Система совершенствования сортимента садовых растений методами генетической инженерии
Институт биоорганической химии
им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Станция искусственного климата «Биотрон»
На правах рукописи
ДОЛГОВ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
Система совершенствования сортимента садовых растений методами
генетической инженерии
03.01.06. – Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2011
Официальные оппоненты:
Доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Высоцкий Валерий Александрович, Доктор биологических наук, профессор, Хрусталева Людмила Ивановна.
Доктор биологических наук, член-корр. РАН Лукьянов Сергей Анатольевич
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН.
Защита диссертации состоится « » 2011 г., в часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42, Тел (495)976-65-44, Факс: (495) 977-09-47;
e-mail;
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.
Автореферат разослан « » 2011 г.
Ученый секретарь Диссертационнго совета Д.006.027. Кандидат биологических наук С.А.Меликова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. По данным FAO к 2030 году ожидается увеличение населения планеты до 8 – 10 миллиардов. В связи с этим в 21-ом веке человечество столкнется с рядом новых трудностей, для решения которых потребуются принципиально новые подходы. Основная проблема, ожидающая человечество в ближайшие десятилетия – продовольственная. Эффективность современного сельскохозяйственного производства не позволит удовлетворить постоянно растущие потребности человечества.
Несмотря на огромные достижения традиционной селекции растений, некоторые проблемы сельского хозяйства решить такими методами невозможно или очень сложно.
Хотя селекция ведется уже несколько тысяч лет, но ее общий принцип фактически остался прежним: скрещивание разнородных в генетическом отношении форм и последующий отбор в гибридном потомстве экземпляров с набором желательных признаков. Таким способом происходит совершенствование существующих культур за счет придания им новых ценных качеств. Но этот метод обладает несколькими недостатками, а именно:
продолжительностью селекционного процесса, случайностью комбинирования генов в результате рекомбинации, низким выходом нужных генотипов, невозможностью переноса признаков из филогенетически отдаленных видов, потребностью в больших площадях, зависимостью от времени года.
С развитием биологической науки, в селекции, кроме обычного скрещивания, стали использовать и другие методы, такие как мутагенез, клеточная селекция и вегетативная, или соматическая гибридизация. Но, несмотря на возлагавшиеся надежды, все эти методы не произвели ожидавшейся “революции” в селекции сельскохозяйственных культур. Мутагенез характеризуется случайностью мутаций и, как правило, полученные формы растений обладают пониженной жизнеспособностью.
Клеточная селекция направлена на реализацию признаков, уже заложенных в геноме исходных форм. Вегетативная, или соматическая гибридизация (слияние протопластов) позволяет преодолеть нескрещиваемость неродственных видов, но сочетание родительских признаков у получаемых форм так же случайно. Введение же определенного гена в организм с минимальным нарушением его генотипа стало возможным лишь с развитием методов генной инженерии.
Генная инженерия – это перенос генов, выделенных из одних организмов, в другие.
Главное преимущество генной инженерии в том, что она позволяет перенести отдельный ген, отвечающей за конкретный признак, что исключает случайные комбинации признаков и разрушение уже сложившегося и вполне удовлетворительного генотипа.
Универсальность генетического кода позволяет использовать гены, выделенные из любых организмов. Таким образом, становится возможным получение признаков недостижимых методами традиционной селекции, например, получить голубую розу. Опираясь на достижения молекулярной биологии и используя технику “in vitro” становится достижимой цель селекционеров – изменение единственного признака без нарушения сложившегося генотипа сорта. Комбинация методов генетической инженерии и традиционных способов селекции позволяет эффективно объединять полезные признаки, вносимые гетерологичным генетическим материалом и комплекс уникальных сортовых признаков, созданных многолетним трудом селекционеров. В мировой практике в настоящее время уже накоплен большой опыт генно-инженерного модифицирования сельскохозяйственных культур, приобретших после создания или повышения естественной устойчивости к болезням, вредителям и абиотическим стрессам повышенную продуктивность а также улучшенное качество продукции. Трансгенные растения становятся своебразными «растительными фабриками» для производства как препаратов медицинского назначения (антитела, съедобные вакцины и т.п.), так и сырья для биотехнологической промышленности например биодеградабельного пластика или паутинного шелка. Более того, по мере расширения генно-инженерных программ, в практическое использование вовлекаются все новые и новые гены, придающие растениям новые, иногда необычные свойства. Одним из ярких примеров создания по сути новой культуры явилось получение коллективом ученых возглавляемым Инго Потрикусом так называемого «Золотого риса», способного как синтезировать провитамин А, так и аккумулировать достаточное для полноценного питания количество железа. Таким образом генно-инженерным методом удалось преодолеть основные недостатки этой основной для миллиардов людей продовольственной культуры и достичь сбалансированного состава ее питательных компонентов.
Технология генетического модифицирования растений впервые была разработана в середине 80-х годов в целях получения новых трансгенных сельскохозяйственных культур с улучшенными агрономическими характеристиками. Наиболее ярким показателем эффективности технологии генетического модифицирования (молекулярной селекции) являются данные о возделываемых площадях генетически модифицированных (ГМ) культур. Они также отражают темпы коммерциализации научных разработок в этой сфере и их внедрения в производство. Ежегодно на протяжении последних лет США, Бразилия, Аргентина, Канада и Китай являются странами, в которых возделывается подавляющая часть ГМ культур, таких как соя, кукуруза, хлопчатник и рапс. По данным на 2010 год мировая площадь угодий под ГМ культурами составила 148 миллионов га (James, 2011).
Прирост по сравнению с 2009 годом составил 10% или 14 млн. га, а по сравнению с годом площадь под ГМ культурами возросла более чем в 87 раз (от 1.7 до 148 млн. га).
Ведущими ГМ культурами по итогам 2010 года стали: соя – 53% (65.8 млн.га), кукуруза – 30% (37.3 млн.га), хлопчатник – 12% (15.5 млн.га), рапс – 5% (5.9 млн.га). На протяжении периода с 1996 до 2008 года устойчивость к гербицидам являлась неизменно ведущей новой агрономической характеристикой всех ГМ культур, после которой следует устойчивость к насекомым обусловленная Bt-токсином. Так, в 2001 году соя, кукуруза и хлопчатник, устойчивые к гербицидам, занимали 63% (79 млн.га) общей мировой площади ГМ культур, а культуры с геном Bt-токсина - 15% (19.1 млн.га), сорта с двумя тремя признаками 22% (26.9 млн.га)(James, 2009).
Все приведенные выше статистические данные относятся исключительно к ГМ культурам, которые уже запущены в масштабное производство. Однако этих данных недостаточно для формирования полной картины скорости развития этой сферы знания, а также прогнозирования ожидаемых изменений в мировой сельскохозяйственной индустрии. Эти недостатки компенсируются широко доступной информацией о проводимых в мире полевых испытаниях трансгенных культур. Так, лидирующее место в мире по числу всех ежегодно проводимых полевых испытаний занимают США: с 1987 до 1998 гг общее их число возросло в 120 раз с 9 до 1086, в последующие годы оно равнялось 982 (1999 г), 882 (2000 г), 1111 (2001 г), 845 (2002 г). Из них на долю кукурузы приходится 4049, хлопчатника – 590, картофеля – 777, табака – 227. Необходимо также отметить, что ГМ формы таких ведущих плодово-ягодные культур как яблоня, груша, виноград и земляника по данным департамента сельского хозяйства США также успешно проходят стадию полевых испытаний: яблоня – 62, груша – 10, виноград – 80, земляника – 67 (FTR Database of USA).
Одним из основных направлений, где успешно применяется генетическая инженерия стало решение проблемы устойчивости к насекомым вредителям. В настоящее время в этой области достигнут значительный прогресс, гены, отвечающие за устойчивость к болезням и вредителям, клонированы, охарактеризованы и уже получены трансгенные растения. Одним из первых в растения был перенесен ген Bt-токсина Bacillus thuringiensis, широко применяющегося с 60-х годов инсектицида биологического происхождения (Perlak и др.,1990). Этот инсектицид обладает узконаправленной токсичностью к насекомым и является безвредным по отношению к животным и человеку. Поскольку ген имеет бактериальное происхождение, то экспрессия его в растениях недостаточна для эффективного подавления развития насекомых (тысячные доли трансгенного токсина от тотального белка растительной клетки). В связи с этим были проделаны успешные работы по оптимизации нуклеотидного состава, что позволило увеличить экспрессию в сотни раз. В последние годы уровень экспрессии нативных генов Bt-токсина Bacillus thuringiensis в растениях достигнут путем увеличения в тысячи раз копийности гена при переносе его в хлоропласты биолистическим методом (Mc Bridge и др.,1995).
Другой областью, в которой достигнуты значительные успехи, стала защита растений от вирусных заболеваний (Smith и др.,1994;
Nelson и др.,1988). Потери продукции от вирусных заболеваний весьма ощутимы, особенно в отношении тех культур, которые размножаются вегетативно. Открытие в 2000е годы феномена РНК интерференции открывает возможности создания форм растений высокоустойчивых к большинству известных фитовирусов.
В последние годы появляется все больше и больше работ по использованию в селекции плодовых культур методов генной инженерии, которые позволяют преодолеть многие недостатки и ограничения традиционной селекции. Помимо прочих, в отношении плодовых культур генная инженерия обладает еще одним преимуществом. Мировое производство некоторых из наиболее экономически важных плодовых культур умеренной и субтропической зон основано на выращивании всего нескольких сортов. Эти сорта в основном удовлетворяют производителей и потребителей и их замена на новые, более лучшие, сорта идет очень медленно. Идеальным вариантом в этом случае было бы улучшение в привычных сортах только одного или нескольких признаков. К сожалению, этого не удается достичь с помощью традиционной селекции, но вполне возможно добиться методами генной инженерии. В настоящее время коммерчески возделывается в США устойчивая к вирусу папайя и в 2010 году получено разрешение на выращивание там же вирусоустойчивой сливы.
