Создание диагностических тест-систем полимерная микросфера – биолиганд медико-биологического применения
На правах рукописи
СТАНИШЕВСКИЙ ЯРОСЛАВ МИХАЙЛОВИЧ СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ «ПОЛИМЕРНАЯ МИКРОСФЕРА – БИОЛИГАНД» МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
МОСКВА - 2012
Работа выполнена на кафедре биомедицинских и фармацевтических технологий федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.
Ломоносова» (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) доктор технических наук, профессор
Научный консультант:
Кедик Станислав Анатольевич доктор химических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Ямсков Игорь Александрович (Зав. лабораторией физиологически активных биополимеров ИНЭОС РАН) доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович (профессор кафедры химической технологии пластических масс РХТУ им. Д.И. Менделеева) доктор биологических наук, профессор Красильников Игорь Викторович (Заместитель генерального директора ЗАО «БИОТЕХ-интер»)
Ведущая организация: Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова.
Защита диссертации состоится «28» мая 2012г. в «15» часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при МИТХТ им. М.В.
Ломоносова по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д.86, ауд.М-119.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК:
http://vak.ed.gov.ru
Автореферат разослан « » 2012г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук старший научный сотрудник Лютик А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы В лабораторной практике для детекции иммунохимического анализа широко применяют реакцию латексной агглютинации (РЛА), с использованием диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд».
Такой способ определения отличается простотой исполнения, не требует специального оборудования и позволяет в течение короткого времени (3-7 мин.) провести визуальный учет результатов.
Преимущества полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов перед частицами биологического происхождения (бактерии, эритроциты и др.) к настоящему времени очевидны. Они состоят в возможности получения полимерных суспензий с определенным диаметром частиц, узким распределением их по размерам, наличием функциональных групп на поверхности полимерных микросфер, способных ковалентно связываться с функциональными группами биолиганда, сохраняющих устойчивость в растворе электролита на всех стадиях получения тест-систем и при хранении.
Практическое применение диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» ограничено отсутствием систематических исследований по выявлению факторов, позволяющих обеспечивать оптимальную конформацию биолигандов при их иммобилизации на поверхность полимерных микросфер, и соответственно высокую чувствительность РЛА.
Все это делает работы в этом направлении важными и актуальными.
Цель работы состояла в создании диагностических тест-систем «полимерная микросфера - биолиганд» для выявления антигенов (антител) при заболеваниях различной этиологии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести синтез полимерных микросфер с необходимыми физико химическими свойствами, и оценить их пригодность для создания диагностических тест-систем.
Выбрать способ иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, обеспечивающий высокую активность диагностических тест-систем при выявлении антигенов (антитела) в реакции латексной агглютинации.
Создать диагностические тест-системы и апробировать их в диагностике заболеваний различной этиологии: иерсиниоза, сальмонеллеза, лептоспироза, инфекционного бронхита, аутоиммунных заболеваний и др.
Научная новизна 1. Установлено, что при конструировании диагностических тест-систем важен выбор полимерного носителя, который должен наряду с прочным связыванием биолигандов, обеспечивать им достаточную конформационную подвижность для участия в реакциях молекулярного узнавания определяемого лиганда (антигена или антитела).
2. Высказана научная гипотеза о том, что многоточечное взаимодействие биолиганда с поверхностью полимерных микросфер вызывает его конформационные перестройки в процессе иммобилизации (физической адсорбции или ковалентного связывания функциональных групп), что приводит к нарушению биологически активной конформации биолиганда и затрудняет взаимодействие его с определяемым антигеном (антителом).
3. Предложена новая экспериментальная методика получения диагностической тест-системы на тиреоглобулин с использованием существующей компьютерной модели тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе, позволившая повысить чувствительность реакции РЛА с расширением границ титров.
4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию тест-системы для выявления антигенов различной природы, заключающейся в использовании промежуточного биолиганда – протеина А, аффинно взаимодействующего с Fc-фрагментом иммуноглобулина G, таким образом обеспечивая доступность Fab- фрагментов для связывания с антигеном.
5. Установлено, что при создании диагностических тест-систем, в которых концентрация определяемого биолиганда намного ниже концентрации биолиганда, иммобилизованного в поверхностный слой полимерных микросфер, необходимо часть поверхности полимерных микросфер экранировать другим белком, например альбумином.
6. Созданные диагностические тест-системы апробированы на панели иерсиниозом, сывороток с различными патологиями заболевания:
лептоспирозом, сальмонеллезом, инфекционным бронхитом, а также заболеваниями щитовидной железы (тиреоидит Хасимото, Базедова болезнь и другие), и показана их высокая чувствительность и специфичность.
Практическая значимость 1. Практическая значимость работы заключается в том, что все ее основные результаты использованы для создания технологии получения диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд», наработке опытных партий, и их апробации при диагностике конкретных заболеваний.
2. Разработан опытно-промышленный регламент (ОПР 04868244-05-2009), и технические условия (ТУ 9380-172-04868244-2009) на производство диагностической тест-системы «ПМ-глицин-ТГ» для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом реакции латексной агглютинации (Всероссийский институт лекарственных и г.Москва), ароматических растений (ВИЛАР), и подготовлено регистрационное досье для регистрации в Минздравсоцразвития России на разработку диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину.
3. Разработан и запатентован способ получения диагностической тест-системы для выявления антител к аденовирусам КРС методом РЛА (патент №2004121606/15 от 20.02.2006г.). Разработан и запатентован способ получения антительной тест-системы для постановки иммунодиагностической реакции латексной агглютинации (патент №2380708 от 05.12.2008г.).
4. Разработанные высокочувствительные и специфичные диагностические тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину, и вирусу инфекционного бронхита кур штамма Н120 были успешно апробированы в лабораторных и клинических условиях в Медицинском Радиологическом г.Обнинск;
Научном Центре (ГУ МРНЦ РАМН), Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), г.Москва, 1120 Центральном Военном Клиническом Госпитале (ЦВКГ), Украинской Независимой иммунологической лаборатории, Авторской лаборатории, г.Львов.
5. Материалы диссертационной работы вошли в курсы лекций и практических занятий по дисциплинам: «Основы биомедицинских технологий» для студентов 5-го курса обучающихся по специальности «Биотехнология» и «Полимеры в медицине и фармацевтике» для студентов 4-го курса обучающихся по направлению 5508800 «Химическая технология и биотехнология» (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (МИТХТ, г.Москва).
Положения, выносимые на защиту:
1. Комплексный методологический и экспериментальный подход к разработке высокочувствительных и специфичных тест-систем, на основе полимерных микросфер и специфических биолигандов, для использования в иммунодиагностической реакции латексной агглютинации (РЛА).
2. Обоснование критериев выбора полимерных микросфер и методов их синтеза для использования в качестве носителей биолигандов при разработке тест-систем, работающих по принципу РЛА.
3. Пути иммобилизации биолигандов белковой природы с различной молекулярной массой: тиреоглобулина, иммуноглобулина G, желатина на поверхность полимерных микросфер, позволяющие обеспечить необходимое взаимодействие биолиганда с детектируемым антигеном (антителом).
4. Получение диагностических тест-систем для реакции латексной агглютинации, и практическую их апробацию при выявлении веществ индикаторов: Yersinia enterocolitica серотип О3, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита, сывороточного фибронектина, и аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы, содержащихся в сыворотках крови с различными патологиями заболевания.
5. Опытно-промышленный регламент и технические условия на производство диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом реакции латексной агглютинации.
Апробация работы Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Десятой и Одиннадцатой научно-технических конференциях "Молодые ученые и аспиранты МГТУ" (Мурманск – 1999г, 2000г);
Международных научно-технических конференциях “Наука и образование” (Мурманск - 2002г, 2003г, 2004г, 2005г, 2006г.);
VI-й Международной конференции "Наукоемкие Химические Технологии" (Москва - 1999г);
Международных научно-практических конференциях НПО "Биомедицинские технологии" (Москва - 2000г, 2001г);
I-ой и II-ой Всероссийских научных конференциях «Биомедицинские технологии» (Москва - 2003г, 2004г);
Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001", “Ломоносов-2002” (Москва - 2001г, 2002г);
ХХХVIII и ХХХIХ Всероссийских научных конференциях по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Москва - 2002г, 2003г);
XII international conference surface forces (Звенигород-2002г);
Международном симпозиуме «Фотография в ХХI веке» (Санкт-Петербург - 2002г);
II-ой Всероссийской конференции “Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах” «ФАГРАН-2004» (Воронеж -2004г);
Международной научной конференции “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Минск - 2004г);
II-й Международной научно-практической конференции “Науковий потенцiал свiту” (Днепропетровск – 2005г);
Первой научно техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» (Москва -2005г);
Международной научной конференции “Молекулярная и прикладная генетика” (Минск – 2005г);
IX Украинском биохимическом съезде (Харьков - 2006г.);
III Всеукраинской научно практической конференции с международным участием «Биотехнология.
Образование. Наука. Практика» (Харьков - 2006г.);
Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (Санкт-Петербург - 2007г.);
IV Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку» (Москва – 2007г.);
3rd International Symposium on «Reactive Polymers in Inhomogeneous Systems, in Melts, and at Interfaces» (Dresden, Germany – 2007г.);
V Польско-украинская конференция «Polymers of special applications» (Radom, Poland.-2008г.);
XII международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии - 2008» (Волгоград - 2008г.);
National Scientific-Technical Conference with International Participation “Actual problems of synthesis and creation of new biologically active compounds and pharmaceutical preparations” (Lviv – 2008г.);
IV международной научно-практической конф.
