Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования днк эукариот
На правах рукописи
ШЕВЧУК ТАРАС ВАЛЕРЬЕВИЧ
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ
ДНК ЭУКАРИОТ
03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Пущино – 2008
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и в департаменте клеточной биологии Национального медицинского цен тра (Лос-Анжелес, США).
Научный консультант:
доктор биологических наук профессор Бурьянов Ярослав Иванович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Патрушев Лев Иванович доктор биологических наук Кирьянов Глеб Иванович доктор биологических наук профессор Романов Георгий Александрович
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва
Защита состоится _2008 г. в _ часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозер ского, лаб. корпус “А”, аудитория 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва.
Автореферат разослан 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Несмотря на изучение явления энзиматического метили рования ДНК эукариот в течение шестидесяти лет, мы ещё далеки от полного пони мания функциональной роли этой модификации генома. В клетках эукариотических организмов метилирование ДНК участвует в регуляции генетической экспрессии, клеточной дифференцировки и морфогенеза, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Эти функции уста новлены как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. В настоящее время установлено, что большинство своих функций метили рование ДНК осуществляет в качестве интегральной части механизма модификации и ремоделирования структуры хроматина. В этом процессе участвуют многочисленные белки, осуществляющие различные ковалентные модификации гистонов, а также ко роткие некодирующие РНК. Согласно современным взглядам, метилирование ДНК служит эпигенетической меткой, позволяющей регуляторным факторам транскрип ции отличать метилированные последовательности генома от гомологичных, но не метилированных последовательностей. Существенные успехи в исследовании мети лирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированной ДНК. В настоящее время особое внимание уделено белкам, связывающимся с мети лированными CpG-последовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гис тоновые деацетилазы и другие гистон-модифицирующие белки, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. Картина сложноразветвлённой сети многочисленных взаимосвязанных реакций модификации и ремоделирования структуры хроматина только устанавливается, в том числе устанавливается специ фичность функций индивидуальных ДНК-метилтрансфераз эукариотической клетки.
В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эука риотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только CpG-типа этой модификации. Однако у эукариот обнаружен второй симметричный тип метилирования ДНК CpNpG (N — любой нуклеозид) и несимметричный тип ме тилирования CpN. Растущее внимание к картине метилирования эукариотического генома, на фоне которой развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедея тельности, ставит вопрос о раздельном анализе каждого из этих типов метилирования ДНК. Исследование различных типов сайт-специфического метилирования ДНК име ет фундаментальное значение для понимания функциональной роли этой модифика ции эукариотического генома.
Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение CpG- и CpNpG-типов метилирования ДНК высших эукариот в условиях изменения метаболизма и клеточ ной дифференцировки и при трансген-индуцированном метилировании генома, а также разработка новых методических приёмов анализа метилирования ДНК и при менения ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях.
В число основных экспериментальных задач входили:
разработка метода определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG (W = А или Т) генома;
исследование эффекта трансген-индуцированного CCWGG-метилирования (CpNpG-тип) ДНК клеток растений Nicotiana tabacum;
анализ метилирования генома растений Mesembryanthemum crystallinum в ус ловиях солевого стресса и переключения метаболизма на С4-путь фотосинтеза;
анализ метилирования 5'-концевой области гена кальцитонина человека в нор ме и при лейкозах;
исследование эффекта трансген-индуцированного CCWGG-метилирования ДНК клеток HK293 культуры эпителиального слоя почек человека;
разработка приёмов применения цитозиновых ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях.
Научная новизна. На основе особенностей каталитической активности ДНК метилтрансфераз BstNI и EcoRII разработан метод определения уровня метилирова ния внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG.
Впервые осуществлён перенос в клетки растений гена гетерологичной ДНК метилтрансферазы EcoRII (M·EcoRII) в составе Т-ДНК агробактериальной Ti плазмиды дикого типа и в модифицированной форме NLS-M·EcoRII в составе обезо руженной Т-ДНК. Обнаружено, что неэкспрессируемый ген M·EcoRII индуцирует у первичной трансформированной клеточной ткани N. tabacum образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень ме тилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в ДНК этих кле ток. Показано, что экспрессия гена NLS-M·EcoRII индуцирует новый морфологиче ский фенотип целого растения и вызывает в его геноме дополнительное метилирова ние последовательностей CCWGG. Установлено, что в условиях засоления, при пере ключении С3-фотосинтеза на С4-путь фотосинтеза, наблюдается двукратное повыше ние уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК растений M.
crystallinum, связанное с гиперметилированием фракции повторяющейся ДНК. Полу ченные данные могут свидетельствовать о новой специфической функциональной ро ли CpNpG-метилирования повторяющейся ДНК в образовании специализированной структуры хроматина в клетках M. crystallinum при их адаптации к солевому стрессу и переключении на С4-фотосинтез.
Обнаружено, что при лейкозах гиперметилирование цитозина в последовательно стях CpG в 5'-концевой области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащие последовательности CpNpG. Сформулировано положение о существо вании особого безальтернативного CpG-метилирования генома высших эукариот.
Впервые осуществлён перенос в клетки HK293 культуры эпителиального слоя почек человека гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в модифицированной форме NLS M·EcoRII-GFP. Установлено, что трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК клеток HK293 не влияет на CpG-метилирование их генома. Показано отсутствие влияния CCWGG-метилирования промотора гена АРС на его экспрессию в клетках HK293. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинук леотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro.
Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.
Для применения в нанобиотехнологии и ингибирования цитозиновых ДНК метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных произ водных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRII.
Практическая ценность работы. Разработанный метод определения уровня метили рования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в геномной ДНК мо жет применяться при анализе динамики сайт-специфического метилирования генома различных организмов в процессе их жизнедеятельности.
Получены генетические конструкции для экспрессии модифицированных форм ге на ДНК-метилтрансферазы EcoRII: NLS-M·EcoRII и NLS-M·EcoRII-GFP в клетках растений и млекопитающих.
Экспрессию в клетках растений гетерологичных генов цитозиновых ДНК метилтрансфераз можно использовать для получения эпигенетического разнообразия клеточных культур растений, а полученные клетки и ткани использовать в качестве новых удобных объектов для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.
Клетки млекопитающих, экспрессирующие гетерологичные гены цитозиновых ДНК-метилтрансфераз могут использоваться как удобные модели для изучения осо бенностей эпигенетических модификаций ДНК.
Сконструированные на основе модифицированных производных цитозина и ДНК метилтрансферазы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид EcoRII белковые комплексы перспективны для восстановления нормальной картины метили рования ДНК эукариотической клетки.
Полученные в работе оригинальные экспериментальные данные могут быть ис пользованы в теоретических и практических курсах современной молекулярной и клеточной биологии высших эукариот.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из ведения, обзора литерату ры, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитиро ванной литературы. Работа изложена на _ страницах машинописного текста, со держит _ рисунков и таблиц. Библиография включает _ источников.
Апробация результатов работы. Результаты данной работы были представлены на 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, (Австрия, 1997);
Annual Oncologycal Congress of American Urologic Association, (США, 2002);
Scholarship of Anticancer Drug Design, (США, 2003);
FEBS-CNRS Workshop on DNA and RNA modification enzymes: Comparative Strucure, Mechanism, Function and Evolution, (Франция, 2007);
12th Congress of the European Hematology Association, (Ав стрия, 2007);
VI Съезде Гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007);
III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002);
VI Съезде Общества Физиологов растений России (Сыктывкар, 2007);
Международном симпозиуме по физико-химической биологии (Москва, 2004);
IV съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, (Пущино, 2006);
IV Съезде Российско го общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаменталь ных исследований и программы Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека»
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии ис следования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в об суждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все ос новные эксперименты, проведённые в работе, выполнены лично автором, а также ру ководимыми им сотрудниками и студентами. В работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками ФИБХ РАН, сотрудниками других институтов РАН и с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, прямом участии в проведении экспериментов и получении результатов, их обсуждении и оформлении в виде публикаций.
Автор выражает особую признательность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборато рии которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы. Автор благодарит всех сотрудников и студентов своей группы, а также всех зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Разработка метода определения уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК У животных и растений в основном исследовано метилирование ДНК в последова тельности CрG. Однако у растений ДНК метилирована в значительной степени не только в последовательности CрG, но и в последовательности CрNрG [Кирнос и др., 1981;
Gruenbaum et al., 1981]. CpNpG-метилирование ДНК имеет место также в клет ках млекопитающих [Clark et al., 1995]. Не исключено, что CpG- и CpNpG-типы мети лирования ДНК могут выполнять особые функции в клетке. Растущее внимание к ди намике метилирования генома, на фоне которого развиваются разнообразные генети ческие процессы, ставит вопрос о его раздельном анализе в последовательностях CpG и CpNpG.
В работе разработан энзиматический метод определения уровня метилирования цитозина в эукариотических ДНК в нуклеотидной последовательности, соответст вующей CpNpG-метилированному мотиву. Предлагаемый метод основан на примене нии ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI. Оба фермента узнают в ДНК одинаковую последовательность CCWGG, в которой метилируют внутренний цитозин. Эти фер менты различаются продуктами ДНК-метилазной реакции. ДНК-метилаза EcoRII мо дифицирует цитозин, перенося метильную группу на С5-атом пиримидинового коль ца с образованием 5-метилцитозина (m5C). ДНК-метилаза BstNI модифицирует этот же остаток цитозина, метилируя экзоциклическую аминогруппу и образуя N4 метилцитозин (m4C). Особенностью ДНК-метилазы BstNI является её способность модифицировать ДНК, содержащую в последовательности CCWGG внутренний ци тозин в форме m5C, образуя при этом N4,5-диметилцитозин (m4,m5C) (рис. 1).
