Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях
На правах рукописи
НОВИКОВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА
Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих:
топогенез и функционирование
в дрожжах и бактериях
03.00.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Лузиков Валентин Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Колесников Александр Александрович доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович доктор биологических наук Патрушев Лев Иванович
Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино-на-Оке.
Предварительная дата защиты - 26 июня 2009 г. в часов на заседании Совета Д 501.001. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, МГУ имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.
Белозерского, аудитория 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан мая 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А.Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Центральную роль в биосинтезе физиологически активных веществ и окислении ксенобиотиков играют ферментные системы с цитохромом Р450 в качестве терминальной оксидазы, осуществляющей гидроксилирование молекул субстратов [Nelson et al., 1996]. Цитохромы P450, обеспечивающие синтез стероидных гормонов, регулируют жизненно-важные функции в организме млекопитающих (эмбриональное развитие, процесс половой дифференциации, ответ на стресс и т.д.);
нарушения синтеза стероидных гормонов приводят к серьезным заболеваниям и даже летальному исходу [Miller, 1988;
Payne and Hales, 2004].
Первую ключевую стадию синтеза стероидных гормонов осуществляет холестерингидроксилазная/лиазная система, включающая белок FAD-содержащий адренодоксинредуктазу (AdR), железосодержащий белок адренодоксин (Ad) и цитохром Р450scc (цитохром P450 холестерингидроксилаза/20,22-лиаза, CYP11A1). AdR и Ad обеспечивают перенос электронов от NADPH к цитохрому Р450scc, катализирующему трансформацию холестерина в прегненолон – исходное соединение для синтеза всех стероидных гормонов. Ряд деталей сложного процесса топогенеза основного компонента системы - цитохрома Р450scc, пока не выяснен (не определены механизм тканеспецифичного импорта белка в митохондрии, способ включения белка в мембрану в отсутствие «классических» трансмембранных доменов и др.). Есть основания полагать, что исследования белков холестерингидроксилазной/лиазной системы и их вариантов (полученных с использованием методов генной инженерии) в созданных в данной работе гетерологических моделях расширят общие представления о топогенезе митохондриальных белков, которые в виде предшественников адресуются в определенные компартменты митохондрии. Изучение особенностей тканеспецифичного импорта предшественника Р450scc может служить источником информации для лучшего понимания механизма импорта белков.
Актуальность работ по созданию микроорганизмов, осуществляющих коэкспрессию белков холестерингидроксилазной/лиазной системы, обусловлена интересом к сборке и функционированию сложных Р450-монооксигеназных систем. Такие трансгенные микроорганизмы могут быть использованы в качестве гетерологических моделей для изучения ряда фундаментальных проблем (регуляция экспрессии гетерологических генов, топогенез белков в гетерологических системах, регуляция стехиометрии компонентов Р450-систем, принципы функционирования «многоцентровых» ферментов и систем, осуществляющих согласованные процессы электронного транспорта, взаимодействия с субстратами и активации молекулярного кислорода и др.).
Изучение структурно-функциональных свойств цитохромов P450, обеспечивающих синтез стероидных гормонов, и механизмов регуляции биосинтеза стероидных гормонов служит необходимой предпосылкой, с одной стороны, для выяснения биохимических основ различных нарушений стероидогенеза и разработки подходов к коррекции дисфункции коры надпочечеников, а с другой стороны, для конструирования биотехнологических систем направленного синтеза физиологически активных стероидов. Изучение монооксигеназной системы цитохрома Р450scc и в теоретическом, и в прикладном плане представляется особенно важным, поскольку экспрессия белков данной системы в микроорганизмах позволит решить ключевую проблему синтеза С21-стероидных гормонов.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение особенностей топогенеза и функционирования белков холестерингидроксилазной/лиазной системы (ХГ/Л системы) в клетках дрожжей и бактерий. Основное внимание было уделено изучению топогенеза основного и наименее изученного компонента ХГ/Л системы - цитохрома Р450scc.
В число основных экспериментальных задач входили:
- выбор гетерологической модели для изучения топогенеза цитохрома Р450scc;
- выяснение возможности импорта предшественника цитохрома Р450scc в митохондрии нестероидогенных клеток;
- изучение специфики поведения предшественника цитохрома Р450scc в митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также выяснение роли протеиназ и шаперонов в топогенезе цитохрома Р450scc;
- изучение особенностей посттранслокационных стадий топогенеза цитохрома Р450scc (зрелой формы), экспрессированного в клетках и возможности Escherichia coli, функционального сопряжения цитохрома Р450scc с редокс-системой бактерий;
- реконструкция ХГ/Л системы в клетках Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli с использованием методологии экспрессии гибридных (слитых) двух- и трехкомпонентных белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы;
изучение характеристик гибридных белков и принципов формирования и взаимодействия каталитических доменов в гибридных молекулах;
- конструирование клеток Escherichia coli, способных осуществлять коэкспрессию всех компонентов ХГ/Л системы (цитохрома Р450scc, AdR и Ad) и изучение свойств экспрессируемых белков;
- создание гетерологической модели для изучения двух монооксигеназных систем цитохромов Р450scc и катализирующих первые стадии стероидогенеза P45017, млекопитающих, на основе клеток дрожжей Yarrowia lipolytica;
- тестирование полученных трансгенных штаммов микроорганизмов, осуществляющих экспрессию белков ХГ/Л системы, на способность осуществлять биотрансформацию холестерина в прегненолон.
В процессе выполнения работы осуществлялось конструирование плазмид, способных направлять синтез рекомбинантных белков и их модифицированных вариантов в бесклеточной системе, а также в используемых штаммах дрожжей и бактерий, и проводилась работа по дизайну рекомбинантных белков.
Научная новизна и практическая значимость работы. При изучении импорта синтезированного в бесклеточной системе предшественника цитохрома Р450scc в изолированные митохондрии из разных источников получены данные, указывающие на принципиальную возможность исследований особенностей топогенеза P450scc в модельных системах на основе нестероидогенных клеток. Впервые предложен путь преодоления тканеспецифических ограничений импорта P450scc в гетерологические митохондрии путем замены N-концевой адресующей препоследовательности.
Установлено, что критическим моментом топогенеза цитохрома Р450scc в дрожжах S.
cerevisiae является не собственно импорт P450scc, а побочные процессы, имеющие место при импорте белка в митохондрии – протеолиз (под действием протеиназы Pim1p) и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов mtHsp70/Mdj1p/Mge1p. Эти данные объясняют низкое содержание каталитически активного Р450scc в дрожжевых митохондриях и позволяют наметить пути для преодоления данной проблемы. Впервые показано, что субстратная специфичность протеиназ Pim1p и m AAA может перекрываться.
При изучении топогенеза зрелой формы Р450scc обнаружено, что характеристики рекомбинантного цитохрома Р450scc, синтезированного в клетках E. coli, соответствуют характеристикам нативного белка, что указывает на возможность использования модельной системы на основе E. coli для изучения, в частности, нестандартного механизма включения Р450scc в мембрану. Впервые осуществлена реконструкция в клетках E. coli функционально активной ХГ/Л системы. Получены результаты, указывающие на возможность взаимодействия цитохрома P450scc млекопитающих с редокс-компонентами бактериальной клетки.
Результаты работы по конструированию и экспрессии в бактериях и дрожжах слитой ХГ/Л системы показали, что объединение полипептидных цепей функционально связанных ферментов в одну молекулу не обязательно приводит к увеличению интегральной активности системы и что формирование каталитических доменов в слитых белках зависит от порядка их расположения в слитой полипептидной цепи. Выявлен ряд общих проблем формирования и функционирования слитых полиферментных систем (деформация активных центров, структурные ограничения для их взаимодействия, подверженность протеолизу). Из числа двойных гибридов найден активный вариант, способный при совместной экспрессии с недостающим компонентом ХГ/Л обеспечить высокий уровень трансформации 22(R) гидроксихолестерина в прегненолон.
Разработан новый подход для введения нескольких чужеродных кДНК в геном дрожжей Y.
lipolytica, включающий (1) ко-интеграцию множества копий разных кассет экспрессии с гетерологическими кДНК с использованием интегративных векторов в области повторяющихся элементов генома дрожжей (rDNA или участки LTR zeta) и (2) конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформантов разного полового типа. Получены штаммы дрожжей Y. lipolytica, способные ко экспрессировать белки ХГ/Л системы и цитохром P45017 и осуществлять превращение холестерина в прегненолон и далее в 17-гидроксипрегненолон. Использованный методический подход может быть полезен для осуществления гетерологической экспрессии в клетках дрожжей других полиферментных систем или сложных белков, состоящих из нескольких субъединиц.
Полученные данные расширяют представления о специфике поведения белков стероидтрансформирующих систем млекопитающих в клетках микроорганизмов и могут являться основой для дальнейших исследований, связанных с развитием новых ферментативных методов биотрансформации стеринов или созданием тест-систем для скрининга лекарственных препаратов на основе микроорганизмов, продуцирующих цитохромы Р450.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на VII международной конференции «Cytochrome P450 Biochemistry and Biophysics» (Москва, 1992), IV симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997), II съезде биохимического общества Российской Академии Наук (Пущино, 1997), международной конференции «Biocatalysis 2000. Fundamentals and applications» (Москва, 2000), международной конференции «Ксенобиотики и живые системы» (Минск, Беларусь, 2000), III Всероссийском съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VI съездe Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2004), IV международном симпозиуме VAAM (Association for General and Applied Microbiology) «Intracellular protein catabolism» (Oснабрюк, Германия, 2007), EMBO Workshop (Гамбург, Германия, 2007), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), ERA-IB Joint Call:
«Industrial biotechnology for Europe: an integrated approach», Partnering Workshop (Франкфурт на-Майне, Германия, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), IX международном симпозиуме «Cytochrome P Biodiversity and Biotechnology» (Ницца, Франция, 2008), семинаре отдела молекулярных основ онтогенеза НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ и конференции, посвященной 70 летию В.Н. Лузикова (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (417 ссылок). Объем работы составляет 305 страниц машинописного текста, работа включает 62 рисунка и таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Работа была направлена на выяснение особенностей топогенеза и функционирования белков-компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы (ХГ/Л системы) коры надпочечников млекопитающих, включающей цитохром P450scc, адренодоксинредуктазу (AdR) и адренодоксин (Ad), в дрожжах (Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica) и бактериях (Escherichia coli). Цитохром P450scc, AdR и Ad синтезируются в виде предшественников в цитозоле и импортируются в митохондрии, где они подвергаются протеолитическому процессингу, связывают кофакторы и принимают определенную конформацию. Известно, что цитохром P450scc включен во внутреннюю митохондриальную мембрану, а AdR и Ad являются белками матрикса.