«Биотехнология. Наука. Образование. Практика» (Днепропетровск. – 2008г.);
Украинской научно-практической конференции. (Харьков – 2009г.);
Участие в II-ой специализированной выставке нано-технологий и материалов "NTMEX 2005" (Москва - 2005г) и на VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва -2007г) «Золотая медаль»;
Участие в международной специализированной выставке «Мир Биотехнологии» (Москва -2007г);
4th International Summer School «Supramolecular Systems in Chemistry and Biology» (Refensburg, Germany – 2011г.) Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 78 печатных работы, из них статьи, 1 учебное пособие, 1 учебно-методический практикум, 2 патента и тезисов докладов.
Личный вклад автора.
Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работы – от выбора направления, постановки конкретных задач, планирования и проведения ключевых исследований до анализа, обобщения и литературного оформления полученных результатов.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», Заключения, Выводов, Списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены настраницах машинописного текста, включая таблицы, ирисунков. Список литературы содержит работы.
Работа выполнена при участии НИИ вакцин и сывороток имени И.И.
Мечникова РАМН (лаборатория иммунологической диагностики эндокринных заболеваний), Российский Университет Дружбы Народов (кафедра микробиологии), МГУ им. М.В. Ломоносова (кафедра коллоидной химии).
Работа проводилась при поддержке Министерства образования и науки по программе: «Государственная поддержка региональной научно-технической политики высшей школы и развитие ее научного потенциала» по темам:
«Полимерные дисперсные системы медико-биологического назначения» (2000г-2002г.);
и «Нанотехнология иммобилизации биолигандов на полимерные микросферы для создания высокоспецифичных иммунореагентов» (2003-2004г.);
а также при поддержке Министерства образования и науки РФ по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» № 2.1.1/12956 по теме: «Научные основы создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для биомедицинских исследований» (2009г 2011г.).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение. Обоснована актуальность разрабатываемой проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, новизна полученных результатов, практическая значимость диссертационной работы, основные положения, вынесенные на защиту.
В главе 1, литературном обзоре, проведен анализ исследований, посвященных синтезу полимерных суспензий, частицы которых используются в качестве носителей биолигандов при разработке диагностических тест систем, рассмотрены проблемы, возникающие при иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, решение которых позволило бы создать новые высокоэффективные диагностические тест системы для реакции латексной агглютинации.
В главе 2, объекты и методы исследования, описаны вещества и материалы, способы их получения (безэмульгаторная, затравочная и дисперсионная полимеризации), способы очистки (микрофильтрация, дезодорация), методы исследования полимерных суспензий (фотон корреляционная спектроскопия, электронная микроскопия), методы иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, способы постановки иммунохимических реакций (реакция латексной агглютинации (РЛА), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и др.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Синтез функциональных полимерных микросфер и изучение их физико химических свойств Несмотря на огромное разнообразие известных полимерных суспензий, далеко не каждая из них может быть использована для биологических и иммунохимических исследований, а те из них, которые оказываются при годными для этой цели, иногда имеют ограниченное применение в силу присущих им свойств. Например, полистирольные микросферы, не содержащие функциональных групп, используют для получения тест-систем, только в том случае, когда биолиганд физически адсорбируют на их поверхность.
Обычно для получения диагностических тест-систем используют полимерные микросферы содержащие на поверхности функциональные группы различной природы: альдегидные, хлорметильные, эпоксидные, хлорсульфоновые, сульфгидрильные группы, способные непосредственно реагировать с амино-, карбоксильными, сульфгидрильными группами биолигандов, а карбоксильные, гидроксильные, амино-, амидные и гликолевые группы образуют с ними химическую связь только после предварительной их активации.
Выбор метода синтеза полимерных микросфер (эмульсионная, суспензионная, дисперсионная, осадительная или затравочная полимеризации) определяется, в первую очередь, требованиями к диаметру частиц и содержа нию в их межфазных адсорбционных слоях функциональных групп опреде ленной природы и концентрации. Так, частицы диаметром до 0,2 мкм получают эмульсионной полимеризацией мономеров, со средним диаметром до 1 мкм и выше - полимеризацией мономеров в отсутствие эмульгатора, суспензионной, дисперсионной и затравочной полимеризацией.
Жесткость требований, предъявляемых к полимерным микросферам, используемым в качестве носителей биолигандов, является причиной создания в каждом методе синтеза особых условий формирования полимерных микросфер, определяющих их необходимые свойства: узкое распределение частиц по размерам, содержание определенной концентрации функциональных групп на поверхности и их устойчивость в процессе полимеризации и модификации. Именно эти условия формирования полимерных микросфер и отличают «ноу-хау» способов их синтеза, предлагаемых различными авторами.
В данной работе синтез полимерных суспензий проводили дисперсионной, затравочной и безэмульгаторной полимеризацией, что было необходимо для получения полимерных суспензий с заданным диаметром частиц и определенными функциональными группами*.
Проводили затравочную полимеризацию стирола (СТ) и стиролсульфоната натрия (ССН) и метакриловой кислоты (МАК) (1), или глицидилметакрилата (ГМА) (2), или акролеина (АК) (3), или в присутствии полидиметилсилок *-работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры ХТВМС им. С.С. Медведева МИТХТ.
сана (ПДС) (4) на затравочных полистирольных частицах (8), дисперсионную полимеризацию СТ и МАК (5), ГМА и МАК (6), и хлорэтилметакрилата (ХЭМА) и МАК (7) в присутствии поливинилпирролидона (ПВП), и полимеризацию СТ и ССН в отсутствие ПАВ (8).
Сопоставительный анализ свойств полимерных суспензий, полученных различными методами приведен в табл.1 и на рис.1-4.
Таблица Характеристика частиц полимерных суспензий Процент агломератов, содержащих не более 3 частиц в расчёте на общее Наличие Средний Коэф- число частиц функц. № Частицы полимерных диаметр фициент групп на потен пар- суспензий (сомономер) поверх- частиц, корреляции, -циал, Фосфат ФС + тии мкм. % ности мВ. но 0, частиц солевой мг/мл буфер альбу (рН=7,2) мин (ФС) 90-100% 0% Метод затравочной полимеризации на затравочных полимерных частицах № Стирол (СТ), стиролсульфонат натрия -СООН 1,54± 0,01 0,8 -51,1 1 + (ССН) и метакриловая кислота (МАК) СТ, ССН и -СН-СН -40, глицедилметакрилат \/ 1,61± 0,01 0,9 2 + (ГМА) СТ, ССН и акролеин (АК) -СНО 1,70± 0,01 0,8 -52,4 3 + СТ, ССН в присутствии полидиметилсилоксана -СООН 1,49± 0,01 1 -46,4 4 + (ПДС) Метод дисперсионной полимеризации СТ и МАК в присутствии поливинилпирролидона -СООН 2,34± 0,03 0,8 -5, 5 + + (ПВП) ГМА и МАК в присутствии -СООН 2,76± 0,03 0,9 -4, 6 + + ПВП Хлорэтилметакрилата (ХЭМА) и МАК в -СООН 3,90± 0,04 0,8 -4, 7 + + присутствии ПВП Метод безэмульгаторной сополимеризации СТ и ССН - 1,15± 0,01 1 -44,4 - + Примечание: «-» - агрегативно неустойчивы, «+» - агрегативно устойчивы.
ni/ni· 100% 1,1 1,15 1,2 d, мкм Рис.1. Микрофотография полимерных микросфер СТ и ССН со средним диаметром – 1,15мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам ni/ni· 100% 1,49 1,54 1,59 d, мкм Рис.2. Микрофотография полимерных микросфер ССН, СТ, МАК со средним диаметром – 1,54мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам ni/ni· 100% 2,29 2,34 2,39 d, мкм Рис.3. Микрофотография полимерных микросфер СТ+МАК и ПВП со средним диаметром – 2,34 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам ni/ni· 100% 3,85 3,9 3,95 d, мкм Рис.4. Микрофотография полимерных микросфер ХЭМА+МАК и ПВП со средним диаметром – 3,9 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам Условия проведения затравочной и безэмульгаторной полимеризации (объемные соотношения мономер/водная фаза, объемные соотношения мономеров, концентрации ПАВ и инициатора) были выбраны таким образом, чтобы диаметры частиц имели значения, равные 1-4 мкм., узкое распределение по размерам, –потенциал, определяющий электростатический фактор устойчивости, -40 -60 мВ.
В случае дисперсионной полимеризации устойчивость частиц определяется структурно-механическим фактором стабилизации, и в качестве стерического стабилизатора использовали поливинилпирролидон (ПВП).
Данными табл.1 и рис.1-4 показано, что синтезированные полимерные суспензии удовлетворяют требованиям, предъявляемым к полимерным микросферам-носителям биолигандов, используемым при разработке тест систем. Наличие на поверхности частиц функциональных групп различной природы предполагает возможность ковалентного связывания с функциональными группами специфических биолигандов.
При замене водной фазы на раствор электролита, в котором проводят РЛА, оказалось, что не все полимерные суспензии ведут себя одинаково. Часть полимерных суспензий в растворе электролита образовывали агрегаты, состоящие из двух, трех… пяти и более частиц, что исключало их использование в иммунодиагностике, поскольку не соблюдается одно из основных требований, предъявляемых к ним, а именно индивидуальность частиц.