H CH3 H CH N NH2 N CH3 CH N N N O N O N O N H H H 5-метилцитозин N4-метилцитозин N4,5-диметилцитозин 5 4 4 (m C) (m C) (m,m C) Рис. 1. Метилированные производные цитозина.
Иными словами, по включению метильных групп в ДНК ферментом BstNI можно оценить в ней общее количество последовательностей CCWGG независимо от при сутствия в ДНК m5C. С другой стороны, с помощью ДНК-метилазы EcoRII можно оценить в ДНК только количество неметилированных последовательностей CCWGG.
Таким образом, разность между метильными группами, включёнными в анализируе мую ДНК ферментами BstNI и EcoRII, должна отражать степень недометилированно сти этой ДНК in vivo.
В предложенном методе необходимым требованием является полнота проведения энзиматической реакции метилирования ДНК в условиях отсутствия её лимитирова ния недостатком фермента или донором метильных групп S-аденозилметионина.
Условия реакции энзиматического метилирования ДНК. Реакционная смесь со держала 40 мМ трис-HCl (pH 8,0), 2 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 6,6 мкМ S аденозил-L-[метил-3Н]-метионин (удельная активность 15 Ки/мМ), от 0,1 до 1,2 мкг ДНК и 20 ед.акт. ДНК-метилазы (1 ед.акт. — количество фермента, катализирующее перенос на ДНК фага dcm— 1 пмоль метильных групп за 1 час). Реакцию проводили в течение 2 ч при 37°С с метилазой EcoRII и 55°С с метилазой BstNI. Пробы наносили на DE-81 бумагу 22 см, промывали последовательно 0,2 М раствором NaHCO3, во дой и этанолом. Образцы высушивали, помещали во флаконы с толуольным сцинтил ляционным раствором и просчитывали на сцинтилляционном спектрометре.
Рис. 2. Включение метильных групп в ДНК E. coli ДНК-метилазами EcoRII и BstNI.
1 – ДНК E. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой EcoRII;
2 – смесь (1:1) ДНК E. coli B834 и E. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой EcoRII;
3 – смесь (1:1) ДНК E. coli B и E. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой BstNI. Общее количество ДНК в стандартной ферментативной реакции составляло 1 мкг.
Рис. 3. Включение метильных групп в стандартных условиях реакции в смесь (1:1) ДНК E. coli B834 и E. coli B834(N3) ДНК-метилазой EcoRII (1), и в ДНК E. coli B834(N3) ДНК-метилазой BstNI (2).
В случае определения радиоактивности m4C и m4,m5C ДНК после реакции энзима тического метилирования гидролизовали до азотистых оснований в 57% хлорной ки слоте в течение 1 ч при 100°С. К полученному гидролизату добавляли синтетические метилированные азотистые основания m4C и m4,m5C. Разделение азотистых основа ний проводили хроматографией на пластинках с целлюлозой (Merck, Германия) в системе бутанол-вода-аммиак (60:10:0,1). Сорбент из областей, соответствующих по ложению метилированных азотистых оснований, соскабливали, помещали во флако ны с толуольным сцинтилляционным раствором и просчитывали на сцинтилляцион ном спектрометре.
Требование проведения полного метилирования ДНК удовлетворяется при исполь зовании в энзиматической реакции метилирования 0,1-1,0 мкг ДНК, 20 ед. ДНК метилазы, 6,6 мкМ концентрации SAM и проведении реакции в течение 1 ч (рис. 2, 3).
Определение уровня метилирования сайтов CCWGG в исследуемых ДНК можно про водить двумя способами. В первом способе используется пара ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI.
Отношение величин включения метильных групп в ДНК, осуществляемое метила зами EcoRII и BstNI, равно 1 в случае полного отсутствия m5C в последовательности CCWGG и уменьшается пропорционально его количественному содержанию в этой последовательности. Уровень метилирования in vivo последовательностей CCWGG в исследуемой ДНК можно определить по формуле:
IEcoRII M = 1 IBstNI где М — уровень метилирования ДНК in vivo (в процентах), IEcoRII — радиоактив ность, включённая в ДНК метилазой EcoRII, IBstNI — радиоактивность, включённая в ДНК метилазой BstNI.
Этот способ проверен на модельных ДНК E. coli B834(N3), полностью модифици рованной in vivo ДНК-метилтрансферазой EcoRII, и ДНК E. coli B834, не содержащей остатков m5C. Данные анализа этих ДНК, а также смеси этих ДНК в соотношении 1:1, полностью соответствуют ожидаемым результатам (табл. 1).
Второй способ определения уровня метилирования этой последовательности со стоит в количественном анализе продуктов энзиматической модификации ДНК фер ментом BstNI, которыми могут быть m4С или m4,m5C. При этом m4С образуется в случае присутствия в последовательности CCWGG внутреннего цитозина в немети лированной форме, в то время как образование m4,m5C зависит от присутствия в этом положении m5C. Уровень метилирования in vivo последовательностей CCWGG в ис следуемой ДНК можно определить по формуле:
I ( m 4, m5 C ) M = I(m, m C) + I (m C) 4 5 где М — уровень метилирования ДНК in vivo (в процентах), I(m4C) — радиоактив ность (количество) N4-метилцитозина, I(m4,m5C) — радиоактивность (количество) N4,5-диметилцитозина.
Этот метод проверен на тех же модельных ДНК E. coli B834, E. coli B834(N3) и равной смеси этих ДНК. Данные анализа этих ДНК, представленные в табл. 1, соот ветствуют результатам их анализа по первому способу с помощью пары ДНК метилтрансфераз EcoRII и BstNI. Использование радиоактивного S-аденозил-L [метил-3Н]-метионина позволяет брать для анализа в реакцию энзиматического мети лирования ДНК менее 1 мкг ДНК, что ставит этот метод в ряд современных методов аналитического микроанализа ДНК.
Таблица 1.
Уровень метилирования последовательностей CCWGG различных ДНК Уровень метилирования (%) ДНК Метилазы EcoRII+BstNI Метилаза BstNI (I способ) (II способ) E. coli B834 0* 1,8±0, E. coli B834(N3) 97,5±3,2 98,2±2, E. coli B834(N3)+E. coli B834 (1:1) 49,4±1,8 47,5±1, N. tabacum (листья) 64,5±2,7 63,3±1, * Включение метил-3Н групп в ДНК ферментом EcoRII на уровне фона.
Разработанный в данной работе метод можно использовать не только для анализа уровня метилирования последовательностей CCWGG, но, в приближении, оценивать состояние метилирования и всех последовательностей CpNpG в ДНК.
2. Трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК растений Nicotiana tabacum Новым экспериментальным подходом к выяснению функциональной роли метили рования ДНК у эукариот является изучение трансгенных клеток с различными генами ДНК-метилтрансфераз. ДНК-метилаза EcoRII (M·EcoRII) модифицирует внутренний цитозин в последовательностях ДНК CCWGG. Эта последовательность содержит центральный тринуклеотид, соответствующий CpNpG-метилированному мотиву ДНК растений. В начальной части работы были трансформированы растения табака N. tabacum рекомбинантной агробактериальной Т-ДНК с геном M·EcoRII и проведён анализ некоторых физиолого-биохимических свойств полученных трансформирован ных тканей и уровня метилирования последовательностей CCWGG в их геноме.
Интеграция гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в Т-ДНК агробактериальной Ti-плазмиды дикого типа. Клонированный в плазмиде pVK32 ген M·EcoRII был суб клонирован в коинтегративном векторе pLGV2382, содержащем фрагмент Т-ДНК аг робактериальной Ti-плазмиды pTiC58 для проведения гомологичной рекомбинации с Ti-плазмидой в клетках A. tumefaciens. (рис. 4).
Рис. 4. Схема клонирования гена M·EcoRII в Т-ДНК Ti-плазмиды дикого типа pLGV2382.
Плазмиду pLGV2382-M·EcoRII переносили из клеток E. coli B834 в клетки A. tumefaciens C58 в трёхродительском скрещивании с помощью штамма E. coli GJ23.
В результате были получены клетки A. tumefaciens с коинтегрированной Ti плазмидой, которая в дополнение к маркерным генам нопалинсинтазы (nos) и синтеза фитогормонов (tms1, tms2, tmr) несла также ген M·EcoRII под дополнительным nos промотором.
В клетках A. tumefaciens, также как и в клетках E. coli B834, ген M·EcoRII опреде лял CCWGG-специфичность метилирования клеточной ДНК и защищал её от гидро лиза рестрикционной эндонуклеазой EcoRII. Аналогичным путём была получена ко интегрированная Ti-плазмида без гена M·EcoRII, использованная в контрольных ва риантах эксперимента.
Интеграция модифицированного гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в обезо руженный агробактериальный вектор. Ген M·EcoRII был клонирован в плазмиду pRT103 под контроль конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (рис. 5). В дальнейшем кодирующая часть гена МEcoRII была мо дифицирована вставкой сигнала ядерной локализации (NLS) вируса SV40. Продукт экспрессии полученной конструкции в dcm клетках E. coli GM272 проявлял EcoRII специфический характер метилирования ДНК. В дальнейшем модифицированный ген NLS-МEcoRII был перенесён в бинарный вектор pGA482, и полученную плазмиду pGA482::NLS-МEcoRII переносили из клеток E. coli GM272 в клетки A. tumefaciens 3101 в трёхродительском скрещивании с помощью штамма E. coli GJ23.
Рис. 5. Схема клонирования модифицированного гена NLS-МEcoRII под контролем промо тора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В результате были получены клетки A. tumefaciens с рекомбинантной Ti плазмидой, которая несла модифицированный ген NLS-МEcoRII под контролем промотора 35S CaMV и ген nptII маркерного белка неомицинфосфотрансферазы.
Присутствие целевого гена NLS-МEcoRII в агробактериях было подтверждено гиб ридизацией по Саузерну с геном МEcoRII в качестве зонда.
