Генетическое разнообразие хантавирусов в популяциях грызунов и насекомоядных азиатской части россии
На правах рукописи
Яшина Людмила Николаевна
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ХАНТАВИРУСОВ В ПОПУЛЯЦИЯХ
ГРЫЗУНОВ И НАСЕКОМОЯДНЫХ АЗИАТСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ
03.01.03 – молекулярная биология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Кольцово - 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Минздравсоцразвития Российской Федерации
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна доктор медицинских наук, профессор Леонова Галина Николаевна доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович
Ведущая организация ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Москва
Защита состоится «_20_» _апреля_2012 г. в _9-00часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского р-на, Новосибирской обл., тел. (383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан «» 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.П. Трошкова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Актуальность темы. Хантавирусы, принадлежащие к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae, широко распространены во многих регионах мира и являются возбудителями двух клинически различных форм заболевания человека: геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в Евразии и хантавирусного легочного синдрома в Северной и Южной Америке (Schmaljohn & Hjelle, 1997). Вирусы Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Dobrava-Belgrade (DOBV) и Seoul (SEOV) вызывают ежегодно до 110 случаев ГЛПС различной тяжести в Евразии (Lee et al., 1990;
Zhang et al., 2010).
ГЛПС занимает одно из первых мест среди природно-очаговых заболеваний человека в России со средней ежегодной регистраций ~7600 случаев.
Инактивированные вакцины для профилактики ГЛПС выпускают и успешно используют только в двух странах - Китае и Корее (Schmaljohn, 2009), в России разрешенные к применению вакцины против ГЛПС отсутствуют (Ткаченко и др., 2009).
Природным резервуаром хантавирусов являются грызуны отряда Rodentia, причем каждый хантавирус ассоциирован с одним или несколькими близкородственными видами (Lee, 1982;
Plyusnin & Morzunov, 2001). В течение последних лет были получены убедительные доказательства того, что природными носителями хантавирусов являются не только грызуны, но и насекомоядные отряда Soricimorpha (Song et al., 2007;
Kang et al., 2009).
Распространение хантавирусов в популяциях насекомоядных носителей и возможность инфицирования этими вирусами человека остаются важными нерешенными задачами.
Хантавирусы имеют одноцепочечный сегментированный РНК геном отрицательной полярности, состоящий из большого, среднего и малого сегментов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу, предшественник двух оболочечных гликопротеинов и нуклеокапсидный белок, соответственно.
Одним из критериев дифференциации видов хантавирусов является уровень различия в последовательностях среднего и малого сегментов вирусного генома: свыше 21% нуклеотидных и 7% аминокислотных различий (Nichol et al., 2005).
В настоящее время в международном комитете по таксономии вирусов зарегистрированы 23 иммунологически и генетически отличающихся друг от друга вида хантавирусов и их число продолжает увеличиваться (Nichol et al., 2005;
Vaheri, 2008). Трудности изоляции штаммов хантавирусов привели к тому, что ряд новых генетически значительно отличающихся хантавирусов был идентифицирован на основании анализа фрагментов их геномов (Klempa et al., 2007;
Song et al., 2009). В литературе до выделения штаммов и их иммунологического анализа генетически отличающиеся хантавирусы называют генетическими типами, а отличающиеся группы внутри каждого генетического типа – генетическими вариантами (Gu et al., 2011;
Kang et al., 2009;
Mir, 2010).
Показано, что основным возбудителем ГЛПС на территории Европейской части России является вирус PUUV, циркулирующий в популяциях рыжих полевок, и 3% случаев ГЛПС ассоциированы с вирусом DOBV, носителями которого являются два вида мышей рода Apodemus: A. agrarius и A. ponticus (Ткаченко и др., 2005;
Klempa et al., 2008). В популяциях полевок рода Microtus (M. arvalis и M. rossiaemeridionalis) обнаружена циркуляция вируса Tula (TULV), для которого накапливается все больше данных о его патогенности для человека (Mertens et al., 2011). К началу нашего исследования наименее изученным регионом была азиатская часть, на территории которой сведения о составе хантавирусов, их распространении и многообразии их естественных хозяев были ограничены. На основе иммунологического анализа вирусных штаммов в Приморском и Хабаровском краях у больных ГЛПС были выявлены вирусы HTNV и SEOV (Астахова и др., 1990;
Иванов и др., 1990).
Генетический анализ циркулирующих в регионе хантавирусов был ограничен одним видом носителей - дальневосточной полевкой (Microtus fortis), в популяциях которой были обнаружены два хантавируса с неустановленной патогенностью для человека - Khabarovsk (KHAV) и Vladivostok (VLAV) (Horling et al., 1996;
Kariwa et al., 1999). В Сибири данные о циркулирующих типах хантавирусов были получены для ограниченной части территории: зоне тундры, Омской и Тюменской областей, где в популяциях грызунов выявлены вирусы PUUV, DOBV, TULV и Topografov (TOPV) (Якименко и др., 2008;
Dekonenko et al., 2003;
Vapalahti et al., 1999).
Состав генетических типов хантавирусов, циркулирующих в популяциях мелких млекопитающих на обширной территории Сибири и Дальнего Востока России, был изучен совершенно недостаточно. Вместе с тем, данные о типовом составе хантавирусов, циркулирующих на определенной территории, и их природных резервуарах имеют важное значение при разработке научно обоснованной стратегии борьбы с хантавирусной инфекцией.
Цели, задачи и методы исследования. Целью настоящей работы было комплексное молекулярно-генетическое исследование хантавирусов, циркулирующих на территории азиатской части России. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.
1. Установить типы хантавирусов – возбудителей ГЛПС в очагах Дальнего Востока России и выявить виды носителей - природных источников ГЛПС.
2. Определить географическое распространение и видовой состав зараженных хантавирусами мелких грызунов на территории административных регионов азиатской части России.
3. На основании генетической идентификации вируссодержащих образцов от мышевидных грызунов определить состав циркулирующих хантавирусов.
4. Исследовать циркуляцию хантавирусов среди новых видов природных носителей - насекомоядных.
Для выявления и идентификации хантавирусов, циркулирующих на территории азиатской части России использовали набор молекулярно генетических методов анализа. Выбранный подход включал выделение и генотипирование новых РНК изолятов, изучение вариабельности генома выявленных генетических типов, определение видов мелких млекопитающих – носителей хантавирусов и поиск новых очагов хантавирусной инфекции. В очагах Дальнего Востока России исследованы типы патогенных хантавирусов, обусловивших заболеваемость людей ГЛПС. Данные о составе генетических типов хантавирусов, распространенных в Сибири и на Дальнем Востоке России, были получены на основании анализа первичных вируссодержащих образцов крови больных ГЛПС и тканей легких животных. Этот подход значительно расширил возможности выявления новых хантавирусов, циркулирующих среди грызунов и насекомоядных, без их адаптации к росту в культуре клеток Vero E6, требующей значительного времени и не увенчавшейся успехом для большинства вирусов насекомоядных.
Для решения поставленных задач нами был разработан новый вариант анализа вирусного генома методом многолокусного ОТ-ПЦР, позволяющий выявить и идентифицировать как ранее известные виды хантавирусов, так и новые генетические типы. Образцы крови больных ГЛПС и тканей легких мелких млекопитающих – природных носителей вируса были протестированы на присутствие антител к хантавирусам и/или вирусного антигена и использованы для последующего анализа методом обратной транскрипции и двухраундовой полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием серий праймеров для анализа вирусного генома и анализа митохондриальной ДНК носителей вируса. Обнаружение специфических антител в сыворотках крови больных ГЛПС и мелких млекопитающих осуществляли с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА), для выявления антигена в тканях легких грызунов применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА). Генетическая идентификация хантавирусов и их природных носителей была основана на определении и анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов трех сегментов вирусных геномов и фрагментов митохондриальной ДНК носителей, и их последующем сравнении с ранее опубликованными последовательностями из базы данных GenBank. Для построения филогенетических деревьев использованы методы ближайших соседей, минимума эволюции и максимального правдоподобия в программах MEGA (версии 4.1) и PAUP 4.0b10 (Stamatakis et al., 2008;
Swoffold, 2003;
Tamura et al., 2007). Соответствие топологий получаемых филогенетических деревьев проверяли двумя или тремя методами.
Размеры и позиции полученных фрагментов (за вычетом праймеров) составили: для M-сегмента фрагмент длиной 244 н.о. (позиции 2737 – 2980);
для L-сегмента - 336 н.о. (175-511), либо 352 н.о. (2988-3339);
для S-сегмента 210 н.о. (395 – 604), либо 837 н.о. (407-1243), либо 1200 н.о. (1-1200).
При выполнении исследований были использованы образцы (n=10681) тканей легких и крови мелких млекопитающих, собранные в ходе экспедиций на территории Дальнего Востока России и Сибири, образцы крови больных ГЛПС (n=194) из очагов Дальнего Востока и Республики Башкортостан, а также образцы (n=211) легких грызунов из коллекций Хабаровской противочумной станции, НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока и г. Иркутска.
Научная новизна и практическая ценность Впервые, с помощью молекулярно-генетических методов исследования образцов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих – носителей хантавирусов получены новые данные о природных резервуарах и составе генетических типов хантавирусов, распространенных в различных ландшафтных зонах 12 административных регионов азиатской части России, включая Тюменскую, Томскую, Кемеровскую, Новосибирскую, Иркутскую области, Республику Алтай, Алтайский, Красноярский, Приморский и Хабаровский края, Амурскую и Еврейскую автономную области, о которых до наших исследований имелись фрагментарные сведения.
Впервые среди мелких млекопитающих на территории Азиатской части России установлено распространение 9 генетических типов хантавирусов, носителями которых в очагах Сибири являются не только мышевидные грызуны, но насекомоядные. Выявлены ранее неизвестные природные очаги хантавирусов на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев, Республики Алтай.
