Роль эпителиально-бактериальных взаимодействий в ассоциативном симбиозе репродуктивного тракта женщин
На правах рукописи
КРЕМЛЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА РОЛЬ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН 03.02.03 – Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Оренбург – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учрежде нии науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН
Научный консультант: Черкасов Сергей Викторович доктор медицинских наук
Официальные оппоненты:
Чайникова доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Ирина Николаевна Оренбургская государственная медицинская ака демия Росздрава Потатуркина-Нестерова доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Наталия Иосифовна Ульяновский государственный университет Перунова доктор медицинских наук, ФГБУН Институт кле Наталья Борисовна точного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет Росздрава
Защита состоится 19 декабря в 12 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03 ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской акаде мии Росздрава (Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, тел.: (3532) 40-35 62, факс: (3532) 77-24-59, e-mail: [email protected], зал заседаний диссертаци онного совета).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава.
Автореферат разослан _ 2013 г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства обра зования и науки Российской Федерации
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, Немцева Наталия Вячеславовна профессор Актуальность проблемы Интерес к изучению эпителиально-микробных взаимодействий, возрос ший в последние годы, определяется стратегически важным положением муко зальных эпителиоцитов - на границе внутренней и внешней сред, а также их способностью, реагируя на внешние стимулы, участвовать в развитии защит ных реакций врожденного и адаптивного иммунитета, в формировании толе рантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов.
Большинство исследований в этой области посвящены взаимодействию эпителиоцитов с патогенными микроорганизмами. Накоплены данные о бакте риальных модулинах, эпителиальных TLR и NLR рецепторах (Yu L. et all, 2009), внутриклеточных сигнальных путях, изменении экспрессии цитокинов, антибактериальных пептидах (McCormick B.A, 2006), способных регулировать локальную иммунную реакцию, обеспечивая защиту от патогенных микроорга низмов.
Изучению эпителиально-микробного взаимодействия с нормофлорой уделяется значительно меньшее внимание, в основном на примере мукозально го иммунитета кишечника. Однако, специфичность функций репродуктивного тракта, требующая обеспечения эффективной защиты от потенциальных пато генов, при сохранении толерантности к генетически чужеродной сперме и пло ду, не позволяет распространить на него данные, полученные в иных биотопах.
Имеющиеся данные об эпителиально-бактериальных взаимодействиях в женском репродуктивном тракте ограничиваются сведениями о роли эпители ального гликогена в поддержании популяции лактобактерий и синтезе эпители альными клетками отдельных антибактериальных пептидов и цитокинов при взаимодействии с патогенами.
Комплексного изучения взаимодействия вагинальных эпителиоцитов с представителями доминантной и ассоциативной микрофлоры влагалища не проводилось, поэтому вопрос о роли эпителиально-бактериальных взаимодей ствий в формировании микробиоценозов и поддержании мукозального имму нитета репродуктивного тракта женщин остается открытым.
Поставленные вопросы лежат в области инфекционной симбиологии, с опорой на концепцию ассоциативного симбиоза с его трехзвеньевой структу рой, включающей хозяина и микрофлору, как доминантную, так и ассоциатив ную (Бухарин О.В. с соавт., 2007). Если к этому добавить, что инфекция в на стоящее время рассматривается как модельная система ассоциативного симбио за (Бухарин О.В. с соавт., 2009), то становится очевидным, что решение задач по изучению эпителиально-бактериальных взаимодействий полностью уклады вается в концепцию первых двух векторов хозяин-доминант и хозяин ассоциант, что актуализирует постановку цели и задач нашей работы.
Цель и задачи исследования Цель: Изучить механизмы эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном биотопе в условиях нормо- и патоценозов и оценить их роль в ас социативном симбиозе репродуктивного тракта женщин.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на числен ность и функциональную активность представителей доминантной и ассоциа тивной микрофлоры влагалища.
2. Определить изменение функциональной активности вагинальных эпите лиоцитов (синтез бактерицидных и регуляторных веществ) в результате взаимо действия с различными вагинальными микросимбионтами.
3. Дать сравнительную характеристику эпителиально-бактериальных взаимо действий в разных типах вагинальных микробиоценозов.
4. Оценить значение микроэкологического статуса вагинального биотопа для функционального состояния женской репродуктивной системы.
5. Охарактеризовать взаимосвязь мукозального иммунитета с характером микрофлоры влагалища и оценить возможность направленной модуляции па раметров мукозального иммунитета пробиотиками.
6. На основе анализа исходов эпителиально-бактериальных взаимодействий обосновать подходы к оценке и коррекции микроэкологического состояния ре продуктивного тракта женщин.
Научная новизна Эпителиально-бактериальные взаимодействия в женском репродуктив ном тракте - модельная система ассоциативного симбиоза, являющаяся основой поддержания микроэкологического гомеостаза.
Установлено, что вагинальные эпителиоциты способны дифференциро вано влиять на свойства микросимбионтов (Патент РФ№2458135), формируя определенный тип микробиоценоза. В условиях нормоценоза эпителиоциты оказывают преимущественно стимулирующее влияние на ростовые свойства и антагонизм нормофлоры (лактобактерий и коринебактерий), одновременно по давляя ростовые свойства, способность к биопленкообразованию и антагони стическую активность ассоциативной микрофлоры (S. aureus и Е. coli).
Особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий при бакте риальном вагинозе, по сравнению с нормоценозом являются: стимуляция спо собности к биопленкообразованию ассоциативных микросимбионтов, сопрово ждающаяся ослаблением подавляющего воздействия на их ростовые свойства, и резкое угнетение свойств “Н2О2+” биоваров лактобактерий.
Установлено стимулирующее влияние экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов женщин на ростовые свойства пробиотического штамма как необходимое условие восстановления нормофлоры влагалища (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2012136487).
Выявлены механизмы регуляции эпителиально-бактериальных взаимо действий, основанные на цитокиновой реакции вагинальных эпителиоцитов при взаимодействии с микросимбионтами и дифференцированном дозозависи мом влиянии провоспалительных цитокинов на свойства вагинальных микро симбионтов. Изучение экспрессии цитокинов вагинальными эпителиоцитами при контакте с микросимбионтами выявило выраженное усиление продукции провоспалительных цитокинов при взаимодействии с E. coli и S. aureus, тогда как лактобациллы и коринебактерии вызывали умеренную стимуляцию их про дукции.
В условиях in vivo продемонстрирована значимость нормофлоры влага лища для состояния цитокинового профиля вагинального содержимого. Дефи цит лактофлоры сопровождается повышением уровня провоспалительных ци токинов, сопоставимым с уровнем, наблюдаемым при ИППП.
Выявлено дифференцированное дозозависимое влияние цитокинов про воспалительной направленности на ростовые свойства вагинальных микросим бионтов. В концентрациях, характерных для нормоценоза, происходит стиму ляция свойств лактобацилл и коринебактерий, и подавление роста S.aureus и E.coli. Цитокины в концентрациях, свойственных бактериальному вагинозу, на против, угнетают ростовые свойства лактобацилл, стимулируя (в случае с IL- и IL-8) свойства S.aureus и E.coli.
Установлено, что результирующая эпителиально-бактериальных взаимо действий, выражающаяся в изменении функционального состояния эпителио цитов и микросимбионтов, может быть использована в качестве критерия диф ференциации автохтонной от аллохтонной микрофлоры в условиях женского репродуктивного тракта.
Установлен синергидный характер взаимодействий доминантной микро флоры с мукозальными эпителиоцитами влагалища, проявляющийся в стиму ляции ростовых свойств и антагонизма лактобактерий, и усилении синтеза эпи телиоцитами веществ антимикробной направленности, что в совокупности слу жит основой поддержания колонизационной резистентности биотопа.
Выявлено, что нарушения микроэкологического состояния вагинального биотопа, проявляющиеся в дефиците доминантных микросимбионтов и повы шении уровня провоспалительных цитокинов – одна из причин женской инфер тильности, что свидетельствует о роли микробного фактора в регуляции гомео стаза хозяина и функционировании репродуктивной системы.
Показана возможность модуляции параметров мукозального иммунитета влагалища пробиотиками. Интравагинальная пробиотическая терапия оказыва ет влияние на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта, выражающееся в противовоспалительном тренде ба ланса цитокинов.
Теоретическая и практическая значимость В теоретическом плане получены новые данные о механизмах симбиоти ческих взаимодействий макроорганизма с доминантной и ассоциативной мик рофлорой вагинального биотопа, лежащих в основе формирования микробио ценоза и определяющих состояние мукозального иммунитета.
Выявленная в ходе исследования связь микроэкологического состояния вагинального биотопа с фертильностью расширяет патогенетические представ ления о причинах женского бесплодия, обосновывая роль микробного фактора в качестве регулятора гомеостаза организма и функционирования репродуктив ной системы.
Практическую значимость работы определяют:
- Новые критерии дифференциации автохтонной и аллохтонной ваги нальной микрофлоры, позволяющие осуществлять диагностику микроэкологи ческих нарушений репродуктивного тракта женщин.
-Выявление связи состояния микробиоценоза с цитокиновым профилем вагинального биотопа позволило предложить определение уровня IL-1 ваги нальной жидкости в качестве маркера дисбиотических состояний женского ре продуктивного тракта.
-Разработан способ оценки влияния вагинальных эпителиоцитов на био логические свойства бактерий, который по изменению свойств микроорганиз мов позволяет оценивать влияние как эпителиальных экзометаболитов, так и непосредственного контакта с эпителиальными клетками (Патент РФ№2458135).
-Предложен новый способ индивидуального подбора пробиотика для эф фективной интравагинальной пробиотической терапии, основанный на оценке результатов взаимодействия вагинальных эпителиоцитов пациентки с пробио тическими штаммами (Положительное решение о выдаче патента на изобрете ние по заявке №2012136487).
