Экологическая роль полигидроксиалканоатов: закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами
На правах рукописи
ПРУДНИКОВА Светлана Владиславна
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ:
ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОРАЗРУШЕНИЯ В ПРИРОДНОЙ СРЕДЕ И
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МИКРООРГАНИЗМАМИ
03.01.06 – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Красноярск
2012
Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) и Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (ИБФ СО РАН).
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Волова Татьяна Григорьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Градова Нина Борисовна доктор биологических наук Сомова Лидия Александровна доктор технических наук, профессор Рязанова Татьяна Васильевна
Ведущая организация Казанский (Приволжский) федеральный университет
Защита состоится «» 2012 года в час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50, ауд. 1-12.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.
Автореферат разослан «_» 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д-р. биол. наук Л.А.Франк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В результате активной хозяйственной деятельности и на фоне роста населения планеты во все более широком масштабе увеличивается производство и потребление химических веществ. Объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. тонн в год;
их основная часть скапливается на свалках, так как повторной переработке в развитых странах подвергается не более 16-20 % (Kijchavengkul, Auras, 2008;
Chanprateep, 2010). Под полигоны и свалки твердых бытовых отходов ежегодно отчуждается до 10 тыс. га земель, в том числе плодородных, изымаемых из сельскохозяйственного оборота. Полиэтиленовый мусор выводит из строя канализационные и дренажные системы городов, загрязняет водоемы. По данным Green Pease, ежегодно в воды Мирового океана попадает до 10% от объемов выпускаемых пластиков (Moore et al., 2001;
Tanabe et al., 2004).
Интенсивные технологии ведения сельского хозяйства требуют применения огромного количества разнообразных химических веществ для борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями болезней культивируемых видов. При этом не боле 10 % применяемых и вносимых в окружающую среду пестицидов достигает цели;
основная масса этих веществ аккумулируется в биологических объектах, загрязняет почвы, водоемы, вызывает гибель полезных организмов и нарушает равновесие в природных экосистемах (Hansen et al., 2004;
Hasler et al. 2010).
Традиционное повсеместное применение продуктов химического синтеза, получаемых из невозобновляемых природных ресурсов, приводит к чрезмерному росту количества неутилизируемых отходов, что вступает в противоречие с мероприятиями, направленными на защиту окружающей среды и создает глобальную экологическую проблему. Одним из путей снижения антропогенного давления на экосистемы является замена синтетических полимеров природными, которые подвержены биологической деструкции и разлагаются в естественной среде, вовлекаясь в круговорот (Kijchavengkul, Auras, 2008;
Волова, 2004;
Asrar, Gruys, 2002;
Штильман, 2006).
Развитие науки и техники приводит к все более широкому внедрению в практику целевых продуктов, синтезируемых микроорганизмами. Ценным продуктом биотехнологии являются микробные полигидроксиалканоаты (ПГА), которые обладают спектром полезных свойств, в том числе биосовместимостью и биоразрушаемостью. ПГА перспективны в качестве материала и изделий биомедицинского назначения, разрушаемой упаковки пищи и напитков, предметов гигиены и санитарии, изделий и препаратов для коммунального и сельского хозяйства (Sudech, Doi, 2000;
Stock et al., 2000;
Asrar, Gruys, 2002;
Volova, 2004;
Hazer et al., 2007).
Наблюдаемые сегодня наращивание объемов выпуска и расширение сфер применения ПГА делают необходимым изучение способности окружающей среды к трансформации этого вида биологической продукции. Однако количество работ, в которых были бы всесторонне рассмотрены различные аспекты разрушения ПГА в природной среде, в целом невелико;
большинство исследований выполнено в лабораторных условиях без учета всей сложности этого процесса (Mergeret et al., 1993;
Jendrossek et al., 2001, 2002;
Bonartseva et al., 2003, Woolnough et al., 2008). Вместе с тем, разрушаемость ПГА зависит от многих составляющих, таких как химический состав и структура полимера, микробная составляющая биоты как главного агента их биодеградации, а также условий среды, которые, в свою очередь, определяются биологическими, гидротермическими, климатическими и погодными условиями. Результаты по разрушаемости ПГА, полученные в лаборатории, не позволяют прогнозировать поведение и разрушение ПГА в сложных и изменяющихся природных экосистемах. Для этого необходимо комплексное исследование, которое даст ответы на ряд ключевых вопросов: 1) как состав микробиоценоза среды влияет на процесс разрушения ПГА и какие микроорганизмы являются истинными и активными деструкторами ПГА применительно к конкретным внешним условиям;
2) какое воздействие на скорость разрушения оказывают химический состав ПГА, способ изготовления изделий, геометрия и размеры образцов;
3) как изменяются макро- и микроструктура ПГА и их свойства (кристалличность, молекулярная масса, полидисперсность) в процессе разрушения;
4) насколько значимо влияние на этот процесс физико-химических условий среды;
5) каким образом процесс разрушения ПГА будет протекать в регионах, различающихся погодными и климатическими условиями.
Необходимость проведения комплексного исследования, позволяющего адекватно и всесторонне изучить этот многофакторный процесс, послужила основанием для настоящей работы, и позволила поставить ее цель и определить задачи.
Цели и задачи исследования. Цель работы – комплексное исследование взаимодействия ПГА с природными микробиоценозами и выявление закономерностей биоразрушения в различных климатических зонах во взаимосвязи с физико-химической структурой полимеров.
Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:
сконструировать из ПГА различной химической структуры экспериментальные образцы изделий и изучить закономерности их биоразрушения и последствия взаимодействия с микроорганизмами в лабораторных микроэкосистемах;
исследовать биоразрушение ПГА в природных экосистемах (почвах и водоемах повышенной солености), расположенных в разных климатических зонах (Сибирский регион, тропики);
изучить особенности микробиоценозов в районах исследования и выделить доминантные микроорганизмы, участвующие в биоразрушении ПГА;
с применением индикаторных сред отобрать первичных биодеструкторов;
идентифицировать на основе культуральных, морфо-физиологических и молекулярно-генетических методов доминантные микроорганизмы деструкторы ПГА, характерные для конкретных природных микроэкосистем;
изучить динамику биодеградации ПГА в сопоставлении с микробиологическими и физико-химическими характеристиками среды с учетом химического состава и формы полимерных образцов;
исследовать изменения микроструктуры и физико-химических свойств ПГА в процессе биодеградации для формирования представлений о механизме разрушения этого класса полимеров;
оценить эффективность ПГА для конструирования экологически безопасных и адресных препаратов сельскохозяйственного назначения.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование закономерностей биоразрушаемости ПГА в природных условиях микробиоценозами различной структуры, функционирующими в различных климатических и погодных условиях, с учетом структуры полигидроксиалканоатов и их физико-химических свойств. Выполнены сравнительные исследования биоразрушения пленок и объемных прессованных форм из ПГА в природных микроэкосистемах: Сибирских и тропических почвах, морской тропической воде, солоноватоводном озере Шира. Установлено, что в почвах разрушение полимеров сопровождается повышением степени кристалличности;
в морской воде в условиях тропиков этот показатель не изменяется, аморфная и кристаллическая фазы полимера подвергаются разрушению в одинаковой мере. Доказано, что в почве и морской воде в условиях тропиков происходит более активное разрушение образцов из гомополимера (поли-3-гидроксибутирата) по сравнению с сополимерными образцами (поли-3-гидроксибутирата-со-3 гидроксивалерата), в то время как в почвах и водоемах Сибири быстрее разрушаются образцы из сополимера. Активное разрушение ПГА имеет место при обсемененности среды не менее 107 КОЕ в 1 г. Установлено, что ПГА стимулируют развитие микрофлоры. Впервые показано, что на поверхности полимерных образцов формируется микробиоценоз, специфичный для конкретной природной среды, качественно и количественно отличающийся от микробиоценозов контрольных образцов почвы. По совокупности культуральных, морфологических, физиологических признаков и результатов анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S и 28S рРНК идентифицированы первичные микроорганизмы-деструкторы ПГА. Во всех исследованных регионах активными деструкторами ПГА являются представители родов Bacillus, Paecilomyces и Penicillium, остальные микроорганизмы – специфичны для различных природных экосистем.
Доминантными деструкторами ПГА в почвах Сибири являются бактерии родов Variovorax, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus и Xanthomonas и микромицеты Penicillium, Paecilomyces, Acremonium, Verticillium и Zygosporium;
в тропических почвах – бактерии родов Burkholderia, Bacillus, Cupriavidus, Streptomyces, Nocardiopsis, Mycobacterium, и микромицеты Gongronella, Penicillium, Acremonium, Paecilomyces и Trichoderma;
в прибрежной воде Южно-Китайского моря – бактерии родов Enterobacter, Bacillus и Gracilibacillus.
Практическая значимость. Комплексное исследование процессов биоразрушения ПГА в природных средах и получение данных, необходимых для прогнозирования сценария биораспада ПГА в природе, составят основу для конструирования долговременных форм сельскохозяйственных препаратов нового поколения. На основе изученных закономерностей биоразрушения ПГА почвенными микробиоценозами сконструированы препараты сельскохозяйст венного назначения: гербицид, азотное удобрение и биофунгицид триходермин.
Показана возможность использования ПГА в качестве основы для депонирования препаратов. Установлено, что такие долговременные формы препаратов обеспечивают контролируемый выход активного начала в течение вегетационного периода растений, что позволяет сократить нормы внесения химических веществ в агроценозы и уменьшить негативное воздействие на биосферу.
Положения, выносимые на защиту:
1. Исследованные закономерности биоразрушения полигидроксиалканоатов в различных регионах, определяемые химическими свойствами ПГА и формой полимерного изделия, структурой микробиоценоза и погодно-климатическими условиями.
2. Идентифицированные микроорганизмы – первичные деструкторы полигидроксиалканоатов, специфичные для условий среды и определяющие механизм биоразрушения ПГА.
