Эколого-физиологический потенциал природных изолятов ксилотрофных базидиомицетов

На правах рукописи

Ильина Галина Викторовна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНЫХ ИЗОЛЯТОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ 03.02.08 – экология (биологические наук

и) 03.01.06 – биотехнология

Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук Саратов – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пензенская государственная сельскохозяйственная академия» Научный доктор биологических наук, профессор консультант: Гарибова Лидия Васильевна Официальные доктор биологических наук, профессор оппоненты: Краснопольская Лариса Михайловна доктор биологических наук, профессор Коннова Светлана Анатольевна доктор биологических наук, профессор Никитина Валентина Евгеньевна Ведущая Государственное образовательное учреждение организация: высшего профессионального образования «Пермский государственный педагогический университет»

Защита состоится 11 ноября 2011 г. в 1000 часов на заседании диссерта ционного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83, E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Автореферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Невский ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Ксилотрофные базидиальные макромицеты – уникальная группа организмов, способная к полной деструкции лигноцеллюлоз, обеспечива ющая мобилизацию депонированного в древесине углерода (Мухин, 1993).

В качестве специфического компонента экосистем, составляющего основу меха низма регуляции процессов накопления и разложения растительных остатков, кси лотрофные базидиомицеты представляются весьма актуальными объектами иссле дования. Ряд крупных монографический работ второй половины ХХ века (Бондар цев, 1953;

Бондарцева, Пармасто, 1986;

Бондарцева, 1998;

Erikson et al, 1973-1988;

Jlich, Stalpers, 1980) предопределил интенсивное развитие экологического направления исследований этой группы грибов. За рубежом преобладающим стал природоохранный аспект (Knudsen, Vesterholt, 1990;

Kotiranta, Niemel, 1996), а в отечественных исследованиях реализовывались традиции классической экологии (Бондарцева, 2000;

Мухин, 2003;

Стороженко, 2002;

Змитрович и др., 2003;

Сафо нов, 2003;

Арефьев, 2006 и др.). На сегодняшний день довольно ограничены све дения, касающиеся аспектов биологии видов, различающихся экологическими особенностями, в условиях культуры, о потенциале различных географических и экологических изолятов in vitro, возможностях сохранения генофонда редких и охраняемых видов в качестве мицелиальных культур. Однако, только в условиях чистой культуры возможно детальное исследование экологических особенностей вида и установление параметров, оптимальных для реализации природного потен циала гриба. В последние десятилетия ксилотрофные базидиомицеты заняли одно из ведущих мест в качестве объектов биотехнологии.

Вышесказанное свидетельствует об актуальности исследований экологии ксилотрофных базидиомицетов, целесообразности создания коллекций их чистых культур, располагающих достаточным объемом экспериментального материала и работы с природными изолятами, потенциально перспективными в биотехноло гии.

Цель и задачи исследований. Цель работы – выявление экологических осо бенностей ксилотрофных базидиомицетов в лесных экосистемах лесостепи Право бережного Поволжья и оценка физиологического и биотехнологического потенци ала изолятов видов с различными экологическими особенностями в условиях чи стой культуры. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучить таксономическую и трофическую структуру биоты ксилотрофных базидиомицетов с учетом особенностей их взаимодействия с древесными субстра тами в районе исследований;

- исследовать функциональные роли группировок видов ксилотрофных бази диомицетов в сукцессионном ряду разложения древесины;

- создать коллекцию изолятов ксилотрофных базидиомицетов, вызывающих разные типы гнилей древесины, выделенных с различных древесных пород и суб стратов различной степени деструкции;

- разработать оптимальные приемы культивирования видов с учетом их эко логических особенностей и степени функциональной зависимости физиологиче ского потенциала от условий культивирования;

- разработать приемы, обеспечивающие максимальную сохранность морфоло го-физиологических параметров мицелиальных культур и генофонда редких и за несенных в Красные Книги РФ и Пензенской области видов;

- исследовать влияние ряда лимитирующих экологических факторов на мице лиальные культуры ксилотрофных базидиомицетов в лабораторных условиях с целью установления пределов толерантности и оценки связи устойчивости к раз личным воздействиям с эколого-биологическими особенностями видов;

- изучить роль метоксильных групп лигнина, как трофического и корригиру ющего процессы морфогенеза фактора;

- выявить взаимосвязь между эколого-физиологическими особенностями культур и их биотехнологической перспективностью.

Научная новизна и теоретическая значимость. Изучены экологические осо бенности ксилотрофной микобиоты лесостепи Правобережного Поволжья, уста новлены закономерности формирования трофических связей видов и древесных пород – их природных субстратов. Выявлена связь между широтой субстратной приуроченности видов грибов в природе и степенью внутривидового полимор физма в культуре. Комплексно изучена роль важнейшей составляющей природно го субстрата – лигнина как трофического и корригирующего фактора в развитии ксилотрофных базидиомицетов. Изучены механизмы адаптации ксилотрофных ба зидиомицетов к фунгициду полиеновой природы. Установлено стимулирующее влияние метоксильных групп лигнина на процесс синтеза эргостерина и плодоно шение в культуре у грибов белой гнили.

Практическая значимость. Создана коллекция мицелиальных культур бази диомицетов – представителей ксилотрофной микобиоты лесостепи Правобережно го Поволжья. Коллекция включает 44 вида и 215 штаммов грибов, принадлежащих к разным систематическим и экологическим группам, в том числе в ней представ лены редкие и занесенные в Красные Книги РФ и Пензенской области виды. Пока заны возможности культивирования видов, независимо от их субстратной специ фичности в природе, на субстратах, содержащих экстрагированные метоксилиро ванные лигноцеллюлозные компоненты. С помощью разработанного метода скри нинга отобраны штаммы ксилотрофных базидиомицетов, перспективные в каче стве продуцентов стеринов. Получены положительные решения по заявкам на па тентование оригинальной рецептуры субстратов и способа получения плодовых тел ксилотрофных базидиомицетов, перспективных в биотехнологии. Разработана биологически активная добавка к рациону сельскохозяйственных птиц на основе мицелия Ganoderma lucidum, которая апробирована в условиях крупнейшего пти цеводческого комплекса Пензенской области (ООО ПТФ «Васильевская»). Подана заявка на патентование. Запатентован способ хранения мицелиальных культур, обеспечивающий сохранение продуктивных свойств штаммов и генофонда редких видов, в том числе, занесенных в Красные Книги РФ и Пензенской области. Полу ченные данные относительно особенностей экологии ксилотрофных базидиомице тов используются в процессе преподавания курсов «Экология» и «Основы эколо гии» в ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА».

Положения, выносимые на защиту:

Лесные экосистемы лесостепи Правобережного Поволжья представляют 1.

собой богатый резерват видов и штаммов ксилотрофных базидиомицетов, состав ляющих различные эколого-трофические группировки.

Комплексная оценка экологического статуса вида в природе позволяет 2.

оптимизировать процесс искусственного культивирования, а статус чистой куль туры расширяет возможности исследования важнейших сторон экологии ксило трофных базидиомицетов в природе.

По эколого-физиологическим характеристикам культуры можно судить 3.

о потенциальной метаболической активности и, как следствие, биотехнологиче ской ценности штамма.

Широта субстратной специфичности в отношении древесных пород и 4.

стадии разложения древесины является одним из факторов, определяющих сте пень штаммового полиморфизма вида в культуре.

Метоксильные группы лигнина служат индуктором синтеза эргостерина 5.

у грибов белой гнили и стимулятором плодоношения ксилотрофных базидиомице тов.

Работа выполнена в лаборатории биохимии при кафедре биологии животных и ветеринарии Пензенской государственной сельскохозяйственной академии (сви детельство о состоянии измерений №264-224-2008), в соответствии с плановой те матикой “Исследование эколого-биохимического и биотехнологического потенци ала ксилотрофных базидиомицетов” (№ гос. регистрации 0120.0850925), а также «Повышение продуктивных качеств животных и разработка рациональных техно логий производства продукции животноводства в условиях Среднего Поволжья» (№ гос. регистрации 0120.1064496). В ходе исследований использовалась матери альная и приборная база Центральной экоаналитической лаборатории Региональ ного Центра государственного экологического контроля и мониторинга по Пен зенской области (аттестат аккредитации в системе СААЛ РОCC PU. 0001.515921).

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конферен циях, форумах и симпозиумах: Международной конференции, посвященной 80 летию кафедры микологии и альгологии МГУ и 90-летию М.В. Горленко «Совре менные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии» (Москва, 1998);

II Съезде ботаников «Проблемы ботаники на рубеже ХХ -ХХI веков» (Санкт - Пе тербург, 1998);

Международном симпозиуме «Проблемы изучения и охраны био разнообразия и природных ландшафтов Европы» (Пенза, 2001);

Международной конференции «Физиология и биохимия культивируемых грибов» (Саратов, 2002);

1-ом Международном Съезде микологов России (Москва, 2002);

Всероссийской научно – практической конференции «Вопросы прикладной экологии» (Пенза, 2002);

Всероссийской научной конференции, посвященной 130-летию со дня рож дения И.И. Спрыгина «Охрана растительного и животного мира Поволжья и со предельных территорий» (Пенза, 2003);

Международной научной конференции «Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофито ценозах» (Минск, 2004);

Международной научно – практической конференции «Проблемы охраны природных ландшафтов и биоразнообразия России и сопре дельных стран» (Пенза, 2004);

Научно – практической конференции, посвященной памяти профессора А.Ф. Блинохватова «Образование, наука, медицина: эколого экономический аспект» (Пенза, 2006);

Всероссийской научно – практической кон ференции «Проблемы охраны и экологического мониторинга природных ланд шафтов и биоразнообразия» (Пенза, 2007);

Всероссийской научно – практической конференции «Мониторинг природных экосистем в зонах защитных мероприятий объектов по уничтожению химического оружия» (Пенза, 2007);

Юбилейной кон ференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко «Высшие ба зидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества» (Москва, 2008);

II Международном Съезде микологов России (Москва, 2008);

Международной науч ной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения И.И. Спрыгина «Био разнообразие: проблемы и перспективы сохранения» (Пенза, 2008);

V Междуна родной конференции «Изучение грибов в биоценозах» (Пермь, 2009);

I и II Меж дисциплинарных Микологических форумах (г. Москва, 2009, 2010);

Всероссий ской научно – практической конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Пенза, 2010);

ХХ Международном Салоне Инноваций и инвести ций (Москва, 2010);

Областном форуме «Инновационные технологии в медицине и фармакологии» (Пенза, 2011);

Второй международной выставке «Инновации и технологии», (Москва, 2011), IV Российском форуме «Российским инновациям – Российский капитал» (Оренбург, 2011).