Основные положения, выносимые на защиту Эпителиально-бактериальные взаимодействия - модельная система ассо циативного симбиоза, являющаяся основой поддержания микроэкологического гомеостаза биотопов женского репродуктивного тракта.
Результирующая бактериально-эпителиальных взаимодействий, выра жающаяся в изменении функционального состояния эпителиоцитов и микро симбионтов, - дифференциальный критерий отличия автохтонной и аллохтон ной микрофлоры вагинального биотопа.
Эпителиально-бактериальные взаимодействия определяют колонизаци онную резистентность биотопов репродуктивного тракта, регулируя числен ность и функциональное состояние доминантной микрофлоры и напряженность факторов мукозального иммунитета.
Дефицит доминантных микросимбионтов и высокий уровень провоспа лительных цитокинов, сопряженные с неудачными попытками ЭКО, характе ризуют связь репродуктивной функции женского организма с микроэкологиче ским состоянием биотопов нижних отделов репродуктивного тракта.
Апробация работы Основные положения работы доложены на V-VII Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2006, 2009, 2012;
Российской научной конференции «Репродуктивное здоровье населе ния», г.Оренбург, 2005;
2 Международном конгрессе по пробиотикам «Санкт Петербург-Пробиотики-2009»;
IV Региональном научном форуме «Мать и Ди тя».г. Екатеринбург, 2010;
Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», г. Санкт Петербург, 2010.
Публикации По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 11- в изданиях, ре комендованных ВАК РФ, и 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 267 страницах и содержит введение, обзор ли тературы, описание материалов и методов, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и указатель литературы, включающий 55 отечественных и 254 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 21 таблицами и 23 рисунками.
Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН в соответствии с планом научно-исследовательской работы: тема «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека», № гос. регистрации 01.2.00 104756;
проект «Межбактериальные взаимодействия и их роль в формировании микробных биоценозов тела челове ка» по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»;
те ма «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в раз личных биологических системах», № гос. регистрации 0120.0 600145;
програм ма инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-У-4 1023.
Материалы и методы исследования Эпителиально-бактериальные взаимодействия были изучены у 326 жен щин, из которых у 62 с нормобиоценозом определяли влияние эпителиально бактериальных взаимодействий на свойства микрофлоры, у 22- экспрессию ци токинов эпителиоцитами при воздействии на них микросимбионтов, у 16 про водили оценку характера взаимодействий эпителиоцитов с ауто- и гетероштам мами лактобацилл;
у 36 женщин, страдающих бактериальным вагинозом, опре деляли влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на свойства мик рофлоры;
у 24 - изменение экспрессии цитокинов эпителиоцитами при воздей ствии на них микросимбионтов;
у 78 женщин, с первичным обращением по по воду бесплодия, изучали связь состояния микробиоценоза с цитокиновым про филем влагалища;
у 52 пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием оце нивали влияние микроэкологического состояния вагинального биотопа на ис ходы ЭКО;
и у 36 женщин, с выраженным дефицитом лактофлоры, при прове дении интравагинальной терапии пробиотиком исследовали состояние муко зального иммунитета и оценивали эффективность способа индивидуального подбора пробиотика.
Первичные вагинальные эпителиоциты получали с боковых стенок влага лища в первой фазе менструального цикла, элиминировали сопутствующую микрофлору, оценивали общее количество и процент живых эпителиоцитов пу тем подсчета в камере Горяева после окрашивания флюорохрома диацетатом при люминесцентной микроскопии (Д.Клаус, 1990), после чего доводили взвесь до концентрации 106 кл/мл. Для оценки контактного бактериально эпителиального взаимодействия эпителиоциты инактивировали 0,4% раствором формалина. Для изучения влияния внеклеточных секреторных продуктов, ис пользовали фильтрат (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм "Milli pore", USA) 4 часовой культуральной жидкости эпителиоцитов, культивируе мых в среде Хенкса.
В работе были использованы штаммы Corynebacterium spp., S.aureus, E.coli и различные по продукции Н2О2 Lactobacillus spp., выделенные из нижне го отдела репродуктивного тракта женщин. Клинические изоляты идентифици ровали по совокупности морфологических, тинкториальных и биохимических характеристик (Бержди, 1997). Способность лактобацилл продуцировать Н2О определяли способом О.В.Бухарина с соавт. (2012).
Лактобациллы культивировали в бульоне MRS (Sifin, Германия), S.
aureus, E. coli и коринебактерии - в 2% мясопептонном бульоне (НПО “Пита тельные среды”, Махачкала) в микроаэрофильных условиях при 37С. Бактери альные супернатанты получали фильтрованием суточной культуральной жид кости (0,22 µм, Millipore). Термоинактивированные бактерии получали нагре ванием взвеси суточной культуры бактерий до 75°C в течение 20 минут, с по следующим контрольным высевом, после чего готовили взвесь 107 кл/мл.
Для определения влияния эпителиально-бактериальных взаимодействий на биологические свойства бактерий к взвеси изучаемых бактерий добавляли инактивированные эпителиоциты в соотношении 1/10, или эпителиальные су пернатанты в объемном соотношении 1/7. При изучении влияния эпителиоци тов на антагонистическую активность микросимбионтов использовали методи ку А.В.Семенова с соавт.(2007). Изменение антагонизма выражали в процентах угнетения прироста индикаторной культуры по сравнению с контролем. Изме нение ростовых свойств бактерий определяли фотометрически (= 540 нм) и чашечным методом, путем подсчета КОЕ после высева на плотные питатель ные среды. Способность бактерий к образованию биопленок изучали по мето дике O’Toole с соавт. (1999).
Для определения влияния микросимбионтов на функциональную актив ность вагинальных эпителиоцитов к их взвеси добавляли термоинактивирован ные лактобациллы или их супернатанты, соблюдая соотношение эпителио цит/микроорганизм - 1/10, или микробный супернатант, при объемном соотно шении микробный супернатант/взвесь эпителиоцитов – 1/7. Контролем служи ли эпителиоциты, подвергнутые воздействию среды культивирования лактоба цилл и/или 0,1 М ФСБ (рН 7,0-7,2).
Определение концентрации цитокинов проводили в эпителиальных су пернатантах и вагинальном содержимом, которое получали, омывая стенки вла галища 2 мл стерильного физиологического раствора. Ингибирование активно сти протеаз в полученных пробах осуществляли фенилметилсульфонилфлюо ридом в конечной концентрации 5 мкМ/мл. Определение в вагинальном лаваже концентрации цитокинов IL 1, ra IL1, IL4, INF проводили иммунофермент ным методом, используя наборы производства ООО «Цитокин», С-Петербург, секреторного Ig A (sIg A) и лактоферрина, - ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, TGF 1- BD Biosciences, США по протоколам, рекомендованным фирмами производителями.
Для оценки влияния цитокинов на свойства бактерий к взвеси исследуе мых микроорганизмов (ПМО=105 КОЕ/мл) в соответствующей культуральной среде добавляли, соблюдая объемное соотношение 10/1, раствор цитокина, соз давая конечные концентрации, характерные для нормо- или патоценоза. Влия ние цитокинов на микроорганизмы оценивали по изменению их ростовых свойств и способности к образованию биопленок.
Диагностику инфекций, передаваемых половым путем, проводили мето дами полимеразной цепной реакции, прямой иммунофлюоресценции (уреа плазмоз и хламидиоз) и культуральным методом (трихомоноз). Воспалитель ную реакцию оценивали при микроскопии нативного мазка из влагалища и цервикального канала. Бактериальный вагиноз диагностировали по критериям R. Amsel с соавт. (1983).
Для проведения интравагинальной пробиотической терапии использовали пробиотический штамм Lactobacillus acidophilus вагинального происхождения (Экофемин, Pharma-vinci, Дания), который, согласно рекомендациям произво дителя, вводили интравагинально 2 раза в сутки в течение 6 суток. Эффектив ность пробиотической терапии определяли по восстановлению обсемененности слизистой влагалища лактобактериями (ПМО106) через 7 дней после заверше ния лечения и первой половине (на 7-8 день) следующего менструального цик ла.
Статистическую обработку полученных результатов, проверку нормаль ности распределения данных проводили с использованием критерия Колмого рова-Смирнова, а для оценки достоверности различий между опытными и кон трольными группами использовали критерий Манна-Уитни (С. Гланц,1998). Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости p 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение На первом этапе нашего исследования было изучено влияние бактериаль но-эпителиальных взаимодействий на биологические свойства вагинальных микросимбионтов в условиях нормо- и патоценозов, которое оценивали по из менению важнейших физиологических свойств, определяющих выживание бактериальной популяции (Перунова Н.Б., 2011) - способности к образованию биопленок, ростовых свойств и антагонистической активности.
Для этого был разработан способ, позволяющий оценивать влияние на бактерии как секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов, так и непо средственного контакта с ними (Патент РФ№2458135).
Было установлено, что вагинальные эпителиоциты, полученные при нор моценозе, способны дифференцированно изменять биологические свойства микрофлоры влагалища как контактно, так и посредством своих внеклеточных продуктов (рис. 1). Изучение влияния вагинальных эпителиоцитов, сформиро ванных в условиях нормоценоза, в отношении S.aureus и E.coli выявило подав ление ростовых характеристик, обусловленное в основном воздействием эпи телиальных экзометаболитов (рис.1). В отношении ростовых свойств лактобак терий и коринебактерий было выявлено как стимулирующее, так и подавляю щее влияние вагинальных эпителиоцитов. При этом стимулирующее влияние превалировало как по выраженности, так и по распространенности. Влияние контактного взаимодействия и внеклеточных секреторных продуктов эпите лиоцитов на ростовые свойства этих микроорганизмов было сходным.