Генетическое разнообразие хантавирусов, циркулирующих на территории Сибири и Дальнего Востока, представлено новыми генетическими типами Амур (AMRV) и Алтай (ALTV), получившими свое название по месту их выделения, новыми вариантами известных широко распространенных хантавирусов HTNV, SEOV, PUUV, KHAV, VLAV и недавно выявленных хантавирусов Hokkaido (HOKV) и Seewis (SWSV). Впервые получены доказательства, что природным хозяином генетического типа Амур является восточноазиатская мышь (Apodemus peninsulae), для выявленного в Сибири генетического типа Алтай – обыкновенная бурозубка (Sorex araneus).
Впервые, на основании анализа геномов РНК изолятов хантавирусов от больных ГЛПС, показано, что популяция патогенных хантавирусов на Дальнем Востоке России представлена новым для рода Hantavirus генетическим типом Амур (AMRV) и новыми генетическими вариантами вирусов HTNV (FE) и SEOV (VDV).
Для вирусов с пока неустановленной патогенностью для человека на территории азиатской части России показана циркуляция вируса HOKV, ранее обнаруженного в Японии. Природным носителем вируса HOKV на Дальнем Востоке России является красно-серая полевка (Myodes rufocanus). Впервые установлено, что в Сибири резервуарами вируса являются два вида полевок рода Myodes: M. rutilus и M. rufocanus.
На территории Сибири впервые установлена циркуляция вируса SWSV, ранее обнаруженного в обыкновенной землеройке (S. araneus) в Швейцарии.
Впервые показано, что резервуарами вируса являются три близкородственных вида землероек рода Sores: S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon.
Выявлено 11 новых очагов циркуляции хантавирусов среди полевок M.
glareolus, M. rutilus, M. rufocanus, M. oeconomus, M. agrestis, M. gregalis, степных пеструшек Lagurus lagurus, мышей A. agrarius и A. peninsulae на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев и Республики Алтай.
Фундаментальные данные о разнообразии генетических типов хантавирусов, обнаруженных в очагах Сибири и Дальнего Востока, могут быть использованы при уточнении классификации и таксономии хантавирусов.
Установленные нуклеотидные последовательности новых РНК изолятов хантавирусов депонированы в базу данных GenBank.
Полученные новые знания являются основой дальнейших исследований роли новых генетических типов в патологии человека, необходимости их использования при разработке вакцин против ГЛПС и создании новых диагностических препаратов.
На основе полученных данных в ГНЦ ВБ «Вектор» совместно с ЗАО «Вектор-Бест» была разработана первая в России тест-система «Векто Ханта– РНК–ампли», использующая метод ОТ-ПЦР для выявления вирусной РНК в образцах крови больных ГЛПС и органах грызунов – носителей патогенных вирусов. Тест-система предназначена для научных исследований и использовалась для ранней диагностики и оценки эффективности противовирусной терапии, оценки эпизоотической активности природных очагов ГЛПС и исследования путей передачи вируса между природными носителями (Кушнарева и др., 2005а, 2005в, 2006;
Кушнарева и Слонова, 2008;
Образцов и др., 2008).
Положения, выносимые на защиту Используя технологию выявления и идентификации хантавирусов у больных ГЛПС и мелких млекопитающих, получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.
На исследованной территории Азиатской части России циркулирует генетических типов хантавирусов;
Популяция патогенных хантавирусов на Дальнем Востоке России представлена новым для рода Hantavirus генетическим типом Амур (AMRV) и новыми генетическими вариантами вирусов HTNV и SEOV.
Носителем нового генетического типа Амур является восточно азиатская лесная мышь (A. peninsulae);
Для вирусов с пока неустановленной патогенностью для человека на территории азиатской части России в красно-серых полевках (M.
rufocanus) показана циркуляция вируса HOKV, на территории Сибири резервуаром вируса HOKV являются два вида полевок рода Myodes: M.
rutilus и M. rufocanus;
В очагах Дальнего Востока циркулируют вирусы KHAV и VLAV, причем каждый из вирусов ассоциирован со своим носителем, полевками Microtus maximowiczii и M. fortis, соответственно;
Носителями хантавирусов на территории Сибири являются не только грызуны, но и насекомоядные. В обыкновенной бурозубке (S. araneus) выявлен ранее неизвестный генетический тип Алтай (ALTV), а в средней бурозубке (S. caecutiens) циркулирует новый генетический вариант вируса Lena (LENV), открытого в том же виде бурозубок в Республике Саха. Кроме того, в географически удаленных точках Сибири в трех близкородственных видах бурозубок S. araneus, S.
tundrensis и S. daphaenodon циркулирует вирус SWSV.
Апробация результатов диссертации и публикации. Основные экспериментальные материалы и положения диссертации были представлены в докладах и постерных сообщениях на 12 международных и 6 российских научных конференциях: The Fourth International Conference on HFRS and Hantaviruses (Атланта, США, 1998);
Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millenium (Новосибирск, 1999);
2nd Croatian Congress on Infectious Diseases (Дубровник, Хорватия, 2000);
The Fifth International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses (Анси, Франция, 2001);
2-й и 3-й научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002, 2006);
II объединенной сессии СОРАН и СОРАМН «Новые технологии в медицине»
(Новосибирск, 2002);
Ecology of Infectious Diseases (Новосибирск, 2002);
«Хантавирусы, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом»
(Владивосток, 2003);
The 6th International Conference on Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS), Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS) and Hantaviruses (Сеул, Корея, 2004);
«Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004);
The VII International Conference on Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS), Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS) and Hantaviruses (Буэнос-Айрэс, Аргентина, 2007);
III Всероссийской научной конференции Биология насекомоядных млекопитающих (Новосибирск, 2007);
XIV International Congress of Virology (Стамбул, Турция, 2008);
19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Хельсинки, Финляндия, 2009);
«Борьба с глобальными инфекциями» (Иркутск, 2009);
«Актуальные проблемы медицинской вирусологии» (Москва, 2009);
The VIII International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses (Афины, Греция, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 50 работ, включая 15 статей, из которых 10 опубликованы в журналах списка, рекомендованного ВАК, главу монографии, медико-географический атлас, патент Российской Федерации, тезиса в сборниках конференций.
Вклад автора в диссертационную работу. Исследования, включенные в работу, выполнены лично автором, под руководством автора и в соавторстве с коллегами из 12 научных учреждений России и США. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, выполнении основных экспериментов и обобщении полученных результатов.
Автор искренне признательна и благодарна коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: Слоновой Р.А., Компанец Г.Г. и Кушнаревой Т.В. из НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока (разделы 1-5);
Иванову Л.И., Здановской Н.И., Пуховской Н.М. и Высочиной Н.П. из ФГУЗ Хабаровская противочумная станция (разделы 1-5);
Абрамову С.А., Дупал Т.А., Ковалевой В.Ю., Кривопалову А.В., Панову В.В., Позднякову А.А., Петровскому Д.В. из Института систематики и экологии животных СО РАН г. Новосибирска (разделы 3-4, 6);
Данчиновой Г.А., Чапоргиной Е.А. и Тимошенко А.Ф. из Института эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Иркутска (разделы 4, 6);
Хасановой С.С. из ГУП «Иммунопрепарат» г. Уфы (раздел 1);
В.В.
Виноградову из Красноярского государственного университета и Лучниковой Е.М. из Кемеровского государственного университета (раздел 6);
Морзунову С.П. из университета Невада (Рино, США) (раздел 4). За плодотворное сотрудничество автор благодарит коллег из ГНЦ ВБ «Вектор» Кузину И.И.
(разделы 1-2), Гуторова В.В. (разделы 2-6), Горбунова Ю.А. (разделы 1-5), Сафронова П.Ф. (раздел 1), Чижикова В.Е. (раздел 1), Мишина В.П. (раздел 2), Малышеву Т.В. (разделы 1-2, 4-5), Олейник О.В. (раздел 4), Патрушева Н.А.
(раздел 1), Протопопову Е.В. (раздел 3), Тучину Н.В. (раздел 6), Якименко Н.В.
(раздел 2), Серегина С.В. (разделы 4-5), Перминову Н.Г. (раздел 3).
За сотрудничество в работе автор признательна своим американским коллегам Dr. C. Schmaljohn из USAMRIID, США;
Dr. S. Nichol из CDC, США;
Dr. R. Yanagihara из университета Гавайи (Маноа, США);
Dr. J. Hay из университета Нью-Йорк (Буффало, США).
Автор искренне благодарна академику РАН, профессору Сандахчиеву Л.С., члену-корреспонденту РАН, профессору Нетесову С.В., профессору Малыгину Э.Г. и Мартынюк Р.А. за активную поддержку данной работы.
Работа выполнена в 1995-2010 годах во ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках научных тем организации, по гранту государственной программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел «Защита от патогенов», в рамках научной школы НШ 65387.2010.4, по грантам Международного научно-технического центра (МНТЦ) № 805-97 и № 0805.2 «Изучение генетического и антигенного многообразия хантавирусов, циркулирующих на территории Азиатской части России», выполненным в сотрудничестве с Хабаровской противочумной станцией, НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока и г. Иркутска, Институтом систематики и экологии животных СО РАН г.
Новосибирска.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов, шести глав экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (508 ссылок). Работа изложена на страницах, включая 43 рисунка и 50 таблиц.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Генетическая характеристика хантавирусов – возбудителей ГЛПС на Дальнем Востоке России Анализ генетического многообразия хантавирусов был начат с идентификации вирусов – возбудителей ГЛПС, циркулирующих на территории Дальнего Востока России. Заболеваемость ГЛПС в дальневосточном регионе ежегодно регистрируется в очагах трех административных территорий (Приморском и Хабаровском краях, Амурской области). Заболевание в регионе характеризуется значительной тяжестью (тяжелые и средне-тяжелые формы составляют более 80%) и высокой летальностью (Лещинская и др., 1990;
Слонова и др., 2006). Методом ОТ-ПЦР с использованием 2-х серий праймеров для среднего (М) сегмента генома были проанализированы 110 образцов крови больных ГЛПС из Приморского и Хабаровского краев, 50 образцов были проанализированы с использованием 2-х серий праймеров для малого (S) сегмента. Были выявлены и идентифицированы 30 последовательностей M сегмента и 15 последовательностей S-сегмента генома, соответствующих кодирующим областям фрагментов поверхностного гликопротеина G2 и нуклеокапсидного (N) белка, соответственно.
