Эколого-биологические факторы и механизмы ремедиации антропогенно-нарушенных почв
На правах рукописи
ТЕРЕЩЕНКО Наталья Николаевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ И МЕХАНИЗМЫ РЕМЕДИАЦИИ АНТРОПОГЕННО-НАРУШЕННЫХ ПОЧВ Специальность 03.00.16 – Экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Томск - 2007
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Сибирском научно исследовательском институте сельского хозяйства и торфа СО Россельхозакадемии в лаборатории микробиологии
Научный консультант: доктор биологических наук Середина Валентина Петровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Островерхова Галина Петровна, кафедра зоологии беспозвоночных, ГОУ ВПО «Томский государственный университет» доктор биологических наук, профессор Чупрова Валентина Владимировна, кафедра почвоведения, ГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» доктор биологических наук, профессор Антонова Ольга Ивановна, НИИ Химизации ГОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет»
Ведущая организация: Институт почвоведения и агрохимии СО РАН
Защита состоится « 2 » ноября 2007 г. в …. часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 при ГОУ ВПО «Томский государственный университет» по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина,
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государствен ного университета
Автореферат разослан «2» октября 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета Е.Ю. Просекина кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследований. Начиная с конца 18 столетия, стремительный рост населения планеты обернулся небывалыми темпами наступления человека на новые еще неосвоенные земли, и, как следствие, постепенным изменением естественного поч венного покрова, а бурное развитие промышленности в последующие столетия привело к полной деградации значительных площадей почвенного покрова планеты. Учитывая важную экологическую роль почвы в поддержании основных параметров биосферы и атмосферы, подобные разрушительные тенденции не могут оставаться без внимания.
Не удивительно, что изучение условий устойчивого функционирования почвенных эко систем, а также поиск эффективных технологий обработки пахотных и ремедиации ан тропогенно-нарушенных почв становится одним из центральных направлений исследо ваний большинства экологических научных школ. Причем в научном поиске все боль шее внимание начинают уделять развитию биологических методов рекультивации, ос нованных на использовании и стимулировании потенциала самой почвы, ее способно сти к самовосстановлению (Pritchard, 1992;
Gallego et al., 2001).
Однако даже поверхностный анализ наиболее широко используемых методов свидетельствует о доминировании формального, механистического подхода к почве при разработке данных технологий. В частности, при биоремедиации нефтезагрязненных почв технологическая схема, как правило, сводится к простому рыхлению и использо ванию бактериальных препаратов по фону внесения весьма высоких доз минеральных удобрений (Capelli et al., 2001;
Bento et al., 2005). Подобная практика часто приводит к еще большему ухудшению ситуации: засеянный многолетними травами участок в пер вый год дает дружные всходы, однако восстановления исходного фитоценоза часто так и не происходит, и в почве неизбежно запускаются механизмы ее медленной деграда ции. Не лучше обстоит дело и с разнообразными почвозащитными технологиями в сфе ре аграрного производства, основанными на применении биологически активных орга нических удобрений.
Причина краткосрочности эффектов обусловлена отсутствием четких представ лений об основных принципах функционирования микробного сообщества почвы. В последнее время формируется новое представление о популяции микроорганизмов не просто как о сумме клеток, вписанных в условия конкретной экологической ниши, а как о своеобразной надорганизменной системе, в определённом отношении аналогичной многоклеточному организму, адаптация которого к экстремальным внешним условиям представляет собой совокупность весьма сложных и специфических реакций (Никола ев, 2004). С теоретической и практической точек зрения чрезвычайно важно определить ключевые, экологически наиболее значимые группы микроорганизмов, запускающие данные реакции, определяющие их направленность, скорость и в конечном итоге эф фективность биоремедиации.
Кроме того, одним из основных вопросов почвенной экологии становится воз можность оценки и прогнозирования изменений, происходящих в почве после ее вовле чения в сферу хозяйственных интересов человека. Для этого необходимо разработать систему критериев, позволяющую судить о степени деградации почвы как природной экосистемы под влиянием антропогенного воздействия (Doran et al., 2000). Такие тради ционно используемые в настоящее время показатели, как содержание подвижных и ва ловых форм элементов, уровень кислотности, общая порозность и т.д., а также средние показатели биологической продуктивности почвы свидетельствуют скорее о степени ее загрязнения и уровне эффективного плодородия почвы, а не об экологической страте гии ее трансформации.
Цель работы. Целью работы является определение основных закономерностей функционирования микробных сообществ антропогенно-нарушенных почв и выявление ключевых биологических факторов и механизмов, определяющих эффективность био ремедиации почв, загрязненных нефтью, а также деградированных вследствие длитель ного нерационального аграрного освоения.
Задачи исследований.
1. Изучить особенности взаимодействия сапротрофных микроорганизмов орга нического субстрата и дождевого червя в процессе вермикультивирования.
2. Исследовать влияние дождевых червей разных морфо-экологических групп (почвенных и навозных) на характер микробиологических и биохимических процессов трансформации органического субстрата.
3. Исследовать динамику основных показателей биологической активности вер микомпоста в процессе его созревания.
4. Установить ключевые микробиологические факторы и механизмы, обуслов ливающие высокую ростостимулирующую и фунгистатическую активность вермиком поста и почв, населенных дождевыми червями.
5. Исследовать эффективность применения почвозащитной технологии Полево го круглогодичного вермикультивирования и вермикомпоста для восстановления пло дородия агрогенной дерново-подзолистой почвы подтайги Западной Сибири.
6. Изучить влияние природных цеолитов на интенсивность процессов биологи ческой азотфиксации и деструкции углеводородов в нефтезагрязненных почвах.
7. Выявить основные биологические факторы и механизмы, определяющие эф фективность применения комплексной технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв, основанной на стимулировании аборигенной микрофлоры почвы.
8. Установить значимые микробиологические критерии экологической устойчи вости почвы и эффективности почвозащитных технологий.
Защищаемые положения.
1. Биологическая активность вермикомпоста обусловлена присутствием в его со ставе стимуляторов роста как аминной-аминокислотной, так и гумусовой природы, в первую очередь фульвокислот, основными продуцентами которых являются микроор ганизмы органического субстрата, стимулируемые дождевыми червями, поставляющи ми протеолитические экзоферменты. Основными факторами, определяющими фунги статические свойства вермикомпоста, являются высокая численность в нем бактерий рода Pseudomonas, отличающихся повышенной супрессивной активностью, и наличие ослабленных форм фитопатогенных грибов, в частности рода Fusarium, стимулирую щих формирование у растений системной неспецифической устойчивости к агрессив ным штаммам грибов. Основным механизмом, обусловливающим повышенную супрес сивную активность Pseudomonas в вермикомпосте, является индукция активности бак терий динамическими характеристиками их популяции и сообщества низших грибов, а именно: цикличностью численности Pseudomonas и микромицетов, приводящей к пе риодическим всплескам плотности популяций, и, как следствие, к обострению внутри и межпопуляционной конкуренции за субстрат.
2. В условиях техногенного загрязнения почв нефтью ведущим фактором биоло гической деструкции углеводородов в почве являются микробиологические процессы, связанные с циклом превращения азота – азотфиксация и денитрификация. Наиболее эффективной формой азота является нитратная, обеспечивающая двойной путь исполь зования азота углеводородокисляющими микроорганизмами, наименее эффективной – аммонийная, способствующая массовому развитию в почве микроскопических грибов, и повышению фитотоксичности почвы. Высокая эффективность органических форм азота при биоремедиации обусловлена медленным течением процессов аммонификации в условиях нефтяного загрязнения и дозированным высвобождением аммония, исклю чающим массовое размножение грибов и подавление процессов азотфиксации.
3. Наиболее значимыми критериями экологической устойчивости почвы и эффек тивности почвозащитных технологий являются: характер изменения трофической стра тегии микробоценоза почвы в отношении таких источников углерода как гумус и све жие растительные остатки в ответ на внесение в почву избытка минерального азота;
ди намический критерий скорости круговорота азота в системе «почва-растение атмосфера», определяемый как скорость противоположно направленных микробиоло гических процессов цикла азота, таких как азотфиксации и денитрификация (данный критерий также применим для оценки уровня биологической активности почвы и орга нических удобрений).
Научная новизна. В работе впервые установлена ключевая роль микробного со общества органического субстрата, перерабатываемого дождевыми червями, в форми ровании биологической активности вермикомпоста, раскрыты основные механизмы и факторы. Разработана новая методика количественной оценки суммарной фунгистати ческой активности сложного микробного сообщества. Определены наиболее значимые для жизнедеятельности дождевого червя физиологические группы микроорганизмов.
Дана сравнительная характеристика микробных сообществ вермикомпостов, получае мых при переработке органического субстрата различными морфо-экологическими группами дождевых червей, установлены достоверные различия в трофической страте гии навозных и почвенных червей, а также технологичного Калифорнийского гибрида.
В стационарных условиях модельного эксперимента впервые установлен гармо нический характер колебания численности микроорганизмов органического субстрата в процессе вермикультивирования.
Обнаружен эффект и установлен механизм формирования системного неспеци фического иммунитета у выращенных на вермикомпосте растений, индуцированного контактом с присутствующими в вермикомпосте ослабленными формами Fusarium.
В многолетнем полевом эксперименте показана высокая эффективность почво защитной технологии Полевого круглогодичного вермикультивирования (ПКВК), рас крыты основные биологические механизмы и факторы, обусловливающие ее позитив ное влияние на эффективное и потенциальное плодородие дерново-подзолистой легко суглинистой почвы подтайги Западной Сибири.