Исторически селекционная работа с культурными растениями всегда была направлена на увеличение урожайности, устойчивости к насекомым, повышение качества продукции, а также ее привлекательности для покупателя, что имеет особую актуальность в производстве продукции цветоводства. Усилия селекционеров в декоративном растениеводстве в основном направлены на изменение эстетических качеств – цвета, формы, аромата, на продолжительности жизни после срезки.
Наиболее привлекательная часть растения – это цветок. В идеале горшечное растение - это плотная шапка цветов, покрывающая зеленую часть растения.
Фитогормоны играют важную роль в контроле размера и формы растения. Соотношение ауксины:цитокинины может быть изменено в трансгенных растениях экспрессирующих онкогены из Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens или Ri-плазмид A.rhizogenes.
Например, констутивная экспрессия rolC гена, кодирующего цитокинин- -глюкозидазу из Ri-плазмиды привели к повышению уровня цитокининов, изменению архитектуры ряда растений.
Таким образом, технология генетического модифицирования нашла широкое применение в создании новых форм сельскохозяйственных культур с улучшенными характеристиками. Более того, в ближайшее десятилетие будет не только продолжаться рост площади мировых с/х угодий занятых ГМ культурами, но и принципиально расширится видовой ассортимент возделываемых культур.
Исходя из вышеизложенного, проблема разработки методов молекулярной селекции, в первую очередь генетической трансформации, и создание трансгенных сортов основных сельскохозяйственных культур России приобретает стратегическое значение с точки зрения продовольственной безопасности и независимости, а владение современными методами биотехнологии и диагностики растений является основой для предотвращения превращения России в свалку отходов биотехнологической индустрии развитых стран.
Цель исследований. Целью исследований являлась разработка генно-инженерных методов улучшения хозяйственно-ценных признаков садовых растений.
В ходе исследования решались следующие задачи:
• достижение эффективной регенерации садовых растений из соматических тканей;
• создание векторных систем для переноса и экспрессии гетерологичных генов в садовые растения и разработка методов их трансформации на основе подбора вирулентных штаммов и селективных агентов;
• оценка влияния присутствия растительного интрона и сигналов клеточной компартментализации на уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях;
• изучения влияния экспрессии гена RolC на архитектуру и физиологию трансгенных растений на примере хризантемы и актинидии;
• экспрессия гена bar в клоновых подвоях плодовых культур (яблони и груши) с целью получения растений устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина • оценка влияния модификации гипервариабельной области гена bt токсина CryIAb на изменения спектра его токсичности;
• создание векторных конструкций для переноса в растения гена thaumaninII и изучение влияния его экспрессии на устойчивость к патогенам и вкусовые качества плодов трансгенных растений;
• получение растений устойчивых к поражению вирусами с использованием постранскрипционного замалчивания генов;
• проведение полевых испытаний полученных трансгенных растений на проявление перенесенных признаков.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основе оптимизации состава питательных сред, источников эксплантов и условий культивирования разработана методика эффективной адвентивной регенерации побегов из соматических тканей декоративных, ягодных и плодовых культур, эффективность, которой, в частности для косточковых культур, значительно превосходит результаты, достигнутые другими исследователями.
Разработаны схемы негативной селекции по степени устойчивости к антибиотикам (канамицин, гигромицин, генетицин) и позитивной селекции на маннозе в том числе впервые для косточковых культур на примере вишни и культурного сорта сливы.
Проведен сравнительный анализ эффективности селекции трансформантов с различными селективными маркерными генами: nptII, hpt и pmi. Впервые при трансформации соматических тканей древесных были получены трансгенные растения с использованием метода позитивной селекции без генов устойчивости к антибиотикам.
Показано положительное влияние присутствия растительного интрона PIV2 в конструкции гетерологичного гена на уровень и стабильность его экспрессии в вегетативных и генеративных тканях земляники, яблони и груши. Впервые показана возможность использования различных лидерных последовательностей клонированных из травянистых видов растений, кодирующих сигнальные пептиды, для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях косточковых культур на примере сливы.
Впервые получены трансгенные растения актинидии коломикты, трансформированные селективными генами nptII, hpt и, впервые, геном rolC A. rhizogenes.
Изучены некоторые морфологические особенности rolС - трансформантов актинидии, впервые изучено содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида), ИУК и АБК в растениях актинидии коломикты, трансформированных геном rolC.
Показано стабильное изменение гормонального статуса rolC-трансформантов актинидии по сравнению с нетрансформированными растениями. Показана потенциальная возможность изменения габитуса надземной части древесных растений посредством переноса в их геном гена rolC из A. rhizogenes.
Показано изменение гормонального статуса rolC-трансформантов хризантем сорта White Snowdon, предположительно являющегося причиной изменения: архитектуры растений;
cтруктуры генеративных органов;
морфологии пыльцевых зерен – ведущее к потере фертильности. Показана возможность использовать rolC гена в практическом цветоводстве для получения горшечных и декоративных форм у вегетативно размножающихся культур. При изучении изменений, вызванных экспрессией в растениях гена rolC из A.rhizogenes в хризантемах обнаружено присутствие гомологичных rolC гену последовательностей в геноме ряда сортов хризантем.
Впервые получены трансгенные растения хризантемы, экспрессирующие укороченный ген -эндотоксина Cry1Ab1. Впервые достоверно установлена токсичность продуктов генов -эндотоксина для нового класса членистоногих – акарид при их экспрессии в трансгенном растении.
Осуществлена трансформация клоновых подвоев яблони и груши геном обуславливающим устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина и показана устойчивость полученных форм к высоким дозам коммерческих препаратов гербицидов в полевых условиях.
Впервые получены трансгенные растения земляники садовой яблони и груши с геном thaumatinII. Показано положительное влияние экспрессии тауматина на устойчивость к фитопатогену Botrytis cinerea на примере земляники. Достигнуто улучшения вкуса плодов у нескольких линий земляники, яблони и груши с экспрессией тауматина. Впервые в России проведены полевые испытания ГМ растений земляники?
яблони и груши. По результатам молекулярно-генетических анализов, биологического тестирования и полевых испытаний среди трансгенных клонов, содержащих ген thaumatin II, отобраны перспективные линии с улучшенным вкусом плодов и повышенной устойчивостью к Botrytis cinerea. Отобранные перспективные линии с геном thaumatin II обладают улучшенными агрономическими характеристиками.
На основе использование феномена РНК интерференции и разработанных оригинальных методиках трансформации косточковых культур получены трансгенные линии культурного сорта сливы устойчивые к вирусу Шарки (PPV).
Полученные формы трансгенных растений прошли испытания в полевых условиях и продемонстрировали достоверное изменение агрономических характеристик обусловленное экспрессией гетерологичных генов и могут далее внедряться в с/х производство или использоваться в качестве исходного материала в традиционных селекционных программах.
Апробация работы основные результаты исследований доложены на международных научных конгрессах: 10th FESPP Congress “From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach” Firenze, Italy, September, 1996;
XXV International Horticultural Congress Brussels, Benelux, August, 1998;
EUCARPIA XV-th General Congress for Crop Quality and resistance, Veterbo, Italy, September, 1998;
Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". – Москва, (2003, 2005, 2007);
XVth International plant protection congress. Beijing, China, May, 2004;
11th IAPTC&В Сongress Biotechnology and sustainable agriculture 2006 and beyond Beijing, China, August, 2006;
9-th International Plant Molecular Biology Congress, St.Louis, Missouri, USA,October, 2009;
12th IAPB Congress, St.Louis, Missouri, USA, June 2010;
28th International Horticultural Congress.
Lisboa, Portugal, August 2010;
2-й Международный Конгресс "ЕвразияБио-2010" Москва, Россия, апрель, 2010. симпозиумах и конференциях: EUCARPIA 19-th International Symposium Improvement of Ornamental Plants, Angers, France, July, 1998;
Symposium of Fruit Breeding and Genetics, Dresden, Germany, September, 1999;
VIII International Pear Symposium, Ferrara-Bologna, September, 2000;
International Symposium on Asian Pears, Tottori, Japan, August, 2001;
EUCARPIA 19-th International Symposium of Fruit Breeding and Genetics, Angers, France, September, 2003;
Industrial microbiology and biotechnology conference. Anaheim, CA, USA, July, 2004;
5th International strawberry symposium. Coolum Beach, Queensland, Australia, September, 2004;
ISHS International Symposium Genetic modifications- Challenges and Opportunities for horticulture in the world. Shi, Norway, September 2007;
I International Symposium on Biotechnology of Fruit species. Dresden, Germany, September, 2008;
First Symposium on Horticulture in Europe. Vienna, Austria, February 2008;
21st International conference on virus and other graft transmissible diseases of fruit crops" Neustadt, Germany, July 2009.;
International Symposium on Plum pox virus, Sofia, Bulgaria September, 2010;
XI International Pear Symposium. Rio Negro Valley of Argentina, November 2010.
Объем и структура диссертации. Диссертация в виде научного доклада изложена на страницах, иллюстрирована 20 таблицами и 23 рисунками, состоит из разделов «
Общая характеристика работы
», «Объекты и методы исследований», «Результаты исследований», «Выводы», списка работ по теме диссертации, включающего 58 статей в ведущих российских и зарубежных рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки, 3 патентов и 1 заявку, на которую получено положительное решение.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований. В экспериментах по регенерации и генетической трансформации садовых растений использовались сорта и подвои следующих культур:
-яблони домашней (Malus domestica L.): гибрид селекции ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, Мичуринск, клоновый слаборослый подвой № 57-545 селекции профессора В.И.Будаговского, Плодоовощной институт им.