2.1. Получение трансгенных опухолевых линий Nicotiana tabacum, содержащих ген ДНК-метилтрансферазы EcoRII На раневую поверхность стеблей проростков N. tabacum наносили суспензию кле ток A. tumefaciens, несущих Ti-плазмиду с геном МEcoRII или без него. Образован ные опухоли вырезали и культивировали в виде каллусной культуры на агаризован ной среде Мурасиге-Скуга (МS). Селекцию трансформированных клеток проводили в суспензионной культуре на безгормональной жидкой среде МS с цефотаксимом. Сво бодные от агробактерий клеточные микроагрегаты переносили на агаризованную среду МS без антибиотиков, содержащую фитогормоны нафтилуксусную кислоту и 6 бензиламинопурин. В течение двух месяцев культивирования первичной опухолевой культуры N. tabacum, трансформированной Ti-плазмидой с геном МEcoRII, происхо дила её спонтанная морфологическая дифференциация. Эта культура дала начало не сколькими новым стабильным морфологическим линиям с характерной структурой и цветом (рис. 6).
2 Рис. 6. Фенотип трансформированных линий культуры ткани N. tabacum с геном МEcoRII.
1 — «белая компактная» линия;
2 — первичная ткань с геном M·EcoRII;
3 — «жёлтая рых лая» линия;
4 — тератомная линия. Названия линий соответствуют их морфологии, цвету и плотности.
Физиолого-биохимическая характеристика трансгенных опухолевых линий N. tabacum. Первичная трансформированная культура имела типичные свойства опу холевой ткани, определяемые специфическими генами T-ДНК агробактериальной Ti плазмиды дикого типа, и проявляла гормон-независимый рост и способность синте зировать нопалин. Однако образованные из первичной опухолевой культуры новые линии различались между собой по этим свойствам. Так, «белая компактная» каллус ная линия проявляла нопалинсинтазную активность и гормон-независимый рост, а «жёлтая рыхлая» линия имела противоположные свойства, то есть не синтезировала нопалин и была гормон-зависимой (табл. 2). В то же время контрольная опухолевая культура ткани, полученная в результате трансформации Ti-плазмидой без гена МEcoRII, стабильно сохраняла свой исходный морфологический фенотип и по своим свойствам не отличалась от первичной опухолевой культуры с геном МEcoRII.
Таблица 2.
Фенотип трансформированных линий культуры ткани Nicotiana tabacum с геном МEcoRII Синтез Зависимость Уровень Линия культуры ткани нопалина от гормонов CCWGG-метилирования (%) Первичная ткань с геном + — 33,4±1, МEcoRII «Белая компактная» линия + — 42,5±1, «Жёлтая рыхлая» линия — + 34,8±1, Тератомная линия — — 37,1±1, Нетрансформированный — + 58,3±1, каллус (контроль 1) Трансформированная ткань + — 60,5±2, без гена МEcoRII Уровень метилирования последовательностей CCWGG в геноме трансгенных опухолевых линий N. tabacum. Блот-гибридизационный анализ ДНК показал присут ствие гена МEcoRII в геноме всех трансформированных фенотипических линий (рис. 7). В то же время, анализ геномов этих линий методом ПЦР с применением праймеров к 5'-концам гена МEcoRII показал отсутствие у них полноразмерных ко пий этого гена (рис. 8). Амплификация этого гена в смеси с исследуемыми ДНК раз личных фенотипических опухолевых линий табака указывает на отсутствие у них диффузного ингибитора ПЦР.
Определение уровня метилирования цитозина в последовательности CCWGG про водили по разработанному нами методу, основанному на применении ДНК-метилаз EcoRII и BstNI. ДНК всех трансформированных опухолевых линий с геном ДНК метилазы EcoRII отличается пониженным уровнем метилирования последовательно стей CCWGG по сравнению с ДНК контрольной нетрансформированной каллусной ткани и опухолевой линии, трансформированной Ti-плазмидой без гена МEcoRII (табл. 2). Таким образом, интеграция в ДНК клеток табака гена МEcoRII в составе агробактериальной Т-ДНК дикого типа не только не вызвала дополнительного мети лирования генома клеток растений, но привела к его значительному понижению.
По-видимому, ген МEcoRII не экспрессируется в клетках трансформированных линий из-за нарушенной структуры его 5'-концевой области. Кроме того, в этих экс периментах ген МEcoRII не кодировал сигнал ядерной локализации для транслока ции ДНК-метилтрансферазы EcoRII из цитоплазмы в ядро, что понижало вероятность проявления белком своей каталитической функции в ядре.
Влияние интегрированного в геном N. tabacum гена ДНК-метилтрансферазы МEcoRII на фенотип трансгенных опухолевых линий и пониженный уровень мети лирования последовательностей CpNpG в их геноме можно объяснить возможностью гомологичной рекомбинации гена МEcoRII с одним из собственных ДНК метилтрансферазных генов N. tabacum и его инактивации («нокаута»).
Этому соответствует наблюдаемый в настоящей работе положительный сигнал гибридизации между геном ДНК-метилазы EcoRII и ДНК из клеток контрольной нормальной каллусной линии и опухолевой каллусной линии без гена МEcoRII (рис.7, дор. 1, 6). В случае гибридизационного анализа ДНК из трансформированных линий с геном МEcoRII этот сигнал отсутствовал или его положение было заметно смещено. Сохраняющийся пониженный уровень метилирования последовательности CCWGG в ДНК этих клеток может обеспечиваться активностью продуктов других интактных генов растительных ДНК-метилтрансфераз. Полученные данные указыва ют на существование выраженной причинно-следственной связи между интеграцией гена ДНК-метилазы EcoRII в геном N. tabacum и изменением фенотипических свойств трансформированных опухолевых тканей.
1 2 3 4 5 6 т.п.н.
23, 9, 6, 4, Рис. 7. Блот-гибридизационный анализ ДНК культур тканей Nicotiana tabacum.
1 – опухолевая ткань без гена M·EcoRII;
2 – первичная опухолевая ткань с геном M·EcoRII;
– «белая компактная» линия;
4 – тератомная линия;
5 – «жёлтая рыхлая» линия;
6 – нетранс формированный каллус.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 т.п.н.
1, Рис. 8. ПЦР-анализ ДНК культур тканей Nicotiana tabacum.
1 – ДНК плазмиды pLGV2383::M·EcoRII;
2 – ДНК трансгенных растений табака с геном M·EcoRII (Nt::M·EcoRII);
3 – «белая компактная» линия;
4 – «белая компактная» линия + Nt::M·EcoRII;
5 – «жёлтая рыхлая» линия;
6 - «жёлтая рыхлая» линия + Nt::M·EcoRII;
7 – те ратомная линия;
8 – тератомная линия + Nt::M·EcoRII;
9 – первичная ткань с геном M·EcoRII;
10 – первичная ткань с геном M·EcoRII + Nt::M·EcoRII;
11 – нетрансформированный каллус;
12 – трансформированная ткань без гена M·EcoRII;
13 – pBR/RsaI Интеграция гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в геном трансформированных аг робактериями клеток N. tabacum привела к появлению различных физиологических и морфолого-биохимических фенотипов опухолевой ткани. После публикации нашей работы [Buryanov et al., 1995] разнообразие морфологических фенотипов было отме чено также у растений Arabidopsis thaliana с пониженным метилированием генома [Finnegan et al., 1996;
Kakutani et al., 1996].
Применение химерных генов ДНК-метилтрансфераз с сигналами ядерной локали зации расширяет возможности этого подхода для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК. Продолжением этой части работы было полу чение и исследование физиолого-биохимических свойств и CCWGG-метилирования трансгенных растений N. tabacum, экспрессирующих ген ДНК-метилтрансферазы EcoRII с сигналом ядерной локализации.
2.2. Получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих модифицированный ген NLS-МEcoRII Получение трансформированных растений табака N. tabacum. Агробактериаль ную трансформацию проводили методом инокуляции листовых дисков растений та бака клетками A. tumefaciens 3101, несущих рекомбинантную Ti-плазмиду с геном NLS-МEcoRII. Образовавшиеся в ходе прямой регенерации растения переносили для укоренения на селективную безгормональную среду MS, содержащую цефотаксим и канамицин. Свободные от агробактерий растения переносили на среду MS без цефо таксима. Для дальнейшего анализа было отобрано 12 линий устойчивых к канамици ну растений.
Физиолого-биохимическая характеристика трансгенных растений Nicotiana tabacum. Трансгенная природа 12 линий растений N. tabacum была подтверждена ПЦР-анализом, который показал наличие полноразмерного гена nptII во всех двена дцати исследуемых линиях (рис. 9). Для подтверждения интеграции гена NLS МEcoRII был проведён ПЦР-анализ ДНК полученных линий трансформантов с при менением праймеров к 5'-концам этого гена. Анализ показал присутствие полнораз мерных копий гена ДНК-метилтрансферазы M·EcoRII только у пяти исследуемых ли ний (рис. 10).
В нашей работе в различных линиях трансгенных каллусных культур N. tabacum с геном M·EcoRII без сигнала ядерной локализации также наблюдалось отсутствие полноразмерной формы этого гена. Это можно объяснить рекомбинационными пере стройками между геном M·EcoRII и одним из генов ДНК-метилтрансфераз N. tabacum. Дальнейшая работа проводилась с растениями с полноразмерной формой гена M·EcoRII.
1 2 3 4 5 6 7 8 т.п.н.
1, Рис. 9. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений Nicotiana tabacum с праймерами к гену nptII.
1 – ДНК фага, гидролизованная рестриктазой HindIII;
2 – ДНК нетрансформированного растения N. tabacum;
3 – ДНК плазмиды pGA482::МEcoRII;
4-8 – ДНК трансгенных растений N. tabacum.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 т.п.н.