Публикации. Автором опубликовано 95 работ, включая 13 статей в изданиях, входящих в “Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых ВАК …”, 66 работ (статьи и тезисы) в сборниках научных трудов, 2 монографии, 9 учебно методических изданий по экологической тематике, получены 5 патентов РФ и 2 положительных решения о выдаче.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит идея исследования, разработ ка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех ос новополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования и интерпретации полученных результатов. В сов местных публикациях доля автора составляла от 20 до 60%.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 9 глав, заклю чения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений.

Работа изложена на 370 страницах машинописного текста, основная часть содер жит 32 таблицы, 34 рисунка, 47 фотоиллюстраций. Список литературы включает 455 источников отечественных и зарубежных авторов.

Благодарности Автор выражает глубочайшую признательность научному консультанту, про фессору Лидии Васильевне Гарибовой. Слова искренней благодарности за важные советы и поддержку автор выражает заведующему кафедрой микологии и альголо гии МГУ им. М.В. Ломоносова профессору Ю.Т. Дьякову, а также ведущему науч ному сотруднику А.Н. Лихачеву и всем сотрудникам кафедры. За понимание и все стороннее содействие, неоценимую помощь автор благодарит своего учителя – профессора А.И. Иванова, за помощь в реализации приборных измерений – своих коллег: Д.Ю. Ильина, А.А. Костычева, А.В. Скобанева и всех сотрудников РЦГЭКиМ по Пензенской области.

Глава 1. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ЭКОСИСТЕМЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ (Обзор литературы) В главе приводится информация относительно функциональной роли ксило трофных базидиомицетов в экосистеме. Описаны особенности экологии предста вителей разных трофических и сукцессионных группировок ксилотрофных мак ромицетов в контексте их взаимодействия в процессе разложения древесины (Дроздова, Белова, 1982;

Денисова, 1991;

Змитрофич и др., 2007;

Арефьев, 2010;

Hatakka et al, 1993;

Evans, 1995;

Shiryaev et al., 2010). Указана уникальная способ ность ксилотрофных грибов к трансформации органических соединений расти тельного происхождения, которая сохраняется и в условиях чистой культуры (Горленко,1967;

Каламеес, 1975;

Бурова, 1986;

Решетникова, 1997;

Becker, 1956).

Проведен анализ концепций выделения узких трофических группировок среди ксилотрофных базидиомицетов, в частности по спектру субстратной специализа ции (Мурашкинский, 1939;

Частухин, 1945;

Мухин, 1993;

Брындина, 2000;

Сафо нов, 2006;

Vasiliauskas et. al., 2007). Уделено внимание ферментным системам гри бов белой и бурой гнили, а также истории вопроса относительно механизмов де струкции древесного субстрата грибами (Schacht, 1863;

Hartig, 1878;

Kirk, 1971;

Ander, Eriksson, 1978;

Eriksson, Vallander, 1980;

Kirk, 1983;

Otien and Blanchette, 1984;

Фенгел, 1988;

Morgan, Lewis, Watkinson, 1990;

Paszczynski, Crawford, 2008).

Подробно анализируется эволюция взглядов относительно статуса чистой культуры в эколого-микологических исследованиях (Высшие съедобные базидио мицеты..,1983;

Бухало, 1988;

Semerdgieva, 1965;

Stalpers, 1978).

В главе указываются направления использования ксилотрофных базидио мицетов в сфере производства пищевого белка, в целях биодеструкции поллютан тов различной природы, в качестве продуцентов БАВ (Горбатова и др., 2000;

Бо лобова и др., 2002;

Костина, 2008;

Паршин и др., 2008;

Ying et al, 1987;

Pointing, 2001;

Bending, et al., 2002;

Mori, Kondo, 2002;

Smith et al, 2002;

Mougin et al., 2002).

Резюмируется, что разработка приемов регуляции ростовых и синтетических про цессов у базидиомицетов в культуре с учетом их экологического статуса в природе является перспективным направлением исследований.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Регион Правобережного Поволжья обладает рядом специфических природ ных особенностей, что отражается как на видовом составе растительных субстра тов ксилотрофных базидиомицетов, так и на распространении и экологии послед них. Оценка экологической структуры микобиоты исследуемого региона проводи лась с использованием маршрутных полевых исследований в лесных экосистемах изученного региона. Определение грибов проводили с использованием определи телей (Бондарцев, 1953;

Бондарцева, Пармасто, 1986;

Бондарцева, 1998;

Julich, 1984). Порядки и семейства в работе приводятся по системе, приведенной на сайте Index Fungorum (CABI Databases, 2010). В качестве основной системы для опреде ления трофической специализации видов использована система В.Г. Стороженко (2002) с некоторыми модификациями, позволившими несколько конкретизировать понятия, применительно к региону исследований. Для лабораторных эксперимен тов отобраны 215 штаммов 44 видов ксилотрофных базидиомицетов, различаю щихся субстратной приуроченностью, степенью трофической валентности, типами вызываемых гнилей.

Выделение, оценка ростовых показателей и хранение чистых культур прово дилось по общепринятым методикам (Бухало, 1988). Для оценки штаммового раз нообразия разных видов в культуре использовали методику, основанную на прин ципе парных сравнений для построения аддитивных функций полезности (Елта ренко, 1995).

Определение содержания метоксильных групп (-ОСН3) в субстратах и древе сине разной степени разложения осуществлялось методом Цейзеля в модификации с применением газо-жидкостной хроматографии (Закис, 1987). В работе использо ван газовый хроматограф Varian CP 3800 с пламенно-ионизационным детектором, оснащнный капиллярной колонкой CP-Wax 52 CB (полиэтиленгликоль). С целью получения модельного соединения методом сернокислотного гидролиза в моди фикации Комарова был выделен лигнин Классона (Фенгел, 1988;

Оболенская, 1991;

Боголицин, 1994), а с целью перевода его в водный раствор была осуществ лена его перколяция (Грушников, 1973). Показатели оксидазной и пероксидазной активности мицелия определялись спектрофотометрически (Александрова, 1999;

Барыкина, 2000;

Стрельцов, 2009;

Gramss, 1997). Оценка целлюлазной активности проводилась косвенно с использованием глюкозооксидазного метода (Синицын, 1995). Определение содержания эргостерина в мицелии грибов осуществлялось ме тодом газо-жидкостной хроматографии (Грг, 1985) на хроматографе «Кристалл 2000 М» с пламенно-ионизационным детектором, оснащнным набивной колонкой с насадкой – 5% SE-30 на носителе «Инертон». Для построения градуировочных графиков использовались стандарты фирмы «Мerck». Оценка уровня окислитель ного стресса культур проводилась при помощи определения маркерного соедине ния – малонового диальдегида (МДА) по методу Michara et al. (1980). Активность фермента глутатионпероксидазы (ГПО) определяли в сопряженной системе с глу татионредуктазой по методу Mills (1959). Определение содержания общего белка, альбумина, триглицеридов, фракций холестерина в сыворотке крови эксперимен тальных животных, получавших кормовые добавки на основе мицелия грибов, про водили по общепринятым методикам (Методы клинических исследований, 1987).

Статистическая обработка проводилась с помощью программы «Statistica 6.0», дисперсионного и корреляционного анализов полученных массивов (ANOVA). Для оценки значимости полученных корреляционных коэффициентов использовался t-критерий Стьюдента при уровне значимости 0,95 (Халафян, 2007).

Глава 3. ЗНАЧЕНИЕ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ЛЕСОСТЕПИ ПРАВОБЕРЕЖНОГО ПОВОЛЖЬЯ В районе исследований описано 249 видов ксилотрофных базидиомицетов, отно сящихся к 99 родам, 40 семействам, 10 порядкам и 3 классам: Agaricomycetes, Dacrymycetes, Tremellomycetes.* Распространение в лесных экотопах лесостепи Право бережного Поволжья получили представители следующих порядков: Hymenochaetales, Polyporales, Russulales, Thelephorales, Agaricales, Boletales, Corticiales, Dacrymycetales, Auriculariales, Tremellales. Ядро ксилотрофной микобиоты составляют представители первых двух порядков. Ведущими по количеству видов семействами являются Polypo raceae, Strophariaceae, Pluteaceae, Mycenaceae, Inocybaceae, Hymenochaetaceae и Physalac riaceae. На них приходится более 60% выявленных видов ксилотрофных базидиомице тов. Коэффициент родовой насыщенности семейств, в среднем, составляет 2,62. Наибо лее крупными родами, насчитывающими свыше 5 видов, являются Phellinus, Polyporus, Mycena, Pleurotus, Pluteus и Pholiota (табл. 1). Определенную долю составляют роды, представленные одним видом (в составе семейств Bolbitiaceae, Coniophoraceae, Corti ciaceae, Cyphellaceae, Entolomataceae, Gloeophyllaceae, Gomphidiaceae, Fistulinaceae, Hy grophoropsidaceae, Meripilaceae, Schizophyllaceae, Sparassidaceae, Bondarzewiaceae, Stereaceae, Thelephoraceae, Tremellaceae) *В настоящей работе использована система Index Fungorum (CABI Databases, 2010) www.indexfungorum.org/Names/Names.asp Таблица Структура биоты ксилотрофных базидиомицетов лесных экосистем лесостепи Правобережного Поволжья (семейства, представленные более чем одним видом) Семейство Число Семейство Число родов/видов родов/видов (доля в составе (доля в составе биоты, %) биоты, %) Polyporaceae 16/36 (14,5) Tricholomataceae 4/5 (2,0) Strophariaceae 6/31 (12,4) Auriculariaceae 2/4 (1,6) Pluteaceae 2/28 (11,2) Schizoporaceae 2/4 (1,6) Mycenaceae 7/24 (10,0) Hericiaceae 2/3 (1,2) Hymenochaetaceae 3/14 (5,6) Marasmiaceae 2/3 (1,2) Inocybaceae 5/14 (5,6) Peniophoraceae 1/3 (1,2) Physalacriaceae 5/11(4,4) Phanerochaetaceae 3/3 (1,2) Psathyrellaceae 1/11(4,4) Lyophyllaceae 2/2 (0,8) Agaricaceae 4/10 (4,0) Dacrymycetaceae 1/2 (0,8) Fomitopsidaceae 6/7 (2,8) Ganodermataceae 1/2 (0,8) Pleurotaceae 2/7 (2,8) Paxillaceae 1/2 (0,8) Meruliaceae 4/5 (2,0) Tapinaceae 1/2 (0,8) Биологическое разложение древесины сопровождается сменой видового со става грибов. В зависимости от положения в сукцессионном ряду разложения дре весины и в контексте трофической специализации видов в данной работе будут использованы определения «облигатный паразит», «факультативный паразит», «факультативный сапротроф», «сапротроф». Преобладающей в районе исследова ний является группировка факультативных паразитов (рис. 1). Она складывается, в основном, представителями семейств Hymenochaetaceae, Polyporaceae, Fomitop sidaceae. Долю облигатных паразитов формируют отдельные агрессивные виды, такие как Heterobasidion annosum, Phellinus tremula, которые осуществляют зара жение живых деревьев, разложение их древесины, тем самым, разрушая древо стой. На уровне лесного сообщества указанные группы видов осуществляют стра тегическую задачу создания другого, более устойчивого и соответствующего эко топу по породным и структурным характеристикам фитоценоза.