И.В.Мичурина, Мичуринск;
-груши обыкновенной (Pyrus communis L.): Надежда, Чижовская, Москвичка, Лада, Академическая селекции Московской сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева, Память Яковлева, Осенняя Яковлева селекции ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им.И.В.Мичурина, г.Мичуринск, Космическая селекции Всесоюзного научно-исследовательского института садоводства им.И.В.Мичурина, г.Мичуринск, Бураковка сорт белорусской народной селекции, клоновые подвои ГП № 217, ГП № 218 селекции Всесоюзного научно-исследовательского института садоводства им.И.В.Мичурина, г.Мичуринск.
-хризантемы (Chrysanthemum morifolium Ramat.): 32 сорта из коллекции Латвийского Ботанического сада (ЛБС) (Саласпилс, Латвия) и “in vitro” коллекцией, любезно предоставленной сотрудницей кафедра вирусологии Московского государственного Университета Берзиной А.Г. и директором ЛБС К. Буйвидисом;
-вишни (Cerasus vulgaris Mill.): шесть промышленных сортов и вишне-черешневый гибрид Cerasus fruticosa Cerasus avium, полученный во ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина;
Мичуринск;
-земляники садовой (Fragaria ananassa): сорт Фейерверк селекции Зубова А.А., ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина;
Мичуринск, сорт Селекта канадской селекции.
-гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L): 17 различных сортов относящихся к двум наиболее распространнным садовым группам мелкоцветных (Spray) и крупноцветных (Standart) гвоздик (в работе сортам присвоены номера от Dia1 до Dia33);
-актинидии коломикты (Actinidia kolomicta ) из коллекции ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина;
Мичуринск;
-сливы домашней (Prunus domestica): Ренклод колхозный, Ренклод Харитоновой, Венгерка итальянская, Ода, Синеокая, Радость, Евразия 21, Заречная ранняя, Этюд, Стартовая.
Для экспериментов по регенерации и трансформации использовали листья с укорененных in vitro растений, которые находились на среде для укоренения в течение 1,5-2 месяцев. Для регенерации брали молодые, но полностью развернутые листья. У листьев удаляли черешки (которые также использовали в качестве эксплантов) и верхушки (у крупных листьев – также и боковые стороны) и наносили несколько надрезов перпендикулярно центральной жилке, не доводя их до краев листа. Подготовленные таким образом экспланты помещали апоксиальной стороной на поверхность питательной среды для регенерации. Регенерацию проводили в чашках Петри размером 90х15 мм, которые содержали 30 мл среды. В каждую чашку помещали по 8-15 эксплантов в зависимости от культуры.
Агробактериальные штаммы и векторы Для трансформации применяли следующие штаммы A. tumefaciens:
1) Необезоруженный супервирулентный штамм A281 с бинарным вектором pBTP 2) обезоруженный штамм GV3101 c бинарным вектором pPCV002rolC.
обезоруженные супервирулентные:
3) CBE21 (Revenkova et al., 1993) с бинарными векторами pBI121, pBIThau35, и pBIBar;
4) EHA105 (Hood et al., 1993) с бинарным вектором p35S GUSintron;
5) AGL0 созданный на основе А281 в центре PRI (Вагенинген, Нидерланды).
Трансформацию проводили следующими бинарными векторами:
1) pBI121 –с маркерными генами gus и nptII (Jefferson et al., 1987).
2) pVec035SGUSint –с геном gus, с модифицированным интроном PIV2 из картофельного гена ST-LS1 в своей 5 -концевой части (Vancanneyt et al., 1990). Вектор был создан “Rhone-Poulenc Agrochimie” (Франция) и любезно предоставлен центром «Биоинженерии» РАН, д.б.н. А.К.Гапоненко.
3) pBIThau35 – с геном cуперсладкого белка thaumatin II из тропического растения Thaumatococcus daniellii Benth. и маркерным геном nptII.
4) pGAGFP-AFVY –с маркерным кодон-оптимизированным геном зеленого флуоресцентного белка (m-gfp5).
5) pBin35SmGFP5-ER – с маркерным кодон-оптимизированным геном зеленого флуоресцентного белка (m-gfp5) фланкированным лидерными последовательностями из хитиназы арабидопсиса.
6) рBIBar –с модифицированным геном bar из S.hygroscopicus, любезно предоставлен проф. К.Г.Скрябиным (центр «Биоинженерия» РАН).
pBTP41 несущим укороченный фрагмент гена токсина Cry IAbI под контролем 7) 35S CaMV промотора (Рукавцова, 1994).
pPCV002 несущим ген rolC (Spena et al.,1987) под контролем 35S CaMV 8) промотора.
pPCV730 создан в лаборатории Д.Шелла Институт Макса Планка г.Кельн и 9) любезно предоставлен Н.И.Стрижовым.
10) pNov35SGFP – с маркерным кодон-оптимизированным геном зеленого флуоресцентного белка (gfp). Для селекции регенерантов на маннозе вектор содержит ген фосфоманнозоизомеразы (pmi) из E.coli под контролем CMPS промотора (cestrium yellow leaf curling virus). Плазмида создана на станции искусственного климата ”Биотрон”, ФИБХ РАН (Пушин А.С.), на основе вектора pNov2819, любезно предоставленного фирмой ”Syngenta”.
11) pCamPPVcp – бинарный вектор содержит ген белка оболочки вируса оспы сливы (PPV-CP) в прямой ориентации.
12) pCamPPVRNAi–содержит фрагменты гена белка оболочки вируса оспы сливы в обратной и прямой ориентациях, разделенных pdk – интроном (из вектора pHANNIBAL),.
Вектор был создан О.А. Шульгой в лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ.
13) pCam35SGFP –содержит маркерный кодон-оптимизированный ген зеленого флуоресцентного белка (m-gfp5) под контролем CaMV35S промотора и Tnos терминатора и кодон-оптимизированный ген bar из Streptomyces hygroscopicus.
Методы анализа трансгенных растений. Определение агропина и активности NPT-II проводили согласно методике описанной Дж.Драйпером (1991). Гистохимическое и флюориметрическое определение активности GUS проводилось по методике Jefferson (1987). Гистохимическое определение GUS активности проводили с использованием 5 бром-4-хлор-3-индолилглюкуронида (Х-GLUC, Duchefa).
Содержание фитогормонов определяли при помощи твердофазного иммуноферментного метода. Использовали готовые наборы реактивов для определения фитогормонов (АО “Уралинвест” Уфа).
Выделение ДНК проводилось по модифицированному нами протоколу. За основу бралась стандартная методика Rogers и Benedich (1994) с применением 2х СТАВ-буфера.
В качестве зонда для гибридизации по Саузерну использовали ДНК плазмиды pRTBt 90, содержащую ген bt-токсина. Растительную ДНК выделяли с протеиназой К (Драйпер, 1991) и очищали в градиент CsCl.
Линии, полученные с помощью любой из использованных векторных конструкций, анализировались двумя парами праймеров: на вставку селективного маркера (nptII, hpt или pmi) и на вставку смыслового (rolC, thauII, bar, PPVcp) или репортерного генов (gus, gfp).
Иммунологическое определение содержания -эндотоксина и тауматина II в вегетативных тканях (листьях) и плодах трансгенных растений анализировались методом Western-блоттинга по модифицированному протоколу Faus et al. (1996). Для снижения уровня пигментов и полифенольных компонентов, ухудшающих эффективность иммунодетекции, экстракты из гомогенизированной листовой ткани переосаждались ацетоном и вновь растворялись в экстракционном буфере. Иммунодетекция проводилась поликлональными кроличьими антителами, полученными с использованием коммерчески доступного препарата тауматина II (Sigma) и очищенного -эндотоксина. Количество рекомбинантных белков в анализируемых образцах оценивалось сканированием мембран с последующей денсиометрией силы сигнала и сравнением с контрольными дорожками чистого тауматина (Sigma).
Анализ содержания пигментов проводили методом тонкослойной хроматографии (Courtney-Gutterson et.al., 1994).
Тест на инсектицидную устойчивость хризантем к паутинному клещу и сподоптере проводили по методикам Plant Research International (PRI) в г.Вагенинген, (Нидерланды).
Влияние чистого препарата тауматина II (Sigma) на прорастание спор Botrytis cinerea оценивалось в камерах Горяева. Трансгенные растения, полученные с помощью векторной конструкции pBIThau35 анализировались на устойчивость к фитопатогену Botrytis cinerea по модифицированной методике Peng и Sutton (1991).
Подсчет фертильных зерен проводился по стандартной методике на временных препаратах: пыльцевые зерна выдерживались в течении 1 минуты в ацетокармине, затем заключались в глицерин, зерна подсчитывались по трансекте, с интервалом в 2 мм, в каждой пробе подсчет доводился до 300 зерен. Для изучения структуры поверхности пыльцы было выполнено напыление платиной, обработанная таким образом пыльца была изучена под сканирующим микроскопом (СЭМ), HITASCI -450A.
Органолептический анализ плодов и устойчивость к гербицидам проводились по общепринятым в селекции плодовых культур методикам.
Полученные данные обрабатывали с помощью дисперсионного анализа:
однофакторного и двухфакторного для неравночисленных комплексов по методу Н.А.Плохинского (1980) и Г.Ф.Лакина (1990). Достоверность различий между вариантами устанавливали методом Шеффе (Лакин, 1980) РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.Разработка методов регенерации садовых растений из соматических тканей.
Любой метод переноса генов в большинстве случаев приводит к получению трансформированных клеток с более-менее удовлетворительной частотой. Значительно сложнее регенерировать из полученных клеток несущих гетерологическую ДНК целые растения и этот этап часто становится лимитирующим фактором в получении трансгенных растений, особенно древесных культур. Поэтому, прежде чем приступать к экспериментам по переносу чужеродных генов в геномы садовых растений, необходимо было разработать методику, позволяющую регенерировать адвентивные побеги из соматических тканей выбранных культур с достаточно высокой частотой (не менее 50%) достаточной для успешных генно-инженерных манипуляций.