Для условий северных регионов РФ и центрального Поволжья разработаны науч ные основы создания комплексной технологии биоремедиации почв, загрязненных неф тью. Впервые установлена экологическая роль нитратной, аммонийной и органической форм азота в запуске микробной сукцессии деструкции углеводородов и их влияние на уровень остаточной токсичности почвы. Показано стимулирующее воздействие при родных цеолитов на процессы несимбиотической азотфиксации и биодеградации неф ти.
Установлен ряд значимых микробиологических критериев экологической устой чивости почвы и эффективности почвозащитных технологий.
Практическая значимость. Результаты исследований были положены в основу создания комплексной технологии биоремедиации нефтезагрязненых почв, обеспечи вающей 70-75% степень очистки почвы в течение первого вегетационного периода и 80-85% степень на второй год рекультивации. В настоящее время технология уже про шла успешную апробацию в ряде предприятий нефтегазодобывающей промышленно сти, таких как НГДУ «Комиарктикнефть», «Комитермнефть», ООО «Сервисэкология», МП «Полигон» (г. Томск) и ФГУП «Томскавиа». В настоящий момент технология про ходит производственные испытания на объектах респ. Коми и Казахстане. Установлен ные микробиологические факторы и механизмы, определяющие ростостимулирующую и фунгистатическую активность вермикомпоста, были использованы для модификации и оптимизации технологии производства органических удобрений и вермикомпост со держащих грунтов. Результаты исследований, имеющих потенциальное коммерческое значение, защищены 4 патентами РФ.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 65 работ, в том числе 9 работ в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 – в зарубежных изданиях, 2 – монографии, 1 – учебное пособие. Основные положения работы были представлены и обсуждены на международных научно-практической конференциях: научных Жилин ских чтениях (Новосибирск, 1997);
«Научное обеспечение АПК Западной Сибири» (Но восибирск, 1999);
«Энерго- и ресурсосберегающие технологии в земледелии аридных территорий» (Абакан, 2000);
«Промышленно-экономическое развитие Западно Сибирского региона на базе местного природного органического сырья» (Омск, 2000);
«Измерение, моделирование и информационные системы, как средства снижения за грязнения на городском и региональном уровнях» (Томск, 2002);
«Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (Томск, 2003);
«Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2004);
на Международной конференции "Peat in Horticulture" (Амстердам, 1997);
на первом Российском симпо зиуме общества «Setac» «Risk assessment for environmental contamination» (Санкт Петербург, 1998);
на 11 международном конгрессе по торфу «Sustaining Our Peatlands» (Финляндия, 2000);
на III и IV съездах Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Моск ва, 2000;
Новосибирск, 2004);
на IV международном симпозиуме «Контроль и реабили тация окружающей среды» (Томск, 2004);
на 1-м, 2, 3 и 4-м Московском Международ ном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005, 2006).
Вклад автора в разработку проблемы. Автору принадлежит постановка про блемы и разработка научной программы исследований, а также ее реализация на всех основных этапах: в полевых и лабораторных экспериментах, обработке и обобщении информации. Отдельные разделы диссертационной работы выполнены в рамках тема тического плана СО Россельхозакадемии и при частичной финансовой поддержке ООО НТО «Приборсервис» и ПК «Темп-2» (г. Томск). Автор благодарна за внимание к рабо те и оказанную помощь д.б.н. профессору Е.В. Евдокимову, д.б.н. В.П. Серединой, всем сотрудникам и студентам кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТГУ, а также сотрудникам лаборатории микробиологии СибНИИСХиТ СО Россельхозакадемии.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 381 странице, состоит из введения, 6 глав, выводов, приложения, включает 95 таблиц и 95 рисунков. Список ли тературы включает 403 источника, из которых 129 на иностранном языке.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕННОСТИ ПРОБЛЕМЫ БИОРЕМЕДИАЦИИ АНТРОПОГЕННО-НАРУШЕННЫХ ПОЧВ 1.1. Микробиологические аспекты вермикультивирования. В разделе приводится анализ отечественной и зарубежной литературы, освещающей вопросы взаимодействия почвенных люмбрицид и сапротрофной микрофлоры почвы, микробиологических и биохимических аспектов вермикультивирования и эффективности применения верми компоста.
1.2. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных почв. В разделе рас сматриваются проблемы биоремедиации нефтезагрязненных почв, основные биологи ческие методы рекультивации, а также особенности микробиологических процессов де струкции углеводородов в почве.
1.3. Основные биологические критерии экологической устойчивости почвы.
Анализ представленных в отечественной и зарубежной печати сведений позволяет сде лать заключение об обширности применяемых в настоящее время методов определения биологических критериев устойчивости почвы, большинство из которых основано на показателях биоразнообразия. И лишь небольшое количество методологических подхо дов и методов позволяет оценить динамические характеристики микробоценозов поч вы.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основными объектами, исследуемыми в рамках диссертационной работы, явля ются: 1. микробные сообщества целинных и антропогенно-нарушенных почв (дерново подзолистой легкосуглинистой и серой лесной оподзоленной тяжелосуглинистой юга Томской области, а также чернозема южного тяжелосуглинистого с 1.50, 3.94 и 5.81%-м содержанием гумуса соответственно;
2. вермикомпосты, произведенные различными морфо-экологическими группами дождевых червей (почвенными (endogeic), навозными (epigeic) и технологичным Красным калифорнийским гибридом).
Изучение биологических факторов и механизмов ремедиации агрогенных почв, а также поиск значимых микробиологических критериев экологической устойчивости почвы проводили на основе 12-ти и 5-ти летних полевых экспериментов, заложенных на дерново-подзолистой легкосуглинистой и серой лесной оподзоленной тяжелосугли нистой почве соответственно. В первом эксперименте исследовали эффективность поч возащитной технологии – полевого круглогодичного вермикультивирования, во втором – эффективность применения разных доз и способов внесения вермикомпоста в сравне нии с традиционными органическими удобрениями (навозом КРС и торфонавозной смесью (ТНС)). Биологическую активность вермикомпоста исследовали в серии мо дельных лабораторных опытов, целью которых было изучение особенностей меж- и внутрипопуляционных взаимодействий в органическом субстрате, перерабатываемом дождевыми червями, а также ключевых микробиологических процессов, ответственных за накопление в вермикомпосте стимуляторов роста растений и формирование его фун гистатических свойств. Особенности взаимоотношений микрофлоры органического субстрата и червей разных морфо-экологических групп (почвенных и навозных) изуча ли путем сравнительных исследований состава микробных сообществ и биохимических свойств копролитов червей.
Изучение биологических факторов и механизмов ремедиации почв, загрязненных нефтью, проводили на основе полевых и лабораторных опытов в рамках разрабатывае мой автором совместно с ООО НТО «Приборсервис» технологии биоремедиации неф тезагрязненных почв, суть которой состоит в комплексном подходе к активации собст венного биоресурса почвы, а также в системном применении всего арсенала техниче ских средств рекультивации, в особенности в рациональной, экологически оправданной схеме применения азотных удобрений. Основными регионами апробации технологии были Усинский район Тюменской области и Самарская область. Для определения клю чевых микробиологических процессов, запускающих микробную сукцессию биодегра дации углеводородов, в рамках модельных лабораторных и полевых экспериментов проводили исследование влияния на микробоценоз почвы природных цеолитов (Ши выртуин и Пегассин), различных видов (аммонийных, нитратных, органических) и доз азотных удобрений, а также сроков их внесения в сравнении с контролем – почвой без внесения мелиорирующих добавок.
При разработке тест-системы микробиологических критериев устойчивости эко логических функций почвы и эффективности почвозащитных технологий были исполь зованы следующие методологические подходы: 1. Сравнительный анализ структуры и функциональных свойств микробных сообществ целинной почвы, а также агро- и тех ногенно-трансформированных почв. 2. Изучение характера и скорости реакции микро боценоза исследуемых вариантов почвы на определенный тип и интенсивность антро погенного воздействия. Исследования в рамках вышеуказанных методологических под ходов проводили с использованием следующих методов: микробиологический анализ основных систематических и физиологических групп почвенных микроорганизмов;
анализ степени биоразнообразия микробного сообщества в целом и внутри отдельных экологически наиболее значимых физиологических групп микроорганизмов при помо щи индексов Шеннона, Симпсона и Бергера-Паркера;
метод инициированного микроб ного сообщества (ИМС) (Экологическая роль…, 1986) и разработанные сотрудниками лаборатории микробиологии СибНИИСХиТ модификации метода для изучения целлю лозолитического микробного сообщества и деструкторов гумуса.
Микробиологический анализ включал в себя определение следующих системати ческих и физиологических групп микроорганизмов: аммонификаторов – на МПА;
мик роорганизмов, усваивающих минеральный азот – на КАА;
спорообразующих бактерий – на СА:МПА=1:1 из пастеризованной водной взвеси;
актиномицетов – на КАА;
мик ромицетов – на среде Чапека с рН = 4,5-5 и на КГА (картофельно-глюкозный агар) (Практикум по микробиологии..., 1976);
актиномицетов – на аспарагино-глицериновом агаре;
фосфатрастворяющих и фосфатмобилизующих микроорганизмов – на среде Му ромцева с добавлением соответственно Са3 (РО4)2 и фитина (Ежов, 1974);
гумусразру шающих микроорганизмов – на жидкой и твердой минеральных средах с добавлением 0,01% гумата натрия (Сэги, 1983);
нитрификаторов – на среде Виноградского;
денитри фикаторов – на простой среде для денитрификаторов;
(Практикум по микробиологии, 1976);
уробактерии – на среде Федорова (Аникеев, Лукомская, 1983);
олигонитрофиль ных микроорганизмов – на среде Эшби;
целлюлозолитических микроорганизмов – на среде Гетчинсона-Клейтона;
микроорганизмов, активно продуцирующие аминокислоты – на среде Асаи с наложением фильтров, обработанных раствором нингидрина в ацето не;
актуальную и потенциальную активность азотобактера – по методу Виноградского (Методы почвенной …, 1980).