3. Научная основа для применения полигидроксиалканоатов в качестве матрикса для конструирования долговременных препаратов сельскохозяйственного назначения.
Работа выполнена в рамках плановой тематики СФУ «Изучение закономерностей микробиологического синтеза разрушаемых биопластиков (полимеров гидроксипроизводных алкановых кислот, ПГА) новой структуры и выявление механизмов их взаимодействия с биологическими системами на организменном и экосистемном уровнях» и при поддержке Министерства образования РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) грант REC 002;
программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты № 2.1.1.528 и РНП- «Фундаментальные основы конструирования полимерных микро- и наноносителей биологически активных соединений»;
программы «Эколан» Т 1.3 «Исследование закономерностей деградации биопластиков и устойчивости их к воздействию факторов внешней среды в условиях тропиков»;
проекта по постановлению Правительства РФ № 220 «Ведущие ученые» Биотехнологии новых биоматериалов.
Апробация работы: материалы диссертации были представлены на XXXIII Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, НГУ, 1995), Региональной научной конференции «Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях агрономического профиля» (Красноярск, КрасГАУ, 1995), Всероссийской научной конференции «Агроэкология и устойчивое развитие регионов», посвященной 45-летию КрасГАУ (Красноярск, КрасГАУ, 1998), IUFRO International Symposium «Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization» (Krasnoyarsk, 1998), Южно-Сибирской Региональной научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири - год» (Абакан, ХГУ, 1998), VI региональной научно-практической и методической конференции «Производительные силы Красноярского края в современных социально-экономических условиях» ( Красноярск, 1999), Annual International Research Conference «Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions» (San Diego, 1999), Международном совещании «Методы оценки состояния и устойчивости сеянцев хвойных» (Красноярск, 1999), I межрегиональном семинаре по мониторингу и защите леса (Красноярск, 2000), 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития городов» (Красноярск, 2001), Conference «Ecology of Soil Microorganisms» (Prague, Czech Republic, 2011), I и II Международном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, СФУ, 2011, 2012), BIT's 4th Annual World Congress of Industrial Biotechnology (Dalian, China, 2011), Second International Conference on Recycling and Reuse of Materials (Kottayam, India, 2011), I и II Съезде микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2002, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 11 статей, в т.ч. 10 в специализированных журналах, рекомендованных ВАК, 2 работы в сборниках научных статей, 1 монография, 1 патент, 15 учебно-методических работ, работы в сборниках материалов международных и Всероссийских конференций.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов, проведение всех микробиологических исследований, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура работы. Диссертация изложена на 248 страницах машинописного текста и содержит 32 таблицы и 58 рисунков;
включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 329 источников, в т.ч. 239 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение. Во введении обоснована актуальность работы и обозначен ее вклад в решение проблемы накопления в окружающей среде продуктов химического синтеза путем замены синтетических полимеров природными биоразрушаемыми соединениями – продуктами жизнедеятельности микроорганизмов.
Аналитический обзор посвящен анализу литературы по проблеме поиска альтернативных экологически безопасных технологий и материалов, способствующих снижению количества тупиковых отходов антропогенного происхождения, накапливающихся в биосфере. Изучен биотехнологический потенциал полигидроксиалканоатов в качестве альтернативы синтетическим полимерным материалам: перспективы наращивания производства и потенциальные сферы применения ПГА. В заключительном разделе анализируется современное состояние исследований процессов биоразрушения полигидроксиалканоатов в лабораторных условиях и природных средах (почвах и водоемах).
Объекты и методы исследования. Исследованы образцы ПГА, полученные по технологии, разработанной и реализованной в НОЦ «Енисей»
СФУ: гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты и двухкомпонентные сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом (концентрация 13 и 27,6 мол%) и 3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (10,2 мол%). Из ПГА различного состава были сформированы 2-х мерные (2D) пленки, 3-х мерные (3D) плотные прессованные формы и микрогранулы. Пленки получали методом полива и испарения из 4 %-го раствора полимера в хлороформе;
объемные формы – методом прямого холодного прессования с помощью лабораторного 25-ти тонного автоматического пресса Carver 3887/4387 (США);
микрогранулы – методом микродропинга из растворов ПГА в осадитель (гексан). Физико-химические свойства полимеров и разработанных изделий изучены с использованием хроматографии (Hewlett Packard, США), дифференциального термического анализа (синхронный термоанализатор STA Германия), рентгеноструктурного анализа 449 Jupiter, NETZCSH, (рентгеноспектрометр D8 ADVANCE, Bruker, Германия), электронной микроскопии (JEM-100C, Япония);
физико-механические характеристики образцов регистрировали на универсальной электромеханической испытательной машине Инстрон 5565 (Великобритания).
Исследования процесса биодеградации образцов ПГА выполнены в лабораторных микроэкосистемах, а также в природных условиях в серии полевых сезонов 2005-2012 гг.: в Сибирском регионе – в почвах Сибири (дендрарий Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН) и солоноватоводном озере Шира;
в тропиках – в почвах окрестностей Ханоя и Нячанга (Вьетнам) и заливе Дам Бай Южно-Китайского моря. Предварительно взвешенные образцы полимеров в чехлах из мелкоячеистого мельничного газа размещали в почве на глубине 5 см, либо погружали в воду на разную глубину в соответствии со схемой эксперимента. Длительность экспозиции составляла 3-4 месяца в условиях Сибири и 10-12 месяцев – в условиях тропиков. В течение экспозиции регистрировали изменение образцов полимеров различной (массы образцов, молекулярной массы и молекулярно-массового распределения полимеров, соотношения упорядоченной и неупорядоченной фаз) с учетом состояния и характеристик среды (температуры, влажности, рН, солености, окислительно восстановительного потенциала), а также микробиологической составляющей почвенных и водных экосистем.
Микробиологические исследования выполнены стандартными методами.
Количественное определение численности бактерий и грибов в фоновой среде и на поверхности образцов ПГА проводили высевом серийных разведений на питательные среды. Для выделения бактерий использовали мясо(рыбо) пептонный агар (МПА, РПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), агар Эшби, почвенный агар, Plate-count agar (PCA), среду Youschimizu-Kimura (Y-K) для морских микроорганизмов;
для выделения грибов – сусловый агар (СА), среды Чапека и Сабуро. Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании культуральных, морфологических признаков и стандартных биохимических тестов, приведенных в определителях Берджи (1997, 2001, 2005, 2009), Р. Вейанта (1999), Л. Н. Егоровой (1986), Д.
Саттона (2001), T. Watanabe (2002). Для выявления микроорганизмов – первичных деструкторов ПГА использовали метод прозрачных зон (Mergaert et al., 1993), предполагающий посев пробы на минеральный агар, содержащий в качестве источника углерода 0,25% порошкообразного поли-3 гидроксибутирата (рис. 1).
Рисунок 1. Проявление ПГА деполимеразной активности бактерий-деструкторов (образование прозрачных зон на диагностической среде с ПГА) Идентификацию выявленных первичных деструкторов проводили секвенированием 16S рРНК. ДНК выделяли с помощью набора реактивов AquaPure Genomic DNA Isolation (Bio-Rad, США) по рекомендованному производителем протоколу. Ген 16S рРНК был амплифицирован с использованием универсальных праймеров 27F и 1492R, соответствующих позициям 8-27 и 1510-1492 E. coli соответственно. Для эукариот амплифицировали ген 28S рРНК с использованием праймеров yest D1/D2. ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler Gradient (Eppendorf, Германия).
Образцы для определения нуклеотидной последовательности подвергали секвенированию методом Сенгера на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США). Определенные секвенированием нуклеотидные последовательности сравнивали с гомологичными последовательностями штаммов из баз данных GenBank, EMBL и DDBJ с помощью программы NCBI BLAST (Altschul et al., 1990), выравнивая их с использованием программы ClustalX версии 2.08 (Thompson et al., 1994).
Филогенетический анализ выполнен по модели Джукеса и Кантора в пакете программ TREECON версии 1.3b. Определенные нуклеотидные последовательности микроорганизмов-деструкторов ПГА депонированы в базе данных GenBank (№№ HQ689679-HQ689694, HM587328-HM587333, JQ – JQ518351).
Долговременные формы препаратов гербицида Зеллек-супер (действующее вещество галоксифоп) и азотного удобрения карбамида, депонированных в ПГА-матрикс получали из растворов полимера в хлороформе, смешанных с препаратами в различных концентрациях. Объемные формы изготавливали путем смешивания порошкообразного полимера с порошком удобрения и последующего прямого холодного прессования. В качестве тест-растений использовали Agrostis stolonifera L. и Latuca sativa.
Растения выращивали в лаборатории в летний период при естественном освящении и в фитотроне при круглосуточном освещение, мощностью Вт/м2 по технологии, разработанной в лаборатории высших фототрофов ИБФ СО РАН. В ходе экспериментов определяли динамику выхода действующего вещества с учетом степени деградации полимеров. Концентрацию гербицида Зеллек-супер в почве определяли на хроматографе с масс-спектрометрическим детектором GCD plus (Hewlett-Packard, США), количество азота – колориметрическим методом с реактивом Несслера. Эффективность препаратов оценивали, сравнивая биомассу растений в различных вариантах опыта.
Исследование возможности иммобилизации спор гриба-антагониста фитопатогенов Trichoderma harzianum Rifai на ПГА-носителе проводили в лабораторных условиях, определяя жизнеспособность спор при различных сроках хранения, а также в модельных почвенных экосистемах, оценивая сохраняемость популяции грибов Trichoderma в почве в течение 4-х месяцев после интродукции. Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам с использованием программы Microsoft Excel 2007.
Для полученных данных рассчитывали среднее арифметическое, среднеквадратичное отклонение, ошибку средней арифметической.