E.coli:
секреторные продукты контактное взаимодействие S.aureus:
секреторные продукты контактное взаимодействие Corynebacterium:
секреторные продукты контактное взаимодействие Lactobacillus:
секреторные продукты контактное взаимодействие 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% стимуляция индифферентно подавление Рис.1 Изменение ростовых свойств бактерий при контактных бактериально эпителиальных взаимодействиях и под влиянием внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов (нормоценоз) Таким образом, в условиях нормоценоза эпителиоциты оказывали пре имущественно стимулирующее влияние на ростовые свойства лактобактерий и коринебактерий, и подавляющее - на S.aureus и E.coli.
При изучении влияния вагинальных эпителиоцитов на антагонистиче скую активность представителей вагинальной микрофлоры было выявлено, что контактное сокультивирование бактерий с инактивированными вагинальными эпителиоцитами не оказывало статистически значимого влияния на антагони стическую активность изученных бактерий.
Воздействие же внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпи телиоцитов на лактобактерии и коринебактерии стимулировало их антагони стическую активность в отношении S.aureus и E.coli (рис.2). Влияние внекле точных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов на взаимную ан тагонистическую активность S.aureus и E.coli было либо индифферентным, ли бо подавляющим.
50, % * * * 45, * 40, 35, 30, 25, 20, 15, * 10, 5, 0, в отношении в отношении в отношении в отношении в отношении в отношении s.aureus. e.coli. s.aureus. e.coli. e.coli. s.aureus.
Lactobacillus. spp. Corynebacterium spp. S.aureus. E.coli.
супернатант бактерий эпителиальный супернатант супернатант бактерий, обработанных секреторными продуктами эпителиоцитов Рис.2.Изменение антагонистической активности бактерий под влияниием вне клеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов *-р0,05 при сравнении с бактериями без предварительной обработки Предварительный контакт эпителиоцита с микросимбионтом, на свойства которого впоследствии оказывалось влияние эпителиальными экзометаболита ми, усиливал интенсивность воздействия, не меняя его направленности. Наи большая стимуляция воздействия наблюдалась при взаимодействии с термо инактивированными бактериями. Воздействие бактериальных экзометаболитов было менее выраженным, что может быть связано с наличием в микробных су пернатантах ферментных систем, способных снижать активность эпителиаль ных экзометаболитов (табл. 1). Усиление интенсивности воздействия в резуль тате предварительного контакта с микросимбионтами подтверждает, что эпите лиально-бактериальные взаимодействия динамический процесс, распознавание типа микросимбионта при котором меняет характер реакции эпителиоцита на него.
Таблица 1.Изменение свойств бактерий под влиянием экзометаболитов эпите лиоцитов, полученных при нормоценозе.
Изменение свойств секреторные продукты эпителиоцитов бактерий без стимулированных стимулированных (% по отношению предварительной микробным термоинактивирован к контролю) стимуляции супернатантом ными бактериями ростовые - (18,3±1,3) - (19,3±2,3) - (28,9±3,6) * свойства S. aureus антагонизм к -(28,5±5,73) -(31,3±3,8) -(33,6±2,6) E. coli ростовые - (14,5±0,73) - (17,1±1,5) - (21,1±1,2) * свойства E. coli антагонизм к -(11,2±2,6) -(15,1±3,1) -(19,6±3,9) * S. aureus ростовые +(20,1±3,5) +(30,2±4,1) * +(43,4±5,2) * Coryne- свойства bacterium антагонизм к +(371,4±13,7) +(379,5±5,8) +(398,6±16,2) S. aureus spp антагонизм к +(313,2±13,2) +(321,1±14,1) +(349,5±15,8) * E. coli ростовые +(22,2±3,6) +(34,9±3,9) * +(48,6±5,3) * Lactobacil свойства lus spp антагонизм к +(50,3±2,6) +(58,9±4,9) +(72,5±6,3) * S. aureus антагонизм к +(35,7± 4,1) +(42,3±5,1) +(55,8±6,3) * E. coli «-»- подавление «+»-стимуляция *- р0,05 –достоверные различия при сравнении с влиянием секреторных про дуктов эпителиоцитов без предварительной стимуляции Суммируя полученные данные, следует отметить, что в условиях нормо ценоза вагинальные эпителиоциты способны оказывать дифференцированное влияние на ростовые свойства и антагонистическую активность различных представителей микробиоценоза влагалища, вызывая в большинстве случаев подавление ростовых свойств S. aureus и Е. coli и ослабление их антагонисти ческой активности. В отношении же лактобактерий и коринебактерий преоб ладало стимулирующее воздействие как на ростовые свойства, так и на антаго нистическую активность. Результирующей этого влияния является создание се лективных преимуществ для конкретного доминантного и/или ассоциативного микросимбионта путем стимуляции его ростовых свойств и антагонистической активности на фоне подавления свойств минорных симбионтов. Это позволяет рассматривать эпителиоциты как “первую линию обороны” макропартнера в вагинальном микробиоценозе, способную оказывать регуляторные воздействия на микросимбионтов с целью поддержания колонизационной резистентности, а эпителиально-бактериальные взаимодействия в качестве основы формирования и стабильного существования ассоциативного симбиоза влагалища.
Направленность и выраженность изменений ростовых свойств и антаго нистической активности лактобактерий и коринебактерий по сравнению с ана логичными показателями у S.aureus, E.coli, вероятно, являются отражением эволюционно сложившейся генетической и метаболической интеграции этих микроорганизмов с макропартнером. С этих позиций, результирующая бакте риально-эпителиальных взаимодействий, вероятно, может рассматриваться в качестве дифференциального критерия отличия автохтонной от аллохтонной микрофлоры за счет создания селективных преимуществ для автохтонных мик росимбионтов путем стимуляции их ростовых свойств и антагонистической ак тивности на фоне подавления свойств аллохонных микроорганизмов.
Изучение особенностей эпителиально-бактериальных взаимодействий в условиях патоценоза было проведено на примере бактериального вагиноза одного из наиболее распространенных вариантов дисбиоза репродуктивного тракта женщин, характеризующегося резким снижением количества лактобак терий и массивным ростом облигатных анаэробов, формирующих биопленки (Кира Е.Ф., 2001).
Влияние секреторных продуктов эпителиоцитов, полученных от женщин с БВ, на ростовые свойства ассоциантов было угнетающим, но менее выражен ным, чем влияние экзометаболитов эпителиоцитов, полученных при нормоце нозе. Способность к биопленкообразованию под влиянием супернатантов эпи телиоцитов, полученных из биотопов с нормо- и патоценозом, менялась диа метрально противоположно: если при нормоценозе наблюдалось угнетение способности к биопленкообразованию как S. aureus, так и E.coli, то в условиях бактериального вагиноза способность к образованию биоплёнок у этих микро организмов усиливалась. То есть, при воздействии эпителиоцитов, полученных при БВ, отмечено угнетение ростовых свойств ассоциантов, что, вероятно, спо собствовало поддержанию колонизационной резистентности, но при этом уси ливалась их способность к биопленкообразованию, что приводило к формиро ванию патомикробиоценозов.
Учитывая, что в патогенезе БВ ведущее место принадлежит снижению об семененности влагалища доминантными микросимбионтами - лактобактерия ми, в особенности их “Н2О2+” биоварами, мы изучили взаимодействия эпите лиоцитов с биоварами лактобактерий, различающимися по продукции перекиси водорода (рис. 3).
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% lactobacillus spp lactobacillus spp lactobacillus spp lactobacillus spp Н2О2+ Н2О2+ Н2О2-- Н2О2 нормоценоз бактериальный нормоценоз бактериальный вагиноз вагиноз подавление индифферентно стимуляция Рис 3.Влияние секреторных продуктов эпителиоцитов, полученных из разных типов микробиоценозов на ростовые свойства лактобацилл Результатом эпителиально-бактериальных взаимодействий в условиях БВ являлось преобладающее угнетение роста и способности к биопленкообразова нию “Н2О2+” биоваров лактобактерий (рис. 3), и стимуляция этих свойств у “Н2О2-” биоваров лактобактерий, что, с одной стороны, объясняет устойчи вость этого типа патоценоза, а с другой, снижение колонизационной резистент ности нижних отделов женского репродуктивного тракта при нем.
Далее, оценивая по аналогии с нормоценозом, ответную реакцию эпите лиоцитов на предварительный контакт с микросимбионтами, зафиксировали повышение интенсивности воздействия эпителиальных экзометаболитов на свойства микроорганизмов, направленность влияния при этом не менялась.
Воздействие на эпителиоциты оказывали как микробные секреторные продук ты, так и термоинактивированные бактерии, однако воздействие последних бы ло более эффективно (табл.2). Изменение функциональной активности эпите лиоцитов, выражалось в повышении интенсивности угнетающего воздействия на прирост “Н2О2+”биоваров лактобактерий, стимулирующего воздействия на способность ассоциантов к биопленкообразованию и ростовые свойства “Н2О2-” биоваров лактобактерий.
Таблица 2. Изменение свойств бактерий под влиянием секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов, полученных при бактериальном вагинозе секреторные продукты эпителиоцитов изменение свойств бактерий без стимулированных стимулированных (% по отношению предварительной микробным термоинактивирван к контролю) стимуляции супернатантом ными бактериями ростовые - (12,5±2,1) - (15,3±2,3) - (21,1±1,6) * свойства S. aureus способность к +(15,1±1,0) +(21,3±1,8) +(31,6±2,0) * образованию биопленок ростовые - (6,7±4,9) - (7,1±1,5) - (5,1±1,2) свойства E. coli способность к +(17,8±3,6) +(20,3±2,6) +(35,1±3,8) * биопленко образованию ростовые +(12,1±2,6) +(20,2±3,9) +(39,4±4,6) * Lactobacil- свойства lus spp способность к образованию H2O2”-” +(23,1±4,3) +(37,1±3,8) +(40,8±3,0) * биопленок ростовые -(3,3±1,9) -(2,9±0,9) -(11,6±2,4) * Lactobacil- свойства lus spp способность к -(6,4±1,6) -(9,6±2,9) -(12,7±2,5) образованию H2O2”+” биопленок «-»- подавление «+»-стимуляция *- р0,05 –достоверные различия при сравнении с влиянием секреторных про дуктов эпителиоцитов без предварительной стимуляции Особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий при бакте риальном вагинозе, по сравнению с нормоценозом являются: стимуляция спо собности к биопленкообразованию ассоциативных микросимбионтов, сопрово ждающаяся ослаблением подавляющего воздействия на их ростовые свойства, и резкое угнетение “Н2О2+” биоваров лактобактерий, на фоне стимуляции рос товых свойств “Н2О2-” биоваров лактобактерий.