Обьективные сложности изучения белков ХГ/Л системы в митохондриях стероидогенных органов (наличие в клетках стероидогенных органов нескольких изоформ цитохромов Р450 и ограниченное количество материала для исследований) стимулировали создание искусственных моделей для их изучения in vitro, а затем и in vivo, осуществляя гетерологическую экспрессию белков в клетках микроорганизмов.
1. ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА Р450scc С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ Термин «топогенез белков» связывает понятия биогенеза (т.е. синтеза, модификации, сворачивания, олигомеризации и т.д.) белковых молекул с топографией процессов, составляющих это понятие [Blobel, 1980;
Лузиков, 2006]. Топогенез митохондриальных белков, синтезирующихся в цитоплазме, включает в себя их синтез, транспорт через мембраны, распределение между митохондриальными компартментами (сортинг) и включение в белковые комплексы. Импорт белков в митохондрии осуществляется в соответствии с универсальным механизмом, который предполагает, что любой белок, имеющий специфическую адресующую аминокислотную препоследовательность и способный к обратимому разворачиванию, должен включаться в митохондрии из любого источника. Известны, однако, случаи когда этот процесс имеет тканеспецифичный характер.
Так, долгое время считалось, что предшественник цитохрома P450scc (pP450scc) способен включаться только в митохондрии стероидогенных тканей [Ogishima et al., 1985;
Matocha et al., 1986]. Поскольку система эндогенного гидроксилирования стероидов существует в ограниченном числе тканей, нельзя было исключить, что митохондрии специализированных стероидогенных органов имеют уникальные ферментные системы и/или транспортные факторы. В связи со сказанным были необходимы исследования по гетерологическому импорту pP450scc, особенно с использованием филогенетически отдаленных источников белка и митохондрий.
Для изучения импорта pP450scc в гетерологические митохондрии использованы две модельные системы. Одна из них включает бесклеточную систему синтеза исследуемого белка или выделенный белок и изолированные митохондрии из разных источников. Другой подход состоит в экспрессии исследуемого белка в дрожжевых мутантах, дефицитных по отдельным компонентам митохондриальной системы импорта белков-предшественников, и контроле за его сортингом в различные митохондриальные компартменты и последующими превращениями.
1.1. ИМПОРТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ЦИТОХРОМА P450scc БЫКА В МИТОХОНДРИИ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ Импорт pP450scc быка в растительные митохондрии Впервые обнаружено, что pP450scc быка, имеющий природную препоследовательность, синтезированный in vitro (трансляция мРНК pP450scc, полученной с использованием плазмиды рТUТ/pP450scc и полимеразы фага Т7, в бесклеточной системе - лизате ретикулоцитов кролика), в модельной системе включается в изолированные растительные митохондрии и подвергается протеолитическому процессингу, принимая размеры зрелой формы (mP450scc) (рис. 1). Последнее предполагает наличие в указанных митохондриях условий (или факторов), обеспечивающих транслокацию белка через митохондриальные мембраны, и эндопептидазы, способной процессировать этот белок. Полученный результат означает, что, либо импорт-процессинг pP450scc не является строго тканеспецифичным процессом, как это считалось ранее [Matocha et al., 1986], либо исследуемые растительные митохондрии участвуют в метаболизме стероидов и обладают специализированным аппаратом для импорта-процессинга митохондриальных цитохромов Р450.
Рис. 1. Синтез и импорт pP450scc быка в митохондрии семядолей сои. 1 – транскрипционно-трансляционная смесь, полоса соответствует pP450scc с молекулярной массой 55 кДа;
2 - митохондрии после инкубации с транскрипционно-трансляционной смесью, нижняя полоса соответствует mP450scc с молекулярной массой 51 кДа;
3 - митохондрии после инкубации с транскрипционно-трансляционной смесью и обработки протеиназой К, обе формы P450scc нечувствительны к протеиназе К, т.е. локализованы внутри митохондрий. Анализ методом Ds-Na электрофореза в ПААГ и авторадиографии.
Модификация N-концевой последовательности предшественника цитохрома P450scc снимает тканеспецифичные ограничения на его импорт Сконструирована рекомбинантная ДНК, обеспечивающая экспрессию модифицированного предшественника P450scc (6His-pP450scc), содержащего на N-конце адресующей последовательности 13 дополнительных аминокислот, 8 из которых несут положительный заряд (рис. 2).
Рис. 2. Модифицированная препоследовательность рекомбинантного 6His-pP450scc. Стрелкой обозначено начало природной препоследовательности pP450scc.
После экспрессии в клетках E. coli рекомбинантный белок был выделен из клеточного лизата (аффинная очистка с использованием системы QIAexpress фирмы QIAGEN).
Эксперименты по импорту 6His-pP450scc в изолированные митохондрии печени крысы, в которые, как было известно, способен импортироваться природный pP450scc [Ogishima et al., 1985], показали, что добавочные аминокислотные остатки не препятствуют ни импорту, ни последующему процессингу белка (рис. 3А). В аналогичных экспериментах показана способность модифицированного pP450scc импортироваться в изолированные митохондрии сердца крысы (нестероидогенной ткани), а также в митохондрии дрожжей, претерпевая при этом нормальный протеолитический процессинг (рис. 3Б, 3В).
Таким образом, оказалось, что тезис о тканеспецифичности импорта pP450scc неприменим к его модифицированной форме 6His-pP450scc. Возможно, присоединение пептида, обогащенного положительно заряженными аминокислотными остатками, к N-концу рР450scc увеличивает «силу» адресующего сигнала и способствует более легкому проникновению препоследовательности внутрь гетерологических митохондрий.
Рис. 3. Импорт 6His-pP450scc в митохондрии печени крысы (А), сердца крысы (Б) и дрожжей Candida valida (В). Анализ проводили методом иммуноблоттинга. А: 1 - контрольная проба, не содержавшая 6His-pP450scc;
2, 3 импортированный 6His-pP450scc до (2) и после (3) обработки митохондрий протеиназой К;
4 6His-pP450scc, выделенный из Е. coli;
5 mP450scc из митохондрий коры надпочечников быка. Б и В: 1 - 6His-pP450scc, выделенный из Е. coli и mP450scc из митохондрий коры надпочечников быка;
6His 2,3 -импорт pP450scc, пробы до (2) и после (3) обработки митохондрий протеиназой К;
4 - контрольная проба, не содержавшая 6His-pP450scc.
В целом, приведенные выше данные продемонстрировали, что для изучения цитохрома P450scc можно использовать модельные системы на основе нестероидогенных клеток, и впервые указали на то, что именно структура адресующей препоследовательности может быть важным фактором, влияющим на «тканеспецифичность» импорта. Так как изложенный подход не позволял оценить возможность формирования холофермента цитохрома P450scc в гетерологических митохондриях, на следующем этапе работы синтез pP450scc был осуществлен в клетках дрожжей S. cerevisiae.
1.2. СИНТЕЗ И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА Р450scc БЫКА В ДРОЖЖАХ S. cerevisiae Экспрессия модифицированной формы цитохрома P450scc с препоследовательностью субъединицы IV дрожжевой цитохром с-оксидазы Для экспрессии в дрожжах S. cerevisiae модифицированной формы цитохрома P450scc с препоследовательностью субъединицы IV цитохром с-оксидазы дрожжей (CoxIV) на основе шаттл-вектора создана плазмида Замена pYeDP 1-8/2 pYeDP/pCoxIV-P450scc.
препоследовательности цитохрома P450scc на pCoxIV была предпринята для осуществления эффективного импорта белка в митохондрии дрожжей. Из результатов Вестерн иммуноблотинга митохондриальных фракций, полученных из клеток коры надпочечников быка и из клеток 2805), трансформированных плазмидой S. cerevisiae (штамм pYeDP/pCoxIV-P450scc и культивированных после индукции промотора в течение 18-20 час (рис. 4А), видно, что (1) pCoxIV-P450scc свободно транслоцируется в митохондрии, используя адресующую препоследовательность дрожжевого белка, и правильно процессируется с образованием mР450sсс, и что (2) содержание рекомбинантного белка в дрожжевых митохондриях примерно равно содержанию цитохрома P450scc в митохондриях коры надпочечников.
Рис. 4. Экспрессированный в дрожжах pCoxIV-P450scc импортируется в митохондрии (А), но его процессированная форма имеет очень низкое сродство к дрожжевой митохондриальной мембране (Б). Анализ методом иммуноблоттинга. А: 1 митохондрии дрожжевых клеток, трансформированных плазмидой pYeDP/pCoxIV-P450scc, 2 митохондрии коры надпочечников. Справа – молекулярные массы белков-маркеров в кДа. Б:
митохондрии и СМЧ коры надпочечников быка (1, 2 ) и митохондрии и СМЧ трансформированных дрожжей (3, 4) соответственно. На дорожки нанесено равное количество белка исследуемых фракций.
Однако, несмотря на высокое содержание P450scc в дрожжевых митохондриях, даже при использовании значительных количеств препарата (до 4,5 мг митохондриального белка на мл пробы) не удавалось зарегистрировать характерный разностный спектр гемопротеина (восстановленная форма, связавшая СО, против восстановленной формы). Эти данные указывали на то, что количество ферментативно активного цитохрома P450scc в дрожжевых митохондриях невелико.
При фракционировании митохондрий было обнаружено, что относительное содержание процессированной формы цитохрома P450scc (от общего содержания в митохондриях) во фракции внутренней мембраны дрожжевых митохондрий (ультразвуковые СМЧ) значительно меньше, чем в СМЧ, приготовленных из клеток коры надпочечников (рис. 4Б).
Изучение состояния цитохрома P450scc в митохондриях показало, что осложнения возникают на стадии сворачивания полипептидной цепи и/или ее включения в мембрану лишь небольшая часть импортированных молекул включается во внутреннюю мембрану, где белок проявляет способность трансформировать 22(R)-гидроксихолестерин в прегненолон в реконструированной системе, включающей изолированные Аd и АdR быка и NADPH регенерирующую систему (0,03+0,01 нмоль прегненолона/мин на 1 мг белка СМЧ, данные четырех экспериментов по экспрессии pCoxIV-P450scc). Это свидетельствует о способности цитохрома Р450scc связывать гем и приобретать правильную ориентацию во внутренней мембране дрожжевых митохондрий. Однако, основная часть импортированного белка находится в матриксе в виде несолюбилизируемых детергентом агрегатов. В составе агрегатов он, очевидно, лишен нативной третичной структуры и, следовательно, не имеет спектральных характеристик, присущих цитохрому P450scc.
Роль митохондриальных протеиназ и системы шаперонов в топогенезе цитохрома P450scc Для выяснения деталей гетерологического импорта в дрожжевые митохондрии предшественника цитохрома P450scc быка с собственной препоследовательностью была использована классическая схема синтеза/импорта белков in vitro. [35S]-Меченый pP450scc получали в бесклеточной системе транскрипции-трансляции с использованием плазмиды pTUT/pP450scc. В экспериментах in vitro по импорту pP450scc в изолированные дрожжевые митохондрии обнаружено, что транслокация белкового предшественника в митохондриальный матрикс протекает легко, однако его превращение в зрелую форму (отщепление N-концевой препоследовательности) осуществляется с низкой эффективностью (рис. 5). В отличие от ситуации в митохондриях коры надпочечников молекулы P450scc не встраивались во внутреннюю митохондриальную мембрану, а накапливались в матриксе (рис. 5), что согласуется с данными о локализации белка при экспрессии гибрида pCoxIV P450scc в дрожжевых клетках.
Рис. 5. Импортированный in vitro в дрожжевые митохондрии цитохром P450scc не встраивается во внутреннюю мембрану.
После импорта [35S]-pP450scc митохондрии фракционировали методом карбонатной экстракции. После обработки митохондрий 0,1 М Na2CO3 и центрифугирования проб (125000g, 30 мин) образцы фракций анализировали Ds-Na электрофорезом в ПААГ с последующей авторадиографией (верхняя панель) или иммуноблоттингом (нижняя панель).
Маркерные белки: цитохром b2 (белок межмембранного пространства), переносчик адениновых нуклеотидов (ААС, белок внутренней мембраны) и Mge1p (белок матрикса). М – митохондрии, С и О – супернатант и осадок, полученные после карбонатной экстракции митохондрий.
Так как основная часть молекул цитохрома не встраивается в P450scc митохондриальную мембрану дрожжей, можно было предположить, что импортированный цитохром P450scc не способен приобретать в гетерологических митохондриях нативную конформацию и, как развернутый белок, деградирует в митохондриальном матриксе. Такого рода деградация под действием сериновой АТФ-зависимой протеиназы Pimlp была показана для модельных рекомбинантных белков, характеризующихся затрудненным сворачиванием [Wagner et al., 1994]. Стабильность импортированного цитохрома P450scc в дрожжевых митохондриях изучали в ходе эксперимента, описанного в подписи к рис. 6. Обнаружено, что в митохондриях подвергается АТФ-зависимому протеолизу. Инкубация P450scc митохондрий в присутствии АТФ-регенерирующей системы приводила к уменьшению количества цитохрома P450scc (рис. 6А), хотя интактность митохондрий при этом не нарушалась, что оценивалось по содержанию белка межмембранного пространства цитохром с-пероксидазы (рис. 6Б). При отсутствии АТФ в среде инкубации деградация цитохрома P450scc полностью прекращалась (рис. 6А).
Рис. 6. Импортированный in vitro в дрожжевые митохондрии деградирует АТФ P450scc зависимым образом (А), при этом интактность митохондрий не нарушается (Б). После импорта и разобщения мембранного потенциала валиномицином (2 мкМ) митохондрии инкубировали при 37°С в присутствии АТФ (+АТФ) или при отсутствии АТФ в матриксе (-АТФ). Для удаления неимпортированого белка аликвоты митохондрий обрабатывали трипсином и осаждали центрифугированием, белки анализировали Ds-Na-электрофорезом в ПААГ с последующими авторадиографией (А) или иммуноблоттингом (Б). CCPO - белок межмембранного пространства цитохром с-пероксидаза.
Для того чтобы выяснить, какая из ATФ-зависимых митохондриальных протеиназ, локализованных во внутреннем компартменте митохондрий (растворимая сериновая протеиназа Pim1p или мембранная металлопротеиназа m-AAA (протеолитический комплекс Yta10р/Yta12p), ответственна за деградацию апо-цитохрома P450scc, был проведен ряд экспериментов, в которых оценивалась стабильность P450scc в митохондриях из различных мутантов дрожжей, дефицитных по протеолитическим активностям или Pim1p Yta10p/Yta12p.
Деградация цитохрома P450scc была полностью блокирована как в митохондриях из штамма с разрушенным геном PIM1 (pim1), так и в митохондриях, содержащих только протеолитически неактивный вариант PimlSl015Ap (рис. 7А).
Рис. 7. Цитохром P450scc деградирует в дрожжевых митохондриях под действием протеиназы Pim1p.
А: Протеолиз цитохрома P450scc полностью блокирован в митохондриях, содержащих неактивную Pim1p (pim1/PimlSl015Ap), но протекает в митохондриях с немутированной Pim1p (pim1/Pim1p). Б: Протеолиз цитохрома P450scc имеет место в митохондриях с протеолитически неактивным Yta10p/Yta12p комплексом (yta10, yta12/Yta10E559Qp, Yta12E614Qp).
А и Б: Митохондрии с импортированным P450scc инкубировали при 37°С, пробы анализировали, как описано в подписи к рис. 6. В: Цитохром P450scc образует агрегаты в отсутствие протеиназы Pim1p, но не в отсутствие Yta10p/Yta12p комплекса. После импорта и разобщения мембранного потенциала валиномицином митохондрии инкубировали при 37°С 15 мин в присутствии АТФ, обрабатывали трипсином для удаления неимпортированого белка и лизировали в буфере, содержащем 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ MOPS/KOH, pH 7,2, 150 мМ NaCl, мМ EDTA, 0,5 мМ PMSF, агрегаты осаждали (25000g, 15 мин), белки осадка и супернатанта анализировали Ds-Na-электрофорезом в ПААГ с последующей авторадиографией. А-В: Содержание белков оценивалось лазерным денситометрированием. За 100% принято содержание импортированного P450scc (pP450scc+mP450scc) в митохондриях перед их инкубацией при 37°С.
В контрольных экспериментах стабильность Р450 оценивалась в митохондриях из штамма рim1, в котором экспрессировалась Pimlp дикого типа (рim1/Pim1p) (рис. 7А), а также в митохондриях из штаммов yta10 и yta12, экспрессирующих только мутированные Yta10E559Qp и Yta12E614Qp (рис. 7Б). В этих штаммах, имеющих pet фенотип, существенно нарушено функционирование митохондрий. Тем не менее, в митохондриях из указанных штаммов (рim1/Pim1p, yta10 и yta12) деградация цитохрома P450scc имела место, хотя и была менее эффективной, чем в митохондриях из штамма дикого типа, вероятно, вследствие низкого содержания АТФ в митохондриальном матриксе.
Ранее было показано, что в отсутствие Pim1p развернутые белки образуют агрегаты в митохондриальном матриксе [Rep et al., 1994]. Обнаружено, что новоимпортированный pP450scc агрегировал в митохондриях из рim1 штамма, но не агрегировал в митохондриях из yta10 и yta12 штаммов, характеризующихся отсутствием функционального Yta10p/Yta12p комплекса (рис. 7В).
Полученные данные позволяют заключить, что протеолиз импортированного P450scc опосредуется растворимой протеиназой Pim1p, и что P450scc находится в дрожжевых митохондриях в развернутом состоянии.
Известно, что деградация развернутых белков в митохондриальном матриксе возможна только при наличии функционирующих шаперонов Ssc1p (mt-hsp70) и Mdj1p (обеспечивает связывание белков с Ssc1p) [Wagner et al., 1994]. Для выяснения роли митохондриальной системы шаперонов в деградации цитохрома P450scc были использованы митохондрии из температурочувствительных мутантов ssc1-3, mdj1-7 и mge1-3 (Mge1p – фактор нуклеотидного обмена для Ssc1p). При инкубации таких митохондрий, содержащих импортированный цитохром P450scc, при непермиссивной температуре его протеолиз не наблюдался ни в одном из трех случаев (рис. 8А). В то же время белок агрегировал в митохондриях из мутантов ssc1-3, и mdj1-7, но не агрегировал в митохондриях из мутанта mge1-3 (рис. 8Б).
Представленные данные могут быть суммированы следующим образом. После импорта цитохром P450scc, по-видимому, остается связанным с mt-hsp70, как это следует из общего механизма импорта, причем это взаимодействие носит обратимый характер и опосредуется белками Mdjlp и Mgelp. Молекулы цитохрома P450scc, которые, по неизвестным пока причинам, не встраиваются в мембрану и не сворачиваются в нативную третичную структуру, находящиеся в комплексе P450scc-mt-hsp70, специфически узнаются протеиназой Pimlp и подвергаются протеолизу. Если нарушено связывание P450scc с mt-hsp 70, в комплексе с которым белок-субстрат поддерживался бы в растворимом виде (например, в мутантах ssc1-3 и mdj1-7), то белок агрегирует, и последний процесс протекает быстрее, чем деградация.
Рис. 8. Протеолиз цитохрома P450scc требует функционирования митохондриальной системы шаперонов. А: Деградация цитохрома P450scc нарушена при непермиссивной температуре (37°С) в митохондриях из температурочувствительных мутантов ssc1-3, mdj1-7, mge1-3. Б: Агрегация цитохрома P450scc имеет место в митохондриях из ssc1-3 и mdj1-7 мутантов, но не наблюдается в митохондриях из mge1-3 мутанта. Пробы анализировали, как описано в подписях к рис. 6 и 7.
Модифицированный вариант цитохрома P450scc с N-концевым трансмембранным доменом деградирует под действием Yta10p/Yta12p протеиназы при участии митохондриальной системы шаперонов Слабое сродство цитохрома P450scc к внутренней митохондриальной мембране дрожжей было искусственно преодолено введением в его полипептидную цепь гидрофобного участка, играющего роль трансмембранного домена в F1F0-ATФ-азе Neurospora crassa. С этой целью была сконструирована плазмида, позволяющая синтезировать in vitro гибридный белок Su9(112)-P450, в котором последовательность из аминокислотных остатков была заменена на адресующую N-концевых mP450scc препоследовательность и первый трансмембранный домен 9 субъединицы F1F0-ATФ-азы, которые способны обеспечивать включение белков во внутреннюю мембрану по механизму «реэкспорта» [Rojo et al., 1999].
Гибридный белок Su9(112)-P450 эффективно связывался с внутренней мембраной дрожжевых митохондрий, тем не менее, домен цитохрома P450scc не приобретал нативной конформации (показано в экспериментах по ограниченному трипсинолизу озвученных митохондрий, содержащих Su9(112)-P450 согласно Ou et al., 1986 и Усанову и др., 1990) и подвергался протеолизу.
В экспериментах с использованием митохондрий из дрожжевых мутантов показано, что деградация Su9(112)-P450 (в отличие от немодифицированного цитохрома P450scc) полностью блокирована в митохондриях с протеолитически неактивным Yta10p/Yta12p комплексом (рис. 9А), но осуществляется в митохондриях, содержащих как протеолитически активную, так и неактивную протеиназу Pim1p (рис. 9Б).
Рис. 9. Деградация импортированного осуществляется под действием Su9(112)-P протеолитического комплекса Yta10p/Yta12p (А, Б) и контролируется митохондриальной системой шаперонов (В). А: Протеолиз Su9(112)-P450 блокирован в митохондриях, содержащих протеолитически неактивный Yta10p/Yta12p комплекс. Б: Протеиназа Pimlp не оказывает влияния на этот процесс. В: Протеолиз Su9(112)-P450 блокирован при непермиссивной температуре в митохондриях из мутантов ssc1-3, mdj1-7 и mge1-3. Анализ проб проводили, как описано в подписях к рис. 6 и 7.
Скорость протеолиза Su9(112)-P450 в штамме с pet фенотипом была снижена, однако, это скорее связано с дефицитом внутримитохондриального АТФ, чем с частичным вовлечением Pim1p в деградацию белка, так как введение Pimlp в митохондрии из pim штамма не стимулировало протеолиз мембранного Su9(112)-P450 (рис. 9Б). Таким образом, можно сделать вывод, что главная роль в этом процессе принадлежит мембранному протеолитическому комплексу Yta10p/Yta12р. Как и в случае цитохрома P450scc, протеолиз мембранного белка Su9(112)-P450 контролируется митохондриальной системой шаперонов (рис. 9В).
В данной работе впервые показано перекрывание субстратной специфичности протеиназ Pimlp и Yta10p/Yta12p. Деградация молекул цитохрома P450scc АТФ-зависимыми протеиназами (участие Pimlp или Yta10p/Yta12p определяется локализацией полипептидной цепи P450scc в митохондриях), по-видимому, инициируется не наличием специфических сайтов у мишеней, а их ненативной конформацией. Представленные данные предполагают существование универсального механизма удаления из митохондриального матрикса развернутых полипептидных цепей, склонных к агрегации и, вследствие этого, представляющих помеху для функционирования митохондрий и жизнедеятельности клетки в целом.
Изучение топогенеза цитохрома P450scc в митохондриях дрожжей S. cerevisiae в какой то мере подтвердило тезис о его «тканеспецифичности», которая проявляется в дрожжах на стадии процессинга и внутримитохондриальной компартментализации.
1.3. ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА Р450scc С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛЬНОЙ ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ Экспрессия mP450scc в клетках E. coli: внутриклеточная локализация и каталитические свойства При экспрессии кДНК зрелой формы цитохрома P450scc (лишенной N-концевой митохондриальной адресующей последовательности, mP450scc) в клетках E. coli было неожиданно обнаружено, что функционально активный цитохром присутствует не только в мембранной, но и в растворимой (супернатант после высокоскоростного центрифугирования гомогената) фракции клетки, причем в обеих фракциях рекомбинантный белок находится примерно в равных количествах и преимущественно в нативном состоянии (проявляет характерный СО-разностный спектр с максимумом при нм). Обработка вывернутых мембранных частиц (ВМЧ) 0,1М Na2CO3 с последующим осаждением показала, что, как и в митохондриях коры надпочечников, основная часть молекул mP450scc включена в бактериальную мембрану. Наличие характерных фрагментов (26 и 29 кДа), образующихся при обработке трипсином ВМЧ, содержащих P450scc [Ou et al., 1986;
Усанов и др., 1990], свидетельствует о том, что белок встраивается в мембрану бактерий в той же ориентации, что и во внутреннюю мембрану митохондрий коры надпочечников (рис. 10).
Рис. 10. Ориентация рекомбинантного цитохрома в P450scc плазматической мембране E. coli. Ds-Na-электрофорез в ПААГ с последующим имунноблоттингом обработанных трипсином препаратов сферопластов (дорожка 1) и вывернутых мебранных частиц (дорожка полученных из клеток 2), E.coli, трансформированных плазмидой Справа pTrc99A/mP450scc. – молекулярные массы белков-маркеров в кДа.
Для того, чтобы выяснить, возможно ли cуществование каталитически активной растворимой формы цитохрома P450scc, был проведен анализ растворимой фракции клеток и сравнительный анализ свойств mP450scc, присутствующего в субклеточных фракциях бактерий и выделенного из коры надпочечников быка.
Рис. 11. ЖХВД и ХГ/Л активность компонентов фракции супернатанта, полученной после центрифугирования гомогената E.coli (120000g, 1 час). Приведены профили элюции в различных буферных системах: А: буфер А (50 мМ Na-фосфат, рН 7,2, 0, мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ);
Б: буфер А+Э (буфер А, содержащий 0,3% Эмульгена 913);
В: буфер А+Э+Na (буфер A+Э, содержащий 0,5 М NaCl).
Кривые 1 – поглощение элюатов при 418 нм (А418);
кривые (активность) степень трансформации холестерина в – прегненолон (% от активности изолированного P450scc) после добавления к элюатам Аd, АdR и NADPH.
С использованием метода ЖХВД установлено, что присутствующий в «растворимой фракции» цитохром P450scc не является истинно растворимым, а находится исключительно в составе 400 кДа липопротеидных частиц.
Только данная фракция частиц обладала способностью превращать холестерин в прегненолон, что исключает возможность существования цитохрома Р450scc в высокоскоростном супернатанте E. сoli в мономерной форме (рис. 11).
Отсутствие нативных олигомеров P450scc в составе супернатанта подтверждено тем, что P450scc, присутствующий в этой фракции, не связывался с Аd-сефарозой (как это происходит при выделении P450scc из нативных митохондрий). Лишь после делипидизации частиц супернатанта 0,5% холатом Na и разделения белков (фракционирование сульфатом аммония) цитохром Р450scc был выделен с помощью аффинной хроматографии (выход P450scc составил ~20%). О содержании в "растворимой фракции" фрагментов мембраны, включающих Р450scc, свидетельствуют также результаты распределения между супернатантом и нерастворимой фракцией гомогената (120000 g, 2,5 час) активности маркерного белка цитоплазматической мембраны сукцинатдегидрогеназы и содержания рекомбинантного белка (85%, 15% и 87%, 13% соответственно). Сравнение констант диссоциации комплексов цитохрома P450scc с холестерином и Аd и доступности центров связывания холестерина и Аd для разных препаратов показало, что функциональное состояние цитохрома P450scc, обнаруженного в составе высокоскоростного супернатанта, более сходно с состоянием белка в мембранной фракции, чем с состоянием белка, выделенного из коры надпочечников быка (Таблица 1).
Таблица 1. Функциональные характеристики цитохрома P450scc в составе различных препаратов Препараты: 1 – Р450scc, выделенный из митохондрий коры надпочечников (плюс 0,3% Эмульген);
и 3 – осадок и супернатант после центрифугирования гомогената E. coli при 120000 g в течение 1 час (плюс 0,3% Эмульген) соответственно;
4 – то же, что и препарат 3, без детергента.
Препараты Параметр 1 2 3 Удельное содержание, нмоль/мг белка 18,02,0 0,040,02 0,020,015 0,020, Кдис для холестерина, мкМ 60,215,2 50,110,1 40,34,5 35,45, (доступность субстрат-связывающего (60,410,3) (55,05,4) (55,16,5) (75,44,8) центра,%) Кдис для Ad, мкМ 0,120,02 0,450,15 0,500.05 0,800, (доступность Ad-связывающего центра, (90,14,5) (95,34,0) (80,26,1) (85,16,3) %) Уровень ферментативного восстановления,% + NADPH * * 5,22,0 80,44, + NADPH + Ad + AdR 90,33,4 80,26,1 85,04,4 85,15, Активность при измерении трансформации 22(R) гидроксихолестерина, мин- + NADPH * * 0,50,2 2,60, + NADPH + Ad + AdR 26,13,2 30,14,2 32,21,5 27,02, Активность при измерении трансформации холестерина, мин- + NADPH * * 0,090,03 0,350, + NADPH + Ad + AdR 3,80,5 2,90,6 3,00,3 3,30, Приведенные данные – среднее значение стандартное отклонение из трех независимых экспериментов;
* Нет эффекта Присутствие функционально-активного цитохрома в клетках P450scc E.coli исключительно в составе цитоплазматической мембраны согласуется с представленными выше данными о том, что при импорте P450scc в матрикс митохондрий дрожжей белок не способен принимать нативную конформацию, и позволяет сделать вывод о том, что стадия встраивания вновь синтезированных полипептидных цепей в мембрану необходима для формирования каталитически активной холо-формы цитохрома Р450scc.
Соответствие характеристик mР450scc, синтезирующегося в клетках E.coli (включение в мембрану, каталитические и спектральные свойства), характеристикам нативного белка указывает на то, что рекомбинантные клетки E. coli можно использовать в качестве модели для изучения деталей топогенеза цитохрома Р450scc.
Сравнительное изучение топогенеза цитохрома P450scc и его гибридов с адренодоксином Данные о роли N- и С-концевых последовательностей в сворачивании цитохромов P получены в основном при изучении белков с делетированными или несущими мутации концевыми участками. В данной работе в клетках E. coli осуществлена экспрессия рекомбинантных кДНК, кодирующих гибридные белки Ad-mP и mP-Ad, включающие аминокислотную последовательность mР450scc (mР), с N- или С-концом которой слита последовательность зрелой формы небольшого (12 кДа) белка Ad. Предполагалось, что наличие гидрофильного домена Ad, сохраняющего свойства нативного белка (см. далее) и, следовательно, расположенного на поверхности плазматической мембраны, может создавать конформационное напряжение в структуре mР450scc, «фиксируя» концы молекулы у поверхности мембраны, и влиять на свойства P450scc. Проведен сравнительный анализ мембранной топологии, субклеточной локализации и функциональных свойств рекомбинантных белков mP, Ad-mP и mP-Ad.
Обнаружено, что наличие дополнительной аминокислотной последовательности Ad (184 аминокислотных остатка) на концах P450scc-домена не препятствует включению белков в плазматическую мембрану (по данным карбонатного теста) и связыванию гема (Таблица 2).
Можно отметить, что при экспрессии в клетках E. сoli других модельных белков с модифицированным N-концом получены аналогичные результаты: несмотря на на удаление более 50 аминокислот (1-53mP450scc) и экранирование N-конца mP450scc протяженной аминокислотной последовательностью, включающей 52 аминокислоты (His6pP450scc), модельные белки, как и немодифицированный mP450scc, обнаруживались в клеточной мембране.
Слияние N-конца Р450scc с Ad несущественно влияет на процесс сворачивания домена P450scc (Р450/Р420 = 1);
при модификации С-конца значительно увеличивается фракция белка с неправильно свернутым Р450scc (Р450/Р420 = 0,2). Удельная активность (в расчете на содержание Р450-формы) mP-Аd примерно равна активности немодифицированного mP, модификация N-конца P450scc в белке Аd-mP приводит к снижению активности фермента на 30%. Таким образом, С-концевая область последовательности Р450scc более, чем N концевая, важна для обеспечения правильного сворачивания и стабильности белка, а N концевая область молекулы Р450scc, по-видимому, играет роль в поддержании структуры каталитически-активного фермента.
Таблица 2. Спектральные и каталитические свойства цитохрома P450scc (mP) и гибридных белков Ad-mP и mP-Ad в составе препаратов вывернутых мембранных частиц (ВМЧ) Варианты P450scc Параметр mP Ad-mP mP-Ad Количество P450 (нмоль/мг белка ВМЧ) 0,14 ± 0,03 0,08 ± 0,03 0,02 ± 0, Количество Р420 (нмоль/мг белка ВМЧ) 0,04 ± 0,012 0,09 ± 0,02 0,09 ± 0, P450/P420 3,5 ± 0,6 0,9 ± 0,4 0,2 ± 0, Суммарное количество гемопротеина 0,18 ± 0,031 0,17 ± 0,05 0,11 ± 0, P450 + P420 (нмоль/мг белка ВМЧ) Количество белка по результатам иммуноблоттинга 0,24 ± 0,08 0,21 ± 0,08 0,16 ± 0, (нмоль/мг белка ВМЧ) Эффективность включения гема (%) 75% ± 10% 80% ± 12% 70% ± 13% Удельная активность (моль прогестерона/моль 3,4 ± 1,4 0,98 ± 0,34 4,8 ± 1, P450-формы мин-1) * Приведенные данные – среднее значение ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. Наличие продукта реакции определяли методом ИФА.
Взаимодействие цитохрома P450scc с бактериальными редокс-белками В высокоскоростном супернатанте, полученном при фракционировании рекомбинантных клеток E.coli, цитохром Р450scc при добавлении NADPH подвергается одноэлектронному восстановлению с участием собственных электрон-транспортных белков бактерии (ферредоксина и ферредоксинредуктазы) (рис. 12А) и катализирует превращение холестерина и 22(R)-гидроксихолестерина в прегненолон (Таблица 1, рис.12Б).
По сравнению с химическим восстановлением дитионитом натрия, уровень эндогенного ферментативного восстановления P450scc в данном препарате достигает 80%, но резко снижается при добавлении детергента (Рис. 12А). Ингибирующее действие детергента указывает на то, что в супернатанте содержатся комплексы, включающие цитохром P450scc и бактериальные редокс-белки. Активность белка во фракции супернатанта составила около 10% от активности реконструированной системы, содержащей оптимальные с точки зрения стехиометрии количества P450scc/Ad/AdR. Вероятно, это связано с низкой степенью структурно-функциональной гомологии между митохондриальными и бактериальными редокс-белками или невысоким содержанием последних. Приведенные результаты являются первым свидетельством возможности функционального сопряжения цитохрома P450scc млекопитающих с электрон-транспортной системой бактерий и, соответственно, возможности включения Р450scc в метаболические пути бактерии.
Рис. 12. Цитохром P450scc способен функционировать, используя в качестве редокс партнеров белки бактерии E.coli.
А. СО-разностный спектр фракции супернатанта, полученной после центрифугирования гомогената E.coli (120000g, 1 час), в буфере без детергента (1) и в присутствии 0,3% Эмульгена 913 (2). Спектры регистрировали через 15 мин после добавления NADPH в отсутствие Ad и AdR. Б. Ферментативная активность фракции супернатанта. Пробы инкубировали с холестерином в присутствии NADPH, Ad и AdR (1), в присутствии только NADPH (2), в присутствии NADPH и Эмульгена 913 (3) в течение 10 мин (1) или 30 мин (2, 3). Кривая 3 демонстрирует эффект ингибирования Эмульгеном NADPH-зависимой реакции.
2. PЕКОНСТРУКЦИЯ СТЕРОИДГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМА Р450scc МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ Совместная экспрессия компонентов ХГ/Л системы млекопитающих в клетках микроорганизмов осуществлялась с использованием трех подходов, используемых для коэкспрессии белков.
2.1. СОВМЕСТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ХГ/Л СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ E. coli Один из подходов, используемых для коэкспрессии белков, заключается в использовании плазмиды, в которой кДНК, кодирующие различные белки, находятся в составе одной транскрипционной единицы, а между парами кДНК введены линкеры, содержащие сайт связывания рибосомы. В этом случае при транскрипции образуется одна протяженная mRNA, но осуществляется трансляция индивидуальных белков.
На основе плазмиды pTrc99A/P450scc [Wada et al., 1991] были сконструированы две генетические конструкции для коэкспрессии трех зрелых белков ХГ/Л системы:
pTrc99A/P450scc/AdR/Ad, в которой кДНК цитохрома P450scc, AdR и Ad находятся в составе одной транскрипционной единицы (рис. 13А), и pTrc/P450-AdR.Ad, включающая кДНК двух белков (P450scc и AdR) в составе одной кассеты экспрессии, а кДНК Ad – в составе отдельной транскрипционной единицы.
Рис. 13. Совместная экспрессия всех компонентов ХГ/Л системы в клетках E. coli. А: Схема плазмиды pTrc99A/P450scc/AdR/Ad, содержащей кДНК цитохрома P450scc, AdR и Ad в составе одной кассеты экспрессии. Б: Экспрессия цитохрома P450scc (а), AdR (б) и Ad (в) в клетках E. coli, трансформированных плазмидой pTrc99A/P450scc/AdR/Ad (4–6);
1–3 – контрольные клетки E. coli.
Клеточные фракции: низкоскоростной осадок (1, 4), цитозоль (2, 5), мембранная фракция (3, 6). 7 – Белки, выделенные из клеток коры надпочечников быка. Слева - молекулярные массы белков маркеров в кДа. Анализ методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза с последующим иммуноблоттингом.
В клетках E. coli эти плазмиды направляют синтез всех трех белков, внутриклеточная локализация которых соответствует локализации соответствующих белков в митохондриях клеток коры надпочечников (рис. 13Б).
Для оптимального функционирования ХГ/Л системы in vivo Ad должен находиться в избытке по отношению к другим белкам [Усанов и др., 1987;
Hanukoglu et al., 1986].
Ожидалось, что использование плазмиды pTrc/P450-AdR.Ad обеспечит более эффективную трансляцию с собственной короткой молекулы мРНК, чем плазмида Ad pTrc99A/P450scc/AdR/Ad. Однако определение соотношения экспрессируемых белков показало, что использование данной конструкции не приводит к увеличению содержания Ad по отношению к содержанию других компонентов ХГ/Л системы.
В гомогенатах рекомбинантных клеток регистрируется характерный СО-разностный спектр с максимумом при 450 нм, что свидетельствует о наличии функционально-активного цитохрома Р450scc. Гомогенаты клеток, культивируемых в условиях индукции экспрессии гетерологических кДНК в течение 48 час, демонстрируют ХГ/Л активность в отношении 22(R)-гидроксихолестерина в системе in vitro (1,6+0,7 и 3,1+0,4 пмоль прегненолона/мин на мг белка гомогената при использовании pTrc99А/P450scc/AdR/Ad и pTrc/P450-AdR.Ad соответственно, результаты не менее трех измерений). Активность существенно не увеличивается при добавлении в среду реакции одного из изолированных белков ХГ/Л системы, что указывает на наличие в клетках каталитически активных форм всех трех белков. Однако приведенные величины существенно меньше активности гомогената клеток, экспрессирующих один цитохром P450scс, измеренной в присутствии изолированных AdR и Аd (14,1+0,8 пмоль прегненолона/мин на 1 мг белка гомогената). Низкая активность ХГ/Л системы в клетках E. coli, возможно, связана с недостатком кофакторов, необходимых для образования активных белков данной системы, или с тем, что значительная часть молекул цитохрома P450scc, AdR и Ad (30-50% от суммарного содержания) присутствует в клетках в неактивной форме в составе телец включения (рис. 13Б).
2.2. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СЛИТЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, СОСТАВЛЕННЫХ ИЗ КОМПОНЕНТОВ ХОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗНОЙ/ЛИАЗНОЙ СИСТЕМЫ Другой методический подход, использованный для коэкспрессии белков ХГ/Л системы – экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих белки-компоненты ферментативной системы, искусственно объединененные в единую полипептидную цепь. Указанный подход упрощает процедуры трансформации и молекулярного клонирования;
снимает проблемы синхронизации процессов синтеза, транспорта и внутриклеточной компартментализации индивидуальных компонентов мультиферментных систем.
Идея создания слитых Р450-систем, объединяющих в составе одной полипептидной цепи все компоненты, необходимые для катализа, возникла после того, как были обнаружены природные «слитые» монооксигеназы [Narhi and Fulco, 1986;
McMillan et al., 1992], в частности, бактериальный цитохром Р450-ВМ3, демонстрирующий очень высокую каталитическую активность (более 1500 оборотов).
С целью повышения активности природной системы цитохрома Р450scc сконструированы двух- и трехкомпонентные гибридные белки, составленные из цитохрома Р450scc, Ad и AdR коры надпочечников быка (рис. 14). При изучении гибридных белков внимание было уделено не только каталитическим свойствам, но и таким аспектам, как сворачивание отдельных доменов в составе общей полипептидной цепи, формирование активных центров доменов и взаимодействие между компонентами системы в составе слитого белка.
Рис. 14. Схематическое представление гибридных белков, экспрессируемых в клетках S. cerevisiae или E. coli. Для конструирования использовались кДНК, кодирующая цитохром P450scc быка (b), и кДНК, кодирующие белки AdR, Ad и P450scc человека (h).
Экспрессия гибридных белков в клетках S. cerevisiae На основе вектора pYeDP/pCoxIV-P450scc при использовании искусственной слитой кДНК, кодирующей pP450scc-AdR-Ad [Harikrishna et al., 1993], сконструированы кДНК, кодирующие pP450scc(h)-AdR(h)-Ad(h) (гомологический вариант pF2(h), h - human) и p CoxIVP450scc(b)-AdR(h)-Ad(h) (гетерологический вариант pF2(b-h), включающий P450scc быка (b - bovine) с адресующей N-концевой препоследовательностью субъединицы IV дрожжевой цитохром c-оксидазы (CoxIV). Кроме этого, была создана плазмида pTUT/p CoxIVP450scc(b)-AdR(h)-Ad(h) для проведения экспериментов по изучению свойств белка F2(b-h) в системе синтеза/импорта in vitro.
Использованные плазмиды обеспечивали экспрессию гибридных белков pF2(b-h) и pF2(h) в дрожжах S. cerevisiae, однако после импорта в митохондрии белки подвергались интенсивному протеолизу (рис. 15). Для pF2(b-h) и pF2(h), выявляемых в дрожжевых митохондрях, получены сходные результаты. В митохондриях кроме полноразмерных гибридных белков с молекулярной массой 121 кДа, обнаружены иммунореактивные белки меньшего размера, которые являются продуктами протеолиза (минорные продукты, реагирующие с антителами к Аd (рис. 15Б), так как они включают последовательность Аd, который является концевым компонентом в составе гибридного белка), а также, возможно, продуктами преждевременной терминации трансляции F2. Два из них соответствуют по размерам P450scc (рис. 15А) и AdR-Ad (рис. 15Б).
Рис. 15. Анализ белков митохондриальной фракции клеток, экспрессирующих рекомбинантный белок F2 (20 час индукции синтеза белка) (А, Б, дор. 1), методом иммуноблоттинга с использованием антител к цитохрому Р450scc (А) и к Ad (Б). В качестве контроля использованы митохондрии из клеток, продуцирующих pCoxIV-P450scc (А, дор. 2) или pAdR-Ad (Б, дор. 2).
Получен ряд данных, указывающих на то, что деградация F2 осуществляется внутри митохондрий: обработка митохондрий трипсином и протеиназой К перед проведением электрофореза не изменяет картину, наблюдавшуюся после иммуноблоттинга F2 (фрагменты белков находятся внутри митохондрий);
при инкубации митохондрий in vitro с течением времени содержание полноразмерного F2 заметно уменьшается;
после импорта в митохондрии F2, синтезированного в бесклеточной системе, в митохондриях обнаруживается набор низкомолекулярных продуктов, которые не регистрируются до осуществления импорта;
кроме того, некоторые фрагменты F2 (например, AdR-Аd) не могут импортироваться в митохондрии в случае их образования в цитоплазме из-за отсутствия адресующего сигнала.
Для определения локализации в митохондриях дрожжей слитого белка F2, синтезированного in vivo, митохондрии обрабатывали увеличивающимися концентрациями дигитонина в присутствии протеиназы К. Устойчивый к протеиназе F2 в значительном количестве обнаруживается даже тогда, когда протеиназой расщепляется не только цитохром b2, находящийся в межмембранном пространстве, но и белок матрикса Mge1p (рис. 16А).
Фракционирование митохондрий посредством щелочной экстракции показало, что большая часть белка F2 находится в матриксе и лишь незначительная часть встроена во внутреннюю митохондриальную мембрану (рис. 16Б).
Рис. 16. Локализация в митохондриях дрожжей гибридного белка F2(h) (P450scc-AdR-Ad), синтезированного в клетках S. cerevisiae. Митохондрии обрабатывали протеиназой К ( мкг/мл) в присутствии различных концентраций дигитонина (А) и 0,1М раствором (Б). Образцы Na2CO3.
анализировали Ds-Na-электрофорезом в ПААГ с последующим иммуноблоттингом. А: Маркерные белки: цитохром b2 (белок межмембранного пространства) и Mge1p (белок матрикса). Б: 1 – митохондрии, 2 – осадок (30 мин, 125000g), полученный после карбонатной экстракции митохондрий.
Полученные данные указывают на то, что топогенез F2, как и топогенез экспрессированного в дрожжах Р450scc, осложнен побочными процессами.
Взаимодействие каталитических доменов в гибридном белке P450scc-AdR-Ad Митохондрии и ультразвуковые СМЧ из дрожжевых клеток, экспрессирующих F2(h) или F2(b-h), проявляли гидроксилазную активность при использовании 22(R) гидроксихолестерина в качестве субстрата. Средняя активность митохондрий в случае F2(b h) составляла 0,03+0,008 пмолей прегненолона/мин на 1 мг митохондриального белка (из независимых экспериментов). ХГ/Л активность СМЧ была обычно в 5-7 раз выше.
Активность митохондрий, содержащих гибридный белок F2(b-h), возрастала при добавлении к разрушенным митохондриям очищенных цитохрома P450scc или смеси Ad и AdРед быка в 17 и 25 раз соответственно, что свидетельствует об ограниченной способности к взаимодействию каталитических доменов гибридного белка и о доступности их активных центров добавленным индивидуальным белкам (P450scc, Ad и AdR).
Экспрессия трехкомпонентные cлитых белков в клетках E.coli Так как низкое содержание активных слитых ХГ/Л в митохондриях дрожжей препятствовало их более подробной характеристике, для экспрессии гибридных белков были использованы клетки E. coli. Для экспрессии зрелых форм белков F2(h) и F2(b-h) в клетках бактерий были сконструированы плазмиды pTrc99A/F2(h) (рис. 17А), pTrc99A/F2(b-h) и pTrc99A/AAP(h), включающая кДНК, кодирующую гибридный белок AdR(h)-Ad(h) P450scc(h) (ААР), в котором COOH-конец P450scc, функционально важный для его правильного сворачивания, является свободным (рис. 14).
Анализ гомогенатов трансформированных клеток (индукция экспрессии гибридных белков в течение 24-48 час) показал, что в клетках синтезируются полноразмерные гибридные белки (рис. 17Б).
Рис. 17. Экспрессия гибридных белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы, в клетках E.
coli. А. Схема плазмиды, содержащей кДНК, кодирующую белок P–AdR–Adx(b–h). Б и В: Ds-Na ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг гомогенатов нетрансформированных (дор. и 1) трансформированных клеток, содержащих тройные (Б) и двойные (В) гибридные белки. На дорожку наносили 100 мкг белка гомогенатов. Прокрашивание осуществляли с использованием антител к Ad.
Для тройных гибридных белков, продуцируемых в клетках E. coli, был установлен ряд интересных фактов: (1) белки F2(b-h), F2(h) и ААР подвержены внутриклеточному протеолизу, причем для разных гибридных белков набор низкомолекулярных продуктов, иммуногенных по отношению к антителам к Р450scc, AdR и Ad, различен - основным продуктом протеолиза F2(b-h) и F2(h) является 65-кД белок, в случае ААР - 33-кДа белок (Рис. 17Б), следовательно, указанные белки имеют разную структуру вследствие разного взаимного расположения белковых доменов;
(2) значительная доля рекомбинантных белков встраивается в мембрану клеток E. coli (показано при карбонатной экстракции фракции ВМЧ и их обработке 1% Тритоном Х-100);
(3) спектры клеточного гомогената не характерны для интактного P450scc и (4) гомогенаты бактериальных клеток, экспрессирующих тройные гибридные белки, проявляют ХГЛ активность с 22(R)-гидроксихолестерином в качестве субстрата, которая увеличивается при добавлении экзогенных индивидуальных белков, входящих в состав гибридного белка, при этом степень активации разных гибридных белков различна (Таблица 3).
Следует отметить, что активности слитых ХГ/Л не менее чем на порядок ниже активности, измеренной в гомогенате клеток, экспрессирующих цитохром Р450scc, в присутствии индивидуальных белков AdR и Аd. Этот вывод подтвержден при изучении белка F2(b-h), выделенного при проведении аффинной хроматографии клеточных лизатов с адренодоксин-сефарозой. Удельная активность изолированного слитого белка - 0,03-0, моль образующегося прегненолона на моль F2(b-h) в 1 мин - соответствует 1-2% от активности системы, реконструированной из изолированных P450scc, AdR и Ad, взятых в молярном соотношении 1:1:1. Низкая активность слитых ХГ/Л, вероятно, связана с тем, что в гибридных белках доля правильно свернутых каталитических доменов невелика (на что указывает высокое содержание продуктов протеолиза), или эти домены не могут эффективно взаимодействовать друг с другом.
Таблица 3. Холестерингидроксилазная/лиазная активность гибридных белков в гомогенатах рекомбинантных клеток E. coli Активность, пмолей прегненолона мин-1 мг-1 белка гомогената Белок Добавки Без добавок P450scc AdR Ad AdR+Ad P–AdR–Ad(b–h) 2,68 + 0,185 2,73 + 0,41 1,8 + 0,30 — 0,898 + 0, P–AdR–Ad(h) 0,058 + 0,033 0,063 + 0,02 0,35 + 0,071 — 0,029 + 0, AdR–Ad–P(h) — — — — 0,065 + 0, P450scc 0,002 + 0,001 0,002+0,001 0,003 + 0,001 36,99+12,99 — Приведенные данные - среднее значение ± стандартное отклонение из не менее, чем трех экспериментов по измерению активности в гомогенатах клеток E. coli.
Согласно предполагаемым механизмам взаимодействия Ad с AdR и Р450scc, для достижения эффективного внутримолекулярного транспорта электронов в слитой ХГ/Л домены Р450 и AdR должны быть расположены таким образом, чтобы они могли либо формировать временный тройной комплекс с Ad («кластерный механизм» [Турко и др, 1988]), либо последовательно взаимодействовать с Ad («челночный» механизм [Lambeth et al., 1979]). Реализация «челночного» механизма требует высокой взаимной подвижности доменов - слитая молекула должна иметь подвижную конформацию, что делает ее потенциальной мишенью для внутриклеточных протеиназ. В данной работе, а также в работе [Harikrishna et al., 1993], обнаружено существование обратной связи между активностью и устойчивостью к протеолизу слитых ХГ/Л: так, наиболее активный вариант ААР присутствует в клетках в незначительных количествах при высоком содержании его фрагментов (рис. 17А, Таблица 3), что согласуется с «челночным» механизмом функционирования ХГ/Л системы.
Таким образом, эксперименты по изучению свойств слитых ХГ/Л, продуцируемых в клетках дрожжей и бактерий, не подтвердили предположение, согласно которому слияние последовательностей компонентов системы может привести к увеличение ХГ/Л активности вследствие более эффективного внутримолекулярного переноса электронов. В отличие от ряда двухкомпонентных монооксигеназ, описанных в литературе [Shibata et al., 1990;
Sakaki et al., 1994;
Wilks et al., 1995;
Shet et al., 1996], трехкомпонентная слитая ХГ/Л менее активна при сравнении с системой, в которой активность обеспечивается взаимодействием отдельных компонентов.
Гетерологическая экспрессия двойных гибридных белков в клетках E. coli Сворачивание гибридных белков изучалось с использованием более простых моделей двухкомпонентных белков AdR-Ad, Ad-P450scc и P450scc-Ad (рис. 14). Данные белки продуцировали в бактериальных клетках и анализированы по той же схеме, что и тройные гибридные белки – определяли их уровень экспрессии, локализацию, активность и спектральные характеристики. При экспрессии в клетках E. coli, трансформированных плазмидами pTrc99A/РА (h), pTrc99A/АР(h) или pTrc99A/АА(h), двойные гибриды, в отличие от трехкомпонентных, не подвергаются протеолизу (рис. 17В).
Для оценки корректного фолдинга двойных белков была измерена их каталитическая активность в клеточном гомогенате в присутствии недостающего компонента ХГЛ системы.
Определение активности гибридных молекул в присутствии дополнительного количества индивидуальных белков, входящих в их состав, выявило наличие в каждом белке лимитирующего компонента: в белках mP450scc-Аd и Аd-mP450scc это Р450scc, а в белке AdR-Ad – Ad (рис. 18А-18В). При добавлении одного из изолированных белков в реакционную среду активность Р450-Ад, Ад-Р450 и AdR-Ад может быть восстановлена до уровня активности полностью реконструированной системы. На рис. 19 представлены предполагаемые схемы взаимодействия между компонентами слитых двухкомпонентных белков и их экзогенными партнерами.
Оказалось, что формирование одних и тех же доменов в составе разных гибридных белков осуществляется по-разному. Так, в случае белков Р-Ad и Ad-Р при добавлении Р450scc активность увеличивается в 20 и 10 раз соответственно (рис. 18А, 18Б). В зависимости от позиции относительно Ad, цитохром Р450scc в составе гибридов обнаруживается либо в нативном (Ad-Р), либо преимущественно в инактивированном (Р-Ad) состоянии (СО-разностные спектры препаратов имеют максимумы при 450 нм и 420 нм соответственно), в то время как Аd в них активен. Тот факт, что даже нативный Р450 не способен эффективно взаимодействовать с функционально активным доменом Ad, позволяет предполагать, что в домене Р450 молекулы Ad-Р участок связывания Ad экранирован и домены слитого белка (способные взаимодействовать с экзогенными партнерами) не в состоянии эффективно взаимодействовать друг с другом.
Рис. 18. Холестерингидроксилазная/лиазная активность гомогенатов, содержащих гибридные белки P-Ad (А), Ad-P (Б) и AdR-Ad (В), и увеличение активности при добавлении индивидуальных компонентов слитого белка. Величины являются средними + стандартное отклонение из трех экспериментов.
Рис. 19. Предполагаемые схемы взаимодействий компонентов двойных гибридных белков (клетчатые фигуры), соответствующих недостающих компонентов ХГ/Л системы (белые фигуры) и добавленных индивидуальных белков (серые фигуры-активирующие компоненты). Темным цветом выделены центры связывания P450scc, AdR и Ad. Толстые стрелки - эффективное взаимодействие, пунктирные стрелки – неэффективное. А: Р-Аd в комбинации с AdR (1) и AdR+P450scc (2);
Б: Аd-Р в комбинации с AdR (1), AdR+Ad (2) и AdR+P450scc (3). В: AdR-Ad в комбинации с P450scc (1) и P450scc+Ad (2).
Чрезвычайно низкая активность гибрида AdR-Ad при добавлении в пробу экзогенного Ad возрастает в 200 раз (до уровня активности реконструированной системы) (рис. 18В), что указывает либо на отсутствие нормального активного центра у Ad, входящего в состав слитого белка, либо на его неспособность взаимодействовать с активным центром AdR вследствие недостаточной взаимной подвижности. Таким образом, даже в двухкомпонентных фрагментах слитой ХГ/Л системы возникают определенные трудности:
нарушение формирования одного из активных центров и/или их стерическое разобщение.
Результаты проведенных исследований четко показывают, что при сворачивании слитых белков, составленных из компонентов ХГ/Л системы, формирование каталитических доменов в составе общей полипептидной цепи зависит от природы и взаимного расположения аминокислотных последовательностей отдельных доменов и что их аранжировка осуществляется в результате некоего кооперативного процесса, определяющего нативность отдельных доменов и результирующую активность слитых монооксигеназ.
2.3. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ СТЕРОИДОГЕНЕЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ, В ДРОЖЖАХ Yarrowia lipolytica:
НОВЫЙ ПОДХОД К КОНСТРУИРОВАНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Выбор дрожжей Yarrowia lipolytica в качестве микроорганизма-реципиента для реконструкции ХГ/Л системы представлялся перспективным, поскольку данный вид дрожжей адаптирован к трансформации гидрофобных соединений. Это достигается благодаря наличию в этих дрожжах эффективных систем поглощения и внутриклеточного транспорта гидрофобных субстратов, наличию характеризующихся высокой активностью цитохромов Р450 (семейство CYP52), высокому уровню экспрессии компонентов, обеспечивающих транспорт электронов, и селективным механизмам выведения окисленных продуктов [Mauersberger et al., 1996]. Предполагалось, что в случае реконструкции ХГ/Л системы в дрожжах Y. lipolytica будет решена проблема, связанная с проникновением в клетку холестерина - субстрата ХГ/Л системы, и выведением в культуральную среду продукта реакции.
Интегративные вектора, содержащие кДНК зрелых форм белков холестерин трансформирующей системы и слитого белка под контролем Ad-Р450scc (AdP) регулируемого промотора и терминатора изоцитратлиазы (индукция этанолом и алканами, репрессия глюкозой;
[Juretzek et al., 2001;
Forster, 2001]), были сконструированы на основе мультикопийных интегративных плазмид p64PT и p67PT, способных интегрироваться в повторяющиеся элементы в геноме дрожжей (последовательности, обеспечивающие интеграцию - rDNA или LTRzeta ретротранспозона Ylt1, маркер для селекции ura3d4 и pICL1-SphI-ICL1t [Schmid-Berger et al., 1994;
Forster, 2001]). На рис. 20 в качестве примера приведены схемы сконструированных плазмид p67-серии p67AdP и p67AdR.
Для введения в дрожжевой геном трех гетерологических кДНК, кодирующих Ad, AdR и Р450scc, была использована трансформация гаплоидных реципиентных штаммов дрожжей Y.
lipolytica E129L, E150 смесью идентичных векторов, включающих разные кассеты экспрессии. На первой стадии работы использовались 2 вектора, один из которых включал кДНК AdR, а второй - генетически сшитую кДНК, кодирующую слитой белок AdР (p67AdR+p67AdP (рис. 20) и p64AdR+p64AdP).
Рис. 20. Многокопийные интегративные вектора p67AdP (А) и p67AdR (Б) для экспрессии AdP и AdR в Y. lipolytica. Вектора содержат последовательность, обеспечивающую интеграцию в геном фрагмент LTR zeta, селективный маркер - ген ura3d4 и экспрессионную кассету pICL1D-SphI-(генX) ICL1t. Перед проведением интегративной трансформации вектора линеаризовали эндонуклеазой рестрикции NotI. SalI - фрагменты из p64AdP (pICL1-AxP) и p64AdR (pICL1-AdR) использовались в качестве зондов для детекции методом Саузерн-гибридизации гена ICL1 и интегративных векторов, включающих кДНК гетерологических белков.
На следующей стадии для котрансформации гаплоидных штаммов были также использованы интегративные вектора, обеспечивающие экспрессию кДНК цитохрома P450scc (p67Pb, bovine) и цитохрома P45017 (p67IC17a, [Juretzek et al., 1999]), катализирующего следующие стадии стероидогенеза после цитохрома Р450scc.
Методом Саузерн-гибридизации показана интеграция в геном до 3 векторов (по меньшей мере, 8-12 копий от 1 до 3 векторов) при одновременной трансформации клеток гаплоидных реципиентных штаммов Y. lipolytica смесью 2-х или 3-х идентичных векторов р64- или р67-серии, включающих кассеты экспрессии с разными гетерологическими кДНК (рис. 21A). Количество копий разных векторов в дрожжевом геноме было определено при использовании в качестве зонда SalI-фрагмента вектора p67AdP, включающего участки последовательности промотора и кДНК AdP (рис. 20А), выявляющего фрагмент, происходящий из гена изоцитратлиазы (присутствует в геноме в количестве 1 копии, служит внутренним стандартом для определения количества копий интегративных векторов), и фрагменты, происходящие из кассет экспрессии, входящих в состав интегративных векторов (вследствие присутствия в них pICL1).
Рис. 21. Детекция интегративных векторов в геноме трансформантов Y. lipolytica E129L после котрансформации тремя плазмидами р67-серии (p67AdP, p67AdR и p67IС17) методом Саузерн гибридизации (А) и ориентация векторов в мультикопийных трансформантах (Б). При анализе хромосомной ДНК дрожжей (рестрицированой эндонуклеазой EcoRV) в качестве зондов использованы SalI-фрагмент вектора р67АdР (pICL1-AxP) (рис. 20) (А) и URA3-зонд (Б). Маркеры молекулярной массы (М) - препарат -DNA, рестрицированной EcoRI/HindIII, T1 - T15 – трансформанты E129L, К – контрольный штамм E129L, г – фрагмент геномной копии ICL1, в – фрагменты кассет экспрессии из интегративных векторов. Продемонстрирована возможность одновременной интеграции в геном дрожжей до трех интеративных векторов (штаммы T2 и Т3).
Ориентация векторов, интегрированных в геном Y. lipolytica, определена при проведении Саузерн-гибридизации с использованием URA3-зонда по наличию характерных фрагментов, выявляемых в препарате рестрицированной хромосомной ДНК. Обнаружено, что мультикопийные вектора встраиваются преимущественно в один сайт интеграции, образуя тандемы с преобладающей ориентацией – «голова – хвост», редко - «голова к голове» (рис. 21Б). Вектора с разными кассетами экспрессии обнаруживаются в одном кластере.
Для увеличения количества и получения разных комбинаций кассет экспрессии гетерологических кДНК в одном штамме, проведено конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформантов разного полового типа - штаммов Y. lipolytica E129L (MATA) и E150 (MATB), скрещивание которых дает прототрофный диплоидный штамм (рис. 22А). Скрещивание гаплоидныx трансформантов обеспечило комбинацию до кассет экспрессии (или до 5 разных векторов) в одном диплоидном штамме (рис. 22А, 22Б).
Рис. 22. Конструирование диплоидных штаммов дрожжей Y. lipolytica DE5-DE10 для коэкспрессии белков ХГ/Л системы (цитохрома Р450scc, AdR и Ad) и цитохрома Р45017 (А) и анализ методом Саузерн-гибридизации штаммов DE5-DE10 и отдельных гаплоидных трансформантов Y. lipolytica (Б).
Скрещивание гаплоидных штаммов E150 Т9 (p67Ad) и E129 Т11(p67AdR+p67Pb) использовано для комбинирования трех кассет экспрессии (для цитохрома Р450scc, AdR и Ad) в диплоидном штамме DE6. ДНК: рестрикция NcoI, зонд для гибридизации - SalI-фрагмент из р67АdР (pICL1-AxP) (рис. 20), маркеры молекулярной массы (М) - препарат -DNA, рестрицированной EcoRI/HindIII.
Получены диплоидные штаммы, обеспечивающие экспрессию кДНК всех белков ХГ/Л системы (DE1 - DE6), белков ХГ/Л системы и цитохрома P45017 (DE5) и контрольные штаммы (DE7-DE10), в которых отсутствуют кассеты экспрессии для одного из указанных белков (рис. 22Б), используя которые можно, в частности, проверить способность редуктазы или ферредоксина дрожжей выполнять функции редокс-партнеров гемопротеидов млекопитающих. Можно отметить, что при котрансформации клеток Y. lipolyticа несколькими плазмидами были получены наборы штаммов не только с разной комбинацией, но и с разным количественным соотношением кассет экспрессии с разными гетерологическими кДНК, что позволяет выбирать для последующего скрещивания трансформанты с желаемым соотношением числа копий кассет экспрессии для разных белков.
Следует отметить, что данная работа выполнялась в рамках международного научного проекта (грант Конструирование рекомбинантных штаммов INTAS). Y. lipolyticа проводилось совместно с В. Йовковой и доктором Ш. Мауерсбергером (Технический университет Дрездена, г. Дрезден, Германия).
Экспрессия полноразмерных белков ХГ/Л системы в рекомбинантных клетках, выращенных в условиях индукции экспрессии гетерологических кДНК этанолом, показана методом Вестерн-блоттинга (рис. 23).
Рис. 23. Результаты иммунодетекции цитохрома P450scc (A), AdR (Б), Ad и слитого белка АdР (В) в гомогенатах клеток диплоидных штаммов Y. lipolytica DE1-13 (Ad,AdP,AdR,P17), DE6 (Ad,AdR,Pb) и DE5 (AdR,Ad,Pb,P17). Клетки растили в присутствии индуктора EtOH (1%) в течение 48 час (А, Б) или 24 час (В). Анализ методом иммуноблоттинга. В качестве стандартов использованы белки, изолированные из коры надпочечников быка. Справа - молекулярные массы белков-маркеров в кДа.
В системе с использованием метода ИФА показано, что in vitro холестерингидроксилаза/лиаза, экспрессированная в клетках Y. lipolytica (24 час роста в присутствии индуктора), способна трансформировать 22(R)-гидроксихолестерин в прегненолон (для штамма DE6 активность составила 2,5 пмоль прегненолона/мин на мг белка гомогената). Для определения ХГ/Л активности в системе in vivo проводили анализ стероидных продуктов, присутствующих в культуральной среде и гомогенатах клеток, методом ГЖХ. Экспрессия активных белков системы цитохрома Р450scc млекопитающих в штаммах Y. lipolyticа DE5 и DE1-13 подтверждена способностью клеток, культивируемых в присутствии индуктора экспрессии гетерологических кДНК (1% Et-OH) и холестерина, осуществлять биотрансформацию холестерина в прегненолон (рис. 24А, 24Б). Важным является то, что клетки Y. lipolytica способны выводить продукт реакции в среду культивирования (рис. 24А и Б), в клеточных гомогенатах продукт ХГ/Л реакции не выявлен.
О функциональной экспрессии P45017 в штаммах DE1-, DE4- и DE5-типов свидетельствует наличие биотрансформации индуцированными клетками холестерина в прегненолон и далее в 17-гидроксипрегненолон (DE1-13 - рис. 24В), а также прогестерона в 17-гидроксипрогестерон (продукты биотрансформации холестерина и прогестерона идентифицированы методами ВЭЖХ и ГЖХ, определение активности P45017 проведено группой профессора В.М. Шкуматова, НИИ ФХП, г. Минск).
Рис. 24. Биотрансформация холестерина рекомбинантными штаммами Y. lipolytica DE5 (экспрессия P450scc, Ad, AdR и P45017) (А) и DE1-13 (экспрессия Ad-P450scc, AdR, Ad и P45017) (Б).
Представлены результаты анализа органических экстрактов внеклеточной среды, полученной после культивирования штаммов DE5, DE1-13 и контрольного штамма E129 в присутствии индуктора экспрессии белков (1% Et-OH) и холестерина (50 мкМ) и штамма E129 в присутствии индуктора, но в отсутствие холестерина в течение 24 час. Стероиды экстрагировали из 6 мл культуральной жидкости, растворяли в 50 мкл хлористого метилена, на анализ брали 1 мкл. Анализ проводили методом ГЖХ.
Таким образом, получены рекомбинантные штаммы Y. lipolytica, способные осуществлять экспрессию функционально активных белков двух систем цитохромов Р млекопитающих, что позволяет обеспечить сопряжение трансформации холестерина до прегненолона (прогестерона) с синтезом 17-гидроксилированных производных.
В работе показано, что при использовании метода, описанного выше, можно конструировать трансгенные дрожжи способные экспрессировать Y. lipolyticа, гетерологических белков (при скрещивании клеток, включающих по 3 разных кассеты экспрессии с гетерологическими кДНК), что, в частности, делает возможным создание новых штаммов, коэкспрессирующих большее количество белков, участвующих в процессе стероидогенеза. Очевидные преимущества алкан-утилизирующих дрожжей Y. lipolytica в плане их использования для биотрансформации гидрофобных стероидов позволяют предполагать, что эти дрожжи могут эффективно примененяться в биотехнологии.
ВЫВОДЫ Предшественник цитохрома P450scc (pP450scc) из клеток коры надпочечников быка с 1.