Достоверность различий считали при уровне значимости р0,05.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Конструирование экспериментальных образцов из ПГА и исследование процесса биоразрушения в лабораторных условиях В связи с существующими представлениями о многофакторности процесса биоразрушения ПГА и влиянии на этот процесс не только условий среды, но также структуры полимера и способа переработки в изделия (Jendrossek, 2000;
2002), проведено сравнительное изучение деградации полимерных изделий в виде гибких пленок, прессованных объемных форм и микрогранул, полученных разными методами.
1.1. Получение и характеристика полимерных изделий из ПГА Для исследования взята серия высокоочищенных образцов ПГА различного состава, из которых были получены экспериментальные образцы в форме пленок (2D), объемных прессованных форм (3D) и микрогранул (рис. 2).
Рисунок 2. Экспериментальные образцы изделий из ПГА Различия основных физических свойств исследуемых полимеров влияли на характеристики полученных изделий. Поверхность пленок из гомогенного поли-3-гидрокисбутирата – плотная, со слабо выраженным нерегулярным рисунком. Поверхность пленок из сополимеров с 3-гидроксивалератом – более гладкая. Пленки из другого типа сополимеров - 3-гидроксигексаноатом, имели наиболее развитую поверхность с неоднородными порами размером от 0,5 до 5 µм. Наличие в составе ПГА помимо 3-гидроксибутирата других мономеров приводило к снижению величин контактных краевых углов смачивания и свободной энергии межфазовой поверхности, а также к увеличению поверхностного натяжения () и величины сил сцепления (WSL), то есть к повышению степени гидрофильности поверхности сополимерных пленок.
Пленки из гомогенного П3ГБ по этим показателям – наиболее гидрофобны (70,0±0,4°). Серия форм, полученных с различным включением 3 гидроксивалерата, имела сходные характеристики как по структуре поверхности, так и по плотности матрикса и величине влагопоглощения.
Поверхность прессованных полимерных форм была плотная и гладкая с единичными порами.
Все формы были использованы для исследования биоразрушения в результате взаимодействия с микроорганизмами и в качестве платформы для конструирования долговременных форм препаратов сельскохозяйственного назначения.
1.2. Исследование разрушаемости ПГА в лабораторных условиях Исследовано влияние химического состава полимера, геометрии образцов и условий внешней среды на его разрушаемость в лабораторных почвенных микроэкосистемах. В пластиковые контейнеры с почвой были помещены образцы ПГА в виде тонких пленок ( 20 мм) и объемных прессованных форм ( 5 мм, h=2 мм), которые экспонировали в течение 120 суток при стабилизации температуры 25±0,1 °С и влажности почвы – 55-60 %.
Установлено, что независимо от химической структуры, все образцы начинали разрушаться после латентного периода, за которым следовал период потери массы образцов. По всей видимости, требуется некоторое время для адаптации микроорганизмов к полимерному материалу как субстрату для синтеза деполимеризующих ферментов, вызывающих деструкцию и последующую утилизацию полимерного материала микробными клетками.
Исследование биоразрушения образцов ПГА различного химического состава в виде пленок показало, что сополимерные образцы, имеющие пониженную степень кристалличности, разрушались в лабораторных условиях быстрее, нежели гомополимер, при этом наиболее активно – сополимер с 3 гидрокисгексаноатом. Периоды уменьшения массы образцов на от исходной составили для пленок П3ГБ и сополимеров П3ГБ/3ГВ и П3ГБ/3ГГ 20, 15 и суток, соответственно (рис. 4а).
Прессованные объемные образцы ПГА разрушались аналогично пленкам, но более медленно. Потеря массы на от исходной зарегистрирована на 82, и 52 сутки для П3ГБ и сополимеров П3ГБ/3ГВ и П3ГБ/3ГГ соответственно. Это практически в 4 раза выше величин, зарегистрированных для 2D форм (рис. 4б).
Рисунок 4. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в лабораторных условиях: а – пленки;
б – объемные формы;
в, г – пленки из П3ГБ Температура среды в диапазоне 16-35 °С существенно влияла на скорость биодеградации ПГА (рис. 4в). При 16 °С в среднем скорость деградации пленок была в 1,5 раза ниже, чем при 20 °С;
при 26-28 °С деградация увеличилась в 2, раза и происходила без ярко выраженной лаг-фазы. Однако при повышении температуры до 35 °С процесс разрушения пленок замедлялся, что связано с ингибирующим действием температуры на активность почвенной микрофлоры.
Влияние активной реакции среды в диапазоне 5,2-7,5 на процесс разрушения ПГА в лабораторных условиях не зафиксировано. Независимо от химического состава и физико-химических свойств образцов ПГА они не деградировали в фосфатном буфере при 37 °С в течение 90 суток (рис. 4г).
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии водного и химического гидролиза ПГА. Результаты согласуются с современными представлениями о том, что ПГА не подвержены небиологической гидролитической деструкции (Amass et al., 1998;
Sudesh et al., 2000). При использовании в качестве модельной среды водопроводной воды, содержащей 1,4105 клеток/мл аэробной микрофлоры, разрушаемость пленок из ПГА толщиной 0,07 мм была сравнима с разрушением в данных условиях писчей бумаги.
Известно, что микробные ПГА-экзодеполимеразы гидролизуют преимущественно аморфную фазу ПГА, а не высокоупорядоченные С-цепи в кристаллическом состоянии (Jendrossek, 2001;
Abe et al., 1996). В сополимерных ПГА по сравнению с высококристалличным П3ГБ имеет место выравнивание соотношения упорядоченной и неупорядоченной фаз, то есть доля аморфной фазы в них выше. Поэтому сополимеры, обладающие большей площадью аморфных (неупорядоченных) регионов в структуре полимерного материала, как правило, разрушаются быстрее. Преимущественное разрушение аморфной фазы образцов в почвенных микроэкосистемах подтверждено данными рентгеноструктурного анализа: степень кристалличности пленок П3ГБ/3ГВ возросла на 17 %, П3ГБ/3ГГ – на 22 % по сравнению с исходными значениями (табл. 1).
Таблица 1 – Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в почве Параметр Исходные значения После экспозиции в почве (20 суток) П3ГБ П3ГБ/ П3ГБ/ П3ГБ П3ГБ/ П3ГБ/ 3ГВ 3ГГ 3ГВ 3ГГ 27,6 мол% 27,6 мол% Кристаллич- 76 45 36 81 62 ность Cx, % Молекулярная 1200±33,2 1077±24,1 620±22,5 932±31,8 674±28,2 380±18, масса Мв, кДа Полидис- 1,66±0,02 3,12±0,14 1,80±0,08 1,78±0,06 4,41±0,16 2,83±0, персность Таким образом, на биодеградацию полигидроксиалканоатов, помимо химического состава и формы изделия, существенно влияет температура среды.
Наличие в составе ПГА мономеров 3-гидроксивалерата и 3-гидроксигексаноата ускоряет процесс биодеструкции в почве и воде. В стерильных условиях разрушение ПГА не зафиксировано в течение 90 суток.
1.3. Результаты взаимодействия ПГА с микроорганизмами в процессе биоразрушения в лабораторных микроэкосистемах Микроорганизмы по своей физиолого-биохимической природе являются наиболее чувствительными индикаторами любого изменения химико экологической обстановки окружающей среды (Наливайко, 2000;
Macler, 2000).
Искусственное внесение в почву любого субстрата вызывает сдвиги в составе и структуре микробного сообщества. Высокая активность той или иной функциональной группы может служить индикатором деградационных процессов, протекающих в почве.
В ходе изучения последствий внесения образцов ПГА в почвенные лабораторные микрокосмы показано положительное влияние на развитие микроорганизмов, обнаружено увеличение количества бактерий, в том числе актинобактерий, на поверхности полимерных образцов (пленок и объемных форм) по сравнению с контролем – фоновой почвой (табл. 2).
Таблица 2 – Общая численность микроорганизмов в лабораторных почвенных микроэкосистемах Бактерии Актинобактерии Грибы Варианты опыта (3,4±0,3)106 (1,7±1,2)105 (6,6±2,3) Фоновая почва (7,1±1,3)108 (3,8±0,7)106 (5,4±0,8) Поверхность П3ГБ (пленки) (5,3±1,1)108 (8,2±1,3)105 (7,8±0,5) Поверхность П3ГБ (прессованные формы) ПГА как дополнительный источник углеродного питания стимулировал развитие этих групп микроорганизмов в почве. В то же время количество пропагул микромицетов во всех образцах оставалось на контрольном уровне.
По соотношению функциональных групп микроорганизмов исходная почва характеризовалась законченностью процессов минерализации и зрелым микробным сообществом: коэффициент минерализации составлял 1,25, олиготрофности – 0,04 (табл. 3).
Таблица 3 – Количественные показатели эколого-трофических групп микроорганизмов лабораторных почвенных микроэкосистем Коэф. Коэф.
минера- олиготроф Варианты Копиотрофы Олиготрофы Прототрофы лизации ности опыта (КАА/ (ПА/ МПА) МПА) Фоновая почва (3,4±0,3)106 (1,3±0,2)105 (4,3±0,8)106 1,25 0, Поверхность (7,1±0,1)108 (2,3±0,6)105 (4,6±0,05)107 0,04 0, П3ГБ (пленки) Поверхность П3ГБ (5,3±0,1)108 (1,9±0,4)105 (5,5±0,01)107 0,02 0, (прессованные формы) Присутствие ПГА в почве стимулировало развитие копиотрофов и прототрофов;
в результате этого коэффициенты минерализации уменьшились до 0,02-0,04. Это является свидетельством активных процессов деструкции органического вещества в почве и накопления продуктов распада ПГА в виде ди- и мономеров в качестве дополнительного и доступного для микроорганизмов субстрата. В микробиоценозах пленок обрастания на поверхности полимера увеличивалось количество азотфиксаторов. Вероятно, это связано с изменением соотношения углерод/азот в почве в результате обогащения последней углеродсодержащими продуктами биораспада ПГА.