Анализ последовательностей фрагментов М-сегмента генома 30 новых РНК изолятов вируса от больных ГЛПС выявил три различные группы хантавирусов и установил их таксономическую принадлежность: 24 изолятов – к виду HTNV, 2 изолятов – к виду SEOV и 4 изолятов – к ранее неизвестному генетическому типу, названному Амур (AMRV).
Внутригрупповой уровень различия дальневосточных изолятов вируса HTNV, обозначенных FE или HTNV (FE), составлял 0-6,0% н.о. и 0-2,6% а.о.
(табл. 1). Для группы изолятов генетического типа Амур (AMRV) уровень различия составлял 0,4-9,9% н.о. и 0% а.о. Две идентифицированных последовательности изолятов вируса SEOV, обозначенных VDV или SEOV (VDV), были идентичными. Уровень различий между группами дальневосточных РНК изолятов составлял 15,9-21,2% н.о. и 6,3-8,9% а.о. для HTNV (FE) и Амур, и 21,5-23,5% н.о. и 16,7-19,2 а.о. для HTNV (FE) и SEOV (VDV). Установленный уровень различия дальневосточных изолятов генетического типа Амур с изолятами вирусов HTNV (FE) и SEOV (VDV) соответствовал генетическому критерию различий для нового вида хантавирусов, наличия различий 21% н.о. и 7% а.о.
Филогенетический анализ последовательностей М-сегмента дальневосточных РНК изолятов продемонстрировал их размещение в составе трех клад на филогенетическом дереве (рис. 1). Первая группа дальневосточных Таблица Различие нуклеотидных (M-сегмент, 2735-2968 н.о.) и аминокислотных последовательностей трех групп дальневосточных РНК изолятов, полученных от больных ГЛПС, и хантавирусов из других регионов Различие (%) с хантавирусами HTNV(FE) AMRV SEOV(VDV) HTNV SEOV н.о.
HTNV(FE) 0-6,0 15,9-21,2 21,5-23,5 9,8-12,0 21,0-23, а.о. 0-3,8 6,3-8,9 16,7-19,2 0-2,6 16,7-19, н.о.
AMRV 0,4-9,9 20,2-24,8 15,9-21,2 20,6-24, а.о. 0 16,7-17,9 6,3-8,9 16,7-17, SEOV(VDV) н.о. 0 23,9 2,6-5, а.о. 0 17,9 1, Примечание - нумерация последовательности относительно штамма HTN 76-118.
HTNV FE 66 66 68 88 72 HTN76- 61 HTNHoJo 99 HTNLee AMRV 93 DOB B- SEOV 99 8243 VDV KI- SR- SEO80- R SNCC PH- KBR PUUSG18- PUUSotkamo Рис. 1. Филогенетические взаимоотношения дальневосточных хантавирусов и хантавирусов из других регионов мира, полученные на основе нуклеотидных последовательностей (А) М-сегмента генома (нуклеотиды 2725-2981), (Б) S-сегмента генома (нуклеотиды 592-947). Дерево построено методом ближайших соседей. Индексы поддержки вычислены для 1000 повторов.
изолятов HTNV (FE) формирует отдельную ветвь (генетический вариант) внутри клады вирусов HTNV. Четыре последовательности, представляющие генетический тип Амур, формировали отдельную кладу внутри кластера, объединяющего клады хантавирусов, переносимых грызунами подсемейства Murinae (HTNV, DOBV, SEOV). Изоляты вируса SEOV формировали отдельную ветвь в кладе SEOV. Здесь и далее топологии полученных деревьев подтверждены с использованием не менее двух методов филогенетического анализа, на рисунках приводится одно из полученных деревьев.
Группа РНК изолятов, представляющая генетический вариант FE вируса HTNV, была наиболее многочисленной среди исследованной нами выборки образцов и была выявлена на всей исследованной территории.
Аминокислотные последовательности изолятов генетического варианта FE незначительно отличались от прототипного вируса HTNV 76-118 на установленных фрагментах как белка G2, так и белка N.
РНК изоляты генетического типа Амур были выделены от больных с тяжелой и средней тяжести клинических форм ГЛПС в тех же очагах, где одновременно циркулировал HTNV (генетический вариант FE).
Аминокислотные последовательности генотипа Амур отличались от прототипного вируса HTNV 5 заменами на исследованном участке белка G (V255, M283, D319, V324, A330). Эти замены оказались идентичными во всех образцах, хотя различие соответствующих нуклеотидных последовательностей достигало 9,9%.
Новый генетический тип Амур был идентифицирован в образцах от больных: 2 больных из Амурского района Хабаровского края, 1 больном, проживающем в 200 км от первых двух и 1 больном, проживающем на расстоянии 400 км, в Приморском крае. Этот ранее неизвестный генетический тип был назван Амур (AMRV) по месту его географического выявления в бассейне реки Амур. Низкое число выявленных случаев Амур инфекции могло быть обусловлено иным природным носителем вируса, более низкой инфицированностью носителя, либо иным географическим расположением очагов генетического типа Амур. Последнее предположение являлось наименее вероятным, так как зарегистрированные случаи географически разнесены, а один из случаев зарегистрирован в районе интенсивного сбора образцов недалеко от Хабаровска. Выявление нового генетического типа Амур поставило две важных задачи: идентификацию природного резервуара вируса и его распространения.
Случаи инфекции вирусом SEOV были установлены во Владивостоке.
Нуклеотидные последовательности фрагментов М-сегмента вирусного генома, полученные при анализе образцов крови больных ГЛПС, инфицированных в 1995 г. и 1997 г., оказались идентичными и отличались от ранее опубликованных последовательностей вирусов SEOV. Этот факт согласуется с высокой генетической стабильностью штаммов вируса SEOV. При сравнении нуклеотидных последовательностей дальневосточных изолятов SEOV(VDV) с другими штаммами SEOV, зарегистрированными в базе данных GenBank, были установлены различия в пределах 2,6-5,1%, при уровне различия между ранее известными штаммами, не превышающем 6%. На филогенетическом дереве РНК изоляты SEOV(VDV) от больных из Владивостока группировались отдельно от штаммов, циркулирующих в сопредельных с территорией Дальнего Востока странах — Китае и Корее, а также в Японии.
Таким образом, нами показано, что не менее трех типов хантавирусов являются возбудителями ГЛПС на Дальнем Востоке России: новый генетический тип Амур, новый генетический вариант FE вируса HTNV, и новый генетический вариант VDV вируса SEOV.
Результаты генетического анализа хантавирусов - возбудителей ГЛПС в очагах Дальнего Востока России, полученные нами, а также депонированные в GenBank генетические данные о возбудителях ГЛПС из европейской части России явились основой разработки тест-системы для детекции основных патогенных хантавирусов (HTNV, SEOV, AMRV, PUUV). Первая в России тест-система на основе ОТ-ПЦР, позволяющая выявлять РНК вируса у больных ГЛПС с первого дня от начала заболевания, была совместно разработана в ГНЦ ВБ "Вектор" и ЗАО Вектор-Бест. Тест-система может быть использована как для тестирования крови больных ГЛПС на присутствие вирусной РНК, так и для надзора за природными очагами ГЛПС, позволяя определять РНК хантавирусов в тканях грызунов - переносчиков заболевания. Нами была исследована эффективность тест-системы "ВектоХанта-РНК-ампли" для диагностики ГЛПС и идентификации возбудителя.
Для исследования были использованы 55 образцов крови от 50 больных ГЛПС из очагов Хабаровского края и Республики Башкортостан, взятые в сроки со 2-го по 14-й день от начала заболевания. Сравнительный анализ показал, что в партиях образцов с серологически подтвержденным диагнозом прослеживается зависимость между сроками от начала заболевания и эффективностью выявления РНК вируса-возбудителя. Наиболее эффективно РНК хантавирусов определяли на ранние сроки заболевания (по 7 день включительно), так, она была выявлена на эти сроки у 100% больных из Хабаровского края, и у 70% больных из Башкортостана. На более поздние сроки процент положительных анализов уменьшался, что, по-видимому, связано с появлением специфических антител и постепенным уменьшением вирусной нагрузки в крови. В образцах, взятых на 8-10 день заболевания, эффективность выявления РНК составила 33%. Таким образом, применение тест-системы позволяет диагностировать ГЛПС на ранних сроках заболевания (до 7 дня) у 70 - 100% больных, что имеет большое значение для выработки оптимальной тактики лечения.
Использование тест-системы перспективно при расследовании вспышек ГЛПС для быстрой идентификации возбудителя, что и было продемонстрировано нами. Тест-система была использована для определения генетического типа патогенных вирусов в исследованных образцах от больных ГЛПС из Хабаровского края. Секвенирование и анализ полученных ампликонов установил их таксономическую принадлежность к вирусу HTNV, его дальневосточному генетическому варианту HTNV(FE).
Серии лабораторной тест-системы Векто Ханта-РНК-ампли были произведены ЗАО «Вектор-Бест» в период 2004-2006 гг. и использованы в ряде научных исследований. Так, тест-система была использована для оценки эффективности противовирусной терапии (Кушнарева и др., 2005б, 2006;
Образцов и др., 2008), оценки эпизоотической активности природных очагов хантавирусной инфекции и исследования путей передачи вируса между природными носителями (Кушнарева и др., 2005а;
Кушнарева и Слонова, 2008).