То есть, эпителиоциты, полученные от женщин с БВ, оказывали влияние на микроорганизмы, характерное для низкой колонизационной резистентности.
Это происходило вследствие угнетения лактобатерий, преимущественно их “Н2О2+” биоваров, играющих ведущую роль в поддержании колонизационной резистентности вагинального биотопа (Черкасов С.В., 2006), и ослабления уг нетающее воздействия эпителиоцитов на бактерии ассоцианты. С другой сто роны, дифференцированное подавление роста “Н2О2+” биоваров доминантного микросимбионта, в совокупности со стимулирующим влиянием на способность к биопленкообразованию ассоциативных микросимбионтов способствует фор мированию и устойчивости таких патомикробиоценозов. Описанные особенно сти отражают реальную клиническую ситуацию с БВ: снижение колонизаци онной резистентности соотносится с повышенным риском возникновения за болеваний, передаваемых половым путем, и высокой частотой воспалительных заболеваний женских половых органов, возникающих на фоне БВ;
стимуляция биопленкообразования объясняет трудности антибатериальной терапии как самого БВ, так и иных инфекций, возникающих на его фоне (Кира Е.Ф., 2001).
Таким образом, стимуляция биопленкообразования и угнетение роста лактобактерий, являющиеся результатом бактериально-эпителиальных взаимо действий при бактериальном вагинозе, раскрывают один из механизмов фор мирования и устойчивости патомикробиоценоза и снижения колонизационной резистентности вагинального биотопа у женщин. Это подтверждает ключевую роль эпителиально-бактериальные взаимодействий в формирования вагиналь ных нормо- и патоценозов.
Следующий этап нашего исследования предусматривал оценку влияния эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном биотопе на функ циональное состояние мукозальных эпителиоцитов в условиях нормо- и пато ценозов. Динамику функционального состояния оценивали по изменению экс прессии эпителиоцитами цитокинов, а также антибактериальной активности эпителиальных экзометаболитов. В качестве факторов воздействия выступали термоинактивированные вагинальные микросимбионты и фильтраты их суточ ных супернатантов.
При изучении влияния доминантных микросимбионтов на антибактери альную активность эпителиальных экзометаболитов было отмечено усиление их бактерицидного эффекта (рис.4), причем эффективность контактного взаи модействия с термоинактивированными лактобациллами была выше, чем воз действие их секреторных продуктов.
% подавления прироста биомассы Е.сoli S.aureus интактные эпителиоциты эпителиоциты, обработанные супернатами лактобацилл эпителиоциты, обработанные tинактивированными лактобациллами Рис.4 Изменение антибактериальной активности эпителиальных экзометаболи тов в результате взаимодействия эпителиоцитов с доминантными микросимби онтами *-р0,05 при сравнении с интактными эпителиоцитами Таким образом, доминантные микросимбионты стимулировали антимик робную активность вагинальных эпителиоцитов. Если учесть описанную ранее способность мукозальных эпителиоцитов стимулировать антагонизм доми нантных микросимбионтов, то можно констатировать синергидное взаимодей ствие хозяина и доминанта, направленное на поддержание колонизационной резистентности вагинального биотопа.
Исследование влияния эпителиально-бактериальных взаимодействий на экспрессию цитокинов показало, что продукция вагинальными эпителиоцитами цитокинов изменялась как при взаимодействии с термоинактивированными бактериями (рис.5), так и секреторными продуктами микроорганизмов (рис.6), и имела отличия у эпителиоцитов, полученных при нормоценозе и бактериаль ном вагинозе.
5, 4, 4, 3, 3, 2, 2, 1, 1, 0, 0, Lactobacillus. spp. Corynebacterium spp S.aureus E.coli IL-6 IL-1 IL-8 TNF Рис.5 Экспрессия цитокинов эпителиоцитами при контакте с термоинактивиро ванными бактериями (кратность изменения по отношению к базовой секреции).
*р0,05 – достоверные различия при сравнении с базовой секрецией цитокинов.
Изучая эпителиоциты, сформировавшиеся в условиях нормоценоза, мы обнаружили, что влияние термоинактивированной доминантной вагинальной микрофлоры – лактобактерий (рис.5) умеренно усиливало продукцию эпите лиоцитами IL-6, IL-1 и IL-8 и подавляло продукцию фактора некроза опухоли.
Секреторные продукты лактобактерий (рис.6) не оказывали влияние на про дукцию IL-1 и IL-8 и умеренно стимулировали секрецию вагинальными эпи телиоцитами IL-6 и TNF.
В качестве грамположительного представителя ассоциативных вагиналь ных микросимбионтов был выбран S.aureus. Контакт эпителиоцитов с термо инактивированными S.aureus не влиял на экспрессию цитокинов, за исключе нием подавления продукции TNF (рис.5). Напротив, взаимодействие ваги нальных эпителиоцитов с секреторными продуктами S.aureus (рис.6) приводило к выраженной стимуляции продукции IL-6 и IL-1 (в 5,8 и 7,5 раз соответст венно) и практически не изменяло экспрессию IL-8 и TNF.
10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, Lactobacillus. spp. Corynebacterium S.aureus E.coli spp IL-6 IL-1 IL-8 TNF Рис.6 Экспрессия цитокинов эпителиоцитами при взаимодействии с секретор ными продуктами бактерий (кратность изменения по отношению к базовой секреции).
*р0,05 – достоверные различия при сравнении с базовой секрецией цитокинов.
В качестве грамотрицательного представителя ассоциативных вагиналь ных микросимбионтов была выбрана E.coli. Влияние секреторных продуктов E.coli на продукцию цитокинов было аналогично влиянию секреторных про дуктов S.aureus (рис.6). Напротив, результаты воздействия термоинативирован ных E.coli и S.aureus значительно различались - взаимодействие эпителиоцитов с E.coli стимулировало экспрессию TNF и IL-1 и значительно подавляло экс прессию IL-6 (рис.5).
Изменение экспрессии цитокинов при взаимодействии эпителиоцитов, полученных при нормоценозе, с коринебактериями было во многом аналогич но результатам взаимодействия с лактобактериями: умеренная стимуляция продукции IL-8, IL-6, IL-1 и подавление продукции TNF, исключение соста вила лишь продукция IL-6, которая выражено стимулировалась секреторными продуктами коринебактерий (рис.6).
При сравнении влияния на продукцию цитокинов термоинактивирован ных бактерий и их экзометаболитов было выявлено, что инактивированные лактобактерии оказывают большее воздействие, чем экзометаболиты лактобак терий, для ассоциативных микросимбионтов прослеживалась обратная тенден ция – воздействие экзометаболитов было более значимо, чем контакт с термо инактивированными ассоциантами.
Таким образом, взаимодействие мукозальных эпителиоцитов с доми нантными вагинальными микросимбионтами в условиях нормоценоза характе ризуется умеренным усилением продукции цитокинов провоспалительной на правленности, возникающим преимущественно в результате контакта эпите лиальной и микробных клеток. Взаимодействие эпителиоцитов с ассоциатив ными микросимбионтами приводят к выраженному изменению экспрессии ци токинов, обусловленному в основном влиянием секреторных продуктов сим бионтов.
Полученные результаты свидетельствуют о различном влиянии ассоциа тивной и доминантной микрофлоры на продукцию цитокинов эпителиоцитами.
Явно заметны отличия в цитокиновой реакции эпителиоцита на взаимодейст вие с грамположительными и грамотрицательными термоинактивированными бактериями (рис. 5,6). Выявленные отличия можно объяснить различием в строении клеточной стенки исследуемых микроорганизмов, тем более, что ва гинальные эпителиоциты имеют определенный дисбаланс TLR4/TLR2. Кроме того, отсутствие реакции эпителиоцитов на контакт с убитым S.aureus возмож но связано с особенностями строения его клеточной стенки, характеризующей ся наличием протеина А, способного экранировать пептидогликан (Дерябин Д.Г., 2000).
Умеренная цитокиновая реакция эпителиоцитов на доминантные микро симбионты по сравнению с ассоциативными микросимбионтами является есте ственной, и при постоянном взаимодействие эпителиальных клеток с лактобак териями не вызывает воспаления из-за иммунного ответа на нормофлору. Му козальные эпителиоциты при этом не были, вопреки ожиданию, “ареактивны” по отношению к доминантному микросимбионту. Умеренное повышение уров ня провоспалительных цитокинов в результате эпителиально-бактериальных взаимодействий с доминантным микросимбионтом вероятно способствует под держанию врожденного иммунитета слизистых оболочек.
Характер цитокиновой реакции эпителиальных клеток на доминантные микросимбионты, а особенно на их экзометаболиты, может служить одним из критериев, позволяющих дифференцировать ассоциативные и доминантные микросимбионты. Так, однонаправленное влияние лактобактерий и коринебак терий на изменение экспрессии цитокинов вагинальными эпителиоцитами по зволяет рассматривать коринебактерии в качестве представителя нормофлоры.