Из почвенных образцов было выделено и проанализировано 40 изолятов бактерий и 28 изолятов микроскопических грибов. В сравнительном аспекте исследован качественный состав контрольных и сформировавшихся экспериментальных микробиоценозов;
выделены и идентифицированы доминирующие бактерии и микромицеты (табл. 4).
Таблица 4 – Соотношение (%) представителей доминирующих микроорганизмов в лабораторных почвенных микроэкосистемах Бактерии Поверхность Фоновая Микромицеты Поверхность Фоновая пленок ПГБ почва пленок ПГБ почва Pseudomonas 8 26 Penicillium 56 Bacillus 25 12 Aspergillus 0 Flavobacterium 2 14 Trichoderma 8 Cellulomonas 31 0 Acremonium 11 Corynebacterium 3 6 Alternaria 7 Streptomyces 6 4 Cladosporium 7 Arthrobacter 6 13 Mucor 2 Planomonospora 2 0 Fusarium 5 Acinetobacter 5 10 Gliocladium 2 Mycobacterium 7 6 Monilia 2 Micrococcus 5 Обнаружено, что на поверхности полимерных образцов селективно формируется микробиоценоз, качественно и количественно отличающийся от контрольных образцов почвы. Во всех образцах с поверхности ПГА зафиксировано увеличение количества спорообразующих бактерий, в том числе актинобактерий, на фоне снижения относительно контроля грамотрицательных палочек.
Следует отметить, что доля первичных деструкторов, обладающих ПГА экзодеполимеразой, в контрольной почве была низкая – около 4 % от общей численности микроорганизмов;
на экспериментальных образцах количество ПГА-деструкторов возросло до 38 %. Среди них идентифицированы представители Bacillus cereus П4, Mycobacterium sp. П8, Streptomyces sp. П12, Pseudomonas sp. П6. Остальные бактерии, выделенные из пленок обрастания, не обладали ПГА-экзодеполимеразой. Вероятно, они могли усваивать продукты биораспада полимера, представляя, таким образом, второй и последующие трофические уровни в сформированном микробиоценозе.
Сведений относительно того, к какому типу ферментов относятся ПГА экзодеполимеразы (конститутивному или индуцибельному), не опубликовано.
Обнаруженный факт значительного увеличения количества микроорганизмов деструкторов ПГА в микробиоценозах, формирующихся на поверхности образцов полимера в течение короткого периода времени (30 суток), позволяет рассматривать индуцибельную природу фермента.
В целом, присутствие ПГА в почве стимулировало рост численности микроорганизмов, не снижало видового разнообразия микробных сообществ и приводило к селективному формированию микробных комплексов в пленках обрастания на поверхности образцов полимера.
2. Закономерности биоразрушения полигидроксиалканоатов почвенными микробиоценозами Почва является мощным природным резервуаром для деструкции различных соединений, включая ПГА. Однако большинство известных работ по изучению почвенной деструкции ПГА в лабораторных и натурных условиях проведены без учета химической структуры и свойств собственно полимера, прежде всего, молекулярной массы и степени кристалличности. В отношении ПГА в настоящее время отсутствуют четкие представления о взаимодействии полимеров с микробоценозами;
мало сведений о систематической принадлежности первичных деструкторов ПГА, выполненных с применением молекулярно-генетических методов.
2.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах средних широт Сибирского региона Были взяты образцы полимерных пленок двух типов: П3ГБ и П3ГБ/3ГВ (с включением сополимера 10 мол%), диаметр 30 мм, масса 60±6,5 мг, которые размещали в почве на глубине 5 см в прикорневой зоне лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) и березы повислой (Betula pendula L.). Исследования выполнены на территории дендрария Института леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН (г. Красноярск) в течение двух полевых сезонов:
первый – 2 июля - 19 октября 2007 г.;
второй – 7 июня - 7 сентября 2010 г.
Условия экспонирования образцов отличались в разные полевые сезоны.
Второму сезону предшествовала суровая зима, при средней температуре воздуха –22,1 °С, что значительно ниже чем, в предшествующий сезон (– 8,6 °С). Активная реакция почвы под березой (6,5-7,2) и лиственницей (7,2-8,0) не проявляла заметных колебаний в периоды исследований;
почва под березой была более сухая (11-23 %).
Исследования показали, что на процесс разрушения ПГА в почве оказали влияние химический состав полимера, характеристика микробиоценоза, а также физико-химические показатели почвы, определяющие численность и активность микроорганизмов.
В 2007 г. разрушение обоих типов полимера происходило активнее в прикорневой зоне лиственницы. Через 109 суток остаточная масса образцов гомополимера П3ГБ составила 45 %, сополимера П3ГБ/3ГВ – 22 % от исходной;
период уменьшения массы образцов на от исходной достигал 83 и 68,5 суток соответственно (рис. 5). В почве прикорневой зоны березы разрушение ПГА обоих типов было замедленным. Остаточная масса образцов П3ГБ составила 84 %, П3ГБ/3ГВ – 74 % от исходной. Сополимер разрушался быстрее, чем высококристалличный гомополимер.
Рисунок 5. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в почве прикорневой зоны березы и лиственницы в условиях Сибири В 2010 году разрушение пленок протекало не так активно. Через 98 суток остаточная масса образцов П3ГБ и П3ГБ/3ГВ, экспонированных под лиственницей, составила 89,9 и 84 %, соответственно;
масса образцов, под березой – 91,4 и 89 %. Малые значения убыли массы полимерных образцов в 2010 г. не позволили достоверно выявить отличия в разрушаемости исследованных ПГА различного химического состава.
При анализе структуры ПГА в ходе разрушения обнаружено увеличение степени кристалличности полимеров обоих типов, как и в предыдущих исследованиях в модельных почвенных средах. Это свидетельствует о предпочтительном разрушении микроорганизмами аморфной фазы полимеров по сравнению с кристаллической (табл. 5). Для образцов, подвергшихся наибольшей деградации (2007 год), итоговые значения средневесовой молекулярной массы ПГА (Мв) составили 81-97 % от исходной для П3ГБ и 79 82 % – для П3ГБ/3ГВ.
Таблица 5 – Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в почве в условиях Сибири Параметр Исходные значения После экспозиции в После экспозиции в почве (98 суток, почве (98 суток, лиственница) береза) П3ГБ П3ГБ/ П3ГБ П3ГБ/ П3ГБ П3ГБ/ 3ГВ 3ГВ 3ГВ 10 мол % 10 мол % 10 мол % 2007 год Кристалличность 61 50 65 68 69 Cx, % Молекулярная 710±10,7 799±24,8 577±26,5 660±17,2 691±20,7 633±34, масса Мв, кДа Полидисперс- 2,05±0,04 1,77±0,08 2,39±0,1 2,41±0,06 2,22±0,14 2,23±0, ность 2010 год Кристалличность 61 50 64 62 65 Cx, % Молекулярная 710±10,7 799±24,8 692±20,1 660±17,2 704±16,2 628±31, масса Мв, кДа Полидисперс- 2,05±0,04 1,77±0,08 2,32±0,07 2,41±0,06 2,25±0,08 2,35±0, ность Таким образом, в условиях резко континентального климата в Сибирской почве биоразрушение образцов пленок из сополимера П3ГБ/3ГВ происходило интенсивнее по сравнению с более кристалличными образцами из гомогенного П3ГБ.
Исследования показали, что течение процесса биодеградации пленок зависело от свойств микробного сообщества в местах размещения образцов.
Исходные микробиоценозы почвы в прикорневой зоне обоих деревьев различались по общей численности микроорганизмов и по видовому составу. В более холодном 2010 г. общая численность микроорганизмов в исходной почве была ниже на 1-2 порядка, чем в 2007 г. (табл. 6).
Таблица 6 – Общая численность бактерий в пробах почвы в условиях Сибири Общее микробное число, КОЕ в 1 г почвы Образец почвы 2007 г. 2010 г.
Прикорневая зона в (1,47±0,08)109 (3,16±0,24) L. sibirica момент размещения ПГА Прикорневая зона в (5,11±0,42)109 (5,28±1,76) конце сезона (1,60±0,04)1011 (1,35±0,11) Поверхности пленок ПГА Прикорневая зона в (1,33±0,47)108 (2,67±0,16) B. pendula момент размещения ПГА Прикорневая зона в (2,21±0,24)109 (6,77±4,51) конце сезона (1,29±0,08)109 (1,96±0,05) Поверхности пленок ПГА Аналогично лабораторным исследованиям установлено, что на поверхности полимерных пленок формировался специфичный микробиоценоз, отличающийся по составу от микробного сообщества фоновой почвы. В контрольной почве среди грамположительных бактерий преобладали представители рода Micrococcus, кроме того, были выделены спорообразующие палочки из рода Bacillus и артробактерии. Среди представителей грамотрицательной микрофлоры выделены бактерии из рода Acinetobacter, Flavobacterium и Pseudomonas (табл. 7).
Таблица 7 – Соотношение (%) представителей доминирующих микроорганизмов в прикорневой зоне лиственницы и березы (сентябрь, 2007) % от % от Образец Грибы общей Бактерии общей почвы числ. числ.
