Закономерности формирования биоразнообразия вида мягкой пшеницы triticum aestivum l. по генам запасных белков.
На правах рукописи
Драгович
Александра Юрьевна
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ
БИОРАЗНООБРАЗИЯ ВИДА МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ Triticum
aestivum L. ПО ГЕНАМ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ.
03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва 2008
Работа выполнена в Лаборатории генетики растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук Пухальский Виталий Анатольевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук доктор биологических наук доктор биологических наук
Ведущая организация:
Кафедра генетики и селекции Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета
Защита состоится «_» 2008 г. в _часов на заседании Диссертационного совета Д002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Губкина, дом 3. Факс: (499)1328962.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Губкина, дом 3.
Автореферат разослан «» 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Г.Н. Полухина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Изучение генетического разнообразия мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) является од ной из самых актуальных проблем генетики вида, поскольку позволяет ответить на ряд во просов, касающихся происхождения, эволюции и путей распространения важнейшей сель скохозяйственной культуры мира, которые остаются не до конца выясненными (Бадаева, 2000;
Dvorak, Luo, 2001;
Dubcovsky et al., 2007 и др.).
Для получения объективной картины генетического разнообразия вида и изучения процес сов его формирования необходимы эффективные генетические маркеры, в качестве которых в данном исследовании выступают гены глиадинов - запасных белков зерновки пшеницы.
Огромный внутривидовой полиморфизм этих белков, выявляемый при электрофорезе, обес печивается множественным аллелизмом глиадинкодирующих локусов. Относительная се лективная нейтральность их полиморфизма и хорошо изученная генетика (Shepherd, 1968;
Созинов, Попереля, 1979;
Созинов, 1985 и др.), позволили использовать глиадины в качестве генетических маркеров (Созинов, 1985;
Конарев, 1983). Однако эти исследования не охваты вали фундаментальную проблему изучения генетического разнообразия вида в пространстве и во времени из-за ограничений, накладываемых на результаты экспериментов гелевым но сителем. Появление новых гелевых носителей (Bushuk, 1982) открыло перспективу много кратного увеличения количества полипептидов глиадина, разделяемых электрофорезом, что, в свою очередь, расширило возможности использования глиадина в качестве генетического маркера для решения ряда фундаментальных вопросов генетики пшеницы. Однако использо вание новых гелевых носителей требовало разработки соответствующей методики, с после дующим изучением генетического контроля компонентов глиадина, характера их наследова ния, выявления аллелей глиадинкодирующих локусов (ГКЛ), контролирующих синтез элек трофоретических компонентов, создание баз данных в виде каталога аллелей. Использование обширных баз данных позволяло оценить вклад искусственного и естественного отбора в микроэволюцию вида на современном этапе развития научной селекции и определить вектор происходящих в результате селекции генетических процессов, а также их влияние на гено фонд вида;
давало возможность проследить динамику уровня генетической изменчивости от представителей древнего генофонда (аборигенных сортов и местных форм) до современных генотипов для оценки состояния генофонда современных сортов, который определяет пла стичность вида и, следовательно, его жизнеспособность. Расширенные возможности, предос тавляемые новыми методиками, позволяли провести сравнительный анализ генетической изменчивости у разных видов рода Triticum и получить объективную информацию об их фи логенетических взаимоотношениях, которые изучены недостаточно полно и данные по этому вопросу у разных авторов крайне противоречивы (Вавилов, 1924;
Удачин, 1991;
Tsunewaki et al., 1993;
Feldman et al., 1995;
2001;
Nesbitt, 2001;
Гончаров, 2007 и др.). Позволяли изучить распределение генетической изменчивости, характерной для аборигенных сортов и местных линий в разных регионах, для формирования представлений о путях расселения пшеницы из Центров разнообразия в Европу и Азию.
Исходя из всего вышеизложенного, была поставлена цель и задачи настоящей диссертаци онной работы.
Цель работы Изучение закономерностей формирования биоразнообразия у мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), ее происхождения, эволюции и распространения из центров разнообразия с ис пользованием в качестве генетических маркеров генов запасных белков.
Задачи работы 1. Установить генетический контроль и характер наследования полипептидов глиадина, разделяемых одномерным и двумерным электрофорезом.
2. Изучить внутривидовую изменчивость глиадинкодирующих генов у сортов мягкой пше ницы. Составить каталог аллелей по всем ГКЛ. Создать базы данных по распределению час тот аллелей у современных и стародавних сортов различных регионов мира.
3. Изучить влияние искусственного отбора в процессе многолетней селекции на поддержа ние генетического разнообразия вида Triticum aestivum L. Выявить генетические процессы, происходящие в генофонде мягкой пшеницы в результате селекции.
4. Оценить состояние генофонда современных сортов мягкой пшеницы через сравнитель ный анализ генетического разнообразия современных и стародавних сортов.
5. Изучить вклад естественного отбора в микроэволюцию вида на современном этапе науч ной селекции: выявить закономерности формирования генетической изменчивости ГКЛ у сортов пшеницы, районированных в различных климатических зонах РФ;
определить меха низмы, вызывающие пространственную дифференциацию аллелей ГКЛ. Исследовать влия ние отбора на динамику частот аллелей ГКЛ в искусственно созданной гибридной популя ции.
6. Изучить филогенетические взаимоотношения видов в роде Triticum L. на основе срав нения генетической изменчивости их глиадинкодирующих генов.
7. Реконструировать пути распространения культуры мягкой пшеницы из Центров разно образия, используя базы данных по распределению частот аллелей ГКЛ у представителей древнего генофонда (аборигенных сортов) различных регионов Научная новизна Впервые изучен генетический контроль и характер наследования электрофоретических компонентов глиадина с использованием двумерного электрофореза. Показано, что электро форетический спектр распадается на 6 групп (блоков) сцеплено наследующихся компонен тов, которые контролируется 6-ю локусами, расположенными на 1-й и 6-й гомеологических хромосомах, что полностью подтвердило результаты, полученные при помощи одномерного электрофореза в полиакриламидном геле. Впервые описан полиморфизм 966 сортов мягкой пшеницы по электрофоретическим спектрам глиадина с использованием одномерного элек трофореза в полиакриламидном геле. Установлен множественный аллелизм ГКЛ – для шести локусов выявлено 170 аллелей, различающихся количеством, интенсивностью и подвижно стью контролируемых ими электрофоретических компонентов. Создан каталог аллелей ГКЛ и определены 267 сортов, электрофоретические спектры которых служат эталонами для кон кретных аллелей ГКЛ.
Впервые выдвинута гипотеза о сложной структуре ГКЛ, представляющих собой кластер тесно сцепленных генов, контролирующих синтез нескольких полипептидов глиадина, кото рые наследуются как единый менделеевский признак. В кластере, как правило, имеется «яд ро» генов, между которыми нет рекомбинации и гены, находящиеся на некотором расстоя нии от ядра. Определена частота рекомбинации между наиболее отдаленным геном и ос тальной частью кластера.
Впервые с помощью SDS-электрофореза получена оценка молекулярной массы всех ком понентов, входящих в блоки, контролируемые разными аллелями всех глиадинкодирующих локусов. Это позволило обосновать гипотезу об эволюции глиадинкодирующих генов, по средством дупликации с последующей дивергенцией последовательностей в результате му тационного и рекомбинационного процесса, что привело к изменению как размера протеин кодирующей части, так и числа экспрессирующихся генов.
Впервые экспериментально с помощью искусственно созданной гибридной популяции по казана возможность маркирования аллелями ГКЛ признаков со сложным полигенным кон тролем, таких как адаптивная и селекционная ценность генотипов, а, следовательно, возмож ность маркирования генотипов сортов.
Впервые выявлен клинальный характер генетической изменчивости ГКЛ на территории РФ. Установлены конкретные абиотические факторы, поддерживающие эту клину.
Впервые установлено, что в результате искусственного отбора при долговременном селек ционном процессе происходит уменьшение генетического разнообразия вида Triticum aesti vum L. в целом, что ведет к его генетической эрозии. Выявлены основные факторы, вызы вающие генетическую эрозию данного вида.
Подтверждена гипотеза о полифилетическом происхождении Triticum aestivum L. Выявле ны филогенетические связи между некоторыми видами рода Triticum, позволившие выдви нуть и обосновать гипотезу о происхождении мягкой пшеницы.
Впервые показано, что в горных районах Закавказья и Центральной Азии сосредоточен максимум аллельного разнообразия ГКЛ, что подтверждает представление об этих районах как центрах разнообразия мягкой пшеницы. Показано, что генотипы сортов Закавказья и Центральной Азии получили D-геном из разных источников.
Впервые выдвинута гипотеза о путях распространения культуры мягкой пшеницы из Цен тров разнообразия в Европу и Азию на основании распределения частот аллелей глиадинко дирующих локусов.
Практическая ценность работы Множественный аллелизм ГКЛ позволяет с высокой точностью и эффективностью марки ровать генотипы сортов, что может быть использовано: а) в селекции и семеноводстве для определения чистоты и подлинности сортов, программированного подбора пар при гибриди зации, создания генетически выровненных сортов;
б) в области торговли семенным материа лом, когда необходимо определить соответствие партии семян коммерческим требованиям;
в) в судебной (арбитражной) практике, где требуется не только оценить чистоту и подлин ность сортов и их родословных, но и выявить источник примесей. Глиадиновые маркеры це лесообразно использовать для контроля чистоты и повторности образцов в коллекциях, а также для мониторинга генетических процессов, происходящих в образцах в течение их дли тельного воспроизводства. Кроме того, множественные аллели ГКЛ могут быть использова ны как генетические маркеры в частной и популяционной генетике мягкой пшеницы при картировании генов, для маркирования участков хромосом, при изучении популяционной структуры и динамики ее изменений, в филогенетических исследованиях рода Triticum L.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Генетический контроль глиадинов осуществляется 6-ю несцепленными локусами хромо сом 1-й и 6-й гомеологической группы. Одним локусом контролируется несколько сцеплено наследующихся полипептидов - блоков электрофоретических компонентов глиадина. Глиа динкодирующие локусы представляют собой кластер тесносцепленных, практически нереком бинирующих генов и характеризуются множественным аллелизмом.