2. Природные носители патогенных хантавирусов 2.1. Природный резервуар нового генетического типа Амур (AMRV) Для установления связи генетического типа AMRV и генетических вариантов HTNV(FE) и SEOV(VDV) с определенными видами грызунов носителей вирусов были исследованы РНК изоляты от инфицированных грызунов, отловленных в очагах Дальнего Востока России. К началу исследования данные о типе вируса, циркулирующего в популяциях восточно азиатской мыши (A. peninsulae), в литературе отсутствовали. Для генетической идентификации хантавируса, циркулирующего среди A. peninsulae, были исследованы образцы от восточно-азиатских мышей, отловленных в лесной зоне в районе Хабаровска. Сравнительный анализ последовательностей М сегмента РНК изолятов от A. peninsulae показал, что они близки к последовательностям генетического типа Амур от больных ГЛПС (различия не превышали 6,6%) и значительно отличались от других известных хантавирусов.
Уровни различия нуклеотидных последовательностей фрагментов M- и S сегментов генома РНК изолятов вируса, выявленного от A. peninsulae, с представителями других видов составляли от 15% до 23% для HTNV, от 21% до 28% для SEOV, от 22% до 29% для DOBV, от 38% до 39% для PUUV, от 36% до 37% для KHAV. Эти данные свидетельствовали, что естественным резервуаром AMRV на Дальнем Востоке России является A. peninsulae. Полученные результаты анализа для генетического типа AMRV соответствовали двум критериям для выделения нового вида рода Hantavirus: наличию отдельного природного носителя вируса (A. peninsulae) и наличию значительных генетических различий в нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностях (21% н.о. и 7% а.о.) фрагментов M- и S-сегментов генома.
Восточно-азиатская мышь широко распространена на территории азиатской части континента от Алтая до Дальнего Востока, включая северо восточную и восточную части Китая и Кореи. Вопрос о распространении патогенного генетического типа AMRV в популяциях A. peninsulae на территории северо-восточной Азии от России до Китая и Кореи требовал дальнейших исследований. Нами была оценена распространенность и вариабельность генетического типа AMRV на территории Дальнего Востока России, в Приморском и Хабаровском краях. Всего методом ОТ-ПЦР нами было проанализировано 70 образцов A. peninsulae с использованием серий праймеров, специфичных для трех сегментов вирусного генома. Во всех использованных для анализа образцах предварительно было установлено наличие антигена в органах или антител в крови, а также сочетание антигена и антител. Животные были отловлены в удаленных друг от друга регионах, включая участки административных районов западной части Приморского края (Спасский), 2-х районов южных территорий края (Шкотовский, Надежденский), и одного района Хабаровского края (Хабаровский). В результате проведенного анализа были определены последовательности фрагментов генома из образцов.
Анализ филогенетических взаимосвязей изолятов генетического типа AMRV на основе последовательностей фрагмента М-сегмента генома выявил четыре различающихся ветви (генетических варианта) в кладе AMRV (рис. 2).
Большая часть РНК изолятов от A. peninsulae из Приморского и Хабаровского краев образовывала одну из этих ветвей (Приморье-Хабаровск). Вторая ветвь (Приморье1-Китай) включала штаммы из Китая и один изолят из Приморского края. Третью ветвь (Амурск) формировали два ранее идентифицированных изолята от больных ГЛПС, проживающих в Амурском районе Хабаровского края. Четвертая ветвь включала штаммы из Кореи. На Дальнем Востоке России наблюдалась циркуляция трех из четырех различающихся вариантов генетического типа Амур, причем вариант Приморье1-Китай наиболее близок штаммам из Китая от больного и от A. peninsulae, отловленной в северо восточной провинции Китая, примыкающей к исследуемой территории Дальнего Востока. Два других варианта циркулировали лишь на исследованной территории Дальнего Востока.
Филогенетический анализ, основанный на последовательностях фрагмента L-сегмента генома, установил разделение единой на древе М сегмента ветви Приморье-Хабаровск на две ветви, Приморье и Хабаровск.
Суммируя данные филогенетического анализа фрагментов трех сегментов, сделано заключение, что на территории Дальнего Востока России циркулируют четыре различающихся варианта генетического типа AMRV (Хабаровск, Приморье, Приморье1-Китай, Амурск), для которых наблюдается группирование по географическому принципу.
Для определения уникальных (маркерных) для генетического типа AMRV аминокислотных остатков в анализируемых фрагментах оболочечного, нуклеокапсидного белков, а также РНК-полимеразы, использован сравнительный анализ аминокислотных последовательностей вновь выявленных изолятов с представителями наиболее близких хантавирусов HTNV и SEOV, а также штаммами генетического типа AMRV из различных географических регионов.
32071/Prim/Sp M сегмент Solovey/AP AMRV 26948/Prim/Sp 25858/Prim/Shk 75 27191/Prim/Sp 25514/Prim/Nad 25784/Prim/Nad Хабаровск 89 25773/Prim/Nad Приморье 25777/Prim/Nad 31630/Prim/Kav 997/Khab Amur/ Amur/ 699/Khab 96 Liu/Китай H5/Китай Китай – 31767/Prim/Nad Приморье 8205/Китай JilinAP06/Китай AMR/ Амурск 100 AMR/ 99 SC-2/Корея Корея 100 SC-1/Korea Z10/Китай 76-118/Корея HTNV HoJo/Корея 100 Lee/Корея SR11/Япония 98 SEO80-39/Korea 80-39/Корея SEOV R22/Китай 89 L99/Китай KHA/Россия Sotkamo/Финляндия PH-1/США NewYork/США 86 SinNombre/США 0. Рис. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных 2.
последовательностей фрагмента M-сегмента (2737-2980 н.о.) генома хантавирусов. Дерево построено методом ближайших соседей. Индексы поддержки вычислены для 1000 повторов.
Жирным шрифтом выделены исследованные РНК изоляты.
Установленные ранее характерные для всей группы изолятов генетического типа AMRV пять замен (относительно прототипного вируса HTNV) в аминокислотной последовательности фрагмента оболочечного белка G2 присутствовали в 14 из 15 новых РНК изолятов, а также в штаммах, использованных для сравнения. Лишь одна из замен, Met283, отсутствовала в штаммах из Кореи (SC-1 и SC-2). Для всей группы AMRV маркерным аминокислотным остатком является Asp337, эта замена является уникальной и присутствует во всех доступных для сравнения последовательностях AMRV.
Анализируемый участок фрагмента РНК-полимеразы содержал один маркерный аминокислотный остаток Tyr143, эта замена является уникальной и отсутствует у других хантавирусов. Еще пять замен относительно прототипного вируса HTN 76-118 (Pro56, Asn87, Thr102, Arg125 и Ala133) присутствовали во всех последовательностях генетического типа AMRV, хотя каждая из этих замен не являлась уникальной и встречалась также в отдельных штаммах близкородственных вирусов (HTNV, SEOV, DOBV).
На анализируемом участке N белка маркерным аминокислотным остатком для генетического типа AMRV являлся Thr290. Четыре замены относительно прототипного вируса HTNV (Ile202, Val216, Ser241, His256) выявлены во всех взятых для сравнения последовательностях N белка генетического типа AMRV, однако в различных сочетаниях замены присутствовали в штаммах вирусов HTNV, SEOV, DOBV.
Проведенные исследования по выявлению нового патогенного вируса на территории Дальнего Востока России привлекли значительный интерес зарубежных и российских исследователей. В последующих работах было установлено широкое распространение вируса Амур на территории Китая и Кореи (Baek et al., 2006;
Kariwa et al., 2007;
Lokugamage et al., 2002, 2004a).
Кроме того, было показано, что новый генетический тип является и новым серотипом. Отличие генетического типа Амур от HTNV было подтверждено при исследовании штаммов, выделенных от больных и грызунов в реакции нейтрализации (Lokugamage et al., 2004;
Baek et al., 2006) и при исследовании иммунных сывороток от грызунов и сывороток крови от больных ГЛПС в реакции торможения гемагглютинации (Кушнарева и др., 2005с). Было установлено, что доля вируса Амур в структуре заболеваемости ГЛПС в Приморском крае России в отдельные годы составляла до 56% (Слонова и др., 2006).
Таким образом, нами было получено доказательство циркуляции нового генетического типа AMRV в популяциях отдельного природного хозяина, восточноазиатской лесной мыши (A. peninsulae) и показано широкое распространение нового генетического типа на Дальнем Востоке России.
Совокупность полученных нами и другими исследователями данных подтвердила принадлежность генетического типа AMRV к новому виду рода Hantavirus – вирусу Амур (AMRV).
2.1. Природный носитель вируса Hantaan (HTNV) Дальнейшие исследования были посвящены идентификации грызунов носителей еще двух патогенных хантавирусов. Для подтверждения циркуляции в популяциях A. agrarius генетического варианта FE вируса HTNV, выявленного у больных ГЛПС, проводилось исследование РНК изолятов вируса от полевых мышей. Методом ОТ-ПЦР было проанализировано образцов легких A. agrarius, отловленных на территории Хабаровского и Приморского краев, Амурской области и Еврейской автономной области. В результате проведенного анализа было выявлено 16 ОТ-ПЦР положительных образцов A. agrarius, представляющих все исследованные административные регионы. Как и в случае вируса Амур, были получены нуклеотидные последовательности фрагментов всех трех сегментов генома. Сравнение вирусных последовательностей М- и S-сегментов генома, выявленных от больных ГЛПС и от полевых мышей подтвердило, что носителем дальневосточных изолятов генетического варианта FE вируса HTNV является полевая мышь (A. agrarius), уровень различия составлял 1-3% и 2-3%, соответственно. Филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов каждого из сегментов вирусного генома продемонстрировал формирование отдельной ветви FE внутри клады вируса HTNV, что свидетельствует о циркуляции на Дальнем Востоке России в популяциях A. agrarius нового генетического варианта FE вируса HTNV.