1, Рис. 10. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений Nicotiana tabacum с праймерами к 5'-концам полноразмерного гена M·EcoRII.
1 – ДНК фага, гидролизованная рестриктазой HindIII;
2 – ДНК плазмиды pRT103;
3 – ДНК плазмиды pRT103::NLS-M·EcoRII;
4-10 – ДНК трансгенных растений N. tabacum Экспрессия чужеродного гена ДНК метилазы M·EcoRII в клетках трансгенных рас тений табака была подтверждена РНК-ДНК гибридизационным анализом, который показал транскрипцию этого гена во всех пяти линиях трансгенных растений (рис. 11). Трансгенные растения линий с полноразмерным геном M·EcoRII впоследст вии были высажены в грунт в оранжерее. Через шесть недель после высадки в грунт эти растения обнаружили фенотипические отличия от нормального табака. В частно сти, их листья имели аномально развитые прилистники (рис. 12). Кроме того, транс генные растения заметно отставали в росте, зацвели на две недели позже, и дали бо лее мелкие семена.
1 2 3 4 5 6 7 Рис. 11. Нозерн-блот гибридизационный анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum.
1 – ДНК плазмиды pRT103::M·EcoRII;
2 – РНК нетрансформированного растения;
3-7 – РНК трансгенных растений с полноразмерным геном M·EcoRII;
8 – РНК трансгенного рас тения с неполноразмерной копией гена M·EcoRII.
От всех линий трансгенных растений были получены жизнеспособные семена, ко торые показали классическое расщепление 3:1 на среде с канамицином. Полученные из семян трансформантов растения первого поколения F1 культивировались на среде MS с канамицином. После высадки в грунт в оранжерее они также как и родительские растения (поколение F0) имели аномально развитые прилистники (рис. 12 В, С), кото рые не только сохранялись в последующих поколениях трансгенных растений, но и становились более выраженными. В первом поколении трансгенных растений F1 с геном NLS-M·EcoRII прилистники не только имели больший размер, но и разраста лись по всей длине листового черешка (рис. 12, С), в отличие от первичных транс формантов поколения F0, у которых прилистники развивались только у основания листового черешка.
Эти результаты вместе с ранними данными, полученными на трансгенных каллус ных культурах с геном M·EcoRII, соответствуют наблюдениям других авторов о мор фологических аномалиях мутантных растений A. thaliana с нарушенным уровнем ме тилирования своего генома, вызванным специфическими мутациями или эффектом антисмысловой формы собственного гена ДНК-метилазы [Kakutani et al., 1996].
В А С Рис. 12. Различия в морфологии между нетрансформированным растением N. tabacum (А), трансгенным растением поколения F0 с геном NLS-M·EcoRII (В) и трансгенным растением поколения F1 с геном NLS-M·EcoRII (С). Стрелками показаны прилист ники.
Следует также отметить, что в этих работах аномальный фенотип во всей полноте проявлялся у таких растений только через несколько поколений. Полученные данные о фенотипических аномалиях трансгенных растений табака с геном M·EcoRII указы вали на вероятное изменение картины метилирования генома полученных нами рас тений. Проведённый анализ подтвердил это предположение.
Определение уровня метилирования цитозина в последовательностях CCWGG ДНК трансформированных растений N. tabacum. ДНК всех линий первичных рас тений-трансформантов (поколение F0) с геном ДНК-метилтрансферазы NLS M·EcoRII и их первого поколения (F1) отличаются повышенным уровнем метилиро вания последовательностей CCWGG по сравнению с ДНК контрольных нетрансфор мированных растений (табл. 3). Экспрессия гена NLS-M·EcoRII в растениях приводит к повышению уровня CCWGG-метилирования ДНК, сохраняющемуся и в последую щем поколении трансгенных растений с аномальным фенотипом.
Таким образом, интеграция различных форм гена M·EcoRII в геном трансформиро ванных клеток N. tabacum приводила к появлению различных физиологических и морфолого-биохимических фенотипов у целых растений и каллусной ткани. Измене ния уровня метилирования CpNpG-последовательностей ДНК, как в сторону его уве личения, так и в сторону его снижения приводили к появлению аномальных феноти пов каллусных тканей и целых растений.
Наши результаты показывают перспективность использования трансгенных расте ний с гетерологичными генами ДНК-метилтрансфераз как удобной модели для иссле дования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.
Таблица 3.
Фенотип трансформированных линий растений Nicotiana tabacum с геном NLS-МEcoRII Линии растений Наличие прилистников Уровень CCWGG-метилирования (%) Нетрансформированное — 58,2±1, растение № Нетрансформированное — 59,0±1, растение № Нетрансформированное — 58,7±1, растение № Линия №3 + 64,1±1, Линия №4 + 63,3±1, Линия №5 + 67,5±1, Линия №6 + 65,8±1, Линия №7 + 63,4±1, Линия №3 (F1) + 64,5±1, Линия №4 (F1) + 66,8±1, Линия №5 (F1) + 65,5±1, Линия №6 (F1) + 67,1±1, Линия №7 (F1) + 66,2±1, 3. Исследование метилирования растений Mesembryanthemum crystallinum в стрессовых условиях Факультативные галофитные растения Mesembryanthemum crystallinum являются хорошо изученной физиологической моделью для исследования адаптации растений к засолению и водному дефициту. Особенностью этого растения является его способ ность в условиях водного дефицита, вызываемого засухой или засолением, переклю чаться с С3-пути фотосинтеза на САМ-путь С4-фотосинтеза (Сrassulacean acid metabo lism). Благодаря своим физиолого-биохимическим особенностям и сравнительно не большому размеру генома (около 350000 т.п.н.), M. crystallinum является удобным модельным организмом для исследования адаптации растений к условиям солевого стресса и водному дефициту.
САМ-специфическая форма фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕР-карбоксилазы) является индикатором функционирования САМ-пути у растений M. crystallinum. В условиях водного дефицита или засолённости количество РЕР-карбоксилазы и соот ветствующей мРНК в клетках этих растений резко возрастает. В этих условиях у рас тений происходит индукция транскрипции гена Ppc1 cемейства генов РЕР карбоксилазы, а также других генов САМ-пути ассимиляции СО2 [Bohnert et al., 1988]. В то же время, механизмы индукции экспрессии этих генов остаются невыяс ненными. В этих механизмах специфическую функцию может играть энзиматическое метилирование ДНК. Однако до настоящего времени отсутствовала информация о специфических особенностях метилирования ДНК растений M. crystallinum в услови ях солевого стресса и о возможном его участии в регуляции САМ-специфических ге нетических программ. Целью этой части работы был анализ уровня CCWGG (CpNpG) сайт-специфического метилирования ядерной ДНК и исследование специфичности метилирования некоторых генов растений M. crystallinum, растущих в условиях соле вого стресса.
Определение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК M. crystallinum. С помощью энзиматического метода, основанного на применении ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI, обнаружено, что в условиях засоления (0,5 М NaCl), при переключении С3-фотосинтеза на САМ-метаболизм наблюдается двукрат ное повышение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ядерном ге номе растений M. crystallinum (табл. 4).
Таблица 4.
Уровень CCWGG-метилирования в ДНК растений M. crystallinum ДНК Уровень метилирования (%) Контрольные растения 31,5±3, Стресс (0,5М NaCl) 67,2±5, Поиск мишеней для CCWGG-гиперметилирования в геноме M. crystallinum. Блот гибридизационный анализ ДНК контрольных и подвергнутых солевому стрессу рас тений M. crystallinum не показал различий в картине CCWGG-метилирования 5 регуляторно-промоторной области гена PEP-карбоксилазы. В то же время, CCWGG метилирование этого гена имеет место, о чём свидетельствуют различия в картине гидролиза гена рестриктазой EcoRII (рис. 13, дор. 2, 4) и рестриктазой BstNI (рис. 13, дор. 1, 3).
Различия в картине гидролиза гена Ppc1 PEP-карбоксилазы рестриктазами MboI и Sau3A (рис. 13, дор. 5-8) свидетельствуют о CpG-метилировании цитозина в последо вательностях GATCG этого гена. Однако у растений, растущих в нормальных физио логических условиях и в условиях солевого стресса, картина метилирования этих по следовательностей в гене PEP-карбоксилазы также не изменяется. Таким образом, у растений M. crystallinum картина CpG- и CCWGG-метилирования промоторной об ласти гена PEP-карбоксилазы при переключении С3-фотосинтеза на САМ-метаболизм не изменяется.
1 2 3 45 6 7 т.п.н.
23, 9, 6, 4, 2, 2, 0, Рис. 13. Блот-гибридизационный анализ гена РЕР-карбоксилазы растений M. crystallinum.
1, 2, 5, 6 – ДНК контрольных растений;
3, 4, 7, 8 – ДНК растений, культивированных в ус ловиях солевого стресса;
1, 3 – гидролиз рестриктазой BstNI;
2, 4 – гидролиз рестриктазой EcoRII;
5, 7 – гидролиз рестриктазой MboI;
6, 8 – гидролиз рестриктазой Sau3A.
1 2 3 45 6 7 т.п.н.
23, 9, 6, 4, 2, 2, 0, Рис. 14. Блот-гибридизационный анализ рибосомной ДНК растений M. crystallinum.
1, 2, 5, 6 – ДНК контрольных растений;
3, 4, 7, 8 – ДНК растений, культивированных в ус ловиях солевого стресса;
1, 3 – гидролиз рестриктазой MspI;
2, 4 – гидролиз рестриктазой HpaII;
5, 7 – гидролиз рестриктазой BstNI;
6, 8 – гидролиз рестриктазой EcoRII.
Солевой стресс не влияет также и на метилирование ядерной рибосомной ДНК.