Факультативная составляющая сапротрофного комплекса представлена вида ми, изредка заселяющими ослабленные деревья, однако чаще встречающимися на валеже и субстратах, подвергшихся частичному разложению. Эта группировка обеспечивает разрушение отмерших древесных растений, пней и сухостоя и фор мируется представителями семейств Meruliaceae, Stereaceae, отдельными предста вителями Polyporaceae (в частности, родов Trametes, Pycnoporus, осуществляющи ми деструкцию тонкомерного валежника).

Облигатные паразиты 4% 7% 18% Факультативные паразиты Факультативные сапротрофы 71% Сапротрофы Рис. 1. Доли группировок с различными трофическими стратегиями в соста ве биоты ксилотрофных базидиомицетов в районе исследований Группировка сапротрофов представлена видами, завершающими процесс де струкции древесных остатков и развивающимися на погруженном в почву, прак тически разложившемся отпаде или остатках пней, реже в гниющих дуплах дере вьев, таким образом, не оказывающими существенного влияния на структуру дре востоя. К этой группировке в районе исследований следует отнести представите лей родов Coprinus, Tubaria, Mycena, Pluteus, Volvariella, Hypholoma, Stropharia.

Биодеструкция клетчатки и лигнина древесины осуществляется базидиальны ми грибами, соответственно определяющими развитие бурой или белой гнили дре весины. Основную долю (73%) в составе ксилотрофной микобиоты района иссле дований составляют грибы белой гнили, грибы бурой гнили – порядка 18%, остальное (9%) – грибы смешанной гнили (рис. 2). Блок грибов белой гнили связан с консорциями основных лесообразующих (дуб, сосна) и мелколиственных, фор мирующих вторичные леса (береза, осина) пород. Это широко распространенные представители родов Trametes, Inonotus, Phellinus, Ganoderma. Меньший по объему блок грибов бурой гнили, связан, в основном, с лесообразующими породами: ду бом (Laetiporus sulphureus, Daedalea quercina, Fistulina hepatica) и сосной (Fomitopsis pinicola, Sparassis crispa). Грибы смешанной гнили также связаны с указанными породами и представлены, в частности, видами: Inonotus dryadeus, Phellinus pini, Heterobasidion annosum.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Доля, % от общего числа Грибы белой гнили Грибы смешанной гнили Грибы бурой гнили Рис. 2. Доли ксилотрофных базидиомицетов, вызывающих разные типы гнилей древесины в лесных сообществах района исследований Специфику видового состава Приволжской лесостепи, по сравнению с запад носибирской, создает присутствие видов, узкоспециализированных по отношению к древесине дуба. Они составляют 12% от видового состава изученной микобиоты, и, в основном создают ее неморальный элемент (Скобанев, 2010). По широте суб стратной специфичности среди ксилотрофных базидиомицетов выделяют: эв ритрофы первого порядка, развивающиеся на древесине всех основных лесообра зующих пород;

эвритрофы второго порядка, развивающиеся на древесине лист венных или хвойных пород;

стенотрофы, развивающиеся на древесине какой-либо одной породы (Брындина, 2000). Однако существуют виды, развивающиеся на близких видах древесных растений, или на очень небольшом количестве субстра тов. При этом их нельзя отнести к эвритрофам второго порядка, поскольку это по нятие охватывает только такую характеристику субстрата, как принадлежность к лиственным или хвойным породам. В связи с этим, представляется целесообраз ным подразделение группы стенотрофных видов на подгруппы: поливалентные (осваивающие набор близких субстратов) и моновалентные (встречающиеся лишь на одном характерном субстрате) стенотрофы. Таким образом, выделяется четыре группы. Такой классификации мы придерживаемся в настоящей работе.

Анализ трофических особенностей ксилотрофной микобиоты района иссле дований позволил выявить преобладание доли поливалентных стенотрофных ви дов (35,8%). Затем следуют моновалентные стенотрофы – 30,9%, эвритрофы вто рого порядка – 26,1% и, наконец, наименьшую долю составляют эвритрофы пер вого порядка – 7,2% (рис. 3).

Эвритрофы I порядка 7, Эвритрофы II 30, 26,1 порядка Поливалентные стенотрофы 35, Моновалентные стенотрофы Рис. 3. Соотношение долей группировок ксилотрофных базидиомицетов с различными особенностями трофической специализации в лесных экосистемах Правобережного Поволжья, % Стенотрофный блок в основном представлен видами, связанными с древеси ной дуба и сосны, причем названные субстраты зачастую характеризуются ярко выраженной спецификой видового состава колонизирующих их ксилотрофов.

Большинство прочих (лиственных) пород характеризуются довольно сходными микокомплексами.

В созданной нами коллекции мицелиальных культур поддерживаются 215 штаммов 44 видов ксилотрофных базидиомицетов. Среди них представлены виды, относящиеся к разным семействам порядков: Hymenochaetales: Coltricia per ennis (L.) Murrill, J. Mycol., Inonotus dryadeus (Pers.) Murrill, Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilt, Phellinus igniarius (L.) Qul., Ph. pini (Brot.) Bondartsev & Singer, Ph. robustus (P. Karst.) Bourdot & Galzin, Ph. tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P.N. Borisov;

Polyporales: Sparassis crispa (Wulfen) Fr., Daedalea quercina (L.) Pers., Fomitopsis pinicola (Sw.) P. Karst., Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst., Ganoderma applanatum (Pers.) Pat., Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst., Bjerkandera adusta (Willd.) P. Karst., B. fumosa (Pers.) P. Karst., Daedaleopsis confragosa (Bolton) J. Schrt., Fomes fomentarius (L.) J.J. Kickx, Lenzites betulina (L.) Fr., L. warnieri Durieu & Mont., Polyporus squamosus (Huds.) Fr., P. varius (Pers.) Fr., Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst., Trametes gibbosa (Pers.) Fr., T. hirsuta (Wulfen) Pilt, Т. рubescens (Schum.: Fr.) Pilat, T. suaveolens (Fr.)Fr., T. versicolor (L.) Lloyd;

Russulales: Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., Stereum hirsutum (Willd.) Pers.;

Agaricales: Chondrostereum purpureum (Pers.) Pouzar, Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth, Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm., Flammulina ve lutipes (Curtis) Singer, Pleurotus сornucopiae (Paulent) Rolland, P. dryinus (Pers.) P. Kumm., P. ostreatus (Jacq.) P. Kumm., P. pulmonarius (Fr.) Qul., Schizophyllum commune Fr., Pholiota aurivella (Batsch) P. Kumm., P. decussata (Fr.) M.M. Moser, Phyllotopsis nidulans (Pers.) Singer;

Thelephorales: Thelephora terrestris Ehrh., Auricu lariales: Auricularia mesenterica (Dicks.) Pers.

Среди изученных видов представлены эвритрофы первого и второго поряд ков, поли- и моновалентные стенотрофы в отношении древесных субстратов, ви ды, осуществляющие различные стадии разложения древесины в природе: обли гатные и факультативные паразиты, факультативные сапротрофы.

Обнаружено высокое разнообразие культурально-морфологических характе ристик у штаммов изученных видов. Отмечаются существенные различия в скоро стях роста, микро- и макроморфологии мицелия, формировании анаморф (бласто конидий, артроконидий, хламидоспор) в культуре, значениях ростовых коэффици ентов. Для оценки штаммового разнообразия разных видов в культуре нами пред ложено использовать методику расчета коэффициента вариабельности (QW) в пределах вида, основанную на принципе парных сравнений, используемом для по строения аддитивных функций полезности (Елтаренко, 1995). Данная методика позволяет учесть значение не только наличия или отсутствия тех или иных при знаков, но и возможные варианты их проявления, а также разные степени значи мости и объективности. Сравниваемые признаки представляли собой пять основ ных параметров, лежащих в основе культурально-морфологической характеристи ки штаммов (средняя скорость роста, тип колонии, характер анаморфы, наличие телеоморфы на стерильных средах и ростовой коэффициент). Были проведены расчеты QW для всех изученных видов, однако приводятся только для тех из них, представительство которых в коллекции превышало пять штаммов (рис. 4). При сопоставлении полученных результатов с эколого-трофическими характеристика ми видов в природе, обнаружена связь штаммового разнообразия в культуре с ши ротой трофического диапазона вида в природе, что подтверждает наши предполо жения. Максимальной вариабельностью (QW0,40) обладают виды, относящиеся к эвритрофам первого и второго порядков с позиций разнообразия древесных суб стратов произрастания и их степени разложения. Виды, характеризующиеся выра женной спецификой местообитания и трофической специализации, не проявляют в культуре значительной вариабельности в характеристиках штаммов (QW0,30).