Анализ аминокислотных последовательностей исследованных РНК изолятов и штаммов из других регионов подтвердил выводы, сделанные на основе нуклеотидных последовательностей о том, что на юге Дальнего Востока России в популяциях A. agrarius циркулирует новый генетический вариант FE вируса HTNV. В исследованных фрагментах поверхностного белка G2 и нуклеокапсидного белка N маркерных для генетического варианта FE аминокислотных остатков не выявлено. Лишь анализ фрагмента РНК полимеразы позволил выявить характерные замены. Сравнение последовательностей дальневосточных изолятов со штаммами доступными из банка данных GenBank установило три аминокислотных замены относительно прототипного штамма HTN 76-118 (Thr87, Asn133 и Val135), присутствующие во всех исследованных изолятах. Хотя замена Thr87 встречается в штаммах вирусов SEOV и DOBV, а замена Asn133 — в штаммах DOBV, однако совокупность трех замен характерна лишь для изолятов генетического варианта FE вируса HTNV, циркулирующих в популяциях A. agrarius на территории Дальнего Востока России.
Таким образом, анализ РНК изолятов хантавируса, циркулирующего в популяциях полевой мыши (A. agrarius) показал, что природным резервуаром патогенного для человека дальневосточного варианта FE вируса HTNV является полевая мышь A. agrarius. Этот вывод согласуется с результатами, полученными при исследовании образцов от A. agrarius, обитающей на территории Кореи и Китая (Wang et al., 2000;
Zou et al., 2008b). Сравнительный анализ изолятов от A. agrarius из трех стран продемонстрировал отличие генетического варианта HTNV (FE) от ранее известных вариантов вируса циркулирующих в сопредельных странах. Отличия HTNV, нуклеотидных/аминокислотных последовательностей фрагментов генома изолятов HTNV (FE) от вариантов вируса HTNV из Китая и Кореи составило 7,8-13,1%/0-4,8% для M-сегмента, 11,0-17,7%/3,0-6,2% для L-сегмента и 10,5 15,7%/0-2,9% для S-сегмента.
2.1. Молекулярная эпидемиология вируса Seoul (SEOV) на Дальнем Востоке России Целью дальнейших исследований было установление связи выявленного генетического варианта VDV вируса SEOV с природным хозяином вируса.
Кроме того, была проведена идентификация вируса, циркулирующего в серых крысах на острове Сахалин и сравнение островных и материковых изолятов вируса. Для анализа были использованы 34 образца сгустков крови, взятых от больных с различными клиническими формами ГЛПС — жителей Владивостока в лихорадочный период заболевания, 48 образцов легких от серопозитивных и/или антиген позитивных серых крыс, отловленных во Владивостоке и на острове Сахалин. Нуклеотидные последовательности вирусного генома были выявлены в 11 образцах.
Как видно из рис. 3, основанного на анализе М-сегмента, новые РНК изоляты из Владивостока как от больных со среднетяжелой и тяжелой формами ГЛПС, так и от серых крыс (R. norvegicus), полученные в разные годы, образовывали единую отдельную ветвь на филогенетическом древе внутри клады вирусов SEOV. Анализ L- и S-сегментов генома выявил сходную картину группирования изолятов SEOV(VDV) из Владивостока. Это свидетельствует о том, что носителями генетического варианта VDV вируса SEOV из Владивостока являются серые крысы. При сравнении кодируемых аминокислотных последовательностей выявлена одна аминокислотная замена в частичной последовательности оболочечного белка G2 (Ile262 на Thr262) по сравнению с другими представителями вируса SEOV. Исследованная область белка G2 является высоко консервативной, выявленное единичное различие в исследованном фрагменте белка G2 является существенным для характеристики изолятов из Владивостока, а замена является маркерной.
Полученный результат показал, что циркулирующий в серых крысах вирус SEOV является стабильным и вызывает заболевания ГЛПС различной тяжести.
Первоначально анализ изолятов SEOV(VDV) был основан на фрагментах L- и M-сегментов геномов. На следующем этапе исследования нами была использована серия праймеров, специфичных для анализа S-сегмента генома.
Выявление нуклеотидных последовательностей малого сегмента генома и включение их в сравнительный анализ с имеющимися в банке данных GenBank представителями вируса SEOV привело к неожиданным результатам. Как и при анализе других сегментов генома, изоляты из Владивостока группировались отдельно от штаммов из географически близко расположенных стран (Китая, 8205/Китай JilinAP06/Китай M сегмент Liu/Китай 94 H5/Китай 699/Россия AMRV 78 997/Россия SC-2/Корея 100 SC-1/Корея 100 HoJo/Корея 96 Lee/Корея 76-118/Korea HTNV 86 76500/Prim/Россия 330/Khab/Россия 99 1410/Khab/Россия 96 R22/Китай L99/Китай 69 SEO80-39/Корея Корея-Сахалин 1999/Rn/Сахалин 18992/Rn SEOV 7218/HU/ср-тяж 8243/HU/ср-тяж 2464/HU/тяж VDV 96 29910/Rn 725/HU/тяж 28935/Rn 18995/Rn NewYork/США SinNombre/США PUUV/Финляндия KHA/Россия PH-1/США 0. Рис. 3. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов M-сегмента (2737–2980 н.о.) генома хантавирусов. Дерево построено методом ближайших соседей. Индексы поддержки вычислены для 1000 повторов.
Жирным шрифтом выделены исследованные РНК изоляты. Сокращения: Rn – R. norvegicus, HU- больной ГЛПС.
Кореи, Японии), однако совместно с группой изолятов из Камбоджи и Сингапура. Был выявлен высокий уровень гомологии изолятов из Владивостока с группой изолятов из Камбоджи (99.4-100%), при меньшем уровне гомологии со штаммами из географически близко расположенных стран 95,3-97,1% (Китай, Корея, Япония). Полученный результат свидетельствовал о том, что единый генетический вариант вируса SEOV(VDV) циркулирует в двух географически удаленных регионах.
Отличающийся результат филогенетического анализа получен для изолята от серой крысы, отловленной на острове Сахалин. Анализ М-сегмента показал, что изолят вируса из города Корсаков Сахалинской области группируется вместе со штаммом SEOV 80-39 из Кореи, а не с генетическим вариантом из Владивостока. Различие нуклеотидных VDV последовательностей изолятов из Владивостока и Сахалина составляло 3,5 4,5%, а из Сахалина и Кореи - 1,3%, что указывало на циркуляцию генетически различающихся вариантов вируса SEOV в материковой и островной популяциях R. norvegicus. Данные о принадлежности изолятов вируса SEOV во Владивостоке и на острове Сахалин к разным генетическим вариантам свидетельствуют о различных путях проникновения инфицированных R.
norvegicus – носителей вируса SEOV на географически отдаленные территории.
Наиболее вероятен завоз инфицированных крыс на о. Сахалин морским путем, поскольку транспортная связь между островом и Кореей существует.
Таким образом, при анализе материала от серых крыс – носителей вируса SEOV материковой (Владивосток) и островной (Сахалин) популяций нами установлено различие в происхождении циркулирующих в них вирусов.
Выявленный у больных ГЛПС и серых крыс генетический вариант VDV имел общее происхождение с вариантом вируса, циркулирующего в серых крысах (R.
norvegicus) в странах юго-восточной Азии (Камбодже и Сингапуре), в то время как РНК изолят вируса SEOV, выявленный на острове Сахалин, был близок варианту вируса из Кореи. Необходимо отметить, что случаи ГЛПС, обусловленные вариантом VDV вируса SEOV на территории города Владивостока регистрируются ежегодно и нередко отмечается средне-тяжелая и тяжелая формы заболевания, в то время как о подобных случаях в Камбодже и Сингапуре сообщений нет (Слонова и др. 2006;
Reynes et al., 2003).
Распространение хантавирусной инфекции у мелких 3.
млекопитающих на территории Сибири и Дальнего Востока Определение географического распространения и видового состава зараженных хантавирусами мелких млекопитающих было основано на анализе образцов, собранных в ходе 23 экспедиций в Сибири и на Дальнем Востоке России. На территории Сибири сбор образцов осуществлялся в ходе экспедиций, проведенных в течение 2000 - 2009 гг. в Омской, Тюменской, Томской, Кемеровской, Новосибирской, Иркутской областях, Республике Алтай, Алтайском и Красноярском краях. Всего было отловлено и протестировано 1094 мелких млекопитающих.
В 2007 – 2009 гг. обследована территория, охватывающая различные ландшафтно-географические зоны Сибири (рис. 4). Районы работ включали степь и лесостепь (Карасук, Шушенское), подтаежные леса (Тюмень, Усть Ишим, Бакса, Сухоречье), предгорья (Парная, Балахнино, Солтон, Хмелевка, Колывань) и горно-таежные леса (Телецкое, Покровка, Средняя Шушь, Кузедеево). Присутствие хантавирусной инфекции (антител к хантавирусам или хантавирусного антигена) обнаружено в образцах крови/тканей грызунов во всех обследованных районах Сибири, в четырнадцати из пятнадцати Рис. 4. Места отлова грызунов на территории Западной и Средней Сибири Обозначения: 1 - Нижнетавдинский район, Тюменская обл.;
2 - Усть-Ишимский район, Омская обл.;
3 - Карасук, Новосибирская обл.;
4 - Бакса, Кожевниковский район, Томская обл.;
5 – Сухоречье, Томский район, Томская обл.;
6 - Балахнино, Яшкинский район, Кемеровская обл.;
7 – Хмелевка, Заринский район, Алтайский край;
8 - Колывань, Курьинский район, Алтайский край;
9 – Покровка, Чарышский район, Алтайский край;
10 Солтон, Солтонский район, Алтайский край;
11 - Артыбаш, Турочакский район, Республика Алтай;
12 – Кузедеево, Новокузнецкий район, Кемеровская обл.;
13 - Парная, Шарыповский район, Красноярский край;
14 – Шушенское, Красноярский край;
15 – Средняя Шушь, Шушенский район, Красноярский край.