2. Микроэволюция мягкой пшеницы в процессе долговременной селекции определяется, в главном, искусственным отбором, в результате действия которого происходит постепенное сужение генетической изменчивости вида, то есть его генетическая эрозия. Причина эрозии замена уникального местного генофонда генетическим материалом ограниченного числа сор тов-доноров.
3. Естественный отбор поддерживает генетическое разнообразие мягкой пшеницы через ме ханизмы адаптации растений к абиотическим факторам среды, что вызывает клинальную из менчивость глиадинкодирующих локусов у современных сортов России.
4. Филогенетические связи между видами рода Triticum L., выявляемые при сравнительном анализе их генетической изменчивости, позволяют определить возможного тетраплоидного предшественника мягкой пшеницы, подтвердить гипотезу полифилетического происхождения вида.
5. Изменчивость ГКЛ у аборигенных сортов горных районов Памира и Гиндукуша позволяет рассматривать их как центры разнообразия мягкой пшеницы, а генотипы сортов этих регионов как две генетические ветви, которые получили D-геном из разных источников 6. Распространение мягкой пшеницы в Европу из центров разнообразия, согласно распреде лению аллелей ГКЛ у аборигенных сортов, шло как минимум двумя крупными волнами.
Апробация работы Результаты работы доложены на международных и всероссийских съездах, симпозиумах, конференциях и семинарах, а именно: на Международном совещании по пшенице и кукурузе (Hungary, Martonvashar, 1989);
3-м (Hungary, Budapest, 1987) и 4-м (Canada, Winnipeg, 1990) Международном Симпозиуме по белкам глютена (Workshop on Gluten Proteins);
5-м и 6-м Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1985, 1987);
Конгрессе генетиков Сербии (Serbia, Subotica, 2004);
3-м Съезде ВОГиС (Моск ва, 2004);
2-м Международном конгрессе «Зерно и хлеб России» (Санкт-Петербург, 2006);
2 й Вавиловской международной конференции (Санкт-Петербург, 2007);
семинарах в универ ситетах Любляны, Нового Сада (Slovenia, 1991, Serbia, 1991) и Векше (Vaxjo University, Swe den, 2006);
Институтских научных семинарах в НИИ Agricultural research institute SERBIA – Small Grains Research Centre (Serbia, Kraguevaс., 2004, 2005) и в НИИ Institute Field and Vege table Crops, (Serbia, Novi Sad,. 2005, 2006).
Публикации Материал диссертации опубликован в 39 работах в международных, отечественных науч ных журналах и сборниках.
Личный вклад автора Все результаты, представленные в работе, получены при непосредственном участии авто ра в период с 1981 по 2006 год. При оформлении научных публикаций, постановке проблемы диссертации участие автора было определяющим. Исследования проведены в Институте об щей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Автор приносит глубокую благодарность акад. А.А.
Созинову, д-ру Е.В. Метаковскому и другим бывшим и настоящим сотрудникам лаборато рии, в сотрудничестве с которыми были выполнены некоторые разделы работы. Особую признательность автор выражает научному консультанту д.б.н., проф. В.А. Пухальскому за поддержку выполненных исследований, критические замечания и полезные советы, выска занные в процессе написания работы.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав, описывающих результаты экспериментов, заключения, выводов, списка литературы. Материал диссертации изложен на 320 страницах машинописного текста, вклю чая 49 рисунков и 50 таблиц. Список литературы содержит 659 работ, из них 543 на ино странных языках.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы Глава включает пять основных разделов, касающихся происхождения и эволюции мягкой пшеницы, ее распространения при доместикации, характеристики запасных белков эндос перма зерновки мягкой пшеницы, их генетического контроля, номенклатуры, молекулярной структуры генов запасных белков.
Глава 2. Материалы и методы Материалы В работе исследовано 966 сортов, которые включают современные коммерческие сорта и линии, а также аборигенные (местные) сорта из различных регионов. Материал был любезно предоставлен оригинаторами сортов, а также получен из коллекции ВНИИР им.
Н.И.Вавилова (г. Санкт Петербург) от д.б.н. О.П. Митрофановой, коллекции СГИ (г. Одесса, Украина) от акад. А.А. Созинова и Ф.А. Поперели, из коллекции проф. В.А. Пухальского, акад. С. Денчича и д-ра Д. Кнежевича (Сербия), акад. РАСХН Л.А. Беспаловой (КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко), д. с.-х. н. В.С. Крупнова (НИИСХ Юго-Востока, г. Саратов), проф.
Б.И.Сандухадзе (МСХА им К. А. Тимирязева). Виды рода Triticum: Т. durum Desf - 78 образ цов, Т. carthlicum Nevsky - 32 образца, T. aestivum var. persicoides - 10 образцов, Triticum sphaerococcum (Perciv.)- 50 образцов, Т. macha Decapr. Menabde -26 образцов были получены из коллекции проф. Пухальского, ВНИИР им. Н.И.Вавилова (г. Санкт Петербург), Грузин ского СХИ (г. Тбилиси, Грузия). Нуллитетрасомные линии сорта Чайниз Спринг получены от доктора Р. Б. Сирса (США).
Для изучения наследования компонентов глиадина с помощью гибридологического анали за были получены гибридные зерна F2 в гибридных комбинациях, в которых скрещивались разные сорта мягкой пшеницы. Для каждого образца исследовалось не менее 100 отдельных зерновок.
Методы Для исследования полиморфизма глиадина автором была разработана методика электро фореза в кислом алюминий лактатном буфере (рН 3,1) в полиакриламидном геле (ПААГ). По количеству компонентов и по четкости их разделения этот метод превосходит все имеющие ся методики. Автором была предложена модификация метода двумерного электрофореза, сочетающего электрофорез в алюминий лактатном буфере (1-е измерение) с SDS- электро форезом по Лэмли (Laemmli, 1970) - (2-е измерение) (Новосельская и др., 1983). Такая моди фикация позволяет разделить перекрывающиеся компоненты уже известных проанализиро ванных спектров, получаемых в 1-м измерении. Метод двумерного электрофореза в отличие от одномерного позволяет выявить в 1,5 – 2 раза больше индивидуальных компонентов. Для определения молекулярного веса полипептидов использовались бычий сывороточный аль бумин (67,000) и овальбумин (45,000).
Математические методы, применяемые в работе, приводятся в тексте автореферата.
Глава 3. Генетика глиадина 3.1. Наследование глиадинкодирующих генов у мягкой пшеницы 3.1.1. Характер наследования глиадинкодирующих генов, выявляемый при разделе нии продуктов их экспрессии одномерным электрофорезом Полиморфизм глиадинов, выявленный у мягкой пшеницы стандартными методами одно мерного электрофореза (ЭФ), стабильность и неизменность электрофоретических спектров глиадинов от условий выращивания растений и других внешних факторов, делает их удоб ной биохимической характеристикой сортов и линий (Конарев, 1980;
Autran, 1975, Sapirstein, Bushuk, 1990;
Degaonkar et al., 2005 и др.). Для изучения характера наследования полипепти дов ЭФ спектра, был проведен гибридологический анализ потомства F2 (зерен F2) гибрид ных комбинаций сорта Безостая 1 с сортами Одесская полукарликовая, Мироновская юбилейная, Левент, Проминь и Дукат. Сорт Безостая 1 был выбран в качестве исследуе мого из-за гомогенного и достаточно простого электрофоретического спектра. Всего для 5 ти комбинаций было исследовано 967 зерен F2. Наблюдаемое расщепление по фенотипиче ским классам соответствовало моно-, ди-, три- и тетрагибридным скрещиваниям, что под тверждено статистически (по критерию 2, который находился в интервале от 1,21 до 19,95 в зависимости от скрещивания). Анализ гибридного материала 5-ти комбинаций позволил вы делить в спектр Безостой 1, состоящий из 24 компонентов, шесть независимых блоков, со держащих 1, 4, 5, 4, 4 и 5 ЭФ компонентов. Каждый блок наследовался, как единый менде левский признак.
Таким образом, в результате гибридологического анализа была выявлена главная особен ность наследования электрофоретических компонентов глиадина: пары аллельных блоков наследуются моногибридно, как единая и нерекомбинирующая группа полос - блоки компо нентов.
3.1.2. Характер наследования глиадинкодирующих генов, выявляемый при разделе нии продуктов их экспрессии двумерным электрофорезом Целью этого раздела работы было изучение характера наследования компонентов глиади на, вычленяемых при двумерном электрофорезе, а также определение их молекулярной мас сы (рис.1). Для решения поставленной задачи были исследованы зерна F2 гибридных комби на Рисунок 1. Дву мерный ЭФ глиа динов разных сор тов пшеницы:
а - Безостая 1, b - Кавказ.
Примечание. Объ яснения нумерации компонентов даны в тексте ций мягкой пшеницы. Анализ наследования глиадиновых компонентов позволил выявить группы сцеплено наследующихся компонентов, аналогично блокам, определяемым одномер ным ЭФ. Так, из 123 зерен F2 от скрещивания сортов Безостая 1 х Мироновская юбилейная в,, и - зонах ЭФ спектра было выявлено 9 основных вариантов расположения компонен тов (рис.2). Эмпирическое распределение зерен по 9-ти классам согласуется с теоретически ожидаемым для двух независимых пар признаков с кодоминантной экспрессией (2 =6.59 при d.f. = 6, 0.50 P 0.25). Анализ того же скрещивания с использованием одномерного ЭФ по зволил показать, что ЭФ спектры родительских сортов отличаются также по двум парам бло ков. Таким образом, анализ гибридных комбинаций и сравнение результатов, полученных с использованием одномерного и двумерного ЭФ, дало возможность определить внешний об лик некоторых блоков после двумерного ЭФ. Применение SDS- электрофореза во 2-м изме рении способствовало определению молекулярной массы компонентов, входящих в 18 бло ков (табл.1).
Рисунок 2. Распределение компонентов после 2D-ЭФ зерен F2 (Безостая 1 Х Ми роновская юбилейная).
Генотипы: a - Gli-A2b, Gli D2b (Безостая 1);
с - Gli A2n, Gli-D2e (Мир. юбил.);
e, f - Gli-A2b /A2n, Gli-D2b /D2e;
(показаны только -, - и глиадины). Схемы: b - Без остая 1;
d - Мироновская юбилейная Оценки молекулярной массы глиадинов хорошо соответствуют значениям молекулярной массы соответствующих компонентов, полученным равновесным центрифугированием или на основе аминокислотной композиции.