Оказалось, что индивидуальность а растворе электролита сохранили только полимерные микросферы, полученные методом дисперсионной полимеризации, стабилизированные ПВП.
Для дальнейшего использования полимерных суспензий, полученных другими методами, необходимо было повысить их устойчивость. Это оказалось возможным после адсорбции на поверхности полимерных микросфер альбумина, взятого в концентрации 0,1мг/мл (в расчете на раствор 0,1% полимерной суспензии), который формировал в межфазном слое частиц дополнительный структурно-механический фактор устойчивости.
Одной из важнейших проблем в процессе получения полимерных суспензий является присутствие в их объеме остаточного мономера, которое негативно отражается на устойчивости полимерных суспензий, при иммобилизации биолигандов на поверхность частиц и при их хранении.
Для определения остаточного мономера в объеме частиц полимерной суспензии использовали спектрофотометрический и хроматографические методы анализа.
Для удаления остаточного мономера из синтезированных полимерных суспензий применяли химические методы (добавление реакционноспособных мономеров, и инициаторов, и радиационная дополимеризация мономера) и физические методы (дегазация и микрофильтрация).
На примере полистиролакролеиновой (СТ, ССН, АК (табл.1)) и полистиролметакриловой (СТ ССН, МАК (табл.1)) суспензий показано, что в процессе очистки полимерных суспензий изменяются их коллоидно химические свойства (табл.2).
При удалении остаточного мономера из объема частиц полимерных суспензий (полистиролакролеиновая/полистирол метакриловая суспензии) такими растворителями как этиловый спирт и ацетон наблюдается снижение массовой доли мономера, однако, при этом снижается и устойчивость полимерных суспензий (табл.2).
Таблица Изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в зависимости от способов удаления мономера из объема частиц полимерных суспензий Устойчивость Массовая доля полимерной мономера, % на Метод очистки мономера суспензии к единицу массы действию NaCl, полимера моль/л Исходные (полистиролакролеиновая/ 0,4/0,37 0,15/0, полистиролметакриловая) суспензии Микро- этиловым спиртом 0,1/0,09 0,1/0, фильтрация полимерных дистиллированной 0,14/0,12 0,15/0, водой суспензий:
Радиационное облучение 0,05/0,04 0,15/0, Удалить мономер отгонкой его под вакуумом, и при этом сохранить устойчивость суспензии не удалось.
Остаточный мономер удалить из объема частиц удалось только его радиационной дополимеризацией при облучении суспензии -лучами (в течение 6 часов, мощность дозы составляла 100 рад/с).
Полимерные суспензии сохраняли срок годности в течение 6 месяцев.
Приведенные исследования позволили разработать рецептуры синтеза частиц полимерных суспензий с различными функциональными группами на поверхности, и выбрать метод их очистки, а также сформулировать основные требования к ним, позволяющие на их основе получать тест-системы, работающие по принципу реакции латексной агглютинации.
2. Создание диагностических тест-систем различного целевого назначения (иммобилизация специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер) Тест-системы для реакции латексной агглютинации (РЛА) представляют собой полимерную суспензию, индивидуальные частицы которой содержат на своей поверхности специфические биолиганды, способные аффинно связываться с детектируемым компонентом, образовывая при этом пространственные сетки-агломераты, которые легко визуализируются.
Наиболее ответственным этапом в создании тест-систем является иммобилизация специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер при сохранении их нативной конформации, от которой зависит их иммунная активность, а следовательно чувствительность РЛА.
Сложность этого процесса состоит в том, что в каждом конкретном случае необходимо иммобилизовать на поверхность полимерных микросфер биолиганды различной белковой природы, размера, молекулярной массы и др.
В работе были изучены особенности иммобилизации на поверхность полимерных микросфер специфических биолигандов различной природы и молекулярной массы: тиреоглобулина (667кДа), специфического иммуноглобулина G (150кДа), и желатины (60кДа).
Основной проблемой в этой части исследований было создание методологии и способа иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер.
2.1.Создание тест-системы с использованием в качестве биолиганда – тиреоглобулина Выявление аутоантител к тиреоглобулину обычно проводят как при выявлении лиц с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, так и при мониторинге за состоянием здоровья лиц, проживающих в экологически неблагоприятных районах.
Исследования были начаты с создания тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину с использованием полимерных микросфер, содержащих на поверхности альдегидные группы, легко взаимодействующие с аминогруппами тиреоглобулина.
В работе молекулу тиреоглобулина выделяли из супернатанта, полученного в результате ультрацентрифугирования гомогената ткани щитовидной железы. Чистый тиреоглобулин выделяли методом гель фильтрации на колонке с сефарозой 6В. Степень очистки тиреоглобулина перед его использованием контролировали методом электрофореза в 5%-ом полиакриламидном геле. Тиреоглобулин определялся с молекулярной массой 600кДа. Степень очистки тиреоглобулина составила 98%.
Вначале была изучена кинетика иммобилизации тиреоглобулина на поверхность частиц полимерной суспензии (минимальная концентрация полимерной суспензии, при которой наблюдалась четкая визуализация частиц при их седиментации на дно лунки иммунологической планшеты составляла 0,4%), при различных температурных режимах 37, 20 и 4С. Образующееся в результате взаимодействия амино и альдегидной групп (основание Шиффа CH=N-), является нестабильным при низких значениях рН, поэтому в дальнейшей работе его восстанавливали до -CH2NH- путем действия в мягких условиях (температура - 25оС, 30 минут) боргидридом натрия.
Количество присоединенного тиреоглобулина к альдегидным группам на поверхности полимерных микросфер рассчитывали на основании данных определения содержания тиреоглобулина в растворе (метод ИФА) на всех последующих этапах проведения отмывки полимерной суспензии.
Было установлено, что в течение 3 часов при температуре 37С на взаимодействие функциональных групп полимера и биолиганда расходуется 80% тиреоглобулина от исходного его количества, а при 4С - через 12 - часов (рис.5). Дальнейшая экспозиция не приводила к увеличению количества связанного тиреоглобулина, что обусловлено, по-видимому, насыщенностью молекулами белка адсорбционного слоя полимерных микросфер.
Концентрация ТГ на поверхности полимерных частиц, мкг/мл Время иммобилизации ТГ на поверхность полимерных частиц, час.
Рис.5. Иммобилизация тиреоглобулина (ТГ) на поверхность полимерных микросфер при разной температуре. 1 – при 4С;
2 – при 20С;
3 - при - 37С.
Ковалентное связывание аминогрупп тиреоглобулина и альдегидных групп полимерных микросфер было подтверждено отсутствием молекул тиреоглобулина в растворе при добавлении ПАВ (твин80).
Однако протекание РЛА не наблюдалось. Было высказано предположение о том, что конформация биолиганда такова, что происходит экранизация антигенных детерминант тиреоглобулина, отвечающих за связывание с активными центрами аутоантител.
Такая же ситуация оказалась характерной для большинства высокомолекулярных биолигандов с молекулярной массой свыше 100кДа (иммуноглобулинов - IgA, IgG, IgM, IgD, IgE, C-реактивного белка, фибронектина и др.) иммобилизованных на поверхность полимерных частиц.
Поскольку трехмерная структура тиреоглобулина на данный момент неизвестна, было предложено сконструировать компьютерную модель его участка, гомологичного ацетилхолинэстеразе, на котором выявлена половина известных детерминант тиреоглобулина, распознаваемых аутоантителами [Пиневич А.А., 2007, Fabrizio et al., 2004, Takagi et al., 1991] (рис.6, табл.3).
Рис.6. Компьютерная модель тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе.
Таблица Название детерминант и их аминокислотная протяженность, которые располагаются на тиреоглобулиновом участке, гомологичном ацетилхолинэстеразе № Название детерминанты ТГ Протяженность аминокислотных п/п остатков 1 M4-814 2188- 2 TgP15 2339- 3 2376-2464 2376- 4 TgP26 2471- 5 TgP41 2651- Как видно из сконструированной модели (рис.6) наиболее выгодная его конформация, сохраняющая доступность детерминантных участков тиреоглобулина, может быть достигнута, если в ковалентном связывании участвуют концевые аминогруппы лизина (Lys), с альдегидными группами полимерных микросфер.
Для этого было предложено связывание функциональных групп проводить через спейсер, предполагая, что в этом случае, возможно снизить многоточечную кооперацию связывания тиреоглобулина с поверхностью полимера, и отдалить биомолекулу от поверхности полимерного носителя, а следовательно - сохранить ее нативную конформацию.
В работе использовали глициновый спейсер, выбор которого обуславливался возможностью ковалентного связывания его аминогрупп с альдегидными группами полимерных частиц (рис.6).
Иммобилизацию глицина на поверхность полимерных микросфер проводили из солянокислого раствора глицина, взятого в диапазоне концентраций 0,1 – 1,0 М при разных значениях рН от 3,0 до 5,0. На рис.7.
приведены зависимости изменения концентрации альдегидных групп на поверхности полимерных микросфер от времени выдерживания полимерных микросфер в растворе глицина.
Концентрация альдегидных групп на поверхности полимерных частиц, *103 моль/г полимера Время выдерживания полимерных частиц в 1М растворе глицина, час.
Рис.7. Изменение содержания альдегидных групп на поверхности полимерных микросфер от времени их выдерживания в 1М растворе глицина.
Видно, что при экспозиции суспензии в течение 1 часа при температуре 37С концентрация альдегидных групп уменьшается в 2 раза, а при выдерживании полимерных микросфер в растворе глицина в течение 2 часов наблюдается полное блокирование их глицином.