Условно-патогенную и патогенную микрофлору учитывали: бактерии группы ки шечной палочки – на среде Эндо;
Proteus vulgaris и бактерии тифозно-дизентерийной группы – на среде Левина;
Вас. perfringens – на среде Вильсона-Блера;
сальмонеллезные бактерии – на висмут-сульфитном агаре (Мишустин, 1954).
Химический анализ почвы включал определение: нитратного азота с фенолди сульфокислотой (ГОСТ 26488-85), аммонийного азота с реактивом Несслера (ГОСТ 26489-85), а также общего азота (СТП 0493925-009-93) и фракционного состава азота по методу Шконде и Королевой (СТП 0493925-010-93). Общее содержание гумуса в почве анализировали по методу Тюрина (ГОСТ 26213-84), фракционный состав гумуса – по Пономаревой-Плотниковой (Определение фракционного …., 1975), активность азотфиксации – ацетиленовым методом на газовом хроматографе «Хром-4».
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов прикладных программ «Snedekor v.5» и «Statistica 5.5 и 6.0».
3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВЕРМИКОМПОСТА:
ФАКТОРЫ И МЕХАНИЗМЫ 3.1. Влияние сапротрофных микроорганизмов органического субстрата и симбиотической микрофлоры дождевого червя на его жизнедеятельность и каче ство получаемого вермикомпоста. Одним из наиболее перспективных и экологически обоснованных направлений современного аграрного производства является развитие так называемого органического земледелия, основанного на соблюдении ключевых принципов устойчивого функционирования почвы: минимизации механического воз действия, исключающей нарушение строения почвенного профиля, применении опти мальных доз минеральных удобрений, строгом соблюдении севооборотов, а также обя зательном поступлении необходимого количества органического вещества. Развитие органического земледелия невозможно без производства и применения биологически активных органических удобрений, обладающих выраженными ростостимулирующими и фунгистатическими свойствами. К числу подобных удобрений относится вермиком пост – продукт переработки разнообразных органических отходов дождевыми червями.
Поскольку вермикомпостирование по своей сути является сложным комплексом разнообразных микробиологических процессов, обусловленных и регулируемых жиз недеятельностью дождевых червей, для производства высококачественного вермиком поста необходимо глубокое и всестороннее изучение этих процессов в целях их направ ленного регулирования. Кроме того, так как ризосфера является местом тяготения большинства представителей почвенной биоты, в том числе и дождевых червей, изуче ние микробиологических процессов формирования ростостимулирующей и фунгиста тической активности вермикомпоста будет способствовать более глубокому понима нию природы биологической активности самой почвы.
Для выявления роли сапротрофной микрофлоры органического субстрата в про цессах вермикомпостирования были проведены микробиологические и агрохимические исследования вариантов вермикомпоста, полученных в результате культивирования Красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei) в исходно различающихся условиях: на стерильном и нативном исходном торфонавозном субстрате. Для опреде ления влияния симбиотической микрофлоры дождевого червя на его жизнедеятель ность в опыте использовали как нормальных червей, так и червей с нарушенным специ альной обработкой микробным сообществом кишечника и внешних слизистых покровов.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что дождевой червь посредством своеобразного «селективного отбора» микроорганизмов-симбионтов оказывает значи тельное влияние на формирование структуры микробного сообщества копролитов. При этом в готовом вермикомпосте заметно увеличивается доля флюоресцирующих бакте рий рода Pseudomonas, актиномицетов, микроорганизмов, участвующих в трансформа ции органических и минеральных фосфатов, нитрификаторов и целлюлозолитической микрофлоры. О симбиотических отношениях этих групп микроорганизмов с дождевым червем свидетельствует факт значительного уменьшения их численности в субстрате, перерабатываемом червями с нарушенной вследствие специальной обработки структу рой микробного сообщества кишечника и внешних покровов (табл. 1). Одной из наибо лее важных для червя групп микроорганизмов, обеспечивающих его защиту от повы шенных концентраций аммиака, являются нитрификаторы. Угнетение деятельности нитрификаторов приводит к массовой гибели червей уже на 2-3 день культивирования.
Кроме того, экспериментально установленный факт супрессивного воздействия червя на патогенную микрофлору (сальмонеллезные бактерии, палочку Шига, Bac. per fringens) свидетельствует о значительном улучшении санитарного состояния вермиком поста по сравнению с исходной ТНС.
Таблица 1 – Влияние обработки дождевых червей на состав микрофлоры вермикомпоста;
N·10n Вариант опыта Pseudo- Нитри- Растворяющие Мобилизующие Актино- Миксо monas, фикаторы, Ca3(PO4)2 органофосфаты, мицеты, бактерии, N·109 N·104 N·107 N·107 N·105 N· Субстрат без 29,2 5,5 16,4 28,2 3,1 14, червей Нормальные 61,0 16,6 63,0 169,3 35,2 42, (необработан ные) черви Обработанные 7,3 2,3 35,4 35,1 18, черви НСР 05 4,8 9,3 2,5 5,6 0,8 7, Примечание. НСР 05 – наименьшая существенная разница при 95% уровне значимости.
О значительном влиянии сапрофитной микрофлоры исходного органического суб страта на качество готового вермикомпоста свидетельствует 3-х кратное снижение со держания минерального азота и 1,3-х кратное подвижных форм фосфора в вариантах вермикомпоста, полученных при переработке стерилизованной ТНС по сравнению с нестерилизованным субстратом.
3.2. Влияние дождевых червей разных морфо-экологических групп (почвенных и навозных) на характер микробиологических и биохимических процессов трансфор мации органического субстрата. Результаты предпринятых сравнительных исследо ваний копролитов дождевых червей, принадлежащих к разным морфо-экологическим группам, позволили сделать заключение об избирательном характере их взаимодейст вия с микроорганизмами исследованных физиологических и систематических групп.
Основное отличие Красного калифорнийского гибрида от остальных изученных видов навозных (Eisenia fetida киргизской и сибирской популяций) и почвенных червей (Apor rectodea caliginosa) состоит в значительном ускорении темпов аммонификации и мине рализации азотсодержащих органических веществ уже на первых этапах переработки ТНС. Численность аммонификаторов и микроорганизмов, усваивающих минеральный азот, в копролитах Красного калифорнийского гибрида после первого месяца верми культивирования значительно (в 6-7 раз) превышала численность данных микроорга низмов в копролитах остальных червей. Навозные черви в целом отличаются от поч венных активным стимулированием микробиологических процессов минерализации азотсодержащих органических веществ, а также нитрификации. Почвенные черви, на против, способствуют усилению микробной деструкции лигно-целлюлозного комплек са органического субстрата. Кроме того, почвенные черви являются активными стиму ляторами несимбиотической азотфиксации, в десятки раз превосходя по этому показа телю навозных червей.
Для ответа на вопрос о степени сходства и различия между исследованными вида ми дождевых червей по их влиянию на биохимические и микробиологические свойства производимого вермикомпоста была проведена статистическая обработка всего массива экспериментальных данных при помощи дискриминантного анализа. Сравнение копро литов четырех видов червей по признакам накопления биомассы микроорганизмов, ин тенсивности выделения СО2 («дыхания»), а также активности таких ферментов как нит рогеназа, целлюлаза, полифенолоксидаза и каталаза показало, что все исследованные виды дождевых червей образуют 4 хорошо обособленные кластера, что, в свою очередь, свидетельствует о наличии значимых отличий в направленности и уровне стимулируе мых ими биологических процессов в органическом субстрате (рис. 1а). При этом наи более обособленную группу формируют почвенные черви – в природных условиях тя готеющие к принципиально иной среде обитания, чем остальные исследованные пред ставители навозных червей.
12 6 Root Root - - КАЛИФОРНИЙСКИЙ - - СИБИРСКИЙ - КИРГИЗСКИЙ - -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 ПОЧВЕННЫЕ - -100 -80 -60 -40 -20 0 20 Root Root а б Рисунок 1 – Результаты дискриминантного анализа копролитов дождевых червей раз ных морфо-экологических групп, по факторам накопления биомассы микроорганизмов, интенсивности «дыхания» и активности ферментов (а);
по факторам, отражающим микробиологические процессы цикла азота (б) Несмотря на то, что данные дискриминантного анализа в целом относят Калифор нийский гибрид в группу навозных червей, на рисунке он все же заметно обосабливает ся от навозных червей природных популяций: сибирского и киргизского. Наиболее за метным данное отличие становится при анализе микробиологических процессов цикла азота (содержание в копролитах общего и нитратного азота, накопление аминокислот, численность аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов), что подтвер ждает наличие определенных особенностей в характере стимулируемых гибридом мик робиологических процессов и является результатом его направленной селекции с целью адаптации к повышенным концентрациям азота в субстрате.