Факторы, определяющие адвентивный органогенез и его эффективность можно разделить на две группы. С одной стороны это источник эксплантов используемых для индукции морфогенеза - в первую очередь выбранный генотип, его физиологическое состояние (возраст, фаза онто-морфогенеза, условия культивирования), орган (лист, стебель, корень, лепесток, цветоножка и т.д.). С другой - непосредственно условия проведения экспериментов. Это относится как к методам использования эксплантов (предобработка, ориентация на среде), так и составу культуральных сред (минеральные соли, органические добавки, фитогормоны) и условиям проведения экспериментов (температура, освещенность и т.п.).
В результате проведенных исследований нами разработана эффективная методика регенерации целых растений земляники садовой из листовых эксплантов и выявлены сорта, обладающие высоким регенерационным потенциалом.
Листовые экспланты сортов Фейерверк и Холидей на средах оптимального состава регенерировали адвентивные побеги с частотой более 90% (табл.1). Показатели регенерации этих сортов находились на уровне, достигнутом в работах Nehra et.al. (1989), James et.al. (1990), Toyoda et.al. (1990) к моменту начала наших первых экспериментов по генетической трансформации этой культуры.
Табл. 1. Оптимальный состав сред для регенерации побегов из листовых эксплантов различных сортов земляники.
Гидро Сорт Сред Концентрация лизат Частота Побегов KNO3, а фитогормонов, казеина, мг/л регене- на мг/л мг/л рации, экспланте БАП ИМК ИУК шт.
% Фейер-верк MS 5,0 0,3 - 600 - 96,7 2, Холидей MS 4,0 0,3 - 300 - 93,3 2, Светлячок MS 5,0 0,5 - - - 60,0 1, Урожайная ЦГЛ MS 5,0 0,3 - - - 44,0 1, Рубиновый Кулон MS 2,0 - 0,2 - - 6,7 1, Зенга-Зенгана MS 4,0 1,0 - - 1000 4,0 1, Использование в дальнейших экспериментах тидиазурона (ТДЗ) в качестве цитокинина показало, что среда MS с 5,0 мг/л ТДЗ обеспечивала частоту порядка 99,3 %, при более чем трехкратном повышении среднего число побегов на один регенерирующий эксплант с 1,2 до 4,1.
Разработанная методика регенерации сортов Фейерверк и Селекта была использована в дальнейших работах по генетической трансформации земляники.
Оптимизация ряда факторов, имеющих важное влияние на регенерацию – минерального состава среды, концентрации сахарозы, регуляторов роста растений и предварительной обработки эксплантов позволила достичь высокого уровня индукции морфогенеза из соматических тканей груши. Результаты эксперимента представлены в таблице.
Таблица 2. Влияние оптимизации условий регенерации на способность продуцировать адвентивные побеги из листовых эксплантов у различных генотипов груши Сорт До оптимизации После оптимизации Частота Побегов на Частота Побегов на регене- экспланте, регене- экспланте, рации, % шт. рации, % шт.
Надежда 6.7 3.3 1.0 0.0 96.7 3.3 3.3 0. Чижовская 0 - 93.3 6.7 1.9 0. Москвичка 0 - 80.0 5.8 1.8 0. Лада 0 - 31.1 4.4 1.1 0. Академичес-кая 7.1 3.8 1.0 0.0 4.4 4.4 1.0 0. Бураковка 28.6 7.8 1.4 0.2 100.0 0.0 5.4 0. Память Яковлева 23.3 6.7 1.0 0.0 75.0 7.2 1.4 0. Осенняя Яковлева 0 - 93.3 3.8 1.9 0. Космическая 3.7 3.7 1.0 0.0 73.3 6.7 2.7 0. ГП № 217 15.6 3.4 1.2 0.2 47.5 5.4 1.2 0. ГП № 218 9.1 5.2 1.0 0.0 53.3 7.7 1.4 0. Условия до оптимизации: среда MS, 20 г/л сахарозы, 5 мг/л ТДЗ, 0.5 мг/л НУК, 0.1 мг/л ГК, до помещения на среду экспланты находились в воде.
Условия после оптимизации: среда NN, 30 г/л сахарозы, 3 мг/л ТДЗ, 0.5 мг/л НУК, 0.1 мг/л ГК, до помещения на среду экспланты находились в жидкой среде NN.
Сравнение с результатами, полученными при первоначальных условиях регенерации, показывает, что для большинства сортов регенерация резко возросла.
Увеличение частоты регенерации у большинства сортов свидетельствует о том, что разработанная нами методика регенерации в целом подходит для сортов груши различного генетического происхождения, то есть условия, необходимые для регенерации побегов, должны соответствовать неким требованиям, более-менее общим для различных генотипов.
Большая часть работ по генетической трансформации косточковых плодовых растений проводилась с использованием в качестве исходного материала зародышевых тканей, что объясняется их более высокой морфогенностью отсутствием протоколов эффективной регенерации из соматических клеток. Однако использование материала зиготического происхождения при трансформации древесных культур приводит к получению трансгенных „дичков, агрономические качества которых неприемлемы, что являлось основным препятствием использования биотехнологических и генно инженерных методов в селекции косточковых культур.
Оценка морфогенетического потенциала 5 сортов отечественной селекции и оптимизация состава питательных сред (Табл.3).позволила выявить наиболее отзывчивые формы (Стартовая, Этюд) и достичь достаточно высокого уровня морфогенеза (60-46%) После оптимизации ряда факторов, имеющих важное влияние на регенерацию – минерального состава среды, регуляторов роста растений, возраста листовых эксплантов, возраста укорененных побегов-доноров эксплантов, предварительной обработки эксплантов и добавления в среду кальция пантотената, мы вновь провели оценку морфогенетического потенциала сортов “Стартовая” и ”Этюд”, но уже по новой методике регенерации. Использование оптимальной комбинации условий культивирования позволило повысить частоту регенерации побегов сорта “Стартовая” до 79,4% при той же концентрации фитогормонов.
Таблица 3. Оптимальные концентрации регуляторов роста для индукции морфогенеза из листовых эксплантов различных сортов сливы домашней (Prunus domestica) Побегов на Концентрация Частота регене Сорт экспланте, фитогормонов, мг/л рации, % шт.
Стартовая ТДЗ 4 НУК 0,5 59,5±7,6 2,4±0, Этюд БАП 5 ГК 0,5 ИМК 0,2 46,1±5,7 3,4±0, БАП 4 ИМК 0,5 31,7±6,0 1,7±0, Евразия 21 БАП 4 ИМК 0,2 32,6±5,6 3,3±0, ТДЗ 4 НУК 0,5 33,3±7,0 2,3±0, Радость БАП 4 НУК 0,5 28,4±5,5 1,1±0, БАП 3 НУК 0,2 25,0±5,4 1,3±0, Синеокая БАП 3 НУК 0,5 16,7±4,8 1,2±0, БАП 3 ИМК 0,2 15,9±4,6 2,3±0, В результате проведенных исследований созданы эффективные методики регенерации растений гвоздики (табл.4) и хризантемы из различных типов эксплантов и выявлены сорта, обладающие высоким регенерационным потенциалом. Использование среды МС с 1,0 мл БАП и НУК (Roest и др.,1975) позволило достичь почти 100% регенерации у сортов хризантем Parliament и Promenade тогда как на базовой среде эти частоты составляли соответственно 76 и 71%. Сорт Festival лучше всего регенерировал на среде содержащей 2,0мгл БАП и 0,2мгл НУК (Rout и др.,1997) 74% против 26% в исходном эксперименте.
При использовании укорененных растений в качестве источника листовых эксплантов частота регенерации выше 50% наблюдалась у 35% протестированных сортов, тогда как из листьев отобранных с растений находящихся на стадии размножения только у 14% сортов регенерация происходила со столь высокой частотой. В тоже время только у 13% сортов в первом случае эта частота не превышала 20% против 45% сортов при использовании мультиплицирующих растений в качестве источника листовых дисков. В целом влияние генотипа и физиологического состояния преобладало в определении эффективности процесса регенерации.
Несмотря на многочисленные исследования, проводившиеся с целью выяснения регенерационной способности изолированных листьев разных видов, нет четкого представления о том, какие именно условия оптимальны для инициации и реализации процесса регенерации. Ввиду этого, что разделение растений на формы с высоким и низким морфогенетическим потенциалом по степени способности к морфогенезу в конкретных условиях не может служить достаточным основанием для суждения о наследственной обусловленности способности к регенерации.
Не отрицая значительную роль генотипа, что если какой-либо сорт не образует регенерантов даже при применении ряда модификаций питательных сред, это еще не говорит о том, что неспособность к регенерации у данного сорта генетически детерминирована. Это свидетельствует лишь о том, что определенный эксплант данного сорта не способен к регенерации в конкретных условиях. Очевидно, что регенерационная способность изолированных органов значительно зависит от возраста тканей и целого ряда других факторов, поэтому вопрос заключается не только в том, в какой мере разные виды и сорта растений различаются по способности к корне- и побегообразованию из различных эксплантов, но и в том, в какой мере эта способность зависит от комплекса Таблица 4. Регенерация адвентивных побегов из различных типов экспланта нескольких сортов гвоздики ремонтантной (А - частота регенерации %, Б - количество побегов на экспланте) Листья растений Листья растений Лепестки Междоузлия Сорт in vitro in vivo А Б А Б А Б А Б Dia2 68 5 6.1 0.6 68 5 10.3 3.6 24 3 5.8 0.9 37 8 5.6 1. Dia3 - - 0 0 - 75 4 3.9 0. Dia8 60 5 4.9 0.4 82 5 8.9 3.7 47 9 4.6 2.1 57 8 10.7 8. Dia10 54 6 4.3 0.9 61 5 6.2 2.8 13 3 4.7 1.0 84 6.1 2. Dia12 93 2 7.4 1.6 96 2 12.8 3.4 79 5 4.2 0.9 42 6 7.5 1. Dia15 50 5 3.9 0.4 71 6 4.4 2.0 21 1.4 0.4 41 4 2.7 1. Dia18 - - - 81 11 4.2 0.3 74 3.1 0. условий и какие из них являются наиболее благоприятными для регенерации. Мы согласны с мнением Л.А. Кучеренко (1991) о том, что работы по оптимизации технологии регенерации следует проводить в двух направлениях: 1) разработать базовую технологию, позволяющую получать требуемое количество регенерантов у большинства сортов;
2) вести поиск ключевых этапов в технологии, при изменении которых можно получить регенеранты или повысить их выход у «трудных» сортов.