Блот-гибридизационный анализ ДНК растений, растущих в нормальных условиях и при засолении, показал отсутствие различий в картине метилирования CCWGG последовательностей в этой области генома (рис. 14, дор. 5-8).
К CCWGG-гиперметилированным мишеням генома растений M. crystallinum, рас тущих в условиях солевого стресса, относится фракция повторяющейся («сателлит ной») ДНК. На это указывают результаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК M. crystallinum, где в качестве зонда использована меченная тотальная ДНК этих растений (рис. 15).
Присутствие на радиоэлектрофореграмме дискретных полос ДНК указывает на существование у растений M. crystallinum специфической фракции «сателлитной»
ДНК. Анализ этой ДНК с помощью рестриктаз BstNI и EcoRII показал её существен ное CCWGG-метилирование у растений, растущих как в нормальных, так и в стрессо вых условиях засолённости (рис. 15, дор. 5-8).
При этом у растений в условиях засолённости наблюдается гиперметилирование этих последовательностей ДНК. На это указывает существенное повышение уровня её устойчивости к расщеплению рестриктазой EcoRII, чему соответствует почти пол ное отсутствие дискретных полос ДНК (рис. 15, дор. 8).
1 2 34 5 6 7 т.п.н.
23, 9, 6, 4, 2, 2, 0, Рис. 15. Блот-гибридизационный анализ повторяющейся ДНК растений M. crystallinum.
1, 2, 5, 6 – ДНК контрольных растений;
3, 4, 7, 8 – ДНК растений, культивированных в ус ловиях солевого стресса;
1, 3 – гидролиз рестриктазой MspI;
2, 4 – гидролиз рестриктазой HpaII;
5, 7 — гидролиз рестриктазой BstNI;
6, 8 – гидролиз рестриктазой EcoRII.
Таким образом, нами впервые обнаружено специфическое CCWGG гиперметилирование повторяющейся ДНК в клетках M. crystallinum в условиях вклю чения экспрессии новой метаболической программы. Функциональная роль CCWGG гиперметилирования «сателлитной» ДНК, вероятно, связана с формированием спе циализированной структуры хроматина, одновременно регулирующей экспрессию множества генов в клетках этих растений при их адаптации к засолению и переклю чении С3-фотосинтеза на CAM-метаболизм.
Дальнейшее развитие этой работы может быть связано с выделением и характери стикой фракции CCWGG-гиперметилируемой повторяющейся ДНК, установлением её локализации на хромосомах растений M. crystallinum и с исследованием «CAM специфической» структуры хроматина.
4. Анализ метилирования гена кальцитонина человека при лейкозах Анализ последовательностей CCGG. Гиперметилирование гена кальцитонина чело века (КТ) в последовательностях CpG при злокачественных новообразованиях, вклю чая лейкемии, наблюдали в различных работах. Ген КТ подвержен гиперметилирова нию в последовательностях CpG не только при развитии различных форм лейкозов, но и при некоторых других видах онкологических заболеваний. Данные о характере метилирования гена КТ при различных видах лейкемий остаются противоречивыми.
Целью нашей работы было исследование сайт-специфических CpG- и CpNpG-типов метилирования 5'-области гена кальцитонина человека при различных формах лейке мий и лечении заболеваний.
В работе исследовано метилирование 5'-области гена КТ в клетках костного мозга и ядросодержащих клеток периферической крови у 25 человек при лейкозах и 27 че ловек здоровых доноров. В качестве специфического зонда применяли 5'-фрагмент гена КТ длиной 1700 п.н., любезно предоставленный доктором S. Baylin.
ДНК гидролизовали чувствительной к метилированию внутреннего цитозина в по следовательности CCGG рестриктазой HpaII и не чувствительной к этому типу мети лирования рестриктазой МspI. Рестрикционная карта гена КЧ и различные варианты картины гидролиза 5'-области гена КТ рестриктазами MspI и HpaII представлены на рис. 16.
Гидролиз 5'-области гена КТ рестриктазой MspI приводит к появлению нескольких фрагментов, из которых три с размерами 0,5, 0,6 и 1,0 т.п.н. видны при гибридизации с применяемым зондом (рис. 17, дор. 2). Гидролиз рестриктазой HpaII демонстрирует появление дополнительного фрагмента размером 2 т.п.н. вследствие частичного ме тилирования цитозина в специфической последовательности 5'-области гена КТ, что является нормой для здоровых тканей (рис. 17, дор. 1).
Рис. 16. Рестрикционная карта и возможные варианты гидролиза 5'-области гена кальцито нина человека рестриктазами HpaII и MspI. Указаны экзоны (1, 2, 3) и координаты использованного зонда 1,7 т.п.н.
При лейкозных заболеваниях и гиперметилированном состоянии последовательно стей CCGG в 5'-области гена КТ HpaII-картина блот-гибридизационного анализа спо собен выявить появление дополнительных аномальных рестрикционных фрагментов размером 1,2, 2,2, 2,6, и 3,1 т.п.н. (рис. 18, 19). Ввиду малой информативности рест рикционной картины гена КТ в области ниже 1,0 т.п.н. эта область на рис. 18-19 не т.п.н. приводится. Из-за нечувствительности рестриктазы 1 MspI к метилированию внутреннего цитозина в по 2,0 следовательности CCGG MspI-картина блот гибридизации гена КТ у здоровых и больных людей остаётся одинаковой. Этот специфический внутрен ний контроль с помощью рестриктазы MspI выпол нен со всеми препаратами ДНК, но приведён лишь однажды на рис. 18 (дор. 2) и на рис. 19 (дор. 6).
Одинаковая картина гибридизации с зондом гена 1, КТ наблюдалась во всех контрольных образцах (здоровые доноры), а также в ДНК периферической крови лиц из области зоны жёсткого контроля Чер нобыльской АЭС.
0,6 Рис. 17 Картина гидролиза гена кальцитонина человека в норме.
0, 1 – гидролиз рестриктазой HpaII;
2 – гидролиз рест риктазой MspI Гиперметилирование гена КТ при миелоидных лейкозах. Описанная картина на блюдалась при всех формах заболеваний: хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ), остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) и миелодиспластическом синдроме (МДС). Ги перметилирование гена КТ обнаружено у всех больных ХМЛ (рис. 18, дор. 1-5) и всех первичных больных ОМЛ как в крови, так и в костном мозге (рис. 18, дор. 6, 10-14).
Аналогичные изменения в картине метилирования наблюдаются и при рецидиве за болевания (рис. 18, дор. 9, 16). Аномалии метилирования полностью или почти пол ностью исчезали по достижении ремиссии (рис. 18, дор. 15, 17) и не были обнаруже ны в ДНК клеток костного мозга больного ОМЛ спустя два года стойкой ремиссии (рис. 18, дор. 8).
В отдельных случаях был прослежен характер изменения метилирования гена КЧ во времени, в зависимости от эффективности химиотерапевтического воздействия.
Картина «патологического» гиперметилирования гена КЧ при первично-резистен тном ОМЛ после трёх курсов химиотерапии не изменилась (рис. 18, дор. 6, 7). В то же время у пациентов с благоприятным прогнозом она нормализовалась по достижении ремиссии (сравнить дор. 14 и 15;
16 и 17). У пациента с МДС присутствие аномально го фрагмента размером 3,1 т.п.н. в ДНК клеток костного мозга обнаружено ещё в фазе клинического благополучия при нормальном лейкоцитозе за 4 месяца до трансформа ции МДС в острый лейкоз (дор. 18 и 19). Гиперметилирование обнаружено и у друго го больного с МДС в фазе трансформации в ОМЛ (рис. 18, дор. 20).
Таким образом, метилирование CCGG сайтов 5'-области гена КЧ является харак терной особенностью опухолевой прогрессии при различных формах лейкозов мие лоидной природы. Вопросы диагностической значимости статуса метилирования гена кальцитонина в клинической практике лейкозов являются предметом профессиональ ного исследования нашего соавтора Д.В. Маринича и не выносятся в нашей работе на обсуждение.
Гиперметилирование гена КТ при остром лимфоидном лейкозе. Аналогичная осо бенность гиперметилирования 5'-области гена КЧ характерна также для случаев лим фоидных лейкозов (рис. 19). После курса химиотерапии в клетках костного мозга па циента с клиническим диагнозом гематологической ремиссии детектировалось ги перметилирование 5'–области гена КТ (рис. 19, дор. 1). Таким образом, на фоне кли нической ремиссии отчетливо наблюдается «молекулярный рецидив» болезни.
Аномальные HpaII-фрагменты, за исключением слабо выявляемого фрагмента раз мером 1,2 т.п.н., исчезли через 3 недели после проведения дополнительного курса ле чения (рис. 19, дор. 2), однако через 4 недели эти фрагменты появились вновь (рис. 19, дор. 3) и уже не исчезали вплоть до клинико-лабораторной констатации ре цидива через 6 месяцев (рис. 19, дор. 4-5).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 т.п.н.
3, 2, 2, 1, 1, Рис. 18. Анализ CpG-метилирования 5'-области гена кальцитонина пациентов с различными формами миелоидных лейкозов.
1 – ХМЛ, рецидив;
2 – тот же пациент, что и 1, гидролиз MspI;
3-5 – ХМЛ, терминальная стадия;
6 – ОМЛ, первичная диагностика;
7 – тот же пациент, что и 6, устойчивость к химиотерапии;
8 – ОМЛ, полная ремиссия;
9 – ОМЛ, рецидив;
10–14 – ОМЛ, первичная диагностика;
15 – тот же пациент, что и 14, полная гематологическая ремиссия;
16 – ОМЛ, рецидив;
17 – тот же пациент, что и 16, повторная ремиссия, 18 – МДС;
– тот же пациент, что и 18, через 4 месяца, ОМЛ;
20 –трансформация МДС в ОМЛ. Везде гидролиз рестриктазой HpaII, кроме дорожки 2 (гид ролиз MspI).