1 2 3 4 Aureobasidium pullulans 38.9 Micrococcus varians 41. Penicillium madriti 16.7 Micrococcus roseus 35. L. sibirica – Penicillium decumbens 16.7 Acinetobacter sp. 11. контроль Penicillium atrovenetum 11.1 Arthrobacter sp. 3. Penicillium adametzioides 5.6 Bacillus alvei 2. Paecilomyces lilacinus 5. Agrobacterium sp. 24. Paecilomyces lilacinus 81. Aureobasidium pullulans 11.1 Cellulomonas sp. 17. L. sibirica – Alcaligenes sp. 6. Acremonium butyri 3. поверхности Aureobacterium Zygosporium masonii 1. ПГА Penicillium novae terregens 4. -caledoniae 1.9 Acinetobacter sp. 1. Pseudomonas sp. 1. Arthrobacter sp. 1. Продолжение таблицы 1 2 3 4 Micrococcus roseus 49. Penicillium fusco-flavum 50. Penicillium steckii 13.6 Micrococcus varians 24. Aureobasidium pullulans 13.6 Actinomyces sp. 6. B. pendula – Micrococcus luteus 3. Verticillium lateritium 9. контроль Trichoderma piluliferum 4.5 Arthrobacter sp. 3. Trichoderma sp. 4.5 Bacillus fastidiosus 1. Pseudomonas sp. 1. Penicillium aurantio Flavobacterium sp. 1. violaceum 4. Bacillus fastidiosus 21. Penicillium canescens 47. Arthrobacter sp. 5. Penicillium Alcaligenes sp. 5. corylophyloides 33. B. pendula – Aureobasidium pullulans 7.1 Micrococcus luteus 5. поверхности Nocardia sp. 5. Paecilomyces lilacinus 7. ПГА Actinomyces sp. 5. Verticillium lateritium 2. Nigrospora gallarum 2.4 Pimelobacter 5. Bacillus brevis 5. Pseudomonas sp. 1. Примечание: жирным шрифтом выделены виды грибов-деструкторов ПГА В составе микробоценозов, сформировавшихся на поверхности полимерных пленок, обнаружено другое соотношение микроорганизмов: в почве прикорневой зоны лиственницы преобладали представители рода Agrobacterium, на втором месте по численности – Cellulomonas, а в почве прикорневой зоне березы доминировали бактерии рода Bacillus.
Для выявления первичных деструкторов ПГА проведен отбор микроорганизмов, обладающих ПГА-экзодеполимеразами, методом прозрачных зон. За два полевых сезона выделено и проанализировано изолятов микроорганизмов. По совокупности морфологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических признаков идентифицированы доминирующие бактерии – первичные деструкторы ПГА:
Variovorax sp.;
Stenotrophomonas sp.;
Acinetobacter sp.;
Pseudomonas sp.;
Bacillus sp.;
Xanthomonas sp. (рис. 6).
При высеве на диагностическую среду наличие ПГА-деполимеразной активности подтверждено также для грибов Penicillium, Paecilomyces, Acremonium, Verticillium и Zygosporium. Основными деструкторами ПГА в почве прикорневой зоны лиственницы определены Paecilomyces lilacinus, численность которых составила 81,5 %. Этот же вид впервые был описан в качестве основного деструктора ПГА в работе (Sang et al., 2002). Среди грибов деструкторов ПГА в ризосфере березы доминировали представители рода Penicillium, суммарная численность которых достигала 81 %.
Рисунок 6. Филогенетическое положение бактерий-деструкторов ПГА, выделенных из почв Сибири (показано курсивом), на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 10 последовательностей.
Цифрами показаны значения индекса “bootstrap” 60% и более 2.2. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в почвах в тропических условиях Исследования проведены на климатических испытательных станциях (КИС) расположенных вблизи Ханоя (КИС Хоа Лак) и Нячанга (КИС Дам Бай).
Образцы полимеров двух типов – гомополимера П3ГБ и сополимера П3ГБ/3ГВ в виде пленок ( 30 мм) и объемных форм ( 10 мм, h=3 мм) – размещали в почве на глубине 5 см. Эксперимент длился с 14 мая 2010 по 15 марта 2011 на КИС Хоа Лак и с 7 мая 2010 по 28 мая 2011 на КИС Дам Бай. Почвенно климатические условия в районах исследования различались по ряду показателей. Температура и влажность воздуха, температура почвы были близкими в течение периода экспозиции. Однако количество осадков на станции Хоа Лак было практически на порядок выше, чем на станции Дам Бай.
Кроме того, для почвы Хоа Лак были характерны более низкие значения pH (5,5), чем для почвы Нячанга (6,6). Эти различия оказали влияние на микробиологические показатели почв и, соответственно, на процессы биоразрушения ПГА.
Биоразрушение образцов ПГА обоих типов происходило активнее в почвах Хоа Лак: пленки из гомополимера разрушились более чем на 98 % через 6 месяцев экспозиции на КИС Хоа Лак и только на 48 % через год на КИС Дам Бай (рис. 7).
Рисунок 7. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в почве в тропических условиях Объемные прессованные формы П3ГБ за 10 месяцев экспозиции разрушились на 60 и 28 % на Хоа Лак и Дам Бай соответственно. Следует отметить, что в обоих районах исследований зафиксировано более быстрое разрушение образцов пленок и объемных форм, изготовленных из гомополимера П3ГБ по сравнению с сополимерными образцами П3ГБ/3ГВ.
Так, длительность периодов, за которые масса пленок уменьшилась на от исходной, составила для П3ГБ – 16, а для П3ГБ/3ГВ – 260 суток в почвах на Хоа Лак. В районе станции Дам Бай образцы из сополимера за год разрушились лишь на 8-14 %.
Полученные результаты отличаются от аналогичных показателей по механизму деградации ПГА, полученных в почвах Сибири, однако они соответствуют ряду работ, в которых также отмечено более быстрое разрушение П3ГБ по сравнению с П3ГБ/3ГВ изолятами бактерий-деструкторов (Manna, Paul, 2000), актиномицетов (Manna et al., 1999) и грибов (Sanyal et al., 2006;
McLellan, Halling, 1988). Такое расхождение связано с различием микробиоценозов почв и, соответственно, субстратной специфичностью ПГА экзодеполимераз, продуцируемых микроорганизмами-деструкторами (Manna, Paul, 2000).
В условиях тропиков зафиксировано значительное падение средневесовой молекулярной массы всех образцов ПГА и возрастание полидисперсности, что свидетельствует о происходящем процессе деструкции С-цепей полимера и образовании более мелких фрагментов с различной степенью полимеризуемости (табл. 8).
Таблица 8 – Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в тропических почвах Параметр Исходные значения После экспозиции в После экспозиции в почве КИС Хоа Лак почве КИС Дам Бай П3ГБ П3ГБ/ П3ГБ П3ГБ/ П3ГБ П3ГБ/ 3ГВ 3ГВ 3ГВ Пленки (2D) Кристалличность 60 51 60 58 62 Cx, % Молекулярная 1401±106 1318±85 1162±37 960±6 1075±60 828± масса Мв, кДа Полидисперс- 2,0±0,37 2,01±0,23 2,16±0,16 2,22±0,15 2,54±0,21 2,48±0, ность Объемные формы (3D) Кристалличность 67 68 70 71 70 Cx, % Молекулярная 1401±106 1318±85 563±18 478±16 502±6 363± масса Мв, кДа Полидисперс- 2,0±0,37 2,01±0,23 3,42±0,07 3,60±0,08 3,71±0,27 5,56±1, ность По данным рентгеноструктурного анализа установлено незначительное возрастание степени кристалличности почти всех исследованных образцов ПГА в ходе разрушения. Аналогичный результат был получен при исследовании в сибирских почвах. Однако падение величины средневесовой молекулярной массы (Мв) в тропических условиях было более выраженным по сравнению с результатами, полученными в условиях Сибири.
Анализ результатов исследования микробиоценозов контрольных образцов почвы двух исследуемых районов Вьетнама выявил существенные отличия. Так, общая численность бактерий в почвах Хоа Лак составила 16 млн.
КОЕ в 1 г, тогда как в почвах станции Дам Бай – 8 млн. КОЕ в 1 г. Численность микромицетов различалась на порядок – 84 тыс. КОЕ в 1 г почвы станции Хоа Лак и 8,0 тыс. КОЕ в 1 г почвы станции Дам Бай (табл. 9).
Таблица 9 – Общая численность микроорганизмов в тропических почвах (ноябрь, 2010 г.) Бактерии Грибы Варианты опыта КИС Хоа КИС Дам КИС Хоа КИС Дам Лак Бай Лак Бай (1,6±0,5)10 (8,0±3,2)10 (8,4±1,2)10 (8,0±2,3) 7 6 Фоновая почва (3,3±0,3)108 (3,1±0,6) Поверхность П3ГБ н/о н/о (2D-формы) (6,9±2,1)108 (9,2±2,0)108 (2,2±0,6)106 (1,2±0,4) Поверхность П3ГБ (3D-формы) Поверхность П3ГБ/3ГВ (1,2±0,1)108 (7,1±3,6)108 (2,2±0,8)106 (3,2±1,3) (2D-формы) Поверхность П3ГБ/3ГВ (1,7±1,0)108 (5,5±1,4)108 (6,2±1,3)105 (6,8±2,2) (3D-формы) Примечание: «н/о» - показатели не определяли, т.к. образцы деградировали На поверхности образцов ПГА, аналогично предыдущим исследованиям, численность органотрофных микроорганизмов возрастала по сравнению с показателями фоновой почвы на 1-2 порядка. Таким образом, полимер стимулировал развитие как бактерий, так и грибов в почве, являясь для них дополнительным субстратом.
Видовой состав микробных сообществ также значительно различался.
Почвы Хоа Лак характеризовались более разнообразным бактериальным сообществом по сравнению с почвами Дам Бай. Однако доля первичных деструкторов составляла 7,5-10 % от общего количества микроорганизмов, выделенных из пленок обрастания.
На поверхности полимерных образцов формировался микробиоценоз, специфичный для конкретной природной среды, и отличающийся от контрольных образцов почвы (табл. 10). В почвах на станции Дам Бай преобладали бактерии-деструкторы, тогда как в почвах станции Хоа Лак – грибы. По всей видимости, различия видового состава связаны с условиями среды обитания, в том числе с кислотностью почвы. Так, почвы на станции Хоа Лак – слабокислые, что благоприятно для развития грибов, в то время как на КИС Дам Бай значения рН почвы близки к нейтральному.
