкубация в присутствие 2 мМ НАДФН (). (B) Потерю общего гема из P450 определяли при помощи способа с использованием пиридина-гемохромогена. Для определения общего содержания гема в разное время отбирали аликвоты реакционной смеси объемом 500 мкл, содержащей 1 мМ P450. Инкубация без НАДФН ();

инкубация в присутствие мМ НАДФН (). Данные на графике представляют собой средние значения трех независимых измерений, для которых SE всегда составляла менее 10% Рисунок 11. Зависимость между скоростью обесцвечивания P450 и снижением количества связанного с ферментом или общего гема в отсутствие или в присутствии каталазы. Реакционная смесь, условия инкубации и измерения содержания связанного с ферментом или общего гема описаны на рисунке 10. (A) Инкубацию проводили без каталазы. Содержание P450 ();

снижение количества связанного с ферментом () или общего гема (). (B) В присутствии каталазы ( ед/мл). Содержание P450 ();

снижение количества связанного с ферментом () или общего гема (). Данные представляют собой средние значения трех независимых измерений, для которых SE всегда составляла менее 10% измеряемой величины.

Как видно из рис. 11B, каталаза предотвращала обесцвечивание и потерю связанного P450 гема в одинаковой степени (приблизительно на 40%).

Корреляция между данными процессами в отсутствие или при наличии каталазы, указывает на то, что H2O2, образующаяся в активном центре фермента, может нарушать взаимодействие между гемом и апоферментом, что приводит к высвобождению гема из фермента. Тот факт, что каталаза полностью предотвращает разрушение общего гема, говорит о том, что гем разрушается H2O2, накапливаемой в среде инкубации. Таким образом, представленные выше результаты доказывают, что окислительная инактивация P450 в МРС связана с модификацией гемовой части P450, которая включает в себя последовательно потерю и дальнейшее разрушение гема перекисью водорода.

Агрегация P Уменьшение спектрального содержания P450 во время монооксигеназной реакции сопровождается агрегацией белка, которую определяли при помощи гель-фильтрационной ВЭЖХ в неденатурирующих условиях в присутствии детергента Эмульген 913 (рис. 12). Поскольку данный детергент обладает максимумом поглощения при 276 нм и, следовательно, затрудняет регистрацию белка в области от 200 до 280 нм, измерения проводили флуорометрическим способом. Анализ ВЭЖХ показал снижение интенсивности флуоресценции нативного P450 (пик 50 кДа) и появление высокомолекулярных агрегатов (95 кДа и более) при окислении бензфетамина в МРС. Суммарная площадь пиков для каждой хроматограммы в данном случае не менялась.

Рисунок 12. Гель-фильтрационная ВЭЖХ нативного и инактивированного P450 в неденатурирующих условиях. Аликвоты инкубационной смеси объемом 50 мкл, содержащей 3.3 мМ P450, забирали до () и после инкубации в течение 8 часов при 30°C с мМ НАДФН (). Разделение белков отслеживали измеряя интенсивность флуоресценции белка модифицированного при o-фталальдегидом длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания 455 нм.

Возможны два объяснения агрегации белка. Одно – это изменение физико химических свойств инактивированного P450 вследствие модификации аминокислотных остатков, изменение поверхностного заряда молекул P и, как следствие, агрегация на основе нековалетных взаимодействия. Другой механизм может быть связан с образованием межбелковых ковалентных сшивок.

Окисление SH-групп при инактивации P Пептидное картирование и измерение флуоресценции SH-групп, меченных пиренмалеимидом (ПМ), позволили нам определить SH-содержащие пептиды цитохрома P450. На рисунке 13 показано, что четыре пика флуоресценции, соответствующие SH-содержащим пептидам, различались для нативного и инактивированного P450 ОФ-ВЭЖХ. Пик 1 не изменялся при инактивации. Снижение пиков 2, 3, и 4 наблюдали через 3 часа и через часов инкубации в присутствие НАДФН и объединенные площади данных пиков снижались приблизительно на 50% и на 80%, соответственно. Такие результаты указывают на то, что остатки цистеинов модифицируются при окислительной модификации P450.

Рисунок 13. Разделение при ОФ-ВЭЖХ пептидов после гидролиза меченного ПМ P450. (A) контроль;

(B) инкубация в течение 3 часов;

(C) инкубация в течение ч. Интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения 343 нм, длина волны испускания 396 нм) SH-содержащих пептидов (пики 1, 2, 3, 4) измеряли используя детектор Shimadzu.