Достигнутый высокий уровень и стабильность адвентивного морфогенеза большинства изучаемых культур позволила нам перейти на следующем этапе к разработке методов переноса в них гетерологического генетического материала.
2. Создание векторных систем для трансформации садовых растений.
Подбор вирулентных штаммов. Широкая вариабельность в спектре растений «хозяев», наблюдаемая среди штаммов агробактерий, и ограниченная восприимчивость многих садовых растений, в частности яблони (James, 1987) и хризантемы ( ), к агробактериальной инфекции сделало актуальной задачу подбора штаммов, способных трансформировать садовые растения. С целью предварительной оценки вирулентности для яблони, как одной из наиболее важных садовых культур, нами использовались штаммов A.tumefaciens и A.rhizogenes, содержащих Ti и Ri плазмиды различных типов из коллекции лаборатории молекулярно-генетических взаимодействий микроорганизмов с растениями ИБФМ РАН, а также обезоруженный штамм GV3850, содержащий коинтегративный вектор pGV3850Neor с маркером устойчивости к канамицину.
К моменту проведения исследований рядом авторов, в частности J. Anne et al.
(1987), была показана возможность переноса в растительную ткань участка бинарного вектора ограниченного краевыми повторами, без переноса Т-ДНК Ti плазмиды содержащей онкогены и получения таким образом трансгенных растений. Подобный прием находил применение в конце 80-х – начале 90-х годов для трансформации маловосприимчивых к агробактериальной инфекции культур, пока не были созданы и не получили широкого распространения обезоруженные супервирулентные штаммы СВЕ21, серии ЕНА, AGL и позднее Chry5. Как будет показано ниже используя этот подход нам удалось в 1993 году успешно трансформировать и получить трансгенные растения хризантем экспрессирующие белок -эндотоксина Bac. thuringiensis.
В качестве донора в триродительских скрещиваниях использовался штамм E.coli HB101 с плазмидой pPCV730 размером около 8 кв. Реципиентами служили Rifr мутанты агробактериальных штаммов. Плазмида pPCV730 обеспечивала устойчивость трансформированных растительных тканей к антибиотику канамицину. Присутствие плазмиды pPCV730 в полученных штаммах подтверждено выделением щелочным методов и электрофорезом в агарозном геле (рис.1).
Рис.1. Проверка агробактериальных штаммов на присутствие плазмиды pPCV730.
1,10- контроль E.coli с pPCV730, 2- В6, 3 Ach5, 4- 181, 5-A.rhizogenes А4в, 6 A.rhizogenes 8196, 7- 519, 8- А281, 9- 8628.
Полученные таким образом бинарные векторные системы использовались для разработки методов генетической трансформации ряда плодовых культур.
Таблица 5. Вирулентность различных штаммов агробактерий для садовых культур Груша Вишня Яблоня Виноград Штамм/ Коперичка №6 Владимирская Подвой 54-118 Муромец плазмида Обр. Прим Обр. Прим. Образ. Прим. Образ. Прим.
кал. кал калл каллус корни pRi 8196 + +- + корни pRi A4abc + - - + агропин pRi A4b ++ - ++ №8628 октопин + ++ ++ октопин A348 pTi A6 ++ + нопалин pTi 181 + агропин A281 pTi Bo542 +++ C58 pTi B6 - - - pTi Ach5 + + +- + pTi C58 + + - корни опины pTi 519 ++ ++ pTi 518 pTi 137 - + pTi 37400 - - - pTi 532 +++ - - Проведенные исследования показали слабую вирулентность для большинства садовых растений наиболее распространенных штаммов, в частности Ach5, B6 и C58, использованных для получения «обезоруженных» агробактерий- соответственно LBA4404, GV3101 и GV3850 и показали необходимость использования для их трансформации супервирулентных штаммов или их производных, что нашло подтверждение в дальнейших исследованиях. Исключение составляла груша, для которой корневой рак, вызываемый агробактериями, является одним из основных заболеваний.
Влияние различных селективных антибиотиков на частоту и эффективность трансформации. Успех в получении трансгенных растений во многом зависит от удачного выбора селективного агента, позволяющего отобрать возможно большее число трансформированных клеток, которые составляют весьма небольшую часть среди всех клеток экспланта. Селективный агент, используемый для селекции, должен быть токсичным для растительных клеток, но не настолько, чтобы продукты из погибших нетрансформированных клеток убивали соседние трансформированные клетки. Наиболее широко в качестве селективных используются гены nptII и hpt и в этих случаях для отбора применяют антибиотики канамицинового ряда или гигромицин.
Многие растения, в том числе садовые, успешно трансформируются с использованием в качестве селективного агента канамицина. В наших экспериментах при использовании селекции на канамицине эффективность трансформации земляники и актинидии была выше, чем на гигромицине, существенно не отличалась при трансформации хризантем и уступала в 1.5-2 раза при трансформации яблони и груши (табл.6).
Однако использование векторов содержащих селективный ген nptII оказалось безуспешным в экспериментах по трансформации гвоздики и косточковых культурах (вишне, сливе). Трансгенные растения вишни удалось получить, только используя селекцию на гигромицине, что согласуется с литературными данными о трудностях селекции косточковых культур на среде с канамицином (Dolgov S.V.,1999).
В последнее время все большую популярность приобретают альтернативные стратегии, при которых нетрансформированные клетки останавливались в развитии, а трансформированные получали метаболическое преимущество. Такие системы получили название позитивная селекция (galT, xylA, ipt, pmi и др.). Главное преимущество позитивной селекции заключается в отсутствие генов устойчивости к антибиотикам в трансгенных растениях. Использование вектора pNovGFP созданного на основе системы Positech (Syngenta) позволило осуществит приоритетные исследования по получению безмаркерных древесных растений на примере сливы, что имеет особую актуальность для плодовых растений, плоды которых потребляются в свежем виде.
Таблица 6. Эффективность трансформации садовых растений при использовании различных генов селективных маркеров.
Культура Средняя частота трансформации,% nptII (канамицин) hpt(гигромицин) pmi(манноза) Актинидия 8,5 2, Земляника 1,0-5,0 1,7-2, Хризантема 16,0 0, Яблоня Гибр. ЦГЛ 13, Яблоня №57-545 1,5-7,2 8, Груша Бураковка 11,4-59, Груша ГП217 0,4-3,1 6,2-11, Гвоздика 0 11, Вишня 0 6, Слива 0,5 2,2 1, Дальнейшие эксперименты по трансформации целевыми генами подтвердили полученные результаты. Так использование гигромицина (pCam35SGFP) для селекции трансформированных тканей сливы сорта “Стартовая” обеспечивало наибольшую частоту трансформации (2,2%) и сокращало время селекции, тогда как при использовании канамицина максимальная частота трансформации составила 0,5%. При использовании маннозы для позитивной селекции сливы, частота трансформации составила 1,4%, а на генетицине трансгенные линии получить не удалось (Mihaylov et.al 2007).
Репортерные гены Широкое применение находят также и репортерные гены, экспрессию которых можно определить визуально или количественно. Наиболее распространенными из них являются ген gus (uidA) и гены флуоресцирующих (gfp, yfp, rfp, cfp) и люминесцирующих (luxA, luxB, luc) белков. Если детекция продуктов экспрессии gus, luc генов требует добавления субстратов приводящих к гибели анализируемой ткани то ген зеленого флуоресцирующего белка (gfp), клонированный из медузы (Aequora victoria), лишен этого недостатка. Он дает возможность наблюдать экспрессию в интактных тканях и для наблюдения нет необходимости добавления экзогенных субстратов. Использование гена gfp для некоторых культур оказалось намного эффективнее, чем гена gus. Однако у ряда растений - хризантемы, томата и земляники наблюдался достаточно высокий уровень автофлуоресценции практически в том же диапазоне длин волн, что резко снижало возможности использования гена gfp в качестве репортерного. Высокий уровень транзиентной и стабильной экспрессии и легкость детекции позволили наблюдать динамику изменений в уровне экспрессии этого гена на всех стадиях селекции, включая начало каллусогенеза и регенерации побегов. Позднее, удачный выбор репортерного гена gfp был подтвержден высоким уровнем экспрессии GFP в различных тканях полученных трансгенных линий сливы.
Влияние присутствия растительного интрона на уровень и стабильность экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях. Высокий и стабильный уровень экспрессия переносимого гена признака необходим для полноценного проявления кодируемого им хозяйственно-ценного признака и является залогом его успешного коммерческого применения. Одним из способов повышения уровня и стабилизации экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях является присутствие в его последовательности интрона. Обнаружение влияния присутствия интрона в кодирующей последовательности гена на уровень его экспрессии впервые обнаружено при оценке уровней экспрессии репортерных генов gus. Мы также проводили трансформацию двумя генами gus, один из которых содержал интрон, а другой – нет, и оценивали экспрессию этих генов в трансгенных клонах груши, земляники и яблони.
Всего было получено и включено в эксперимент 9 линий грушевого подвоя ГП217, 21 подвоя яблони №57-545 и 12 земляники сорта Фейерверк трансформированных pBI содержащей безинтронный ген gus и соответственно 10, 2, 3 линии с геном содержащим модифицированный интрон PIV2 из картофельного гена ST-LS1 в своей 5 -концевой части.