3.3. Роль микробного сапротрофного сообщества в формировании ростости мулирующих свойств вермикомпоста. Анализ данных, представленных как в отечест венной, так и зарубежной литературе, подтверждает установленную автором высокую ростостимулирующую активность вермикомпоста (Терещенко, 1994;
Колесник, 2002;
Edwards, Arancon, 2004;
Norman et al., 2006). Изучение динамики активности кислотной и щелочной вытяжек из вермикомпоста, периодически отсеиваемого из перерабатывае мой червями ТНС, показало, что наибольшее стимулирующее влияние и на корни, и на зеленую массу оказывает кислотная вытяжка, способствуя почти 40%-ой прибавке веса корней и зеленой массы пшеницы. Следовательно, в вермикомпосте стимуляторы роста растений представлены главным образом аминокислотами, органическими кислотами и витаминами – основными продуктами кислотного гидролиза. Это подтверждается по ложительной корреляцией (rxy = 0,88) динамики кислотных вытяжек и накопления нин гидрин-положительных продуктов в органическом субстрате в процессе вермикульти вирования. Максимальные показатели активности щелочной вытяжки по отношению к зеленой массе проростков составили 20-25 %.
Определение роли, которую играют дождевые черви и сапротрофная микрофлора органического субстрата в синтезе и накоплении в вермикомпосте соединений аминной и аминокислотной природы, осуществляли в рамках модельного опыта, схема которого предполагала культивирование Красного калифорнийского гибрида на двух видах орга нического субстрата: смеси (1:4) низинного торфа и подстилочного навоза КРС, а так же – смеси низинного торфа со свиным навозом (1:4). В качестве контроля использова ли вариант с ТНС на основе навоза КРС без червей.
Сходный характер динамики активности кислотных вытяжек в вариантах с верми культивированием и в контроле показал, что динамика в большей степени определяется метаболической активностью микрофлоры самого субстрата, а не червя (рис. 2). Одна ко присутствие червей обусловливает тенденцию к увеличению абсолютных значений активности вытяжек, что в конечном итоге сказывается на возрастании показателей ростостимулирующей активности вермикомпоста по сравнению с исходной ТНС.
а б Рисунок 2 – Динамика активности кислотных вытяжек из торфонавозного субстрата без червей и двух вариантов вермикомпоста по отношению к зеленой массе проростков (а) и корням (б) Примечание. * – здесь и далее в рисунках различия достоверны при 95%-м уровне значимости. 1 – контроль (без червей);
2 – вермикультивирование на навозе КРС;
3 – вермикультивирование на свином навозе Исследование динамики активности соединений гумусовой природы, экстраги руемых щелочными вытяжками из отсеваемого вермикомпоста, на всем протяжении культивирования дождевых червей, по отношению, как к зеленой массе, так и к корням проростков, показало, что в кривой активности наблюдалась определенная периодич ность (рис. 3).
Рисунок 3 – Динамика активности Рисунок 4 – Динамика накопления в щелочных вытяжек из вермикомпоста по вермикомпосте гуминовых кислот (2) и отношению к зеленой массе (1) и корням фульвокислот (3), а также активности (2) проростков полифенолоксидазы (1) Динамика накопления фульвокислот и гуминовых кислот, а также активности от ветственной за их синтез полифенолоксидазы также имела статистически достоверный колебательный характер (рис. 4). Сопоставление кривых активности щелочных вытяжек с кривыми накопления фульвокислот выявило хорошо выраженную прямую зависи мость (рис. 5а). Тогда как, вопреки существующему мнению ряда специалистов о ре шающем вкладе гуминовых кислот в ростостимулирующие свойства вермикомпоста (Калинина, 2002;
Norman, 2006), зависимости между интенсивностью накопления гу миновых кислот и активностью щелочных вытяжек установить не удалось (рис. 5 б).
First: Гуминовые кислоты, % First : Фульвокислоты, % Lagged: Активность щелочных вытяжек, Lagged: Активность щелочной вытяжки, % прибавки биомассы пшеницы % прибавки биомассы пшеницы Lag Corr. S.E.
Lag Corr. S.E.
-15 -.038. -15 -.023. -14.1129. -14 -.053. -13 -.132. -13 -.107. -12 -.200. -12 -.050. -11.0582. -11 -.002. -10.0123. -10 -.013. -9 -.070. -9 -.125. -8 -.164. -8 -.206. -7 -.130. -7 -.194. -6.0305. -6.0080. -5.1725. -5.1556. -4.3376. -4 -.025. -3.1878. -3 -.111. -2 -.001. -2.4440. -1 -.149. -1.2520. 0 -.087. 0.1795. 1.1338. 1.2027. 2 -.173. 2.0646. 3 -.262. 3.0492. 4 -.118. 4.0573. 5 -.166. 5.0804. 6 -.130. 6 -.033. 7.0750. 7.0452. 8.1915. 8.0301. 9.1771. 9.0476. 10.2416. 10 -.003. 11.4003. 11 -.047. 12.2800. 12 -.053. 13.1482. 13 -.063. 14.0732. 14 -.055. 15 -.016. 15 -.046. Conf. Limit -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1, а б Рисунок 5 –Зависимость динамики активности щелочных вытяжек от динамики накопления гуминовых кислот (а), фульвокислот (б) Сопоставление динамики активности полифенолоксидазы с динамикой накопле ния фульвокислот и гуминовых кислот также свидетельствует о наличие зависимости между данными параметрами. Кросскорреляционный анализ показал, что активность полифенолоксидазы в большей степени обусловливает накопление фульвокислот, чем гуминовых кислот (рис. 6 а, б).
First : Полифенолоксидаза, First : Полифенолоксидаза, мг ПБХ/1г*30 мин мг ПБХ/1г*30 мин Lagged: Фульвокислоты, % Lagged: Гуминовые кислоты, % Lag Corr. S.E.
Lag Corr. S.E. -15 -.168. -15 -.009.3333 -14 -.187. -14.2302.3162 -13 -.189. -13.5996.3015 -12 -.124. -12.6536.2887 -11 -.029. -11.4971.2774 -10.0007. -10.2823.2673 -9 -.007. -9.0231.2582 -8 -.054. -8 -.085.2500 -7.0140. -7.0429.2425 -6.0616. -6.2334.2357 -5.0964. -5.0478. -4.1414. -4 -.120. -3.2605. -3.0368. -2.2461. -2 -.029. -1.5050. -1.0257. 0.9500. 0.1641. 1.0942.2085 1.5292. 2.0600.2132 2.2112. 3.0533.2182 3.1286. 4 -.039.2236 4.0167. 5 -.107.2294 5.0103. 6 -.083.2357 6.0368. 7 -.101.2425 7 -.002. 8 -.136.2500 8.0012. 9 -.157.2582 9.0443. 10 -.147.2673 10 -.051. 11 -.088.2774 11 -.112. 12 -.043.2887 12 -.080. 13 -.007.3015 13 -.055. 14.0172.3162 14 -.070. 15.0003.3333 15 -.088. 0 Conf. Limit -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1. а б Рисунок 6 – Зависимость динамики накопления гуминовых (а) и фульвокислот (б) от динамики активности полифенолоксидазы Возможно, это связано с тем, что фульвокислоты являются менее зрелыми и ме нее сложными соединениями, по сравнению с гуминовыми кислотами и являются непо средственным продуктом активности полифенолоксидазы. Гуминовые кислоты, напро тив, это – соединения более зрелые и, как правило, начинают накапливаться на более поздних этапах вермикультивирования (Еськов, 2004). Согласно полученным в данном эксперименте результатам в «молодом» вермикомпосте ростостимулирующая актив ность определяется в большей степени воздействием фульвокислот, чем гуминовых ки слот.
Сопоставление кривой активности полифенолоксидазы с кривой численности микроорганизмов показало, что динамика активности фермента полифенолоксидазы в большой степени обусловлена динамикой численности микроорганизмов аммонификаторов с коэффициентом корреляции 0,7. Эти данные свидетельствуют о том, что накопление в органическом субстрате фульвокислот, а соответственно и росто стимулирующие свойства субстрата в большой степени обусловлены метаболической активностью аммонификаторов. Согласно сведениям Н.П. Битюцкого с соавт. (2005) дождевые черви способны сами выделять фенолоксидазы клетками эпителия. Однако полученные в ходе рассматриваемого эксперимента данные свидетельствуют о том, что поставщиками полифенолоксидаз наряду с дождевыми червями могут быть также и микроорганизмы субстрата.
Как известно в кишечнике беспозвоночных активно протекают процессы гуми фикации органических остатков. У дождевых червей эти процессы наиболее выражены.
При переработке органических субстратов происходит не только новообразование низ комолекулярных форм гумусовых кислот, но и их полимеризация, увеличение степени ароматизации, что является признаком более зрелых стадий гумификации. Высокое со держание в вермикомпостах «готовых» гумусовых веществ, термодинамически ста бильных, устойчивых к минерализации, имеет важное значение для гумусового состоя ния почв. Однако основными ростостимулирующими веществами в вермикомпосте (по крайней мере – в свежеприготовленном) являются не столько гуминовые, сколько менее высокомолекулярные фульвокислоты.
3.4. Влияние микрофлоры вермикомпоста на уровень его фунгистатической активности. Изучение микробиологических аспектов вермикультивирования показа ло, что в вермикомпосте значительно возрастает численность микрофлоры биоконтро ля, в частности, бактерий рода Pseudomonas (Toyota, Kimura, 2000;
Терещенко, 2003).
При этом скрининг бактериальных культур рода Pseudomonas, выделяемых из верми компоста, показал очень высокий уровень фунгистатической активности у большинства изолятов по отношению к фитопатогенным грибам, который может достигать 50-80% подавления скорости роста чистых культур фитопатогенных грибов Bipolaris sorokini ana и Fusarium oxysporum.