Таким образом, генетический анализ образцов, полученных двумерным электрофорезом, позволил выявить группы сцеплено наследующихся компонентов аналогично блокам компо нентов, определяемым при одномерном электрофорезе, при этом не обнаружено компонен тов глиадина, которые бы контролировались дополнительными локусами.
Сравнение аллельных вариантов блоков, полученных двумерным ЭФ, позволило получить информацию о возможных путях эволюции глиадинкодирующих генов. Было показано, что часто блоки имеют пару компонентов с незначительно различающейся молекулярной массой и одинаковой интенсивностью окраски, причем компонент с немного большей молекулярной массой характеризуется и немного большей электрофоретической подвижностью, например, компоненты №1 и №2 (рис.1). Все компоненты, контролируемые хромосомой 6D, имеют Таблица 1. Относительная молекулярная масса и относительная интенсивность компонентов некоторых блоков у озимой пшеницы Молекулярная массаа и интенсивностьb компонентов Блок 46 + +, 47 + +, 32 + + + + + Gli-A1b 38 + + + + Gli-A1n 60 + + +, 56 +, 41 + + + + +, 30 + + Gli-B1b 57 + + +, 53 + + +, 54 + + +, 41 + + + + +, 30 + Gli-B1d 49 + +, 47 +, 45 + + +, 43 +, 42 +, 45 + + +, 44 + +, 45 +, 33 + +, 33 + + +, 33 + + Gli-B1l 50 +, 50 + + +, 51 + +, 34 + + + + +, 30 + + Gli-D1b 52 +, 53 + +, 44 + +, 45 + +, 45 +, 44 + +, 34 + + + + +, 30 + + Gli-D1j 52 + +, 53 + +, 44 + +, 45 + +, 44 +, 34 + + + + +, 30 + + Gli-D1g Gli-A2b(у 33 + + +, 28 +, 34 + + +, 32 + +, 31 + +, 27 + +, 33 + +, 31 + +, 33 + Безостой 1) Gli-A2b (у 33 + + +, 28 +, 32 + +, 31 + +, 27 +, 33 + +, 31 + +, 33 + Кончо) 35 +, 39 + +, 34 + + +, 35 +, 36 + + +, 32 +, 31 + +, 33 +, 32 + + +, 32 + + Gli-A2n 33 + + +, 28 +, 32 + + + +, 34 + + +, 27 + +, 33 + +, 31 + Gli-A2p 45 +, 36 + + +, 36 + + +, 37 + + + +, 37 + + + + Gli-B2b 42 +, 40 + + +, 30 + + + + Gli-B2o 41 + +, 34 + +, 37 + + + +, 37 + + + + Gli-B2e 35 + + + +, 34 + + + +, 32 + + + +, 34 + + +, 34 + + + + Gli-D2b 35 + + + +, 34 + + +, 33 + + + +, 34 + + +, 34 + + + + Gli-D2e 35 + + + +, 34 + + +, 32 + + + +, 34 + + +, 34 + + + + Gli-D2a a в килодальтонах b + слабый минор;
+ + минор;
+ + + средней интенсивности;
+ + + + интенсивный;
+ + + + + очень интенсивный. Компоненты каждого блока ранжированы в порядке увеличения элек трофоретической подвижности.
сходную молекулярную массу и отличаются, главным образом, по своей электрофоретиче ской подвижности (рис.4, табл. 1). Аналогичным образом различаются интенсивные компо ненты №5 и №6 (рис.1). Ряд блоков, контролируемых хромосомой 1В, включают интенсив ный компонент с молекулярной массой около 41.000 и варьирующей ЭФ подвижностью.
Различия в ЭФ подвижности без изменения молекулярной массы полипептидов может воз никнуть в результате точечных мутаций в первоначально идентичных генах (Ewart, 1977;
Hsia, Anderson, 2001). Увеличение подвижности более тяжелого компонента может быть связано с инсерцией в одну из копий, контролирующую в норме последовательности с большим коли чеством нейтральных аминокислот, особенно глютамина и пролина, последовательность, ко дирующую фрагменты с повышенным содержанием основных аминокислот. Таким образом, полученные данные указывает на то, что, по-видимому, некоторые индивидуальные гены в глиадинкодирующих локусах могли возникнуть в результате дупликаций некоторого гена предшественника и затем дивергировать в различной степени под действием мутационного и рекомбинационного процесса. Следовательно, существенную роль в ходе эволюции глиа динкодирующих локусов сыграли генетические процессы, которые привели к изменению как размера протеин кодирующей части генов, так и числа экспрессирующихся генов.
3.2. Хромосомная локализация глиадинкодирующих генов у мягкой пшеницы Хромосомный контроль блоков компонентов глиадина у сорта Безостая 1, выявляемых при одномерном ЭФ-е, установлен на основе анализа сегрегации гибридов F2 от скрещивания сортов Безостая 1 и Чайниз Спринг 1. В результате гибридологического анализа 260 зерен F установлены аллельные отношения между 6-ю парами блоков двух сортов. Для каждой пары блоков наблюдаемое распределение зерен по трем фенотипическим классам хорошо соответ ствовало теоретически ожидаемому соотношению 1:2:1 для пары кодоминантных признаков.
Кроме того, для уточнения хромосомного контроля всех компонентов глиадина сорта Безос тая 1 проводился сравнительный анализ электрофоретических спектров гибридов F2, полу ченных от скрещивания сорта Безостая 1, а также сорта Чайниз Спринг с рядом одинаковых сортов. В результате показано, что 6 блоков компонентов глиадина, выявленных у Безостой 1, контролируются 6-ю глиадинкодирующими локусами хромосом 1-й и 6-й гомеологиче ских групп (рис.3).
3.3. Каталог аллельных вариантов блоков компонентов глиадина. Эталонные сорта Для описания аллельного разнообразия глиадинкодирующих локусов были исследованы отдельные гибридные зерна F2 50 скрещиваний, в которых одним из родителей был сорт Безостая 1, а вторым - сорта озимой и яровой мягкой пшеницы. Идентификация блоков ком понентов у исследуемых сортов, позволило использовать их в качестве сортов-тестеров еще в 30 гибридных комбинациях. Кроме гибридологического анализа для определения блоков было разработано еще 3 метода: 1) анализ внутрисортовых биотипов, различающихся по Хромосомная локализация генов, контролирующих все компоненты глиадина сорта Чайниз Спринг, была определена ранее при исследовании нуллитетрасомных линий сорта Чайниз Спринг (Ахмедов, Метаковский, 1987) спектру глиадина;
2) анализ родственных сортов, который позволяет проследить наследова ние некоторых групп компонентов;
3) сопоставление новых сочетаний компонентов с из вестными идентичными блоками. Используя перечисленные методы, были идентифицирова ны блоки компонентов глиадина у 966 сортов и образцов пшеницы. Всего выявлено 170 бло ков, контролируемых 170 аллелями 6-ти глиадинкодирующих локусов. По этим данным со ставлен каталог аллельных вариантов блоков компонентов для каждого локуса (рис. 4). Ка талог представляет собой генетическую номенклатуру, с помощью которой можно описать аллельное состояние всех 6-ти локусов у генотипа любого сорта или линии. У сорта Безостая 1 хромосомы 1A, 1B, 1D, 6A, 6B и 6D (локусы Gli-A1, Gli-B1, Gli-D1, Gli-A2, Gli-B2, Gli-D2) контролируют блоки b.b.b.b.b.b. соответственно. Такая запись ал лелей называется формулой сорта. Формулы глиадина составлены для всех исследованных сортов, что позволило изучать генетическое разнообразие вида. Кроме того, используя каталог, можно идентифицировать блоки компонентов у любого сорта, анализируя только распределение компонентов глиадина в электрофоретическом спектре. Составлен список из 267 сортов, которые могут служить эталонами для блоков компонентов глиадина, представленных в каталоге.
Среди блоков компонентов, контролируемых Рисунок 3. Блоки компонентов глиадина каждым локусом, хорошо различимы 2-6 под у сорта Безостая групп, или семейств блоков, характеризую щиеся присутствием одного или нескольких компонентов с одинаковой электрофоретической подвижностью. Так, почти все блоки, контролируемые хромосомой 1В, имеют интенсивный компонент в середине спектра, исходя из подвижности которого, блоки Gli-В1 могут быть подразделены на два семейства: Gli-В1b, e, f, g, j и Gli-В1i, k, m, o, p (рис 4). Блоки внутри каждого семейства могли возникнуть один от другого в результате мутаций. Единичная му тация могла превратить блок Gli-В1m в блок Gli-В1k, и Gli-В1e в Gli-В1f, а включе ние/выключение или потеря одного глиадинкодирующего гена блок Gli-В1b в блок Gli-В1j,а Рисунок 4. Каталог аллельных вариантов блоков компонентов, контролируемых ше стью глиадинкодирующими локусами.
Б - Схематически представлен электрофоретический спектр сорта Безостая Gli-В1g в Gli-В1e и.т.д. Однако ни один блок не мог возникнуть даже через внутрилокусную рекомбинацию между членами 2-х различных семейств. Можно предположить, что блоки внутри семейства имеют общего предка и наблюдаемый полиморфизм является результатом накопления мутаций в процессе эволюции. На существенные различия между семействами указывает, например, сцепление аллелей первого семейства локуса Gli-В1 с аллелем rg-1, де терминирующим белую окраску колосовых чешуй, а аллелей второго семейства Gli-В1 с ал лелем Rg-1, определяющим красную окраску колоса (Коваль и др.,1986). Естественно пред положить, что скорость изменений в блоках сцепленных компонентов в процессе эволюции (изменения в числе, подвижности и интенсивности компонентов, вызываемые мутациями, дупликациями, делециями, неравным кроссинговером внутри кластера генов и.т.д.) одинакова в разных сериях блоков, контролируемых А-, В- и D-геномом. Вероятно, что более высокое разнообразие, наблюдаемое среди блоков А- и В-геномов по сравнению с D-геномом, обу словлено тем, что D-геном интродуцировался в тетраплоидную форму ААВВ несколько раз.
Блоки глиадина, контролируемые А- и В-геномами должны были различаться в этих тетрап лоидных формах и могли дать начало возникновению семейств блоков, наблюдаемых в на стоящее время. Таким образом, наличие семейств блоков свидетельствует о полифилетично сти происхождения мягкой пшеницы.