обследованных участков. Среди 810 обследованных животных антитела/антиген были обнаружены у 73 особей относящимися к 9 видам (таб.
2). Наибольший процент инфицированных животных выявлен среди степных пеструшек (Lagurus lagurus) (33,3%), красно-серых (29,0%), рыжих (18,2%), красных (15,4%) и узкочерепных (Microtus gregalis) (15,0%) полевок в районах, где они занимают доминирующее или субдоминирующее положение в сообществе. Рыжая полевка (M. glareolus), доминирующая в лесных сообществах в европейской части России и являющаяся носителем вируса PUUV, в Сибири в исследованных таежных лесных биотопах встречалась вместе с красной и красно-серой полевками, но, как правило, уступала им по численности, за исключением подтаежной зоны Тюменской (58,3%), Омской(50%) и Кемеровской (50%) областей. Серопозитивные животные были обнаружены в четырех ключевых участках, причем в одном из них, на Телецком, доля рыжих полевок среди отловленных составляла лишь 6,7%. В выборках Тюмень, Усть-Ишим, Хмелевка и Телецкое доля инфицированных среди отловленных рыжих полевок составляла 9,5%, 18,2%, 14.3% и 10,0%, соответственно. В остальных точках инфицированных особей не выявлено.
Таблица Виды грызунов и их инфицированность в различных местах отлова на территории Сибири Администрат Место Биотоп Число Вид грызуна ивный регион отлова инфицированных животных среди отловленных Республика Телецкое Кедрово- 6/80 M. rutilus Алтай пихтовый лес с 1/3 M. rufocanus примесью 1/10 M. glareolus березы и осины 0/9 M. oeconomus 4/48 A. peninsulae Алтайский Солтон Осиновый лес с 2/14 M. rutilus край примесью пихты 1/2 M. rufocanus 0/10 M. glareolus 0/2 M. oeconomus 0/1 A. peninsulae Хмелевка Осиново- 0/13 M. rutilus пихтово- 0/1 M. rufocanus березовый лес 1/7 M. glareolus 1/8 M. oeconomus 0/1 A. peninsulae Покровка Кедрово- 0/16 M. rutilus лиственичный 8/37 M. rufocanus лес 2/7 M. oeconomus 0/3 A. peninsulae Колывань Березово- 1/11 M. rutilus осиновый лес с 0/1 M. rufocanus примесью пихты 0/2 A. peninsulae и сосны 1/2 M. gregalis 0/1 M. agrestis 0/1 A. agrarius Красноярский Средняя Смешанный 4/26 M. rutilus край Шушь пихтово- 9/31 M. rufocanus осиново-еловый 0/11 M. oeconomus лес 1/10 A. peninsulae 1/9 M. agrestis 1/2 A. agrarius Шушенское Остепненный 0/2 M. rutilus луг между 0/1 M. glareolus березовыми 0/2 M. oeconomus колками 1/3 A. peninsulae 3/20 M. gregalis 2/16 A. agrarius Парная Лиственнично- 1/11 M. rutilus березовый лес с 0/5 M. glareolus примесью пихты 1/2 M. oeconomus и осины 0/2 A. peninsulae 0/1 M. agrestis Кемеровская Кузедеево Смешанный 1/9 M. rutilus область осиново- 0/6 M. rufocanus пихтовый лес с 0/21 M. glareolus примесью липы 0/5 A. peninsulae Балахнино Смешанный 0/5 M. rutilus березово 0/6 M. rufocanus пихтовый лес с 0/1 M. glareolus примесью осины 0/21 M. oeconomus 0/6 A. peninsulae 0/13 M. gregalis Томская Сухоречье Смешанный 1/8 M. rutilus область березово- 0/3 M. rufocanus пихтов- 0/3 M. glareolus осиновый лес 0/3 A. peninsulae Бакса Луг на окраине 0/1 M. rutilus смешанного леса 4/67 M. gregalis 0/1 A. agrarius Тюменская Тюмень Липовая роща с 1/29 M. rutilus область примесью пихты 4/42 M. glareolus 0/1 M. oeconomus Омская Усть-Ишим Смешанный 0/11 M. rutilus область березово- 2/11 M. glareolus пихтовый лес с примесью липы Новосибирска Карасук Север 0/17 M. oeconomus я область Кулундинской 3/49 M. gregalis степи, южная 4/12 Lagurus lagurus лесостепь Красно-серая полевка (M. rufocanus), обитающая в таежных биотопах, доминировала в отловах в предгорьях Тегерецкого хребта (Покровка, Алтайский край — 55,2%) и по среднему течению реки Большая Шушь (Средняя Шушь, Красноярский край — 34,8%). Здесь доля инфицированных среди отловленных красно-серых полевок составляла 21,6% и 29,0%, соответственно. Инфицированных животных выявляли также в Республике Алтай (Телецкое) и в Алтайском крае (Солтон), где красно-серая полевка была малочисленна (2,0% и 6,9% от всех отловленных).
Красная полевка (M. rutilus) обычна для всех лесных ландшафтов Сибири, являясь доминантным видом в сообществе Солтона, Хмелевки, Колывани, Парной, Телецкого и Сухоречья. Серопозитивных животных выявляли в восьми из пятнадцати исследованных районов. Инфицированность красных полевок была достаточно велика и составляла от 9,1% до 15,4%, за исключением Тюменской области, где лишь 3,4% животных были серопозитивны. В литературе отсутствовали данные о том, носителем какого генетического типа хантавируса являются красные полевки. Основываясь на близком родстве видов рыжей и красной полевок можно предполагать, что красные полевки являются носителем PUU-подобного вируса, но этот вопрос оставался открытым.
Узкочерепную полевку (Microtus gregalis) отлавливали в открытых ландшафтах Сибири, включая степные районы Новосибирской (Карасук) области и луговые участки между лесными массивами в подтаежной зоне Томской (Бакса), Кемеровской (Балахнино) областей и Красноярского края (Шушенское). Инфицированность вида составляла 6,1%, 6,0%, 0% и 15%, соответственно. В Алтайском крае (Колывань) одна из двух отловленных полевок оказалась серопозитивной.
Степную пеструшку (Lagurus lagurus) отлавливали лишь в одном месте, в степных районах Новосибирской области (Карасук), где она обитает в тех же биотопах, что и узкочерепная полевка. Как показано ранее, оба эти вида являются носителями разных генетических вариантов вируса TULV. Нами выявлен высокий уровень инфицированности степной пеструшки (33,3%), превышающий инфицированность других видов, что может объясняться групповым образом жизни пеструшек.
Полевка экономка (Microtus oeconomus) присутствовала в отловах в 10 из 15 районов. В трех районах (Хмелевке, Покровке и Парной) были выявлены серопозитивные животные. Хотя число отловленных полевок было менее 10 и вычисление процента инфицированности некорректно, можно полагать, что инфицированность вида достаточно высока.
Выполненное нами исследование установило широкое географическое распространение хантавирусов среди мелких млекопитающих. Выявлено новых очагов циркуляции хантавирусов на территории Республики Алтай, Алтайского и Красноярского краев, Кемеровской, Томской, Омской, Тюменской, Новосибирской и Иркутской областей. За исключением Иркутской, Тюменской и Омской областей, а также района села Шушенское в Красноярском крае, где ранее выявляли инфицированных хантавирусами грызунов, остальные выбранные нами территории не были обследованы. В районе Шушенского Красноярского края, где ранее сообщалось о выявлении хантавирусного антигена у красно-серых полевок (M. rufocanus), нами установлена инфицированность новых видов: полевой (A. agrarius) и восточно азиатской мышей (A. peninsulae), узкочерепной полевки (Microtus gregalis).
В следующих разделах идентифицированы вирусы, циркулирующие в популяциях M. rufocanus, M. rutilus, M. glareolus. Инфицированными оказались также узкочерепная полевка Microtus gregalis и степная пеструшка Lagurus lagurus, обитающие на территории Новосибирской области. В настоящем исследовании идентификация хантавирусов от этих видов не проводилась, однако ассоциация видов с вирусом TULV была установлена ранее в соседней Омской области (Якименко и др., 2008).
Полевая мышь (A. agrarius), с которой на Европейской территории и в Омской области ассоциирован вирус DOBV, встречалась в отловах в четырех точках и была малочисленна, за исключением района Шушенского, где являлась второй по численности (36,4%) среди отловленных животных.
Инфицированные полевые мыши были выявлены в Красноярском крае в окрестностях села Шушенское (12,5%) и в районе села Средняя Шушь (1 из 2).
Указанные находки являются первыми данными о распространении хантавирусов среди полевых мышей на территории Восточной Сибири.
Проведенный анализ не позволил идентифицировать вирус, так как образцы оказались отрицательными при тестировании методом ОТ-ПЦР. Наиболее вероятна ассоциация полевых мышей с патогенным вирусом DOBV, как это было установлено ранее на территории европейской части России и в Омской области (Ткаченко и др., 2008;
Якименко и др., 2008), однако нельзя исключить циркуляции в Красноярском крае вируса HTNV, носителем которого на Дальнем Востоке также являются полевые мыши. Более обоснованные предположения о типе циркулирующего вируса могут дать данные анализа мтДНК полевых мышей и их отнесение к европейскому либо дальневосточному подвидам A. agrarius. Присутствие антител к хантавирусам выявлено и у восточно-азиатской мыши (A. peninsulae) на территории Республики Алтай и Красноярского края. Ранее в литературе отсутствовали данные о выявлении хантавирусной инфекции у восточно-азиатской мыши на территории Сибири.
Попытки идентификации хантавируса в A. peninsulae оказались безуспешными.