20 из 23 трансгенных линий клонового подвоя яблони №545 демонстрировали окрашивание листовых пластинок. Количественное измерение GUS активности в течение двух сезонов вегетации в теплице (1998, 1999 гг) показало как разницу между клонами, трансформированными одинаковой конструкцией, так и между ними. Детектируемый уровень активности GUS варьировал от 43 (уровня фоновой активности контрольных растений) до 8830 нМ 4-MU/мин/мг сырого веса листовой ткани у линии трансформированной интрон-содержащей конструкцией (Dolgov et al. 2000).
Флюориметрический анализ экспрессии гена gus, проведенный в 1998 году на тепличных растениях груши, показал, что активность GUS в клонах, трансформированных геном gus с интроном, была в среднем в 2.7 раз выше, чем в растениях с геном без интрона (147 и 54 нМ 4-MU/мин/мг сырого веса). Аналогичные результаты мы получили и в году, после прохождения растениями листопада и периода покоя. Интрон усилил экспрессию репортерного гена в 3.5 раза (162 и 48 нМ 4-MU/мин/мг сырого веса).
Мы также наблюдали различия в стабильности экспрессии генов с интроном и без в листьях трансгенных растений груши на протяжении 5 вегетационных периодов в условиях защищенного грунта и 3 полевых сезонов. Количественный анализ экспрессии гена uidA в тепличных растениях груши проведенный в 1999-2005 гг показал значительное варьирование активности фермента у различных линий (от 100 до 2900 нМ 4-MU/мин/мг).
Несмотря на значительную флуктуацию по годам, полного замолкания гена не наблюдалось. Ранее Fladung et al. (1997) также отмечал редкость этого явления у древесных растений. Сходные результаты наблюдались и у растений в полевых условиях опытного полигона ВНИИСПК (г. Орел). При этом общий уровень экспрессии гена снижался по сравнению с тепличными растениями, что отмечалось и другими авторами (Hawkins et al., 2003). Несмотря на годовые колебания, уровень экспрессии у растений груши содержащих интронированный ген был в несколько раз выше. При этом в условиях защищенного грунта присутствие интрона увеличивало уровень экспрессии в 2.5-3,7 раза тогда как в полевых разница была немного ниже 2,2-3,3 раза (рис.3).
Кроме того, у большинства линий, трансформированных геном gus c интроном, экспрессия сохранилась на прежнем уровне, и даже возросла в полевых условиях. Для линий, содержащих ген без интрона, наблюдалась противоположная картина: экспрессия сохранилась или возросла лишь у трети линий, а у остальных – упала в 2-6 раз, а в одном случае даже до уровня контроля. Таким образом, экспрессия генов с интроном оказалась более стабильной, что особенно важно для многолетних листопадных древесных растений Сходная картина наблюдалась и у трансгенных растений земляники.
Гистохимическое окрашивание листовых пластинок с черешками трансгенных растений земляники показало наличие детектируемой GUS-активности у 10 линий из 12, полученных с помощью векторной конструкции pBI121 (Рис.4). Последующий флюориметрический анализ экстрактов из листовой ткани подтвердил присутствие детектируемой активности -глюкуронидазы в тех же 10 линиях из 12. Между независимыми линиями активность -глюкуронидазы в экстрактах существенно варьировала, максимальный (Ф-6-III-3) и минимальный (Ф-6-III-5) уровни различались приблизительно в 2,8 раз (соответственно 3738 и 1330 нМ 4-MU/мин/мг общего белка).
Из трех независимых трансгенных клонов, полученных с помощью конструкции p35SGUSint, GUS-активность детектировалась только в двух. У клона Ф-45-I-2 G вставка гена gus отсутствовала. Уровни детектируемой GUS-активности в экстрактах листовой ткани для линий Ф-45-I-1 и Ф-45-III-1 составили соответственно 13888 и 19656 нМ 4 MU/мин/мг общего белка, что превышает максимальную GUS-активность в растениях с геном gus без интрона (Ф-6-III-3) в 3,7 и 5,3 раз соответственно (Рис 2).
Усиление экспрессии гетерологичного гена вызываемое присутствием интрона (Intron-mediated enhancement, IME) известно достаточно давно (Callis et al., 1987).
Потенциальные объяснения включают повышение эффективности транскрипции, стабильности иРНК обусловленное сплайсингом, стабильность в процессе экспорта в и т.
д (Сlancy&Hannah;, 2002;
для обзора см. Le Hir at al., 2003), однако до конца механизм не ясен до сих пор. IME варьирует от 2-10 раз у двудольных до более чем 100-раз у однодольных (Сlancy&Hannah;, 2002). Полученные нами результаты подтверждают данные наблюдения и впервые показывают стабильность данной закономерности на протяжении 6 лет в полевых условиях.
Приведенные результаты показывают, что экспрессия чужеродных генов в плодовых и ягодных культурах может быть достаточно постоянной на протяжении нескольких лет, как в тепличных, так и полевых условиях и значительно усиливается в случае использования интрон-содержащих конструкций. Растения при этом не показали каких-либо отличий от нетрансгенного контроля в течение всех лет испытаний.
GUS-активность нМ 4-MU/мин/мг общего белка Контроль Контроль Ф-6-I- Ф-6-I- Ф-6-I- Ф-6-I- Ф-6-III- Ф-6-III- Ф-6-III- Ф-6-III- Ф-6-III- Ф-45-I- Ф-45-I- Ф-45-III- Ф-6-II- Ф-6-II- Ф-6-III- Рис 2. Флюориметрический анализ активности -глюкуронидазы в трансгенных растениях земляники in vitro, полученных с помощью векторных конструкций pBI121 и p35SGUSint.
(нМ 4-MU/мин/мг общего белка).
1800, А 350, Б 1600, 300, 1400, 1200,0 250, 1000, 200, gus gus gus-intron 800,0 gus-intron 150, 600, 100, 400, 50, 200, 0, 0, 2001 2003 1999 2000 2002 2003 Рис.3 Активность -глюкуронидазы в листовой ткани трансгенных клонов груши в теплице (А) и полевых условиях (Б). среднее значение для групп содержащей ген gus без интрона и с интроном (нМ 4-MU/мин/мг сырого веса).
А В Г Б Д Рис 4. Гистохимический анализ GUS-активности в листьях и плодах трансгенных растений земляники садовой:
А – лист с линии Ф-6-III-10;
Б – спелый плод с растения линии Ф-6-III-10;
В – листья с линии Ф-45-III-1;
Г – спелый плод с растения линии Ф-45-III-1;
Д – сравнительный анализ GUS-активности в плодах с растений, содержащих безинтронный (вверху, линия Ф-6-II-1) и интронсодержащий гены gus (внизу, Ф-45-III-1).
Влияние компартментализации на уровень экспрессии маркерного гена gfp в трансгенных растениях сливы. В данном исследовании использовали различные сигнальные пептиды. Вектор pBin35SmGFP5-ER содержал ген gfp c сигнальными последовательностями, кодирующими N-концевой сигнальный пептид и C-концевой тетрапептид HDEL из хитиназы арабидопсиса для локализации продукта экспрессии в эндоплазматическом ретикулуме (ретикулярная форма GFP). Вектор pGAGFP-AFVY содержал ген gfp c аналогичной последовательностью, кодирующей N-концевой сигнальный пептид из хитиназы арабидопсиса и сигнальную последовательность, кодирующую С-концевой сигнальный пептид AFVY из фазеолина фасоли, определяющий накопление белка в вакуолях (вакуолярная форма GFP). Для сравнения использовали трансгенные линии, полученные при трансформации вектором pNovGFP в котором ген gfp не содержал никаких лидерных последовательностей (цитозольная форма GFP). Во всех использованных бинарных векторах ген gfp находился под контролем одинарного CaMV35S промотора. Вектора созданы на станции «Биотрон» А.С.Пушиным.
Полученные результаты продемонстрировали возможность использования лидерных последовательностей из генетически отдаленных видов растений для компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в сливе. Так, при сравнении различных трансгенных линий сливы был обнаружен различный характер экспрессии маркерного гена (рис.5). Также предварительные результаты показали визуально детектируемые различия в уровне экспрессии гена gfp. Линии с ретикулярной формой GFP имели значительно более высокий уровень экспрессии по сравнению с линиями с вакуолярной и цитозольной формами GFP.
Однако было отмечено, что уровень экспрессии GFP сильно варьировал в зависимости от возраста наблюдаемого растительного материала, что заставляет крайне осторожно подходить к оценке уровня экспрессии.
pNovGFP А В Рис. 5. Влияние лидерных последовательностей на характер экспрессии маркерного гена gfp в листьях трансгенных растений. pBin35GFP5-ER-эндоплазматический ретикулум;
pGAGFP-AFVY – вакуоль;
pNovGFP – цитозоль.
A 450-490 nm excitation filter 510 nm FT dichromatic mirror LP 520 nm barrier filter B 450-490 nm excitation filter 510 nm FT dichromatic mirror BP 515-565 nm barrier filter 3.Трансформация садовых растений генами хозяйственно-ценных признаков.
Агротехнические признаки Влияние гена rol C на некоторые морфологические и физиологические показатели трансгенных растений. Возможность изменения формы растения методами генетической инженерии имеет колоссальное значение для цветочной индустрии.
Определение и изучение генов ответственных за рост, развитие и форму растения имеет кроме фундаментального и широкое прикладное значение. Идеальное горшечное растение – это плотная шапка цветов, прикрывающая зеленую часть растения (Mol и др.,1995).
Использование гена rolC вполне возможно в коммерческих целях для получения горшечных форм растений. Роль и воздейстивие rol генов из A.rhizogenes недостаточно ясна, тем не менее, вызываемые фенотипические изменения более значительны, чем генами из A.tumefaciens: уменьшение апикального доминирования, мужская стерильность, усиление корнеобразования и увеличение синтеза ароматических масел (Shmulling и др.,1988;
Fladung и др., 1990;
Pellegrinschi и др., 1994 van der Salm и др.,1997) все это может найти применение в практическом цветоводстве.