Полученные результаты позволили выдвинуть гипотезу о сложной структуре глиадинко дирующего локуса. Каждый из этих локусов контролирует синтез серии компонентов с раз личной ЭФ подвижностью и различной молекулярной массой. Гены, контролирующие синтез этих компонентов тесно сцеплены на хромосоме. Однако в глиадинкодирующих генах локуса могут происходить рекомбинации, мутации и другие события, изменяющие подвижность, число и интенсивность компонентов, составляющих блок. Судя по большому разнообразию аллельных блоков, эти изменения не были редкими и не элиминировались естественным отбо ром и/или селекцией.
3.4. Маркирование аллелями глиадинкодирующих локусов адаптивной и селекци онной ценности генотипа В процессе эволюции вида под действием естественного отбора сформировались коадаптив ные комплексы генов, ответственные за основные признаки генотипа растений (Nevo et al., 2002;
Korol et al., 1996). Если глиадинкодирующие локусы относятся к таким ассоциациям, то их аллели могут маркировать генотип в целом и быть использованы как эффективные ге нетические маркеры. Для подтверждения этого предположения была исследована связь от носительной адаптивной и селекционной ценности генотипов растений мягкой пшеницы с несколькими аллелями ГКЛ хромосомы ID (локус Gli-D1). Была создана искусственная гиб ридная популяция яровой мягкой пшеницы (рис. 5). Начиная с F3, популяция ежегодно высе валась в поле в объеме 500-1000 семян на вариант, в зоне северной лесостепи. Были исследо ваны 3 варианта гибридной популяции (табл. 2). Восемь родительских сортов передали в гиб ридную популяцию 5 аллелей ГКЛ хромосомы ID (Gli D1) (рис. 5). В исходной популяции чаще встречался аллель Gli-D1a, унаследованный от 4-х из 8-ми родительских сортов. Концен трация остальных аллелей приблизительно соответствовала доле одного родительского сорта (100%:8=12,5%). Через 4 года пересевов без искусственного отбора (вариант 2) доля Gli-D1a Рисунок 5. Схема получения гибридной популяции. Аллели локуса Gli-D1 и их частоты, вы явленные у сортов, вошедших в гибридную популяцию.
Латинскими буквами обозначены аллели ГКЛ, в скобках даны частоты их встречаемости.
возросла, а Gli-D1i, и D1d - уменьшилась. Сравнение двух вариантов популяции - без искусст венного отбора (вариант 2) и с отбором на крупность зерна (вариант 3) – позволило показать, что частота аллеля Gli-D1a статистически достоверно увеличивается и в популяции с отбором, Таблица 2. Исследованные варианты популяции № Характеристика популяции Число зерен 1 «Исходная» популяция (F3), полученная гибридизацией 8-и сортов с последующим пересевом 2-х поколений в теплице 2 Популяция (F7), пересевавшаяся 4 года без искусствен. отбора 3 Отбор в течение 4-х лет на крупность зерна на фоне естественного отбо- ра (F7) Gli-D1d почти полностью исчез из популяции, а концентрация Gli-D1i достоверно возросла.
Достоверно уменьшилась частота Gli-D1b, что не отмечалось в популяции без отбора. Ал лель Gli-D1g встречался во всех вариантах популяции примерно с одинаковой частотой (табл. 3). Анализ распространения изученных аллелей Gli-D1 среди 85 сортов яровой пшени цы РФ также продемонстрировал очевидное селективное преимущество аллеля Gli-D1a по сравнению с другими аллелями. Этот аллель встречался в 68% случаев, на втором месте по частоте встречаемости аллель Gli-D1g–19 %, затем b -14%, i - 6%, d - 0. Таким образом, Таблица 3. Частоты встречаемости аллелей локуса Gli-D1 (p) и оценка достоверности разли чия частот аллелей по критерию Фишера в 3-х вариантах популяции Аллели Варианты популяций Сравниваемые популяции Gli-D1 1-2 2-3 1- 1 2 ** * 21,9*** 42,8 53,3 61,0 7,3 4, a 15,2 12,8 17,0 0,8 3,1 0, g ** 4,2* 15,6 18,1 9,7 0,9 10, b 8,3** 7,3** 12,8 6,3 11,4 0, i *** 45,6*** 13,4 9,3 1,1 2,8 31, d Значения критерия Фишера для трех порогов вероятности - * - 3,9, ** - 6,7, *** - 11,0.
достоверные изменения частот некоторых аллелей обнаружены как при свободной эволюции по пуляции, так и при четырехлетнем искусственном отборе на крупность зерна. Аллель Gli-D1a, получая преимущество по сравнению с другими аллелям в популяциях обоих типов, маркиру ет не только комплекс генов, придающих растениям относительно большую адаптацион ную ценность (вариант 2), но и селекционные преимущества (вариант.№ 3), так как его частота повышается при отборе на крупность зерна. Следоватедьно, вместе с Gli-D1a отби рается целый комплекс признаков, удовлетворяющий действию как естественного, так и искусственного обора. Аллели b и d не поддерживаются искусственным отбором, а Gli-D1i стремиться к исчезновению из популяции без отбора. Адаптивная ценность гетерозиготных генотипов характерна для Gli-D1g.
Таким образом, изучение формирования разнообразия в искусственно созданной модель ной популяции мягкой пшеницы позволило показать, что аллелями ГКЛ можно маркировать количественные признаки со сложным полигенным контролем, что позволяет использовать ГКЛ как генетические маркеры и выявлять сопряженность блоков компонентов глиадина с хозяйственно-ценными, жизненно-важными и другими характеристиками генотипа.
Глава 4. Динамика генетического разнообразия мягкой пшеницы под дей ствием искусственного отбора в процессе долговременной селекции Современная научная селекция прошла путь от простого улучшения местных сортов популяций до программированного создания генотипов чистолинейных сортов. Доступность генетического материала из любых генбанков мира расширяет возможности селекционных программ. Искусственный отбор в результате интенсификации процессов селекции становится одним из главных факторов микроэволюции вида, который может привести к существенным изменениям генофонда мягкой пшеницы, являющейся стратегическим объектом страны. Для оценки изменений, вызываемых в генофонде мягкой пшеницы длительным искусственным отбором, были исследованы сорта с разным типом развития из нескольких крупных селекцен тров. Анализировались все сорта, созданные за время существования этих селекцентров (табл.4). Как видно из табл.4 у современных сортов всех регионов, исключая Нечерноземье, увеличивается число аллелей по сравнению с группой старых сортов. Со временем сокращает ся число гетерогенных по глиадину сортов, которые содержат 2 и более биотипа. Это свиде тельствует об устойчивой тенденции к переходу от использования гетерогенных сортов популяций к созданию однородных чистолинейных сортов, которые, как было показано Таблица 4. Основные характеристики для сортов пяти исследованных селекцентров Регионы Исследованы Число Число Гетероген Всего Утеряно/ сорта, создан- аллелей сортов стар/совр алле- приобретено ные за период стар/совр сорта,% лей аллелей сорта Нечернозем. 1930 - 2006 гг. 64/37 56 52/16 77 40/ Саратов (яр.) 1920 - 2006 гг 18/25 44 100/50 37 7/ Краснодар 1920 - 2006 гг 21/59 80 50/41 59 8/ Сербия 1940-е 2005 гг. 24/36 118 50/11 55 13/ Италия* 1940-е-2000-е гг. 37/43 129 10 66 9/ ранее, характерны для большинства европейских стран (например, во Франции гомогенных по глиадину сортов 99,5%). Для исследования динамики частот аллелей ГКЛ сорта каждого селекцентра разделены на 2 - 5 группы, соответствующие последовательно изменяющимся направлениям в селекции (табл.5). Для каждой группы рассчитаны частоты аллелей, что по Таблица 5. Количество сортов (N), изученное в разные периоды селекции в 5-ти регионах Краснодар Нечерноземье Сербия и Италия Яровые Саратова Годы N Годы N Годы N Годы N 1920 - 1930-е 4 1929-1958 25 1964 - 1973 10 и 31 1924-1929 1940-е - 1955 6 1991-2006 31 1973-1988 61 и 53 1938-1976 1959- 1990 16 1989-2004 по 45 1977-1983 1990 - 2000 22 1985-2002 2000 - 2006 зволило проследить генетические изменения, происходящие во времени. Во всех селекцен трах от группы к группе наблюдается общая закономерность. - С одной стороны, появляют ся новые, не характерных для старых местных сортов, аллели (что свидетельствует о привле чении в селекционные программы инорайонного материала), с другой - исчезает ряд аллелей старых сортов (рис.6), часть которых встречалась с достаточно высокими частотами (от 12, до 60%).