На рисунке 14 приведена корреляция между обесцвечиванием P450, агрегацией белка и уменьшением содержания SH-групп белка в отсутствие и в присутствии каталазы в зависимости от времени. Схожий ингибирующий эффект каталазы при данных процессах указывает на то, что перекись водорода H2O2, образующаяся в результате окислительного разобщения монооксигеназных реакций, может быть вовлечена в модификацию апопротеина и его цистеинов в частности.

Рисунок 14. Сравнение скорости обесцвечивания P450, агрегации и окисление SH-групп белка в отсутствие (,,, соответственно) или в присутствии каталазы (,,, соответственно). Каждая точка представляет собой среднее значение пяти измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

Образование ковалентных сшивок в P Окислительная модификация аминокислот, таких как цистеин, гистидин, тирозин и триптофан, может приводить к конформационным изменениям в молекуле белка. Используя SDS-PAGE (рис. 15), мы обнаружили, что инактивация P450 сопровождается образованием межмолекулярных перекрестных сшивок. Как видно на элекрофореграмме (рис. 15), реакция инактивации Р450 сопровождалась образованием продуктов белковой агрегации. При этом окраска серебрением визуализировала белковые полосы, которые по молекулярному весу соответствовали димеру и тримеру P450.

Денситометрический анализ показал, что интенсивность зарегистрированных ковалентных димеров и тримеров обратно пропорциональна исчезновению полосы мономерного P450. При гель-фильтрационной ВЭЖХ в присутствии 0,1% SDS также обнаружены продукты, которые могут представлять собой олигомеры P450 (450 кДа и более). Скорость образования перекрёстных сшивок в P450 и исчезновения мономеров P450 не коррелировала со скоростью обесцвечивания P450, наблюдаемого спектральным методом.

После 8 часов инкубации в МРС P450 инактивировался более чем на 85%, а исчезновение полосы мономерного белка составляло только 38%.

Ингибирующее действие каталазы на образование перекрёстных сшивок указывает на то, что в данный процесс вовлечена перекись водорода. Тем не менее, H2O2 только частично может обуславливать образование перекрёстных сшивок, поскольку мы не обнаружили корреляции между полимеризацией и скоростью обесцвечивания P450. Образование ковалентносшитых агрегатов молекул P450 было более медленным по сравнению с обесцвечиванием гемопротеина, что говорит о вторичной природе данного процесса, позволяя предположить, что неспецифические радикальные реакции могут вносить вклад в модификацию апопротеина.

Рисунок 15. SDS-PAGE нативного и инактивированного в различные P временные интервалы инкубации в МРС. Для анализа отбирали аликвоты реакционной смеси, содержащей 10–20 мг P450, обрабатывали буфером Лемли и инкубировали при 900С в течение 2 мин. Белковые стандарты представлены на электрофорезе в двух крайних дорожках. Контроль, инкубация в МРС течение 2 ч., в течение 4 ч.;

в течение ч.;

в течение 8 ч., дорожки 1-5, соответственно.

Уменьшение полоски для мономера P450 на дороже 5 составляло 40%.

Образование карбонильных групп в P450 в ходе инактивации Доказательством участия гидроксильных радикалов в ковалентной модификации P450 служит образование карбонильных групп. В своих работах Stadtman показал, что карбонильные модификации белка обусловлены их окислением с участием металлов c переменной валентностью [Stadtman, 1993]. Железо гема может катализировать превращение перекиси водорода в свободные гидроксильные радикалы в реакции Фентона. Радикалы •OH чрезвычайно реакционны и могут вызывать образование межмолекулярных перекрёстных сшивок в результате окисления аминокислотных остатков. Как показано на рисунке 16, содержание карбонильных групп в P450 через 6 часов инкубации было больше (кривая b, пик 2), чем в контроле (кривая a, пик 1). При этом, наиболее значимое увеличение наблюдали в высокомолекулярной фракции белка ( 100 кДа).

Каталаза снижала образование карбонильных групп на 35% (кривая c, пик 3), позволяя предположить, что перекись водорода может инициировать окислительные реакции свободных радикалов, участвующих в модификации аминокислот.

Рисунок 16. Сравнение содержания кабронильных групп в нативном и инактивированном Инкубацию P450.