Кроме того, эти данные могут быть использованы для индивидуального подбо ра пробиотических препаратов на основе оценки их влияния на продукцию ци токинов в репродуктивном тракте женщин.
Полученные результаты свидетельствуют, что при эпителиально бактериальных взаимодействиях доминантные и ассоциативные микроорганиз мы оказывают дифференцированное влияние на функциональное состояние мукозальных эпителиоцитов, что должно учитываться при регуляции муко зального иммунитета.
Изучение экспрессии цитокинов эпителиоцитами, полученными от паци енток, страдающих бактериальным вагинозом, выявило повышенный по срав нению с эпителиоцитами, полученными при нормоценозе, уровень базовой экс прессии цитокинов (рис.7).
TNF БВ стимул.
IL-8 БВ стимул. lactobacillus.
БВ базовая S.aureus IL-1 spp Нормоценоз IL- Нормоценоз базовая Нормоценоз стимул.
стимул. S.aureus lactobacillus.
spp Рис.7 Экспрессия цитокинов эпителиоцитами, сформировавшимися при нор моценозе и бактериальном вагинозе, при взаимодействии с секреторными про дуктами бактерий.
Данный факт можно объяснить длительным влиянием патологического микроокружения, характерного для бактериального вагиноза. Измененной ока залась и реакция на стимуляцию секреторными продуктами вагинальных мик росимбионтов. Так, взаимодействие с супернатантом лактобацилл вызывало умеренное усиление экспрессии цитокинов, которое значительно превосходило практически отсутствующую реакцию на секреторные продукты S.aureus. Эпи телиоциты, полученные при нормоценозе, демонстрировали диаметрально противоположную реакцию – практически не реагировали на экзометаболиты лактобацилл, и бурно на S.aureus. Обнаруженные особенности отчасти объяс няют снижение колонизационной резистентности при бактериальном вагинозе, где ключевая в мукозальном иммунитете влагалища клетка - эпителиоцит (Wira C.R. et all, 2005) утрачивает способность адекватно реагировать на угро зу.
Для подтверждения обнаруженной в условиях in vitro закономерности мы провели сравнительный анализ цитокинового профиля вагинальной жидкости у женщин с нормоценозом влагалища, дефицитом лактобактерий и бактериаль ным вагинозом (табл. 3).
Повышеный уровнь IL-1 и IL-8 и пониженный TGF 1 наблюдается у пациенток не только в группе с бактериальным вагинозом, но и при дефиците лактофлоры, не сопровождающимся массивным ростом анаэробной микрофло ры, что подтверждает результаты, полученные ранее.
Таблица 3. Концентрация цитокинов вагинального содержимого в зависимо сти от состояния микробиоценоза влагалища.
состояние TGF TNF IL-8 IL- IL-6 (pg/ml) микробиоценоза (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (ng/ml) нормоценоз (n=12) 21,3±5,1 2,7±0,9 366±69 32,9±10,1 8,7±0, дефицит лактобак 52,9±11,0* 1,7±0,6 792±114* 434±217* 4,6±0,3* терий (n=9) бактериальный ва 39,8±21,4 2,1±0,8 780±101* 480±274* 4,9±0,4* гиноз (n=16) Примечание: *р0,05 – достоверные различия при сравнении с группой «нор моценоз» Суммируя данные по влиянию микросимбионтов на продукцию эпите лиоцитами цитокинов, следует отметить, что лактобактерии, составляющие по давляющее большинство микросимбионтов в условиях нормоценоза, поддер живают умеренную цитокиновую реакцию эпителиоцитов, а их утрата, или час тичное замещение ассоциативными симбионтами вызывает резкое возбужде ние клеток макроорганизма, проявляющееся в многократном усилении экспрес сии цитокинов провоспалительной направленности. Наиболее чувствительно на изменения в микробиоценозе влагалища реагирует уровень IL-1, что позволяет рассматривать его в качестве маркера дисбиотических состояний женского ре продуктивного тракта. Эпителиоциты, сформировавшиеся в условиях патоце ноза, демонстрируют повышенный уровень базовой секреции цитокинов про воспалительной направленности, при этом они утрачивают способность значи мо изменять продукцию цитокинов, адекватно взаимодействуя с микросимби онтами.
Не исключено, что концентрация цитокинов в вагинальном биотопе, де монстрирующая динамичные высокоамплитудные изменения, может оказывать влияние на вагинальные микросимбионты, регулируя состояние микробиоцено за влагалища. В связи с этим, мы изучили влияние цитокинов в концентрациях, характерных для нормо- и патоценозов влагалища на ростовые свойства ваги нальных микросимбионтов (рис.8).
30, Нормоценоз Дисбиоз % 20, * * 10, 0, * -10, -20, * pg/ml -30, 15,6 31,2 62,5 125 250 500 Lactobacillus spp. Corynebacterium spp. E.coli S. aureus Рис. 8 Влияние IL-1 на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов (в % по отношению к контролю) *- р0,05 – достоверные различия при сравнении с влиянием концентраций IL-1, характерных для нормоценоза Влияние IL-1 на свойства вагинальных микросимбионтов было диффе ренцированным и дозозависимым. Умеренные концентрации IL-1, характер ные для нормоценоза, стимулировали ростовые свойства лактобацилл и кори небактерий (рис. 8) и угнетали у S.aureus и E.coli. Влияние IL-1 в концентра циях, фиксируемых при бактериальном вагинозе, было диаметрально противо положным. С возрастанием концентрации цитокина (рис. 8) стимуляция росто вых свойств доминантного вагинального симбионта – лактобацилл становилась менее выраженной, а затем и вовсе сменилась дозозависимым угнетением. В отношении S.aureus и E.coli напротив подавление ростовых свойств сменялись стимуляцией.
Влияние IL-6 и IL-8 на вагинальные микросимбионты было аналогичным и выражалось для концентраций, характерных для нормоценоза, в стимуляции роста лакто- и коринебактерий и подавлении ростовых свойств и способности к биопленкообразованию S.aureus и E.coli. В концентрациях, характерных для патоценоза, подавляющее влияние на свойства S. aureus и E. coli усиливалось, но сопровождалось угнетением ростовых свойств лакто- и коринебактерий.
Влияние TGF 1 на свойства доминантных и ассоциативных микросимбионтов было однонаправлено стимулирующим и не зависело от концентрации.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что провоспалительные цитокины способны оказывать дифференцированное дозозависимое влияние на ростовые свойства и биопленкообразование вагинальных микросимбионтов.
В концентрациях, характерных для нормоценоза, их действие выражалось в стимуляции ростовых свойств лактобацилл и коринебактерий, и подавлении роста S.aureus и E.coli как в планктонной, так и биопленочной культуре. Кон центрации, свойственные вагинальному дисбиозу, напротив, приводили к по давлению роста лактобацилл, сопровождающемуся, в случае с IL-1 стимуля цией ростовых свойств и биопленкообразования S.aureus и E.coli.
Сведения о дифференцированном дозозависимом влиянии провоспали тельных цитокинов на свойства вагинальных микросимбионтов позволяют рас сматривать изменение цитокинового профиля в качестве механизма формиро вания микробиоценоза влагалища в норме и при патологии.
Обобщая полученные данные, мы провели сравнительный анализ эпите лиально-бактериальных взаимодействий в двух устойчивых типах вагинального биоценоза – нормоценозе и бактериальном вагинозе.
Таблица 4 Сравнительная характеристика эпителиально-бактериальных взаи модействий при нормоценозе и бактериальном вагинозе Нормоценоз Бактериальный вагиноз Взаимодействие вагинальных эпителиоцитов с доминантными микросимбионтами Усиление ростовых свойств перекись Угнетение ростовых свойств перикись продуцирующих лактобацилл продуцирующих лактобацилл Усиление антагонистической активно- Не оказывает значимого влияния на ан сти лактобацилл тагонизм лактобацилл Взаимодействие вагинальных эпителиоцитов с ассоциативными микросимбионтами Угнетение ростовых свойств ассоциантов Умеренное угнетение ростовых свойств ассоциантов Снижение способности ассоциантов к Повышение способности ассоциантов к образованию биопленок образованию биопленок Снижение антагонистической активно- Отсутствие значимого влияния на анта сти ассоциантов гонизм ассоциантов Исходное состояние эпителиоцита Умеренная базовая экспрессия цитоки- Повышенный уровень базовой экспрес нов провоспалительной направленности сии провоспалительных цитокинов Изменение функционального состояния эпителиоцитов в результате взаимодейст вия с доминантными микросимбионтами Умеренная стимуляция экспрессии ци- Выраженная стимуляция экспрессии ци токинов токинов Изменение функционального состояния эпителиоцитов в результате взаимодейст вия с ассоциативными микросимбионтами Значительное усиление синтеза цитоки- Продукция эпителиоцитами цитокинов нов эпителиоцитами значимо не изменяется Концентрация провоспалительных цитокинов в вагинальной жидкости Умеренная Высокая Влияние присущей типу биоценоза концентрации цитокинов на ростовые свойства доминантных микросимбионтов Стимуляция ростовых свойств Подавление ростовых свойств Влияние присущей типу биоценоза концентрации цитокинов на ростовые свойства ассоциативных микросимбионтов Подавление ростовых свойств Стимуляция ростовых свойств Если попытаться суммировать все вышеизложенное, то эпителиально бактериальные взаимодействия в условиях нормоценоза влагалища представ ляются следующим образом. Вагинальный эпителиоцит, сформировавшийся в условиях благоприятного микроокружения (подавляющее преобладание лак тофлоры) дифференцированно влияет на свойства микросимбионтов, стимули руя ростовые свойства и антагонизм доминантов и подавляя указанные свойст ва у ассоциантов. Создаваемые селективные преимущества определяют высо кую удельную долю лактобацилл в вагинальном биоценозе, что оказывается выгодно для функционального состояния эпителиоцита. Ввиду высокой удель ной доли доминантов, суммарная продукция цитокинов эпителиальными клет ками остается умеренной (рис.9), что позволяет эпителиоцитам сохранять функциональный резерв, реализуемый при встрече с патогенами, когда запуск воспалительной реакции абсолютно оправдан.