Поскольку на Дальнем Востоке с этим видом связан патогенный вирус Амур — возбудитель тяжелых и среднетяжелых форм ГЛПС, а в Сибири тяжелые формы ГЛПС не зарегистрированы, генетическая идентификация вируса и его особенностей в сравнении с дальневосточным вирусом Амур остается важной, пока нерешенной проблемой.
На территории Дальнего Востока России в ходе 14 экспедиций, проведенных на территории Приморского и Хабаровского краев, Амурской и Еврейской автономной областей в течение 2007 - 2009 гг., собрано и протестировано 9587 мелких млекопитающих 13 видов, среди них выявлено 875 инфицированных животных. Проведены исследования по оценке эпизоотологического состояния дальневосточных очагов хантавирусной инфекции, выполнен сбор образцов на территории Амурской области и ЕАО, где ранее анализ генетических типов циркулирующих хантавирусов не проводился, собраны пробы от инфицированных животных из ряда малоисследованных районов Приморского и Хабаровского краев. Помимо того, что собранные коллекции образцов явились основой для идентификации хантавирусов, циркулирующих в природных носителях вируса, был расширен ареал циркуляции патогенных хантавирусов. В расположенном на побережье Хабаровского края Ванинском районе впервые выявлена зараженность хантавирусами A. peninsulae – резервуара вируса Амур.
4. Хантавирусы Hokkaido (HOKV) и Puumala (PUUV) 4.1. Новый генетический вариант вируса HOKV в Приморье и его природный носитель, красно-серая полевка (Myodes rufocanus) Исследование типов вирусов, переносимых другими видами мелких млекопитающих Дальнего Востока и Сибири - основными носителями хантавирусов - было начато с характеристики геномов РНК изолятов хантавируса, циркулирующего в популяциях красно-серых полевок из Приморского края и митохондриальной ДНК его природного хозяина, M.
rufocanus. Ранее было показано, что на территории азиатской части континента красно-серые и красные полевки являются носителями хантавируса (Иванов и др., 1990;
Мясников и др., 1992;
Ткаченко и др., 1987;
Zhang et al., 2007), а в красно-серых полевках на острове Хоккайдо в Японии идентифицирован вирус HOKV (Kariwa et al., 1999). Тип хантавируса, циркулирующего в популяциях красных полевок (M. rutilus), не был определен.
С помощью метода ОТ–ПЦР нами было проведено исследование образцов тканей легких M. rufocanus, отловленных в Приморском крае, из четырех образцов определены фрагменты M-сегмента вирусного генома.
Обнаруженные в Приморье РНК изоляты показали наименьшие различия с изолятом вируса HOKV, выявленным из образца красно-серой полевки с японского острова Хоккайдо (18–20% различий). На филогенетическом древе Sotkamo/Финляндия Virrat/Финляндия Vindeln/Швеция 94 Vranica/Швеция Kazan/Россия CG17/Россия 71 PUUV 100 CG1820/Россия Berkel/Германия CG13891/Бельгия Couvin/Бельгия CGErft/Германия Kamisso/Япония CRF74392/Приморье CRF74372/Приморье HOKV 100 CRF74356/Приморье Шкотово 100 CRF74333/Приморье KHAV/Россия 86 TOPV/Россия NewYork/США 99 SinNombre/США SEOV/Япония HTNV76-118/Корея 55 DOBV/Словения 0. Рис. 5. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента М-сегмента генома хантавирусов длиной 222 н.о. Для анализа использован метод ближайших соседей. Индексы поддержки получены для повторов.
изоляты вируса, выделенные из красно-серых полевок в Приморском крае и Японии, группировались отдельно от штаммов, выделенных от рыжей полевки и от пациентов в районах распространения данного грызуна (рис. 5).
Наблюдалось филогенетическое разделение штаммов PUUV от рыжих полевок и изолятов HOKV от красно-серых полевок на 2 группы в соответствии с их природными резервуарами (переносимые рыжей полевкой и переносимые красно-серой полевкой). Изучаемые нуклеотидные последовательности РНК изолятов вируса от красно-серых полевок с высоким индексом поддержки группировались вместе и представляли отдельный генетический вариант вируса HOKV, названный нами «Шкотово». Филогению грызуна - хозяина геноварианта Шкотово (M. rufocanus) исследовали путем анализа последовательности фрагмента мтДНК, при этом наблюдалось филогенетическое разделение природных хозяев, M. rufocanus и M. glareolus, на две группы в соответствии с филогенетическим группированием переносимых ими хантавирусов. Таким образом, нами было установлено, что на Дальнем Востоке России, граничащем с северо-восточной частью Китая, в M. rufocanus циркулирует новый генетический вариант вируса HOKV, названный Шкотово.
4.2. Распространение вируса HOKV на территории азиатской части России и его природные носители, красно-серая полевка (M. rufocanus) и красная полевка (M. rutilus) Нами был проведен анализ генетической вариабельности вируса HOKV, его географического распространения на территории азиатской части России и установлены природные резервуары вируса в различных географических регионах. Были проанализированы 32 серо/антиген положительных образцов полевок M. rufocanus, отловленных на территории Приморского, Хабаровского краев и острова Сахалин, 6 образцов красно-серых полевок, отловленных в двух районах, прилегающих к озеру Байкал. Для исследования в очагах совместного обитания были взяты 44 серопозитивных полевки трех видов (M.
rufocanus, M. rutilus, M. glareolus), отловленных в 7 административных регионах Сибири - Алтайском и Красноярском краях, Республике Алтай, Кемеровской, Томской, Омской, Тюменской областях. Последовательности фрагментов трех сегментов вирусного генома были определены для 21 РНК изолята, представляющих все исследованные регионы.
Анализ нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностей трех фрагментов вирусного генома выявил пять генетических вариантов вируса HOKV, циркулирующих на территории Дальнего Востока России (геноварианты Шкотово-Китай, Солнечный и Сахалин-Япония), Восточной Сибири (геноварианты Байкал и Сибирь) и Западной Сибири (геновариант Сибирь).
При анализе дальневосточных изолятов, полученных от M. rufocanus, показано, что уровень различия установленных последовательностей L сегмента генома между вариантами превышал 16,8% н.о. и 2,6% а.о. Для L сегмента различие новых нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вируса HOKV и ранее опубликованных штаммов вируса PUUV достигало 23% и 11,4%, соответственно. Уровни различия нуклеотидных/аминокислотных последовательностей с другими хантавирусами были выше и достигали 25%/13% с вирусом TOPV, 25%/17% - c вирусом KHAV, 27%/19% - с вирусом TULV, 34%/25% - с вирусом PHV. Как и в случае L-сегмента, для M-сегмента наибольшие различия выявлены между последовательностями изолятов из Приморского края и острова Сахалин, 21,2 22,0%. Анализ всех трех сегментов генома показал, что генетический вариант Шкотово из Приморского края наиболее близок изолятам из китайской провинции Fusong и представляет собой единый генетический вариант вируса HOKV, обозначенный Шкотово-Китай. Второй генетический вариант представляли изоляты вируса HOKV с островов Сахалин и Хоккайдо (Сахалин Япония), для которых различие аминокислотных последовательностей не превышало 1,2%. Изолят из Солнечного района Хабаровского края был отнесен к третьему генетическому варианту.
Два идентифицированных РНК изолята от полевок, отловленных в районе озера Байкал выявили существенные различия. Уровни различия нуклеотидных/аминокислотных последовательностей L-сегмента двух прибайкальских изолятов составили 18,4%/5,3%, а их отличие от дальневосточных изолятов вируса HOKV составило 17,8-23,6%/3,5-8,8%.
Сравнительный анализ кодируемых аминокислотных последовательностей показал, что на территории Прибайкалья в красно-серых полевках циркулирует два генетических варианта вируса HOKV, отличающихся как друг от друга, так и от дальневосточных вариантов этого вируса. Новые генетические варианты были названы Байкал и Сибирь и выявлены в двух районах, прилегающих к озеру Байкал с южной (Тункинский район Республики Бурятии) и западной (Ольхонский район Иркутской области) сторон и разделенных Приморским хребтом и Хамар-Дабаном.
На большей части территории Азиатской части России в таежных лесных биотопах красно-серая полевка M. rufocanus встречается вместе с красной полевкой M. rutilus, а в ряде регионов Западной Сибири — и с рыжей полевкой, M. glareolus. В 11 из 14 исследованных нами мест отлова в Сибири одновременно отловлено два и более видов полевок (табл. 2), при этом в большинстве районов присутствие специфических антител установлено одновременно у двух и более видов полевок.
Вирусные последовательности были получены от полевок, отловленных в 4 ключевых участках: озеро Телецкое (Республика Алтай), Покровка и Солтон (Алтайский край) и в Тюменской области. Сравнительный анализ новых последовательностей от M. rutilus и M. rufocanus, отловленных в трех сайтах Республики Алтай и Алтайского края, показал, что оба вида являются носителями хантавируса HOKV. Различия по всем сегментам были минимальными в паре M.rutilus/M.rufocanus (1,5-3,4%) из одного места отлова (озеро Телецкое ) и в паре M.rutilus/M.rutilus (1,5-3,0%) из разных, но наиболее близко расположенных мест отлова (Телецкое и Солтон). Различие новых последовательностей вируса из Западной Сибири с HOKV последовательностями всех доступных для сравнения изолятов вируса HOKV варьировало от 14,6% до 22,7% для L- сегмента, от 15,4% до 22,9% для M сегмента, и от 16,4% до 20,6% для S-сегмента генома. Сравнительный анализ установил принадлежность алтайских изолятов к генетическому варианту Сибирь, выявленному в Иркутской области в районе озера Байкал.