Карбоксильные группы глицина, расположенные на поверхности полимерных микросфер, активировали карбодиимидом (N-этил-N'-(3 диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид) и присоединяли к ним аминогруппы тиреоглобулина.
Количество тиреоглобулина, израсходованного для иммобилизации на поверхность полимерных микросфер, составило 8% от исходного его количества.
Создание такой тест-системы позволило выявлять аутоантител к тиреоглобулину в образцах сывороток крови в диапазоне 20-1700МЕ/мл.
Для оценки уровня чувствительности полученных тест-систем был проведен сравнительный анализ результатов выявления аутоантител к тиреоглобулину методом РЛА и традиционными методами тестирования иммуноферментным анализом (ИФА);
реакцией непрямой гемагглютинации (с использованием эритроцитов) (РНГА), на панели сывороток здоровых и больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (АИЗЩЖ) (табл.4).
Совпадение результатов выявления аутоантител к тиреоглобулину методом РЛА и методами ИФА или РНГА отмечено в 92 % и 96 % случаев соответственно.
Разработанная тест-система для выявления аутоантител к тиреоглобулину была апробирована на панели человеческих сывороток здоровых (n=30) и больных аутоиммунных заболеваний щитовидной железы (тиреоидит Хасимото, Базедова) (n=70) в Медицинском Радиологическом Научном Центре (ГУ МРНЦ РАМН) (г.Обнинск) и на базе Авторской лаборатории (г. Львов, Украина).
Таблица Результаты выявления аутоантител к тиреоглобулину методами РЛА, ИФА и РНГА Количество Диапазон сывороток Количество выявления Группы Титр РЛА совпавших с исследо- аутоантител к обсле- данными РЛА ванных тиреоглобулину дованных по по сывороток методом данным данным РЛА, МЕ/мл ИФА РНГА Доноры 30 1:10-1:40 10-30 28 10 1:40-1:120 20-100 9 30 1:120-1:540 200 – 400 27 Больные АИЗЩЖ 20 1:540-1:1620 600 – 1000 19 10 1:1620-1:3240 1100 –1700 9 %-совпадений 92% 96% Примечание: за отрицательный результат в РЛА принят титр аутоантител к тиреоглобулину равный 1: К преимуществам разработанной диагностической тест-системы для РЛА, кроме стабильности, срока хранения, технологии получения, можно отнести и тот факт, что диапазон титра анализируемой сыворотки (обнаружения аутоантител) на порядок ниже в РЛА (1:40-1:640) в сравнении с РНГА (1:160 1:10240). Это преимущество дает возможность уменьшить время постановки анализа в 2-3 раза.
Эта методология была использована при создании тест-систем, в которых биолиганды представляют собой специфические иммуноглобулины с молекулярной массой свыше 100 кДа.
2.2. Создание тест-системы с использованием в качестве биолиганда – специфический иммуноглобулин G.
Специфические иммуноглобулины (антитела) продуцируются лимфоцитами как иммунный ответа организма на присутствие в нем антигенов (патогенных микроорганизмов) и являются важным иммунологическим критерием диагностики вирусных и инфекционных заболеваний [Вольпе Р.,2000].
В качестве биолиганда при разработке тест-систем для выявления антигенов различной природы в РЛА в наших экспериментах использовали специфический иммуноглобулин G, который представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 150кДа, состоящий из двух антигенсвязывающих Fab фрагментов, которые являются активными центрами, и одного константного Fс-фрагмента.
Как известно из литературных данных [Кузник Б.И., 1998, Jeremy M. Berg 2003] структура иммуноглобулина G имеет нативную конформацию в виде «Y»-образной формы, поэтому при его иммобилизации на поверхность полимерных микросфер сложно получить необходимую ориентацию Fab фрагментов в водную среду.
В качестве промежуточного биолиганда по литературным данным [Sufi R., 2006;
Schramm W., 1987] был выбран протеин А (Staphylococcus aureus), который способен аффинно связываться с Fc-фрагментом молекулы иммуноглобулина G, при этом не экранируя его Fab-фрагменты. Компьютерная модель приведена на рис.8.
Рис.8. Компьютерная модель иммуноглобулина G присоединенная к протеину А.
К альдегидным группам, находящимся на поверхности полимерных микросфер (0,4%-ная полимерная суспензия), присоединяли аминогруппы протеина А при температуре 37С, и определяли минимальное разведение иммунных сывороток, при котором не происходила спонтанная агрегация конъюгатов «полимерная микросфера (ПМ) – протеин А».
Использовали следующие иммунные сыворотки: иммунная кишечно иерсиниозная сыворотка кролика;
иммунная сальмонеллезная сыворотка кролика;
иммунная лептоспирозная сыворотка кролика;
положительная сыворотка к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК) штамма Н120.
В результате исследований были определены минимальные разведения сывороток (для каждой сыворотки свое разведение, при которых не происходит спонтанная агрегация частиц коньюгатов «ПМ–протеинА» в буферном растворе (табл.5).
Таблица Минимальное разведение иммунных сыворотки, при которой не происходит спонтанной агрегации частиц коньюгатов «ПМ–протеинА» № п/п Сыворотка крови Минимальное разведение 1 Иерсиниозная сыворотка кролика 1: 2 Сальмонеллезная сыворотка кролика 1: 3 Лептоспирозная сыворотка кролика 1: 4 Положительная сыворотка к вирусу ИБК 1: штамма Н Таким образом, был получен конъюгат «ПМ-протеинА», который может быть использован в качестве универсального иммуносорбента, пригодного для аффинного присоединения специфических иммуноглобулинов G (без предварительной очистки иммуноглобулинов G из иммунных сывороток крови) при конструировании тест-систем для РЛА.
К преимуществам такого способа получения диагностических тест-систем относится то, что при их создании не требуется предварительного выделения и очистки специфических иммуноглобулинов G, содержащихся в -глобулиновой фракции иммунной сыворотки.
Используя иммунные сыворотки и конъюгат «ПМ-протеинА», были созданы тест-систем на: иерсиниоз к Y. enterocolitica серотипа О3;
сальмонеллез к S. Pullorum;
лептоспироз к L. Conicula;
инфекционный бронхит кур к вирусу штамма Н120.
В табл.6 приведен сравнительный анализ по выявлению в РЛА минимальных концентраций антигенов и живых микроорганизмов тест системами, полученными прямой иммобилизацией специфических иммуноглобулинов G на поверхность полученных микросфер «ПМ-IgG» и через спейсер-протеин А «ПМ-протеинА-IgG».
Таблица Минимальные концентрации выявления антигенов и живых микроорганизмов разработанными тест-системами Антиген Выявляемая минимальная концентрация антигена тест-системами в РЛА «ПМ-протеин А-IgG» «ПМ-IgG» Yersinia enterocolitica 0,061 мкг/мл 0,7 мкг/мл серотип О Salmonella pulorum 1,09 мкг/мл (300кД*) 10 мкг/мл (300кД*) различной молекулярной 1,95 мкг/мл (100-300кД*) 20 мкг/мл (100-300кД*) массы 0,02 мкг/мл (30-100кД*) 3 мкг/мл (30-100кД*) Leptospira canicola 4296 кл/мл ~ 100 000 кл/мл 107 ЭИД/мл** Вирус инфекционного 10 ЭИД/мл** бронхита кур штамм Н Примечание: *-фракция О-антигена;
** - ЭИД/мл – Эмбриональная инфекционная доза.
Как видно из данных табл.6, диагностические тест-системы «ПМ протеинА-IgG», оказались на порядок выше по чувствительности в РЛА в сравнении с тест-системами «ПМ-IgG».
Разработанная диагностическая тест-система «ПМ-протеинА-IgG» для выявления вируса инфекционного бронхита кур штамм Н120 в РЛА c положительным заключением была апробирована во Всероссийском Государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) (г.Москва).
2.3. Создание тест-системы с использованием в качестве биолиганда – желатины Желатина была выбрана в качестве биолиганда, способного аффинно взаимодействовать с сывороточным фибронектином, содержание которого необходимо контролировать при шоке, сепсисе, травматических, ожоговых повреждениях, острой хирургической патологии, хронических диффузных заболеваниях печени и ряде других заболеваний внутренних органов [Matsui S, Takahashi Т., 1999;
Левитан Б.Н., Астахин А.В., 1993;
Качалов С.Н., 1990].
В широком диапазоне рН желатина представляет собой полиамфолит со множеством гидрофобных и полярных остатков. Главным компонентом желатины являются -, - и - полипептидные цепи и их фрагменты. Известно, что полипептидные цепи претерпевают конформационные переходы типа спираль- клубок. Эти цепи характеризуются разным расположением функциональных групп по ходу спирали, что связано с особенностями их пространственного строения. В -цепях функциональные группы более доступны реагентам, а в - и - цепях значительное число функциональных групп оказывается внутри пространственных образований. Это и определяет различные гидрофильно-гидрофобные свойства полипептидных цепей и реакционную способность функциональных групп по отношению к реагентам различной природы.
При температурах выше 35С макромолекула желатины в водном растворе находится в состоянии беспорядочного клубка. При понижении температуры полипептидные цепи способны частично восстанавливать коллагеноподобную спиралевидную структуру. Конформационные изменения макромолекул желатины являются следствием изменения в балансе электростатических и гидрофобных взаимодействий.