Поскольку одной из доминирующих групп микроорганизмов в вермикомпосте яв ляются низшие сапротрофные грибы, возникло предположение о возможной индукции супрессивной активности Pseudomonas микромицетами. Чтобы проверить предположе ние о зависимости уровня фунгистатической активности псевдомонад от численности низших грибов в вермикомпосте, был предпринят эксперимент, в ходе которого спро воцировали резкое скачкообразное увеличение численности грибов в перерабатываемой червями ТНС за счет первоначального снижения влажности субстрата на 10% и после дующего обильного увлажнения. Непосредственно до и после увлажнения субстрата из него выделяли бактериальные культуры рода Pseudomonas и в биотесте методом прямо го штриха (Методы почвенной микробиологии…, 1980) определяли уровень их фунги статической активности, о котором судили по степени подавления скорости радиально го роста чистых культур грибов Bipolaris sorokiniana и Fusarium oxysporum.
Резкое увеличение влажности субстрата привело не только к более чем двукрат ному возрастанию численности грибов (с 412 тыс. КОЕ в 1 г до 841), но и к увеличению таких показателей роста микромицетов, как длина и плотность гиф (с 3,7 мм и шт/мм2 перед увлажнением до 5,7 мм и 44,8 шт/мм2 после увлажнения соответственно).
Фунгистатическая активность бактериальных изолятов рода Pseudomonas, выделенных из вермикомпоста после увлажнения, возросла по отношению к Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana с 10,9±2,9% до 24,1±2,3% и с 32,3±1,9% до 60,36±2,8% соответст венно. Таким образом, результаты эксперимента подтвердили вероятность того, что фунгистатическая активность бактерий в вермикомпосте в значительной степени может быть обусловлена активностью грибной составляющей микробоценоза вермикомпоста.
Полученные результаты соответствуют сведениям S. Scheu и D. Parkinson (1994) об увеличении в субстратах, перерабатываемых червями, прежде всего быстрорастущих форм микромицетов. Кроме того, в субстратах, где обитают дождевые черви, на фоне увеличения общей численности грибов часто наблюдается перестройка структуры со общества микромицетов, которая выражается в увеличении доли ряда сапротрофных грибов, в частности рода Trichoderma, и сокращении количества некоторых патогенных грибов за счет подавления прорастания пропагул (Moody, Briones, 1995;
McLean, Park inson, 2000). В связи с этим, возникает предположение о том, что фунгистатическая ак тивность вермикомпоста может быть обусловлена не только показателями общей чис ленности грибов в вермикомпосте, но также и численностью микромицетов с разной трофической стратегией, т.е. сапротрофов и патогенов. Поскольку основными агентами биоконтроля в вермикомпосте являются бактерии рода Pseudomonas, актуальным ста новится вопрос о влиянии сапротрофных и патогенных микромицетов на уровень фун гистатической активности псевдомонад. Серия биотестов с чистыми культурами грибов и бактериальными изолятами рода Pseudomonas показала отсутствие статистически значимых отличий в величинах подавления роста патогенных и сапротрофных грибов псевдомонадами (табл. 2).
Таблица 2 – Средние по серии биотестов показатели подавления скорости роста чистых культур фитопатогенных и сапротрофных грибов под влиянием Pseudomonas Культура гриба Скорость роста Скорость роста Подавление роста грибов в присутст- грибов в контроле, гриба по отноше вии бактерий, мм/ч мм/ч нию к контролю, % 0,169±0,023 0,249±0,011 32, Fusarium oxysporum 0,069±0,002 0,150±0,020 53, Bipolaris sorokiniana 0,176±0,016 0,228±0,023 31, Rhizoctonia solani 0,157±0,044 0,206±0,014 24, Penicillium sp.
0,325±0,030 0,475±0,031 31, Aspergillus sp.
0,403±0,029 0,640±0,025 36, Trichoderma viride В связи с тем, что помимо Pseudomonas в вермикомпосте содержится довольно широкий в систематическом отношении спектр бактерий, также способных оказывать влияние на его фунгистатические свойства, была разработана новая методика, позво ляющая проследить динамику суммарной фунгистатической активности всего консор циума бактериальных культур по отношению к фитопатогенным грибам, обеспечиваю щая совместное культивирование гриба и бактерий, при котором отсутствует экраниро вание питательной среды для гриба колониями бактерий.
Результаты, представленные на рисунке 7, свидетельствуют о том, что кривая ди намики суммарной фунгистатической активности бактериального консорциума верми компоста и кривая численности бактерий на протяжении 2 месяцев вермикультивиро вания имеют вид, близкий к синусоиде. Анализ временных рядов Фурье показал, что обе кривые характеризуются одинаковыми значениями периода колебаний, равными 14-15 суткам (рис. 9 а, б). Следовательно, существует вероятность того, что изменение во времени уровня фунгистатической активности вермикомпоста может быть обуслов лено изменением численности самих бактерий, продуцирующих биофунгициды.
Рисунок 7 – Сопоставление динамики Рисунок 8 – Сопоставление динамики численности микроорганизмов (1) и численности микроорганизмов (1) и суммарной фунгистатической активности фунгистатической активности одной микробного сообщества (2) бактериальной клетки (2) Пересчет суммарных показателей фунгистатической активности на одну бактери альную клетку показал, что активность отдельных клеток бактерий также носит цикли ческий характер (рис. 8). При этом период колебаний активности отдельных клеток совпадает с периодом колебаний суммарной активности бактериального консорциума (рис. 9 б, в). Следовательно, характер периодических изменений фунгистатической ак тивности вермикомпоста в процессе его созревания может быть обусловлен не только простым колебанием общей численности бактерий, продуцирующих биофунгициды, но и изменением уровня фунгистатической активности самих бактериальных клеток.
500 Квадрат амплитуды Квадрат амплитуды Квадрат амплитуды 0 0 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 1 3 5 7 9 11 13 1 3 5 7 9 11 13 1 3 5 7 9 11 Период Период Период а б в Рисунок 9 – Значение периода колебания для функций, описывающих динамику чис ленности микроорганизмов (а), суммарной фунгистатической активности микробного сообщества вермикомпоста (б), а также активности одной бактериальной клетки (в) Изучение технологических процессов производства антибиотиков позволило ус тановить, что динамика накопления антибиотика в культуральной жидкости, как прави ло, имеет вид зависимости, характерной для биологического синтеза вторичных мета болитов, т.е. максимум образования биомассы микроорганизмов во времени предшест вует максимуму продуцирования микроорганизмами антибиотика (Быков и др., 1987).
Подобная прямая зависимость между продуцированием биологически активных ве ществ и плотностью популяции наблюдается не только в условиях закрытых биотехно логических систем, но и в условиях открытых природных экосистем, в частности у ри зосферных Pseudomonas (Хмель и др. 2002). Явление взаимного антибиотического по давления у бактерий, принадлежащих к одному роду, было также установлено Б.В. Та ракановым с соавт. (2001) в экспериментах с Escherichia coli.
Результаты кросскорреляционого анализа подтвердили прямую зависимость ди намики суммарной фунгистатической активности бактериального консорциума от ди намики численности бактерий (рис. 10 а).
First : Численность бактерий First : Численность бактерий Lagged: Фунгистатическая Lagged: Фунгистатическая активность активность бактерий 1 клетки Lag Corr. S.E. Lag Corr. S.E.
-15 -- -- -15 -- - -14 -- -- -14 -- - -13 -- -- -13 -- - -12 -- - -12 -- - -11 -.094 1. -11 -.042 1. -10.0422. -10.0053. -9.0200. -9.1870. -8 -.214. -8 -.260. -7.1602. -7 -.031. -6.2645. -6.3653. -5 -.277. -5 -.241. -4 -.077. -4 -.136. -3.4059. -3.4860. -2 -.229. -2 -.375. -1 -.383. -1 -.343. 0.5760. 0.6430. 1.1916. 1 -.183. 2 -.533. 2 -.294. 3.3007. 3.3466. 4.1829. 4.0767. 5 -.631. 5 -.503. 6.2948. 6.2364. 7.0630. 7.0818. 8 -.185. 8 -.133. 9.2371. 9.2522. 10 -.065. 10 -.083. 11 -.051 1. 11 -.057 1. 12 -- - 12 -- - 13 -- - 13 -- - 14 -- - 14 -- - 15 -- - 15 -- - Conf. Limit -1,0 -0,5 0,0 0,5 1, -1,0 -0,5 0,0 0,5 1, а б Рисунок 10 – Зависимость динамики суммарной фунгистатической активности бактериального консорциума вермикомпоста (а) и динамики фунгистатической активности отдельной бактериальной клетки (б) от динамики численности бактерий Этот же анализ показал высокую вероятность прямой зависимости между уров нем фунгистатической активности одной отдельно взятой бактериальной клетки и чис ленностью бактерий в один определенный срок наблюдений, подтвердив предположе ние об индуцированном характере фунгистатической активности бактерий в вермиком посте (рис. 10 б). При этом в качестве индуктора может выступать не только конкурен ция бактерий за субстрат с обильно населяющими вермикомпост низшими грибами, но и конкуренция между самими бактериями, высокая численность которых поддержива ется физиологической активностью дождевых червей.
3.5. Гармонический характер динамики численности микроорганизмов и роль динамических характеристик микробного сообщества вермикомпоста в фор мировании его фунгистатических свойств. Анализ большого массива полученных автором экспериментальных данных о микробиологических процессах в перерабаты ваемых дождевыми червями органических субстратах убедительно свидетельствует о колебательном характере динамики численности микроорганизмов (рис. 11 а, б). Стати стический анализ достоверности колебаний во всех экспериментах подтвердил истин ность полученной картины динамики численности микроорганизмов при 95-ти % уров не значимости.