проводили при 30°C в течение 8 часов в отсутствие или в присутствии каталазы ( ед/мл). Образцы (100 мкл) забирали и обрабатывали 2% 2,4-динитрофенил гидразином в течение 40 мин при 30°C.

Контроль (кривая a, пик 1);

инкубация в течение 8 часов без каталазы (кривая b, пик 2);

инкубация в течение 8 часов с каталазой (кривая c, пик 3).

На основании приведенных в данном разделе данных мы предположили следующий механизм деградации цитохрома P450 при монооксигеназных реакциях. Инактивация P450 в основном происходит из-за перекиси водорода H2O2, образующейся непосредственно в активном центре фермента. Перекись водорода модифицирует некоторые аминокислотные остатки, включая Cys 436, SH группа которого является коаксиальным лигандом железа гема.

Окисление данного остатка вызывает выход гема из цитохрома P450. В результате потери гема и окислительной модификации аминокислотных остатков изменяется конформация белка. Именно эти изменения цитохрома P450, по нашему мнению, ответственны за агрегацию белка, за счет ионных и гидрофобных взаимодействий.

Известно, что окислительная модификация белков может служить сигналом для эндогенных протеаз к деградации модифицированных белков.

Таким образом, окислительная модификация P450 в ходе несопряжённых окислительно-восстановительных реакций может представлять собой начальную стадию в его деградации в клетке [Davies, 2001].

Протеолитическая деградация нативного и модифицированного СYP2B.

Для определения механизмов деградации P450 монооксигеназной системы печени мы использовали штаммы Saccharomyces cerevisiae, дефицитные по генам протеасомного и вакуольного пути. Данная модельная система использовалась ранее для изучения деградации белков, ассоциированных с ЭР, но отличных от цитохромов Р450 [Kostova и Wolf, 2003].

Учитывая высокую эволюционную консервативность между системами деградации дрожжей и млекопитающих и наличие генетически охарактеризованных штаммов S. сerevisiae, дефектных по вакуольному или Ub-зависимому протеасомному пути, данная модель была использована для изучения молекулярных механизмов деградации СYP 2B1.

Исследование роли системы деградации UBC/HRD в гидролизе CYP2B1.

Основной задачей исследования было определение молекулярных механизмов деградации CYP2B и количественная оценка данного процесса с использованием штаммов дрожжей с дефектными (отсутствующими) системами деградации в сравнении с уровнем деградации того же белка в диком типе дрожжей. Роль связанного с ЭР Ub-конъюгирующего фермента Ubc6p или Ubc7p или обоих этих ферментов в деградации CYP2B исследовали с использованием pYcDE-2B1 экспрессионного вектора в дрожжевых штаммах ubc6, ubc7 и ubc6_/ubc7, дефицитных по одному или обоим ферментам протеасомного пути деградации белков. Во время стационарной фазы роста культуры не наблюдалось статистически достоверных изменений содержания CYP2B1 в указанных выше трансфецированных штаммах по сравнению с контрольным штаммом (wt S.

сerevisiae), в котором все системы деградации белков находятся в рабочем состоянии (рис. 17).

Следовательно, деградация CYP2B1 проходит по протеолитическому пути, не связанному ни с одним из двух известных сегодня Ub-зависимых путей мембранных белков. Аналогичный экспрессионный анализ проводился на контрольных (wt) и штаммах дрожжей, дефицитных по второму из возможных путей протеолической деградации, включающий гены hrd2-1, hrd1 и hrd3. При этом иммуноферментный анализ микросомального белка также не выявил различий в скорости протеолитического расщепления CYP2B1. Полученные результаты указывают на отсутствие взаимосвязи протеолитического метаболизма CYP2B1 с Hrd2p белками и, соответственно, с 26S протеасомой.

Рис. 17. Протеолитическая деградация CYP2B1 в контрольном штамме wt S. cerevisiae и в штаммах дрожжей, дефицитных по убиквитин-конъюгирующим белкам. Штаммы дрожжей, трансформированные экспрессионным вектором CYP2B1 (pYcDE/2B1) или пустым вектором (pYcDE-2;

данные не представлены) растили при 30°C в SD среде с соответствующими добавками для селекции. Клетки собирали центрифугированием на ранней фазе логарифмического (ОП 1. при 600 нм) или на поздней стадии (20–24 ч после достижения ОП=0.5 при 600 нм). Полученный из этих клеток микросомальный белок анализировали методом Вестерн Блот используя анти CYP2B1 IgG антитела (верхняя панель рисунка) На нижней панели представлены относительные величины денсиметрирования иммуноблотов белка выделенного из клеток поздней стадии по отношению к клеткам ранней стадии. Представленные значения выражены в виде средних ±S.D., полученные по крайней мере в трех независимых экспериментах.