Анализ последовательностей фрагмента РНК-полимеразы показал, что дальневосточные изоляты вируса HOKV имели как общие маркерные замены (относительно вируса PUUV, штамм CG1820), присутствующие во всех исследованных изолятах: His59, His137, Lys153, так и замены характерные для пар географических вариантов вируса: E69, Gly73, Met126 у генетических вариантов Шкотово и Солнечный;
Arg53 и Val125 у генетических вариантов Шкотово и Сахалин (рис. 6). Маркерными для генетического варианта Байкал являлись Arg53 и Val125, общие с генетическими вариантами Шкотово, Сахалин и Сибирь, а также Ile121, присутствующий у нескольких вариантов HOKV (Сахалин, Байкал, Сибирь). Общими маркерными аминокислотными остатками вируса HOKV являлись His59 и Lys153.
L сегмент PUUV 49 59 69 119 129 139 149 CG1820 Mg Россия DNKDKEQPIG LVLLMAGVPN DVIQSMEKRI/ /RGVREKILKY QGGLEFIEQL LQIEAQKGNC QSGFRIKFDV VAIR HOKV Cахалин Sakhal-104 Mrf Сахалин....R..... H..................V..I...V...........H...............K.........
Шкотово-Китай SHK/74372 Mrf Шкотово....R..... H......... E..LG...........VM..........H...............K.........
SHK/74307 Mrf Шкотово....R..... H......... E..LG...........VM..........H...............K.........
SHK/74333 Mrf Шкотово....R..... H......... E..LG...........VM..........H...............K.........
SHK/74356 Mrf Шкотово....R..... H......... E..LG...........VM..........H...............K.........
26536 Mrf Шкотово....R..... H......... E..LG...........VM..........H...............K.........
31942 Mrf Чугуев....R..... H......... E..LG...........VM..........H...............K.........
31642 Mrf Кавалер....R...T. H......... E..LG...........VM..........H...V...........K.........
31612 Mrf Кавалер....R..... H......... E..LG...........VM..........H...V...........K.........
Солнечный Soln-574 Mrf Солнеч.......... H......... E...G...........MM..........H...............K.........
Байкал Baik-227 Mrf Бурят....R..... H.............G...KV..I...V...........................K.........
Сибирь Baik-109 Mrf Ольхон.......... H.............G.......I...VI.............H............K.........
Solton-35 Mrt Алтай.......... H.............G.......I...V..............H.........P..K.......V.
Telet-937 Mrf Алтай.......... H.............G.......I...V..............H.........P..K.......V.
Telet-854 Mrt Алтай.......... H.............G.......I...V..............H.........P..K.......V.
Pokrov-674 Mrf Алтай....R..... H.............G.......I...V..............H.........P..K.......V.
Рис. 6. Сравнение аминокислотных последовательностей белка РНК-полимеразы (49 162 а.о.) хантавирусов, выявленных в рыжих (M. glareolus), красно-серых (M. rufocanus) и красных полевках (M. rutilus). Точками обозначены идентичные аминокислоты. Сокращения:
Mg - Myodes glareolus, Mrf – M. rufocanus, Mrt – M. rutilus.
При сравнительном анализе фрагмента нуклеокапсидного белка N всех вновь выявленных и опубликованных изолятов вируса HOKV было установлено, что маркерными аминокислотными остатками генетического типа HOKV являлись Lys237, Ile262, Pro283. Маркерными аминокислотными остатками для геноварианта Сибирь являлись Met127, Ala233, Asp302 и Asp306, а для генетического варианта Байкал – Gln279 и Pro299. Маркерным аминокислотным остатком для изолятов геноварианта Шкотово-Китай являлся Ala229, при этом у всех изолятов данного варианта присутствовало сочетание 10 замен (Ile126, Val168, Ala229, Pro233, Asp234, Lys237, Lys258, Val260, Ile262, Pro283).
На исследованном участке поверхностного гликопротеина G2 маркерным для дальневосточных изолятов был Val262, отсутствующий у изолятов HOKV и штаммов PUUV из других регионов. Сочетание пяти замен (Val262, Ala287, Gly308, Val323, Ser327) являлось характерным для геноварианта Шкотово, а замены Ala287, Gly308, Val323, Ser327 присутствовали у всех изолятов генетического варианта Сибирь. Маркерными аминокислотными остатками для геноварианта Сахалин-Япония являлись Ala308, Ile311, Gly317. Как показывает проведенный анализ, маркерные аминокислотные остатки генотипа HOKV на исследованном участке не выявлены.
В настоящем исследовании нами впервые получено молекулярное доказательство циркуляции вируса HOKV на территории азиатской части России. Циркуляция вируса HOKV в настоящее время установлена на большей части ареала обитания M. rufocanus: на территории Западной Сибири (геновариант Сибирь), Восточной Сибири (геноварианты Байкал и Сибирь), Дальнего Востока (геноварианты Шкотово-Китай и Солнечный), Китая (геновариант Шкотово-Китай), островов Сахалин и Хоккайдо (геновариант Сахалин-Япония).
Полученные нами данные свидетельствуют о широком распространении вируса HOKV на территории Азиатской части России, и о способности его циркуляции в двух видах полевок, красно-серой полевке (M. rufocanus) и красной полевке (M. rutilus). Нами показано, что подобно вирусу PUUV, представленному многочисленными генетическими вариантами, циркулирующими в рыжих полевках (M. glareolus) на территории Европы, вирус HOKV также представлен пятью генетическими вариантами, каждый из которых циркулирует в различных географических регионах азиатской части континента.
До сих пор не решен вопрос о значении в патологии человека вируса HOKV. Среди исследованных образцов от больных ГЛПС из очагов Дальнего Востока (раздел 1) нам не удалось выявить случаев, ассоциированных с вирусом HOKV. Варианты вируса HOKV, значительно отличающиеся от дальневосточных, выявлены в Сибири и на Сахалине, однако в этих регионах отсутствуют не только генетические, но и серологические данные о типах потенциальных возбудителей ГЛПС. Опубликованные данные по выявлению специфических антител у здорового населения регионов основаны на использовании комплекса антигенов хантавирусов, не позволяющего провести дифференциацию вирусов (Малкин и др., 1996). Возможность инфицирования человека вирусом HOKV, либо каким-либо из его генетических вариантов остается предметом дальнейших исследований.
4.3. Изоляты вируса PUUV из Тюменской области При анализе 437 образцов от полевок рода Myodes, отловленных на территории Сибири, были выявлены инфицированные рыжие полевки.
Серопозитивные M. glareolus были обнаружены в четырех местах отлова, расположенных в Омской, Тюменской областях, Республике Алтай и Алтайском крае (табл. 2). РНК изоляты вируса были выявлены от 4 из серопозитивных M. glareolus.
Все ОТ-ПЦР положительные образцы от M. glareolus были собраны на территории Тюменской области. Выявленные вирусные последовательности были наиболее близки к ранее опубликованным последовательностям вируса PUUV из соседней Омской области, минимальное различие для M- и S сегментов генома составило 3,3% и 3,8%, при уровне различия со штаммами из европейской части России 17,0% и 16,0%. Сравнение аминокислотных последовательностей подтвердило, что тюменские изоляты представляют тот же генетический вариант вируса PUUV, что и ранее опубликованные изоляты из Омской области.
На территории Сибири до настоящего времени отсутствуют прямые доказательства хантавирусной инфекции у человека, то есть выявление РНК изолятов хантавирусов от больных ГЛПС и их генетическая идентификация.
Выявление и идентификация вируса PUUV в рыжих полевках (M. glareolus), выполненное нами в Тюменской области, а также ранее опубликованные данные о циркуляции PUUV среди рыжих полевок в Тюменской и Омской областях (Якименко и др., 2008;
Dekonenko et al., 2003), свидетельствуют о возможной связи заболевания людей ГЛПС в этих областях с вирусом PUUV, который является возбудителем ГЛПС в европейских очагах хантавирусной инфекции.
5. Хантавирусы Khabarovsk (KHAV) и Vladivostok (VLAV) и их природные носители Microtus maximowiczii и Microtus fortis 5.1. Генетическая идентификация хантавируса, циркулирующего среди дальневосточных полевок M. fortis К вирусам, связь с заболеваниями человека которых не установлена, относятся вирусы KHAV и VLAV, циркулирующие на территории Дальнего Востока (Horling et al., 1996;
Kariwa et al., 1999).
Исследование хантавируса, циркулирующего в популяциях дальневосточных полевок (M. fortis), было опубликовано нами в 2006 году и основывалось на анализе M-сегмента вирусного генома. Нуклеотидные последовательности M-сегмента (позиции 2735-2993) двух РНК изолятов были выявлены в образцах от серопозитивных дальневосточных полевок M. fortis, отловленных в Надеждинском районе Приморского края вблизи поселка Городечное. Анализ нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностей РНК изолятов от полевок M. fortis показал, что они значительно отличались как от последовательностей вируса KHAV, так и от всех остальных хантавирусов (более чем на 21,9% и 9,8%, соответственно).
Выявленное нами различие последовательностей РНК изолятов от M. fortis от других хантавирусов соответствовало различию, необходимому для их отнесения к новому генетическому типу, который был предварительно назван Городечное (GD). Нельзя было исключить близкого сходства генетического типа GD с вирусом VLAV, выявленным ранее от M. fortis на других участках очаговой территории Приморского края, однако на данном этапе не представлялось возможным их сравнение. Для вируса VLAV были опубликованы только последовательности S–сегмента генома (Kariwa et al., 1997).
Полученные нами характеристики изолятов от M. fortis, а также опубликованные данные о выявлении двух различающихся вирусов KHAV и VLAV у одного вида носителей, дальневосточных полевок (M. fortis), не согласовывались с большинством опубликованных данных о циркуляции каждого вируса в своем природном носителе (Plyusnin & Morzunov, 2001). Для более точной идентификации вида носителей и ассоциированных с ними вирусов нами была получена характеристика геномов хантавирусов и митохондриальной ДНК их природных хозяев - полевок рода Microtus, отловленных на территории Дальнего Востока России.