Колебания численности микроорганизмов различных трофических групп на на чальных стадиях разложения свежих растительных остатков непосредственно после внесения их в почву наблюдали многие исследователи (Kuikman et al., 1991;
Zelenev et al., 2000;
Mamilov et al., 2001). В качестве основной причины большинство авторов по лагают изменение численности простейших – основных хищников бактерий (Verhoeff, Brussaard, 1990) или связывают это явление с концентрацией легкодоступных субстра тов (Ferris et al., 1998;
Calbrix et al., 2007).
а б Рисунок 11 – Динамика численности аммонификаторов (1) и микроорганизмов, усваи вающих преимущественно минеральный азот (2) в органическом субстрате, перераба тываемом червями в процессе вермикультивирования (данные 2004 (а), 2006 (б) годов) Исследование характера колебаний при помощи статистического анализа вре менных рядов Фурье позволило выявить хорошо различимый период, подтвердив тем самым их гармонический характер (рис. 9 а), одной из наиболее вероятных причин ко торого могут быть автоколебания, возникающие в любой достаточно сложной биологи ческой системе, включающей две и более взаимодействующие и взаимозависимые друг от друга популяции (Базыкин, 1985).
Расчет коэффициента кросскорреляции между динамикой численности микроор ганизмов-аммонификаторов (на МПА) как ведущего фактора, и динамикой численности микроорганизмов, преимущественно усваивающих минеральный азот (на КАА), как за висимой переменной, показал наличие прямой взаимосвязи между данными показате лями с коэффициентом корреляции 0,85. Данное явление может быть обусловлено тем, что для микроорганизмов, учитываемых на КАА, продукты трофической активности аммонификаторов являются основным пищевым субстратом.
В соответствии с выдвинутой V.V. Zelenev с соавт. (2006) гипотезой при домини ровании в субстрате представителей r-стратегии, составляющих основу микробной сук цессии на легкодоступных источниках углерода, ведущую роль в возникновении авто колебаний начинают играть внутри- и межпопуляционные взаимодействия быстрора стущих форм микроорганизмов, конкурирующих за данный субстрат, а не отношения типа «хищник-жертва». Поскольку торфонавозная смесь, перерабатываемая червями в процессе вермикультивирования, отличается очень высоким содержанием доступных для микробов источников углерода, населяющее ее микробное сообщество имеет ярко выраженные черты r-стратегии с доминированием быстрорастущих неспорообразую щих форм бактерий (Toyota, Kimura, 2000;
Терещенко, 2003). По этой причине роль ин дуктора обнаруженных в перерабатываемом дождевыми червями органическом суб страте колебаний численности микроорганизмов, вероятнее всего, играют взаимодейст вия типа «микроорганизмы – субстрат», а не «черви – простейшие – микроорганиз мы», т.е. «хищник – жертва».
Математический анализ динамики численности низших грибов также обнаружил гармонический характер колебаний с периодом, равным 12-14 суткам. Чтобы подтвер дить влияние низших грибов на уровень фунгистатической активности Pseudomonas в вермикомпосте, исследовали кросскорреляционную зависимость динамики фунгиста тической активности бактерий от динамики численности грибов. Для изучения динами ки фунгистатической активности Pseudomonas использовали методику, отличную от описанной в разделе 3.4, согласно которой по мере созревания вермикомпоста через каждые 3-4 дня проводили выделение Pseudomonas в чистую культуру. Затем определя ли супрессивную активность штаммов в биотесте с Fusarium oxysporum и рассчитывали усредненные показатели активности. Результаты кросскорреляционного анализа под твердили высказанное в разделе 3.4 предположение о зависимости уровня фунгистати ческой активности бактерий рода Pseudomonas от численности низших грибов в верми компосте (рис. 12 б). Поскольку представленные в вермикомпосте преимущественно быстрорастущие виды микромицетов являются одними из основных конкурентов Pseu domonas за энергетический субстрат, велика вероятность того, что цикличность числен ности грибов в значительной степени обусловливает цикличность супрессивной актив ности бактерий.
First: Динамика численности грибов First : Динамика численности Lagged: Динамика фунгистат. активности Pseudomonas бактерий, % Lagged: Динамика фунгистат. активности, % Lag Corr. S.E.
-15 -- -- Lag Corr. S.E.
-14 -- -- -15 -.047. -13 -- -- -14.0195. -12 -.165 1.000 -13 -.056. -11 -.267.7071 -12 -.095. -11 -.056. -10 -.381. -10 -.081. -9 -.377. -9 -.121. -8 -.122. -8.0199. -7 -.072. -7.0055. -6.1971. -6.2043. -5.1525. -5.1103. -4.1717. -4.2469. -3.4597.3162 -3.5119. -2.5698.3015 -2.1197. -1.4405.2887 -1.0561. 0.4071.2774 0 -.057. 1.2528.2887 1 -.250. 2.1661.3015 2 -.158. 3 -.177.3162 3 -.089. 4 -.284.3333 4 -.052. 5 -.178.3536 5 -.131. 6 -.129.3780 6 -.259. 7 -.306.4082 7 -.304. 8 -.151.4472 8 -.070. 9 -.129.5000 9 -.119. 10 -.066.5774 10.1520. 11 -.060.7071 11.0929. 12.1109. 12.0457 1. 13.0967. 13 -- - 14 -.099. 14 -- - 15 -.006. 15 -- - -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1. а б Рисунок 12 – Влияние динамики численности флюоресцирующих бактерий (а) и динамики численности низших грибов (б) на фунгистатическую активность бактериальных изолятов рода Pseudomonas В свою очередь расчет кросскорреляционным методом зависимости динамики по казателей фунгистатической активности псевдомонад от динамики численности бакте рий подтвердил ранее высказанное предположение о возможности индукции активно сти бактерий динамическими характеристиками их популяции, а именно: цикличностью их численности, обусловливающей периодические всплески плотности популяции, и, как следствие, обострение внутрипопуляционной конкуренции за пищевой субстрат (рис. 12 а).
3.6. Микробиологические механизмы формирования системного неспецифи ческого иммунитета у растений под воздействием вермикомпоста. Как известно помимо локальной устойчивости к патогенам растения могут формировать и системную устойчивость, проявляющуюся на расстоянии от точки взаимодействия с патогеном и захватывающую все растительные ткани. В большинстве случае в производственных условиях для иммунизации растений используют обработку семян или вегетирующих растений фитоалексинами или индуцирующими их синтез элиситорами, а также рас творами иммунных индукторов, полученных из культуральных сред фитопатогенных грибов или компонентов клеточных стенок грибов (Ayers, 1976;
Yoshikawa et al., 1993).
Кроме того, предпринимались также попытки иммунизации растений ослаблен ными культурами патогенных грибов и их авирулентными расами (цит. по Метлицкий, 1985). Последний способ иммунизации растений наиболее интересен для объяснения механизма формирования системного иммунитета у растений, выращиваемых на грун тах, содержащих вермикомпост, и на почвах, обильно населенных дождевыми червями.
Известно, что вермикомпост отличается высокой численностью и видовым раз нообразием микроорганизмов, в том числе и микроскопических грибов. В основном в копролитах доминируют сапротрофные виды грибов, однако встречаются и представи тели рода Fusarium, как известно, способные поражать широкий спектр сельскохозяй ственных культур. Так, например, Fusarium ventricosum и Fusarium oxysporum наряду с Trichoderma viride часто составляет основу целлюлозолитического грибного сообщества копролитов. Однако, несмотря на это, растения, выращиваемые на вермикомпост со держащих субстратах, практически никогда не проявляют признаков фузариоза. Это может быть обусловлено тем, что патогенные грибы находятся в вермикомпосте в угне тенном состоянии из-за постоянного супрессивного воздействия на них бактериального сообщества вермикомпоста, многие представители которого являются активными про дуцентами биофунгицидов. Наличие в вермикомпосте ослабленных форм Fusarium по зволяет сделать предположение о присущей вермикомпосту способности индуцировать у выращиваемых на нем растений неспецифическую системную устойчивость к агрес сивным штаммам Fusarium.
Для проверки данного предположения в рамках модельного эксперимента перво начально получили два вида рассады овощных культур, путем выращивания на натив ном и на стерилизованном (т.е. без микромицетов) вариантах грунта, содержащем вер микомпост. Затем проводили наблюдение за вегетативным ростом обоих видов рассады после пересадки на торфо-минеральный грунт по инфекционному фону Fusarium oxysporum и без него. Об уровне устойчивости растений судили по степени проявления основных признаков фузариозного поражения, а именно: по увяданию молодых листьев и гибели растений, по общему угнетению вегетативного роста, выражающемуся в сни жении вегетативной массы, а также по специфическому эффекту вытягивания растений, стимулируемому грибом, посредством выделения гибберелинподобных веществ. Для более наглядного представления результатов эксперимента был рассчитан удельный вес рассады, как отношение массы растений к их длине.
В вариантах с инфекционным фоном максимальная степень поражения Fusarium oxysporum (33%) была зафиксирована у растений капусты, выращенных из «стериль ной» рассады, здесь же были отмечены случаи гибели (13% от общего числа). Удель ный вес растений капусты и огурца, выращенных из рассады, полученной на нормаль ном нестерильном грунте, был больше, чем растений, выращенных из «стерильной» рассады (рис. 13). Это может быть обусловлено тем, что рассада, полученная на натив ном вермикомпост содержащем грунте, предположительно была иммунизирована и по тому оказалась более устойчива к фузариозу, чем растения, выращенные в стерильных условиях.