A. mesentterica Ph. aurivella Sh. commone P. pulmonarius P. ostreatus F. velutipes F. hepatica Th. terrestris S. hirsutum H. annosum T. versicolor T. hirsuta T. gibbosa P. cinnabarinus L. warnieri L. betulina F. fomentarius B. adusta G. lucidum G. applanatum P. betulinus L. sulphureus F. pinicola Ph. tremulae Ph. robustus Ph. pini I. obliqus C. perennis 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0, QW Рис. 4. Различные степени штаммовой вариабельности видов ксилотрофных ба зидиомицетов в условиях чистой культуры Определенную долю составляет группа видов, для которых характерна сред няя степень вариабельности культуральных признаков, незначительная разница в скоростях роста, слабо выраженные отличия в макро- и микроморфологии (0,30QW0,40). Их субстраты представлены небольшим набором видов, но отме чается варьирование положения в сукцессионных рядах разложения древесины.

Полученные данные свидетельствуют о существовании связи между широтой субстратной специализации вида в отношении природного древесного субстрата и степенью его внутривидового полиморфизма в культуре.

Глава 4. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ШТАММОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ При погруженном культивировании выявлены несколько морфотипов глу бинного мицелия: мицелиальные филаменты – роды Bjerkandera, виды C. perennis, I. dryadeus, I. obliquus, S. hirsutum, F. hepatica, S. commune;

рыхлые, опушенные пеллеты – роды Phellinus, Polyporus, а также виды P. betulinus, L. sulphureus, H. annosum, F. pinicola;

плотные пеллеты с гладкой поверхностью – представители рода Ganoderma, а также видов F. fomentarius, P. cinnabarius. Причем среди пеллет последнего типа обнаруживаются гигантские, с тенденцией к дифференцировке мицелия внутри такой структуры, что отмечено для культур видов – представите лей родов Trametes, Lenzites. Размеры структур варьировали в довольно широких пределах (от 10,0 мкм до 12,5 мм). Образование плотных пеллет у афиллофороид ных грибов характерно для видов с димитической и тримитической гифальными системами, тогда как преимущественно филаментный рост – для видов с мономи тической. Наблюдается своеобразная параллель: моно- – ди- – тримитическая гифальная система и филаменты – рыхлые пеллеты – плотные пеллеты с внутрен ней дифференциацией (рис. 5). Проведенный анализ соответствий на основе вы борки, составленной представителями афиллофороидных грибов, позволил уста новить наличие трех групп, различающихся по типу морфологических структур при глубинном развитии. Обособленность существующих группировок отмечается с большим значением инерции (=99,27%), что свидетельствует в пользу предпо лагаемой закономерности.

У различных видов и штаммов обнаружена разная способность к накоплению биомассы, а также установлено, что эти параметры определенным образом (r=0,45) коррелируют со скоростями роста мицелия в поверхностной культуре (рис. 6).

а) б) в) Рис. 5. Основные морфотипы глубинного мицелия штаммов различных видов:

а) филаменты C. perennis (штамм CPe-3) ( 200);

б) рыхлые опушенные пеллеты F. pinicola (штамм Fpi-2) ( 200);

в) плотная гигантская пеллета T. versicolor (штамм Trw-2) (в натуральную величину), на поперечном срезе заметна тенденция к дифференциации мицелия (показана стрелкой) Scatterplot: Var1 vs. Var2 (Casewise MD deletion) Var2 = 1,8650 +,30594 * Var Correlation: r =, Var -2 0 2 4 6 8 10 12 95% confidence Var Рис. 6. Корреляционная зависимость и уравнение регрессии между показате лями скоростей роста и накопления биомассы глубинного мицелия у штаммов различных видов ксилотрофных базидиомицетов (вариант 1 – средняя скорость роста, мм/сут;

вариант 2 – биомасса, г/л) Таким образом, исходя из известных показателей скорости роста мицелия штамма на агаризованных средах, с высокой вероятностью можно предполагать продуктивные свойства культуры, что упрощает процесс скрининга штаммов, пер спективных в биотехнологии.

У штаммов изученных видов ксилотрофных базидиомицетов выявлены суще ственные различия в отношении к содержанию кислорода в культуральной жидко сти. Кластерный анализ на основе метода «ближайшего соседа» позволил обнару жить, что установленные отличия прослеживаются у культур на видовом уровне.

Сравнительно большая потребность в кислороде объединяет культуры видов, об разующих in situ однолетние плодовые тела: C. perennis, I. obliquus, L. sulphureus, P. betulinus, B. adusta, P. cinnabarinus, F. hepatica, S. commune.

Обнаружена тенденция связи между потребностью в кислороде и характером гнили древесины, отмечаемым для того или иного вида в природе. Повышенные концентрации предпочитают виды, для которых показана заболонная гниль, а низ кое содержание растворенного кислорода удовлетворяет виды, вызывающие серд цевинную гниль. Однако для более четких выводов в данном контексте выборка недостаточна, поэтому следует говорить лишь о тенденциях такой связи.

Глава 5. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ВИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ТРОФИЧЕСКИМИ СТРАТЕГИЯМИ В УСЛОВИЯХ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ Для исследований были отобраны представители облигатных паразитов:

Ph. tremulae, S. crispa, H. annosum;

факультативных паразитов: I. obliquus, L sulphureus, F. fomentarius, F. hepatica и факультативных сапротрофов: F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum и P. cinnabarinus.

Выявлены отличия в предпочтении разных питательных сред представителя ми различных трофических группировок (использован непараметрический тест Дункана). Для группировки облигатных паразитов на всех изученных средах уста новлены минимальные скорости роста. У факультативных паразитов и факульта тивных сапротрофов на всех изученных средах отмечены относительно высокие средние скорости роста, причем последние наилучшим образом развивались на крахмалистых средах. Более полной реализации физиологического потенциала об лигатных и факультативных паразитов, прежде всего редких и ценных в биотех нологии видов, можно достичь использованием некоторых ростовых факторов, а также адаптогенов различной природы.

Изучено воздействие парааминобензойной кислоты (ПАБК) на рост и разви тие культур. Установлено, что ПАБК в концентрации 0,005 г/л оказывает позитив ное влияние на развития мицелия большинства штаммов изученных видов, разли чающихся трофическими стратегиями и представляющих интерес с позиций прак тической экологии и биотехнологии (рис. 7).

Средняя скорость роста, мм/сут 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Штаммы Ряд1 Ряд Рис. 7. Влияние ПАБК на скорость роста штаммов ксилотрофных базидио мицетов: ряд 1 – контроль (КГА);

ряд 2 – опыт (КГА+ПАБК). Штаммы: I. obliquus:

1-IO-1, 2-IO-2, 3-IO-3;

Ph. tremulae: 4-Pht-1, 5-Pht-2;

6-Pht-3;

S. crispa: 7-AI-10;

F. pinicola: 8-Fpi-1, 9-Fpi-2, 10-Fpi-3;

L. sulphureus: 11-РD-99, 12-РD-01, 13-Аh-02;

G. applanatum: 14-G-1, 15-G-2, 16-G-3;

G. lucidum: 17-Gl-1, 18-Gl-3, 19-Gl-6;

F. fomentarius: 20-AH-96, 21-Nic-02, 22-Lp-05;

P. cinnabarinus: 23-PyC-1, 24-PyC-2, 25-PyC-4;

H. annosum: 26-Han-1, 27-Han-2, 28-Han-3;

F. hepatica: 29-Fh-1, 30-Fh 1а, 31-Fh-5 (планки погрешностей – ошибка средней, р0,05) Не изменяя существенно темпов развития в целом, ПАБК сокращает продол жительность фазы адаптации культур видов, обладающих паразитной трофикой (Ph. tremulae, S. crispa, H. annosum) к субстрату. Характерной чертой влияния ПАБК на штаммы факультативных паразитов и факультативных сапротрофов ока залось позитивное воздействие на стадиях логарифмического и стационарного ро ста, когда доступные ресурсы субстрата в большей степени исчерпаны.

Полученные результаты косвенно свидетельствуют о стимуляции обменных процессов у факультативных сапротрофов, связанных с вовлечением в метаболизм труднодоступных источников углерода.

В качестве адаптогенных добавок также испытаны селенат натрия (Na2SeO4) и 9-фенил-симметричный-октагидроселеноксантен (селенопиран, СП-1). Соедине ния вносили в среду в концентрациях 10 -6 г/л в пересчете на селен. Оценка резуль татов с использованием теста Дункана показала, что виды, склонные к паразитной трофике в природных условиях, обнаруживают факты стимуляции органической формой селена, а обладающие сапротрофной трофикой – неорганической. Общей тенденцией является более ранний переход к фазе стационарного роста, при этом отмечается существенное сокращение фазы адаптации, и незначительное сокра щение фазы логарифмического роста. Эффект синхронизации развития культуры отмечался нами ранее на примере микромицетов – продуцентов антибиотиков (Ильина и др., 2000). Позитивное воздействие селенопирана на развитие штаммов облигатных паразитов, вероятно, определяется частичным снятием окислительно го стресса, неминуемо развивающихся у паразитов ex situ.

Обнаруженные факты позволяют рекомендовать ряд соединений (парааминобензойная кислота, селенат натрия, 9-фенил-симметричный октагидроселеноксантен) в качестве компонентов питательных сред для культивирования изолятов ксилотрофных базидиомицетов.

Глава 6. ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОЕДИНЕНИЙ СЕЛЕНА ПРИ ХРАНЕНИИ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ При длительном хранении и частых пересевах культуры нередко изменяют физиологические и продуктивные параметры. Отчасти это обусловлено спонтан ной диссоциацией штаммов, инициируемой окислительными стрессами.

Изучены возможности использования соединений селена (селенат натрия, 9-фенил-симметричный-октагидроселеноксантен) при хранении культур S. crispa и G. lucidum. Состояние культур оценивалось по маркерным показателям: ско рости роста, степени базофилии протоплазмы, оксидазной активность культу ры. Установлено, что указанные соединения способствуют сохранению физио логических параметров хранящихся культур в течение 18–24 месяцев.