Доминанты + Умеренная экспрессия цитокинов Макропартнер (Эпителиоцит) Выраженная экспрессия цитокинов + Ассоцианты Рис. 9. Схема эпителиально-бактериальных взаимодействий в условиях нормо ценоза влагалища Создаваемая умеренная концентрация цитокинов (рис. 9) оказывает стиму лирующее влияние на ростовые свойства доминантных микросимбионтов и по давляющее - на ростовые свойства и способность к биопленкообразованию ас социативных, что также способствует доминированию в вагинальном биотопе лактобацилл.
По иному складываются эпителиально-бактериальные взаимодействия в условиях бактериального вагиноза. Эпителиоциты, сформировавшиеся в пато логическом микроокружении, подавляют рост “Н2О2+” биоваров лактобакте рий, тормозят рост ассоциантов, стимулируя при этом их способность к био пленкообразованию. Удельная доля в вагинальном биотопе лактобацилл резко падает. Эпителиальные клетки остаются в окружении ассоциантов, взаимодей ствие с которыми вызывает многократное усиление экспрессии эпителиоцита ми провоспалительных цитокинов. Высокий уровень цитокинов оказывается дополнительным прессингом для лактофлоры, и стимулятором для патогенной и условно-патогенной микрофлоры. В результате чего патологическое микро окружение сохраняется и продолжает влиять на формирование эпителиоцитов с извращенным типом реакции на микросимбионтов. Возникает порочный круг, определяющий устойчивость этого типа патоценоза. Приведенные данные сви детельствуют о ключевой роли эпителиально-бактериальных взаимодействий в формировании или поддержании вагинального микробиоценоза.
В дальнейшем мы попытались найти ответ на вопрос: существует ли связь состояния микробиоценоза репродуктивного тракта с функцией репро дуктивной системы в целом? Для этого был проведен сравнительный анализ микроэкологического состояния биотопов репродуктивного тракта у женщин с оппозитными результатами экстракорпорального оплодотворения. ЭКО было выбрано в качестве модели для изучения влияния на возможность реализации репродуктивной функции, в связи с гарантированным исключением при нем других причин инфертильности.
Результаты микробиологического исследования, выполненного в цикле, предшествующем стимуляции суперовуляции, показали, что состояние паци енток обеих групп соответствовало требованиям, предъявляемым к участникам программ вспомогательных репродуктивных технологий, подразумевающим отсутствие инфекций, передаваемых половым путем, и неспецифических вос палительных заболеваний репродуктивного тракта. Сравнительный анализ микрофлоры влагалища в группах с оппозитными исходами ЭКО выявил, что состояние микрофлоры влагалища женщин, попытка ЭКО которых заверши лась неудачей, характеризовалось относительным дефицитом лактофлоры 4.1±0.2 lg КОЕ/мл против 5.4±0.2 lg КОЕ/мл в подгруппе женщин с благопри ятным исходом ЭКО (р=0.03), при этом достоверных отличий в обсемененно сти условно патогенными микроорганизмами или их видовой характеристики не наблюдалось.
При ретроспективном анализе содержания цитокинов в вагинальном содержимом женщин, оппозитных по исходам ЭКО, установлено, что отсутст вие беременности сопряжено с более высоким уровнем IL-8, IL-1 и TNF (табл. 5), что отражает общую провоспалительную настроенность.
Таблица 5. Концентрация цитокинов в вагинальном содержимом Результат ЭКО по- Результат ЭКО нега зитивный(n= 26) тивный (n=28) IL -6 (pg/ml) 43,0±12,0 47,3±9, TNF (pg/ml) 1,0±0,3 4,5±1,0 * IL -8 (pg/ml) 557,0±89,7 854,6±84,1* IL -1 (pg/ml) 41,3±10,3 321,1±118,2* Примечание: *р0,05 – достоверная разница между группами.
Наступление в результате ЭКО беременности имело прямую связь с по казателем микробной обсемененности влагалища лактобактериями (r=0.50, p0.05) и обратную связь с концентрацией в вагинальном содержимом IL- (r=-0.52, p0.05), IL-8 (r=-0.36, p0.05), TNF (r =-0.41, p0.05).
Полученные результаты позволяют связать неблагоприятный исход ЭКО со следующими факторами, отражающими микроэкологическое состояние нижних отделов репродуктивного тракта:
-снижением микробной обсемененности влагалища лактобактериями;
- повышенным уровнем TNF, IL -1 и IL -8 в вагинальном содержимом.
Связь исходов ЭКО с микробной обсемененностью влагалища доми нантным микросимбионтом - лактобактериями свидетельствует о значимости микробиоты репродуктивного тракта женщин для реализации фертильной функции макросимбионта, что с позиции биологической целесообразности по нятно и оправдано, так как возможность развития и рождения плода в услови ях нормобиоценоза обеспечивает становление нормальной микрофлоры но ворожденного (Orrhage K, Nord C.E., 1999), и препятствует возникновению ос ложнений беременности и родов.
Выявленные отличия уровня цитокинов вагинальной жидкости женщин, оппозитных по фертильности в программе ЭКО, свидетельствуют либо о влия нии цитокинов нижних отделов репродуктивного тракта на процесс импланта ции, либо о том, что изменения, происходящие в цитокиновом профиле ваги нального содержимого, являются отражением процессов, происходящих в ци токиновой системе всего репродуктивного тракта. Но совершенно очевидно, что уровень цитокинов вагинальной жидкости может служить прогностическим критерием готовности макроорганизма к возникновению беременности.
С другой стороны, связь неудачных исходов ЭКО с повышенным уровнем цитокинов вагинальной жидкости указывает на значимость нормального уров ня цитокинов нижних отделов репродуктивного тракта для возникновения бе ременности, и открывает перспективы поиска терапевтических воздействий, способных прямо или косвенно снижать уровень провоспалительных цитоки нов в вагинальном биотопе, нормализуя микроэкологическое состояние репро дуктивного тракта.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии со стояния микробиоценоза и цитокинового профиля вагинального биотопа на фертильность, и обуславливают необходимость изучения факторов, опреде ляющих микроэкологическое состояние репродуктивного тракта женщин.
Учитывая вышеизложенное, мы предприняли попытку выявить микроб ные факторы, определяющие цитокиновый профиль нижних отделов репро дуктивного тракта женщин. Для этого было проведено сопоставление уровня TNF, IL-1, IL-6 и IL-8 вагинального содержимого с состоянием микрофлоры влагалища и цервикального канала, а также наличием инфекций, передаваемых половым путем.
Повышенный уровень цитокинов был отмечен как при наличии патоге нов, передаваемых половым путем, что было вполне ожидаемым, так и при дисбалансе нормальной микрофлоры влагалища. Причем дефицит доминантно го вагинального микросимбионта – лактобацилл оказался фактором, более зна чимым для повышения уровня IL-1, чем наличие ИППП (табл. 6). Корреляци онный анализ позволил выявить обратную связь между показателем микроб ной обсемененности влагалища лактобактериями и концентрацией в вагиналь ном лаваже IL-1 (r = -0.69, p0.05), IL-8 (r = -0.48, p0.05), прямую зависи мость уровня IL-1 (r=0.64,p0.05) от микробной обсемененности влагалища условно-патогенными микроорганизмами.
Таблица 6.Концентрация цитокинов вагинального содержимого в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища и цервикального канала.
состояние IL-6 TNF IL-8(pg/ml) IL-1(pg/ml) микробиоценоза (pg/ml) (pg/ml) нормоценоз(n=12) 21,3±5,1 2,7±0,9 366,0±69,1 32,9±10, дефицит 52,9±11,0* 1,7±0,6 792,6±114,6* 434,8±217,2* лактобактерий (n=9) бактериальный 39,8±21,4 2,1±0,8 780,3±101,8* 480,6±274,7* вагиноз(n=16) трихомониаз (n=6) 56,5±15,6* 6,7±3,2 1244,6±12,7* 237,9±102,6* хламидиоз (n=8) 69,4±12,9* 6,9±1,7* 1090,6±113,8* 55,0±11, хламидиоз в сочета нии с дефицитом лак- 126,9±37,7* 8,1±1,8* 986,9±97,5* 325,4±131,6* тобактерий (n=10) уреаплазмоз 16,8±0,8 0,4±0,1 949,7±9,1* 37,8±1, (n=6) уреаплазмоз в сочета нии с дефицитом лак- 15,6±1,2 2,5±1,7 981,1±189,3* 87,6±21,1* тобактерий (n=8) трихомониаз в сочета нии с хламидиозом и 83,4±12,7* 13,6±2,6* 1204,5±72,7* 392,3±115,1* дефицитом лактобак терий (n=6) уреаплазмоз в сочета нии с хламидиозом и 178,4±91,1* 12,0±3,6* 1027,6±219,0* 625,4±284,7* дефицитом лактобак терий (n=7) Примечание: *р0,05 – достоверные различия при сравнении с группой «нор моценоз» Сравнительный анализ цитокинового профиля вагинальной жидкости среди пациенток с наличием ИППП также продемонстрировал роль доминант ной микрофлоры в сдерживании бурной цитокиновой реакции. Так сочетание ИППП с дефицитом лактофлоры приводило (табл.6) к достоверному повыше нию уровня IL-1 с 55,0±11,3 пг/мл при изолированном хламидиозе до 325,4±131,6 пг/мл при сочетании хламидиоза с дефицитом лактобактерий, и с 37,8±1,5 пг/мл при уреаплазмозе до 87,6±21,1 пг/мл при уреаплазмозе, проте кающем на фоне дефицита лактобактерий. Это свидетельствует о том, что де фицит лактобактерий, выступающих в роли доминантного вагинального микро симбионта, является фактором, оказывающим значительное влияние на повы шение уровня провоспалительных цитокинов в нижних отделах репродуктив ного тракта женщин.