Таблица 10 – Доминирующие микроорганизмы в тропических почвах (ноябрь, 2010 г.) Образец Виды бактерий Виды грибов почвы КИС Хоа Acinetobacter calcoaceticus Aspergillus sp.
Лак Arthrobacter artocyaneus Aspergillus niger Bacillus aerophilus, Bacillus megaterium, Gongronella butleri Bacillus sp. Penicillium sp.
Brevibacillus agri Phizopus stolonifer Brevibacillus invocatus Spicaria sp.
Burkholderia sp. Acremonium recifei Chromobacterium violaceum Paecilomyces Cupriavidus gilardii lilacinus Mycobacterium fortuitum Trichoderma Nocardiopsis sp. pseudokoningii Ochrobactrum anthropi Staphylococcus arlettae, Staphylococcus pasteuri Streptomyces sp.
Pseudomonas acephalitica Rodococcus equi КИС Дам Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus Gongronella butleri Бай mycoides Penicillium oxalicum Brevibacillus agri Penicillium sp.
Gordonia terrari Aspergillus sp.
Cupriavidus sp.
Burkholderia sp.
Microbacterium paraoxydans Mycobacterium sp.
Streptomyces sp.
Примечание: жирным шрифтом выделены микроорганизмы-деструкторы ПГА Определение видового состава первичных деструкторов ПГА показало, что среди бактерий доминировали грамотрицательные палочки, принадлежащие к роду Burkholderia. Эти микроорганизмы были выделены из образцов обоих исследуемых районов. Также в почвах обеих станций обнаружены актинобактерии рода Streptomyces. Кроме этих представителей на станции Дам Бай в качестве деструкторов ПГА определены бактерии родов Bacillus, Cupriavidus и Mycobacterium, а на Хоа Лак – актинобактерии рода Nocardiopsis. Среди грибов-деструкторов ПГА общими для исследуемых районов определены Gongronella butleri и Penicillium sp. Виды Acremonium recifei, Paecilomyces lilacinus и Trichoderma pseudokoningii встречались только в почве станции Хоа Лак. Результаты идентификации бактерий и грибов – первичных деструкторов ПГА, проведенные по совокупности культуральных, морфо-физиологических признаков и результатов секвенирования генов 16S и 28S рРНК, представлены на рисунках 8 и 9.
Рисунок 8. Филогенетическое положение изученных штаммов бактерий деструкторов ПГА, выделенных из тропических почв (показано жирным шрифтом), на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей. Цифрами показаны значения индекса “bootstrap” 50% и более.
Рисунок 9. Филогенетическое положение изученных штаммов микромицетов деструкторов ПГА, выделенных из тропических почв (показано жирным шрифтом) на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 28S рРНК методом ближайших соседей. Цифрами показаны значения индекса “bootstrap” 60% и более.
Таким образом, активность и механизм процессов биоразрушения ПГА в сибирских и тропических почвах зависели от численности и специфичности микробиоценозов, сформировавшихся в анализируемых экосистемах. Активное разрушение ПГА зафиксировано при обсемененности почв не менее чем 10 КОЕ в 1 г.
3. Закономерности биоразрушения ПГА в природных водоемах В важной проблеме оценки последствий постепенной замены синтетических пластмасс разрушаемыми биополимерами наименее изученным аспектом остается биодеградация ПГА в природных водоемах. Ранее сотрудниками Института биофизики СО РАН были проведены исследования деградации ПГА в пресных водоемах в окрестностях Красноярска (Volova et al., 2007). Принимая во внимание тот факт, что акватория Мирового океана превращается в глобальный аккумулятор пластиковых отходов, и это крайне негативно сказывается на состоянии гидросферы, в данной работе исследования были сосредоточены на процессах биоразрушения ПГА в водных экосистемах повышенной солености.
3.1. Исследование биоразрушения полигидроксиалканоатов в морской воде в тропических условиях Исследование разрушаемости ПГА проведено на морском испытательном стенде в бухте Дам Бай Южно-Китайского (Восточного) моря. Образцы ПГА двух типов (П3ГБ и П3ГБ/3ГВ с включением гидроксивалерата около 10 мол%) в чехлах из мелкоячеистого мельничного газа были закреплены на стандартных стационарных кассетах из нержавеющей стали, которые помещали в шлюзовую камеру платформы. Глубина погружения образцов в море составила 120 см.
Эксперимент проведен в период с 11 марта по 27 июля 2009 г. За это время гидрохимические показатели морской воды изменялись незначительно:
температура воды 28,5±1,5 °С;
рН 7,0-7,5;
соленость около 34 ‰, концентрация растворенного кислорода 5,4-8,3 мг/мл Потеря массы образцов ПГА в течение первых 60 суток экспозиции происходила медленно, без резких изменений. За этот период происходило формирование биопленок обрастания на поверхности образцов и адаптация микроорганизмов к субстрату. Затем убыль массы изделий из ПГА быстро увеличивалась, при этом пленочные образцы, имеющие большую площадь поверхности, разрушались быстрее объемных форм (рис. 10). Остаточная масса пленок гомополимера через 140 суток экспозиции в морской воде составила 28,5 %, сополимера – 42,5 %, при периодах уменьшения массы образцов на от 127 до 133 суток. Остаточная масса прессованных форм была выше и составила к концу эксперимента 63,5 и 86,7 % для П3ГБ и П3ГБ/3ГВ соответственно. В тропической морской воде, также как и в тропических почвах, образцы из П3ГБ разрушались быстрее, чем П3ГБ/3ГВ.
Изменение морфологии поверхности прессованных форм в процессе биоразрушения проявлялись менее значительно по сравнению с поверхностью пленок (рис. 11).
Рисунок 10. Изменение массы образцов ПГА (% от исходной) в морской воде Южно-Китайского моря Рисунок 11. Изменение структуры поверхности П3ГБ в виде пленок (1) и объемных форм (2): а – исходные образцы;
б – после экспозиции в морской воде Южно-Китайского моря Молекулярная масса образцов всех типов в процессе разрушения снизилась, а значение полидисперсности увеличилось (табл. 11). Эти данные аналогичны результатам, полученным в предыдущих экспериментах. Тем не менее, анализ рентгенограмм ПГА не выявил изменения степени кристалличности. Это позволяет говорить о том, что в процессе биодеградации ПГА в морской среде в исследованных условиях происходило разрушение микроорганизмами обеих фаз, как аморфной, так и кристаллической, в результате чего интегральный показатель степени кристалличности ПГА не изменился.
Таблица 11 – Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в морской воде Южно-Китайского моря Параметр Исходные значения После экспозиции в морской воде П3ГБ П3ГБ/3ГВ П3ГБ П3ГБ/3ГВ Пленки (2D) Кристалличность Cx, 71 69 70 % Молекулярная масса 1401 ± 106 1318 ± 85 1040 ± 33 1114 ± Мв, кДа Полидисперсность 2,00 ± 0,37 2,01 ± 0,23 2,26 ± 0,20 2,00 ± 0, Объемные формы (3D) Кристалличность Cx, 70 71 71 % Молекулярная масса 1359 ± 63 1427 ± 46 1090 ± 87 610 ± Мв, кДа Полидисперсность 1,83 ± 0,11 2,06 ± 0,12 2,57 ± 0,51 2,41 ± 0, Микробиологические исследования показали, что в морской воде бухты Дам Бай общая численность гетеротрофных бактерий на среде Y-K составляла 1,6103 КОЕ в 1 мл, численность микроскопических грибов – 1,2102 КОЕ в мл. На поверхности полимерных образцов, экспонированных в морской воде в течение 140 суток, сформировались биопленки, в которых регистрировали более высокую численность и большое разнообразие микроорганизмов.
Грамотрицательные палочки доминировали во всех образцах, составляя от до 65 % (табл. 12).
Исследование способности выделенных микроорганизмов к гидролизу ПГА показало, что их значительная доля не проявляла ПГА-деполимеразной активности. Выделенные штаммы-деструкторы ПГА идентифицированы как Enterobacter cloacae IBP-V001, Bacillus sp. IBP-V002 и Gracilibacillus sp. IBP V003 (рис. 13).
Результаты идентификации доминирующих микроорганизмов деструкторов представлены на рисунке 12.
Таблица 12 – Доминирующие микроорганизмы в морской воде Южно Китайского моря (июль, 2009 г.) Бактерии Грибы Морская вода Поверхность Морская вода Поверхность образцов образцов ПГА ПГА Pseudomonas Pseudomonas Aspergillus Aspergillus Flavobacterium Pseudoalteromonas Verticillium Penicillium Enterobacter Mucor Trichoderma Enterobacter Bacillus Cellulomonas Verticillium Halobacterium Mucor Bacillus Propionibacterium Gracilibacillus Malbranchea Corynebacterium Staphylococcus Planococcus Мicrococcus Arthrobacter Примечание: жирным шрифтом выделены микроорганизмы-деструкторы ПГА Рисунок 12. Филогенетическое положение изученных штаммов бактерий – деструкторов ПГА, выделенных из морской воды (показано жирным шрифтом), на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые последовательностей. Цифрами показаны значения индекса “bootstrap” более 65%.
Размер шкалы – 5 мкм Исследование деполимеразной активности микроскопических грибов в отношении ПГА показало, что из всех выделенных видов способностью к биодеградации обладает только один – Malbranchea sp. Таким образом, в процессах морской деструкции ПГА в тропических условиях в основном принимают участие бактерии.