Предположение о том, что соединения селена нивелируют негативное вли яние свободных радикалов, нашло подтверждение при определении содержания в мицелии хранящихся культур биохимического маркера окислительного стресса – малонового диальдегида (МДА). Предварительно проведенный ана лиз жирнокислотного состава мицелия выявил преобладание ненасыщенных жирных кислот (моноеновых, диеновых), что свидетельствует о существовании ресурса для образования МДА при активизации окислительных процессов.

Уровень МДА в мицелии определяли на этапе адаптации к субстрату, в пери оды логарифмического и стационарного роста, на разных сроках хранения. В фазу адаптации уровень МДА находится на довольно высоком уровне, что свидетель ствует о наличии окислительного стресса (табл. 2). С переходом культур к логарифмическому и стационарному росту содержание МДА в мицелии не сколько снижается и стабилизируется.

Таблица Содержание малонового диальдегида в мицелии штаммов G. lucidum и S. crispa на стадии активного роста и после продолжительного хранения при температуре 4°С (нмоль/г) Время развития мицелия с мо- Виды, штаммы мента инокуляции G. lucidum S. crispa Gl-1 Gl-3 Gl-6 AI- трое суток 88,6±2,14 102,1±1,22 94,5±2,05 123,4±3, (фаза адаптации) пять суток 64,6±1,96 80,5±2,04 85,1±4,43 112,7±5, (фаза логарифмического роста) семь суток 59,9±2,55 75,9±4,37 82,1±3,29 88,4±1, (фаза стационарного роста) девять суток 60,1±2,81 87,8±3,47 90,2±4,75 84,2±3, (фаза стационарного роста) После хранения в течение:

3 месяцев 40,8±1,80 51,2±6,38 141,9±4,75 77,8±6, 6 месяцев 93,8±7,24 84,9±8,23 210, 5±5,79 126,9±4, 9 месяцев 115,9±3,53 171,5±4,59 262,3±1,75 162,5±5, 12 месяцев 148,1±4,57 214,0±6,57 105,2±2,72 147,9±5, 18 месяцев 107,8±4,08 177,6±5,47 104,2±1,78 24 месяцев 91,2±2,54 168,1±3,21 100,6±3,33 Содержание МДА в образцах мицелия, хранящегося на средах с добавлением соединений селена, сравнивали с показателями, отмеченными в контроле на ста дии логарифмического роста (рис. 8).

Исходное содержание в контрольном образце, Процент от исходных принятое за 100% показателей 0пыт Опыт 3 мес.

6 мес Контроль 9 мес.

12 мес.

18 мес.

24 мес Рис. 8. Динамика содержания малонового диальдегида (МДА) в образцах ми целия G. lucidum (на примере штамма Gl-3) при продолжительном хранении на различных средах: контроль – КГА;

опыт 1 – КГА, обогащенный Na2SeO4;

опыт 2 – КГА, обогащенный 9-фенил-симметричным-октагидроселеноксантеном (веще ства добавлены в концентрации 10-4 г/л среды в пересчете на селен) Полученные результаты свидетельствуют о значительном нивелировании для мицелия фактора окислительного стресса и целесообразности использования со единений селена в практике хранения культур ксилотрофных базидиомицетов.

Глава 7. АДАПТАЦИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ПОЛИЕНОВОГО МАКРОЛИДА НИСТАТИНА Эргостерин, входящий в состав мембран грибов, является своеобразной био химической мишенью для повреждающего действия полиеновых макролидов, в том числе нистатина. В литературе сообщается о различных механизмах, обеспе чивающих устойчивость к нистатину у дрожжей и мицелиальных грибов, которые в той или иной степени связаны с изменением синтеза эргостерина, однако, по данному вопросу нет единого мнения. Вероятно одновременное существование различных систем адаптации.

В качестве объектов исследования изучены тканевые (Gl-1, Gl-3, Gl-6) и спо ровые (GD-I-1, GD-I-2, GD-I-4) изоляты G. lucidum. Определена концентрация ни статина, лимитирующая развитие изученных штаммов (120 ЕД/мл), условно эти штаммы названы полиенчувствительными. Путем высева базидиоспор на пита тельные среды, содержащие нистатин в указанной концентрации, получены пять полиентолерантных дикариотических штаммов G. lucidum: GD-II–ун1, GD-II–ун2, GD-II–ун3, GD-II–ун4, GD-II–ун5.

Обнаружены различия в содержании эргостерина даже между обычными (по лиенчувствительными) штаммами G. lucidum в 1,3–2,1 раза. Значительное его со держание обнаружено в мицелии штамма Gl-1, характеризующегося повышенной склонностью к образованию базидиом в чистой культуре. Показатели содержания эргостерина в мицелии изученных полиентолерантных штаммов превышают сред нее значение, установленное для полиенчувствительных в 2,0–2,4 раза (рис. 9).

Содержание эргостерина, мг% 0, 0, 0, 0, 0, GD II GD II GD II GD II GD II Gl -1 Gl -3 Gl -6 GD-I- GD-I- GD-I – ун1 – ун2 – ун3 – ун4 – ун5 1 2 Содержание эргостерина в разных штаммах Среднее для полиенчувствительных штаммов Рис. 9. Содержание эргостерина в образцах мицелия разных штаммов G. lucidum (р0,05, планки погрешностей – ошибка средней) Полиентолерантные штаммы быстро формируют примордии. Дифференциро ванные зачатки плодовых тел, имеющие типичную для вида структуру, образуют ся в короткие сроки (9–12 суток от момента посева). Отмечена своеобразная цепь событий: после освоения вегетативным «первичным» мицелием площади пита тельной среды, поверх образуется бархатистая корочка, богатая артроспорами. Из артроспор прорастает «вторичный» мицелий, образующий плотные островки, на которых формируются зачатки плодовых тел (рис. 10).

Рис. 10. Формирование примордиев G. lucidum: слева штамм GD II-ун1, спра ва штамм GD II-ун Результаты определения содержания эргостерина в частях мицелия и базиди омах свидетельствуют о сопряженности морфогенетических процессов и интен сивности биосинтеза эргостерина у изученного вида (рис. 11).

мицелии, % от массы эргостерина в сухом 0, 0, Содержание 0, 0, 0, 0, GDII -ун1 GDII -ун Штаммы Вегетативный мицелий Коричневая корочка Примордии Базидиомы Рис. 11. Содержание эргостерина в разных частях мицелия колоний G. lucidum (р0,05, планки погрешностей – ошибка средней) Изучены также полиенчувствительные штаммы P. ostreatus: ПН-10, PlО(K)- (тканевые изоляты);

PlО-I-09 PlО-I-10 (споровые изоляты), а также полиентоле рантные споровые изоляты (Pl-ун1, Pl- ун2, Pl-ун3, Pl-ун4, Pl-ун5). Некоторые из полиентолерантных штаммов характеризовались исключительно медленным ро стом, а другие, напротив, интенсивным. Среди таких штаммов обнаружены как характеризующиеся относительно высокими, так и пониженными, по сравнению с контрольными штаммами, показателями содержания эргостерина (рис. 12).

эргостерина, мг% 0, Содержание 0, 0, 0, Pl-ун1 Pl-ун2 Pl-ун3 Pl-ун4 Pl-ун5 ПН-10 PlО PlО-I- PlО-I (K)-05 09 Содержание эргостерина в разных штаммах Среднее для полиенчувствительных штаммов Рис. 12. Содержание эргостерина в образцах мицелия разных штаммов P. ostreatus Штаммы с повышенным содержанием эргостерина обладали более выражен ной склонностью к образованию примордиев, а у штаммов с пониженным его со держанием их образование происходило менее интенсивно (рис. 13).

а) б) в) Рис. 13. Примордии на мицелии штаммов P. ostreatus: а) полиенчувстви тельный штамм ПН-10 (тканевый изолят);

б) полиентолерантный штамм Pl-ун1;

в) полиентолерантный штамм Pl-ун Таким образом, изученные виды ксилотрофных базидиомицетов, являющиеся в свою очередь исключительно важными объектами биотехнологии, характеризу ются разными стратегиями формирования устойчивости к экзогенному воздей ствию полиенов. Установленные закономерности могут быть использованы при скрининге штаммов – перспективных продуцентов эргостерина, а также склонных к плодоношению в условиях культуры.

Глава 8 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСТОЧНИКОВ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЛИГНИНА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ Лигнин, как компонент природного субстрата ксилотрофов, влияет на морфо генез гриба в естественных условиях (Фенгел, 1988). В качестве трофических фак торов изучены формы лигнина с разной степенью конденсации молекулы – экстрагированные системой полярных и неполярных растворителей нативные и метанолизные опилки древесины дуба. Экстрагирование материала обеспечивает возможность развития на нем видов, которые не встречаются в природе на древе сине дуба и прочих лиственных пород. Метанолиз – модификация лигнинсодер жащего материала, позволяющая существенно увеличить в нем число доступных метоксильных групп и олигомерных фрагментов лигнина (Закис, 1987). Содержа ние метоксильных групп в нативных опилках составляло 18,9 мг/г материала или 0,61 мМ/г;

а в опилках, подвергшихся метанолизу – 41,6 мг/г (1,32 мМ/г), что в це лом соответствует определенным нами показателям соответственно, в здоровой и фаутной древесине дуба (Ильина и др., 2006). Содержание холоцеллюлозы в об разцах опилок отличалось недостоверно и составляло от 78,7 до 81,6%.

Установлено, что факультативные сапротрофы активнее осваивают метано лизный субстрат. Альтернативные группировки, напротив, лучше развиваются на нативных опилках. Сапротрофные виды эволюционно адаптированы к эффектив ному использованию обилия метоксильных групп в значительной степени разру шенной древесины, что следует учитывать при работе с их культурами.

Изучение активности ферментов ксилотрофных базидиомицетов проводилось при твердофазном культивировании на экстрагированных нативных и метанолиз ных дубовых опилках, пропитанных солевым раствором Чапека. Полученные дан ные представлены на примерах штаммов, для которых отмечены максимальные показатели, однако выявленные и описываемые ниже закономерности прослежи ваются на видовом уровне (табл. 3).