Особенно резко исчезновение местного генетическаго материала проявляется в группе сортов Нечерноземья 1970-х - 2006 гг. создания. За годы селекции утеряно 40 аллелей, кото рые были характерны для сортов 1929-1958 гг., появилось всего 10 новых аллелей. Отноше ние исчезнувших аллелей к сумме всех аллелей равно 50%, а к сумме старых аллелей - 59% (В селекцентре Саратова, эти отношения составляют 24 и 44%.).В целом у современных сор А Б Рисунок 6. А. Частоты аллелей локуса Gli-А2 в разных группах краснодарских сортов. Б - частоты аллелей локуса Gli-D у современных (темные) и старых мест ных (светлые столбики) сортов Нечерно земья. По оси абсцисс - аллели ГКЛ, по оси ординат - частоты встречаемости ал лелей тов обнаружено почти в 2 раза меньше аллелей ГКЛ, чем у старых сортов (табл.6). Наиболь шее распространение в этой группе получили аллели сорта Мироновская 808 (70%), доста точно часто встречаются аллели Gli-A1b (19%) и Gli-B2b (17%), характерные для генотипа другого широко распространенного сорта - Безостая 1. Практически ни один из часто Таблица 6. Аллели ГКЛ, встречающиеся у 2-х групп сортов с высокой частотой Группа ЛОКУСЫ Всего Гетеро сортов аллелей ген. сор Gli-A1 Gli-B1 Gli-D1 Gli-A2 Gli-B2 Gli-D та, % Старые 63 o+d new3 a+i i+f r+j a+p Соврем. 37 f+b m+b+d e+a+b b g n Мир.808 - e+a f b g n m встречающихся аллелей старых сортов не появился в генофонде современных сортов, (ис ключение составляет только аллель Gli-D2a). Такая же тенденция прослеживается и для сор тов, созданных в Саратове и Краснодаре. Появление в конце 50-х годов в КНИИСХе сорта Безостая 1, а позже в 70-х гг. Кавказа и Авроры (сорта 1959 - 1990 гг.) кардинально изменило набор аллелей, характеризовавших генофонд старых краснодарских сортов (1920-е 1930-е гг.). Частота аллелей от Безостой 1 во всех группах вплоть до настоящего времени колеблет ся около 50%, а Кавказа и Авроры – около 20%. Аллели этих сортов более чем на 70% опре деляют генофонд современных сортов КНИИСХа, независимо от изменения направлений селекции (рис. 7). Использование генотипов Безостой 1, Кавказа и Авроры с 70-х годов про шлого века в качестве генетического материала в селекционных программах в Сербии Рисунок 7. Частоты аллелей от сортов Безостая 1 (сплошная линия), Миро новская 808 (пунктир) и всех других аллелей (точки) в разных группах красно дарских сортов обусловило генетический облик сортов этой страны. У сербских сортов наблюдается такая же высокая частота встречаемости аллелей российских сортов-доноров, как и у сортов, соз данных в КНИИСХе, то есть около 50% и 30%. В результате, генофонд старых сортов Сер бии заменился более чем на 70%, учитывая также и генетический материал, привнесенный из других регионов. Характерные для вышеперечисленных российских сортов аллели появля ются и у современных сортов Италии. Они не встречались в группе старых сортов. Так, час тоты аллелей, характерные для Безостой 1, по локусам Gli-A2b и Gli-B1b возрастают к 2000 м гг. от 0 до 30%, Gli-B2b от 0 до 14%, Gli- D1b - от 16 до 28%, а Gli-B1l (от сортов Кавказ или Аврора) от 0 до 10%. Кроме того, в селекционных программах обеих стран используют ся также близкий набор сортов-доноров из других источников (K.Boroevic, 2003). При оцен ке генетического расстояния между старыми и современными сортами этих стран показано, что оно сократилось в 1,9 раза с 0,949 до 0,504.
Таким образом, результаты изучения динамики распределения частот аллелей в разных СЦ позволяют сделать вывод, что в процессе селекции происходит замена уникальных аллелей, характерных для начального этапа селекции, на аллели ограниченного числа сортов-доноров.
Очевидно, что генофонд современных сортов беднеет за счет исчезновения части генетиче ского материала старых сортов. Так, в процессе селекции, начиная с 20-30-х годов из гено фонда исчезло: у саратовских сортов - 7, краснодарских -8, сербских - 5, итальянских -14, озимых сортов северных регионов России - 40 аллелей. В данном случае мы можем говорить о генетической эрозии генофонда мягкой пшеницы, определяемой как уменьшение генетиче ского разнообразия вида.
Однако часто наличие генетической эрозии оценивается по уменьшению во времени пока зателя генетической гетерогенности сортов (Н) определенных регионов (Tripp 1996;
Donini et al., 2000 и др.). Исходя из значений Н, рассчитанной для разных групп сортов пяти исследо ванных регионов (табл. 7), можно считать, что только озимые сорта Нечерноземной зоны и с Таблица. 7. Величина генетической гетерогенности в разных группах сортов Регионы Гетерогенность разных групп сортов Старые сорта Промежуточные группы Современные сорта 2-я 3-я 4-я Нечернозем 0,825±0,01 0,508±0, Саратов 0,516±0,02 0,203±0,01 0,494±0,03 0,417±0, Краснодар 0,599±0,05 0,700±0,03 0,688±0,02 0,761 0,712±0, Сербия 0,626±0,03 0,578±0,01 0,633±0, Италия 0,765±0,04 0,695±0,04 0,763±0, натяжкой саратовские сорта подверглись в процессе селекции генетической эрозии. У сортов Краснодара Н увеличивается, а в группах сербских и итальянских сортов - практически не меняется со временем. Исследование динамики смены аллелей в разные периоды позволило показать, что увеличение Н происходит за счет аллелей, привнесенных сортами-донорами из других регионов, но разнообразие таких аллелей невелико, так как в селекционных програм мах разных селекцентров используется близкий набор сортов. Например, генотип сорта Без остая 1 и его потомков в значительной мере определяет генофонд Краснодарских, Сербских и Итальянских сортов, а генотип Мироновской 808 - озимых сортов северных регионов Рос сии. В увеличение аллельного разнообразия современных сортов вносят вклад также боль шое число редких аллелей. Поэтому показатель Н, выявленный в отдельных селекцентрах, не может рассматриваться как критерий генетических процессов, происходящих в генофонде мягкой пшеницы в целом.
Сравнение набора и частоты аллелей у 42-х стародавних и 118-ти современных озимых сортов РФ также позволяет подтвердить происходящую в результате селекции генетическую эрозию суммарно по нескольким регионам. Уменьшается число аллелей и генетическая гете рогенность групп сортов, аллели старых местных сортов исчезают (табл. 8). Происходит ди вергенция старых и новых сортов (табл. 9). Таким образом, в процессе искусственного отбо ра происходит уменьшение генетического разнообразия мягкой пшеницы, что представляет собой процесс эрозии генетических ресурсов в пределах целого вида, в результате которого теряются уникальные коадаптированные генные комплексы, сформировавшиеся в течение Таблица 8. Разнообразие современных1 и староместных2 озимых сортов, распространен ных на территории РФ Аллели* Всего Всего Н Сорта Gli-A1 Gli-B1 Gli-D1 Gli-A2 Gli-B2 Gli-D2 сортов аллел.
Местные 42 72 0,824±0, o+d b+new a+g+i+d i+m r+j+k a+e Соврем. 118 54 0,630±0, f+b b g+b n+b+f m+b+o e+b Безостая 1 b 33% b b b b b Мирон.808 f 41% b g n m e *Представлены аллели, встречающиеся с высокой частотой. Современные – все райони рованные в 2006 г. сорта, 2 староместные сорта взяты из тех же регионов, что и современные длительного периода под действием естественного отбора. Как было показано последствием такого процесса является деградация вида (Алтухов, 1995). В результате уменьшается гене тический потенциал растений, от которого зависит устойчивость растений к болезням и но вым пестицидам, а также приспособленность к будущему изменению климата и сельскохо зяйственной практики (Clunies-Ross 1995;
Tripp 1996;
Donini et al., 2000) Таблица 9. Генетические расстояния (d 2) между разными по времени создания группами сортов Сравниваемые группы Краснодар Нечерноз. Сербия Италия Саратов старые - современные 1,30±0,08 1,2±0,03 0,974±0,1 0,618±0,09 0,572±0, сорта 90-х - сорта 2000-х гг. 0.301±0,03 0,094±0,05 0,236±0,04 0,333±0,04 0.350±0, Проблеме генетической эрозии культурных растений, особенно таких, как пшеница, ко торая занимает одно из первых мест в пищевом рационе человека, необходимо уделять осо бое внимание. Для предотвращения процесса деградации вида необходимо сохранение всего генофонда пшеницы и в первую очередь генотипов старых местных сортов и рас. Старые сорта, хорошо приспособленные к условиям среды своего региона (Пыльнев, 1998), облада ют уникальными ассоциациями генов, потенциал которых еще недостаточно изучен и недос таточно использован.
Глава 5. Влияние естественного отбора на структуру генотипов мягкой пшеницы Естественный отбор как главный фактор эволюции у диких сородичей мягкой пшеницы (Allard, 1996;
Li et al., 2000;
Nevo et al., 2003), действуя на целые комплексы генов, дает пре имущество самым высоко приспособленным и пластичным генотипам (Korol et al., 1996). У культурных видов в качестве мощного фактора, резко изменяющего генофонд культивируе мой пшеницы, становится искусственный отбор. Для определения роли естественного отбора при формировании генетической изменчивости мягкой пшеницы было исследовано распре деление аллелей ГКЛ у 118 сортов озимой мягкой пшеницы, включенных в реестр Россий ской Федерации на 2006г. Исследованные сорта районированы в 8 сельскохозяйственных провинциях, различающихся по климатическим показателям (табл.10). Состав сортов в про винциях формировался таким образом, что если сорт районирован в нескольких провинциях, то он учитывался в каждой из них. Показано, что сорта разных провинций различаются меж ду собой как по набору аллелей ГКЛ, так и по частотам их встречаемости (рис. 8). В некото Таблица 10. Природно-сельскохозяйственные провинции и их характеристики, а также дан ные по генетической структуре сортов разных провинций Влага1*Теп- Зи- Гом- Число № Провинция Зона Число H ло2* ма3* ть, %* сортов аллелей 1 Белорусская Таежно- 1 2 4 5 14 0, 2 Средне-Русская 1 лесная 1 1 3 72,2 18 25 0, 3 Западно- Лесо- 2 1 1 77,8 9 19 0, Сибирская степная 4 Предуральская 2 1 2 71,4 14 22 0, 5 Средне-Русская 2 2 2 3 85,7 14 23 0, 6 Заволжская Степная 3 2 2 50, 0 23 26 0, 7 Южно-Русская 3 2 3 43,7 30 27 0, 8 Предкавказская 3 3 4 48,3 59 46 0, Гом-ть – процент гомогенных по глиадину сортов;
Влагообеспеченность (отношение количества осадков в год к испаряемости*): 1 - высокая (0,55-0,53), 2 - средняя (0,53-0,44), 3 - низкая (0,35-0,24). 2Теплообеспеченность (сумма тем ператур выше 10 градусов С0 *): 1 - ниже средней (1600-2200), 2 - средняя (2400-2900), 3 выше средней (3200). 3Суровость зимы: 1 - очень холодная, 2 - холодная, 3 - умеренно хо лодная, 4 - умеренно мягкая. * - данные цитируется по (Pomortsev, Kalabushkin, 1991).
рых регионах с незначительными частотами встречаются аллели, которые не характерны для агроклиматических условий местности. Например, в Предуральской провинции обнаружено 2 сорта - Смуглянка и Волжская 100, у которых имеются аллели Gli-D1d у первого, а также A1o и D2p у второго, характерные только для южных сортов. В южных и западных регионах возрастает число аллелей, а также число гетерогенных по глиадину сортов, что очевидно связано с более благоприятными для возделывания пшеницы агроклиматическими условия ми. Так, в самой южной провинции - Предкавказской районировано максимальное число сортов - 58, из которых 51,7% гетерогенны. Выявлено 46 аллелей ГКЛ (что в среднем в два раза больше, чем в каждой из других провинций (от 14 до 27)), из которых 15 встречаются только в этом регионе. Уровень аллельного разнообразия превышает таковой в других ре гионах (табл.10).