3.2. Исследование деградации ПГА в солоноватоводном озере Шира Особенностью озера Шира является глубинная стратификация по температуре, химическому составу, а также характеристикам биоты (Kalacheva et al., 2002;
Gaevsky et al., 2002;
Пименов с соавт., 2003;
Zadereev, Tolomeev, 2007). Образцы пленок ( 30 мм), изготовленных из ПГА двух типов (П3ГБ и П3ГБ/3ГВ с включением гидроксивалерата около 10 мол%), погружали на различную глубину с учетом горизонтов стратификации озера. Глубина 3 м соответствует эпилимниону (теплые верхние воды, летние температуры порядка 20 оС, оксигенные процессы);
глубина 9 м – гиполимниону (холодные воды под термоклином, летние температуры порядка 6 оС, оксигенные процессы);
глубина 13 м – хемоклину (зона перехода от оксигенных к аноксигенным условиям, температура порядка 2 оС, как оксигенные так и аноксигенные процессы);
20 м – монимолимниону (неперемешивающиеся воды под хемоклином, аноксигенные процессы, температура порядка 1 оС).
Эксперимент проведен с 13 июня по 29 августа 2007 г. В этот период регистрировали изменение физико-химических параметров водоема.
Температура воды в эпилимнионе составляла от 13 °С в начале эксперимента до 23-24 °С в середине июля;
на глубине 9 м температура была подвержена меньшим колебаниям – от 12 до 18 °С;
в хемоклине и монимолимнионе в среднем составляла 5,0-6,0 и 1,5-2,0 °С, соответственно. Соленость воды варьировала от 10,6-11 ‰ на верхних горизонтах до 12-12,5 ‰ – ниже хемоклина;
значения рН составляли от 8,9 до 8,5.
Характер уменьшения массы пленок из ПГА на разных глубинах озера указывал на то, что практически во всех случаях имела место латентная фаза от 20 до 40 суток, как и при биодеградации образцов ПГА в морской воде.
Наиболее активно разрушение ПГА происходило на глубине 3 м, где через 50 суток экспонирования масса пленок из гомополимера (П3ГБ) уменьшилась на 9,0 % от исходной, масса образцов из сополимера – на 15,8 % (рис. 13). По данным Н.В. Пименова с соавт. (2003) на этом горизонте регистрируется высокая концентрация бактерий планктона, а поскольку основной механизм разрушения ПГА в окружающей среде связан с ферментативной активностью бактерий, поэтому в верхних горизонтах водоема возникали благоприятные условия для его деградации.
На глубине 9 м достоверного изменения массы образцов пленок обоих типов ПГА не обнаружено. Это объясняется преобладанием автотрофных микроорганизмов и небольшой долей деструкторов, т.к. на данном горизонте оз. Шира находится зона активного фотосинтеза с максимальной концентрацией хлорофилла и биомассы цианобактерий и зеленых водорослей (Gaevsky et al., 2002).
Рисунок 13. Изменение массы пленок из ПГА (% от исходной) в озере Шира, экспонированных на различных глубинах: 1 – П3ГБ, 2 – П3ГБ/3ГВ Примечательно, что деградация образцов зафиксирована также в монимолимнионе (20 м), для которого характерны отсутствие кислорода, наличие сероводорода и низкие температуры. В конце периода наблюдения на этом горизонте отмечено снижение массы гомополимера П3ГБ на 9,2 %, сополимера – на 16,2 % от исходных величин. Это свидетельствует об активном участии анаэробной микрофлоры в ассимиляции ПГА в водоемах.
В связи с малыми значениями убыли массы пленок проанализированы (с использованием ВЭЖХ) и определены средневесовая, среднечисловая молекулярная массы, а также степень полидисперсности ПГА (табл. 13).
Таблица 13 – Изменение степени кристалличности и молекулярной массы образцов ПГА в процессе биодеградации в озере Шира Параметр Исходные После экспозиции на различной глубине значения 3м 9м 13 м 20 м Пленки, П3ГБ Кристалличность Cx, % 64 68 65 69 Молекулярная масса 884±19 874±38 863±29 796±40 808± Мв, кДа Полидисперсность 2,1±0.1 2,6±0,1 2,3±0,1 2,4±0,1 2,5±0, Пленки, П3ГБ/3ГВ Кристалличность Cx, % 54 64 57 61 Молекулярная масса 872±41 785±44 795±67 718±32 670± Мв, кДа Полидисперсность 2,2±0,1 3,0±0,2 2,4±0,1 2,9±0,1 2,3±0, Зафиксированное снижение молекулярной массы на всех горизонтах является свидетельством протекания процесса биоразрушения ПГА в озере Шира на глубине до 20 м, как в оксигенных, так и в аноксигенных зонах водоема.
4. Конструирование и оценка эффективности долговременных форм сельскохозяйственных препаратов, депонированных в матрикс из ПГА Использование биоразрушаемых полимеров в качестве платформы для депонирования и доставки препаратов сельскохозяйственного назначения – новое направление исследований, ориентированное на снижение риска неконтролируемого распространения химических соединений в биосфере.
Такие формы позволяют сократить объемы вносимых в почву препаратов и обеспечить их длительную и контролируемую доставку в течение вегетационного сезона (Piletska, 2005;
Kanampiu, 2009).
Анализ данных, полученных при исследовании закономерностей биоразрушения ПГА в почвах, свидетельствует о постепенном развитии этого процесса, что позволяет использовать полимеры этого класса для конструирования долговременных форм сельскохозяйственных препаратов нового поколения. Исследования выполнены на примере трех типов препаратов: гербицида, азотного удобрения и биофунгицида на основе гриба Trichoderma.
4.1. Долговременная форма гербицидного средства, депонированного в матрикс из ПГА В качестве гербицида исследован системный препарат Зеллек-супер (действующее вещество – галоксифоп);
спектр гербицидной активности – однолетние и многолетние злаковые. Для депонирования гербицида использовали сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (П3ГБ/3ГВ), который разрушается в сибирских почвах быстрее, чем гомополимер (П3ГБ). Были получены экспериментальные формы гербицида в виде пленок и микрогранул. Соотношение «полимер : гербицид» в пленке составило 25 : 75 (в % от общей массы). Из полученных пленок высекали фрагменты размером 55 мм. Для получения микрогранул использовали раствор гербицида и сополимера в дихлорметане, осаждая его в гексане методом микродропинга. Получено два вида микрогранул с соотношением «полимер : гербицид» - 60 : 40 и 90 : 10 (в % от общей массы).
Эффективность действия разработанных форм гербицида оценивали в лабораторных условиях. Одновременно с посевом семян модельных растений Agrostis stolonifera L. в контейнеры с почвой вносили экспериментальные препараты. Отрицательный контроль – вариант без гербицида, положительный контроль – рекомендованная форма обработки, опрыскивание раствором гербицида в фазе начала кущения.
Убыль массы гранул варьировала в зависимости от степени нагруженности препарата гербицидом (рис. 14). Так, через 19 суток после начала эксперимента остаточная масса гранул, в которых соотношение «полимер : гербицид» было 60 : 40, составила 87 %, в то время, как для гранул с соотношением, равным 90:10, эта величина составила 56 %. Однако, через суток в обоих вариантах опыта остаточная масса гранул сравнялась и составила 28 % от исходной. С увеличением содержания гербицида в форме увеличивалась скорость его выхода. Конечная концентрация препарата составила 30 мкг/ г почвы для более нагруженных Зеллеком гранул, и 17 мкг/г – для гранул с меньшей нагруженностью.
Рисунок 14. Динамика биоразрушения в почве матрикса из П3ГБ/3ГВ в виде пленок и микрогранул (1) и оттока гербицида Зеллек-супер (2):
микрогранулы с соотношением «полимер : гербицид» - 60:40 (a) и 90:10 (б);
пленки с соотношением 75:25 (в) Деградация пленочных образцов происходила медленнее по сравнению с гранулами: к концу эксперимента остаточная масса полимера составила 67 % (рис. 14в). В отличие от гранулированной формы выход гербицида из полимерной пленки был более активным и неравномерным. В первые 19 суток выход препарата составил 142 мкг на 1 г почвы, что соответствует 91 % от включенного. Выход гербицида в этот период происходил за счет диффузии препарата через полимерный матрикс и был связан с тем, что пленки обладают большей площадью контакта по сравнению с гранулами. Далее процесс высвобождения препарата замедлился на фоне начавшейся деградации полимера.
Микробиологический анализ показал, что экспериментальные формы препарата не подавляли развитие почвенной микрофлоры. Численность микроорганизмов в контрольной почве составляла (2,38±0,09)1010 КОЕ/г, в опытных вариантах с внесением экспериментальных форм препаратов – почти в 3 раза превышала численность микрофлоры в контрольных образцах.
Добавление гербицида в концентрации 15 мкг на 1 г почвы не оказывало достоверного влияния на рост микроорганизмов.
По мере разрушения полимерного матрикса, выхода препарата в почву и его доставки к корневой системе растений количество ростков постепенно снижалось, всходы быстро увядали и высыхали (рис. 15).
Рисунок 15. Подавление роста растения (Agrostis stolonifera L.) гербицидом Зеллек: 1 - контроль (без применения гербицида), 2 – традиционная форма обработки (опрыскивание раствором гербицида), 3 - форма гербицида в виде микрогранул, 4 форма гербицида в виде пленок Подавление роста растений, оцениваемое по количеству биомассы в конце периода наблюдения, составило 96-99 % по сравнению с биомассой в контроле. Обработка растений препаратом Зеллек-супер методом опрыскивания в рекомендованных дозах оказалась менее эффективной. Этот способ не препятствовал фазе прорастания семян и не снижал всхожесть, так как обработке подвергали вегетирующие растения в фазе начала кущения и рост прекращался в более поздние сроки, через 23-25 суток после высева семян.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности разработанной формы гербицидного средства в виде пленок. В этом варианте более эффективный выход препарата из активно разрушающегося полимерного матрикса создавал высокую концентрацию препарата в почве и полностью подавлял развитие тестового растения.