На метанолизных опилках, по сравнению с нативными, достоверно снижается общая оксидазная активность у паразитных видов, что, вероятно, определяется воздействием фенольных компонентов субстрата. Это, возможно, и является од ной из причин приуроченности этой группы грибов к живым деревьям, древесина которых на начальных этапах колонизации имеет небольшое, по сравнению с фа утной, содержание мономерных и олигомерных фенольных структур (Фенгел, 1978).

Таблица Общая оксидазная, пероксидазная и целлюлазная активность мицелия штаммов изученных видов на нативных (Н) и метанолизных (М) опилках Штамм Ферментативная активность общая оксидазная, общая общая целлюлазная ед.оп.пл.100/гсек пероксидазная, (по убыли ед.оп.пл.100/гсек холоцеллюлозы), % Н М Н М Н М 0,65±0,13 0,61±0,12 0,53±0,11 5,80±1,16 8,30±1,66 18,30±3, I. obliquus, IO- 0,24±0,05 0,11±0,02 2,64±0,53 1,12±0,22 1,70±0,34 3,60±0, Ph. tremulae, Pht- 0,09±0,02 0,33±0,07 0,26±0,05 0,11±0,01 14,10±2,82 20,32±4, F. pinicola, Fpi- 0,11±0,02 0,13±0,03 13,73±2,74 17,67±3, L. sulphureus, - Аh- G. applanatum, 0,09±0,02 0,19±0,04 1,75±0,35 4,00±0,80 7,80±1,56 18,22±3, G- 0,38±0,08 0,58±0,12 2,06±0,41 5,90±1,18 8,12±1,62 19,68±3, G. lucidum, Gl- F. fomentarius, 0,15±0,03 0,27±0,05 1,83±0,36 2,90±0,58 5,97±1,18 9,62±1, Lp- P. cinnabarinus, 0,62±0,12 0,51±0,10 0,53±0,11 6,91±1,38 14,62±2, PyC- 0,31±0,06 0,13±0,03 0,45±0,09 10,30±2,06 17,56±3, H. annosum, Han- 0,32±0,06 0,19±0,04 0,47±0,09 15,90±3,18 16,55±3, F. hepatica, Fh- Установленное увеличение оксидазной активности на субстрате с доступны ми фенольными компонентами лигнина у сапротрофных видов, может свидетель ствовать о наличии у них индуцибельных форм оксидазных ферментов. Метано лизный субстрат может содержать разнообразные фенольные компоненты, такие как сирингалдазин, гваякол, пирокатехин и другие, являющиеся индукторами био синтеза ферментов, в частности лакказ (Горбатова, 2007).

При развитии на нативном субстрате все виды грибов обладают в разной сте пени выраженной пероксидазной активностью, а выявленные отличия в основном связаны не с широтой трофической специализации, а с типом вызываемой гнили.

Высокая активность характерна, за редким исключением, для возбудителей белой (Ph. tremulae, G. applanatum) и смешанной гнили (F. fomentarius). Возбудители бу рой гнили при культивировании на метанолизных опилках показали снижение ак тивности пероксидаз.

При развитии на нативных опилках представители бурой гнили активнее, чем представители белой, разрушали целлюлозу, при этом достоверных отличий в утили зации целлюлозы на разных субстратах у грибов бурой гнили не обнаружено. Рост на метанолизном субстрате сопровождался более интенсивным потреблением целлюлозы у представителей белой гнили. Фенольные компоненты лигнина, и, в частности, со держащие метоксильные группы, индуцируют выработку целлюлазных ферментов у грибов этой группы (Muller, 1988). Это подтверждается полученными результа тами и свидетельствует о целесообразности дериватизации лигноцеллюлозных субстратов для биоконверсии.

В ходе исследований общей оксидазной и общей пероксидазной активностей обнаружены достоверные различия показателей у штаммов грибов белой гнили, чего не отмечено для представителей бурой. Для выяснения возможных зависимо стей в эксперимент были включены 15 видов грибов (по пять штаммов каждого, итого 75 штаммов), вызывающих белую коррозионную гниль древесины:

C. perennis, I. obliquus, Ph. tremulae, G. applanatum, G. lucidum, B. adusta, F. fomentarius, L. betulina, L. warnieri, P. cinnabarinus, T. gibbosa, T. hirsuta, T. versicolor, H. annosum, T. terrestris. Данные, полученные при исследовании ско ростей роста на лигноцеллюлозном субстрате, результаты определения общей ок сидазной и общей пероксидазной активностей штаммов были сопоставлены с их «исходными» ростовыми характеристиками, зафиксированными на сусло-агаре.

Обнаружена корреляция ростовых показателей на агаризованных и твердофазных субстратах (r = 0,76, р0,05). Это позволяет оперировать терминами «относитель но быстрорастущие» и «относительно медленнорастущие» без дополнительных уточнений, не принимая во внимание характер субстрата. Установлено существо вание зависимостей между скоростью роста мицелия и сторонами ферментативной активности у культур изученных видов (рис. 14).

Рис. 14. Трехмерная проекция зависимости уровней общей оксидазной (ООА) и общей пероксидазной (ОПА) активностей штаммов от средних скоростей роста мицелия Таким образом, быстрорастущие штаммы грибов белой гнили, в среднем ха рактеризуются более высокой общей пероксидазной, а медленнорастущие – общей оксидазной активностью. Данную закономерность, с определенной долей вероят ности (r=0,86 по оксидазной активности и r=0,30 – по пероксидазной), можно ис пользовать в ходе скрининга перспективных штаммов.

Изучено влияние лигноцеллюлозных компонентов на процесс накопления биомассы и синтез эргостерина культурами в глубинных условиях. Эксперимен тальные среды были приготовлены на основе экстрактов – перколятов лигнинов Классона (Оболенская, 1991), в которые было добавлено 30,0 г/л глюкозы и 3,0 г/л целлобиозы. При анализе сухого вещества перколятов нативного и метанолизного лигнинов была установлена существенная разница в содержании метоксильных групп – показатели составили 2,50±0,06 мМ/г и 7,45±0,03 мМ/г соответственно.

Контрольной служила среда Чапека, модифицированная комплексом сахаров ана логично экспериментальным средам.

Внесение перколятов позитивно повлияло на ход накопления биомассы мице лия изученных видов, причем большинство штаммов (за исключением облигатных паразитов) наилучшим образом реагировали на внесение метанолизного лигнина (табл. 4).

Таблица Влияние перколятов лигнина на процесс накопления биомассы и синтез эргостерина мицелием некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов Вид, штамм Варианты питательных сред (на основе среды Чапека) контроль экстракт нативного экстракт метанолизного лигнина лигнина масса % эрго- масса % эргосте- масса навес- % эрго навески стерина навески (мг) рина ки (мг) стерина (мг) I. obliquus, 2983,7 0,74 3113,3 0,79 3023,0 1, a a* a a* a b* ±182,1 ±0,04 ±133,1 ±0,02 ±104,3 ±0, IO- Ph. tremulae, 1611,2 0,41 2052,3 0,46 0, 1439, a a* b a* b* ±71, ±131,0 ±0,01 ±152,7 ±0,02 ±0, Pht- F.pinicola, 0,38 7529,5 0,35 8506,1 0, 5694, a* a a* b a* ±82,4 ±0,03 ±151,5 ±0,04 ±153,8 ±0, Fpi- L. sulphureus, 5782,1 0,32 6108,1 0,41 6832,3 0, a* a a* b b* РD-99 ±80,7 ±0,07 ±78,9 ±0,02 ±132,1 ±0, G. applana- 4321,8 1,08 4751,1 1, 3179,3 0, a a* b a* ±102,2 ±0,09 ±122,5 ±0,03 ±144,4 ±0, tum, G- G.lucidum, 3638,2 0,87 0,91 5303,2 1, 3104, a a* a* b b* ±121, ±74,2 ±0,01 ±0,02 ±139,1 ±0, Gl- F.fomentarius, 3081,7 5831,3 1,20 4107,2 1, 1, b a* a b* ±83,7 ±0,04 ±160,3 ±0,06 ±182,6 ±0, Nic- P. cinnabari- 1,11 5062,8 1,19 3619,5 1, 3292, a* b a* a b* ±90,3 ±0,13 ±144,8 ±0,02 ±172,9 ±0, nus, PyC- H. annosum, 2894,3 0,65 2774,3 0,68 1652,3 0, b a* b a* a b* ±100,2 ±0,01 ±102,9 ±0,03 ±23,9 ±0, Han- F. hepatica, 1,60 3575,7 1,72 4643,4 1, 2093, a* a b* b a* ±89,6 ±0,04 ±113,1 ±0,04 ±84,8 ±0, Fh- Примечание: результаты теста Дункана –a,b – маркировка групп по достоверным различиям в показателях биомассы;

a*,b* - по содержанию эргостерина Данный показатель следует рассматривать как один из факторов, определяю щих положение вида в сукцессионных рядах деструкции древесины в природе.

Содержание эргостерина выше в образцах мицелия, выращенного на средах с добавлением перколятов метанолизного лигнина, что достоверно отмечено для представителей белой гнили, и, как исключение для представителя бурой гнили L. sulphureus (см. табл. 4). Стимуляция процессов образования эргостерина не об наруживает достоверной корреляции с процессами стимуляции накопления био массы мицелия. Вероятно, помимо затрат этого вещества на пластический обмен, культуры накапливают материал для синтеза на его основе веществ и образования структур на последующих стадиях развития, формируя резерв для синтеза вторич ных метаболитов, связанных с протеканием репродуктивных процессов. Установ ленные закономерности предполагают исследование влияния лигноцеллюлозных компонентов субстратов на процессы образования репродуктивных структур в условиях поверхностного культивирования на плотных средах.

При внесении в картофельно-глюкозный агар (КГА) опилок в количестве 2% от массы среды, обнаружен факт стимуляции роста большинства штаммов. У ряда культур, в присутствии лигноцеллюлозных источников, на 12–15 сутки развития было отмечено формирование мицелиальных узелков, а на 20–25 сутки сформиро вались типичные примордии (табл. 5).