0, 0, Gli-D Gli-D 0, 0, 0, 0, 0, a b c a b d e f g j j k p а б Рисунок 8. Распределение частот аллелей глиадинкодирующих локусов в группах сортов из провинций с разной влагообеспеченностью (а) и с разными условиями перезимовки (б). (В качестве примера приведены частоты аллелей локусов Gli-D1 и Gli- D2). а) -частоты алле лей в группе сортов полузасушливой степной зоны, - лесостепной зоны, - влажной лес ной зоны;
б) - частоты аллелей сортов из регионов с умеренно мягкой зимой, - с холодной зимой, - с очень холодной зимой. b - аллели от Безостой 1;
g, e – от Мироновской Для определения факторов, которые могут влиять на распределение частот аллелей, провин ции были сгруппированы по однородности таких абиотических характеристик, как влагообес печенность, теплообеспеченность и суровость зимы. Глиадиновые профили сортов, принадле жащих разным группам, сравнивались между собой по критерию идентичности (I) (Животов ский, 1983). В результате было выявлено, что статистически достоверно различаются группы сортов, произрастающие в районах с разной влагообеспеченностью (соответствует делению на климатические зоны), а также суровостью зимы (табл. 10,11, рис. 8).
Таблица 11. Достоверность различия в наборе аллелей и их частотах между сортами, рас пространенными в провинциях, различающихся влагообеспеченностью и суровостью зимы Влагообеспеченность Суровость зимы Сравниваемые группы Сравниваемые группы I I Влаж. – полувлаж. 66,82** Очень холодная - мягкая 185*** Полувлаж. - полузасуш. 178,50*** Холодная - мягкая 111*** Влажная – полузасушл. 174,02*** Очень холодная – холодная 46,4* Очень холод. – умерен.холод. 79* Холод. – умерен. холод. 32, Если по влагообеспеченности между всеми группами сортов существует высокодостоверное различие, то по условиям перезимовки такие различия наблюдаются только между группами сортов из существенно различающихся по суровости зимы регионов. Для сибирских сортов, произрастающих в условиях очень холодной зимы, даже выявлены специфические аллели- B2d и A1new3 (в сортах, районированных ранее 2006 г., они встречались с частотой до 30%). Ис следование распределения аллелей ГКЛ позволило показать, что во всех провинциях домини руют аллели характерные всего для двух сортов - Безостая1 и Мироновская 808, причем сум марно частоты аллелей этих сортов в некоторых регионах достигают более 80%. В более мяг ких условиях южных и западных провинций преобладают аллели первого сорта, в суровых ус ловиях северных и восточных регионов – второго (рис. 9). Как показал анализ родословных северных сортов, при их создании помимо Мироновской 808 широко использовались сорта южных регионов, например, краснодарские, зерноградские, одесские сорта, однако подавляю Без. Мир. Др. сорта ая ая я ая ая ая ка ая ая ск ск ск ск ск зс ир ск ск ль ус лж ус ка ус ус иб -Р ра ор во ав Р Р С но ду ел е е За дк о ж ре дн дн Б дн ре Ю П ре ре П па С С За Рисунок 9. Частоты аллелей, которые характерны для Безостой 1, Мироновской 808 и всех других сортов вместе в разных провинциях.
По оси ординат – частоты аллелей, по оси абсцисс – сорта разных провинций, которые рас положены в порядке улучшения условий произрастания пшеницы щее большинство современных северных сортов унаследовало генотип Мироновской 808.
Например, в провинции №2 (табл. 10) пять из 18 сортов имеют спектр полностью идентич ный Мироновской 808, а суммарная частота встречаемости аллелей от Мироновской состав ляет 72 %, т.е. почти 3/4 генофонда провинции. Полученные результаты позволяет предпо ложить разную адаптивную ценность генотипов, маркируемых аллелями сортов Безостая 1 и Мироновская 808, в разных климатических зонах, что, очевидно, поддерживается естествен ным отбором. Таким образом, комплексом природно-климатических условий определяется набор генотипов сортов иногда независимо от усилий селекционеров. Появление с низкой частотой в генотипах северных сортов генов, характерных для южных сортов и наоборот, вероятно, связано с микроэволюционными процессами, происходящими под влиянием ис кусственного отбора. В результате скрещиваний генетически удаленных генотипов разры ваются коадаптированные сцепленные комплексы генов, которые возникли в результате дли тельного естественного отбора, и появляются рекомбинантные генотипы, поддерживаемые искусственным отбором. Поэтому мы наблюдаем появление необычных сочетаний ге нов.Однако существование новых генотипов напрямую зависит от их приспособленности к условиям среды обитания, то есть от действия естественного отбора, чем, вероятно, и объяс няется низкая частота встречаемости таких генотипов. Следовательно, естественный отбор в значительной степени влияет на набор генотипов сортов в разных агроэкологических зонах, благоприятствуя в каждой зоне более приспособленным генотипам, маркируемым опреде ленными аллелями ГКЛ.
Преимущественное распространение на обширной территории, охватывающей 8 при родных провинций, аллелей, характерных всего для 2-х сортов (Безостая 1 и Мироновская 808), подтверждает данные о глубокой генетической эрозии, происходящей в генофонде озимой пшеницы. (У сортов из северной зоны возделывания показатель генетического раз нообразия за 60 лет интенсивной направленной селекции снизился в 1,6 раза, с Н=0,825 у старых сортов до Н=0,508 у современных.) В ходе работы выявлено, что около 40% современных сортов, районированных в 2006 го ду, несут в своем составе несколько глиадиновых биотипов, которые могут по-разному реа гировать на изменения условий окружающей среды, обеспечивая пластичность сортов (Ме таковский и др., 1987;
Metakovsky, 1990). Существенное изменение частот биотипов может изменить характеристики сорта и даже привести к его потере. Нами показано, что у старо давних сортов в процессе их многолетних пересевов в коллекциях постепенно исчезает большая часть биотипов. В связи с этим встает вопрос о сохранении сортов во всем многооб разии их внутренней генетической структуры, особенно стародавних сортов, генофонд кото рых постепенно обедняется и часть генетического разнообразия безвозвратно утрачивается, что приводит к их деградации.
Глава 6. Филогения, происхождение и распространение культуры мягкой пшеницы 6.1. Филогенетические взаимоотношения видов в роде Triticum L.
Изучение филогенетических связей между разными видами рода Тriticum позволяет полу чить информацию о происхождении мягкой пшеницы. Мягкая пшеница Triticum aestivum (ге ном ААВВDD) и тетраплоидные виды Тriticum durum и Тriticum carthlicum (геном ААВВ), как предполагается, имеют идентичные А- и В-геномы (Kihara, 1975;
Kerby and Kuspira 1987;
Dvorak et al., 1990, 1993;
Talbert et al., 1995;
Caldwell et al., 2004 и др.), и, следовательно, находятся в тесном родстве между собой. Сходство структуры глиадинкодирующих локусов у Т. durum, Т. carthlicum и Т. aestivum дает основание утверждать, что вероятность независи мого происхождения (например, путем мутаций) двух блоков с одинаковым компонентным составом, контролируемым сложным кластером генов, практически равно нулю (Metakovsky et al., 1989). Следовательно, сходство блоков у разных видов будет указывать на их тесное родство. Для определения родства Т. durum, Т. carthlicum и Т. aestivum было проведено срав нение этих видов по аллельным вариантам блоков компонентов глиадина, контролируемых локусами А- и В-геномов.
А-геном. У сортов видов Т. durum, и Т. aestivum обнаружены одинаковые блоки, контро лируемые локусами А-генома. Например, у сортов Веллс, Лангдон (Т. durum) и Ранняя 73 (Т.
aestivum) выявлен блок Gli-A1r (рис. 10А), у Оренбургской Ранней, Харьковской 7 (Т. durum) и Одесской 16 (Т. aestivum)– блок Gli-A1o (рис. 10Б), у Мелянопуса 7 (Т. durum) и Кзыл-Бас (Т. aestivum)– блок Gli-A1p (рис. 10А) 2. В целом, около 70% исследованных сортов Т. durum имело в своем спектре блоки типа Gli-A1o, Gli-A1p или Gli-A1r. Эти блоки присутствует так же у многих сортов яровой и озимой мягкой пшеницы. У Т. durum и Т. aestivum выявлены также идентичные блоки, контролируемые 6А хромосомой (Кудрявцев и др., 1987). Следова тельно, обе глиадинкодирующие хромосомы А-генома (1А и 6А) у Т. durum контролируют Наследуемость компонентов у Т. durum блоками доказана с помощью гибридологического анализа зерен F2 скрещиваний: 1) Веллс * Шарк (2=0,01;
Р0,9);
2) Безенчукская 105 * Харь ковская 7 (2= 0,12;
Р0,5), 3) Оренбургская Ранняя * Мелянопус 7 (2= 1,29;
Р0,5). В по следней гибридной комбинации пара блоков Gli-A1o и Gli-A1p наследуется независимо от компонентов, контролируемых хромосомой 1В (для расщепления 1:2:1:2:4:2:1:2:1 2 = 8,82;
P0,2). Это подтверждает, что изученные блоки кодируются хромосомой 1А.
аллельные варианты блоков, идентичные тем, которые были идентифицированы при анализе Т. aestivum.
При сравнении Т. aestivum и Т. durum с Т. carthlicum выявлено, что 3 из 4-х исследованных разновидностей Т. carthlicum (dekaprelevichi, rubiginosum и stramineum) имеют блоки, подоб ные контролируемому хромосомой 6А блоку мягкой пшеницы, Gli-A2b (рис. 10В, 1, 2), а образца разновидности fuliginosum – блоку Gli-A2n (рис. 10В, 3, 5). Такие же блоки компо нентов контролируется хромосомой 6А и у Т. durum (рис. 10В, 4). В спектрах глиадина Т.
carthlicum var. fuliginosum и var. dekaprelevichi в -зоне присутствуют блоки, идентичные контролируемым хромосомой 1А у Т. durum и у Т. aestivum (рис. 10А). Таким образом, Т.
carthlicum, Т. durum и Т. aestivum имеют одинаковые блоки компонентов, контролируемые хромосомами генома А. Таким образом, одинаковые блоки компонентов, контролируемые хромосомами А-генома, выявленные у 3-х изученных видов, свидетельствуют об идентич ности А-генома у этих видов.