4.2. Использование ПГА для разработки пролонгированной формы азотных удобрений Высокие концентрации азотных удобрений, вносимые в почву, не усваиваются в полной мере растениями и попадают в грунтовые воды вместе со стоками, вызывая эвтрофирование природных водоемов и массовое развитие цианобактерий. Использование удобрений, депонированных в полимерный матрикс, позволяет уменьшить концентрации вносимых препаратов и обеспечивает снижение азотной нагрузки на агроценозы. Однако необходимо определить, насколько соответствует скорость разрушения полимерного матрикса и оттока азота в почву потребностям растений.
Разработаны и исследованы две экспериментальные формы пролонгированного азотного удобрения (на примере карбамида): в виде пленок и объемных прессованных форм на тестовом растении – салате листовом (Latuca sativa) – в условиях фитотрона. Использовали также отрицательный контроль – без внесения удобрения, и положительный контроль – полив раствором карбамида в рекомендованных дозах.
Анализ показал, что процесс разрушения полимерных матриксов обоих форм препарата протекал практически одинаково. Спустя 7-8 суток от начала наблюдения убыль массы пленок и гранул составила 35-40 % от исходной;
через 12-14 суток – 50 %;
к концу наблюдения (28 суток) остаточная масса была на уровне 30-35 %.
Результаты измерения концентрации азота в почве показали отличия в разных вариантах используемой формы доставки удобрения. Концентрация азота в почве в положительном контроле резко нарастала и достигла на 7-е сутки 0,1 мг/ г почвы. В опыте с пленочной формой депонированного карбамида профиль выхода азота был аналогичным, однако зарегистрированный максимум его концентрации в почве составил 0,06 мг/г.
Выход азота из прессованной формы и его накопление в почве были на уровне 0,047 мг/г, что практически в 2 раза ниже по сравнению с внесением свободного карбамида. В течение последующих 6-8 суток концентрация азота в почве сравнялась во всех вариантах. За период наблюдения из полимерных форм выход азота составил около 70 % (рис. 16).
Рисунок 16. Динамика концентрации азота в почве при различных способах доставки карбамида Анализ концентрации азота в дренажных водах показал, что при внесении удобрения в свободном виде и в виде пленок, часть азота в первые 7 суток эксперимента была вынесена из системы дренажными водами, и таким образом была потеряна для растений. Потери азота, депонированного в объемные формы, были существенно ниже (рис. 17).
Рисунок 17. Динамика концентрации азота в дренажных водах при различных способах доставки карбамида При определении влияния формы подачи азота на урожай тестового растения было установлено, что в первые две недели количество образованной биомассы было близким при всех способах внесения азотного удобрения.
Важно отметить, что в начальный период, несмотря на то, что основная масса карбамида была связана в полимерном матриксе, отставания в росте салата не было. К концу наблюдения (28 сутки) отмечено достоверное увеличение биомассы при использовании экспериментальных форм карбамида на 18-25 % (рис. 18).
Рисунок 18. Динамика прироста биомассы растений Latuca sativa при различных способах доставки карбамида Микробиологический анализ образцов почвы показал, что в период вегетации в контрольной почве без удобрений, количество микроорганизмов изменилось незначительно по сравнению с исходной. В варианте с внесением карбамида поливом в виде раствора наблюдали тенденцию к незначительному снижению численности органотрофных бактерий и микромицетов в почве по сравнению с контролем (табл. 14).
Таблица 14 – Количественный состав микрофлоры в почвенных образцах при различных способах доставки азота Варианты опыта Численность микроорганизмов, КОЕ в 1 г почвы Бактерии (МПА) Актинобактерии Грибы (СА) (КАА) (5,6±1,9)107 (3,6±0,5)105 (4,0±1,3) Исходная почва (начало опыта) (2,7±1,1)107 (2,8±1,1)105 (3,6±1,2) Отрицательный контроль (почва без внесения карбамида) (1,4±0,5)107 (4,1±0,7)106 (1,8±0,6) Внесение карбамида в свободной форме (4,3±2,0)109 (5,3±1,6)107 (3,4±1,3) Карбамид, депонированный в пленках (1,4±0,5)109 (1,3±0,3)107 (3,1±1,3) Карбамид, депонированный в объемных формах Депонирование карбамида в ПГА-матрикс привело к достоверному увеличению численности бактерий по сравнению с контролем. Наибольшая численность бактерий зарегистрирована в варианте с внесением карбамида в пленках и достигала (4,3±2,0)109 КОЕ в 1 г почвы. Достоверного изменения численности микромицетов в опытных вариантах зарегистрировано не было.
Анализ соотношения эколого-трофических групп микроорганизмов в опытных и контрольных вариантах показывает характер протекания и сбалансированность процессов минерализации азот- и углеродсодержащего вещества, поступающего в почву. Исходная и контрольная почва, в которую не вносили карбамид, характеризовались законченностью процессов деструкции органического вещества, с коэффициентами минерализации 2,61 и 1, соответственно (табл. 15). При внесении раствора карбамида в почве резко возрастала численность прототрофов, использующих аммонийный азот, в то же время количество копиотрофов и азотфиксаторов сохранялось на контрольном уровне. Высокий коэффициент минерализации свидетельствовал об изменении соотношения С/N в сторону повышения количества азота.
Таблица 15 – Соотношение эколого-трофических групп почвенных микроорганизмов при различных способах доставки азота Варианты опыта Численность эколого-трофических групп, КОЕ в 1 г почвы Копиотрофы Прототрофы Азотфиксаторы Коэффициент минерализации (5,6±1,9)107 (1,4±0,2)108 (4,2±0,6) Исходная почва 2, (начало опыта) (2,7±1,1)107 (3,1±1,0)107 (3,4±1,1) Отрицательный 1, контроль (почва без внесения карбамида) (1,4±0,5)107 (2,7±1,0)108 (1,4±0,6) Внесение 19, карбамида в свободной форме (4,3±2,0)109 (9,0±0,3)108 (1,8±0,6) Карбамид, 0, депонированный в пленках (1,4±0,5)109 (1,0±0,3)108 (1,7±0,6) Карбамид, 0, депонированный в объемных формах При внесении в почву карбамида, депонированного в прессованные формы, коэффициент минерализации понижался до 0,07. Связано это с тем, что выход азота из объемных матриксов был более медленным, чем из пленок, сдвиг соотношения С/N был направлен в сторону увеличения поступления углеродсодержащей органики за счет полимера. В варианте с внесением карбамида в виде пленок сдвиг С/N был менее значительным, поскольку повышение концентрации углеродсодержащего вещества компенсировалось поступлением аммонийного азота и приводило к увеличению всех групп микроорганизмов в почве.
В аналогичном опыте с использованием экспериментальных форм карбамида, депонированного в полимерный матрикс П3ГБ в виде пленок и гранул, оценили эффективность препаратов на тестовом растении Agrostis stolonifera L. при естественном освещении. В результате было выявлено позитивное влияние исследуемых форм удобрений на рост биомассы растения.
В экспериментальных группах биомасса растений (по абсолютно сухому веществу) на 22-е сутки относительно негативного контроля была выше в 1,3 1,5 раза. Биомасса растений в вариантах с экспериментальными формами удобрений достоверно не различалась между собой и с положительным контролем, т.е. скорость выхода не лимитировала развивающееся растение (рис. 19).
Рисунок 19. Прирост биомассы растений Agrostis stolonifera L. при различных способах доставки карбамида: 1 – отрицательный контроль без внесения удобрения;
2 – положительный контроль;
3 – карбамид, депонированный в гранулы;
4 – карбамид, депонированный в пленки Таким образом, депонированная форма азотного удобрения по своей эффективности не уступает свободной форме, и в то же время динамика разрушения полимерного матрикса обеспечивает адекватный потребностям культуры отток препарата, исключая возникновения лимита для растений по азоту.
5. Конструирование новых форм биологических препаратов защиты растений на основе иммобилизованных спор грибов Trichoderma Биологические препараты на основе грибов Trichoderma эффективны в отношении широкого круга фитопатогенов и широко применяются для защиты сельскохозяйственных и лесных культур. Их действие сопоставимо и даже в ряде случаев превосходит эффект химических фунгицидов. Учитывая, что распространение химических средств защиты растений приводит к развитию резистентности у патогенов, существует острая необходимость замены слабоактивных и опасных для окружающей среды химических пестицидов биологическими средствами. Особенно актуально применение биопрепаратов при ведении органического сельского хозяйства.
В России разработано и запатентовано около 20 препаратов, содержащих биомассу (споры или мицелий) гриба. Они используются для борьбы с возбудителями болезней растений и обладают высокой антагонистической активностью к широкому спектру грибных фитопатогенов, относящихся к родам Fusarium, Rhizoctonia, Helminthosporium, Colletotrichum, Alternaria, Sclerotinia, Verticillium, Botrytis, Phytophtora и др. (Тюльпанова с соавт. 1997;
Гайдашева с соавт., 2008;
Громовых с соавт., 2002;
Гродницкая, Сорокин, 2006;
Справочник…, 2011) 5.1. Эффективность биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma в защите сеянцев хвойных в лесопитомниках В полевых опытах вегетационных периодов 1997 и 1998 гг., проведенных в Мининском лесопитомнике Красноярского края, оценивали действие биофунгицида на основе гриба T. harzianum, вносимого в ризосферу сеянцев ели, на фоне естественного микробиоценоза. Опытные варианты включали следующие формы: внесение T. harzianum в почву вместе с посевным материалом в виде чистых спор, а также в виде препарата триходермин-БЛ на твердом носителе (зерна ячменя). Инфекционная нагрузка при внесении чистых спор гриба составляла 150 тыс. спор на 1 см2 почвы, а при внесении триходермина-БЛ использовали два варианта: 600 и 1200 тыс. спор на 1 см2.
Как показали исследования, при внесении спор T. harzianum масса корневой системы сеянцев увеличилась на 36,7 %, а при внесении разных концентраций триходермина-БЛ – на 10,2 и 34,7 % по сравнению с контролем.