Аналитическая обработка результатов фенологических наблюдений показала, что эффект иммунизации у «нестерильной» рассады проявлялся не только в больших зна чениях массы растений и удельного веса, но и в меньшей степени деформации листовой пластинки. Расчет соотношения длины и ширины листовой пластинки выявил эффект вытягивания листовой пластинки у неиммунизированных растений при их выращива нии на зараженном Fusarium oxysporum грунте. Особенно хорошо это было заметно на 4-м, более молодом листе (рис. 14).
6, * * Удельный вес растений, мг/см 6,6 Удельный вес растений, * * 6, 6, 6,0 мг/см 5, 5, 5,4 5, 5, 4,8 4, 4, 1 2 1 1** 2 1 Зараженный грунт Незараженный Зараженный грунт Незараженный Капуста Огурец Рисунок 13 – Показатели удельного веса растений капусты и огурца, выращенных из рассады, полученной на «стерильном» и нативном (нормальном) вариантах грунта Примечание. ** 1 – «Стерильная» и 2 – «нестерильная» рассада – предположи тельно неиммунизированная и иммунизированная рассада соответственно Результаты микробиологическо 1. го анализа ризосферы обоих типов рас 1. Отношение длины сады показали, что численность неспо листа к ширине 1. рообразующих флюоресцирующих 1. форм бактерий в ризосфере «стериль 0.95 * 0. ной» рассады была не меньше, чем в 0. ризосфере «нестерильной» и составила 0. соответственно 87,2±20,8 и 36,8±5, 0. млн. КОЕ/1г. Данное явление обуслов 1 2 1 Зараженный грунт Незараженный лено обсеменением ризосферы «сте рильной» рассады собственной микро Рисунок 14 - Соотношение длины флорой семени. Следовательно, корни и ширины 4-го листа «стерильной» рассады в момент ее пе Примечание. - 1,2 - см. рис. ресадки на зараженный и незаражен ный грунт были обсеменены полезной микрофлорой в не меньшей степени, чем корни рассады, выращенной на нестерилизованном грунте. Поэтому более высокая устойчи вость «нестерильной» рассады в опыте по сравнению со «стерильной» обусловлена именно эффектом иммунизации, а не присутствием полезной микрофлоры на корнях.
4. ОСОБЕННОСТИ БИОРЕМЕДИАЦИИ АГРОГЕННО-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ПОЧВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЧВОЗАЩИТНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПКВК 4.1. Основные этапы и особенности технологии ПКВК и модифицированной технологии получения грунта на основе вермикомпоста. Одной из наиболее акту альных экологических проблем современности является необходимость утилизации разнообразных органических отходов при вполне очевидном дефиците органических удобрений, особенно в нечерноземной зоне, где почвы отличаются исходной малогу мусностью. Однако свежий навоз и другие органические отходы в чистом виде вносить на поля нельзя из-за присутствия в них патогенной микрофлоры и других, опасных для почв и сельскохозяйственных растений организмов. Поэтому все органические отходы сельского хозяйства нуждаются в предварительной переработке в компосты, но процесс этот довольно длительный и требует немалых затрат. Выход из ситуации видится в раз работке комплексных безотходных способов сельскохозяйственного производства, к числу которых относится и вермикультура – переработка органических отходов при помощи дождевых червей.
Современная практика вермикультивирования располагает большим разнообрази ем технологических приемов и технических средств. Вместе с тем большинство из них разработаны для условий Европейского региона и потому не всегда применимы в Си бири. В частности, использование обогреваемых помещений зимой для сохранения по головья червей сводит на нет доходы от вермикультивирования, полученные за летний период. Следовательно, в условиях длительных зим с устойчивыми морозами, но при значительной мощности снегового покрова экономически и экологически целесообраз но перемещение вермикультивирования непосредственно на паровое поле, нуждающее ся в биологической рекультивации (Чичерин, Терещенко, 1996). В этом случае для зим него содержания нарастающей массы червей создаются специальные, увеличенные в размерах и укрытые соломой вермибурты, в которых обеспечивается и необходимый запас корма червям (на всю зиму), и удовлетворительные условия для жизнедеятельно сти и даже воспроизводства червей (температура внутри вермибурта зимой не опуска ется ниже +6...8оС).
Весной бурты вскрываются и трансформируются в вермигряды оптимальных раз меров, которые используются для получения вермикомпоста и воспроизводства червей в коммерческих целях, частично для внутренних потребностей самого производителя (фермерского и государственного хозяйства), а также для наращивания маточной куль туры червей. Непереработанные червями остатки вермигряд (как правило, нижние их слои), но претерпевшие преобразование за счет компостирования, могут использоваться в качестве органических удобрений на полях. На следующий год вермикультивирова ние перемещается на соседнее поле, которое отводится под пар, а прошлогоднее поле, после проведения на нем вермикультивирования, вспахивается и используется под вы ращивание конкретной сельскохозяйственной культуры. Так, в результате планомерно го применения на полях технологии Полевого круглогодичного вермикультивирования (ПКВК), происходит последовательная пространственно-временная биологическая ре культивация (окультуривание) пахотных земель, которая с агроэкологической точки зрения особенно важна для нечерноземной зоны.
4.2. Влияние вермикомпоста на биологическую активность почвы и развитие сельскохозяйственных культур в условиях вегетационных опытов. Одной из основ ных целей производства и применения в растениеводстве вермикомпоста является по вышение плодородия почвы и улучшение качества выращиваемой сельскохозяйствен ной продукции. Однако применение вермикомпоста, как и любого другого биологиче ски активного органического удобрения требует специальных исследований для опре деления оптимальных доз его внесения под конкретные культуры и при возделывании их на тех или иных почвах. В этих целях в теплице научно-экспериментальной базы СибНИИСХиТ СО Россельхозакадемии были проведены вегетационные опыты с куль турой огурца и томата. Рассаду огурца выращивали на верхнем (пахотном) слое дерно во-подзолистой почвы с добавлением различных доз вермикомпоста Красного кали форнийского гибрида: 10, 25, 50 и 70% от общей массы почвы, а также на чистом не просеянном компостном субстрате после культивирования червей. В качестве контроля использовали почву с NPK (контроль-1) и почву с добавлением 50% низинного торфа и NPK (контроль-2).
Результаты фенологических наблюдений показали, что максимальная статисти чески достоверная прибавка массы корней и зеленой массы растений была получена в варианте с 25% вермикомпоста и составила, соответственно, 31 и 41% в сравнении с контролем-2. Положительный эффект на биомассу огурца обеспечило и 10%-ное внесе ние вермикомпоста в почву. Этим двум дозам соответствуют и достоверно лучшие по казатели количества листьев и цветков (15 и 54% соответственно к контролю-2). Внесе ние вермикомпоста в дозах свыше 25% привело не только к замедлению роста расте ний, но и резкому подавлению формирования цветков. Еще большее угнетение роста и развития огурца произошло при его выращивании на чистом непросеянном компосте.
Проявление ингибирующего эффекта в вариантах с высокими дозами вермикомпоста, согласно U. Tomati (1988) и N. Arancon (2006) могут быть обусловлены гормоноподоб ным влиянием экскрементов червей.
Для оценки влияния вермикомпоста на рост и развитие культуры томата в веге тационном эксперименте изучали эффективность нескольких разновидностей органиче ских и торфо-минеральных грунтов («Селигер», «Фарт», «Чародей»), в том числе со держащего вермикомпост грунта «Гарант» и составного торфяного грунта с 25% (по объему) содержанием вермикомпоста. Начиная с четвертой недели наблюдений, мак симальными значениями веса сухой зеленой массы растений, площади листовой пла стинки, ширины и длины стебля характеризовались растения, выращиваемые на обоих вермикомпост содержащих грунтах. Сопоставление интенсивности прироста биомассы растений и изменения содержания в грунте минерального азота показало, что во всех грунтах, за исключением содержащего 25% вермикомпоста, прирост биомассы расте ний с течением времени сопровождался уменьшением содержания в грунте подвижных форм азота, т.е. имела место классическая схема выноса питательных элементов из грунта при активно формирующейся биомассе растений. Расчет коэффициентов корре ляции содержания в грунте минерального азота и прироста биомассы растений в вари антах опыта показал довольно высокую степень обратной зависимости между данными показателями («Селигер»: rxy = – 0,69;
«Чародей»: rxy = – 0,63;
«Фарт»: rxy = – 0,81;
«Га рант»: rxy = – 0,49). В грунте с 25%-м содержанием вермикомпоста при длительных экс позициях (1,5-2 месяца) наблюдалось заметное накопление минерального азота, не смотря на активный прирост биомассы а, следовательно, и вынос элементов, что под тверждается довольно высоким значением коэффициента корреляции биомассы и со держания азота в грунте (rxy = 0,51). Причиной столь необычного явления может быть очень высокий уровень актуальной (по Виноградскому) активности азотобактера в дан ном варианте, варьирующего в диапазоне 92 – 99% от максимально возможного для данного грунта, что и обусловило интенсивный приток атмосферного азота в грунт.