Таким образом, на этом этапе исследования нам удалось выяснить что:
Факторами, способствующими повышению уровня провоспалительных цитокинов в вагинальном содержимом являются наравне с инфекциями, пере даваемыми половым путем, дисбиотические состояния нижних отделов репро дуктивного тракта.
Сочетание ИППП с дисбиотическими состояниями нижних отделов жен ского репродуктивного тракта приводит к дополнительному повышению уровня провоспалительных цитокинов в вагинальной жидкости.
Дефицит доминантного вагинального микросимбионта - лактобактерий сопровождается многократным повышением концентрации IL-1 в вагиналь ном содержимом.
На следующем этапе нашего исследования мы рассмотрели с позиции эпителиально-бактериальных взаимодействий интравагинальную терапию про биотическими штаммами лактобацилл, применяемую для восстановления нор мальной микрофлоры женского репродуктивного тракта. При этом мы пресле довали две цели: получить данные, подтверждающие ключевую роль в форми ровании микробиоценоза эпителиально-бактериальных взаимодействий;
и, ис пользуя ранее полученные сведения, разработать подходы к повышению эф фективности пробиотической терапии.
Для этого мы изучили характер взаимодействия вагинальных эпителио цитов и штаммов лактобактерий, полученных из того же биотопа (аутоштаммы) при нормоценозе. Оказалось, что внеклеточные секреторные продукты эпите лиоцитов, полученных из того же биотопа, в 100% случаев стимулировали при рост аутоштамма. Гетероштаммы лактобактерий реагировали на аналогичное воздействие, как усилением, так и торможением скорости прироста.
Попытка выявить зависимость направленности влияния секреторных про дуктов эпителиоцитов на ростовые свойства штаммов лактобактерий от их ви довой принадлежности или наличия и выраженности способности продуциро вать перекись водорода, считающиеся с антропоцентристских позиций наибо лее экологически привлекательными, показала, что характер влияния эпителио цитов на ростовые свойства лактобактерий не связан с этими параметрами..
Таким образом, было выявлено, что стимуляция роста аутоштаммов доми нантной микрофлоры, является характерной особенностью эпителиально бактериальных взаимодействий в реально существующих нормоценозах.
Ориентируясь на это, мы попытались оценить зависимость “приживле ния” пробиотика от результата влияния вагинальных эпителиоцитов пациентки на ростовые свойства пробиотического штамма. Для этого у пациенток с выра женным дефицитом лактофлоры до проведения стандартной интравагинальной пробиотической терапии получали вагинальные эпителиоциты и изучали их влияние на ростовые свойства пробиотического штамма. Затем сравнивали эф фективность терапии в группах, сформированных в соответствии с характером влияния эпителиоцитов на рост пробиотического штамма.
При сравнении эффективности пробиотической терапии через неделю по сле завершения лечения было выявлено, что у пациенток, вагинальные эпите лиоциты которых стимулировали ростовые свойства пробиотического штамма лактобактерий, в 85,7% случаев происходило восстановление обсемененности влагалища лактофлорой (рис. 10), у оставшихся (14,3%) также наблюдалось увеличение показателя микробной обсемененности влагалища лактобактерия ми, но не превышающее 105 КОЕ/мл. В случае если эпителиоциты влияли на рост пробиотического штамма индифферентно, восстановление лактофлоры наблюдалось только в 16,7% случаев, и не происходило вовсе в случае подав ляющего влияния эпителиоцитов на рост пробиотика.
подавление индифферентно стимуляция 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% ПМО лактобактерий 10 3 ПМО лактобактерий 10 ПМО лактобактерий 10 5 ПМО лактобактерий10 Рис 10. Обсемененность влагалища лактобактериями на 7 сутки после заверше ния пробиотической терапии.
Микрофлора половых путей женщины находится под воздействием цик лически изменяющихся параметров существования и способность адаптиро ваться к этим постоянным изменениям является обязательным условием для сохранения нормофлоры влагалища. В связи с этим, мы оценили обсеменен ность влагалища лактофлорой вторично - в первой фазе следующего за про биотической терапией менструального цикла. По прошествии одного менстру ального цикла ситуация несколько ухудшилась при сохранении прежней тен денции: нормальное количество лактобактерий было зафиксировано лишь в группе пациенток, вагинальные эпителиоциты которых стимулировали росто вые свойства пробиотического штамма лактобактерий, хотя, доля таких паци енток снизилась с 85,7% до 64,3%. Это происходило за счет увеличения коли чества женщин с умеренным дефицитом лактофлоры. Выраженного дефицита нормофлоры не было зафиксировано ни у одной женщины в этой группе. На против, у лиц третьей группы в течение одного менструального цикла эффект пробиотической терапии был полностью нивелирован и количество лактобак терий вернулось к прежнему уровню.
Из представленных данных следует, что эффективность пробиотической терапии зависит от характера эпителиально-бактериальных взаимодействий ва гинальных эпителиоцитов с пробиотическим штаммом, что в условиях in vivo подтверждает возможность использования результирующей эпителиально бактериальных взаимодействий в качестве критерия автохтонности, и свиде тельствует о необходимости предварительного определения индивидуальной совместимости пробиотического штамма и клеток макроорганизма.
Параллельно, с целью подтверждения в условиях in vivo значимости эпи телиально-бактериальных взаимодействий для модуляции параметров муко зального иммунитета, в процессе интравагинальной пробиотической терапии было изучено исходное состояние и динамика показателей мукозального имму нитета влагалища.
При сравнительном анализе исходного состояния мукозального иммуни тета вагинального биотопа в группах пациенток с оппозитной эффективностью пробиотической терапии были выявлены следующие различия. Для исходного состояния мукозального иммунитета пациенток с успешным результатом про биотической терапии были характерны достоверно более высокие концентра ции sIg A и лактоферрина и более низкие концентрации провоспалительного цитокина IL1 (табл.7). Показатель отношения raIL1/IL1, характеризующий вероятность блокирования провоспалительного потенциала IL1, был выше, а коэффициенты IL1/IL4, INF/IL4, IL1/TGF1, характеризующие соотношение цитокинов провоспалительной и противовоспалительной направленности, были достоверно ниже в этой группе. Перечисленные различия свидетельствуют о том, что в группе пациенток с успешным восстановлением лактофлоры, исход ное состояние мукозального иммунитета влагалища имело меньший провоспа лительный тренд, при этом обладая высоким уровнем факторов защиты (sIgA, лактоферрин), то есть характеризовалось меньшей глубиной микроэкологиче ских нарушений.
Таблица 7. Характеристика исходного состояния мукозального иммунитета влагалища у пациенток с оппозитным результатом пробиотической терапии.
Пробиотическая терапия Концентрация в вагинальном ла- не достаточно эффективна не эффективна важе: эффективна 564,0±44,0 617,7±63,2 902,1±144,0* IL 1 pg/ml 9283,8±286,9 6955,8±235,2 9858,0±338, ra IL1 pg/ml 40,6±0,6 42,2±0,3 44,2±1, INF pg/ml 4,9±0,1 5,1±0,2 5,5±0, TGF 1 ng/ml 2,2±1,2 1,3±0,4 1,0±0, IL 4 pg/ml Лактоферрин 5712,4±35,4 3650,9±87,3* 866,4±139,4* ng/ml 19,3±0,2 12,6±0,7* 10,1±1,7* sIg A mkg/ml 17 11,1* 11* ra IL1/IL 256 464* 902* IL 1 / IL 18 31,6* 44* INF/ IL 116 120 163* IL1 / TGF Примечание: *р0,05 – достоверная разница при сравнении с 1 группой.
Оценка связи успешности пробиотической терапии с исходным состояни ем мукозального иммунитета выявила достоверные положительные корреляции с уровнем лактоферрина (г=0,935;
р=0,001), sIgA (г=0,612;
р=0,045), отрица тельные с IL1 (г=-0,575;
р=0,051), IL1/IL4 (г=-0,799;
р=0,016), INF/IL4 (г= 0,698;
р=0,031), IL1/TGF1 (г=-0,597;
р=0,049). Данные о том, что высокий уровень провоспалительных цитокинов препятствует восстановлению нормо ценоза, могут быть объяснены способностью лактобактерий изменять росто вые свойства под влиянием провоспалительных цитокинов, в частности IL1, при этом низкие концентрации цитокина оказывают стимулирующее воздейст вие, а высокие - подавляющее. Поэтому у пациенток с высоким уровнем IL лактобациллы не могли нарастить биомассу и успешно колонизировать ваги нальный биотоп и оказывались в роли транзиторных микроорганизмов.
Изучение динамики показателей мукозального иммунитета влагалища в группах с оппозитным результатом интравагинальной пробиотической терапии выявило различия, как по интенсивности, так и по направленности изменений изучаемых показателей (табл. 8).
Таблица 8. Характеристика состояния мукозального иммунитета влагалища в группах пациенток с оппозитным результатом пробиотической терапии.
Концентрация Пробиотическая терапия в вагинальном эффективна не эффективна лаваже:
до после до после 564,0±44,0 233,4±65,4** 902,1±144,0 * 572,3±92,3** IL 1 pg/ml 9283,8±286,9 7259,2±199,6 9858,0±338,0 8546,1±265, ra IL1 pg/ml 40,6±0,6 19,2±0,6** 44,2±1,0 42,3±0, INF pg/ml 4,9±0,1 8,68±0,6** 5,5±0,4 4,6±0, TGF 1 ng/ml 2,2±1,2 1,2±0,4 1,0±0,2 1,1±0, IL 4 pg/ml Лактоферрин 5712,4±35,4 1087,4±132,2** 866,4±139,4* 4664,6±98,6** ng/ml 19,3±0,2 4,5±0,4** 10,1±1,7* 16,5±1,1** s Ig A mkg/ml 17 31** 11* ra IL1/IL 256 201** 902* 506** IL 1 / IL 18 16 44* INF/ IL 116 27** 163* IL1 / TGF Примечание: *р0,05 – достоверная разница при сравнении с 1 группой.