Для экспрессии гена rolC использовали сорт хризантемы “White Snowdon”, листовые экспланты которого отобранные с укорененных in vitro растений регенерировали на среде Мурасиге-Скуга, обогащенной 2 мг/л БАП и 0,5мг/л ИУК, с частотой более 90%. После трансформации 38 листовых дисков обезоруженным агробактериальным штаммом GV3101, несущим плазмиду pPCV002 c геном rolC под контролем 35S промотором РНК вируса мозаики цветной капусты были получены 2 линии трансгенных растений. Растения этих линий успешно размножались и укоренялись на среде с высоким содержанием селективного антибиотика канамицина (50 и 10 мг/л соответственно). Частота трансформации составляла приблизительно 3%.
Таблица 7. Морфологические изменения трансгенных растений хризантем экспрессирующих ген rolC из A.rhizogenes Характеристика растения контроль Линия 1 Линия Высота растения (мм) 558,3 24,0 545,0 18,2 441,4 21, Длина междоузлия (мм) 27,1 1,0 30,0 6,4 15,9 0, Кол-во боковых побегов (шт.) 11,7 1,2 12,5 3,4 22,7 3, Диаметр соцветия (мм) 77,3 9,6 76,2 4,6 48,1 5, Количество бутонов (шт) 28,3 3,7 20,6 0,9 128,0 12, Как видно из таблицы 7 и рис. 6, растения одного из трансгенных клонов морфологически резко отличалась от контроля и демонстрировали ярко выраженный rol овый фенотип, признаки которого проявлялись уже на ранних стадиях развития при перенесении растений в теплицу. У растений этой линии наблюдалось 20% снижение высоты с 55 до 44 см, и двукратное укорочение междоузлий с 27-30 до 16 мм по сравнению с контрольными растениями. У трансгенов также происходило подавление апикального доминирования и множественное развитие боковых побегов, количество которых возрастало, в среднем, примерно вдвое с 12-13 до 23 на растение. Наибольшие различия наблюдались по количеству бутонов. Число закладываемых бутонов на трансгенных растениях линии 2 в 4-5 раз превосходило таковое, как у контрольных, так и у фенотипически не измененных растений линии 1 (табл.7) достигая 130 штук на растение при 20-30 на контрольных. Наблюдалась корреляция между увеличением количества бутонов и уменьшением их диаметра (48 мм по сравнения с 77 мм у контрольного растения). Помимо этого произошли изменения боковых язычковых цветов в соцветиях – соотношения ширины к длине. Они стали более широкими, чем контрольные. Листовые пластины трансгенных растений наоборот имели более удлиненную и изрезанную форму.
В период цветения растения этой линии покрывались сплошной плотной шапкой цветов, идеально соответствуя требованиям, предъявляемым к горшечным формам (Mol и др.,1995) (рис. 6А).
В целях подтверждения произошедшей трансформации была проведена полимеразная цепная реакция в присутствии праймеров, специфичных к внутреннему фрагменту гена rolC, однако амплификация фрагмента ожидаемой длины в 514 п.н.
происходило как в трансгенных растениях, так и в контрольных (рис.6В). Подобные результаты описаны для Nicotiana sp. в работе Furner и др., (1986). Он показал присутствие в некоторых видах табака последовательностей, гомологичных rol генам.
Проведенный в дальнейшем ПЦР анализ некоторых других сортов хризантем показал амплификацию внутреннего фрагмента гена rolC во всех исследованных растениях. Для определения встроившегося в нашем эксперименте гена был синтезирован праймер для участка 35S промотора под контролем, которого находилась переносимая нами последовательность. Его добавляли в первую смесь вместе с правым праймером для rolC гена. В этом случае происходил синтез фрагмента размером в 700 пн только на ДНК трансгенных линий (рис.6В).
Б А 1 В.
Рис. 6. А – Растения в теплице: слева – нетрансгенное, справа - растение линии 2;
Б - Скульптура поверхности пыльцевых зерен. Фотографии выполнены на сканирующем электронном микроскопе:
1 – пыльцевые зерна нетрансгенных растений;
2 – пыльцевые зерна линии 2.
В- ПЦР- анализ растений хризантемы сорта White Snowdon на присутствие гена rolC A.rhizogenes: Амплификация последовательности с праймерами на внутренний участок rolC гена (514 п.н.) – 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 дорожки. Амплификация последовательности с праймерами на rolC и 35S промотор (700 п.н.) – 2, 3, 4, 7, 8, 9 дорожки.
1 - молекулярный маркер pGEM2/AluI: фрагменты 679, 666, 521;
2,3,4, – нетрансгенные хризантемы (Bornholm, White Hurricane, Parliament;
5 – нетрансгенные растения сорта White Snowdon;
7,8 – трансгенные растения (линия1, линия2), 9 – плазмида pPCV002 rolC-35S.
Морфологические показатели полученных нами rolC-растений актинидии также существенно отличались от соответствующих показателей контрольных нетрансформированных растений (табл.8). Это, в первую очередь, ослабление роста надземной части и формирование кустовидного габитуса. Средняя высота трансгенных растений была меньше, чем контрольных. RolC-трансформанты уступали контрольным растениям и по суммарной длине ветвей. Среднее количество разветвлений на 1 м суммарной длины ветвей в различных трансгенных линиях актинидии было достоверно больше чем в контроле. Ослабление роста надземной части у трансгенных растений сопровождалось укорачиванием междоузлий, средняя длина междоузлий на ветвях первого порядка у rolC-трансформантов была в 2-8 раз меньше, чем у контрольных растений. На rolC-трансформантах актинидии формировались удлиненные листья с увеличенным отношением длины к ширине. Листья трансгенных растений отличались, также, более бледной окраской по сравнению с контрольными. Отмечено запаздывание в наступлении фенофаз у rolC- трансформантов по сравнению с контрольными растениями.
Изучение стерильности пыльцы контрольных и трансформированных растений выявило значительное различие между ними. Так, доля стерильной пыльцы у растений линии 2 (с успешной интеграцией гена rolС в геном), составляет 98,8 %, в то время как у растений линии 1 (не имеющих фенотипического проявления активности этого гена), 29,1% и 39,1% - у контрольных. Возможно, повышенные показатели стерильности пыльцы у трансгенных растений обусловлены изменением гормонального статуса под действием продуктов гена rolC.
На рис. 6Б представлена пыльца контрольных растений хризантемы: пыльцевые зерна 3-бороздно-оровые, сфероидальные;
в очертании с полюса 3-лопастные, с экватора округлые или широкоэлиптические;
полярная ось 40 мкм, экваториальный диаметр мкм. Борозды длинные, глубокопогруженные, узкие. Оры выпуклые, округлые, 7 мкм в диаметре. Шипы длиной 6-8 мкм, в основании ширококонические, на вершине заостренные, расстояние между верхушками шипов 10-12 мкм. В основании шипов отчетливо видны крупные перфорации. Многие пыльцевые зерна густо облеплены пыльцевым клеем.
Пыльца трансгенных растений имела различную степень нарушений. Нормальная пыльца: пыльцевые зерна линии 1 отличаются элипсоидной формой, сглаженностью шипов или их недоразвитием.
Стерильная пыльца со сглаженной скульптурой поверхности: пыльца растений линии 2 бороздно-оровая, в очертаниях сфероидальная, диаметром 30 мкм. Борозды неглубокие, некоторые не выражены, нередко на месте борозд сохраняется только выпуклая ора, 3,5 мкм. диаметром. Скульптура сглажено-шиповатая, высота шипов 3 мкм, они соединены невысокими гребнями, расстояние между шипами 10 мкм, перфорации не просматриваются.
С целью изучения возможного механизма действия гена rolC нами было определено содержание некоторых фитогормонов в трансгенных растениях актинидии..
В условиях in vitro наблюдалось значительное увеличение содержания фитогормонов в молодых листьях трансгенных растений линии R2 по сравнению с контролем. Особенно резко возросла концентрация ИУК - почти в 10 раз. Содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида) и абсцизовой кислоты в листьях rolC-трансформантов увеличилось соответственно в 5,0 и 7,0 раз по сравнению с контрольными растениями. Однако, несмотря на такие большие различия в содержании эндогенных регуляторов роста, трансгенные растения существенно не отличались по своим морфологическим показателям от контрольных.
Среднее Среднее Суммар Средняя Средняя Средняя длина количество количество ная длина Габитус высота междоузлий на разветвлений разветвлений 3- длина ветвей 3-4 надземной Линия растений,с ветвях 1 на 1 м порядков на 1 м ветвей, порядков,с части м порядка, см суммарной суммарной см м длины ветвей длины ветвей 104,3 392,3 2,4 8,4 5,2 1, Контроль лиановидный R1 55,0 251,6 1,4 16,3 9,9 0,8 кустовидный R2 56,5 302,0 1,2 10,9 6,8 1,0 кустовидный R3 24,0 73,5 0,6 26,0 15,0 0,9 кустовидный R6 24,0 53,1 0,6 24,5 13,2 0,5 кустовидный R7 30,0 173,4 0,7 10,7 5,2 0,6 древовидный R9 41,7 133,6 1,7 13,1 9,7 0,8 кустовидный R10 54,9 179,2 1,3 13,9 8,8 0,8 кустовидный Растения актинидии трансформированные геном rolC R101 8,5 27,2 0,3 43,7 23,9 0,6 древовидный Слева клон R101;
справа контроль Табл. 8. Морфологические особенности растений актинидии коломикты, трансформированных геном rolC.
Таблица 9. Содержание эндогенных фитогормонов в апикальных побегах контрольных и трансгенных растениях хризантемы сорта White Snowdon.