Исследование роли PEP4 генов в протеолитической деградации CYP2B Экспрессионный анализ pYES2-2B1 выявил значительное замедление уровня деградации CYP2B1 в pep4 штамме по сравнению с контрольным штаммом, содержащим нормальный ген Pep4, участвующий в вакуолярной протеолитической деградации данного цитохрома (рис. 18). Как видно из представленных данных, в культуре pep4 в стационарной фазе роста наблюдалась значительное (более пяти раз) увеличение содержания CYP2В по сравнению с диким штаммом (Рис. 18).

Рис 18. Протеолитическая деградация CYP2B1 в контрольном штамме wt S. cerevisiae и в штаммах дрожжей, дефицитных по pep4 белкам. Детальное описание эксперимента см. в подписях Рис. 17.

Значения выражены в виде средних ±S.D. полученные не менее чем в трех независимых экспериментах. *Статистически достоверное различие (р0.01).

Полученные данные указывают на то, что вакуолярный путь деградации является основным для CYP2В1, эксперссированного в дрожжах. Учитывая высокую гомологию между вакуолярными протеазами дрожжей и лизосомальными протеолитическими ферментами, можно предположить, что и в клетках млекопитающих деградация Р450 проходит по тому же метаболическому пути.

CYP2B1-3A4CT деградация в дрожжах.

Как было показано выше, цитохром CYP2B1 проходит протеолитическую деградацию по лизосомальному метаболическому пути, что отличает данную изоформу от цитохрома CYP3A4, который преимущественно гидролизуется с участием протеасомальной системы [Murray and Correia, 2001]. Такие различия в молекулярных механизмах деградации мембранных CYP2B1 и CYP3A4 подразумевают наличие структурных или молекулярных детерминант, которые определяют протеолитический путь деградации белков. До настоящего времени такие детерминанты не определены и, теоретически, могут быть локализованы на любом участке молекулы Р450.

Согласно представлениям о структуре микросомальных P450 N-концевая последовательность белка является трансмембранным фрагментом и менее доступна для протеаз по сравнению с С-концевым фрагментом, экспонированным в цитозоль клетки (Williams et al., 2004;

Yano et al., 2004).

Поэтому мы исследовали роль С-концевых аминокислотных остатков CYP3A4 в определении гидролитического пути деградации. Для этого с использованием молекулярно-биологических подходов была разработана химерная конструкция белка, включающая полноразмерный CYP2B1, к С концевому участку которого добавили семь С-концевых остатков CYP3A (CYP2B1-3A4 CT).

Рис 19. Протеолитическая деградация CYP2B1-3A4CT в контрольном штамме wt S. Cerevisiae, в штаммах дрожжей, дефицитных по pep4-белкам (левая панель) и в штаммах дрожжей, дефицитных по hrd2-1 белкам (правая панель). Значения выражены в виде средних ±S.D., полученные не менее чем в трех независимых экспериментах.

На первом этапе проводили определение кинетики протеолитической деградации CYP2B1-3A4CT в штаммах дрожжей, дефицитных по pep ферменту (рис. 19). Из представленных данных видно, что в отличие от немодифицированного CYP2B1, не наблюдалось ожидаемого замедления деградации химерного белка CYP2B1-3A4CT в культуре в pep дефицитных штаммах дрожжей. Эти данные означают, что химерный CYP2B1-3A4CT больше не является субстратом для вакуолярных гидролаз и его деградация проходит по другому метаболическому пути. При изучении роли hrd2-1 на уровень протеолитического расщепления химеры CYP2B1 3A4CT было зарегистрировано статистически значимое двукратное увеличение содержания химерного цитохрома в поздней стационарной фазе роста клеток по сравнению с аналогичными клетками контрольных дрожжей (рис 19).