В-геном. Сравнение 3-х видов, у которых блоки компонентов глиадина, контролируемые хро мосомой 1В, выявлены с помощью гибридологического анализа, позволило показать, что Т.
durum и Т. aestivum не имеют идентичных блоков. Тогда как у Т. carthlicum var. stramineum, fuliginosum и dekaprelevichi обнаружен блок, идентичный блоку мягкой пшеницы Gli-В1n (рис. 10Г, 4-6), а у var. rubiginosum - блоку Gli-В1k (рис.10Г, 1, 2 ). Блоки Gli-В1n и Gli-В1k встречаются у многих неродственных сортов мягкой пшеницы.
Наш анализ позволяет предположить, что доноры В - генома у Т. durum и Т. carthlicum раз личались по крайней мере аллельными вариантами глиадинкодирующих локусов хромосомы 1В. Возможно, это были разные генотипы, принадлежащие к одному виду. Исходя из полно го различия Т. aestivum и Т. durum по набору блоков компонентов, контролируемых хромо сомой 1В, можно предположить, что В-геном мягкой и В-геном твердой пшеницы произош ли от разных популяций (разновидностей/подвидов) прародителя. Несколько типов идентич ных блоков, контролируемых как А-, так и В-геномом согласуются с предположением, что Т.
carthlicum и Т. aestivum филогенетически очень близки и, возможно именно Т. carthlicum или ее прототип могли участвовать в происхождении мягкой пшеницы. С другой стороны, имеющиеся в коллекции разновидности Т. carthlicum, не могли обеспечить все разнообразие типов блоков мягкой пшеницы.
У Т. aestivum выявлено 6 семейств блоков, находящихся под контролем хромосомы 6А, у Т. durum – 5 (Кудрявцев и др., 1987), у Т. carthlicum – минимум 2. Ни одно из семейств не могло возникнуть из другого в результате единичных мутационных изменений. Тем не ме нее, три одинаковых типа блоков имеется у Т. durum и Т. aestivum, один тип - у Т. aestivum и Т. carthlicum и два типа у Т. durum и Т. carthlicum. Эти данные свидетельствуют в пользу полифилетического происхождения Т. aestivum, которая не могла появиться в результате единственного акта межвидовой гибридизации тетраплоидного прародителя (геном ААВВ) А Б В Г Рисунок 10. Электрофоретические спектры разных видов пшениц. А, Б - сравнение блоков компонентов глиадина, контролируемых хромосомой 1А. В - сравнение блоков, контроли руемых хромосомой 6А. Г - сравнение блоков, контролируемых хромосомой 1В с диплоидным донором генома D. Таких событий, по-видимому, было несколько, и в них уча ствовали тетраплоиды, различавшиеся, по крайней мере, аллельными вариантами глиадинко дирующих локусов.
6.2. Распространение мягкой пшеницы Triticum aestivum L.
Анализ полиморфизма глиадина у местных сортов Т. aestivum различных географических ре гионов имеют большое значение для изучения процесса формирования генетического разно образия пшеницы и путей ее распространения. Было исследовано 17 групп сортов T. aestivum из различных регионов Евразии, а также образцы филогенетически близкого мягкой пшени це вида T. sphaerococcum (табл. 12). Всего проанализировано 215 местных сортов. Выявлено 105 аллелей ГКЛ из 111, известных к началу исследования местных сортов, а также 78 алле лей (70,2% от 111), которые не были обнаружены ранее. Эти данные еще раз подтверждают, что в процессе искусственного отбора происходило обеднение генофонда мягкой пшеницы разнообразие старых местных сортов (183 аллеля) более чем в полтора раза (в 1,64 раза) ши ре, чем у современных сортов (111 аллелей). При этом надо учесть, что аллельное разнообра Таблица. 12. Исследованные группы сортов и внутригрупповое аллельное разнообразие (Н) Регион рас- Число Регион распростра- Число простр. сортов сортов нения группы сортов сортов Н Н Грузия 17 0.83±0.02 Зап. Таджикистан 4 0.68±0. Крым 20 0.69±0.03 Туркменистан 7 0.70±0. Украина (оз.) 9 0.70±0.05 Нечерноземье (яр.) 13 0.63±0. Поволжье (яр.) 13 0.65±0.01 Нечерноземье (оз.) 14 0.70±0. Поволжье (оз.) 9 0.67±0.04 Горный Бадахшан* 20 0.85±0. Киргизия 12 0.72±0.03 Азербайджан 9 0.67±0. Армения 6 0.70±0.06 Узбекистан 13 0.74±0. Польша (оз.) 7 0.64±0.05 Зап. Сибирь 12 0.66±0. Испания 15 0.75±0.03 T. sphaerococcum 15 0.55±0. оз. - озимые сорта, яр. - яровые сорта зие местных сортов в естественных популяциях значительно (в 2-10 раз) больше, чем в кол лекционных, которые мы анализировали. Сорта Горного Бадахшана и Грузии отличаются наибольшим разнообразием, у них обнаружено по 50 известных, а также соответственно 12 и 9 уникальных аллелей ГКЛ (табл.12). Именно эти территории Н.И.Вавилов (1924, 1935) счи тал центрами разнообразия и, возможно, историческими центрами происхождения мягкой пшеницы. Расчет генетических расстояний между сортами разных групп позволил показать, что сорта Закавказья имеют наименьшее генетическое расстояние с сортами Горного Бадах шана (d=0.74), что свидетельствует об их родстве. Однако по генетической изменчивости D генома закавказские сорта статистически достоверно отличаются от бадахшанских (критерий идентичности I= 70,95***) (рис.11). Эти результаты в совокупности с литературными дан ными, например, по генам Vrn (Tsunewaki,1966;
Гончаров, Чикида, 1995;
Гончаров, 2002), генам гибридного некроза (Пухальский, 2002) позволяют рассматривать генотипы сортов этих двух регионов как две генетические ветви, которые могли получить D-геном из разных источников. По матрицам генетических расстояний проведен кластерный анализ (STATISTICA 6.0) (рис 12).В результате, сорта Закавказья, Крыма и Украины, а также ози мые сорта Поволжья объединяются в один подкластер «в». Сорта Крыма и Украины имеют наименьшее генетическое расстояние с сортами Закавказья (d2=0.88 и 0.89 соответственно).
Выявлено, также, что некоторые сорта Закавказья и Украины (например, Долис-Пури - Ук раинка) имеют идентичные спектры глиадина. Кроме того, нами показано, что разнообразие аллелей, обнаруженное в Закавказье, на 75±9% и более покрывают разнообразие европей ских сортов: Восточной Европы - на 84±6%, 0. 0. 0. 0. Gl i -D1 Gl i -D 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. a a d e b h f j g k h l q i r j s n1 n2 n k p q n4 n Рисунок 11. Частоты аллелей локусов Gli-D1 и Gli-D у грузинских ( )и бадахшанских ( ) сортов Франции, Англии и Италии в, среднем, на (73±4)%, Испании - на 66±7%. Полученные ре зультаты позволяют предположить, что распространение озимых форм мягкой пшеницы в Европу происходило из Закавказья через территорию Крыма 3 и Украины. Это согласуется с мнением Н. И. Вавилова (1935) о том, что сорта Закавказья были предшественниками мест ных европейских сортов - Банаток.
Рисунок 12. Кластеризация групп сортов по матрицам генетических расстояний по Нею О торговых связях между античными государствами Тавриды и Колхиды указывали еще гре ческие авторы В отдельный кластер «д» объединились сорта географически отдаленных регионов. Для них характерно присутствие аллелей (например, В1h, D1i), не встречающихся в Закавказье, и высокая частота аллелей (например, A1d, В1о, A2j, D2r), редких для других групп сортов. У некоторых сортов из удаленных регионов выявлены идентичные спектры глиадина. Напри мер, аллели сорта Бабило из Горного Бадахшана идентичны аллелям одного из биотипов сорта Jeja из Испании. Аллели образца k-12393 из Афганского Бадахшана не встречаются у среднеазиатских сортов, но являются наиболее характерными для польских Сандомирок и Высоколитовок.
На основании распространения аллелей ГКЛ мы считаем, что существовало, как минимум, две волны продвижения пшеницы в Европу. Первая волна, вероятно, включала генотипы, давшие начало пшенице Испании, Польши и местным озимым сортам северных районов Ев ропы. Сорта этих регионов объединяют уникальные аллели ГКЛ, которые не обнаруживают ся во всех остальных регионах Европы и Закавказья, а также рецессивные аллели генов гиб ридного некроза ne1ne2 (Пухальский, 2002). Периферийное положение этих сортов и отсут ствие непрерывного ареала указывает на значительную древность их распространения. Вто рая волна, вероятно, шла из Закавказья через южную Украину в Восточную Европу и далее на Запад и Север Европы. Продвижение пшениц в Европу из Закавказья подтверждается также результатами по изучению распространения гена гибридного некроза Ne2 (Пухаль ский, 2002). Установлено, что этот ген широко распространен в озимых сортах Европы и почти полностью отсутствует в Азии, за исключением озимых пшениц Закавказья, в которых он встречается с частотой 36%. Пшеницы второй волны, вероятно, вытеснили пшеницы пер вой волны на окраины ареала, заняв большую часть Европы. Часть потока 2-й волны, про двинувшись на север, в некоторой степени (до 10%) внесла вклад в генофонд озимых сортов Нечерноземья, сформированного, в основном, генетическим материалом, характерным для 1 й волны (рис.12, кластер «д»).
Генетическая близость сортов Крыма (d2 = 0,74) и Украины (d2 = 0,76) с озимыми сортами Поволжья и Западной Сибири позволяет констатировать значительное влияние сортов юга Украины на формирование генофонда озимых этих двух регионов. Что же касается яровых сортов Поволжья, то они кластеризуются с сортами Азербайджана. Исторически Нижняя Волга и, особенно, Азербайджан тесно связаны с Персией, откуда, вероятно, и шел основной поток генов, определивший генофонд местных яровых сортов Поволжья. Распространившись в северные районы, этот поток оказал влияние на генофонд яровых Нечерноземья и яровых Западной Сибири. Надо отметить, что у сибирских сортов обнаруживаются также аллели, характерные для азиатских пшениц, которые представляют собой четко отличающуюся от европейских сортов по составу глиадина группу. На примере озимых и яровых групп сортов из Поволжья, Нечерноземья и Западной Сибири, можно заключить, что пшеницы с разным типом развития, занимающие один ареал, могут иметь разное происхождение.
У образцов вида T. sphaerococcum, кластеризующихся с азиатскими сортами, не обнару жено аллелей, которые отличали бы их от мягкой пшеницы. Поэтому по составу глиадинов T. sphaerococcum не выходит за рамки видового разнообразия мягкой пшеницы и составляет относительно узкую группу внутри полиморфного вида T. aestivum. Полученные нами ре зультаты позволяют согласиться с классификациями С.А.Невского (1934), J. MacKey (1989) и van Slageren (1994), где Triticum sphaerococcum Perciv. придается статус подвида.
Как следует из распространения аллелей ГКЛ между различными регионами, происходил обмен генами, в результате которого формировались местные, отличающиеся высоким раз нообразием, сорта мягкой пшеницы. Таким образом, генетическое разнообразие генофонда мягкой пшеницы нашей страны, обогащенное многочисленными генными потоками, доста точно велико. Оно включает в себя большое число генотипов, распространенных на протя женной евроазиатской территории. Не удивительно, что еще в начале ХХ в. европейские ис следователи обращали внимание (Baur, 1914) на генетические ресурсы мягкой пшеницы Рос сии как мощный источник разнообразия, имеющий огромное значение для будущего селек ции всего мира.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что весь электрофоретический спектр, получаемый при одномерном и двумер ном электрофорезе, состоит из 6-ти групп полипептидов - блоков компонентов, которые на следуются кодоминантно и моногибридно как единый менделевский признак. Установлено, что все выявленные блоки компонентов контролируются 6-ю локусами, расположенными на хромосомах 1-й и 6-й гомеологических групп.
2. На основе гибридологического анализа потомков F2 из разных гибридных комбинаций, а также изучения полиморфизма 966 сортов по спектру глиадина, с использованием одномер ного и двумерного электрофореза, установлено, что блоки компонентов контролируются разными аллельными вариантами глиадинкодирующих локусов (ГКЛ). Выявлен множест венный аллелизм ГКЛ. Составлен каталог из 170 аллелей, который позволяет, не прибегая к гибридологическому анализу, установить генотип любого сорта. К каталогу составлен спи сок из 267 сортов, электрофоретические спектры которых служат эталонами для определения аллелей ГКЛ.
3. Выдвинута гипотеза о сложной структуре глиадинкодирующего локуса: гены, контроли рующие синтез полипептидов глиадина, входящих в блок, представляют собой кластер тес носцепленных генов. Показано, что частота рекомбинации, между наиболее отдаленным ге ном кластера и его основной нерекомбинирующей частью может достигать величины 1%.
4. Впервые с помощью SDS-электрофореза получена оценка молекулярной массы всех ком понентов, входящих в блоки, контролируемые разными аллелями шести ГКЛ. Это позволило обосновать гипотезу об эволюции глиадинкодирующих генов, посредством дупликаций с по следующей дивергенцией последовательностей в результате мутационного и рекомбинацион ного процесса, что привело к изменению числа экспрессирующихся генов, образующих кла стер.
5. Впервые экспериментально с помощью искусственно созданной гибридной популяции по казана возможность маркирования аллелями ГКЛ признаков со сложным полигенным кон тролем, таких как адаптивная и селекционная ценность генотипов и др., а, следовательно, возможность маркирования аллелями ГКЛ генотипов сортов мягкой пшеницы.
6. Выявлена общая закономерность, характерная для процесса научной селекции: искусст венный отбор способствует уменьшению генетической изменчивости вида Т. aestivum, т.е.
его генетической эрозии. Впервые установлены основные факторы, вызывающие генетиче скую эрозию – это потеря уникального генофонда местных сортов и замена его на генетиче ский материал ограниченного числа сортов-доноров, использующихся повсеместно.
7. Установлено, что у культурной пшеницы главным фактором микроэволюции и поддержа ния биоразнообразия является взаимодействие естественного и искусственного отбора, что аргументируется: разной адаптивной и селекционной ценностью генотипов, маркируемых различными аллелями ГКЛ, как при естественном, так и при искусственном отборе;
кли нальным характером изменчивости ГКЛ у современных сортов, который поддерживается абиотическими факторами среды, в частности, условиями увлажнения и перезимовки расте ний, то есть естественным отбором;
поддержанием естественным отбором наиболее приспо собленных к зоне возделывания рекомбинантных генотипов, возникших при гибридизации сортов из разных климатических зон при интенсивном искусственном отборе.
8. Установлено, что блоки, контролируемые одним ГКЛ, образуют семейства, члены которых могли происходить от общего предка через единичные мутационные события. Блоки из раз ных семейств не могли возникнуть друг от друга даже через внутрилокусную рекомбинацию.
Наличие разных семейств блоков как у Т. aestivum (геном AABBDD), так и у ее возможных предшественников, тетраплоидных видов Т. durum и Т. carthlicum с ААВВ - геномом, а также сходство некоторых семейств блоков у гексаплоидной и тетраплоидных пшениц свидетель ствует о полифилетичности происхождения вида Т. aestivum, появившегося в результате не скольких актов межвидовой гибридизации тетраплоидного прародителя с диплоидным доно ром D - генома.
9. Сравнительным анализом генетической изменчивости ГКЛ у Т. aestivum с видами Т. durum и Т. carthlicum, наиболее вероятными 4-х предшественниками мягкой пшеницы, установле но, что тетраплоидный прародитель мягкой пшеницы с геномом ААВВ не был идентичен современному виду T. durum.,так как он филогенетически связан с мягкой пшеницей только единством А-генома. Для Т. carthlicum показано филогенетическое единство с Т. aestivum как по А-, так и по В-геному, что позволяет рассматривать Т. carthlicum или близкую ему форму в качестве донора ААВВ - генома мягкой пшеницы или свидетельствует об одном источнике происхождения этих 2-х видов. Установлено, что вид Triticum sphaerococcum представляет собой обособленную группу с узким размахом изменчивости внутри высокополиморфного вида T. aestivum и может рассматриваться лишь как один из подвидов мягкой пшеницы.
10. Исследование аборигенных сортов из 19 регионов мира позволило впервые показать, что сорта горных районов Закавказья и Центральной Азии (горные районы Памира и Гинду куша) характеризуются наибольшим аллельным разнообразием ГКЛ, что подтверждает дан ные Н.И.Вавилова об этих территориях, как центрах разнообразия мягкой пшеницы. Уста новлено, что аборигенные закавказские сорта статистически достоверно отличаются от або ригенных центрально-азиатских сортов по генетическому разнообразию глиадинкодирую щих локусов D-генома (критерий идентичности I= 70,95***). Эти результаты свидетельст вуют о принадлежности генотипов сортов этих двух регионов к двум генетические ветвям, которые получили D-геном из разных источников.
11. На основании распространения аллелей ГКЛ местных сортов в различных регионах мира выдвинута гипотеза о существовании как минимум двух крупных волн распростране ния мягкой пшеницы в Европу. Первая волна дала начало пшенице Испании, Польши и ме стным озимым сортам северных районов Европы. Сорта этих регионов объединяют уникаль ные аллели ГКЛ, которые не обнаруживаются во всех остальных регионах Европы и Закав казья. Вторая волна шла из Закавказья через южную Украину в Восточную Европу и далее на Запад и Север Европы. Пшеницы второй волны вытеснили пшеницы первой волны на ок раины ареала, заняв большую часть Европы.
Список публикаций 1. Новосельская, А.Ю. Изучение полиморфизма глиадина некоторых сортов пшеницы методами одномерного и двумерного электрофореза / А.Ю. Новосельская, Е.В. Мета ковский, А.А. Созинов // Цитология и генетика. 1983. Т. 17. С.45-52.
2. Metakovsky E.V. Blocks of gliadin components in winter detected by one-dimensional polyacrilamide gel electrophoresis / E.V. Metakovsky, A.Yu. Novoselskaya, M.M. Kopus, T.A. Sobko, A.A. Sozinov // Theor.Appl.Genet. 1984. V.67. N.6. P.559-568.
3. Metakovsky, E.V. Genetic analysis of gliadin components in winter wheat using two dimensional polyacryiamide gel electrophoresis / E.V. Metakovsky, A.Yu. Novoselskaya, A.A. Sozinov // Theor.Appl.Genet. 1984. V.69. N.1. Р.31-37.
4. Метаковский, Е.В. Генетический контроль компонентов глиадина у озимой мягкой пшеницы Безостая 1 / Е.В. Метаковский, А.Ю. Новосельская, А.А. Созинов // Генети ка. 1985. Т.21. №3. С. 472-478.
5. Новосельская, А.Ю. Генетический контроль компонентов глиадина у яровой мягкой пшеницы Новосибирская 67 / А.Ю. Новосельская, Е.В. Метаковский, С.Ф. Коваль, А.А. Созинов // Докл. АН СССР. 1985. Т.281. С.702-704.
6. Метаковский, Е.В. Изучение адаптивной и селекционной ценности аллелей глиадин кодирующего локуса хромосомы 1D яровой мягкой пшеницы с помощью анализа гибридной популяции и коллекционного набора сортов / Е.В. Метаковский, С.Ф. Ко валь, А.Ю. Новосельская, А.А. Созинов // Генетика. 1986. Т.22. №5. С.843-851.
7. Metakovsky, A.A. Problems of interpreting results obtained in studies of somaclonal varia tion in gliadin proteins of wheat / E.V. Metakovsky, A.Yu. Novoselskaya, A.A. Sozinov // Theor.Appl.Genet. 1987. V.73. N.5. P.764-766.
8. Novoselskaya, A.Yu. Studying of somaclonal variation in wheat with the help of biochemi cal markers / A.Yu. Novoselskaya, V.P. Upelniek, G. Galiba, J. Sutka, A.A. Sozinov, E.V.
Metakovsky // Proc.IV Intern. Workshop on Gluten Proteins (Budapest, 1987): 57-70.