Таблица Формирование зачатков плодовых тел на мицелии штаммов изученных видов ксилотрофных базидиомицетов на разных средах в стерильных условиях Вид, штамм Сроки появления зачатков плодовых тел (сутки после холо дильника) и их дифференцирование на разных средах* КГА (контроль) КГА + нативные КГА + метанолиз опилки ные опилки 12 15 20 25 12 15 20 25 12 15 20 +д + +д +д I. obliquus, IO-1 - - - - + + + + Ph. tremulae, Pht-1 - - - - - - + + - + + + S. crispa, AI-10 - - - - - - - - - - - F.pinicola, Fpi-2 - - - - - - - - - - - L. sulphureus, РD-01 - - - - - - - - - - - +д G. applanatum G-1 - - - ++ + + + + + + +д + +д +д + +д +д +д G.lucidum, Gl-1 - - + + +д +д +д F.fomentarius, Nic- - - - - - - - + + +д +д P.cinnabarinus, - - - - - - - - + + PyC- Вид, штамм Сроки появления зачатков плодовых тел (сутки после холо дильника) и их дифференцирование на разных средах* КГА (контроль) КГА + нативные КГА + метанолиз опилки ные опилки H. annosum, Han-2 - - - - - - - - - - - F. hepatica, Fh-5 - - - - - - - - - - - +д - +д +д - +д +д +д F. velutipes, FV-9 - - + + +д +д - +д +д - +д +д P. ostreatus, - - + + PlО(23)- +д +д S. commune, SZ-2 - - - - - - - - - +д +д P. aurivella, PhoA-5 - - - - - - - + - + *Обозначения: «-» – примордиев не отмечено;

«+» отмечены зачаточные структу ры примордиев (узелки);

«д» – дифференцированные примордии, заметен гимено фор На средах, содержащих метанолизные источники лигнина, отмечено раннее формирование базидиом P. ostreatus, F. velutipes, F. fomentarius, S. commune, P. au rivella, P.cinnabarinus. Примордии на таких средах характеризовались, по сравне нию с контрольными вариантами, более выраженными, типичными для видов га битусами, с хорошо выраженной дифференциацией (рис. 15).

Рис. 15. Базидиомы, сформированные на КГА с добавлением метанолизных опилок, 20 сутки: слева – P. cinnabarinus (штамм PyC-1), справа – P. aurivella (штамм PhoA-5) Образование зачатков плодовых тел и базидиом наблюдалось только у пред ставителей грибов белой гнили. Модельные опыты показали, что грибы этой груп пы активно деметилируют метоксильные группы (Фенгел, 1988). Опыты с мече ным (14С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами белой гнили конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из меток сильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и аромати ческих колец. Таким образом, нет сомнения в том, что метоксильные группы не безразличны для культур грибов белой гнили. Метоксильные группы лигнина (концентрация которых заметно выше в древесине, уже подвергшейся процессам деструкции в природе), могут служить факторами плодоношения не только в ис кусственных, но и в естественных условиях, где могут выступать также и своеоб разным фактором отбора.

Глава 9. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАЗИДИОМ И ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ МИЦЕЛИЯ Ganoderma lucidum Разработки, связанные с исследованиями возможностей получения стадии те леоморфы у грибов, перспективных в качестве продуцентов биологически актив ных веществ, актуальны по многим причинам (возможность верификации вида, ведение селекционной работы). Основным компонентом разработанных нами суб стратов для получения плодовых тел G.lucidum по интенсивной технологии слу жила гидролизованная ржаная солома. Субстрат подвергался кислотному гидроли зу, об эффективности которого судили по убыли массы и совокупной концентра ции сахаров в перколяте. Затем гидролизованный субстрат запаривался и поме щался в термоустойчивые пластиковые пакеты, которые укупоривались ватно марлевыми пробками и подвергались стерилизации. Изучены следующие компо зиции:

- гидролизованная солома – традиционный субстрат, контроль;

- гидролизованная солома в комплексе с экстрагированными нативными опилками (80% : 20%) – первый вариант;

- гидролизованная солома с экстрагированными метанолизными опилками (80% : 20%) – второй вариант.

Процессы морфогенеза протекали более интенсивно в вариантах с использо ванием метанолизных опилок: примордии, появившиеся, в среднем, на 12 суток ранее, чем в альтернативном варианте и контроле, характеризовались ярко выра женной пигментацией. Показательно сравнение состояния базидиом, полученных при реализации первого и второго вариантов опытов на 55 сутки развития, когда базидиома, полученная на субстрате с метанолизными опилками, уже приступила к спороношению, а у выросшей на субстрате, содержащем нативные опилки, толь ко началось формирование гименофора (рис. 16). Таким образом, отмечена досто верная стимуляция морфогенетических процессов метанолизными лигноцеллю лозными компонентами субстрата. Метоксильные группы лигнина могут служить фактором, стимулирующим переход культуры к вторичному метаболизму, по скольку одной из иллюстраций этой фазы развития служит телеоморфа.

Рис. 16. Базидиомы G. lucidum, полученные в лабораторных условиях на суб стратах разного состава (55 сутки развития с момента инокуляции субстратов): на переднем плане – субстрат содержит метанолизные опилки;

на заднем плане – субстрат содержит нативные опилки Исследована возможность использования субстратного мицелия, представля ющего собой, фактически, отход грибного производства, после высушивания до постоянной массы и измельчения до фракции 10,0–50,0 мкм, в качестве кормовой добавки к рациону сельскохозяйственной птицы. В условиях крупнейшего в Пен зенской области птицеводческого комплекса (ООО ПТФ «Васильевская) проведе на серия испытаний кормовой добавки к рациону кур-несушек породы «Бройлер» на биохимические показатели сыворотки крови и материала яиц, получено соот ветствующее комиссионное заключение о результатах исследований. Установлено достоверное позитивное влияние добавки на белковый и липидный обмен птиц родительского стада, причем особого внимания заслуживает факт увеличения пропорциональной доли в составе холестерина липопротеидов высокой плотности.

Зафиксирована стабилизация антиоксидантного статуса птиц: показан рост актив ности глутатионпероксидазы на фоне снижения концентрации малонового диаль дегида в сыворотке (рис. 17). Этот факт представляет значительный интерес, по скольку речь идет о фундаментальной проблеме возможности стимуляции адапта ционных процессов животных, и, безусловно, требует пристального внимания.

Содержание МДА, нмоль/мл 1200 мкмоль глутатиона/мин Активность ГПО, 6 Активность ГПО Содержание МДА 0 Контроль Опыт Рис. 17. Влияние кормовой добавки на основе мицелия G. lucidum к рациону птиц на показатели окислительного статуса сыворотки: активность глутатионпе роксидазы (ГПО) и содержание малонового диальдегида (МДА) (планки погреш ностей – ошибка средней, р0,05) Изучены показатели активности глутатионпероксидазы и содержания МДА и в массе желтка (рис. 18).

Содержание МДА, нмоль/мл 5000 мкмоль глутатиона/мин Активность ГПО, 3000 Активность ГПО Содержание МДА 0 Контроль Опыт Рис. 18. Влияние кормовой добавки на основе мицелия G. lucidum к рациону птиц родительского стада на показатели окислительного статуса желтка: актив ность глутатионпероксидазы (ГПО) и содержание малонового диальдегида (МДА) (планки погрешностей – ошибка средней, р0,05) Использование добавки на основе мицелия позволило повысить показатели яйценоскости родительского стада на 12%, способствовало повышению рента бельности производства яиц на стадии их получения и инкубации. Существенное снижение доли выбракованных яиц обеспечило увеличение объема инкубации на 10 %. Использование добавки на основе сухого измельченного мицелия G. lucidum к рациону кур родительского стада способствует росту показателей вывода на 5 %.

На наш взгляд, это тесно связано с процессом стимуляции антиоксидантной си стемы птиц, о чем свидетельствуют факты, приведенные выше. Использование предложенной добавки рекомендовано к внедрению в практику птицеводства в сфере производства яиц и получения молодняка.

ВЫВОДЫ 1. Таксономическая и экологическая структура ксилотрофных базидиомице тов лесных экосистем лесостепи Правобережного Поволжья характеризуется вы соким разнообразием. Описанные в районе исследований 249 видов различаются широтой трофической специализации, трофическими стратегиями использования субстрата и типами вызываемых гнилей древесины;

215 штаммов 44 видов, со ставляющие репрезентативную выборку, вошли в созданную коллекцию мицели альных культур.

2. В составе ксилотрофной микобиоты района исследований превалирует группировка с факультативно-паразитической трофической специализацией.

Широкое распространение получили виды, вызывающие развитие белой корро зионной гнили древесины. В соответствии с особенностями структуры лесных экосистем (участие коренных пород – дуба и сосны в составе древостоев) в структуре ксилотрофной микобиоты преобладает группировка поливалентных стенотрофов.

3. Установлена зависимость между широтой субстратной специализации ви да в отношении природного древесного субстрата и степенью его внутривидово го полиморфизма в культуре. Эвритрофные виды характеризуются более высо кой степенью штаммового разнообразия, что проявляется в достоверных отличи ях макро – и микроморфологических характеристик мицелия, в формировании различного типа анаморф, на фоне относительного однообразия этих показателей у штаммов стенотрофных видов.

4. Изученные виды различаются зонами оптимума и пределами толерантно сти по отношению к содержанию растворенного кислорода при развитии в глу бинных условиях: повышенную потребность в кислороде имеют виды, форми рующие in situ однолетние плодовые тела.

5. Особенности морфогенеза структур мицелия при погруженном культиви ровании у представителей Hymenochaetales и Polyporales связаны с типом гифальной системы: для видов с мономитической гифальной системой в целом выявлена тенденция к филаментному, а для характеризующихся ди- и тримити ческой – к пеллетному росту. Дифференцировка мицелия внутри пеллеты отме чена у видов с тримитической гифальной системой, тогда как для видов с дими тической характерно формирование рыхлых однородных структур, в связи с чем, последнюю группу можно рассматривать как переходную в отношении особен ностей глубинного роста.

6. Использование в качестве адаптогенных добавок к питательным средам парааминобензойной кислоты в концентрации 0,005 г/л и 9-фенил симметричного-октагидроселеноксантена в концентрации 10 -6 г/л (в пересчете на селен) оптимизирует развитие, что имеет особое значение при культивировании редких и охраняемых видов. Органические (9-фенил-симметричный октагидроселеноксантен) и неорганические соединения селена (селенат натрия) при добавлении к питательной среде в концентрациях 10-4 г/л (в пересчете на се лен) позволяют увеличить сроки хранения мицелиальных культур при темпера туре 4°С до 18–24 месяцев. Жизнеспособность, ростовые, биохимические харак теристики (скорость и характер роста, базофилия протоплазмы, ферментативная активность, способность к образованию базидиомы) сохраняются на достаточ ном уровне.

7. Определены диапазоны и механизмы толерантности видов Ganoderma lucidum и Pleurotus ostreatus к воздействию полиенового макролида нистатина.

У толерантных к нистатину штаммов G. lucidum установлена интенсификация синтеза эргостерина;

толерантность P. ostreatus определяется как интенсифика цией, так и альтернативным путем – пассивацией синтеза эргостерина у разных штаммов. У всех нистатинтолерантных штаммов, характеризующихся интенси фикацией продукции эргостерина, установлены выраженные способности к пло доношению на стерильных средах.

8. Быстрорастущие на агаризованных питательных средах штаммы грибов белой гнили, в среднем характеризуются более высокой общей пероксидазной, а медленнорастущие – более выраженной общей оксидазной активностью.

9. Лигноцеллюлозный субстрат, обогащенный метоксильными группами, ингибирует оксидазную активность видов с паразитной специализацией в приро де и стимулирует таковую у большинства сапротрофных видов;

он повышает пе роксидазную и целлюлазную активность у видов, вызывающих белую гниль.

Метоксильные группы лигнина стимулируют процесс биосинтеза эргостерина культурами грибов белой гнили и плодообразования у грибов этой группы в условиях чистой культуры. Есть все основания рекомендовать включение мета нолизных лигноцеллюлозных материалов в субстрат для получения плодовых тел G. lucidum по интенсивной технологии.

10. Кормовая добавка, созданная на основе мицелия G. lucidum, вносимая в количестве 0,1% от массы сухого рациона, интенсифицирует пластический об мен сельскохозяйственных птиц родительского стада: в сыворотке крови обна ружено увеличение содержания альбумина на 15%, триглицеридов – на 9%. От мечен рост уровня холестерина на 12%, за счет фракции липопротеидов высокой плотности. Установлена стимуляция антиоксидантной системы птиц: в сыворот ке крови на 19%, а в желтке – в 2,3 раза возрастает активность фермента глутати онпероксидазы;

снижается содержание малонового диальдегида соответственно на 32% и в 2,5 раза. Применение добавки к рационам на основе мицелия G. lucidum обеспечивает увеличение показателей яйценоскости на 12%, объема ин кубации на 10% и показателей вывода на 5%.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК РФ Блинохватов А.Ф., Денисова (Ильина) Г.В., Иванов А.И., Ильин Д.Ю.

Влияние соединений селена на рост и развитие грибов I. Микромицеты // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34, Вып. 5. С.42–45.

Блинохватов А.Ф., Денисова (Ильина) Г.В., Иванов А.И., Ильин Д.Ю. Влия ние соединений селена на рост и развитие грибов II. Макромицеты // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34, Вып. 5. С.46–50.

Сашенкова С.А., Ильина Г.В., Козырева Н.С., Иванов А.И. Рост и морфологи ческие особенности мицелия чистых культур трутовика серно - желтого Laetiporus sulphureus в зависимости от условий культивирования // Микология и фитопатоло гия. 2005. Т. 39, Вып. 1. С.35–40.

Иванов А.И., Блинохватов А.Ф., Ильин Д.Ю., Ильина Г.В., Костычев А.А., Озерова Н.С. Биоабсорбция микроэлементов и их влияние на ростовые и метабо лические свойства грибов // Нива Поволжья. 2007. №3 (4). С. 7–10.

Ильина Г.В., Ильин Д.Ю., Лыков Ю.С. Роль специфики лигнинсодержащих субстратов при культивировании ксилотрофных грибов in vitro // Микология и фи топатология. 2009. Т. 42, Вып. 2. С.35–40.

Гарибова Л.В., Ильина Г.В. Региональные коллекции мицелиальных культур как возможность сохранения природного разнообразия базидиомицетов, а также их физиолого-биохимических особенностей // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. №1. С.38–39.

Ильина Г.В., Лыков Ю.С., Костычев А.А. Изучение антимикробной активно сти местных штаммов Laetiporus sulphureus Bond. et Sing. // Иммунопатология, ал лергология, инфектология. 2009. №2. С. 178–179.

Ильина Г.В., Гарибова Л.В. Использование нистатина при скрининге штам мов базидиомицетов, способных к синтезу стеринов // Иммунопатология, аллерго логия, инфектология. 2010. №1. С. 251.

Ильина Г.В., Лыков Ю.С. Особенности развития мицелиальных культур пара зитных видов базидиальных макромицетов ex situ // Иммунопатология, аллерголо гия, инфектология. 2010. №1. С. 115.

Иванов А.И., Ильина Г.В., Скобанев А.В., Скобанев Ар.В. Эколого биологическая характеристика видов рода Trametes в условиях Пензенской обла сти // Микология и фитопатология. 2010. Т. 44, Вып. 3. С. 197–204.

Ильина Г.В., Лыков Ю.С. Особенности распространенных в лесостепи Право бережного Поволжья видов ксилотрофных базидиомицетов в природе и чистой культуре // Поволжский экологический журнал. 2010. № 4. С. 263-273.

Ильина Г.В., Ильин Д.Ю., Гарибова Л.В. Влияние нистатина на биосинтез эрго стерина базидиомицетами // Микология и фитопатология. Т. 48 (1). 2011. С. 112–118.

Монографии Ильина Г.В., Ильин Д.Ю., Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Селен в грибах и микроорганизмах // Селен в биосфере. Пенза, 2001. - С. 56–95.

Ильина Г.В., Ильин Д.Ю., Скобанев А.В. Коллекция культур базидиальных макромицетов (Basidiomycota) Пензенской ГСХА. Каталог видов и штаммов. Пен за: РИО ПГСХА. 2009. 70 с.

Авторские свидетельства, патенты Денисова (Ильина) Г.В., Блинохватов А.Ф., Иванов А.И. Способ стимулиро вания роста посевного мицелия шампиньона // Патент на изобретение № 213641.

М., 1999. 4 с.

Ильин Д.Ю., Блинохватов А.Ф., Денисова (Ильина) Г.В., Иванов А.И., Ты щенко А.Ф., Сергеева Н.В., Михалева Т.В., Полунина Е.Е. Способ интенсифика ции биосинтеза гелиомицина // Патент на изобретение №2157848. М., 2000. 12 с.

Ильин Д.Ю., Блинохватов А.Ф., Ильина Г.В., Иванов А.И. Способ хранения культур микроорганизмов // Патент на изобретение №2185435. М., 2002. 14 с.

Статьи, тезисы в сборниках трудов научных конференций, симпозиумов, форумов Денисова (Ильина) Г.В., Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Влияние неорганиче ского соединения селена на рост и плодоношение грибов // Труды научной конфе ренции профессорско–преподавательского состава и специалистов сельского хо зяйства: сб. науч. тр. Пенза:,1997. С. 84–85.

Денисова (Ильина) Г.В., Блинохватов А.Ф., Иванов А.И., Сашенкова С.А.

Влияние соединений селена на скорость роста мицелия базидиальных грибов раз личных таксономических групп // Методологические основы познания биологиче ских особенностей грибов – продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов: сб. науч. тр. Донецк, 1997. С. 102–103.

Денисова (Ильина) Г.В., Сашенкова С.А. Влияние витамина В1 (тиамина) и ультрамикроэлемента селена на рост мицелия гастеромицетов в культуре // Про блемы охраны и рационального использования природных экосистем и биологи ческих ресурсов: сб. науч. тр. Пенза, 1998.С. 251–252.

Иванов А.И., Денисова (Ильина) Г.В., Иванова В.А., Сашенкова С.А., Моска лец П.В. Влияние различных концентраций солей и микроэлементов на напочвен ные макромицеты // Проблемы ботаники на рубеже ХХ–ХХI веков: сб. науч. тр.

С-Пб., 1998. С. 23–24.

Денисова (Ильина) Г.В. Влияние соединения селена на сроки образования плодовых тел у базидиальных макромицетов различных таксономических групп // Современные проблемы науки в АПК: сб. науч. тр. Пенза, 1999. С. 15–17.

Денисова (Ильина) Г.В. Влияние соединений селена на степень накопления биомассы мицелия грибов // Материалы конференции., посвященной 60-летию ПГПУ: сб. науч. тр. Пенза, 1999. С. 30–33.

Денисова (Ильина) Г.В., Блинохватов А.Ф., Ильин Д.Ю. Универсальная роль элемента селена в объектах биосферы // Эколого-экономические проблемы лесо степных регионов: сб. науч. тр. Пенза, 2000. С. 8–13.

Блинохватов А.Ф., Денисова (Ильина) Г.В., Ильин Д.Ю., Иванов А.И., Вихре ва В.А., Хрянин В.Н. Значение элемента селена для объектов биосферы // Эколого экономическое развитие России (анализ и перспективы): сб. науч. тр. М., 2000. С.

145–152.

Blinochwatow A., Iwanow A., Chrjanin W., Ilyina G., Wicrjewa W. Die Bedeutung des Selen Fr die Biosphre // Forschungs – Fhorum. №14. Jahhre Fachhochschule, Neubrandenburg, Dezember 2001. S. 8–9.

Ильина Г.В., Ильин Д.Ю., Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Использование элемента селена как фактора замедления процессов старения мицелиальных куль тур // Проблемы изучения и охраны биоразнообразия и природных ландшафтов Европы: сб. науч. тр. Пенза, 2001. С. 112–114.

Ильина Г.В., Сашенкова С.А. Опыт использования соединений селена при производственном культивировании некоторых съедобных грибов // Физиология и биохимия культивируемых грибов: сб. науч. тр. Саратов, 2002. С. 20–21.

Сашенкова С.А., Ильина Г.В. Некоторые особенности физиологии питания га стероидных базидиомицетов в культуре // Физиология и биохимия культивируе мых грибов: сб. науч. тр. Саратов, 2002. С. 16–17.