Полученные данные указывают на то, что введение гептапептида в С концевую последовательность CYP3A4 достаточно для изменения молекулярного пути протеолитической деградации.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что за деградацию нативного CYP2B1 в S. сerevisiae и в клетках млекопитающих ответственна протеолитическая система лизосомальных ферментов. Кроме того, путь гидролитического метаболизма CYP2B1 может быть изменен на убиквитин-зависимый при модификации первичной структуры белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Протеомный анализ изменения содержания белков под воздействием индукторов Р450 показал, что одновременно с индукцией гемопротеинов наблюдается сопряженное увеличение концентраций шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы;

На рис. 20 представлена возможная схема участия этих белков в встраивании гема в апофермент, окислительной модификации аминокислотных остатков и, наконец, деградации белка.

Как видно из схемы, потеря гема цитохромом Р450 происходит при окислении Cys436 CYP2B перекисью водорода, образующейся в активном центре в ходе разобщения монооксигеназной реакции или в ходе окисления суицидного субстрата AIA. Сульфоксидные группы цистеинов могут быть восстановлены при участи эндогенного глутатиона. Однако, одного восстановления цистеина недостаточно для сборки гема и апофермента.

Очевидно, что только в комплексе с GRP94 у CYP2B возникает конформация, при которой апобелок способен принять гем и восстановить характерные для Р450 спектральные и функциональные свойства.

Совместная индукция цитохромов и GRP94, а также некоторых других шаперонов позволяет предположить участие этой группы белков не только в восстановлении инактивированной формы CYP2B, но также и в фолдинге белка в ходе его синтеза.

Протеомные данные об увеличении в ходе индукции концентрации каталазы и других ферментов, участвующих в утилизации АФК, говорят о защитных реакциях клетки в ответ на окислительный стресс. Такая реакция клетки позволяет снизить уровень инактивации P450, происходящей из-за перекиси водорода, образующейся непосредственно в активном центре фермента. В результате потери гема и окислительной модификации аминокислотных остатков изменяется конформация гемопротеина. Именно эти изменения цитохрома P450, по нашему мнению, ответственны за агрегацию белка, за счет ионных и гидрофобных взаимодействий.

Низкая скорость образования межмолекулярных сшивок между агрегатами указывает на вторичность этого процесса. Данные, полученные нами при исследовании полимеризации в присутствии каталазы, которая ингибирует этот процесс, указывают на вовлеченность перекиси водорода в образование межмолекулярных сшивок. Вероятно, ведущую роль в этом процессе играют высоко реакционные гидроксильные радикалы, образующиеся при распаде перекиси водорода в реакции Фентона при участии ионов железа, освобождающихся при распаде гема. Одним из показателей участия гидроксильных радикалов в модификации апофермента Р450 является образование карбонильных групп в модифицированных белках [Skarydovа, Wsоl, 2011] Окислительная модификация белков является сигналом для эндогенных протеаз к деградации модифицированных белков [A. Pickering and K.. Davies, 2012]. При этом предполагается, что основную роль в катаболическом гидролизе CYP2B играют ферменты лизосомальной системы, а при модификации первичной структуры CYP2B скорость деградации белка увеличивается за счет участия протеасомных белков.

Рисунок 20. Схема посттрансляционной регуляции цитохрома Р450 2В (объяснения в тексте).

ВЫВОДЫ Разработанный метод протеомного анализа, основанный на 3D 1.

фракционировании белков и пептидов с последующим тандемным масс спектрометрическим анализом, позволяет идентифицировать более белков в одном эксперименте.

Индукция цитохромов Р450 фенобарбиталом или метилхолантреном 2.

параллельно с увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы сопровождается индукцией: шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы;

В формировании функционального цитохрома Р450 участвуют 3.

эндогенный низкомолекулярный фактор (идентифицированный как восстановленный глутатион) и шаперон GRP94, способствующие связывании гема апоцитохромом.

Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции 4.

фенобарбиталом или метилхолантреном является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода, которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых CYP2B.

При отсутствии каталазы в реконструированной монооксигеназной 5.

системе взаимодействие цитохрома CYP2B с АФК приводит к химической модификации SH-групп трех из четырех остатков цистеина цитохрома, образованию карбонильных групп, нековалентных белковых агрегатов, с последующим формированием межмолекулярных ковалентных сшивок CYP2B. Данные модификации служат сигналом для протеолитической деградации этого цитохрома.

Катаболизм CYP2В в модельных дрожжевых системах, включает 6.

Pages: |

| 2 |

Авторефераты диссертаций >> Авторефераты по Биологии

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

Посттрансляционная регуляция цитохромов р450 подсемейства 2в