**р0,05 – достоверная разница при сравнении по сравнению с исходными данными.
В группе эффективной пробиотикотерапии динамику параметров муко зального иммунитета характеризовало снижение концентрации цитокинов про воспалительной направленности- IL1 и INF на фоне повышения уровня TGF1, обладающего противовоспалительным эффектом. При этом наблюда лось закономерное увеличение отношения raIL1/IL1, и снижение коэффициен тов IL1/IL4, IL1/TGF1, что свидетельствует о противовоспалительном трен де в состоянии мукозального иммунитета влагалища. Это сопровождалось дос товерным снижением уровня секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина (табл.8). Явный противовоспалительный тренд, наблюдаемый при восстановле нии нормоценоза, объясняется особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном биотопе. В результате пробиотической терапии на смену “резко раздражающему” влиянию условно-патогенных микроорга низмов пришло преобладание “мягко стимулирующего” влияния лактобакте рий. Снижение уровня sIgA и лактоферрина, наблюдаемое у обследованных в этой группе, вероятно можно оценить, как ответ на восстановление бактери альной составляющей колонизационной резистентности влагалища, что позво ляет макроорганизму снизить компенсаторно-повышенный уровень продукции этих защитных факторов.
В результате пробиотической терапии, не увенчавшейся восстановлением лактофлоры, также наблюдались изменения мукозального иммунитета. Анало гично первой группе происходило снижение концентрации IL1 (табл.8), при этом она достигла уровня, равного исходному в первой группе, однако при этом снижалась и концентрация TGF1, что в совокупности не позволило значимо изменить соотношение про/противовоспалительных цитокинов. Тенденция из менения уровня sIgA и лактоферрина была противоположна первой группе – уровень этих факторов возрастал, приближаясь к исходным показателям груп пы, пробиотическая терапия в которой была успешной. Таким образом, в груп пе пациенток, пробиотическая терапия у которых не достигла эффекта, наблю далось повышение уровня факторов колонизационной резистентности, сниже ние концентрации про- и противовоспалительных цитокинов при сохранении их соотношения, что в совокупности свидетельствовало о снижении степени микроэкологических нарушений. Несмотря на отсутствие внешнего эффекта (восстановление нормоценоза) в этой группе произошли значимые изменения, повышающие защиту полового тракта от инфекции. Тот факт, что в результате проведенной терапии состояние мукозального иммунитета приблизилось к ис ходному уровню группы успешной пробиотической терапии, позволяет рассчи тывать, что желаемый эффект у пациенток с выраженными микроэкологиче скими нарушениями может быть достигнут при пролонгации курса интраваги нальной терапии пробиотиками.
Полученные данные свидетельствуют о том, что пробиотические штаммы лактобацилл оказывают влияние противовоспалительной направленности на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивно го тракта;
выраженные микроэкологические нарушения, проявляющиеся в вы соком уровне провоспалительных цитокинов и низких значениях sIgA и лакто феррина препятствуют колонизации лактобацилл.
Таким образом, на этом этапе исследования в условиях in vivo было по лучено доказательство ключевой роли эпителиально-бактериальных взаимо действий в формировании микробиоценозов, подтверждена возможность ис пользования результирующей эпителиально-бактериальных взаимодействий в качестве критерия автохтонности микрофлоры, показана возможность направ ленной модуляции параметров мукозального иммунитета пробиотиками и раз работан способ индивидуального подбора пробиотического штамма для эффек тивной пробиотической терапии, основанный на оценке эпителиально бактериальных взаимодействий (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2012136487).
В заключение, обобщая полученный материал, следует выделить три ос новных момента:
- бактериально-эпителиальные взаимодействия – регуляторная основа ас социативного симбиоза женского репродуктивного тракта, определяющая его колонизационную резистентность при инфекции;
- микробный фактор вкупе с цитокиновым “зеркалом” вагинальных эпи телиоцитов важнейший инфектологический механизм функционирования жен ской репродуктивной системы;
- бактериально-эпителиальные взаимодействия – методический ключ распознавания автохтонной и аллохтонной микрофлоры, позволяющий инди видуализировать подбор пробиотика для купирования вагинального дисбиоза.
Выводы 1. Мукозальные эпителиоциты влагалища в условиях нормобиоценоза ока зывают дифференцированное воздействие на ростовые свойства, биопленкооб разование и антагонистическую активность вагинальных микросимбионтов, определяя селективные преимущества для микрофлоры вагинального биотопа.
2. Бактериально-эпителиальные взаимодействия при бактериальном вагинозе направлены на угнетение роста лактобактерий (преимущественно биоваров, продуцирующих перекись водорода) и стимуляцию способности к биопленко образованию ассоциативных микроорганизмов, определяя формирование и ус тойчивость патомикробиоценоза при бактериальном вагинозе.
3. Доминантные вагинальные микросимбионты синергидно взаимодействуют с мукозальными эпителиоцитами влагалища, формируя колонизационную рези стентность биотопа.
4. Стимулирующее влияние экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов женщин на ростовые свойства пробиотического штамма способствует успеш ному восстановлению нормофлоры влагалища.
5. Экспериментально установлено изменение продукции цитокинов ваги нальными эпителиоцитами при взаимодействии с микрофлорой: E. coli и S.
aureus приводят к их выраженной экспрессии провоспалительных цитокинов, тогда как лактобациллы и коринебалктерии вызывают умеренную стимуляцию продукции цитокинов.
6. Цитокины провоспалительной направленности, экспрессируемые эпите лиоцитами, способны оказывать дифференцированное дозозависимое влияние на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов. В концентрациях, харак терных для нормоценоза, происходит стимуляция свойств лактобацилл и кори небактерий, и подавление роста S.aureus и E.coli. Цитокины в концентрациях, свойственных бактериальному вагинозу, напротив, угнетают ростовые свойства лактобацилл, стимулируя (в случае с IL-1 и IL-8) S.aureus и E.coli.
7. При определении связи состояния микробиоценоза с цитокиновым профи лем вагинального биотопа, выявлена корреляция высокого уровня IL-1 с де фицитом лактофлоры, что позволяет рассматривать IL-1 в качестве маркера дисбиотических состояний.
8. Выявлена связь микроэкологического состояния вагинального биотопа с фертильностью женского организма (на примере экстракорпорального оплодо творения). Неудачи ЭКО коррелировали с дефицитом лактобацилл и высоким уровнем провоспалительных цитокинов.
9. Интравагинальная терапия пробиотическими штаммами лактобактерий оказывает влияние на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта, выражающееся в противовоспалительном тренде баланса цитокинов.
10. Эффективность восстановления нормофлоры в результате интраваги нальной пробиотической терапии зависит от тяжести исходных изменений ме стного иммунитета, она прямо пропорциональна уровню факторов защиты (sIgA, лактоферрин) и обратно пропорциональна степени провоспалительного тренда.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах,рекомендованных ВАК 1. Кремлева Е.А., Константинова О.Д., Черкасов С.В. Микроэкологическое со стояние вагинального биотопа пациенток, оппозитных по фертильности в про грамме ЭКО // Медицинский альманах, 2010, №4(13), с. 95-97.
2. Кремлева Е.А., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Влияние микробно эпителиальных взаимодействий на биологические характеристики вагинальной микрофлоры // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2011, №2, с.53- 3. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Особенности эпителиально бактериальных взаимодействий при бактериальном вагинозе. // Журнал микро биологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, № 3, с.3- 4. Кремлева Е.А., Черкасов С.В., Константинова О.Д. Характеристика уровня цитокинов и состояния микробиоценоза репродуктивного тракта женщин с бес плодием // Российский вестник акушера-гинеколога, 2012, Т 12, №3, с.11- 5. Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Продукция цитокинов вагинальными эпите лиоцитами в процессе взаимодействия с доминантными и ассоциативными микросимбионтами // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиоло гии, 2012, № 4, с.114- 6. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В. Роль ассоциативных микросим бионтов в функционировании ассоциативного симбиоза // Журнал микробиоло гии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, № 6, с.85- 7. Кремлева Е.А., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Эпителиально-бактериальные взаимодействия как основа формирования микробиоценоза // Журнал микро биологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, № 6, с. 89- 8. Кремлева Е.А., Константинова О.Д. Индивидуальный подбор пробиотика для эффективной интравагинальной пробиотической терапии // Лечение и профи лактика, 2013, 2 (6), с.32- 9. Кремлева Е.А., Бухарин О.В Влияние IL-1 на ростовые свойства вагиналь ных микросимбионтов// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобио логии, 2013, № 4, с.65- 10. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Участие доми нантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2013, №6, с.65- 11. Кремлева Е.А., Константинова О.Д. Состояние мукозального иммунитета влагалища при интравагинальной пробиотической терапии// Медицинский аль манах, 2013, №4, с.170- Публикации в других изданиях:
12. Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Влияние вагинальных эпителиоцитов на мик роорганизмы, выделенные из влагалища // Материалы 2 Международного кон гресса по пробиотикам «Санкт-Петербург – Пробиотики -2009», 2009г., с. М 13. Кремлева Е.А., Черкасов С.В. Изменение ростовых свойств бактерий при контакте с вагинальными эпителиоцитами // Материалы международной конфе ренции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболева ниями», Санкт-Петербург,2010, С. 121.
Патенты: