Создание и использование новых биопрепаратов для деструкции органических отходов и повышения сохранности животных
На правах рукописи
ИВАНОВ АЛЕКСАНДР АРКАДЬЕВИЧ
СОЗДАНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВЫХ БИОПРЕПАРАТОВ
ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ И
ПОВЫШЕНИЯ СОХРАННОСТИ ЖИВОТНЫХ
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Ульяновск – 2012
Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиаци онной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань) доктор биологических наук, профессор
Научный консультант ТРЕМАСОВ МИХАИЛ ЯКОВЛЕВИЧ
Официальные оппоненты: РОМАНОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА доктор биологических наук, профессор, заве дующая кафедрой биологии, ветеринарной ге нетики, паразитологии и экологии ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйст венная академия имени П.А. Столыпина»
ЕРЕМЕЦ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ доктор биологических наук, профессор, замес титель директора по НИР ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»
ЕЖКОВА АСИЯ МАЗЕТДИНОВНА доктор биологических наук, заведующая отде лом животноводства ГНУ «Татарский научно исследовательский институт агрономии и поч воведения РАСХН»
Ведущее учреждение ГНУ «Всероссийский научно - исследова тельский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН»
Защита состоится «12» октября 2012 г. в 1000 часов на заседании диссер тационного совета Д-220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государствен ная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» по адресу: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, тел. (8422) 44-30-58;
факс 44-30-72, e-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», а с авторефератом на сайте www.vak.ed.gov.ru
Автореферат разослан «» 2012 года.
Учёный секретарь диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна 1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Приоритетный национальный проект «Развитие аг ропромышленного комплекса» – ориентирует российскую науку на привлече ние инновационных и наукоемких технологий, способных обеспечить населе ние качественной, полноценной и безопасной продукцией растениеводства и животноводства в контексте решения общегосударственной проблемы продо вольственной безопасности.
Интенсивное развитие животноводства и птицеводства в России, безус ловно, сопряжено с наращиванием поголовья сельскохозяйственных животных, однако проблема утилизации органических отходов их жизнедеятельности (на воза и помета) до настоящего времени не решена (Смирнов А.М., 2004;
Тюрин В.Г., 2004;
Лысенко В.П., 2011;
Архипченко Н.А., 2011;
Матросова Л.Е., 2005, 2012) и порождает новый круг проблем, обусловленных формированием в зо нах животноводческих комплексов и птицефабрик значительных территорий с повышенным уровнем биологической опасности (Шоль В.Г., 1999;
Малик Н.И.
и др., 2003;
Салеева И.П. и др., 2007;
Панин А.Н. и др., 2012).
Вокруг животноводческих предприятий накапливаются огромные залежи навоза и помета, отличающиеся высоким содержанием экологически опасных компонентов, в частности: тяжелых металлов, пестицидов, микотоксинов, ме дикаментозных средств, возбудителей инфекционных и инвазионных болезней, радиоактивных веществ, аммиака, сероводорода, меркаптана, фенола (Тремасов М.Я., 2010;
Андреев А.Ю., 2011). Внесение такого навоза и помета в почву без предварительной обработки неприемлемо.
По данным Всемирной организации здравоохранения навоз является ис точником передачи более 100 возбудителей опасных для человека и животных болезней (Романенко Н.А., 1981). Общеизвестно, что возбудитель сальмонелле за в навозе сохраняет свою жизнеспособность 92-157 сут., туберкулза – сут., листериоза – более 160 сут., вирус болезни Марека – более 6 месяцев;
яйца и личинки гельминтов в свином навозе сохраняются 12-15 мес., крупного рога того скота – 7-8 месяцев. После внесения необработанных органических отхо дов почва в значительной степени обсеменяется микрофлорой, что повышает уровень ее биологической опасности (Тюрин В.Г., 2004;
Матросова Л.Е., 2010).
Кроме того, использование органических отходов без переработки нецелесооб разно, т.к. сопровождается снижением содержания азота до 50-60% (Мыц Е.А. и соавт., 1996;
Фомин Ю.И., 1996;
Morse Д., 1994).
Существует прямая зависимость содержания техногенных экотоксикантов в тканях организма с наличием их в почве. Экотоксиканты повышают нагрузку на иммунную систему, вызывают иммунодефицит, в результате возрастает за болеваемость, уменьшается сохранность и продуктивность животных. Полу чаемое в результате этого некачественное, неполноценное, опасное питание приводит к росту заболеваемости среди населения, в том числе хронических инфекций.
В настоящее время ускоряется тенденция деградации и истощения почвы, теряется ее продуктивная сила, разрушается природная среда. Среду обитания, водные источники загрязняют сточные воды промышленных предприятий крупных городов, бытовые и хозяйственные отходы. Ил из очистных сооруже ний содержит органические компоненты, которые могут служить благоприят ной средой для развития патогенной микрофлоры. Вероятными и опасными ис точниками загрязнения окружающей среды являются тяжелые металлы, пести циды и другие токсические соединения (Дорожкин В.И., 2010;
Menzi H. et.al., 1995). Промышленные, коммунальные выбросы, отходы сельскохозяйственных предприятий, разливы нефти и нефтепродуктов загрязняют всю пищевую це почку человека, поскольку их принимает на себя почва, сельскохозяйственные угодья и пастбища, которые служат основой для производства сельскохозяйст венной продукции и продуктов питания (Протасов В.Ф. и др., 1995).
Учитывая вышеизложенное, следует отметить, что в современном индуст риальном обществе существует острая необходимость в эффективных средст вах восстановления экологического равновесия. Решение экологических про блем напрямую связано с развитием прикладной биотехнологии, нацеленной на создание средств реабилитации природной среды. Современные биотехноло гии, основанные на использовании микроорганизмов, участвующих в био трансформации органических отходов животноводства в экологически чистое удобрение, способны обеспечить возрождение почвенного плодородия, суще ственно повысить урожайность сельскохозяйственных культур, снизить до безопасного уровня содержание экотоксикантов техногенного и природного происхождения.
Биотехнологические препараты, созданные на основе консорциумов эф фективных микроорганизмов, способных осуществлять очистку стоков, почв, сельскохозяйственных угодий, пастбищ от комплекса поллютантов является ак туальными и широко востребованными.
Результатом настоящей диссертационной работы явилась разработка тех нологии лабораторного, полупромышленного и промышленного производства эффективных биотехнологических препаратов, представляющих собой устой чивый самоорганизующийся консорциум микроорганизмов – деструкторов, существенно ускоряющих ферментацию и биотрансформацию органических отходов животноводства (навоза) и птицеводства (помета) в высокоценное ор ганическое удобрение вне зависимости от сезона. При создании препарата были использованы штаммы микроорганизмов, выделенные на базе ФЦТРБ-ВНИВИ (г. Казань). При внедрении в практику, особое внимание было уделено исследо ванию биобезопасности препаратов, повышению их эффективности, поиску но вых форм, способов и областей применения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разра ботка биотехнологий получения эффективных препаратов-деструкторов орга нических отходов для реабилитации почвы, а также создание и апробация пре паратов для повышения сохранности животных.
Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:
- Провести поиск культур микроорганизмов, обладающих деструк тивными свойствами.
- Изучить морфологические, культуральные и биохимические свойства отобранных микроорганизмов, обладающих свойствами ускорять процессы ферментации органических отходов.
- Изучить показатели безопасности ускорителя ферментации с оценкой острой, субхронической, хронической токсичности, аллергенных, эмбриоток сических и тератогенных свойств.
- Сконструировать консорциумы микроорганизмов для создания препара тов-деструкторов органических отходов, разработать технологические процес сы их лабораторного и полупромышленного производства.
- Разработать на основе биотехнологических приемов различные формы биопрепаратов – ускорителей ферментации для утилизации органических отхо дов сельскохозяйственных предприятий, бытовых и коммунальных отходов, нефти и нефтепродуктов, технологии их применения.
- Оценить в лабораторных и производственных условиях эффективность препаратов – ускорителей ферментации при обработке органических отходов различной природы.
- Оценить эффективность ускорителей ферментации на активность роста растений (зерновых, овощей) и реабилитации почвы.
- Разработать на основе биотехнологии препараты для повышения сохран ности животных.
- Экономически обосновать разработку и внедрение в АПК биологических методов утилизации органических отходов и получение экологически «чистой»
сельскохозяйственной продукции и продуктов питания.
- Разработать НД на производство и применение ускорителей фермента ции.
Научная новизна работы. Из почвы, сенного настоя выделены и отобра ны микроорганизмы – деструкторы органических отходов сельскохозяйствен ного производства, бытовых и промышленных отходов, нефти и нефтепродук тов, сточных вод, воды из различных водоемов и источников;
разработаны вы сокоэффективные препараты – ускорители ферментации, различные формы и технологии получения и инструкции по использованию ускорителей фермента ции, а также схемы их применения. Штаммы ускорителей ферментации паспор тизированы и депонированы. Препараты ускорители ферментации не обладают токсическими свойствами, отдаленными последствиями, являются экологиче ски безопасными. Установлена их высокая эффективность обезвреживания, утилизации органических отходов в течение всего года, независимо от погод ных и сезонных условий. Показано положительное влияние ускорителей фер ментации «УФ-1» и «Экос» на рост, развитие зерновых и овощных культур, с повышением урожая этих культур до 20%.
Внесение в почву удобрения, полученного с помощью ускорителей фер ментации «УФ-1» и «Экос», способствует реабилитации почвы, повышению содержания почвенного гумуса. С помощью биотехнологических приемов соз даны средства лечения и профилактики легочных и желудочно-кишечных бо лезней молодняка. Проведено экономическое обоснование разработки и приме нения ускорителей ферментации при переработке органических отходов и реа билитации почвы.
По материалам диссертации разработан препарат для переработки органи ческих отходов животноводства и птицеводства «Экос» (Патент на изобретение № 2425016 от 27 июля 2011 г.). Получены положительные решения на выдачу патентов на изобретения: «Способ получения сыворотки крови взрослого круп ного рогатого скота для культивирования клеток животных и человека» (Заявка №2011115490/10 от 19.08.2011 г.);
«Полиспецифическая гипериммунная сыво ротка против рото-коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят» (Заявка №2010151702/15 от 15.12.2010 г.);
«Способ получения сыво ротки крови плодов коров для культивирования клеток животных и человека»
(Заявка №2011126222/15 от 24.06.2011 г.).
Практическая ценность работы заключается в том, что на основе ком плексных исследований решена крупная научная проблема в области биотехно логии, токсикологии и ветеринарной медицины, имеющая важное народно хозяйственное значение. Научно обосновано получение и применение эффек тивных препаратов-деструкторов органических отходов для реабилитации поч вы, а также лекарственных средств и биопрепаратов для повышения сохранно сти животных. По результатам исследования разработаны 14 нормативных до кументов, утвержденных в установленном порядке:
1. Санитарно-микологическая оценка кормов и улучшение их качества.
МСХ РФ. – М.: изд-во «Росинформагротех». 2006. -31 с.
2. Рекомендации по диагностике, лечению и профилактике отравлении жи вотных солями тяжелых металлов и другими токсическими элементами. МСХ РФ. – М.: изд-во «Росинформагротех». 2006. -35 с.
3. Средство для биодеградации и обезвреживания навоза и помета. Техни ческие условия от 7 августа 2007 г. – 8с.
4. Инструкция по применению средства для биодеградации и обезврежи вания навоза и помета (утв. зам. руководителя Россельхознадзора от 7 августа 2007 г.).-2с.
5. Методические рекомендации по применению энтеросорбентов при от равлениях животных (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). М.;
2010. -30 с.
6. Методические рекомендации по безопасности кормового, продовольст венного сырья и продуктов питания (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). М.;
2011. -47 с.
7. Методическое пособие по лечению и профилактике комбинированных поражений животных ионизирующим излучением, микотоксинами и солями тяжелых металлов (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). М.;
2011. - 47с.
8. Методические рекомендации по применению пробиотиков при отравле ниях животных (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). М.;
2011. 44с.
9: Сыворотка полиспецифическая против рота-, коронавирусного гастро энтерита и эшерихиозной диареи поросят. Технические условия (ТУ 9389-013 00492374-2011), (утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 11.10.2011г. и со гласованы нач. ГУВ КМ РТ 14.10.2011г.)- 17с.
10. Инструкция по применению сыворотки полиспецифической против ро та-коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят (утв. ди ректором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 11.10.2011г. и согласовано нач. ГУВ КМ РТ 14.10.2011г.).-3с.
11. Органическое удобрение на основе ускорителей ферментации «УФ-1»
и «Экос». ТУ 2189-001-2781003-2012. – 11с.
12. Методическое пособие по переработке органических отходов животно водческих и птицеводческих предприятий в экологически чистое удобрение (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). М.;
2012 – 26с.
13. Методическое пособие: диагностика, профилактика и лечение сочетан ных отравлений животных вторичными метаболитами микроскопических гри бов рода Fusarium (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). М.;
2012. - 46с.
14. Технологический регламент на производство препарата на основе Ba cillus subtilis для ускорения ферментации органических отходов (утв. директо ром ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»). 2012. – 8с.
Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертаци онной работы доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2005-2011 гг., Международ ных и Межрегиональных и Всероссийских научно-практических конференциях (Казань 2005, 2009, 2010;
Москва 2008, 2010, 2011;
Харьков 2010;
Краснодар 2011;
С-Петербург 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 53 научные рабо ты, в том числе 14 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также 1 патент и 3 положительных решения на выдачу патентов, в которых отражены основные положения и выводы диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту:
- поиск и отбор микроорганизмов-деструкторов выявил выраженные дест руктивные свойства у микромицетов из рода Actinomyces, Candida, бактерий из рода Bacillus (разработаны паспорта на штаммы: A. fradiaе-96, C. kruzei-96, B.
Subtilis - 99, которые депонированы во ВГНКИ и ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»);
- исследование морфологических, культуральных, биохимических свойств используемых штаммов, выявило отсутствие острой, субхронической, хрониче ской токсичности, аллергенных, эмбриотоксических и тератогенных свойств на фоне четко проявляющихся антагонистических свойств в отношении патоген ных E. cоli и Sal. тyphimurium при выраженном эффекте подавления роста и развития аскарид, семян сорных растений;
- разработанная технология лабораторного и полупромышленного получе ния ускорителей ферментации отходов животноводства и птицеводства «УФ-1»
и «Экос», сконструированных на основе симбионтного консорциума штаммов деструкторов, представленных - A. fradiaе-96;
C. kruzei-96 и B. subtilis-99, га рантирует их биобезопасность для животных, устойчивость при хранении и эффективность в широком диапазоне температур;
- ускорители ферментации «УФ-1» и «Экос» обеспечивают быструю био трансформацию органических отходов (навоза и помета) в высококачественное удобрение летом в течение 30-35 сут, зимой – 40-60 сут;
биопрепараты эффек тивны в диапазоне температур +30 и -300С в лабораторных и производственных условиях;
продукт биотрансформации свободен от патогенной микробиоты, характеризуется повышенным содержанием биогенных элементов (азота, фос фора и калия), не содержит экотоксикантов и является ценным органическим удобрением;
- полученное удобрение при внесении в почву улучшает ее агрохимиче ские свойства: увеличивается подвижный фосфор (Р2О5), обменный калий, снижается величина гидролитической и обменной кислотности, повышается сумма поглощенных оснований и степень насыщенности почвы основаниями, обеспечивая 20% прироста урожайности зерновых культур и корнеплодов.
- использование препаратов «УФ-1» и «Экос» для обработки почв, ранее содержавших нефть и нефтешламы, демонстрирует нормальный рост зерновых культур;
- разработанные технологии производства, контроля и применения ускори телей ферментации обеспечивают получение высокоэффективных препаратов, способных в короткие сроки перерабатывать органические отходы животно водства в высококачественное удобрение;
- применение препаратов ускорителей ферментации для обработки сточ ных вод, почвы и воды, достоверно снижает уровень загрязненности объектов нефтью и нефтешламами, способствует оздоровлению окружающей среды и является экономически оправданным;
- разработанные ветеринарные препараты – полиспецифическая гиперим мунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиоз ной диареи новорожденных поросят, в комплексе с применением ускорителей ферментации органических отходов, пробиотика Энтероспорин, сорбента Фи тосорб повышают сохранность животных при бактериальных и вирусных ин фекциях, дисбактериозах и диспепсии, вызванных микотоксинами.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 323 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литера туры и приложений. Работа иллюстрирована 84 таблицами. Список литературы включает 365 источников, в том числе – 88 зарубежных авторов.
2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа проводилась в 2005-2012 гг. в отделах токсикологии и нанобиотех нологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и био логической безопасности», результаты исследований апробированы в условиях животноводческих, птицеводческих и других предприятий АПК, на очисти тельных сооружениях г.г. Лениногорск, Альметьевск, Тула и др., в рамкам вы полнения госзадания по теме: «Разработка мероприятий по ликвидации в оча гах поражения последствий воздействия экотоксикантов»;
(«Токсикологическая безопасность» (№ гос. регистрации 01200202603);
«Биотехнология» (№ гос. ре гистрации 01201150931).
Микроорганизмы – деструкторы органических отходов выделяли из свеже го куриного помета, почвы из под навоза различной степени созревания, с по верхности обработанных и созревших навозных буртов, нефти, нефтепродуктов и их отходов – нефтешламов, каловых масс, отстойников, сливных ям и т.д.
Выделение микромицетов, бактерий проводили, руководствуясь приняты ми методами (Лабинская А.С., 1963;
Байрак В.А. и др., 1980;
Сидоров М.А. и др., 1995). Идентификацию культур проводили с использованием определителя бактерий Берджи (1997, 1 и 2 том), монографий под редакцией Н.А. Красиль никова «Биология отдельных групп актиномицет» (1985);
Реброва Р.Н. «Грибы рода Candida при бактериальных инфекциях» (1979), а микроскопических гри бов – согласно определителю Билай В.И., Пидопличко Н.М. (1970).
Биологическую оценку культур проводили с учетом определения морфо логических (форма, размеры клеток), тинкторальных (способность к окраске анилиновыми красителями), физиологических (характер роста культур на жид ких и плотных питательных средах, ферментации углеводов и многоатомных спиртов, уреазная и каталазная активность, образование конечных продуктов белков) и патогенных свойств. Морфологические и тинкторальные свойства штаммов устанавливали путем микроскопирования мазков из агаровых или бульонных культур, окрашенных по Граму.
Размеры микроорганизмов определяли с помощью световой микроскопии с использованием окулярного микрометра АМ 9-2, при этом высчитывали среднее арифметическое значение от измерения 20 клеток.
Для культивирования микроскопических грибов использовали поверхно стный и глубинный методы.
Культуральные свойства микроорганизмов изучали по характеру их роста в жидких (МПБ) и на плотных (сусло-агар) питательных средах, после инкуби рования посевов в термостате в течение 24-48 ч, при температуре 370С. Посевы на плотных питательных средах просматривали как невооруженным глазом, так и под световым микроскопом «Биолам», определяя их размеры, форму, харак тер краев, прозрачность, консистенцию колоний. Характеризовали рост микро организмов в жидких питательных средах, учитывали наличие пленки, осадка, степень помутнения МПБ.
При изучении биохимических свойств штаммов использовали: МПБ с ин дикаторными бумажками, пропитанными уксусно-кислым свинцом (определе ние сероводорода), реактив Эрлиха (выделение индола);
среды Гисса содержа щие различные углеводы и многоатомный спирт;
агар Кристенсена (уреазная активность);
МПЖ (протеолитическая активность);
МПА с 0,2%-ным раство римым крахмалом (амилолитическая активность). Каталазную активность мик ромицетов изучали путем суспендирования культуральной массы в 3%-ной пе рекиси водорода на предметном стекле. Кроме этого, каталазную активность тестировали непосредственно у выросших культур на сусло-агаре. Для этого на поверхность культуры на скошенном агаре наносили несколько капель 3%-ной перекиси водорода. Наличие каталазы оценивали по появлению пузырьков газа (атомарный кислород, отщепленный каталазой от перекиси водорода).
Патогенные свойства Actinomyces fradiae-96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 изучали путем подкожного и внутрибрюшинного введения белым мышам 0,5-1 см3 взвеси микроорганизмов в МПБ, с содержанием в 1 см3 100, 250, 500 млн. 1 и 2 млрд. микр. клеток.
Исследования проводили на лабораторных (белые мыши, крысы, морские свинки, кролики) и сельскохозяйственных (коровы, подсвинки) животных, со держащихся в условиях вивария ФЦТРБ-ВНИВИ и хозяйствах Кукморского района (СХП «им. Вахитова» и «Рассвет»). Перед проведением каждого опыта животных, по принципу аналогов (живая масса, возраст, пол), делили на опыт ные и контрольные группы. Кормление и содержание животных опытных групп не отличалось от контрольных.
Изучение острой, хронической токсичности, кумулятивного, раздражаю щего и аллергизирующего действий, пирогенных, канцерогенных и эмбриоток сических свойств препарата проводили согласно «Руководству по эксперимен тальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (М., 2005) и «Методических указаний по определению токсических свойств препа ратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (М., 1988, 2008).
Острую токсичность ускорителей ферментации оценивали на белых мы шах и белых крысах. Препарат вводили в желудок атравматическим зондом од нократно как в виде рабочего раствора, так и в нативном виде.
Через 7 сут после введения ускорителя ферментации по 5 животных из ка ждой группы убивали декапитацией с предварительным эфирным наркозом.
После убоя проводили диагностическое и микробиологическое исследования внутренних органов.
Изучение влияния ускорителя ферментации на функциональное состояние печени проводили с использованием гексеналовой пробы и определения актив ности гепатоспецифических ферментов. Активность аспартатаминотрансфера зы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови определяли вначале методом Рейтмана-Френкеля (Кондрахин И.П. и др., 2004), в дальней шем с помощью биохимического анализаторов EXPRES PLUS» и «Microlab 200».
Функциональное состояние нервной системы при многократном воздейст вии ускорителя ферментации оценивали в опытах на белых крысах, с использо ванием тест-метода «открытое поле», предложенного Boissier O.R. et al. (1964).
Физико-химический анализ воды проводили согласно СанПиН 1074-01.
Определение содержания тяжелых металлов в воде и органических отходах проводилось атомно-абсорбционным методом на ААС Perken Elmer «AAnalyst 200» по ГОСТ 30178-96. Пробоподготовку проводили согласно ГОСТ 26929-94.
Содержание ртути определяли методом типа «холодного пара» на анализаторе «Юлия-5К» по ГОСТ 51212-98, мышьяка – колометрическим методом по ГОСТ 26930-86.
Определение пестицидов в навозе/помете, воде определяли с помощью га зожидкостной хроматографии на хроматографах Дименшин-1 (США), Кри сталл-5000 (Россия, США), диоксинов - с помощью тандемной ГЖХ и хрома томассспектрометрии на приборах Хиттачи (Япония) и Финиган (США).
Для выявления тератогенного эффекта опытных животных убивали в кон це беременности. Послойную оценку макроструктуры внутренних органов про водили по методу Willson (1965) в модификации отдела эмбриологии ИЭМ АМН СССР;
изучение развития скелета - по методу Dawson (1926).
В ходе экспериментов определяли гематологические и биохимические по казатели крови, регистрировали прирост массы тела животных. Количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ определяли по общепринятым ме тодам (Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А., 1974), глюкозы – ортотолуидиновым методом, общего белка – рефрактометрически (Антонов Б.И. и др., 1991).
Обеззараживающее действие ускорителя ферментации изучали на экспе риментально контаминированном органическом субстрате (свиной навоз). Для контаминации субстрата использовали музейные штаммы микроорганизмов:
Escherichia coli 0126 и Salmonella typhimurium 371. До и каждые 5 сут после об работки навоза ускорителем ферментации подсчитывали количество микроор ганизмов в субстрате методом серийного разведения.
Производственные опыты по изучению эффективности ускорителя фер ментации для переработки навоза и помета проведены в условиях свиноводче ских, скотоводческих и птицеводческих хозяйств РФ. Использовались различ ные дозы препарата, ставились опытные и контрольные пробы. До и после об работки навозных масс отбирали пробы (как с поверхности, так и с глубины) для проведения микробиологических, копрологических, токсикологических и химических исследований. Для выделения и количественного учета микроорга низмов образцы навоза высевали в виде разведенной суспензии на питательные среды разного состава, в чашках Петри. Культивирование осуществлялось в ус ловиях термостата, а затем проводился подсчет и микроскопический анализ выросших колоний. С целью выявления в отобранных образцах яиц гельмин тов, исследование фекалий проводили методом Фюллеборна (Шевцов А.А. и др.,1973).
По окончании процесса ферментации проводили анализ качества получае мого удобрения и качества воды в соответствии с ГОСТ. Качество получаемого удобрения оценивалось по содержанию основных питательных веществ. Опре деление влаги проводили по ГОСТ 26713-85, общего азота по ГОСТ 26715-85, общего фосфора в пересчете на Р2О5 и общего калия в пересчете на К2О по ГОСТ 26717-85.
Из сравнительных нагрузочных тестов использовались модели антагониз ма с гексеналом (антинаркозное действие) по продолжительности гексеналово го сна (Брехман И.И., 1957), учет длительности восстановления способности к прямолинейному движению после вращения по Васильеву К.Г. (1957), макси мальной длительности статической работы (удержание белыми мышами своего тела на вертикальной сетке), длительности плавания мышей с грузом (динами ческой работы), содержание малонового деальдегида по Е.Н. Гончаренко, А.М.
Латиновой, (1985). Из моделей экстремальных факторов использовали модели рование гипоксии в замкнутом объеме («баночная гипоксия») (Кигель Г.Б., Ха барджахьян А.В., 1978).
Содержание сульфгидрильных групп сыворотки крови – амперомет рическим титрованием по Рубиной Н.С. (Кост С.А., Стенко М.И., 1974).
В экспериментальной работе использовали 224 белых мышей, 320 белых крыс, 24 морских свинок, 32 кролика, 260 проб крови, 520 проб навоза, помета, 40 образцов нефти, 20 – нефтешламов, 120 – сточных вод. Проведено более 2000 микробиологических, копрологических, гематологических, биохими ческих и хроматографических исследований.
Экономические расчеты проводили с учетом вероятного экономического ущерба и экономической эффективности (Никитин И.Н., 2008, 2011).
Цифровой материал подвергали статистической обработке на персональ ном компьютере по общепринятым методам вариационной статистики с вычис лением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±m), критерия достоверности Стьюдента (t) и коэффициента корреляции (r) с ис пользованием программы Microsoft Excel.
При выполнении отдельных этапов работ принимали участие зав. секто ром, с.н.с., к.б.н. Матросова Л.Е., вед. инженер Мохтарова С.Л., с.н.с., к.б.н.
Конюхова В.А., за что выражаем им признательность.
Библиографическое описание использованных в диссертации литератур ных источников осуществляли в соответствии с требованиями действующего ГОСТа.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ УСКОРИТЕЛЯ ФЕРМЕНТАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ, ИХ ПАСПОРТИЗАЦИЯ Для создания препаратов, обладающих биодеструктивными свойствами, были использованы культуры микроорганизмов B.subtilis-93;
B.subtilis F-1;
F-2;
F-3;
B.subtilis –К.М.;
B.subtillis-99;
B.subtilis-2006;
B.subtilis-2009, хранящиеся в коллекции отдела токсикологии, а Actinomyces fradiae-96;
99;
2006, Candida krusei -96;
99;
2006, выделенные из почвы покрытой свежим куриным пометом и сенного настоя.
Были созданы консорциумы, обладающие способностью ускорять биоде градацию навоза, помета и других органических отходов.
Ускоритель ферментации представляет собой взвесь микроорганизмов в питательной среде (физиологический раствор, патока). В состав препарата вхо дят микроорганизмы: лучистый гриб рода Actinomyces, Candida и спорообра зующие бактерии рода Bacillus, Actinomyces fradiae и Candida krusei, Bacillus subtilis. Указанные культуры микроорганизмов были выделены сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Тремасов М.Я., Сергейчев А.И., 1996;
1999;
Трема сов М.Я., Матросова Л.Е., 2006;
2009) из почвы, покрытой свежим птичьем по метом, и показали высокую ферментирующую активность в отношении орга нических отходов.
Проведено изучение культурально-морфологических и биохимических свойств, выделенных микроорганизмов, которые были идентифицированы как штаммы Actinomyces fradiae, разновидность – 96, B. subtilis, разновидность – 99, Candida krusei разновидность – 96;
2006;
2009. После изучения свойств культур, паспортизации и депонирования они получили статус штаммов.
Штамм микроорганизма Actinomyces fradiae-96, представитель семейства Actinomycetaceae, рода Actinomyces.
Штамм микроорганизма Bacillus subtilis-99, представитель семейства и ро да Bacillus.
Штамм микроорганизма Candida krusei -96, представитель рода Candida.
Actinomyces fradiae-96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 поддержи ваются в секторе по производству ветпрепаратов отдела токсикологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань).
Изучение биологических свойств Actinomyces fradiae, Bacillus subtilis- и Candida krusei включало определение морфологических, физиологических и па тогенных свойств.
В мазках из агаровых или бульонных культур Actinomyces fradiae пред ставляет собой грамположительные микромицеты, длиной 6,0±0,4 мкм и шири ной 4,0±0,5 мкм, располагающимися поодиночке, парами, короткими и длин ными цепочками.
Bacillus subtilis- в препарате из агаровых или бульонных культур округлые, грамположительные спорообразующие палочки, размерами: 5,0±0, мкм и 5,0±0,1 мкм. В мазках клетки располагаются по отдельности изолировано или скоплениями в виде коротких цепочек.
Candida krusei на агаровых и бульонных культурах представляет собой округлые, грамположительные дрожжевые клетки, размерами: 4,0 ± 0,17 мкм и 5,0 ± 0,3 мкм. В мазках клетки располагаются по отдельности изолировано или скоплениями в виде цепочек.
При исследовании морфологических свойств штамма Actinomyces fradiae на сусло–агаре отмечено образование мелких (1-2 мм), кремоватого цвета, вы пуклых, вязкой консистенции, мутных колоний с гладкой поверхностью и ров ными краями (S-формы колоний). В жидкой питательной среде (МПБ) рост Ac tinomyces fradiae характеризовался помутнением, с формированием слизистой пленки, легко разбивающейся при встряхивании.
На сусло-агаре рост клеток Bacillus subtilis-99 характеризовался образованием пленки на питательной среде, округлой формы колоний, мутных, кремового цвета, с ровными краями. Клетки вызывали помутнение МПБ, с формированием слизистой пленки и хлопьев, разбивающиеся при встряхивании.
На твердой среде (МПА) образует плоские, непрозрачные блестящие колонии бежевого цвета с неровными краями в диаметре около 2-3 мм.
На сусло-агаре рост дрожжевых клеток Candida krusei характеризовался образованием мелких (1 мм), округлой формы колоний, мутных, кремового цвета, с ровными краями и вязкой консистенции. Дрожжевые клетки вызывали помутнение МПБ, с формированием слизистой пленки и хлопьев, разбивающиеся при встряхивании.
В результате проведенных исследований было установлено, что сахаролитическая активность Actinomyces fradiae хорошо выражена: на средах Гисса интенсивно ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, дульцит, лактозу;
а с образованием кислоты и газа - мальтозу. Bacillus subtilis-99 на средах Гисса ферментирует мальтозу с образованием кислоты и газа. С образованием только кислоты расщепляет глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, сорбит, дульцит, лактозу, амилазу.
Исследуемые штаммы обладают протеолитической активностью, об этом свидетельствует разжижение всего столбика желатина, находящегося в пробирке.
Actinomyces fradiae–96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 обладают каталазной и уреазной активностью. Не образуют индол и сероводород.
При нанесении на поверхность агара раствора Люголя наблюдалось образование бесцветной зоны вдоль штриха, образующейся в результате расщепления крахмала, что позволяет сделать вывод о том, что исследуемые штаммы обладают амилолитической активностью.
Actinomyces fradiae–96, Bacillus subtilis-99 и Candida krusei-96 не патоген ны для животных. Исследуемые штаммы не вызывали гибели белых мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении взвеси культуральной массы в объеме 0,5 см3, с содержанием в 1 см3 50, 100, 250, 500 млн., 1 и 2 млрд. мкр.
клеток. При вскрытии вынужденно убитых животных видимых изменений во внутренних органах не наблюдалось. Из тканей внутренних органов убитых животных исходная культура не выделялась.
Штаммы паспортизированы как:
1. Actinomyces fradiae-96-ВГНКИ 04.05.17.-ДЕП, депонирован 10.08. во «Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Справка о депонировании штамма выдана за № 2395/20 от 23.09.2004.
2. Bacillus subtilis-99 –ДЕП и депонирован 22.09.2004 и во ФГБУ «ФЦТРБ ВНИВИ» под № 2/04.
3. Candida krusei-96 – ВГНКИ 04.05.18.-ДЕП и депонирован 23.09.2004 во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» (ФГУ ВГНКИ). Справка о депонировании штамма выдана за № 2396/20 от 23.09.2004.
3.2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ БЕЗОПАСНОСТИ УСКОРИТЕЛЯ ФЕРМЕНТАЦИИ «ЭКОС»
3.2.1 Острая и субхроническая токсичность ускорителя ферментации Острую токсичность ускорителя ферментации изучали в опытах на 50 бе лых мышах (массой 18-20 г) и 40 крысах (массой 150-160 г) обоего пола, разде ленных по принципу аналогов на опытные и контрольные группы.
Животным опытных групп однократно внутрижелудочно вводили ускори тель ферментации дозе 0,5 см3 для белых мышей и 5 см3 для крыс. Препарат вводили как в нативном состоянии (1 группа), так и в рабочем растворе, то есть раствор ускорителя ферментации в концентрации 1:1000 (2 группа). При этом содержание микробных клеток в 1 см3 ускорителя ферментации составило млн. микр. клеток, раствора – 250 тыс. микр. клеток. Таким образом, мышам вводили в концентрации 100 млн. микр. клеток (препарат) и 100 тыс. микр. кле ток (раствор), крысам соответственно 1 млрд. микр. клеток и 1 млн. микр. кле ток в см3. Животным контрольных групп в аналогичном объеме вводили фи зиологический раствор.
Проведенные опыты показали, что однократное внутрижелудочное введе ние препарата не вызывало гибели животных и существенных отклонений от нормального физиологического состояния. Поскольку дозы 0,5 и 5 см3 являют ся максимально вводимыми при внутреннем введении соответственно белым мышам и белым крысам, то большие дозы ускорителя ферментации не вводили.
Вследствие этого ЛД50 препарата установить не удалось.
Субхроническую токсичность ускорителя ферментации оценивали на белых крысах обоего пола с начальной массой 150-160 г., разделенных по принципу аналогов на 3 группы по 10 голов в каждой. Подопытным животным ускоритель ферментации вводили внутрижелудочно в нативном виде (1 группа) и в рабочем растворе (2 группа). В связи с невозможностью определения ЛД50, первоначально вводимая доза в первые 4 сут составила 0,5 см3, то есть 1/10 от максимальной вводимой. В последующие 4 сут дозу увеличивали в 1,5 раза, что составило 0,75 см3;
спустя 4 сут предыдущую дозу вновь увеличивали в 1,5 раза (1,5см3) и так до окончания эксперимента (24 сут).
Контрольным животным по аналогичной схеме вводили физиологический раствор. Таким образом, суммарная вводимая доза в первые 4 сут составила см3, последующие – 3;
4,5;
6,8;
10 и 15,2 см3, соответственно. Суммарно вводи мая доза в течение всего периода эксперимента составила 41,5 см. Ежедневное внутрижелудочное введение препарата не вызвало гибели жи вотных опытных групп и существенных отклонений от нормального состояния.
Животные всех групп сохраняли удовлетворительный аппетит, имели гладкий и чистый шерстный покров.
В течение эксперимента у животных всех групп наблюдалось постепенное увеличение массы тела. Так, при многократном введении как нативного уско рителя ферментации, так и раствора в концентрации 1:1000 в возрастающих до зах у животных 1 и 2 группы на 10 сут отмечалось увеличение живой массы в среднем на 13,9 (Р0,001) и 11,7 % (Р0,05) соответственно. На 20 сут опыта прирост массы тела у животных этих групп составил соответственно 23, (Р0,001) и 22,0 %. В конце опыта (на 24 сут) живая масса подопытных крыс увеличилась в среднем на 28,4%(Р0,01) и 33,8% (Р0,001).
У контрольных животных отмечался более низкий прирост массы тела, ко торый составил на 10 сут – 10,1, на 20 сут – 20,2 и на 24 сут – 25,7% соответст венно.
Гематологические и биохимические показатели крови крыс при много кратном введении ускорителя ферментации находились в пределах физиологи ческой нормы.
Однократное и многократное внутрижелудочное введение ускорителя ферментации как в рабочем растворе, так и в нативном состоянии не вызывает гибели лабораторных животных. Данное обстоятельство не позволило опреде лить ЛД50 и рассчитать коэффициент кумуляции по показателю «смертельный эффект». Однако, можно предположить, что коэффициент кумуляции (отноше ние максимально вводимой дозы при многократном введении на максимально вводимую дозу при однократном введении) составляет 8,3 и по классификации Медведь Л.И. (1986) ускоритель ферментации можно отнести к веществам не обладающим кумулятивным действием.
3.2.2 Изучение хронической токсичности ускорителя ферментации «Экос» на белых крысах Длительное действие препарата, а также влияние его на энергию роста, ге матологические и биохимические показатели крови изучали в опытах на белых крысах, разделенных на 4 группы, по 10 животных в каждой. Крысы 1 группы в течение 3 мес получали вместо питьевой воды 16%-ный водный раствор уско рителя ферментации, 2 группы – 8% раствор ускорителя ферментации, 3 груп пы – 4%-ный раствор ускорителя ферментации. Содержание микробных тел со ставило в 1 см3 данного раствора соответственно 32, 16 и 8 млн. микр. клеток.
Контрольная (4) группа крыс по аналогичной схеме получала физиологи ческий раствор.
Крысы первой опытной группы по сравнению с контролем быстрее наби рали в весе. Так, через 1,2 и 3 мес прирост живой массы составил 88;
84,8 и 21,4%, тогда как в контроле – 81,1;
69,9 и 18,3% соответственно.
Проведенные исследования крови показали, что существенной разницы у крыс контрольной и опытных групп в гематологических и биохимических по казателях не обнаружено.
При диагностическом вскрытии изменений в органах сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и мочевыводящих путей не обнаружено.
При микробиологическом исследовании печени, почек, желудка, сердца и селезенки исходные культуры ускорителя ферментации не выделены.
Таким образом, в острых и хронических экспериментах на лабораторных животных установлена безвредность ускорителя ферментации «Экос» и соглас но гигиенической классификации он относится к малотоксичным препаратам, по ГОСТ – 4-му классу – вещества малоопасные. Полученные данные позволя ют отнести ускоритель ферментации к безвредным препаратам, не обладающим кумулятивным действием.
Многократное внутрижелудочное введение ускорителя ферментации не оказывало отрицательного влияния на функциональное состояние центральной нервной системы, на антитоксическую функцию печени и на поведенческие ре акции животных. Так, при рассмотрении показателей двигательной активности число пересечений в опытной и контрольной группах было 38,2±1,1 и 37,4±0, (Р0,05). Исследовательская активность у подопытных животных составила 9,8±0,30 и 8,5±0,57 (Р0,05) заглядываний.
Тест учета длительности восстановления способности к прямолинейному движению после вращения демонстрирует эффективность ускорителя фермен тации «Экос» повышать адаптацию вестибулярного аппарата к перегрузкам и увеличение статической физической выносливости. Так, длительность висения мышей опытной группы составила 25,8±0,5, а в контроле 21,6±0,5 минут.
Ускоритель ферментации «Экос» достоверно увеличивает время жизни мышей, при этом стабилизировались показатели перекисного окисления липидов (снижались уровни малонового диальдегида и гидроперекисей липидов мозга) и восстанавливалась антиокислительная (каталазная) активность, что свидетельст вует об увеличении резервной антиокислительной активности мозга.
Проведенные исследования показали, что ежедневное употребление мы шами обработанной ускорителем ферментации «Экос» воды в течение месяца увеличивает адаптационные возможности организма, в том числе способность к антирадикальной защите.
На моделях фармакологических (гексенал) и физиологических нагрузок (радикальное ускорение, статико-силовая выносливость, динамическая работа – плавание с грузом) были продемонстрированы общие адаптогенные свойства воды: активация центральной нервной системы, улучшение вегетомоторной и психомоторной саморегуляции, увеличение физической выносливости и рабо тоспособности экспериментальных животных.
Статистически достоверной разницы в продолжительности и характере гексеналового сна опытных и контрольных животных не обнаружено, что сви детельствует о достоверном наличии у ускорителя ферментации «Экос» анти наркозного действия (длительность гексеналового сна сократилась), т.е. препа рат повышает детоксицирующую функцию печени (она быстрее обезвреживает гексенал).
Многократное введение ускорителя ферментации не оказывало отрица тельного влияния на функциональное состояние печени. В сыворотке крови контрольных и опытных животных достоверных изменений АсАТ и АлАТ не наблюдалось.
3.2.3 Изучение раздражающего и аллергезирующего действия ускорителя ферментации «Экос»
Местно-раздражающее действие ускорителя ферментации на кожу изучали в опытах на 4-х кроликах породы «Шиншилла» и 4-х морских свинках. За день до проведения эксперимента у животных на симметричных участках спины по обе стороны от позвоночника тщательно выстригали шерсть размером 6х6 см у кроликов и 2х2 см - у морских свинок.
На кожу правого бока животного шпателем наносили ускоритель фермен тации «Экос», участок кожи левого бока служил контролем – наносили физио логический раствор. Реакцию кожи регистрировали и оценивали с симметрич ным участком кожи того же животного через 1 и 16 часов.
Функциональное нарушение кожи определяли с учетом появления эрите мы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры кожи или отсутствия таковых.
В течение всего периода наблюдения, каких-либо функциональных нару шений кожи не наблюдалось.
В следующей серии опытов в конъюнктивальный мешок правого глаза 4-х кроликов глазной пипеткой закапывали по 2 капли ускорителя ферментации.
Левый глаз служил контролем, куда в том же объеме закапывали физиоло гический раствор. После внесения препарата и физиологического раствора на мин прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза. Наблюдение за состоянием слизистой оболочки и прозрачности роговицы проводили в течение недели.
После нанесения на слизистую оболочку глаза ускорителя ферментации и физиологического раствора у животных наблюдалось незначительное слезоте чение, исчезающее через несколько минут. В дальнейшем каких–либо призна ков раздражения слизистой оболочки глаз, выражающегося в инъецировании сосудов конъюнктивы и гиперемии, не отмечалось, что свидетельствует об от сутствии у препарата раздражающих свойств.
Для выявления аллергенных свойств ускорителя ферментации проводили внутрикожную сенсибилизацию морских свинок массой 250-300 г., разделен ных на 2 опытные и контрольную группы по 4 животных в каждой. Подопыт ным морским свинкам однократно внутрикожно вводили ускоритель фермен тации в дозе 0,02 мл (1-я опытная группа) и 0,1 мл (2-я опытная группа). Кон трольным животным вводили в том же объеме стерильный физиологический раствор.
Выявление сенсибилизации проводили через 8 дней, используя специфи ческий аллерготест с клетками крови животных – реакцию специфического ли зиса лейкоцитов (РСЛЛ).
Реакцию расценивали как положительную при лизисе лейкоцитов более 10%.
На протяжении всего опыта, видимых кожных изменений на месте введе ния препарата не отмечалось.
Показатели РСЛЛ у животных 1-ой опытной группы составили 4,5±0,4 %, у 2-ой - 12,4±0,5 %. В то время как у интактных животных увеличения лизиса лейкоцитов не отмечалось, РСЛЛ составила 4,8±0,3%.
Положительная РСЛЛ, обнаруженная только у животных 2 опытной груп пы, при отрицательной кожной пробе, свидетельствует о слабо выраженной ал лергической реакции ускорителя ферментации «Экос».
3.2.4 Изучение канцерогенных свойств, эмбриотоксического и тератогенного действий ускорителя ферментации «Экос»
Канцерогенные свойства ускорителя ферментации выясняли в опытах на белых крысах (n=40) и кроликах (n=10), разделенных на опытные и контроль ные группы. Подопытным животным 3 раза в неделю, в течение 6 мес, на вы стриженный участок кожи (кроликам на кожу уха) наносили ускоритель фер ментации, в объеме 0,5 мл. Контрольным животным по аналогичной схеме на носили физиологический раствор. В течение всего периода исследований про водили наблюдение за общим клиническим состоянием животных, контролиро вали прирост массы тела, осуществляли патологоанатомическое вскрытие пав ших животных.
В результате проведенных исследований обнаружено, что многократное накожное нанесение ускорителя ферментации не оказывало отрицательного влияния на общее состояние подопытных животных, изменений кожи на месте нанесения препарата не выявлено, опухолевидных образований на коже и дру гих структурах организма не отмечалось.
За время экспериментов как в контрольной, так и опытной группе белых крыс отмечался падеж. Однако, гибель отдельных животных являлось естест венным отходом и не выходила за допустимые при этом границы.
Достоверной разницы в показателях прироста массы тела подопытных бе лых крыс не обнаружено. Гематологические показатели крови кроликов как контрольной, так и опытной групп находились в пределах физиологической нормы. При диагностическом вскрытии вынужденно убитых животных патоло гоанатомические изменения во внутренних органах не обнаруживались.
С целью определения последствий действия ускорителя ферментации на организм потомства нами было проведено изучение эмбриотоксических и тера тогенных свойств.
Опыты проводили на 20 самках белых крыс половозрелого возраста живой массы 180-200 г, разделенных по принципу аналогов на 2 равные группы (кон трольная и опытная). После установления беременности, по влагалищной сли зи, крысам опытной группы вводили ускоритель ферментации в дозе 0,5 см3 с по 19 дни беременности. Доза была взята из расчета 1/10 от максимально вво димой. Крысам контрольной группы по аналогичной схеме вводили физиоло гический раствор.
В результате проведенных исследований было обнаружено, что ускоритель ферментации не оказывает отрицательного влияния на массу тела и продолжи тельность беременности самок.
На 20-е сут по 5 животных из обеих групп были умерщвлены декапитаци ей для проведения исследований эмбрионального материала.
Исследования показали, что введение ускорителя ферментации беремен ным самкам не вызвало увеличения предимплантационной и постимплантаци онной гибели эмбрионов, общей эмбриональной смертности, данные показате ли у животных опытных и контрольных групп не имели существенной разницы и находились в пределах физиологических норм.
При внешнем осмотре извлеченных из матки плодов видимых морфологи ческих изменений не наблюдалось, аномалий развития не выявлено.
Для выявления нарушений постнатального периода развития, крысят как опытной, так и контрольной групп каждые 10 сут взвешивали, регистрировали сроки отлипания ушей, появления шерстного покрова, прозрения и прорезыва ния резцов. В результате проведенных исследований установлено, что сущест венных различий в показателях прироста массы тела и развития крысят, кон трольных и опытных групп не отмечалось.
3.3 ТЕХНОЛОГИЯ ОБЕЗВРЕЖИВАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ УСКОРИТЕЛЯ ФЕРМЕНТАЦИИ «ЭКОС» НА ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ С целью определения антагонистического действия ускорителя фермента ции, и сроков гибели патогенных микроорганизмов провели серию модельных опытов. Для этого в аквариумы размером 40х20х10 см помещали пробы орга нического субстрата и контаминировали взвесью суточных культур музейных штаммов микроорганизмов Escherichia coli 0126 и Salmonella typhiуmurium из коллекции ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В начале опытов и через каждые 5 сут, проводили определение количества данных микроорганизмов, используя метод последовательных разведений в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида с последующим посевом каждого разведения на дифференциальные среды. Подсчет выросших колоний с пересчетом их титра в 1 г фекалий прово дили после культивирования посевов в термостате в течение 24-72 ч при темпе ратуре 370С. Для индикации Е.coli был использован агар Эндо, сальмонелл – висмут-сульфит агар, с последующей микроскопией выросших колоний.
Антагонистическое действие ускорителя ферментации изучали в различ ных модификациях. Ставили опытные и контрольные пробы. В опытных про бах к органическому субстрату добавляли по 0,005;
0,01 и 0,02 мл/кг ускорите ля ферментации (соответственно 1, 2 и 3 проба). Указанные дозы препарата разводили в воде в концентрации 1:1000. Таким образом, в 1-ую пробу (на кг субстрата) вносили ускоритель ферментации в концентрации 1 тыс. микр.
кл./кг, во 2-ую - 2 тыс. микр. кл./кг, и в 3-тью - 4 тыс. микр. кл./кг субстрата.
Контрольные пробы (4 проба) были без добавления ускорителя ферментации.
3.3.1 Обеззараживающее действие ускорителя ферментации «Экос»
в отношении Escherichia coli Первоначальное содержание E. coli в 1 г навоза составило в 1 образце 1020±8,4 (10,2х108);
во 2-ом - 1010±0,1 (10,3х108);
в 3-ем - 1200±9,0 (12х108), а в 4-ой пробе (контроль) - 1025±0,17 (10,25х108) млн. микр. клеток.
Эффект был получен при добавлении к субстрату ускорителя ферментации в концентрации 4 тыс. микр.кл./кг, содержание E. coli в данном случае на 20 сут в 1 г объекта составило в 1-ой пробе - 0,010±0,005 (1,0х104), во 2-ой 0,005±0,0014 (5,0х103) и в 3-ей - 0,0001±0,00008 (1,0х102) млн. микр. клеток.
(Р0,001). На 25 сут содержание E. coli в 1 г навоза составило в 1-ой пробе 0,0020±1,0001 (2,0х102), во 2-ой - 0,0002±1,00001 (2х102) млн. микр. клеток (Р0,001). В то время как в контрольных пробах содержание E. coli на 20 сут снизилось лишь на 1-2 порядка от 15,7±0,16 х108 до 4,8±0,5 х106 КОЕ/г суб страта. Через 25 сут в 1 пробе наблюдалось полное обеззараживание субстра тов. Полное обеззараживание субстрата 2 и 3 проб наблюдалось на 30 сут опы та. Тогда как в контроле, содержание E. coli в 1 г субстрата на 30 сут опыта со ставило 4,20±0,6 млн. микр. клеток.
3.3.2 Обеззараживающее действие ускорителя ферментации в отношении Salmonella typhimurium При изучении динамики изменения количества Sal. typhimurium в обрабо танном препаратом – ускорителем ферментации «Экос» органическом субстра те установлено значительное снижение уровня микробной контаминации на 10 15 сутки.
Наиболее эффективной оказалась концентрация ускорителя ферментации – 4 тыс. микр. кл./кг субстрата. Через 20 сут после обработки навоза ускорителем ферментации в объеме 0,02 мл наблюдалось полное его обеззараживание. В 1 ой и 2-ой пробе содержание сальмонелл снизилось в среднем на 5-7 порядков, от нескольких миллионов до несколько тысяч в 1 пробе и несколько сотен - во второй. Полное обеззараживание субстрата 2-ой и 3-ей пробы наблюдалось со ответственно на 30 и 25 сутки. Содержание Sal. typhimurium в контрольных об разцах также изменялось: от нескольких миллионов в начале опыта и до не скольких тысяч на 30 сут, но в опасных для человека, животных и окружающей среды концентрациях.
3.4 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ УСКОРИТЕЛЯ ФЕРМЕНТАЦИИ «ЭКОС»
В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ Оценку эффективности ускорителя ферментации проводили сначала на модельных опытах, для этого пластиковые емкости (ведерко) объемом 0,5 л и 10 л заполняли свежим куриным пометом, свиным навозом и навозом от круп ного рогатого скота, в пяти повторностях.
Результаты исследования показывают, что дозы препарата 0,01-0,1 см3 на кг массы органических отходов животного происхождения в модельных опытах обеспечивают ускорение процесса созревания компоста, получение органиче ского удобрения. Доза 0,1 см3 более эффективна при обработке органических, животноводческих отходов в условиях лаборатории.
Провели опыты и по обработке ускорителем ферментации «Экос» аквари умной воды. До опыта вода в течение 2-3 мес оставалась застойной и заросла растениями, тиной, из емкостей шел неприятный запах, вода «цвела». Емкость аквариумов составляла по 12 л, в каждый аквариум добавляли по 1 см3 препа рата «Экос», с содержанием 1 млрд.микр. клеток в 1 см3.
Исследования проб, отобранных из аквариумов до внесения препарата «Экос», показало несоответствие по большинству органолептических, физико химических и санитарно-гигиенических показателей. Вода представляла собой жидкость от темно-серого до бурого цвета, с иловым и хлопьевидным осадком и резким специфическим, тинным, затхлым запахом. Запах при разбавлении 200 раз составил 2 балла, отмечалось превышение нормативов по окраске воды, высокие показатели перманганатной окисляемости.
В необработанной воде выявлялось высокое содержание аммиака и БПК, что свидетельствует о наличии в ней органических отходов, на окисление кото рых расход кислорода, растворенного в воде, значительно увеличивается.
Исследования санитарно-бактериологического состояния образцов аквари умных вод, отобранных из различных аквариумов, показало высокую степень микробной контаминации. Так, количество термотолерантных и общих коли форменных бактерий составило соответственно 11,4;
10,4 lg КОЕ/100 мл, при норме СанПин 2.15.980-00, не более 2,7 и 2 lg КОЕ/100 мл. Общая микробная обсемененность вод составила 7,0 lg КОЕ/100 мл, сальмонеллы, ооцисты про стейших не обнаруживались.
На 30 сут отмечалось восстановление органолептических показателей: во да прозрачная, без плавающих примесей, на дне небольшой осадок сероватого цвета, запах - 1 балл.
Содержание химических веществ было в количествах, свойственных для водопроводной питьевой воды. Показатели БПК и ХПК, содержание аммиака соответствовали нормативным требованиям.
Активная кислотность воды составила 6,9 ед., общая микробная обсеме ненность соответствовала нормам – 1,5 lg КОЕ/100 мл.
Анализ проведенных исследований свидетельствует об эффективности ис пользования ускорителя ферментации для очистки загрязненной органически ми отходами воды, что дает перспективу для применения препарата для обез вреживания и очистки воды в водоемах и стоках различных предприятий.
3.5 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА УСКОРИТЕЛЯ ФЕРМЕНТАЦИИ «ЭКОС»
Согласно требованиям, контроль качества препарата производился по сле дующим показателям: определение внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, концентрации Actinomyces fradiae-96, Bacillus subtlis-99, контамина цию посторонней микрофлорой, безвредности для животных (ранее эти показа тели оценивались для препарата ускорителя ферментации УФ-1 (Матросова Л.Е., 2005)).
Ускоритель ферментации представляет собой прозрачную светло-желтого цвета жидкость со специфическим запахом. Допускается содержание осадка, легко разбивающегося при встряхивании. В препарате не допускается наличие посторонних примесей и контаминация посторонней микрофлорой более тыс. микроорганизмов в 1мл. В 1 мл препарата должно содержаться не менее 200 млн. микр. кл. Actinomyces fradiae и Bacillus subtilis. Ускоритель фермента ции безвреден для животных. Внутрибрюшинное введение белым мышам по 0,5 см3 ускорителя ферментации не вызывает гибели и видимых отклонений от нормального состояния.
Наиболее оптимальным является хранение препарата при температуре 40С и в лиофильно высушенном виде.
Наиболее стабильные результаты получены при хранении препарата в па токе, в которой его активность сохранялась в течение 12 месяцев. Срок хране ния ускорителя ферментации в физиологическом растворе и фосфатном буфере примерно равен 6-8 мес, наиболее стабилен препарат при температуре +4 +60С.
Поэтому для экстренного использования препарата рекомендовано его из готовление на физиологическом растворе, для хранения – в патоке.
Концентрация компонентов консорциума в препарате не влияют на сроки его хранения.
3.6 ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ УСКОРИТЕЛЕЙ ФЕРМЕНТАЦИИ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ Производственные опыты по изучению эффективности переработки сви ного навоза препаратом «Экос» проведены в условиях агрофирмы «Нур», «Аш Бузи», СХП им. Вахитова Кукморского района и СХП «Коммуна», «Искра» Бу инского района РТ. Для этих целей, на твердую площадку закладывали свиной навоз (высотой примерно 1 м). Поверхность субстрата равномерно поливали ускорителем ферментации «Экос» в дозе 1 млрд. микр. клеток, см3, разведен ным в воде в концентрации 1:1000. На обработанную поверхность вновь закла дывали субстрат (примерно 0,8-1,0 м) и повторяли процедуру полива. Испыты вали различные дозы препарата. Ставили 3 опытные пробы и 1 контрольную пробу. Объем заложенных буртов составил от 500 до 1000,0 тонн. Аналогичная схема применялась и при обработке свиного навоза ускорителем ферментации «УФ-1».
В 1 опытную пробу вносили ускоритель ферментации в дозе 1 млрд. микр.
клеток в см3, во 2 - в количестве 2 млрд. микр. клеток в см3 и в 3 - 3 млрд. микр.
клеток в см3. Поверхность контрольной пробы поливали в том же объеме во дой, в которую добавляли соответствующую дозу физиологического раствора.
До и после обработки навозных масс, отбирали пробы как с поверхности, так и с глубины для проведения копрологических и микробио-логических исследова ний. Каждые 10 сут навозную массу перемешивали бульдозером.
В СЗАО «СКВО» Зерноградского района Ростовской области проведены опыты по утилизации жидкого навоза крупного рогатого скота, содержащегося в лагунах, объемом 4500 м3. С помощью разбрызгивателя в лагуны вносили ус коритель ферментации «Экос», предварительно разведенный до рабочего рас твора, из расчета 2 млрд. микр. клеток см3. По той же схеме проводили и обра ботку навоза ускорителем ферментации УФ-1.
Проведены также опыты по переработке птичьего помета на птицефабри ках РТ: «Ак Барс Пестрецы», «Юбилейная», «Ключинская», «Казанская» и «Набережно-Челнинская». Технологический процесс переработки птичьего по мета аналогичный. Результаты органолептических и физико-химических иссле дований представлены в табл. 1 и 2.
В результате проведенных исследований установлено, что обработка поме та птиц, навоза крупного рогатого скота и свиней ускорителями ферментации «Экос» и «УФ-1» в течение 30 сут способствует получению экологически чис того удобрения. Так, массовая доля влаги во всех обработанных образцах сни зилась в птичьем помете при обработке препаратом «Экос» на 66,1%, «УФ-1» – 63,4%, в свином и полученном от крупного рогатого скота навозе – на 66,1;
54,8% и 53,0;
52,5% соответственно. В то время как в контрольных образцах это снижение было менее выражено и составило 19,0;
27,6;
26,9 и 36,9;
24,8;
15,6% соответственно.
Таблица 1 – Органолептические и физико-химические показатели удобре ния из куриного помета, обработанного ускорителем ферментации «Экос»
Показатель Исходные Опыт Контроль данные через 30 через суток суток Внешний вид, запах Темно- Темно- Темно коричневая коричневая коричневая масса, с рез- масса, без масса, с ха ким характер- характерного рактерным ным запахом запаха запахом Массовая доля влаги, % 78,8±0,6 26,7±3,0 52,6±2, Содержание общего азота, % 5,9±0,3 5,3±0,4 3,8±0, Содержание общего фосфора, % 4,4±0,4 4,1±0,3 3,5±0, Содержание общего калия, % 1,9±0,1 1,8±0,1 1,5±0, Зольность, % 20,1±1,0 20,8±2, 22,2±1, Кислотность, рН 8,9±0,1 8,4±0,1 8,5±0, Содержание солей тяжелых металлов, мг/кг:
- медь 5,0±0, 5,1±0,26 5,1±0, - цинк 122,0±8,0 101,0±5,7 120,0±7, - свинец 1,3±0,01 1,3±0,03 1,3±0, - кадмий 0,06±0,006 0,05±0,006 0,06±0, - ртуть 0,002±0,0002 0,001±0,0001 0,002±0, Содержание остаточного количест ва пестицидов, мг/кг:
- байлетон не обнар. не обнар. не обнар.
- арцерид не обнар. не обнар. не обнар.
Радионуклиды на удобрение, Бк/кг:
- цезий 137 3,2 3,2 3, - стронций 90 1,3 1,3 1, 8 2,2±0,2х Микробиологические показатели 3,5±0,3х10 1,0±0,2х Патогенные микроорганизмы 1 г 10,5±0,2х108 1,7±0,5х навоза, E.coli При обработке помета и навоза ускорителями ферментации во всех ис следуемых образцах патогенная микрофлора, в том числе группы кишечной па лочки, а также яйца гельминтов обнаружены не были, при наличии их в исход ном и контрольном субстрате. По всем исследуемым показателям, полученное в результате обработки ускорителями ферментации, удобрение соответствует ус тановленным нормам.
В связи с тем, что сточные воды различных предприятий представляют значительную экологическую опасность, возникла необходимость их очистки и обезвреживания. Были проведены эксперименты по испытанию препарата ус корителя ферментации «Экос» для обработки сточных вод, с целью снижения их негативного воздействия на окружающую среду.
Таблица 2 – Органолептические и физико-химические показатели удобре ния из куриного помета, обработанного ускорителем ферментации УФ- Показатель Исходные Опыт Контроль данные через 30 сут через 30 сут Внешний вид, запах Темно- Темно- Темно коричневая коричневая коричневая масса, с рез- масса, без ха- масса, с ха ким характер- рактерного рактерным ным запахом запаха запахом Массовая доля влаги, % 78,8±0,6 49,7±3, 28,8±2, Содержание общего азота, % 5,9±0,3 4,9±0,3 3,5±0, Содержание общего фосфора, % 4,4±2,1 4,0±0,3 3,8±0, Содержание общего калия, % 1,90±0,1 1,95±0,2 1,5±0, Зольность, % 22,2±4,4 20,8±1,1 21,9±3, Кислотность, рН 8,3±0, 8,9 8,6±0, Содержание солей тяжелых металлов, мг/кг:
- медь 5,05±0,26 5,05±0,3 5,05±0, - цинк 100,0±8,6 100,0±3,5 115,6±3, - свинец 1,3±0,04 1,3±0,01 1,3±0, - кадмий 0,06±0,003 0,05±0,004 0,06±0, - ртуть 0,002±0,0001 0,002±0,0002 0,002±0, Содержание остаточного количе ства пестицидов, мг/кг:
- байлетон не обнар. не обнар. не обнар.
- арцерид не обнар. не обнар. не обнар.
Радионуклиды на удобрение, Бк/кг:
- цезий 137 3,2 3,2 3, - стронций 90 1,3 1,3 1, 8 1,8±0,1х Микробиологические показатели 3,3±0,2х10 1,1±0,1х Патогенные микроорганизмы 10,2±0,1х108 1,8±0,2х 1 г навоза, E.coli р0,05;
р0,01.
На первом этапе работы обработали сточные воды, отобранные из очист ных сооружений г. Калуги, а также Шеморданского мясокомбината, г. Арска и г. Лениногорска РТ.
До обработки препаратом сточные воды по всем показателям не соответст вовали существующим требованиям. На 30 сут после обработки происходили позитивные сдвиги по всем изучаемым показателям. Например, запах стано вился слабым, рН – ближе к нейтральной, показатели цветности уменьшились в 2, мутность – в 7, окраски – в 12, перманганатной окисляемости – в 13, хлори дов – в 2, сульфатов – в 5, нитратов – в 9, нитритов – в 2, ионов аммония – в 15, общей щелочности – в 2,2, фосфатов – в 2 раза, показатель бихроматной окис ляемости (БПК5) уменьшился в 16 раз, стабильность возросла в 1,7 раза, что свидетельствует о значительных положительных сдвигах в очистке сточных вод.
В рамках производственных испытаний провели исследования артезиан ской воды, отобранной из ООО АФ «Сарсазы» Чистопольского района РТ, до и после обработки ускорителем ферментации «Экос», доза препарата составила 0,1 см3 на 1 литр.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что артезианская вода по сле обработки ее ускорителем ферментации соответствует требованиям нормы по всем исследованным показателям, ее можно без ограничений использовать для питьевой цели. Органолептические показатели (вкус, запах, цветность, мутность) значительно улучшились, особенно цветность - на 87,6%, мутность – на 77%. Жесткость, содержание кальция, магния, остаточной активности хлора, нитратов, фторидов, показателя общей минерализации не изменялись, остава лись в пределах нормы. Величина щелочности, хлоридов, аммиака и ионов ам мония, нитратов, рН, сульфатов, фосфатов и перманганатной окисляемости имели тенденцию к снижению на 3,0-15,0% в зависимости от показателя.
По микробиологическим показателям вода соответствует требованиям ГОСТ.
В рамках работы проведены опыты по оценке качества водопроводной (хлорированной) воды из водосети г. Казани (n=5) до и после обработки уско рителем ферментации «Экос».
Установлено, что после обработки воды препаратом «Экос» происходили положительные сдвиги органических показателей (запах, привкус, мутность, цветность) в сторону уменьшения этих величин. Показатели мутности и цвет ности уменьшились на 35,5 и 21,7%, до допустимого уровня величины, запаха и привкуса – на 25%, но оставались несколько выше нормы. Водородный показа тель характеризует нейтральную реакцию, в обработанной воде снизился – на 1,3%.
Величины общей минерализации (сухой остаток), общей жесткости, со держание магния, бора, железа, кадмия, марганца, меди, молибдена, мышьяка, никеля, ртути, свинца, селена, хрома, цинка, аммиака не превышают нормы.
Содержание аммиака, аммоний-иона и сульфатов уменьшилось на 0,9 и 11,2%.
Количество фенолов после обработки уменьшилось в 26,6 раза, нефтепро дуктов – в 2 раза, полифосфатов – в 1,7 раза. Показатель нормативной окисляе мости не изменился и был в пределах нормы.
По большинству исследуемых показателей обработанная вода соответст вовала допустимым СанПин уровням, при превышении их в исходе. Так, до об работки такие показатели как запах и вкус, превышали установленные нормы на 50%, а мутность на 30%, а после обработки эти показатели значительно сни зились и находились на верхней границе норм.
Кроме того, обработка хлорированной воды ускорителем ферментации «Экос» позволила снизить ее общую жесткость на 26,6% от исходных данных.
Такие показатели как общая минерализация, перманганатная окисляе мость, количество нефтепродуктов и фенолов в обработанной воде также сни жалась на 37,7;
9,1;
40 и 93,3% соответственно.
Проведено исследование проб воды из Юдинского озера РТ, загрязненной сточными водами близрасположенной птицефабрики до и после обработки препаратом «Экос», однократно в дозе 3 млрд. микр. клеток в см3, опыт длил ся в течение 30 суток. Результаты органолептических и физико-химических ис следований воды представлены в табл. 3.
Таблица 3 – Результаты исследования проб воды из Юдинского озера РТ, обработанных ускорителем ферментации «Экос»
Показатель Норма Результаты анализа ПДК До обработки После обработки 2 б при разбав- 2 б при разбав Запах при 200С, балл лении 20 раз лении 10 раз Водородный показатель рН, ед 7,42±0,2 6,82±0, 6,5-8, Цветность, град 1530,2±21,1 38,0±7, 20- Мутность, ЕМФ 102,5±3,8 4,0±0, 2,6-3, Окраска, кратность разбавления 20 раз светло 10 раз серый светлый Перманганатная ок-ть, мг О2//дм 968,0±15,3 10,2±0, 5- Хлориды, мг/дм 250,0±12,7 75,0±2, Фториды, мг/дм 0,5±0,1 0,4±0, 1, Сульфаты, мг/дм 580,0±10,1 106,4±7, Нитраты, мг/дм 92,6±5,5 35,5±5, Нитриты, мг/дм 0,16±0,01 0,05±0, 0, Ионы аммония, мг/дм 320,0±8,2 1,0±0, 0, Железо, мг/дм 0,30±0, 0,1 3,7±2, Ост. акт. хлор, мг/дм отсут.0,3 0,4±0,001 0,2±0, Нефтепродукты, суммарно, 0,002±0,0003 0,001±0, 0, мг-экв/л ХПК – химическое потребление 1500,6±27,1 26,0±3, кислорода, О2/дм Общая щелочность 5,8±0,2 6,9±0, 30- (бикарбонаты), мг/дм Фосфаты, мг/дм3 1,5±0,2 1,4±0, 3, Стабильность (загниваемость), % 80% 62,0±5,7 75,2±4, БПК5, мг О2/дм 489,6±17,2 6,1±0, 2, Диоксины, нг не обнаружены 0,4 Из таблицы 3 видно, что в пробах озерной воды до обработки показатели:
запах, цветность, мутность превышали значительно показатели нормы, причем по запаху в 20 раз, цветности и мутности – более 50 раз. Данные перманганат ной окисляемости были превышены – более 16 раз, количество сульфатов выше в 5,8 раз, нитратов – в 2,3 раза, ионов аммония – в 4 раза, показатель химиче ского потребления – в 50 раз, другие показатели были в пределах нормы. Через 30 сут после двукратной обработки (с интервалом 10 сут) озера препаратом ус корителем ферментации «Экос» органолептические показатели (запах, цвет ность, мутность, окраска) приходили к норме.
Полученное удобрение было испытано в полевом опыте на серой лесной почве при культивировании на ней яровой пшеницы. Для сравнения испытыва ли навоз и минеральное удобрение (NPK). Результаты опыта представлены в табл. 4.
Таблица 4 – Урожай яровой пшеницы (полевой опыт, почва серо-лесная) при внесении переработанного с использованием ускорителя ферментации навоза Вариант Урожай, ц/га Прибавка, % Компост, 3 т/га 3,5 Компост, 6 т/га 7,5 Компост, 9 т/га 11,8 Навоз, 20 т/га 5,9 Минеральное удобрение 4,5 Из таблицы 4 следует, что наиболее эффективной дозой компоста является 9 тонн на га. Внесение данного удобрения из расчета 6 т/га позволило повысить урожай яровой пшеницы в среднем на 1,6 ц/га или на 8 % больше, чем при вне сении 20 т/га навоза, и на 15 % больше, чем внесение минеральных удобрений.
Но, учитывая, что действие изучаемого органического удобрения не ограничи вается одним-двумя годами, как у минеральных удобрений, то преимущество получаемого удобрения высокое. При внесении полученного удобрения с при менением ускорителя ферментации в почве увеличивалось содержание под вижного фосфора – (Р2О5), обменного калия – (К2О), снижалась величина гид ролитической и обменной кислотности и повышалась сумма поглощенных ос нований в почве и степень насыщенности почвы основаниями. Полученное в процессе ферментации удобрение оказывало положительное влияние и на жиз недеятельность почвенных микроорганизмов, что проявлялось усилением био логической активности почвы. Получаемое органическое удобрение оказывало положительное влияние на улучшение качества зерна яровой пшеницы. В зерне повышалось содержание белка и клейковины.
С использованием ускорителя ферментации разработаны биопакеты, пред назначенные для утилизации выгребных ям на приусадебных участках, приме нение которых позволяет избавиться от неприятного запаха в течение 1-3 суток.
3.7 ВОЗМОЖНОСТЬ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ УСКОРИТЕЛЯМИ ФЕРМЕНТАЦИИ «УФ-1» И «ЭКОС»
В лабораторных условиях были проведены опыты по деградации нефти и нефтешламов.
В лаборатории была доставлена нефть «Ромашкинская» РТ. Условия опы та: в химические стаканы объемом 500 см3, в количестве 11 штук была налита вода и сверху наслоена нефть толщиной 1 см3. Две емкости были контрольны ми, 1 емкость – интактной, вторая – контрольной - на поверхность нефти нано сился физиологический раствор, в объеме 10 см3, в третий, четвертый и пятый стаканы - ускоритель ферментации «Экос» в количестве 1млрд. микр. клеток;
в шестой, седьмой, восьмой стаканы - ускоритель ферментации (УФ-1) в количе стве 1млрд. микр. клеток;
в девятый, десятый и одиннадцатый – ускоритель ферментации «Экос» в объеме 1 млрд. микр. клеток. Таким образом, содержа ние препарата в 1 см3 составило 1 млрд. микр. клеток. Фиксировалась дата и время постановки опыта и температура в помещении и окружающей среды.
Первая серия опытов была поставлена в летний период: июнь – начало июля 2006 года. Еженедельно замерялся слой толщины нефти, проводился ви зуальный контроль, фиксировалась выраженность запаха, цвета и прозрачности воды. Установлено, что запах нефти в опытных стаканах существенно умень шился на 5-9 сутки.
В течение 20 сут внешних изменений цвета воды не отмечалось, не было заметно перемены и в слоях нефти. Однако на 25 сут, на поверхности нанесен ной нефти с препаратами, вначале с «УФ-1», через 2 сут и с ускорителем фер ментации «Экос», появились белые мелкие округлые колонии, а на дне стака нов – многогранные и мелкие округлые гранулы светло-бурого цвета. Запах нефти в опытных стаканах становился слабым. Высота нефти – уменьшилась на 50-60%. На 40 сут наблюдения весь нефтяной слой в опытных стаканах де градировался, вода стала прозрачной, запах не превышал 1 балла, рН воды – нейтральная, в воде содержание фенола не выявлено. Количество осадка соста вило 0,5±0,1 г. Вода в опытных емкостях не обладала токсичностью для рыб гуппии, стилонихий, мышей. В стаканах № 1 (интактная) и № 2, и контрольной (физ. раствор) за этот промежуток времени заметных изменений не отмечалось.
Толщина слоя нефти в этих стаканах не уменьшилась.
Следовательно, ускорители ферментации обладают способностью дегра дировать нефть до безопасных в экологическом отношении продуктов, которые не представляют опасности для окружающей среды и растений, не являются за грязнителями растениеводческой и животноводческой продукции.
Во второй серии опытов была проведена оценка эффективности ускорите лей ферментации «УФ-1» и «Экос» при обработке нефтешламов, доставленных из Нижнекамского, Лениногорского районов РТ и Тульской области. Нефтеш ламмы имели резкий, сильный специфический запах, черно-бурый цвет. Обра ботку отходов нефтепродуктов проводили в полиэтиленовых ведрах объемом 10 дм3.
По принципу аналогов пробы делили на контрольные (не обработанные) и опытные (обработанные препаратами «УФ-1» и «Экос»). Контрольные (2 емко сти) обрабатывали физиологическим раствором из расчета 20 и 40 см3 на кг, емкости обрабатывали без опилок ускорителем ферментации «УФ-1» в дозе 1млрд. микр. клеток, 4 емкости (1 опыт) – «УФ-1» в количестве 2 млрд. микр.
клеток в см3, 4 емкости обработали препаратом «УФ-1» в дозе 4 млрд. микр.
клеток в см3, 4 – препаратом в количестве 1 млрд. микр. клеток в см3, во всех этих емкостях нефтешлам перемешивали с опилками. В следующей серии про вели опыты с ускорителем ферментации «Экос». При этом использовались ана логичные емкости и дозы, что и в первом опыте, однако вместо препарата «УФ 1» применяли ускоритель ферментации «Экос».
Продолжительность опыта составила 40 суток.
В течение первых 5-8 сут запах во всех опытных емкостях уменьшился, стал менее резким. Через 10 сут после начала эксперимента субстрат во всех емкостях тщательно перемешивали, для увеличения влажности субстрата до бавляли воду по 0,5 дм3 на емкость.
Количество нефтепродуктов в обработанном субстрате на 30-40 сут не превышал соответствующие нормы. На субстрате произрастали зерновые, то маты и картофель.
Таким образом, проведенные производственные опыты свидетельствуют о высокой эффективности использования ускорителя ферментации для переработки органических отходов животноводства и птицеводства.
Всего с применением ускорителя ферментации переработано свыше тыс. т навоза и помета в различных регионах РФ.
3.8 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РЕГЛАМЕНТОВ НА ОПЫТНОЕ ПРОИЗВОДСТВО УСКОРИТЕЛЕЙ ФЕРМЕНТАЦИИ «УФ-1» И «ЭКОС» ДЛЯ БИОДЕГРАДАЦИИ И ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ НАВОЗА И ПОМЕТА Технологическая схема получения представляет собой процесс на первой стадии, которого проводится приготовление и посев культур микроорганизмов, накопление биомассы гриба и микроба, в колбах, емкостью 0,5 или 1, 5 л, на второй стадии - культивирование и накопление в реакторе при 27 и 370С, на третьей стадии контроль, маркировка, разливка, укупорка, упаковка и склади рование препарата. Выход готового препарата составляет 1000 м3 на заправку.
3.9 ТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ С ПОМОЩЬЮ УСКОРИТЕЛЕЙ ФЕРМЕНТАЦИИ «УФ-1» И «ЭКОС»
Технологический процесс применения ускорителей для утилизации орга нических отходов животноводства, обработки сточных вод, нефти, нефтешла мов предусматривает следующее:
- характеристику получаемой продукции;
- характеристику исходного сырья;
- технологическую схему производства и описание технологического про цесса;