1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 т.п.н.
3, 2, 2, 1, 1, Рис. 19. Анализ CpG-метилирования 5'-области гена кальцитонина пациентов с острым лимфоидным лейкозов.
1 – гематологическая ремиссия, «молекулярный рецидив»;
2 – тот же пациент, что и 1, дополнительный курс лечения;
3 – тот же пациент, что и 1, гематологическая ремиссия;
4 – тот же пациент, что и 1, костный мозг, клинический рецидив болезни;
5 – тот же пациент, что и 1, перифери ческая кровь, клинический рецидив болезни;
6 – первичная диагностика, гидролиз MspI;
7 – тот же пациент, что и 6, первичная диагностика;
8 – тот же пациент, что и 6, гематологическая ремиссия;
9 – ОЛЛ в фазе неустойчивой ремиссии;
10 – тот же пациент, что и 9, дополнительный курс лечения;
11 – тот же пациент, что и 9, гематологическая ремиссия, 8 мес. до клинического рецидива, «молекулярный рецидив»;
12 – гематологическая ремиссия, «молекулярный рецидив»;
13 – тот же пациент, что и 12, клинический рецидив;
14 – гематологическая ремиссия, мес. до клинического рецидива, «молекулярный рецидив»;
15 – ДНК клеток донорского костного мозга;
16 – ОЛЛ, трансплантация костного мозга;
17-18 – неустойчивая повторная ремиссия;
19 – тот же пациент, что и 17, второй клинический рецидив;
20-21 – ОЛЛ, первичная диагно стика;
22-23 – ОЛЛ, устойчивость к химиотерапии. Везде гидролиз рестриктазой HpaII, кроме дорожки 6 (гидролиз MspI).
Таким образом, картина «молекулярного рецидива» появилась на 5 месяцев раньше первых клинических признаков рецидива болезни. Сходная корреляция между карти ной метилирования гена КТ и клиническим состоянием была отмечена также при ле чении других пациентов (рис. 19, дор. 11-14).
Анализ последовательностей CCWGG. В клетках млекопитающих, как и в клетках высших растений, ДНК может быть метилирована как в CpG, так и в CCWGG последовательностях (CpNpG-тип метилирования) [Clark et al., 1995]. Это поднимает вопросы о функциональной роли CpNpG-метилирования ДНК у млекопитающих и о специфичности генетических областей, подвергающихся CpNpG-метилированию. В этой связи ген КТ представляет особый интерес. Мы обратили внимание на то, что этот ген в своей 5'-концевой области содержит наряду с динуклеотидами CpG также и кластер последовательностей CCWGG (рис. 20), являющихся потенциальными мише нями для CpNpG-специфического метилирования ДНК [Broad et al., 1989]. До на стоящего времени анализ состояния метилирования CCWGG последовательностей в 5'-концевой области гена КТ не проводился.
Нами исследовано CCWGG-метилирование 5'-области гена КТ в ДНК лейкоцитов ядросодержащих клеток костного мозга и периферической крови пациентов с миело идными и лимфоидными лейкозами. В качестве контроля были использованы ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров. ДНК гидролизовали рестрик тазой EcoRII, чувствительной к метилированию внутреннего цитозина в последова тельностях CCWGG, и рестриктазой BstNI, не чувствительной к этому типу метили рования ДНК. В качестве зонда использовали 1,7 т.п.н. фрагмент 5'-концевой области гена КТ. Рестрикционная карта гена КТ представлена на рис. 20.
Блот-гибридизационный анализ 5'-области гена КТ с помощью рестриктазы BstNI и указанного зонда выявил ожидаемые нуклеотидные фрагменты с размерами 962, 331, 274, 235, 205, 157, 130, 101 и 83/80 п.н. (рис. 21).
Рис. 20. Рестрикционная карта и возможные варианты гидролиза 5'-области гена кальцито нина человека рестриктазами EcoRII и BstNI. Указан экзон (1) и координаты ис пользованного зонда 1,7 т.п.н.
Относительно слабая интенсивность радиоактивного сигнала фрагмента размером 962 п.н. связана с незначительным перекрыванием его гибридизуемым зондом. Во всех случаях картина гидролиза 5'-области гена КТ рестриктазой EcoRII, чувстви тельной к присутствию m5C в узнаваемой последовательности, не отличалась от соот ветствующей BstNI-картины. Это указывает на отсутствие m5C в CCWGG последова тельностях этой области гена как в норме, так и при различных формах лейкемий, ха рактеризующихся CpG-гиперметилированием этой области гена. Известно, что в клетках млекопитающих при установлении de novo картины метилирования ДНК волна метилирования может распространяться не только на соседние CpG-сайты, но даже на отдельные остатки цитозина в непалиндромных последовательностях [Toth et al., 1990]. Однако ни в одном из проанализированных случаев нам не удалось обна ружить такого распространения метилирования на близлежащие последовательности CCWGG в 5'-области гена КТ. Таким образом, нами обнаружено, что CCWGG последовательности 5'-области гена кальцитонина человека, в отличие от гипермети лирования CpG-динуклеотидов, сохраняются неметилированными в процессе разви тия лейкозов.
В работах американских авторов было показано, что у культуры клеток первичных линий В-клеточной лимфомы и миеломы в промоторе неэкспрессируемого гена В- метилируются последовательности CCGG или CCWGG, но не обе эти последователь ности одновременно [Malone et al., 2001]. Жёсткая обратная связь между метилирова нием этих последовательностей отмечена также для генома вируса мышиной лейке мии Молони [Lorincz et al., 2000] и миотического гена myf-3 [Franchina, Kay, 2000].
Рис. 21. Анализ состояния метилирования сайтов CCWGG в 5'-области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах.
А – pUC19/MspI;
1, 2 – острый лимфоидный лейкоз, полная ремиссия;
3, 4 – острый лимфо идный лейкоз, рецидив;
5, 6 – острый миелоидный лейкоз, первая атака;
7, 8 – хронический миелоидный лейкоз, бластный криз;
9, 10 – норма. 1, 3, 5, 7, 9 – гидролиз рестриктазой EcoRII;
2, 4, 6, 8, 10 – гидролиз рестриктазой BstNI.
В то же время полученные нами данные о постоянном отсутствии CCWGG метилирования в 5'-области гена кальцитонина человека могут указывать на особый «безальтернативный» CpG-тип метилирования протяжённой последовательности ДНК.
С целью изучения влияния CpNpG-метилирования ДНК на уровень метилирования CpG-последовательностей в дальнейшей работе было проведено исследование экс прессии в клетках эпителиального слоя почек человека полученного нами модифи цированного гена бактериальной ДНК-метилтрансферазы MEcoRII.
5. Трансген-индуцированное CCWGG метилирование ДНК клеток эпителиального слоя почек человека Получение трансгенных клеток, экспрессирующих модифицированный ген NLS МEcoRII-GFP Для трансфекции клеток HK293 получена плазмида pEcoGFP-N3, со держащая генетическую конструкцию, кодирующую модифицированный ген NLS МEcoRII, сшитый с зелёным флуоресцентным белком (GFP) под контролем промо тора цитомегаловируса (CMV) (рис. 22). Поскольку клетки HK293 не чувствительны к антибиотику G418 неомицинового ряда, а полученная плазмида содержала только ген устойчивости к неомицину, то гены GFP и NLS-МEcoRII-GFP были перенесены в вектор с устойчивостью к пуромицину pIGFP (рис. 22). Этот бицистронный вектор содержит IRES (internal ribosome entry site) за полилинкером, что обеспечивает совме стную транскрипцию генов GFP или NLS-МEcoRII-GFP вместе с геном устойчиво сти к пуромицину под контролем CMV-промотора.
Трансфекцию клеток проводили стандартным Ca-фосфатным методом. Свечение GFP наблюдали при ультрафиолетовом освещении в флуоресцентном микроскопе при экспрессии как самого GFP (контроль), так и NLS-МEcoRII-GFP слитого белка (рис. 23). Поскольку фолдинг белковых молекул начинается с N-конца, флуоресцен ция GFP, расположенного на С-конце химерного белка указывает на правильную ук ладку его N-концевой части, содержащей ДНК-метилтрансферазу EcoRII. Клетки по сле трансфекции были отобраны на среде с пуромицином и фракционированы с по мощью сортировщика клеток MoFlo MLS (Daco Cytomation, США) по флуоресценции GFP (рис. 24).
5.1. Анализ метилирования генома трансформированных клеток, экспресси рующих ген химерного белка NLS-МEcoRII-GFP De novo метилирование сайтов CCWGG. Сравнительный гидролиз высокомолеку лярной ДНК трансформированных клеток НК293 рестриктазами EcoRII и BstNI, под тверждает функциональную активность ДНК-метилазы EcoRII и её почти полное CCWGG метилирование в клетках с геном NLS-M·EcoRII-GFP (рис. 25, табл. 6).
HindIII HindIII XhoI HindIII EcoRI/NotI NheI/NotI Рис. 22. Схема клонирования гена NLS-МEcoRII в вектор для экспрессии в животных клетках.
А В Рис. 23. Вид трансформированных клеток НК293 в флуоресцентном микроскопе в обычном (А) и ультрафиолетовом (В) свете.
Рис. 24. Графики сортировки трансформированных клеток НК293, экспрессирующих только GFP (А) или слитый белок NLS-МEcoRII-GFP (В) Таблица Уровень CCWGG-метилирования в ДНК трансформированных клеток HK Линия клеток Уровень метилирования, % M·EcoRII-GFP экспрессирующая 93,9±4, GFP экспрессирующая 55,2±3, Нетрансформированные клетки 57,6±3, Анализ метилирования последовательностей CCGG. С целью исследования эф фекта экспрессии ДНК-метилтрансферазы M·EcoRII на CpG-метилирование был про ведён анализ метилирования CCGG-последовательностей ДНК трансформированных клеток. Для этого сравнивали степень гидролиза геномной ДНК рестриктазами HpaII и MspI. После гидролиза липкие концы образовавшихся фрагментов ДНК были мече ны включением [32P]dCTP с помощью фрагмента Клёнова.