4.3. Эффективность применения вермикомпоста в агроценозах. Результаты пяти лет полевых испытаний вермикомпоста на дерново-подзолистой легкосуглинистой и серой лесной тяжелосуглинистой почве показали, что наиболее эффективной и эко номически оправданной дозой является 6 т/га, по эффективности соответствующая т/га навоза и 40 т/га ТНС. На серой лесной почве прибавка урожая картофеля от внесе ния 6 т/га вермикомпоста оказалась даже менее затратной (52,7-53,6 руб./ц), чем от т/га навоза (139,3-160,7 руб./ц). Среди исследованных способов применения наиболее эффективным является локальное ленточное внесение, способствующее почти двукрат ному увеличению урожая картофеля, а также росту содержания в клубнях сухого веще ства и крахмала. Вопреки существующим представлениям низкие дозы вермикомпоста оказали слабое последействие на яровую пшеницу.
4.5. Эффективность почвозащитной технологии Полевого круглогодичного вермикультивирования (ПКВК) в зернопропашном севообороте на дерново подзолистой легкосуглинистой почве. Решение проблем биологической рекультива ции земель, увеличения количества и улучшения качества сельскохозяйственной про дукции при использовании технологии вермикультивирования традиционно предпола гает использование конечного продукта вермикультивирования – вермикомпоста, а не самого этого процесса. Между тем, в природе деятельность дождевых червей осуществ ляется непосредственно в зоне роста корневых систем растений и не существует разде ления на процесс и продукт. Чтобы исследовать влияние процесса вермикультивирова ния, инициированного непосредственно в почве на ее биологические и агрохимические свойства, был предпринят эксперимент, согласно которому в поле, где внедряется тех нология ПКВК, были нарезаны увеличенные до 70 см почвенные гряды. По центру од них гряд закладывали ленты из вермикомпоста, по центру других – из свежей ТНС, со держащей Калифорнийский гибрид. Поверхность гряд мульчировали смесью соломен ной резки и торфяной крошки. ТНС и мульча одновременно служили приманкой для аборигенных навозных и почвенных червей и способствовали инициации процесса вер микомпостирования непосредственно в корнеобитаемой зоне картофеля.
Результаты исследования свидетельствуют, что по всем параметрам наиболее эффективным является вариант с инициированным вермикультивированием (ИВК).
Урожай картофеля здесь в 1,5-2 раза выше, чем в варианте с простым внесением вермикомпоста и составляет для сорта Невский – 475 ц/га, для сорта Адретта – 456 ц/га.
Максимальное количество микроорганизмов и наибольшее значение их биомассы, а также активности азотфиксации и выделения СО2 обнаружено в варианте с ИВК, что свидетельствует о высокой скорости процессов трансформации вносимой в почву ТНС и усилении биологической активности почвы. Большая эффективность приема ИВК по сравнению с простым внесением вермикомпоста обусловлена тем, что свежее органическое вещество ТНС привлекает в почвенную гряду также почвенных червей, в результате чего задействуется весь сложный комплекс мезофауны и микрофлоры почвы. Это приводит к накоплению непосредственно в корнеобитаемой зоне картофеля не только элементов питания, но и разнообразных стимуляторов роста, в значительном количестве образующихся на ранних стадиях вермикультивирования. Кроме того, интенсивная трансформация органического вещества ТНС при сбалансированности микробиологических процессов преобразования органического азота (аммонификация, нитрификация, денитрификация и азотфиксация) в результате совместного воздействия экологически различных групп дождевых червей (почвенных и навозных) способствует положительному балансу гумуса в почве, сводит к минимуму потери азота из агроценоза, обеспечивая экологическую чистоту технологии выращивания картофеля в системе полевого круглогодичного вермикультивирования.
5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ И МЕХАНИЗМЫ РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ 5.1. Особенности комплексной технологии биоремедиации нефтезагрязнен ных почв. Нефтяное загрязнение почв по масштабам проявления и глубине последствий занимает одно из ведущих мест в «рейтинге» экологических проблем современности.
Сумма накопленных экологической наукой теоретических и эмпирических данных убе дительно доказывает невозможность решения задачи восстановления загрязненных территорий без привлечения всего биологического ресурса почвы и в первую очередь потенциала ее микробного сообщества. Установленные автором основные закономер ности микробиологических процессов в нефтезагрязненных почвах, а также факторы и механизмы, обусловливающие оптимальное течение данных процессов, легли в основу разработанной совместно с НТО «Приборсервис» (Патент РФ № 2245748) технологии биоремедиации почв, загрязненных нефтью. Применяемый в рамках технологии ком плекс агромелиоративных мероприятий направлен на максимальное стимулирование активности аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры (УОМ) почвы, в том числе и в неблагоприятных почвенно-климатических условиях северных регионов.
Особенность технологии состоит в том, что стимулирование активности микрофлоры обеспечивается за счет внесения природных алюмосиликатных минералов – цеолитов, обогащенных необходимым для почвенных микроорганизмов комплексом микроэле ментов. Цеолиты, обладающие, благодаря своей высокопористой структуре, большой площадью активной поверхности, обеспечивают одновременно сорбцию УВ нефти и адгезию клеток нефтеусваивающих микроорганизмов. Такое совмещение в одном объ еме углеводородного субстрата и агентов его утилизации при наличии в почве доста точного количества азота, фосфора и микроэлементов способствует формированию в загрязненном грунте центров активной деструкции веществ-загрязнителей. Кроме того, используемая в рамках технологии схема внесения минеральных удобрений, разрабо танная с учетом характера и динамики естественных микробиологических процессов в очищаемой почве, способствует поддержанию этих процессов на максимально высоком уровне, тем самым значительно сокращая сроки очистки почвы и позволяя существенно (более чем в 3 – 4 раза) уменьшить расход дорогостоящих азотных удобрений.
5.2. Эффективность применения природных цеолитов для ускорения очистки нефтезагрязненных почв. Применение цеолитов различных месторождений (Шивыр туйского (Красноярский край), Пегасского (Кемерово) и Чанканайского (Казахстан)) для рекультивации дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы с 10-15%-й исходной степенью загрязнения нефтью в лабораторных и полевых опытах обеспечило 15–24%-е увеличение степени деструкции нефти по сравнению с контролем без цеолита за 2 ме сяца рекультивации. Сравнительный анализ эффективности цеолитов данных месторо ждений показал отсутствие достоверных отличий между ними. Испытания эффективно сти разных фракций цеолита Шивыртуйского и Пегасского месторождений показали, что наибольшее стимулирующее воздействие на скорость деструкции нефтепродуктов (НП) в почве оказывает фракция цеолита, соответствующая 0,8–2,0 мм.
5.3. Экологические преимущества системного применения азотных удобре ний в микробиологической деструкции нефтяных углеводородов в почве. Исследова ние микробиологических процессов в нефтезагрязненной почве показало, что актив ность УОМ находится в прямой зависимости от интенсивности притока в почву атмо сферного азота, осуществляемого азотфиксирующими микроорганизмами (Терещенко и др., 2002). Известно, что внесение даже небольших и средних доз минеральных азотных удобрений приводит к резкому ингибированию процессов биологической азотфикса ции.
В модельном опыте 1 исследовали влияние различных доз и сроков внесения азотных минеральных удобрений на активность азотфиксирующей микрофлоры и ско рость процессов биодеструкции нефти. Вопреки существующим представлениям о сти мулирующем влиянии азотных удобрений на углеводородокисляющую микрофлору (УОМ) данные микробиологического анализа почвы выявили обратную зависимость между численностью УОМ в почве и количеством внесенных минеральных удобрений по вариантам опыта. Так, например, наименьшая численность УОМ была зафиксирова на в варианте с максимальной стартовой дозой внесения удобрений (1т/га), а наиболь шая – в варианте с минимальной стартовой дозой удобрений (150 кг/га) (рис.15 а). Ана лиз динамики численности активных клеток азотобактера также свидетельствует об об ратной зависимости между данным показателем и стартовой дозой азотных удобрений.
При этом максимальная численность на протяжении всего периода наблюдений отме чалась в варианте с минимальной стартовой дозой удобрений. В варианте с максималь но высокой дозой азотобактер вовсе не был обнаружен (рис. 15 б).
Применение высокой стартовой дозы удобрений способствует созданию в нефте загрязненной почве условий активного протекания диссимиляционной нитратредукции и, как следствие, интенсивному выбросу молекулярного азота в атмосферу (рис. 16 а).
Если принять во внимание низкий уровень азотфиксации в данном варианте, то можно предположить, что применение больших стартовых доз минеральных удобрений не только не способствует устранению лимитирования почвы по азоту, но и приводит к значительным непроизводительным потерям азота минеральных удобрений вследствие усиленно протекающей денитрификации. При этом одним из основных продуктов де нитрификации является закись азота, которая, как известно, входит в состав парнико вых газов.
а б Рисунок 15 – Динамика общей численности УОМ (а) и активности азотобактера (б) в почве вариантов опыта Примечание. 1 – 1-й вариант (1 т/га);
2 – 2-й вариант (250 кг/га + 250 кг/га через месяц);
3 – 3-й вариант (150 кг/га + 150 кг/га через 1 месяц) Анализ содержания остаточной нефти в почве показал, что уже в начальный пе риод наблюдений в варианте с максимально высокой стартовой дозой удобрений отме чалось довольно резкое снижение содержания НП в почве (рис. 16 б). В вариантах с минимальными стартовыми дозами удобрений снижение содержания НП в начальный период было менее заметным. Однако, начиная примерно с 10-15-х суток опыта, в дан ных вариантах наблюдалось ускорение темпов биодеструкции нефти, что привело в ко нечном итоге к довольно существенному снижению содержания НП, в то время как в варианте с максимальной стартовой дозой внесения минеральных удобрений содержа ние НП оставалось на прежнем уровне. Наибольшая степень деструкции нефти при этом была достигнута в варианте с наименьшей дозой удобрений (рис. 16 б).