Линия Содержание фитогормонов (нг/г) Зеатин+ Индолилуксусная Абсцизовая кислота зеатинрибозид кислота Закладка бутонов Контроль 3 0,4 306,0 35,0 1,1 0, Клон 1 150,0 10,0 71,0 6,9 4,1 0, Клон 2 250,0 30,2 58,0 7,1 4,0 0, Цветение Контроль Измерения не Измерения не 0,25 0, Клон 1 проводили проводили 10,0 0, Клон 2 100,0 1, Увядание Контроль Измерения не Измерения не 14,9 1, Клон 1 проводили проводили 51,9 7, Клон 2 101,3 12, Некоторые фенотипические особенности rolC-трансформантов напоминают определенные гормональные эффекты, в частности, увеличение соотношения цитокининов к ауксинам (Schmulling et. al., 1988, Spena et.al., 1989). Nilsson et. al. (1993), напротив, считают, что для растений, экспрессирующих ген rolC, характерна тенденция к снижению концентрации активных цитокининов и их предшественников, а не к их увеличению. Наши данные показали уменьшение активных форм цитокининов в трансгенных растениях актинидии коломикты, растущих in vivo. Наблюдавшееся нами резкое возрастание содержания ИУК в апексах может быть обусловлено вторичными эффектами гена rolC и быть связанным с особенностями гормональной регуляции в растениях актинидии коломикты.
Табл. 10. Содержание и соотношение эндогенных фитогормонов в апексах побегов контрольных растений актинидии коломикты и rol C- трансформантов.
Содержание Соотношение фитогормонов, нг/г концентраций Линия фитогормонов Фенотипические изменения З+ЗР ИУК АБК З+ЗР/ИУК З+ЗР/АБ К Контроль 49,6 13,0 27,6 3,8 1,8 нет R2 248,0 134,0 196,1 1,9 1, Одним из объяснений механизма апикального доминирования является предположение об ингибировании прорастания латеральных почек ауксином, базипетально транспортирующимся из апексов побегов (Bangerth, 1989;
Cline, 1991, 1994).
Возможно, что увеличение содержания ИУК в трансформантах является ответом растения на усиление ветвления побегов, вызванное геном rolC. В ранее опубликованных работах разными исследователями приводились противоречивые данные по влиянию трансформации растений геном rolC на их гормональный баланс. Возможно, это происходило оттого, что делались попытки сравнивать результаты исследований, проведнных на разных видах растений, или находящихся на разных фазах онтогенеза.
Поэтому мы провели исследования на одном виде растения, на разных фазах развития. Из полученных нами результатов видно, какое сильное влияние оказывает трансформация растений хризантемы указанной генетической конструкциией на их гормональный баланс в сравнении с исходной формой. При этом бросаются в глаза зависимость в уровне каждого отдельного класса исследованных фитогормонов, соотношения фитогормонов разных классов от фазы развития, а также различий между трансформированными и исходной формами на разных стадиях онтогенеза.
Таким образом, нашими исследованиями показано стабильное изменение гормонального статуса актинидии по сравнению с rolC-трансформантов нетрансформированными растениями. Показана потенциальная возможность изменения габитуса надземной части древесных и декоративных цветочных растений посредством переноса в их геном гена rolC из A. rhizogenes.
Устойчивость к абиотическим факторам внешней среды – гербицидам. Перенос генов устойчивости к гербицидам в плодовые или орехоплодные деревья может оказаться особенно полезным для получения качественного посадочного материала, на что влияет, в частности, наличие сорняков. В питомниках же борьба с сорняками затруднена, так как плодовые растения в молодом возрасте особенно чувствительные к гербицидам, а другие способы трудоемки и недостаточно эффективны. Кроме того, в настоящее время в мире лучшим способом содержания почвы в садах считается сочетание задернения в междурядьях и гербицидного пара в приствольной полосе. Поэтому подвои, устойчивые к гербицидам, идеально подходят для такой системы содержания почвы.
C целью получения трансгенных растений подвоев яблони и груши, обладающих устойчивостью к гербициду четвертого поколения “Basta”, содержащего в качестве действующего вещества фосфинотрицин, и другим аналогичным гербицидам, мы провели несколько экспериментов по переносу гена устойчивости к этому веществу bar в клоновые подвои груши ГП № 217 и яблони 57-545. Агробактериальную трансформацию листовых дисков и черешков подвоев проводили вектором рВIBar в супервирулентном штамме СВЕ21. Образование каллуса у трансформированных эксплантов наблюдалось уже на десятый день культивирования, а регенерация побегов происходила преимущественно на втором месяце культивирования.
После первой трансформации удалось получить 30 регенерантов подвоя яблони и 309 груши (табл.11). Но только одно растение яблони и 17 груши активно росли и укоренялись в присутствии селективного агента. ПЦР анализ подтвердил наличие вставки гена bar в геномы этих 18 регенерантов. Усиление регенерационной способности и образование большого количества «эскейпов» являлось следствием селекции на РРТ, о чем ранее уже отмечали Hebert-Soule et al. (1995). Более эффективным оказалось сочетание селективных агентов или длительное (6 месяцев) пассирование на среде с высоким содержанием (5.0 мг/л) фосфинотрицина (табл.11).
Дальнейшее размножение и укоренение полученных линий мы проводили на средах с различными концентрациями РРТ для определения предельной концентрации селективного агента не вызывающей повреждения или гибель трансгенных растений.
Большинство линий клоновых подвоев без каких-либо повреждений успешно пролиферировали на среде, содержащей до 100мг/л РРТ (табл.12), тогда как контрольные растения погибали при 2-3 мг/л. фосфинотрицина. Трансгенные растения этих линий образовывали корни на среде с содержанием РРТ до 15 мг/л, в то время как контроль также погибал на 2 мг/л. Растения отдельных линий продолжали успешно размножаться при 300 мг/л РРТ в среде, что более чем в сто раз превышает летальную дозу.
Таблица 11. Результаты трансформации подвоев яблони и груши агробактериальным штаммом СВЕ21, +несущим вектор pBIBar Селекция Эксплант Число Общее число Транс Частота Вид мг/л(число эксплантов регенерантов гены трансформ In vitro пассажей/длител ации,% ьность Яблоня 2.0 РТТ (6х4нед) листья 78 30 1 1. 57- Груша 2.0 РТТ (3х4нед) листья 256 14 0 ГП217 черешки 258 48 0 2.0 РТТ (3х4нед) листья 109 59 1 0, 25.0 Км(7х4нед) черешки 98 41 5 5, 2.0 РТТ (3х4нед) листья 123 19 0 5.0 РРТ (6х4нед) черешки 175 73 5 2, листья 166 30 0 черешки 240 136 6 2, Таблица 12. Устойчивость трансгенных линий подвоев яблони и груши к фосфинотрицину в условиях in vitro.
Клон Концентрация фосфинотрицина,мг/л 0 100 200 300 500 750 100 контроль + D P-BK + +/- +/- +/- -- D P-BK2 + + +/- -- D P-BU + +/- -- D P-BU2 + + +/- -- D P-BW + + + -- -- D P-BX + + + -- -- -- -- D T-AP + + -- -- D T-BO + + +/- -- -- D T-BT + + -- -- -- -- D T-CD + + -- D T-CF + -- D T2- AF + + -- D T2- BF + + + +/- -- -- -- D T2- BR + + +/- -- -- -- -- D T2- BS + + + + -- D T2-DE + +/- +/- -- D T2-ES + +/- +/- +/- -- -- -- D +- размножение без поражения;
+/--отсутствие размножения без поражения;
-- -различная степень некроза;
D - гибель растений Трансгенные линии яблони и груши, размноженные в условиях in vitro, были успешно адаптированы к условиям защищенного грунта. Молодые растения яблони и груши были подвергнуты обработке гербицидом «Баста» в различных концентрациях.
Растения трансгенных линий подвоя яблони №57-545 показали высокую степень устойчивости к действию гербицида «Баста». Доза гербицида, рекомендованная производителем, составляет 6 л/га. Однако большинство анализируемых трансгенных линий, за исключением линии груши T-CF, выдерживало дозу, двукратно превышающую рекомендуемую, и только при обработке дозой, четырехкратно превышающей рекомендуемую, у трансгенных линий наблюдались незначительные признаки повреждения листовой поверхности (Таблица 13).
Линия T-CF проявила слабую устойчивость к действию гербицида «Баста», что может быть связано со встраиванием гетерологичных генов в слабо транскрибируемую область генома, либо с повреждением регуляторных элементов генетических конструкций. У трансгенных линий подвоя груши также не было обнаружено признаков действия гербицида даже в очень высоких дозах, в то время как контрольные растения полностью погибали через 12 дней после обработки даже при обработке низкими концентрациями гербицида (Рис. 7).
Таблица 13. Анализ трансгенных линий подвоев яблони и груши на устойчивость к действию гербицида «Баста» в условиях защищенного грунта.
Культура Линия Доза гербицида в пересчете на полевую дозу 3 л/га 6 л/га 12 л/га 24 л/га Яблоня Контроль П П П П P9 ++ ++ ++ + Груша Контроль П П П П н/а P-BK ++ ++ ++ н/а P-BK2 ++ + + P-BU2 ++ ++ + + P-BW ++ ++ ++ + P-BX ++ ++ ++ + T-CD + + +/- н/а T-CF +/- - T2-AF ++ ++ + + T2-BF ++ ++ + +/ T2-BR ++ + - T2-BS ++ ++ +/- +/ T2-DE ++ ++ + н/а T2-ES ++ ++ ++ + - степень устойчивости, П – растения погибли, н/а – не анализировали При обработке растений груши и яблони гербицидом «Либерти» наблюдалась схожая картина.
Поскольку условия открытого и закрытого грунта сильно отличаются, уровень экспрессии гетерологичных генов в оптимальных и стрессовых условиях также может сильно отличаться. Поэтому проведение полевых испытаний является важным этапом необходимым для отбора наиболее перспективных форм трансгенных растений.
Часть клонально размноженных и адаптированных растений подвоев яблони и груши были вовлечены в полевые испытания, которые проводились в 2002-2009 годах на сертифицированном полигоне, созданным на базе карантинного питомника ВНИИСПК, г.