1 2 3 4 5 т.п.н.
ДНК фага 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 1, 0, Рис. 25. Рестрикционный анализ ДНК трансформированных клеток HK293.
1 – негидролизованная ДНК клеток HK293 (GFP);
2 – негидролизованная ДНК кле ток HK293 (NLS-M·EcoRII-GFP);
3 – ДНК клеток HK293 (GFP), гидролиз EcoRII;
4 – ДНК клеток HK293 (GFP), гидролиз BstNI;
5 – ДНК клеток HK293 (NLS-M·EcoRII GFP), гидролиз EcoRII;
6 – ДНК клеток HK293 (NLS-M·EcoRII-GFP), гидролиз BstNI Соотношение включённой метки в гидролизатах HpaII/MspI отражает относитель ное количество неметилированных CCGG сайтов. Результаты анализа указывают на отсутствие изменения общего уровня CpG-метилирования в ДНК клеток, экспресси рующих M·EcoRII-GFP (табл. 7). Таким образом, трансген-индуцированное CCWGG метилирование генома клеток НК293 не оказывает заметного влияния на уровень его CpG-метилирования.
Таблица Уровень метилирования CCGG сайтов в ДНК трансформированных клеток HK R·HpaII концы R·MspI концы Линия клеток R·HpaII/R·MspI (имп/мин/мкг) (имп/мин/мкг) M·EcoRII-GFP экспрессирующая 0, 2349±243 9752± GFP экспрессирующая 0, 1834±195 7582± Нетрансформированные клетки 0, 1957±213 8050± Состояние CpG-метилирования промоторов генов SERPIN B5 и APC. Поскольку данные по тотальному метилированию в ДНК последовательностей CCGG прямо не отражают степень CpG-метилирования промоторных областей отдельных генов, был проведён анализ уровня метилирования CpG-последовательностей промоторов двух индивидуальных генов. Промотор гена SERPIN B5 характеризуется его полным CpG метилированием в клетках НК293, тогда как промотор гена супрессора опухолей АРС (adenomatous polyposis coli) отличается отсутствием метилирования его CpG динуклеотидов. [Futscher et al., 2002;
Esteller et al., 2000]. Такая особенность состоя ния CpG-метилирования этих промоторов наблюдалась в контрольных клетках, экс прессирующих только ген GFP, и сохранялась в клетках, экспрессирующих NLS МEcoRII-GFP (рис. 26, 27). Анализ метилирования промоторной области гена SERPIN B5 с помощью метода бисульфитного секвенирования показал, что во всех секвенированных клонах рекомбинантная метилаза M·EcoRII-GFP осуществляет пол ное CCWGG-метилирование этого промотора.
Рис. 26. Анализ метилирования промотора гена SERPIN B5.
Красным показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих только ген GFP. Жёлтым показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирую щих NLS-МEcoRII-GFP Рис. 27. Анализ метилирования промотора гена APC.
Красным показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих только ген GFP. Жёлтым показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих NLS-МEcoRII-GFP При этом, несмотря на присутствие метилированных сайтов CCWGG в этом про моторе, уровень его CрG-метилирования не изменялся (рис. 26). Таким образом, трансген-индуцированное CCWGG-метилирование промотора гена SERPIN B5 не влияет на его CpG-метилирование.
Результаты анализа промоторной области гена АРС показали, что во всех 10 секве нированных клонах метилаза M·EcoRII-GFP также осуществляет его полное CCWGG метилирование. Появление метилированных сайтов CCWGG в этой промоторной об ласти не индуцировало заметного метилирования практически всех CpG-сайтов (рис. 27).
Таким образом, CCWGG-метилирование ДНК не оказывает существенного эффек та как на индуцирование метилирования немодифицированных CpG-сайтов промо торных областей индивидуальных генов, так и на блокирование их CpG метилирования.
Анализ экспрессии CCWGG-метилированного гена АРС. Методом количественной RT-PCR определён уровень экспрессии генов АРС и hTERT. РНК выделяли из клеток экспрессирующих MEcoRII-GFP и клеток, экспрессирующих только GFP. Амплифи кацию проводили с использованием набора iScript RT-PCR с применением флуорес центного красителя SYBR green (Bio-Rad, США). В каждом эксперименте для по строения калибровочных кривых использовались пять точек разбавления РНК в диа пазоне от 3,125 нг до 50 нг суммарной РНК. Уровень экспрессии гена hTERT исполь зовали в качестве контроля, поскольку CpG-метилирование его промотора не приво дит к обязательному замолканию гена [Devereuks et al., 1999;
Dessain et al., 2000].
Уровень экспрессии генов АРС и hTERT в клетках с MEcoRII-GFP оставался на том же уровне, что и в клетках, экспрессирующих только GFP. Таким образом, CCWGG-метилирование промоторов исследованных генов не влияло на уровень их экспрессии (рис. 28).
Проведённый анализ также показал отсутствие влияния CCWGG-метилирования на уровень экспрессии гена hTERT. По-видимому, CCWGG-метилирование не участ вует в регуляции экспрессии исследованных генов.
Можно заключить, что интеграция в геном клеток HK293 модифицированной бак териальной метилтрансферазы M·EcoRII приводит к метилированию большинства CCWGG сайтов в их геноме. Однако, несмотря на значительное повышение уровня CCWGG-метилирования ДНК, оно не влияет как на общее метилирование CpG последовательностей генома трансформированных клеток, так и на CpG метилирование индивидуальных генов.
Следует отметить, что в наших экспериментах мы не наблюдали индуцированное CCWGG-метилированием возникновение и распространение волны метилирования на любые другие остатки цитозина в исследуемых последовательностях ДНК. Результа ты нашей работы не подтверждают существование жёсткой обратной взаимосвязи между CpG- и CpNpG-типами метилирования ДНК и указывают на отсутствие влия ния CpNpG-метилирования на генетическую экспрессию. Эти данные, однако, не противоречат ситуации, когда в специфических областях генома трансформирован ных клеток может сохраняться безальтернативный CpG-тип метилирования.
А В Рис. 28. Сравнение уровней экспрессии генов APC и hTERT в клетках, экспрессирующих GFP или MEcoRII-GFP.
Показаны значения Ct (cycle threshold), соответствующие значениям разведения анализи руемой РНК. А – данные для гена hTERT;
B – данные для гена APC;
квадраты – данные для клеток, экспрессирующих MEcoRII-GFP;
ромбы – данные для клеток, экспрессирующих GFP. Полученные для каждого разведения данные указывают на отсутствие существенной разницы в уровне экспрессии генов APC и hTERT в обоих клеточных линиях.
Этому соответствуют данные, полученные нами при биоинформационном анализе генома человека. Нами была проанализирована встречаемость CG, CWG, CCWGG и некоторых других последовательностей во всём геноме и в областях, фланкирующих 28501 индивидуальных генов (табл. 8).
Из случайной встречаемости, CG-динуклеотидов должно было бы быть значитель но больше, чем CWG-последовательностей, в то время как общее число последова тельностей CG и CWG в геноме человека составляет соответственно 28163853 и 115802370. Это отражает уже известный многократный дефицит последовательностей CG в сравнении с GC-последовательностями в геномах высших животных.
Таблица Отношение реального к теоретически рассчитанному количеству некоторых фланкирующих гены последовательностей в геноме человека CG CWG CCWGG всего в геноме 0,2356507 1,341659605 3, 104 п.н./5' 0,375492 1,346793 3, 350 п.н./5' 0,371113 1,358913 3, 300 п.н./5' 0,377446 1,347656 3, 250 п.н./5' 0,385302 1,349094 3, 200 п.н./5' 0,396256 1,360905 3, 200 п.н./3' 0,225111 1,343136 3, 250 п.н./3' 0,228525 1,337590 3, 300 п.н./3' 0,230770 1,349032 3, 350 п.н./3' 0,234954 1,352709 3, 104 п.н./3' 0,227323 1,348970 3, Эта величина для промоторной области больше, чем для 3'-области, что соответст вует сблоченности этой последовательности в CpG-островках [Bird et al., 1986]. В то же время, частота встречаемости последовательности CCWGG более чем в три раза выше расчётной величины и значительно выше величины для последовательности CWG. Эта выявленная особенность, по-видимому, отражает различную структурно функциональную роль последовательностей CWG и CCWGG в геноме человека.
Эффект CCWGG-метилирования на активность ДНК-метитрансферазы DNMT1. Проведено сравнение активности DNMT1 на субстратах, не содержащих 5 метилцитозин, содержащих метилированный сайт CCWGG, содержащих метилиро ванный сайт CG и одновременно содержащих метилированные сайты CCWGG и CG (рис. 29). Этот анализ подтвердил, что метилтрансфераза DNMT1 наиболее эффек тивна на асимметрично метилированных последовательностях CpG. При этом ско рость метилирования асимметрично метилированных сайтов CpG существенно не из менялась в случае присутствия близкорасположенных метилированных сайтов CCWGG (рис. 29).
6. Применение ДНК-метилтрансфераз в нанобиотехнологии В настоящее время нанобиотехнология — одно из наиболее активно развивающих ся и перспективных направлений биологических наук. Целью нанобиотехнологии яв ляется создание новых материалов и надмолекулярных конструкций с использовани ем биологических макромолекул, в первую очередь белков и нуклеиновых кислот.
Рис. 29. Эффективность включения CH3-групп в олигодезоксинуклеотидные субстраты с различным метилированием.