Далее, известно, что для межфазного адсорбционного слоя желатины на поверхности частиц константа Гамакера составляет величину порядка 10-21Дж и близка к соответствующей константе для воды. Это означает, что межфазный слой действует как барьер, препятствующий контакту диспергированных частиц, и они удерживаются на таком расстоянии друг от друга, при котором ван-дер-вальсовы силы становятся незначительными, т.е. частицы индивидуальны.
Эти знания были положены в основу выбора условий иммобилизации желатины на поверхность полимерных микросфер.
Концентрация фибронектина в сыворотке крови невысока (150-800 мкг/мл) и для обеспечения аффинного связывания его с желатиной с высокой чувствительностью РЛА, концентрация желатины на поверхности микросфер должна соответствовать концентрации фибронектина. Отсюда следует, что часть желатины в межфазном адсорбционном слое микросфер необходимо заменить другим белком, индеферентным по отношению к фибронектину, например, альбумином который обеспечит и устойчивость системы за счет структурно-механического барьера.
Концентрацию желатины изменяли в широком интервале значений 0,004– 2,5мг/мл. В качестве носителя желатины использовали полистирольные микросферы, полученные в отсутствие ПАВ, на поверхность которых желатину физически адсорбировали (табл.7).
Как видно из данных табл.7, при одинаковых концентрациях желатины – потенциал полимерных микросфер после иммобилизации желатины и в конформации «клубка» и спирали на их поверхность уменьшился с -44,4 мВ до -15,2 мВ (5-10С) и -22,4 мВ (50-60С), что говорит о частичной экранизации молекулами желатины ионогенных групп макромолекул полимера.
При иммобилизации желатины в конформации полимерного «клубка» чувствительность тест-системы в РЛА оказалась выше (1:256), чем при иммобилизации желатины в конформации коллагеноподобной спирали (1:64).
Таблица Характеристика тест-систем полученных при различной температуре иммобилизации желатины на поверхность полимерных микросфер Агрегативная устойчивость Концентрация -потен полимерных микросфер Средний желатины при циал в иммобилизации диаметр полимер- концентрация Титр фосфатно полимер на поверхность ных добавленного РЛА буферном полимерных ных микрос- микро- альбумина в растворе фер, мкм микросфер сфер, ФС, мг/мл (ФС), мг/мл мВ.
рН=7, при 50-60С - 0,025 1: 0, 1,18± 0,01 -37,5 - 0,012 1:256* 0, 1,27± 0,01 -22,4 + + 1: 0, + + 1: 0, + + 1: 2, при 5-10 С - 0,05 1: 0, 1,22± 0,01 -20,3 - 0,025 1: 0, 0,39*10- 1,38± 0,01 -15,2 - 1: 0, + + отр.
0, + + отр.
2, Полимерные 1, - микросферы без 1,15± 0,01 -44,44,4 - 0,1 отр.
желатины 1510, Примечание: «-» - агрегативно неустойчивы, «+» - агрегативно устойчивы. * Титры РЛА - 1:256, 1:128 и 1:64 отвечают концентрации выявляемого тест-системами фибронетина – 200, 400 и 800мкг/мл соответственно.
При иммобилизации желатины в интервале концентраций 0,62-2,5 мг/мл, на поверхность полимерных микросфер, не наблюдается практически ее взаимодействия с детектируемой молекулой фибронектина, и титр РЛА составляет 1:32-1:64. Уменьшение концентрации желатины на поверхности полистирольных микросфер приводит к повышению титра РЛА до 1:256, однако при этом снижается устойчивость тест-системы в растворе электролита.
В связи с этим дополнительно добавляли в систему альбумин в концентрации свыше 0,012 мг/мл (табл.7).
Более низкие и высокие концентрации желатины не использовали, поскольку при этом наблюдалось существенное снижение титров чувствительности РЛА.
Таким образом, устойчивые в буферном растворе тест-системы с высокой чувствительностью РЛА (1:256) были получены при последовательной физической адсорбции желатины в конформации полимерного «клубка» (60С) в концентрации 0,035 мг/мл, и альбумина в концентрации - 0,012 мг/мл на поверхность полистирольных частиц.
В качестве частиц - носителей биолигандов (желатины и альбумина) были использованы полимерные микросферы, содержащие на своей поверхности функциональные группы различной природы (карбоксильные, эпоксидные, альдегидные) и не содержащие функциональные группы, полученные различными методами полимеризации, с диаметром частиц в интервале 1,5- мкм.
Иммобилизацию желатины на поверхность полимерных частиц проводили ковалентным связыванием функциональных групп полимера и биолиганда, и путем их физической адсорбции.
Диагностические тест-системы, полученные при ковалентном связывании функциональных групп желатины и полимерных микросфер, независимо от природы функциональных групп полимера, оказались высоко чувствительными. Титр РЛА при выявлении сывороточного фибронектина составил в диапазоне разведений 1:128-1:512 (рис.9).
Титр РЛА Концентрация желатины, мг/мл Рис.9. Чувствительность РЛА (титр) при выявлении фибронектина, тест-систем полученных способом ковалентного связывания функциональных групп желатины и функциональных групп полимерных микросфер Тест-системы, в которых желатину иммобилизовали на поверхность полимерных микросфер путем физической адсорбции, имели значительно меньшую чувствительность РЛА - 1:4-1:256 (рис.10).
Титр РЛА Концентрация желатины, мг/мл Рис.10. Чувствительность РЛА (титр) при выявлении фибронектина, тест систем полученных способом физической адсорбции желатины на поверхность полимерных микросфер Примечание: титры РЛА 1:512;
1:256, 1:128 и 1:64 отвечают концентрации выявляемого фибронектина – 100, 200, 400 и 800 мкг/мл соответственно.
Наличие ковалентной связи функциональных групп желатины и полимерных микросфер контролировали путем добавления в систему ПАВ твина 80. Титр РЛА после введения в систему твина 80 не изменялся, это свидетельствует о взаимодействии фибронектина только с ковалентно связанными молекулами желатины на поверхности полимерных микросфер.
Было установлено, что природа поверхности частиц существенно влияет на устойчивость тест-систем полученных на их основе. Так, полистирольные суспензии, частицы которых были стабилизированы полидиметилсилоксаном (ПДС) и поливинилпирролидоном (ПВП), либо полученные со-полимеризацией стирола (СТ) и стиролсульфоната натрия (ССН) оказались значительно более стабильными (рис.11), чем синтезированные со-полимеризацией СТ, ССН и Акролеина (АК), или метакриловой кислоты (МАК), или глицидилметакрилата (ГМА) (рис.12).
Для всех исследованных полимерных суспензий были определены минимальные концентрации альбумина и желатины, которые необходимо ввести в систему для сохранения ее устойчивости в растворе электролита (рис.11-12).
Как видно из данных представленных на рис.11-12, чем выше концентрация желатины, тем меньше концентрация альбумина, которую необходимо ввести в систему для обеспечения ее устойчивости.
1 - CТ, ССН, ГМА - сополимерные микросферы стирола (СТ), стиролсульфоната натрия (ССН) и глицидилметакрилата (ГМА).
2 - CТ, ССН, АК - сополимерные микросферы СТ, ССН и Акролеина.
3 - CТ, ССН, МАК - сополимерные микросферы СТ, ССН и метакриловой кислоты (МАК).
4 - CТ, ССН, ПДС - сополимерные микросферы СТ, ССН, полученные в присутствии полидиметилсилоксана (ПДС).
Рис.11. Минимальные концентрации альбумина и желатины, которые необходимо ввести в систему для сохранения ее устойчивости в растворе электролита.
4 - CТ, ССН, ПДС - сополимерные микросферы СТ, ССН, полученные в присутствии полидиметилсилоксана (ПДС).
5 - CТ, ССН - сополимерные микросферы СТ и ССН.
6 - СТ+МАК (ПВП);
ГМА+МАК (ПВП);
и ХЭМА+МАК (ПВП) полистиролметакрилатные (СТ+МАК), полиглицидилметакрилатные (ГМА+МАК), и полихлорэтилметакрилатные (ХЭМА+МАК) микросферы полученные в присутствии поливинилпирролидона (ПВП).
Рис.12. Минимальные концентрации альбумина и желатины, которые необходимо ввести в систему для сохранения ее устойчивости в растворе электролита.
3. Разработка технологии создания диагностических тест-систем работающих по принципу реакции латексной агглютинации (РЛА) Выше приведенные результаты легли в основу создания малоотходной технологии получения тест-системы с использованием полимерных микросфер и биолигандов, отвечающих требованиям их использования в современных клинико-диагностических лабораториях при выявлении веществ-индикаторов потенциального заболевания.
Разработана технология создания диагностических тест-систем, работающих по принципу РЛА, которая включает в себя следующие стадии:
1. Синтез полимерных суспензий;
2. Очистка полимерных суспензий от остаточных компонентов полимеризации;
3. Выделение и очистка специфических биолигандов;
4. Иммобилизация специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер и очистка полимерной суспензии от неприсоединившихся биолигандов.
Технологическая и принципиальная схемы производства диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и биолигандов представлена на рис.13 и 14.
Выделение и очистка Синтез полимерных ТП.1 ТП.3 специфических суспензий биолигандов Очистка полимерных ТП. суспензий Иммобилизация специфических биолигандов на поверхность ТП. микросфер полимерных суспензий и их очистка Рис.13. Технологическая схема производства диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов На основе проведенных экспериментальных исследований определены параметры нормирования качества диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» (чувствительность, специфичность, агрегативная устойчивость) и методы их контроля (реакция латексной агглютинации, реакция торможения латексной агглютинации, седиментация частиц в растворе электролита), и разработана технология их получения, которые вошли в нормативно-техническую документацию на их производство.
1 - Реактор для проведения синтеза полимерных суспензий;
2,4 - Фильтровальные ячейки с мембраной;
3 - Емкость для иммобилизации биолиганда на поверхность частиц полимерной суспензии.
Рис.14. Принципиальная схема производства диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов На рис.15 представлена схема реакции латексной агглютинации (РЛА) с использованием тест-систем.
Инкубация в Исследуемый образец буферном растворе Результат РЛА (сыворотка пациента) Тест-система (t, рН, время) (суспензия полимерных Положительная Инкубация в микросфер, Результат РЛА контрольная буферном растворе содержащих (положительный) сыворотка (t, рН, время) на своей поверхности Отрицательная Инкубация в биолиганд) Результат РЛА контрольная буферном растворе (отрицательный) сыворотка (t, рН, время) Рис.15. Схема РЛА с использованием диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» В табл.8 представлены характеристики разработанных диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» которые могут быть использованы в клинической практике при диагностике специфических антигенов (антител) в реакции латексной агглютинации.
Таблица Характеристика диагностических тест-систем «полимерная микросфера биолиганд» Диагностическая Молекуляр Минимальная Антиген Заболевание тест-система с ная масса концентрация (антитело) использованием в биолиганда, антигена качестве кДа (антитела) биолиганда: определяемая в РЛА Аутоантитела к Аутоиммунные тиреоглобули- заболевания 20-30 МЕ*/мл ну щитовидной щитовидной Тиреоглобулин железы железы (тиреоидит Хасимото, Базедова болезнь и др.) Иммуноглобулин G к Yersinia Yersinia enterocolitica enterocolitica 150 0,061 мкг/мл Иерсиниоз серотип О3 серотип О Иммуноглобулин G к Salmonella 150 0,02-1,95 мкг/мл Salmonella pulorum pulorum Сальмонеллез Иммуноглобулин G к Leptospira 150 4296 кл./мл Leptospira canicola canicola Лептоспироз Иммуноглобулин G к Вирус вирус инфекционного инфекционного 105 ЭИД**/мл 150 Бронхит бронхита кур штамм бронхита кур Н120 штамм Н Изменение уровня Сывороточный при шоке, сепсисе, фибронектин травматических, 60 ожоговых, Желатина 100 мкг/мл хронических заболеваниях печени и др.
Примечание: *-МЕ-международная единица, **ЭИД-Эмбриональная инфекционная доза.
Диагностические тест-системы «полимерная микросфера-биолиганд» сохраняли срок годности в течение 3 месяцев при температуре 4С.
Разработанные тест-системы «полимерная микросфера-биолиганд» могут быть масштабированы при создании тест-систем на различные виды заболеваний.
ВЫВОДЫ 1. Синтезированы полимерные суспензии с заданными диаметрами и узким распределением частиц по размерам, изучены их коллоидно-химические свойства, и на их основе созданы диагностические тест-системы для выявления конкретных заболеваний. Разработаны ОПР и ТУ на их производство, наработаны опытные партии, которые исследованы с положительным результатом.
2. Для создания диагностических тест-систем различного целевого назначения предложены полимерные микросферы двух типов: с межфазной поверхностью, содержащей функциональные группы, и содержащие на поверхности вещества, аффинно связывающиеся с биолигандами. Все полимерные суспензии не содержали ассоциатов и сохраняли устойчивость в буферных растворах и при хранении в течение месяцев.
3. Предложена новая экспериментальная методика получения диагностической тест-системы на тиреоглобулин с использованием существующей компьютерной модели тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе, позволившая повысить чувствительность реакции РЛА с расширением границ титров.
4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию диагностических тест-систем для выявления антигенов различной природы, заключающийся в том, что молекулу иммуноглобулина G фиксируют на поверхности полимерных микросфер Fc-фрагментом;
в этом случае Fab фрагменты, несущие активные центры оказываются доступными для взаимодействия с антигенами.
5. Впервые в качестве промежуточного биолиганда при создании тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» на различные антигены, использован протеин А, который специфически взаимодействует с Fc-фрагментом иммуноглобулина G. Показано, что такой способ получения тест-систем обеспечил им высокую чувствительность в реакции латексной агглютинации и устойчивость в буферных растворах и при хранении.
6. При разработке тест-системы на сывороточный фибронектин выявлено влияние конформации желатины и способа ее иммобилизации на поверхность полимерных микросфер. Установлено, что для обеспечения устойчивости тест-системы в растворах электролитов и при хранении, необходимо использовать физически адсорбированный альбумин и ковалентно иммобилизованную желатину в конформации полимерного «клубка» в определенных массовых соотношениях.
7. Разработана технология получения диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов для реакции латексной агглютинации и показана их пригодность на примере выявления Yersinia enterocolitica серотип О3, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита кур штамм Н120, сывороточного фибронектина, аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы.
8. Проведенные исследования позволяют рекомендовать разработанные тест системы «полимерная микросфера-биолиганд» для диагностики заболеваний различной этиологии, а также использовать разработанные в работе методологические подходы для создания и масштабирования новых диагностических тест-систем для медико-биологического применения.
Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:
Статьи 1. Станишевский, Я.М. Полимерные суспензии для диагностической тест системы на фибронектин / Я.М. Станишевский, И.А.Грицкова, В.Н.
Измайлова, В.А.Быков, Е.Г. Кравцов, Н.И. Прокопов, А.Е.Харлов, А.Н.
Лобанов // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал. Москва-2001.-Вып.3.-С.71-84.
2. Грицкова, И.А. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований / И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, Я.М. Станишевский, А.Н.
Лобанов, А. Ожеховски // Высокомолекулярные соединения МАИК "Наука" Москва-2002.-Сер.А, т.44, №11.-С.1887-1893.
3. Станишевский, Я.М. Получение антительных диагностических тест-систем заданной специфичности / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И.
Прокопов, Э.Г. Кравцов, Е.Г. Волина, А.Н. Лобанов, И.И. Григорьевская // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал. -Москва 2003.-Вып.2.-С.81-85.
4. Станишевский, Я.М. Фагоцитирование полимерных микросфер, иммобилизированных биолигандами, лейкоцитами периферической крови у больных с острым панкреатитом / Я.М. Станишевский, В.Б. Скопинцев, Э.Г.
Кравцов, В.А. Быков, И.А. Грицкова // Клиническая лабораторная диагностика. -Москва-2003.-№10.-С.44-47.
5. Станишевский, Я.М. Полимерные микросферы для изучения фагоцитоза при различных стадиях заболевания хроническим гломерулонефритом / Я.М.
Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.А. Быков, В.Б. Скопинцев // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. -Москва-2004.-Вып.5-6. С.35-38.
6. Станишевский, Я.М. Полимерные микросферы – носители биолиганда в реакции латекс-агглютинации для определения аутоантител к тиреоглобулину / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, Н.С.
Кузмина, Г.А. Кириллова, Г.И. Кузнецова // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. -Москва-2004.-Вып.8-9.-С.61-65.
7. Грицкова, И.А. Исследование свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С реактивного белка / И.А. Грицкова, А.Г. Марков, Я.М. Станишевский, В.А.
Быков, Н.И. Прокопов, И.В. Хачатурян, М.А. Мягкова, А.П. Каплун, В.Б.
Скопинцев // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.- Москва 2005.-Вып.1-2.-С.69-75.
8. Станишевский, Я.М. Латексный диагностикум для выявления короновирусной инфекции / Я.М. Станишевский, Э.Г. Кравцов, В.А. Быков, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, И.И. Григорьевская // Технологии живых систем. - Москва-2005.-Том2.№3.-С.55-62.
9. Станишевский, Я.М. Перспективы синтеза полимерных микросфер и создание на их основе скрининговых тестов для детекции антител к аутоантигенам щитовидной железы. Сообщение 1. Синтез полимерных носителей / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.Е.
Храмович, Н.С. Кузьмина, Г.А. Кириллова, Г.И. Кузнецова // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал.-Москва-2005.-Вып.4.-С.78 83.
10. Кириллова, Г.А. Перспективы синтеза полимерных микросфер и создание на их основе скрининговых тестов для детекции антител к аутоантигенам щитовидной железы. Сообщение 2. Создание латексного экспресс-теста для определения аутоантител к тиреоглобулину / Г.А. Кириллова, Н.С.
Кузьмина, Г.И. Кузнецова, Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А.
Грицкова, В.Е. Храмовичев // Биотехнология теоретический и научно практический журнал.-Москва-2005.-Вып.5.-С.90-95.
11. Кузьмина, Н.С. Определение антител к тиреоглобулину и пероксидазе щитовидной железы в сыворотке крови человека в реакции латекс агглютинации / Н.С. Кузьмина, Г.А. Кириллова, Н.Ф. Гаврилова, В.В.
Свиридов, Г.И. Кузнецова, И.В. Яковлева, М.А. Буркин, Ю.В. Лукин, А.Н.
Генералова, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Аллергия, астма и клиническая иммунология (ВИНИТИ РАН). -Москва-2005.-№8.-С.
19-24.
12. Станишевский, Я.М. Использование конъюгата «полимерная микросфера Fab-фрагмент антитела» для определения столбнячного анатоксина в реакции латексной агглютинации / Я.М. Станишевский, И.И. Григорьевская, В.А. Быков, Э.Г. Кравцов, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, О.П. Лазарева // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.- Москва-2006.-Вып.5-6. С.80-84.
13. Станишевский, Я.М. Использование полимерных суспензий в качестве сорбента вирусов для детекции антител в сыворотках крови крупного рогатого скота / Я.М. Станишевский, Т.П. Лобова, И.А. Грицкова, Р.В.
Белоусова, Н.И. Прокопов, И.В. Третьякова // Вопросы вирусологии. Москва-2006.-№4.-С.46-49.
14. Станишевский, Я.М. Исследование коллоидной устойчивости полимерных микросфер в физиологических солевых растворах используемых в реакции латексной агглютинации (РЛА) / Я.М. Станишевский // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.- Москва-2006.-Вып.1-2.-С.70-74.
15. Грицкова, И.А. Тест-системыы на основе полимерных микросфер / И.А.
Грицкова, Н.И. Прокопов, Я.М. Станишевский // Вестник МИТХТ -Москва 2006.-Том 1.Вып.2.-С.5-20.
16. Станишевский, Я.М. Создание тест-системы включающих полимерный носитель и биочувствительный компонент для оценки состояния рецепторного аппарата клеточной мембраны / Я.М. Станишевский // Технологии живых систем - Москва-2006.- Том.3. Вып.2.- С.37-41.
17. Федорова, О.В. Синтез полiмерних суспензiй для бiоаналiтичних дослiджень / О.В. Федорова, Р.О. Петрiна, В.П. Новiков, Я.М. Станiшевськый, I.О.
Грицкова, Н.I. Прокопов // Вiсник Нацiонального унiверситету «Львiвська полiтехнiка» Хiмiя, технологiя речовин та iх застосування. – м. Львiв-2006 №553.-С.315-317.
18. Федорова, О.В. Вплив способу iммобiлiзацii iммуноглобулiну G на стiйкiсть полiмерноi суспензii / О.В. Федорова, Р.О. Петрiна, Я.М. Станiшевськый, В.П. Новiков, I.О. Грицкова, Н.I. Прокопов // Доповiдi Нацiональноi академii наук Украiни– м. Киiв-2006- №12.-С.146-149.
19. Григорьевская И.И. Сравнение различных способов иммобилизации специфических антител на полимерные микросферы при создании диагностикума для определения Tamm-Horsfall протеина / И.И.
Григорьевская, И.А. Грицкова, И.Г. Крашенинникова, Э.Г. Кравцов, С.М.
Левачев, Я.М. Станишевский // Биотехнология теоретический и научно практический журнал.-Москва-2007.-Вып.2.-С.-78-83.
20. Федорова, О.В. Дослiдження фагоцитозу за допомогою модифiкованих i не модифiкованих опсонiнами полiмерних мiкросфер / О.В. Федорова, Я.М.
Станiшевський, Р.О. Петрiна, В.П. Новiков, I.О. Грицкова, Н.I. Прокопов // Вопросы химии и химической технологии – г. Днепропетровск -2007- №3. С.59-63.
21. Федорова, О.В. Полімерні носії для створення діагностичних тест-систем / О.В Федорова, Р.О. Петріна, Н.Л. Заярнюк, В.П. Новіков, Я.М.
Станішевський, І.О. Грицкова, Н.І Прокопов // Вопросы химии и химической технологии. г. Днепропетровск –2007.–№6.- С.123-126.
22. Федорова, О.В. Iммобiлiзацiя правцевого анатоксину на частинки полiмерного носiя. / О.В. Федорова, Р.О. Петрiна, Я.М. Станiшевськый // Вiсник Нацiонального унiверситету «Львiвська полiтехнiка» Хiмiя, технологiя речовин та iх застосування. – м. Львiв-2008- №622.-С.153-155.
23. Кедик С.А. Взаимосвязь чувствительности реакции латексной агглютинации и степени гидратации поверхностных групп полимерных микросфер / С.А. Кедик, И.А. Василенко, И.А. Грицкова, Я.М.
Станишевский, С.М. Левачев // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.-Москва-2012.-№2. в печати.
Патенты, учебные пособия и учебно-методические пособия:
24. Быков В.А., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Прокопов Н.И.
Лабораторный практикум по курсу “Полимерные микросферы в диагностике” Москва-2003. - 41с.
25. Быков В.А., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Прокопов Н.И. Учебное пособие (Рекомендовано ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава» и УМО по образованию) “Полимерные микросферы в диагностике” Москва-2004. 130с.
26. Способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации: Пат. № 2270449, РФ // Белоусова Р.В., Грицкова И.А., Лобова Т.П., Станишевский Я.М., Третьякова И.В., Прокопов Н.И. от 20.02.2006г.
27. Способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации: Пат. № 2380708, РФ // Станишевский Я.М., Грицкова И.А, Прокопов Н.И. от.05.12.2008г.
Тезисы докладов 28. Станишевский, Я.М. Синтез функциональных полимерных суспензий с регулируемой концентрацией функциональных групп на поверхности частиц / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, В.Б. Ромах, Д.И. Науменко, М.В. Глазунов // Тезисы десятой научно-технической конференции.- Мурманск-1999.-С.368-369.
29. Прокопов, Н.И. Технология синтеза полимерных микросфер для изучения фагоцитоза / Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, Я.М. Станишевский, В.Б.
Ромах, М.В. Глазунов // Тезисы докладов VI Международной конференции "Наукоемкие Химические Технологии".-Москва-1999.-С.306-307.
30. Грицкова, И.А. Создание технологии синтеза полимерных суспензий медико-биологического назначения / И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, А.А.
Ишков, М.В. Глазунов, В.Б. Ромах, Я.М. Станишевский, Д.И. Науменко // Тезисы докладов VI Международной конференции "Наукоемкие Химические Технологии".-Москва-1999.-С.77-78.
31. Станишевский, Я.М. Тест-системы для исследования рецепторного аппарата фагоцитирующих клеток / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Е.Г.
Кравцов, Н.И. Прокопов, В.А. Быков, В.Б. Скопинцев // Тезисы одиннадцатой научно-технической конференции МГТУ.- Мурманск-2000. С.458-459.
32. Прокопов, Н.И. Полимерные суспензии для проведения реакций фагоцитоза / Н.И. Прокопов, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Е.Г. Кравцов, В.А.
Быков, М.В. Далин, А.Н. Лобанов // Тезисы одиннадцатой научно технической конференции МГТУ.- Мурманск-2000.-С.459-460.
33. Станишевский, Я.М. Полимерные суспензии для проведения реакций фагоцитоза / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Е.Г. Кравцов, В.А. Быков, Н.И. Прокопов // Биомедицинские технологии. -Москва-2000.-Вып.13.-С.43 51.
34. Станишевский, Я.М. Свойства частиц полимерной суспензии, используемой в качестве носителя биолигандов, при получении тест-системы / Я.М.
Станишевский // Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов-2001” -Москва-2001. С.190.
35. Лобанов, А.Н. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований / А.Н. Лобанов, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, Е.Д.
Селищева, Я.М. Станишевский // Тезисы научно-технической конференции “Молодые ученые и аспиранты МГТУ”.- Мурманск-2001.-С.323-324.
36. Станишевский, Я.М. Принципы выбора полимерных микросфер для получения диагностической тест-системы на фибронектин / Я.М.
Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, А.Н. Лобанов, В.Н.
Измайлова, А.Е. Харлов, В.А. Быков, Е.Г. Кравцов // Тезисы научно технической конференции “Молодые ученые и аспиранты МГТУ”. Мурманск-2001.-С.329.
37. Харлов, А.Е. Поверхностные свойства частиц полистирольного латекса модифицированного желатиной на границе водный раствор сульфата амония/воздух / А.Е. Харлов, Я.М. Станишевский, Е.С. Шведов // Тезисы научно-технической конференции “Молодые ученые и аспиранты МГТУ”. Мурманск-2001.-С.330-332.
38. Станишевский, Я.М. Влияние способа присоединения биолиганда на устойчивость иммунохимических тест-систем, основу которых составляют полимерные микросферы / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, В.А. Быков, Е.Г. Кравцов, Н.И. Прокопов, В.Н. Измайлова, А.Н. Лобанов // Биомедицинские технологии. -Москва-2001.-Вып.16.-С.-107-113.
39. Онзе Урбен Боско. Использование реакции агглютинации латекса для диагностики инфекционного бронхита кур / Онзе Урбен Боско, Л.Ф.
Левина, Я.М. Станишевский // Биомедицинские технологии. – Москва 2001.-Вып.16.-С.-236-239.
40. Харлов, А.Е. Тонкие пленки латексов, модифицированных желатиной / А.Е.
Харлов, Я.М. Станишевский, Е.С. Шведов, М.А. Саквапелидзе, И.А.
Грицкова, С.М. Левачев, Г.П. Ямпольская, В.Н. Измайлова // Санкт Петербургский государственный университет кино и телевидения. Сборник научных трудов. Санкт-Петербур-2001.-Вып.1.-С.-14-35.
41. Станишевский, Я.М. Подходы к созданию антительного диагностикума на сальмонеллез / Я.М. Станишевский, А.Н. Лобанов // Тезисы ХХХVIII Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Химическая секция) - Москва: Изд-во РУДН.- 2002.-С.72.
42. Григорьевская, И.И. Тонкие пленки латексов полистирола, модифицированных сывороточным альбумином человека / Григорьевская И.И., Станишевский Я.М. // Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов-2002” – Москва-2002-С.-245.
43. Izmailova, V.N. Periodic colloidal structures in thin films of latexes, modified by proteins. / V.N. Izmailova, I.A. Grizkova, G.P. Yampolskaya, A.E. Kgarlov, E.S.
Shvedov, I.I. Grigorievskaya, Ya.M. Stanishevskiy, A.V. Grigorieva, D.S.
Turygin // XII International conference surface forces. Zvenigorod, Russia.
June29-July5. -2002.-р.101.
44. Сакварелидзе, М.А. Влияние формальдегидных дубителей на свойства желатины в объеме и на границе раздела фаз / М.А. Сакварелидзе, С.М.
Левачев, В.В. Родин, А.Е. Харлов, Е.С. Шведов, Я.М. Станишевский, И.А.
Грицкова, П.В. Нусс, С.Р. Деркач, З.Д. Туловская, Г.П. Ямпольская, В.Н.
Измайлова // Тезисы докладов. Международный симпозиум. Фотография в ХХI веке. Санкт-Петербург - 2002.-С.-98-100.
45. Станишевский, Я.М. Создание антительной диагностической тест-системы на липтоспироз / Я.М. Станишевский, А.Н. Лобанов, И.И. Григорьевская, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Материалы Всероссийской научно технической конференции. “Наука и образование - 2002” Тезисы докладов – Мурманск 2002.-С.-543-544.
46. Измайлова, В.Н. Тонкие пленки латексов полистирола, модифицированных сывороточным альбумином человека / В.Н. Измайлова, И.И. Григорьевская, Я.М. Станишевский // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. “Наука и образование - 2002” Тезисы докладов – Мурманск 2002.-С.-538.
47. Лобанов, А.Н. Способ получения антительного диагностикума на столбнячный анатоксин / А.Н. Лобанов, Я.М. Станишевский, Э.Г. Кравцов, И.И. Григорьевская, Н.И. Прокопов // Материалы Всероссийской научно технической конференции. “Наука и образование - 2002” Тезисы докладов – Мурманск 2002.-С.-541-542.
48. Станишевский, Я.М. Использование полимерных микросфер в качестве иммуносорбентов для конструирования антительных противостолбнячных диагностикумов / Я.М. Станишевский, А.Н.Лобанов, И.И. Григорьевская // Тезисы ХХХIХ Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Химическая секция) - Москва: Изд-во РУДН.-2003.-С.52.
49. Лобанов, А.Н. Разработка новых концепций синтеза полимерных микросфер для иммунохимических реакций / А.Н. Лобанов, Я.М. Станишевский, И.И.
Григорьевская, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. “Наука и образование - 2003” Тезисы докладов – Мурманск-2003.-С.-38.
50. Станишевский, Я.М. Совершенствование свойств полимерных микросфер носителей биолигандов и методики изучения фагоцитоза полиморфно ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) с их использованием / Я.М. Станишевский, А.Н.
Лобанов, И.И. Григорьевская, В.Б. Скопинцев // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. “Наука и образование - 2003” Тезисы докладов – Мурманск -2003.-С.-134-135.
51. Станишевский, Я.М. Тесты для экспресс-диагностики на основе латекс агглютинации / Я.М. Станишевский, И.И. Григорьевская, А.Н. Лобанов, Е.Г.
Кравцов, И.А. Грицкова // Материалы 1-ой Всероссийской научной конференции “Биомедицинские технологии”. Москва-2003.-Вып.20.-С.-72 80.
52. Станишевский, Я.М. Влияние остаточного мономера в объеме полимерно мономерных частиц на свойства тест-систем, полученных на их основе / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.И. Григорьевская, Д.Н. Вовк // Материалы международной научно-технической конференции “Наука и образование 2004” часть IV.-Мурманск-2004.-С. 172-175.
53. Станишевский, Я.М. Синтез полимерных суспензий медико-биологического назначения методом затравочной полимеризации мономеров / Я.М.
Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, А.Н. Лобанов // Материалы международной научно-технической конференции “Наука и образование 2004” часть IV.-Мурманск-2004.-С.175-178.
54. Станишевский, Я.М. Частицы полимерных суспензий в качестве носителей биолигандов на примере лецитина / Я.М. Станишевский, А.Г. Марков, М.А.
Мягкова, В.А. Быков, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова // Материалы II Всероссийской конференции “Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах” «ФАГРАН-2004» Воронеж-2004.-Том. 2.-С.649-650.
55. Марков, А.Г. Полимерные микросферы, содержащие в поверхностном слое полярные липиды, для определения C-реактивного белка / А.Г. Марков, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, А.П. Каплун, М.А. Мягкова, Н.И.
Прокопов, В.Б. Скопинцев, В.В. Ветрова // Материалы II-ой Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии». -Москва-2004. Вып.22.-С.-42-51.
56. Марков, А.Г. Определение С-реактивного белка в сыворотке крови больных методом латексной агглютинации с использованием полимерных микросфер и биолигандов различной природы / А.Г. Марков, И.А.
Грицкова, Я.М. Станишевский, В.А. Быков, М.А. Мягкова, А.П. Каплун, В.Б. Скопинцев, Н.И. Прокопов // Материалы II-ой Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии». -Москва-2004.-Вып.22.-С. 113-121.
57. Станишевский, Я.М. Диагностическая тест-система для определения аутоантител щитовидной железы, с использованием полимерных микросфер в качестве носителей тиреоглобулина / Я.М. Станишевский, Н.С. Кузмина, И.А. Грицкова // Материалы международной научной конференции “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология”-Минск-2004.-С.257 258.
58. Станишевский, Я.М. Получение латексных диагностикумов для выявления антител продуцированных вирусами / Я.М. Станишевский, Е.Е. Ткаля, Т.П.
Лобова // Материалы II международной научно-практической конференции “Науковий потенцiал свiту ” -г. Днепропетровск- 2005.-Том1.-С.45-46.
59. Станишевский, Я.М. Выбор полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов при создании диагностических тест-систем для детекции антител к возбудителям аденовирусных инфекций у КРС / Я.М.
Станишевский, Т.П. Лобова, И.А. Грицкова, Р.В. Белоусова, Н.И. Прокопов, И.В. Третьякова // Материалы международной научно-технической конференции “Наука и образование - 2005” часть V.-Мурманск-2005.-С.202 204.
60. Станишевский, Я.М. Получение стабильных полимерных микросфер для создания на их основе иммунодисперсных тест-систем / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, С.А. Кедик // Первая научно-техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» Москва-2005.-Том2.-С.68-69.
61. Ткаля, Е.Е. Тест-системы для диагностики вирусных инфекционных заболеваний / Е.Е. Ткаля, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Т.П.Лобова // Первая научно-техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» -Москва-2005.-Том2.-С.67-68.
62. Станишевский, Я.М. Получение и использование антигенных латексных диагностикумов для выявления инфекционных заболеваний вызванных вирусами у КРС / Я.М. Станишевский, Е.Е. Ткаля, Т.П. Лобова // Материалы международной научной конференции “Молекулярная и прикладная генетика” -г. Минск-2005.-С.247.
63. Fedorova, A. Polymeric microspheres for immobilization of immunoglobulin G / A. Fedorova, R. Petrina, Ya. Stanishevsky, V. Novikov, I. Gritskova // Europeen Conference of the Colloid and Interface Society. – Budapest, Hungary – 2006.-№8. р.30.
64. Ткаля, Е.Е. Тестирование респираторно-кишечных заболеваний тест системами, созданными на основе полимерных носителей / Е.Е. Ткаля, Я.М.
Станишевский, Н.И. Прокопов, Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова // Материалы Международной научно-технической конференции. “Наука и образование 2006” Тезисы докладов – Мурманск-2006.-С.-669-671.
65. Станишевский, Я.М. Тест-системы с использованием полимерных носителей биолигандов / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И.
Прокопов, А.Н. Лобанов, Е.В. Фёдорова, В.П. Новиков // Материалы Международной научно-технической конференции. “Наука и образование 2006” Тезисы докладов – Мурманск-2006.-С.-667-668.
66. Петрiна, Р.О. Iммобiлiзацiя бiолiгандiв та створення тест-систем на основi полiмерних мiкросфер / Р.О. Петрiна, О.В. Федорова, Я.М. Станiшевський, В.П. Новiков, I.О. Грицкова // Матерiали IX Украiнського бiохiмiчного з’iзду. – м. Харкiв-2006.-Том 2.-С.216-217.
67. Федорова, О.В. Iммобiлiзацiя iмуноглобулiну G на поверхню полiмерних мiкросфер / О.В. Федорова, Р.О. Петрiна, В.П. Новiков, Я.М. Станiшевський // Материалы III Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология. Образование. Наука. Практика» – г. Харкьков-2006.-С.133.
68. Petrina, R. Polymeric suspensions for bioanalytical study / R. Petrina, E.
Fedorova, V. Novikov, Ya. Stanishevsky // Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology - Kyiv-2006.-p.117.
69. Фёдорова, Е.В. Полимерные носители для иммуноанализа / Е.В. Фёдорова, Р.Е. Петрина, В.П. Новиков, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова // Международная конференция по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» – г. Санкт-Петербург-2007. С.790.
70. Федорова, Е.В. Исследование фагоцитоза с помощью полимерных носителей / Е.В. Федорова, Р.Е. Петрина, В.П. Новиков, Я.М.
Станишевский, И.А. Грицкова // Тезисы IV Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку» - Москва-2007.-.Вып.2.
С.438.
71. Fedorova, A. Polymeric suspensions for bioanalytical study / A. Fedorova, R.