1 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' m 2 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' m m 3 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' 4 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' m В нанобиотехнологии можно использовать способность белков к связыванию со специфическими последовательностями ДНК. В этой связи перспективным объектом являются сайт-специфические (цитозин-С5)ДНК-метилтрансферазы. Одним из воз можных практических применений нанобиотехнологий является создание противора ковых препаратов. Развитие онкологических заболеваний сопровождается гипермети лированием специфических последовательностей ДНК, в том числе и генов супрессоров опухолей. Ингибирование ДНК-метилтрансферазной активности может блокировать опухолевую прогрессию, что поднимает вопросы разработки ингибито ров ДНК-метилтрансфераз для их клинического применения.
Первые применяемые ингибиторы ДНК-метилтрансфераз представляли собой про изводные 5-азацитидина, которые ковалентно и необратимо связывались с цистеино вым остатком в активном центре фермента, тем самым блокируя его активность. Од нако, включаясь в молекулы вновь синтезированной ДНК клетки и необратимо свя зываясь с молекулами цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, 5-азацитидин способен инициировать нарушение нормальных процессов репликации и транскрипции и вы зывать формирование аномальной структуры хроматина. Случайное включение 5 азацитидина в ДНК способно вызвать её неспецифическое деметилирование, что мо жет инициировать экспрессию онкогенов.
Для снижения неспецифического токсического воздействия 5-азацитидина на клет ку нами были разработаны и проверены новые методы подбора ингибирующих структурных аналогов цитидина. Таким менее токсичным производным оказался 5 фтордезоксицитидин.
Двуцепочечные олигонуклеотиды с 5-азацитидином в их составе относятся ко вто рому поколению ингибиторов цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, не включающих ся в ДНК.
Проведены эксперименты по оценке эффективности связывания модельной ДНК метилазы HhaI с ингибиторами ДНК-метилтрансфераз второго поколения. Для этого были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды длиной 30 оснований: 5' TCACCAGATG(5FC)CTGTAGGTCGTGTG(5FC)GCTGGTTCCACCAGAG(5FC)GCTT GACCTGTAGTT-3' и 5'-AACTACAGGTCACAG(5mC)GCTCTGGTGGAACCAG(m5C) GCACACGACCTACAG(m5C)GCATCTGGTGA-3'. Олигонуклеотиды включали три асимметрично метилированных по одной цепи сайта узнавания CGCG для ДНК метилазы HhaI, причём в другой цепи метилируемый внутренний цитидин был заме нен на 5-фтордезоксицитидин. Такие каталитические «капканы» предназначались для связывания метилазы DNMT1, которая имеет повышенное сродство к асимметрично метилированной ДНК в сайтах CрG.
Анализ продуктов связывания с помощью капиллярного электрофореза и электро фореза в полиакриламидном геле выявил образование всех теоретически ожидаемых комплексов: свободного олигонуклеотида и олигонуклеотида с одной присоединен ной молекулой HhaI, с двумя и с тремя молекулами HhaI (рис. 30).
Рис. 30 Анализ продуктов связывания ДНК-метилтрансферазы HhaI c 30-членным дуплекс ным олигонуклеотидом-ингибитором:
5'-tcaccagatg5Fcctgtaggtcgtgtg5Fcgctggttccaccagag5Fcgcttgacctgtagtt-3' 3'-agtggtctacgmcgacatccagcacacgmcgaccaaggtggtctcgmcgacactggacatcaa-5' A – результаты анализа продуктов связывания, полученные капиллярным электрофорезом В – результаты анализа продуктов связывания, полученные электрофорезом в полиакриламиде Создание ингибиторов ДНК-метилтрансфераз третьего поколения. Вероятность встречи ДНК-метилазы с ингибирующим линейным олигонуклеотидным дуплексом (второе поколение ингибиторов) можно увеличить только повышением концентрации самого ингибитора. Негативным фактором остаётся также равномерное распределе ние ингибитора по объёму всей клетки вместо его локализации в клеточном ядре.
Ингибиторы третьего поколения, представляют собой сложные олигонуклеотидные структуры или олигонуклеотид-белковые комплексы (рис. 31).
Сконструированные ингибиторы имитировали форму репликативной вилки (Y структуру), к которой ДНК-метилтрансфераза DNMT1 имеет повышенное сродство.
В процессе проектирования ингибиторов третьего поколения применялось трёхмер ное молекулярное моделирование (рис. 32).
Сборку этой структуры проводили путём последовательного отжига всех трёх час тично комплиментарных олигонуклеотидов.
Рис. 31. Схема сборки олигонуклеотидного ингибитора и его связывание с ДНК метилтрансферазой HhaI.
Рис. 32. Компьютерная модель связывания олигонуклеотидного ингибитора с ДНК метилтрансферазой HhaI.
При связывании модельной ДНК-метилтрансферазы HhaI с Y-структурой наблю далось формирование всех трёх возможных форм, соответствующих комплексам с одной, двумя или тремя молекулами фермента (рис. 33). Степень насыщения всех трёх сайтов связывания была пропорциональна повышению концентрации ДНК метилтрансферазы HhaI и обратно пропорциональна концентрации самого ингибито ра (рис. 34).
Рис. 33. Сборка и связывание ДНК-метилтрансферазы HhaI с олигонуклеотидной Y структурой (анализ капиллярным электрофорезом) Рис. 34. Кинетика связывания HhaI ингибитором третьего поколения Проведены эксперименты по оценке специфичности связывания ДНК метилтрансфераз с полученными ингибиторами. Для этого была собрана Y-структура, содержащая различные сайты узнавания: два сайта для МHhaI и один сайт для МEcoRII. Обе ДНК-метилтрансферазы связывались специфично и с высокой избира тельностью. В отдельном эксперименте была показана способность ингибитора спе цифично связывать метилазу МEcoRII из частично очищенного бесклеточного экс тракта, то есть в условиях, имитирующих работу ингибитора в клетке. Комплекс МEcoRII с ингибитором выявлялся в виде единичной полосы с молекулярной массой несколько бльшей, чем продукт связывания с одной молекулой МHhaI, что соответ ствует разнице в молекулярной массе этих ферментов: 57,5 kDa для МEcoRII и 39,5 kDa для МHhaI.
В реакции с метилазой HhaI наблюдалось образование комплексов ингибитора с одной и двумя молекулами метилазы HhaI. В реакции одновременно с двумя ДНК метилтрансферазами МHhaI и МEcoRII наблюдалось формирование всех трёх воз можных комплексов, что указывает на высокую специфичность ингибитора (рис. 35).
Для повышения стабильности Y-структуры к ней была ковалентно присоединена по сайту узнавания ДНК-метилтрансфераза МEcoRII. В полученной конструкции ДНК-метилтрансфераза МEcoRII содержала сигнал ядерной локализации для на правленного переноса этого надмолекулярного комплекса в клеточное ядро.
Рис. 35. Сборка и связывание ДНК-метилтрансфераз HhaI и EcoRII с олигонуклеотидной Y структурой (анализ капиллярным электрофорезом) ВЫВОДЫ 1. Разработан энзиматический метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательности CCWGG эукариотических ДНК (CpNpG-тип метилирования) с помощью ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI.
2. Получена рекомбинантная агробактериальная Ti-плазмида дикого типа с интегрированным в область Т-ДНК неэкспрессируемым геном ДНК метилтрансферазы EcoRII (MEcoRII). Этой плазмидой осуществлена ге нетическая трансформация клеток Nicotiana tabacum. Ген MEcoRII инду цировал у первичной трансформированной клеточной линии образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пони женный уровень CCWGG-метилирования ДНК этих клеток, что может быть связано с инактивацией одного из генов ДНК-метилтрансфераз.
3. Для трансген-индуцированного CCWGG-метилирования ДНК в клетках эукариот получены модифицированные формы экспрессируемого гена M·EcoRII, кодирующие этот фермент, слитый с сигналом ядерной лока лизации (NLS- M·EcoRII) и зеленым флуоресцентным белком (NLS M·EcoRII-GFP).
4. Экспрессия гена NLS-M·EcoRII в клетках растений Nicotiana tabacum приводит к изменениям морфологического фенотипа трансформирован ных растений и к дополнительному CCWGG-метилированию их ДНК.
5. В условиях засоления, при переключении С3- на С4-фотосинтез, наблю дается двукратное повышение уровня метилирования последовательно сти CCWGG в ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum. К CCWGG-гипер-метилированным мишеням генома растений относится фракция повторяющейся ДНК, что может указывать на специфическую функциональную роль CCWGG-метилирования этой ДНК в образовании специализированной структуры хроматина при адаптации растения к со левому стрессу и переключении на САМ-метаболизм.
6. Проведён анализ статуса метилирования внутреннего цитозина в после довательностях CCWGG 5'-концевой области гена кальцитонина человека в клетках периферической крови и костного мозга при различных видах лейкозов. Эти последовательности сохраняются неметилированными как в норме, так и при лейкозах, сопровождающихся их CpG гиперметилированием. Таким образом, гиперметилирование динуклеоти дов CpG в промоторной области гена кальцитонина человека не распро страняется на близлежащий блок последовательностей CCWGG. Сфор мулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома эукариот.
7. Осуществлена и исследована экспрессия ДНК-метилтрансферазы EcoRII в модифицированной форме NLS-M·EcoRII-GFP в клетках культуры эпи телиального слоя почек человека. Трансген-индуцированное CCWGG метилирование ДНК этих клеток не влияет на CpG-метилирование их ге нома. CCWGG-метилирование промотора гена АРС не влияет на его экс прессию в трансформированных клетках. Установлено отсутствие эффек та CCWGG-метилирования олигодезоксинуклеотидных субстратов на ак тивность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro. Выявлены особенно сти частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.
8. Для применения в нанобиотехнологии и для ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигоде зоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на ос нове модифицированных производных цитозина и ДНК метилтрансферазы EcoRII.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Обзоры: