авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МОРДВИНОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

РЕГУЛЯТОРНЫХ РАЙОНОВ И МЕХАНИЗМЫ ТРАНСКРИПЦИИ

ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Кольцово - 2008

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск), университете Западной Австралии (the University of Western Australia, Perth) и Технологическом университете Перта (Curtin University of Technology, Perth, Western Australia)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Э. Г. Малыгин доктор медицинских наук, профессор С. В. Сенников доктор биологических наук Н. Б. Рубцов

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится 26 сентября 2008 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу:

ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559;

тел. (383) 336-74-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «» 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Л. И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Согласно современным представлениям, основные события, ' определяющие временные и количественные характеристики экспрессии генов, происходят на уровне транскрипции. Транскрипцию генов контролируют регуляторные белки – транскрипционные факторы (ТФ), опознающие определенные последовательности ДНК. Такие последовательности – сайты связывания ТФ – представляют собой регуляторные элементы, формирующие регуляторные области генов.

Инициация транскрипции и её реализация зависят от взаимодействия ТФ с регуляторными элементами. Таким образом, набор регуляторных элементов генов программирует их экспрессию в онтогенезе, определяет тканеспецифичность экспрессии, а также способность отвечать на сигналы внешней и внутренней среды. В связи с этим исключительно важное значение имеют исследования, направленные на выявление отдельных регуляторных элементов в различных генах, изучение их свойств и идентификацию ТФ, взаимодействующих с данными элементами. Результаты таких структурно функциональных исследований позволяют перейти к изучению общих и ген специфических механизмов регуляции транскрипции и создают базу для решения других актуальных задач молекулярной биологии - выяснению принципов организации регуляторной зоны гена и раскрытию механизмов, обеспечивающих реализацию информации, заложенной в последовательностях ДНК этой зоны.

Интерлейкин-5 (ИЛ-5) - гомодимерный гликопротеин, секретируемый в основном активированными Т-лимфоцитами [Schwenger et al., 2000]. Впервые он был описан как фактор дифференцировки эозинофилов [Sanderson et al., 1985]. Впоследствии было показано, что ИЛ-5 регулирует продукцию эозинофилов, контролирует их дифференцировку, миграцию, активацию и продолжительность жизни in vivo и in vitro [Hogan, 2007]. Эозинофилия, повышенное содержание эозинофилов в периферической крови и тканях, как правило, сопровождается высоким уровнем экспрессии гена ИЛ-5. У животных, несущих инактивированый ген ИЛ-5, индуцировать эозинофилию не удаётся [Foster et al., 1996]. Таким образом, ИЛ-5 является одним из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов.

Эозинофилы - это гранулярные лейкоциты, которые продуцируются в костном мозге и после недолгого пребывания в периферической крови мигрируют в ткани. Принято считать, что эти клетки представляют в системе иммунитета основное звено противопаразитарной защиты [Sanderson, 1992]. В норме содержание эозинофилов в организме человека незначительно, однако, при определенных патологиях их количество может увеличиваться в несколько раз. Следует отметить, что при паразитарных заболеваниях рост числа эозинофилов, как правило, способствует элиминации паразитов и является признаком адекватной реакции организма на, например, глистную инвазию [Voehringer, 2007]. В противоположность этому, при аллергии, в частности, астме, рост числа эозинофилов ассоциируется с обострением заболевания [Kiley et al., 2007]. Наличие этих клеток в легких астматиков связано с повреждением ткани, а их количество коррелирует со степенью поздней астматической реакции [Jacobsen et al., 2007]. Выявлена также негативная роль эозинофилов при развитии ряда аутоиммунных и злокачественных заболеваний [Di Stefano, Amoroso, 2005].

Широкая распространенность заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, подчеркивает актуальность структурно-функционального картирования регуляторных районов гена ИЛ-5, идентификацию ТФ, определяющих активность отдельных элементов этих районов, и выяснение механизмов инициации и регуляции транскрипции гена. Не вызывает сомнений, что раскрытие системы контроля экспрессии гена ИЛ-5 будет способствовать дальнейшему прогрессу в понимании молекулярных механизмов патогенеза ряда серьёзнейших заболеваний.

На сегодняшний день одним из наиболее эффективных средств лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются препараты глюкокортикоидов [Hall, 2006;

Spahn, Szefler, 2007]. В результате применения этих средств у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al., 1991;

Greenfeder et al., 2001], в бронхиально-альвеолярных смывах падает количество Т-клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al., 1993]. Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов в практической медицине, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью. В частности, до сих пор не выяснен механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 глюкокортикоидами, не определены причины возникновения устойчивости экспрессии гена ИЛ-5 к их действию [Inagaki et al.,2006;

Kocak et al., 2006]. Таким образом, изучение механизмов действия глюкокортикоидов на экспрессию гена ИЛ-5 остается актуальной темой молекулярной биологии. Данные, полученные в результате таких исследований, могут быть полезны как для решения задач академического характера, так и для развития прикладных исследований по созданию новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

Установлено, что в Т-лимфоцитах экспрессия генов таких индукторов кроветворения и иммунного ответа, как ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и ГМ-КСФ часто происходит одновременно [Ansel et al., 2006;

Dean, 2006]. Вместе с тем известно, что существуют механизмы, позволяющие селективно регулировать экспрессию отдельных генов. Например, в отличие от активации экспрессии большинства генов цитокинов, запуск транскрипции гена ИЛ-5 зависит от синтеза белка de novo [Schwenger et al., 2002]. Таким образом, исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции ИЛ-5 является важным шагом к пониманию как общих, так и ген-специфических механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов.

Цель и задачи исследования Цель данной работы – исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции генов ИЛ- человека и мыши. Для её достижения необходимо было решить следующие задачи:

- Выбрать клеточную модель для проведения масштабных экспериментов по структурно-функциональному картированию регуляторных районов и изучению механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека.

- Провести структурно-функциональное картирование регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши.

- Идентифицировать белки, взаимодействующие с функционально активными элементами регуляторных районов и определить их роль в регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.

- Выяснить основные механизмы инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека.

Основные положения работы, выносимые на защиту 1. Cтруктурно-функциональные карты регуляторных районов генов ИЛ- человека и мыши существенно различаются между собой. Кроме того, найдены различия в составе белковых комплексов, определяющих активность сходных по локализации, структуре и функции регуляторных элементов генов человека и мыши. Эти факты указывают на участие видоспецифических механизмов в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.

2. Консервативный лимфокиновый элемент 0 (CLE0) контролирует инициацию и уровень транскрипции гена ИЛ-5 человека. Ключевым транскрипционным фактором, определяющим активность CLE0, является AP-1. Функцию регулятора активности формирования комплекса CLE0/AP-1 выполняет одна из субъединиц фактора AP-1 белок Fra-2.

3. Клеточная активация индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок Fra-2, который, в свою очередь, инициирует транскрипцию гена ИЛ-5.

Существует прямая зависимость между интенсивностью экспрессии генов Fra-2 и ИЛ-5 человека.

4. Мишенью дексаметазона в контексте регуляторных элементов гена ИЛ 5 человека является CLE0. При определённых условиях клеточной стимуляции дексаметазон индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок GILZ (активируемый глюкокортикоидами белок лейциновая застежка, glucocorticoid-induced leucine zipper). Этот белок ингибирует активность CLE0 ИЛ-5, что и приводит к подавлению транскрипции гена.

5. Фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека. Вероятнее всего он действует как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК, т.е. постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами генов необходим для создания функционально активной пространственной структуры промоторов.

Научная новизна исследования - Впервые проведено системное картирование функционально активных элементов регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши. В последовательности промоторов этих генов обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1/2 и мРЭ1/2. Установлено, что регуляторные элементы РЭ1 и РЭ2 гена человека принимают участие в подавлении индуцированной транскрипции, а мРЭ1 и мРЭ2 гена мыши - в активации транскрипции.

- В составе 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши и найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ- человека.

- В последовательности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, не имеющие аналогов в генах ИЛ-5 и ИЛ-4 мыши. Установлено, что данные регуляторные элементы участвуют в подавлении базальной и индуцированной транскрипции.

- Впервые идентифицированы ключевые белки, регулирующие экспрессию гена ИЛ-5 человека, и раскрыт механизм инициации и регуляции транскрипции гена. Показано, что элемент CLE0 контролирует запуск и интенсивность транскрипции гена ИЛ-5 человека. Основным фактором, регулирующим эти процессы, является белок Fra-2, входящий в состав CLE0 связывающего комплекса AP-1.

- Впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ- человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид индуцируемого гена, кодирующего белок GILZ. Выяснено, что этот белок блокирует активность промотора гена ИЛ-5 и его мишенью в контексте регуляторных элементов является CLE0.

- Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши. В результате обнаружены существенные различия в составе факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов ИЛ-5 мыши и человека.

- Впервые показано, что белок GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека: все функционально активные элементы GATA промоторов данных генов взаимодействуют именно с этим фактором транскрипции. Впервые продемонстрировано, что элементы GATA генов цитокинов участвуют как в индукции, так и в подавлении промоторной активности.

Практическая значимость Ведущая роль ИЛ-5 в регуляции продукции и активации эозинофилов обусловливает практическую значимость исследований структурно функциональной организации регуляторных областей гена этого цитокина и механизмов, контролирующих его экспрессию. Так, на основании данных, полученных в настоящей работе можно предположить, что перспективными мишенями для фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются регуляторный элемент CLE гена ИЛ-5 человека и ядерные белки, определяющие функциональную активность этого элемента.

Практическое значение имеют также данные о различиях в структурно функциональной организации промоторов и 3’-нетранслируемых областей генов ИЛ-5 человека и мыши. Они демонстрируют, что результаты, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека.

И, наконец, результаты проделанной работы позволяют рекомендовать перевиваемую линию Т-клеток человека PER-117 в качестве модели для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ- человека.

Апробация результатов диссертации и публикации Основные положения диссертации докладывались на международном симпозиуме «Интерлейкин-5, первое десятилетие» («Interleukin-5, the First Decade», Перт, Австралия, 1997), Десятом Международном иммунологическом конгрессе (Tenth International Congress of Immunology, Нью-Дели, Индия, 1998), ежегодных собраниях Биохимического Общества Великобритании (1995, 1999), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии в рамках программы «Keystone Symposia» (1996, 1998, 2000, 2002), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии, проводимых исследовательским центром Hanson Institute (Аделаида, Австралия, 1994, 1996, 1998, 2000), собраниях международного общества «International Eosinophil Society» (1997, 1999), международных школах по молекулярной и клеточной биологии (Канберра, Австралия, 1995, 1997) и других международных и национальных конференциях.

По материалам диссертации в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях опубликовано 20 статей.

Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждение, и выводов. Работа изложена на 257 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 86 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 382 ссылки.

Благодарности Автор глубоко признателен профессору Colin J. Sanderson за его постоянный интерес к исследованиям, за поддержку и ценные предложения, касающиеся экспериментальной работы и интерпретации полученных данных.

На разных этапах в работе принимали участие Gretchen T. F. Schwenger, Susanne E. Peroni, Anish D. Singh, Monica Senna Salerno, Stphane Karlen, Marc A. Thomas, Rgis Fournier, Monica L. De Boer и другие сотрудники группы профессора Colin J. Sanderson – автор приносит им искреннюю благодарность.

Автор также благодарен ведущему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, доктору биологических наук Д. П. Фурман и старшему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, кандидату биологических наук А. В. Катохину за плодотворное сотрудничество при обсуждении представленных в работе результатов исследований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор перевиваемой клеточной линии Экспрессия генов цитокинов – индуцибельный процесс. К началу наших исследований работа по изучению механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека существенно осложнялась отсутствием лимфоцитарной линии клеток человеческого происхождения, индуцибельно продуцирующей ИЛ- после стимуляции стандартными Т-клеточными активаторами. Поэтому в качестве этапа, предваряющего исследования структурно-функциональной организации промотора и механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ- человека, был проведен поиск Т-клеточных линий человеческого происхождения, обладающих в контексте экспрессии генов лимфокинов свойствами, близкими к свойствам первичных Т-клеток. Один из основных критериев отбора линий клеток – кандидатов на роль клеточной модели нашего исследования – экспрессия в них генов ИЛ-5 и ИЛ-4 после активации культур стандартными клеточными стимуляторами.

В результате тестирования значительного числа Т-клеточных линий нам удалось найти клетки PER-117, в которых после активации происходит экспрессия генов ИЛ-5 и ИЛ-4. Как показано на рис. 1-1, в нестимулированных клетках PER-117 не удаётся выявить присутствие мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 (дорожка 1). Однако в образцах РНК, полученных из активированных культур, мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 присутствуют (дорожка 2).

Таким образом, экспрессия генов ИЛ-4 и ИЛ-5 в клетках линии PER- является индуцибельной.

Рис. 1-1. Экспрессия мРНК ИЛ-5, ИЛ-4 и -actin в интактных и активированных клетках PER-117. Клетки активированы форбол миристат ацетатом (phorbol 12 myristate 13-acetate, PMA) в комбинации с кальциевым ионофором А23187 (calcium ionophore А23187, CaI).

Определение мРНК проводилось с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) Следует отметить, что PMA активированная продукция ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть значительно усилена с помощью ко-активаторов циклического аденозинмонофосфата (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), CaI или анти-CD28-антител (anti-CD28 antibody, CD28) (рис. 1-2). Таким образом, аналогично продукции ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах, наиболее эффективная продукция этого цитокина в клетках PER-117 достигается только с помощью стимуляции TCR-зависимого сигнального пути в комбинации с одним из дополнительных сигнальных путей клеточной активации.

Рис. 1-2. Продукция ИЛ-5 в интактных и активированных клетках PER-117:

1 – интактные культуры;

2 – стимуляция клеток с помощью PMA;

3 – PMA в комбинации с CaI;

4 – PMA в комбинации с cAMP;

5 – PMA в комбинации с CD 1 2 3 4 Важно подчеркнуть, что синтез мРНК и продукция ИЛ-5 в клетках PER 117 подавляются дексаметазоном. Интересно, что эффект дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию этого гена в клетках, активированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28. В культурах же, стимулированных с помощью PMA в комбинации с CaI, дексаметазон лишь слабо понижает уровень синтеза мРНК и продукции ИЛ-5. Аналогичные данные были получены при исследовании эффекта дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах человека. Эти факты в совокупности с данными по активации экспрессии гена ИЛ-5 и продукции данного цитокина в тестируемой культуре дают основания полагать, что регуляция экспрессии гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах и клетках PER 117 осуществляется с помощью, по крайней мере, аналогичных механизмов.

Таким образом, клетки PER-117 являются хорошей моделью для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека. Тем не менее, необходимо упомянуть, что данные о механизмах экспрессии генов, полученные при использовании этих клеток, как и любых других клеточных линий, должны быть интерпретированы достаточно осторожно, поскольку механизмы, контролирующие экспрессию генов в перевиваемых культурах, могут иметь свои особенности. Поэтому в нашей работе результаты ключевых экспериментов, проведенных с использованием клеток PER-117, всегда проверялись с помощью экспериментов, выполненных на первичных Т лимфоцитах.

2. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 человека Структурно-функциональное картирование регуляторных районов гена ИЛ-5 человека проводилось по следующей схеме: (i) выявление потенциальных регуляторных элементов с помощью футпринтинга и компьютерного анализа последовательности регуляторных районов;

(ii) функциональное тестирование потенциальных регуляторных элементов с использованием адресного мутагенеза и репортёрного анализа;

(iii) идентификация факторов транскрипции, участвующих в активации этих элементов, с помощью различных модификаций метода задержки ДНК-зондов в геле (electrophoretic mobility shift assay, EMSA).

В результате проделанной работы в составе регуляторной области гена, охватывающей первые 500 пар оснований промотора (п.о.), были выявлены функционально активные элементы, аналоги которых присутствуют в составе промоторов ряда других генов цитокинов. В частности, непосредственно за ТАТА-боксом между позициями -59 и -43 был локализован консервативный лимфокиновый элемент 0 (CLE0), в районе позиции -70 – элемент GATA, а в районе позиции -110 – сайт связывания NF-AT. Далее, в районах позиций - и -152 были локализованы два элемента GATA, а в районе позиции -400 ещё один элемент GATA. Столь «настойчивое» повторение этого мотива может говорить о важной роли элементов GATA в регуляции транскрипции гена ИЛ 5. Поэтому исследованию роли элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 была посвящена отдельная работа, результаты которой изложены в следующем разделе.

Помимо вышеупомянутых элементов в составе исследуемого фрагмента промотора нам удалось обнаружить два новых регуляторных элемента, РЭ1 и РЭ2. РЭ1 расположен между позициями -90 и -79 в проксимальной области промотора (последовательность CCATTATTAGGC). РЭ2 находиться в дистальной части промотора между позициями -559 и - (последовательность TGGCAGTTTCCAT). Мутации последовательностей, участвующих в составе этих элементов во взаимодействии с ядерными белками, приводят к усилению активности промотора в стимулированных культурах первичных Т-лимфоцитов и клетках PER-117 (рис. 2-1 и 2-2).

Следовательно, новые элементы обладают способностью подавлять активность промотора гена ИЛ-5 человека. Поскольку функции РЭ1 и РЭ проявляются только в условиях клеточной стимуляции, эти элементы участвуют в репрессии индуцированной активности промотора гена ИЛ-5.

РЭ Рис. 2-1. А - замены в последовательности РЭ1;

Б - экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности РЭ1, в PMA/cAMP активированных клетках PER-117.

Пояснения: репортёрная конструкция -281/+18 несёт фрагмент гена ИЛ- человека, расположенный между позициями -281 и + Относительная активность люциферазы (%) Рис. 2-2. Экспрессия базовой (-508/+18) и модифицированных (пК1м, пК3м и пК1/3м) репортёрных конструкций, несущих замены в последовательности РЭ2, в PMA/CaI активированных клетках PER-117. Приведены данные трёх независимых экспериментов:

эксперимент 1;

- 2;

- 3.

Активность люциферазы в стимулированных культурах выражена относительно активности люциферазы в нестимурованных культурах Регуляторные области многих генов цитокинов содержат элементы, участвующие в блокаде базальной и индуцированной активности промоторов [Blom et al., 2006]. Довольно часто репрессорные элементы расположены в проксимальной части промоторов в непосредственной близости от регуляторных последовательностей, участвующих в активации транскрипции [Tsuruta et al., 1998]. Один из обнаруженных нами репрессорных элементов, РЭ1, обладает «классической» локализацией: 3’-область этого элемента граничит с блоком GATA/CLE0, а 5’-область с блоком GATA/NF-AT, активаторами транскрипции гена ИЛ-5. Расположение же второго репрессора, РЭ2, несколько необычно, - он удалён от насыщенного регуляторными элементами проксимального промотора более чем на 300 п.о.

Идентификация репрессорных элементов существенно дополняет структурно-функциональную карту промотора гена ИЛ-5 и позволяет по новому взглянуть на возможные механизмы регуляции экспрессии гена. Так, учитывая локализацию РЭ2, можно предположить, что в реализации механизмов регуляции транскрипции этого гена существенную роль играет пространственная структура промотора.

При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК белковых комплексов РЭ1 и РЭ2, было выяснено, что оба элемента взаимодействуют с фактором YY1 (рис. 2-3) – многофункциональным ядерным белком, способным как активировать, так и репрессировать промоторы различных генов [Shi et al., 1997].

Проба РЭ Проба РЭ Рис. 2-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2 с использованием EMSA. А: РЭ1 - факторы транскрипции Oct1 и YY1 участвуют в образовании комплексов C1 и C3;

Б: РЭ2 - факторы транскрипции NF-AT и YY входят в состав комплексов K1 и K Следует отметить, что YY1 участвует в регуляции экспрессии генов ряда цитокинов и действует при этом как репрессор транскрипции [Ye et al., 1996a;

Ye et al., 1996b]. В состав ДНК-белковых комплексов РЭ1 входит также фактор Oct-1. В некоторых случаях этот белок проявляет свойства репрессора промоторной активности [Hoppe-Seyler et al., 1991;

Delhase et al., 1996], однако, в основном он выполняет функции активатора транскрипции [Scholer et al., 1991]. Вместе с YY1 в состав ДНК-белковых комплексов РЭ2 входит фактор транскрипции NF-AT. Согласно данным различных авторов, NF-AT является активатором транскрипции и играет важную роль в регуляции экспрессии многих генов цитокинов, в число которых входит и ИЛ-5 [De Boer et al., 1999].

Таким образом, в число факторов, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2, входят репрессор активности промоторов генов цитокинов YY1 и два активатора транскрипции этих генов, Oct-1 и NF-AT. Можно предположить, что в составе ДНК-белковых комплексов РЭ1 и РЭ2 YY1 сохранил свою функцию репрессора, однако, функции Oct-1 и NF-AT неясны. В пределах каждого регуляторного элемента мотив связывания YY1 перекрывается с мотивами связывания Oct-1 или NF-AT. Интересно, что такие комбинации транскрипционных факторов являются уникальными. Не исключено, что эта уникальность может отражать особые механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5.

3. Роль фактора транскрипции GATA-3 в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека Как упоминалось в разделе 2, на сравнительно небольшом расстоянии от старта транскрипции в составе промотора гена ИЛ-5 человека расположены три элемента GATA, ещё один такой сайт находится в дистальной области промотора. К началу нашей работы роль элементов GATA в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 человека оставалась неясной, что и послужило мотивацией для следующей работы.

3.1. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 человека При идентификации белков, формирующих комплексы с элементами GATA промотора гена ИЛ-5, было выяснено, что сайты -70, -152 и - взаимодействуют с транскрипционным фактором GATA-3 (рис. 3-1). Сайт GATA-128 промотора гена ИЛ-5 не формирует комплексы с ядерными экстрактами из клеток PER-117.

При оценке функциональной активности элементов GATA, расположенных в промоторе гена ИЛ-5 человека, было обнаружено, что элементы GATA-70 и GATA-152 участвуют в активации промотора, GATA 128 не обладает функциональной активностью, а GATA-400 принимает участие в подавлении базальной и индуцированной активности промотора (рис. 3-2).

Проба GATA- Проба GATA-70 Проба GATA- Рис. 3-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с мотивами GATA гена ИЛ-5 человека. Олигонуклеотиды, соответствующие мотивам GATA в районах позиций -70, -152 и -400, обозначены -70, -152 и -400. Олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов GATA, Octamer, C/EPB, AP-1 и AP-2, обозначены GATA, Octamer, C/EPB, AP-1 и AP- В Б А Проба GATA- 1 5 1 3 4 Рис. 3-2. Влияние замен в последовательности сайтов GATA-70 (А), GATA-128(Б), GATA-152(Б) и GATA-400 (В) на активность промотора гена ИЛ-5 человека:

экспрессия репортёрных конструкций в нестимулированных (чёрные столбцы) и PMA/cAMP-активированных (серые столбцы) клетках PER-117. Репортёрные конструкции: 1 – базовая (-508/+18);

2 - мутация сайта GATA-70;

3 - мутация сайта GATA-128;

4 - мутация сайта GATA-152;

5 - мутация сайта GATA-400 в кодирующей цепи, 6 – в некодирующей цепи, 7 – в двух цепях Таким образом, в результате тестирования функциональной активности четырех элементов GATA промотора гена ИЛ-5 человека были получены данные, указывающие на то, что фактор GATA-3 непосредственно участвует в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека. Действительно, единственный неактивный в отношении регуляции транскрипции элемент, GATA-128, не взаимодействует с GATA-3. Остальные элементы связывают этот фактор и обладают определёнными функциями в контексте тестируемого фрагмента промотора гена ИЛ-5. Элементы GATA-70 и GATA-152 являются активаторами транскрипции, элемент GATA-400 проявляет свойства репрессора базальной и индуцированной активности промотора. Полярное различие функций элементов GATA, находящихся в составе одного промотора, явление необычное. Является ли это особенностью промотора гена ИЛ-5 или элементы GATA промоторов других генов лимфоцитарных цитокинов обладают такими же характеристиками? Чтобы ответить на этот вопрос мы исследовали роль элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека.

3.2. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека В результате компьютерного анализа регуляторной области гена ИЛ- человека, расположенной между позициями -1075 и +66, было обнаружено несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства GATA. При тестировании этих сайтов в экспериментах по определению белок связывающей активности было выяснено, что элементы, расположенные между позициями -274/-269 и -860/-852, взаимодействуют с ядерными белками из клеток PER-117 и первичных Т-лимфоцитов. Сайты были названы GATA(-)274 и GATA(-)860. Было установлено, что в состав ДНК-белковых комплексов, образованных этим элементами и ядерными экстрактами входит фактор транскрипции GATA-3.

При функциональном тестировании элемента GATA(-)274 было показано, что этот сайт участвует в активации промотора гена ИЛ-4 человека.

Однако при исследовании функциональной активности дистального элемента GATA были получены совершенно иные результаты. Мутация последовательности GATA(-)860 и делеция фрагмента ДНК, содержащего этот элемент, существенно увеличивали эффективность экспрессии репортёрных конструкций. Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкциями пИЛ4GATA(-)860мут и пИЛ4GATA( )860дел, в 3-7 раз превышала активность репортёрного белка в клетках, трансфицированных пИЛ4бк (рис. 3-3).

Рис. 3-3. Активность люциферазы в культурах клеток PER-117 и Jurkat, трансфицированных Клетки PER-117 конструкциями, экспрессирующим репортёрный ген под контролем промотора гена ИЛ-4 человека.

Конструкции:

1, пИЛ4бк - содержит фрагмента гена ИЛ- человека, расположенный между позициями -1075 и +60;

2, пИЛ4(-)860мут отличается от пИЛ4бк мутацией мотива GATA в Клетки Jurkat последовательности элемента GATA(-)860, мутация блокирует белоксвязывающую активность сайта;

3, пИЛ4(-)860дел содержит фрагмента гена ИЛ-4 человека, расположенный между позициями –744 и +60.

Обозначения: нс - нестимулированные культуры;

PMA, cAMP, CaI, CD28 – культуры, стимулированные соответствующими активаторами Важно отметить, что мутация GATA(-)860 и делеция этого элемента увеличивают активность репортёрных плазмид не только в стимулированных, но и в нестимулированных культурах PER-117 и Jurkat. Это означает, что элемент GATA(-)860 участвует в репрессии как базальной, так и индуцированной активности промотора ИЛ-4. Поскольку GATA(-) взаимодействует с фактором транскрипции GATA-3 в интактных культурах и клеточная активация мало влияет на интенсивность этого взаимодействия, можно заключить, что данный фактор является компонентом механизма, сдерживающего базальную активность промотора ИЛ-4 и подавляющего индуцированную транскрипцию гена.

Итак, при исследовании функциональной активности GATA-3 связывающих элементов генов ИЛ-4 и ИЛ-5 человека были получены неоднозначные результаты. Так, установлено, что мотивы GATA-860 гена ИЛ 4 и GATA-400 гена ИЛ-5 участвуют в репрессии индуцированной и базальной активности промоторов. Таким образом, складывается впечатление, что GATA-3 может действовать как транскрипционный репрессор ИЛ-4 и ИЛ-5.

Однако это заключение противоречит нашим же данным о позитивной роли GATA-3-связывающих элементов в активации транскрипции этих генов.

Действительно, GATA-70 и GATA-152 промотора ИЛ-5, также как и GATA 274 промотора ИЛ-4 являются активаторами транскрипции. Кроме того, супрессорный эффект GATA-3 на транскрипцию ИЛ-4 и ИЛ-5 не согласуется с устоявшимися представлениями о важнейшей роли этого белка в экспрессии генов цитокинов в T-хелперах типа 2 (Tх2) [Murphy, Reiner, 2002].

Возникшее противоречие можно разрешить с помощью модели, в которой GATA-3 рассматривается как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК. В этом случае постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами гена необходим для создания функционально активной пространственной структуры промотора. Разрушение одного из сайтов связывания GATA- будет вести к частичному изменению такой структуры, что может выражаться в изменении эффективности действия активаторов или репрессоров транскрипции, действующих как через регуляторные элементы промотора, так и через последовательности, расположенные в других областях кластера генов Tх2 цитокинов. В наших экспериментах были использованы фрагменты промоторов, содержащие комплекс регуляторных элементов, среди которых есть репрессоры и активаторы. Вполне вероятно, что мутация дистального мотива GATA резко понижает или отменяет действие транскрипционных репрессоров, например, РЭ1 и РЭ2 гена ИЛ-5 (раздел 2) и P2 NRE, NRE-I и NRE-II гена ИЛ-4 [Li-Weber et al., 1992]. В отличие от этого, мутации GATA сайтов, расположенных в проксимальных областях промоторов, ослабляют эффект активаторов транскрипции, например, CLE0 ИЛ-5 [Stranick et al., 1995;

Thomas et al., 1999] и элемента P гена ИЛ-4 [Aune et al., 2001]. Такая модель действия GATA-3 полностью согласуется с общепринятыми представлениями об участии этого белка в инициации реконструкции хроматина для формирования транскрипционного профиля Tх2 и регуляции экспрессии генов Tх2 цитокинов.

4. Идентификация белков, регулирующих активность консервативного лимфокинового элемента 0 (CLE0) генов ИЛ-5 человека и мыши Идентификацию белков, взаимодействующих с CLE0 гена ИЛ- человека, проводили с помощью EMSA ядерных экстрактов из клеток PER 117 и олигонуклеотида CLE0о, последовательность которого соответствовала последовательности промотора гена ИЛ-5 человека между позициями -59 и 38. Ядерные экстракты были получены из интактных клеток и культур PER 117, активированных PMA в комбинации с CaI.

Как показано на рис. 4-1А, ядерные экстракты из нестимулированных клеток и CLE0о формируют два комплекса, CI и CIII (дорожка 1). Активация клеток не влияет на образование комплекса CI, однако значительно усиливает формирование CIII (дорожка 2). Клеточная стимуляция индуцирует также и образование третьего ДНК-белкового комплекса CII (дорожка 2).

Формирование этого комплекса полностью зависит от стимуляции клеток PER-117.

Б А Рис. 4-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLE0 гена ИЛ- человека. А - EMSA с использованием конкурентных олигонуклеотидов (CLE0о, олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов транскрипции AP-1, Octamer и NF-AT). Б - EMSA с использованием антител к факторам транскрипции (пояснения в тексте) Антитела, специфические к белку Oct-1, полностью блокируют формирование комплекса CI (рис. 4-1Б, дорожка 2), а антитела к фактору Oct-2 изменяют электрофоретическую подвижность комплекса CIII (дорожка 3). Следовательно, Oct-1 входит в состав комплекса CI, а CIII содержит Oct-2.

Как показано на рис. 4-1Б, антитела, распознающие все белки семейства Jun (a-Jun) значительно подавляют интенсивность формирование комплекса CII (дорожка 4). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Jun, сходным эффектом обладают только антитела к Jun D (дорожка 7).

Антитела, распознающие все белки семейства Fos, также значительно подавляют формирование комплекса CII (дорожка 8). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Fos, подобным образом действуют только антитела к Fra-2 (дорожка 12). Следовательно, комплекс CII содержит фактор транскрипции AP-1, состоящий из белков Jun D и Fra-2.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что ядерные белки клеток PER-117 и CLE0 ИЛ-5 человека формируют комплексы, содержащие транскрипционные факторы AP-1 (Jun D/Fra-2), Oct-1 и Oct-2.

Такие же комплексы формируют с CLE0 ИЛ-5 человека и ядерные белки первичных Т-клеток здоровых доноров.

Для верификации белоксвязывающих мотивов CLE0 ИЛ-5 человека были использованы олигонуклеотиды, содержащие замены в последовательности CLE0 (рис. 4-2A).

А Рис. 4-2. Верификация белок связывающих мотивов CLE0 ИЛ- человека:

А - олигонуклеотиды, содержащие замены последовательности CLE0;

Б – влияние замен в Б последовательности CLE0 на формирование ДНК-белковых комплексов.

В EMSA использованы ядерные экстракты из интактных (-) и активированных (+) клеток PER- Как показано на рис. 4-2Б, замена триплета AAA, расположенного между позициями -58 и -56, на CTC (проба Мl) приводит к значительному подавлению взаимодействия пробы с факторами Oct-1 и Oct-2, но не влияет на формирование комплекса AP-1(CII). Замена TCA на CTC между позициями 51 и -49 (проба M3) не оказывает влияния на формирование Oct-1 и Oct- содержащих комплексов, однако, эта мутация значительно подавляет формирование комплекса AP-1. В олигонуклеотиде M4 сохранена целостность всех мотивов взаимодействия CLE0 с факторами транскрипции, входящими в состав CI-III. Таким образом, можно заключить, что хотя мотивы связывания факторов Octamer и AP-l в составе последовательности CLE0 ИЛ-5 человека перекрываются (проба M2), это не помешает созданию изменённых вариантов CLE0, образующих комплексы только с одним из транскрипционных факторов.

Для оценки функциональной значимости белоксвязывающих мотивов CLE0 ИЛ-5 человека на основе базовой конструкции -281/+18, несущей фрагмент гена ИЛ-5 человека, расположенный между позициями -281 и +18, были выполнены плазмиды Octmut, APlmut и Controlmut, содержащие те же замены, что и олигонуклеотиды Ml, M3 и M4 (рис. 4-2A).

Мутации CLE0 не влияют на активность репортёрных конструкций в нестимулированных клетках. Однако после клеточной стимуляции активность экспрессии плазмид, содержащих замены в последовательности CLE0, включая Controlmut, составила всего 10 % от активности экспрессии конструкции -281/+18 (рис. 4-3). Эти данные указывают на то, что мутации в пределах CLE0 приводят к практически полной потере активности промотора.

Следовательно, вся последовательность CLE0 - белоксвязывающие мотивы и участки, не вовлечённые в прямое взаимодействие с факторами транскрипции, - играет важнейшую роль в активации промотора гена ИЛ-5 человека.

Рис. 4-3. Экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности CLE0 ИЛ-5 человека, в клетках PER-117.

Пояснения в тексте Роль AP-1 в регуляции экспрессии генов цитокинов изучена достаточно подробно. Как следует из названия этого фактора – активирующий белок 1, AP-1 является активатором транскрипции. В противоположность этому, данные о роли факторов Octamer в регуляции экспрессии цитокинов неоднозначны и не позволяют связать эти белки только с одной функцией в отношении контроля транскрипции различных генов. Присутствие Oct-1 и Oct-2 в транскрипционном комплексе CLE0 нами обнаружено впервые и функция данных белков в регуляции активности промотора гена ИЛ- человека не ясна.

В экспериментах по исследованию роли транскрипционных факторов Oct-1 и Oct-2 в активации CLE0 ИЛ-5 помимо репортёрных конструкций были также использованы экспрессионные векторы pCG-Oct-1 и pCG-Oct-2, содержащие кДНК Oct-1 и Oct-2. Экспрессия данных плазмид в клетках PER 117 и Jurkat ведёт к существенному повышению содержания белков Oct-1 и Oct-2 в ядерных экстрактах, полученных из этих культур. Показано, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 человека. Таким образом, факторы Oct-1 и Oct-2 действуют как активаторы транскрипции этого гена. Следует отметить, что белок Oct-2 обладает более значительным эффектом, чем Oct-1.

При идентификации белков, взаимодействующих с CLE0 гена ИЛ- мыши, было установлено, что этот элемент обладает сходной белоксвязывающей активностью с CLE0 ИЛ-5 человека. В состав комплексов, образованных CLE0 ИЛ-5 мыши и ядерными белками из перевиваемой Т клеточной линии мыши EL4 и из первичных Т-лимфоцитов мыши, входят транскрипционные факторы Oct-1, Oct-2 (рис. 4-4, дорожки 2 и 3) и AP-1.

Однако составы комплексов AP-1 CLE0 ИЛ-5 человека и мыши различаются, последний образован белками FosB и JunB (дорожки 4 и 6).

Рис. 4-4. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLE0 ИЛ-5 мыши.

EMSA ядерных экстрактов из активированных клеток EL4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей CLE0 ИЛ-5 мыши, с использованием антител к факторам транскрипции. Стрелкой указан дополнительный комплекс (дорожки 3, 4 и 6) 1 2 3 4 5 6 Определение роли факторов Oct-1 и Oct-2 в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши было также проведено с использованием репортёрных и экспрессионных конструкций. В результате было установлено, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 в клетках EL4 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 мыши. Однако в отличие от системы регуляции экспрессии гена человека, где ведущая роль принадлежит белку Oct-2, при активации экспрессии гена мыши эффект Oct- представляется более мощным, чем Oct-2.

Результаты, полученные при проведении идентификации факторов транскрипции, определяющих активность CLE0 ИЛ-5, позволили существенно пополнить наши знания о системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши. Установлено, что в интактных клетках CLE ИЛ-5 взаимодействует с белками, принадлежащими к семейству факторов транскрипции Octamer, - широко распространенным Oct-1 и лимфоцит специфическим Oct-2. Клеточная стимуляция значительно усиливает связывание Oct-2 и CLE0, но не влияет на взаимодействие этого элемента с Oct-1. Оба фактора являются активаторами транскрипции генов и обладают определённой видовой «тропностью». Для гена человека более мощным активатором является Oct-2, для гена мыши - Oct-1.

Следует отметить, что стимуляция клеток индуцирует взаимодействие CLE0 с фактором AP-1. Субъединичный состав AP-1 также представляется видоспецифичным: CLE0 ИЛ-5 человека связывает комплекс белков Jun D и Fra-2, CLE0 ИЛ-5 мыши - FosB и JunB.

5. Регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши Изложенные выше данные указывают на возможность участия в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши видоспецифических механизмов. Если это действительно так, то структурно-функциональная организация регуляторных районов этих генов может существенно различаться. Для проверки этого предположения был проведен поиск новых регуляторных элементов гена ИЛ-5.

5.1. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 мыши С помощью компьютерного анализа промотора гена ИЛ-5 мыши были обнаружены потенциальные регуляторные элементы, гомологичные РЭ1 и РЭ2 гена ИЛ-5 человека. Новые элементы были названы мРЭ1 и мРЭ2.

Аналогично РЭ1 и РЭ2 они расположены между позициями -79/-90 и -459/ 470 соответственно. Оба элемента содержат идентичные инвертированные повторы в 3 п.о., фланкирующие специфические для каждого элемента последовательности размером 5 п.о.

Функциональная Таблица 1. Последовательности модифицированных мРЭ активность потенциальных и мРЭ2, находящихся в составе репортёрных конструкций регуляторных элементов была исследована с помощью адресного мутагенеза и репортёрного анализа. В этой работе мы использовали базовую конструкцию mIL5wt-Luc, содержащую первые 1700 п.о. промотора гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al., 1987]. На основе данной конструкции была создана коллекция репортёрных плазмид с различными заменами в последовательности промотора (таблица 1).

Как показано на рис. 5-1, мутация в левом плече мРЭ1 приводит к значительному снижению активности промотора. Мутация левого плеча элемента мРЭ2 также существенно понижает активность промотора. Однако замены в правых плечах элементов мРЭ1 и мРЭ2 оказывают незначительное влияние на активность промотора. Слабое влияние на активность промотора оказывает и замена пары нуклеотидов, расположенной выше инвертированных повторов мРЭ1 и мРЭ2.

Рис. 5-1. Экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности мРЭ1 и мРЭ2, в клетках EL4. Пояснения в тексте Полученные данные позволяют заключить, что левые части палиндромных последовательностей мРЭ1 и мРЭ2 входят в состав регуляторных элементов, участвующих в активации промотора гена ИЛ- мыши. Таким образом, мРЭ1 и мРЭ2 выполняют функции, противоположные функциям РЭ1 и РЭ2, аналогов этих элементов промотора гена ИЛ-5 человека.

5.2. Новый регуляторный элемент 3'-нетранслируемой области гена ИЛ- мыши В результате компьютерного анализа последовательности гена ИЛ- мыши в области расположения сайта полиаденилирования был обнаружен потенциальный регуляторный район. В последовательности этого района между позициями +4539 и +4578 расположены четыре прямых повтора ATGAATGA (рис. 5-2). Первый и последний повторы отделены от двух центральных повторов четырьмя нуклеотидами и последовательность этого фрагмента гена в целом выглядит симметричной. Весьма существенно, что фрагмент содержит мотивы, имеющие сходство с последовательностями канонических сайтов связывания факторов транскрипции AP-1, Octamer, GATA и c-Ets. Как описано в предыдущих разделах, AP-1, Oct-1, Oct-2 и GATA-3 являются важнейшими факторами, регулирующими транскрипцию гена ИЛ-5 человека. Поэтому логично было предположить, что данный район 3'-нетранслируемой области может участвовать в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши.

Рис. 5-2. Схема фрагмента гена ИЛ-5 мыши в составе базовой репортёрной конструкции.

Обозначения: HindIII (H)/BamHI (B) - фрагмент гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al., 1988];

регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши - CLE0, мРЭ1, мРЭ1 и м3' ПЭ (РС I/III, повторы ATGAATGA обведены);

- экзоны, alu пов-ры – alu повторы;

репортёр - ген люциферазы. Конструкция выполнена на основе вектора p-Poly-III Косвенное подтверждение того, что последовательность, содержащая прямые повторы ATGAATGA, может содержать регуляторные элементы, было получено в результате футпринтинга 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши. Оказалось, что кодирующая и некодирующая цепи ДНК этого фрагмента гена обладают способностью взаимодействовать с ядерными белками клеток EL4. Район связывания с ядерными белками 3' нетранслируемой области, содержащий повторы ATGAATGA, обозначен как м3’-ПЭ (рис. 5-2). Делеция этого района из базовой репортёрной конструкции, содержащей фрагмент гена ИЛ-5 мыши размером 9.5 kb (рис. 5-2), приводила к 3-х кратному падению уровня экспрессии репортёрного гена (таблица 2).

Эти данные однозначно свидетельствуют о том, фрагмент гена, расположенный между позициями +4539 и +4585 содержит новый регуляторный элемент, принимающий участие в активации транскрипции гена ИЛ-5 мыши.

Таблица 2. Результаты пяти независимых экспериментов по исследованию экспрессии базовой конструкции и конструкции с делецией повторов ATGAATGA в активированных При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК белковых комплексов м3’-ПЭ, были использованы ядерные экстракты из клеток EL4 и первичных лимфоцитов мыши. Оказалось, что Oct-1 участвует в формировании комплекса C1, AP-1 в формировании C2, а Oct-2 входит в состав C3 (рис. 5-3).

Рис. 5-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с м3’-ПЭ.

EMSA ядерных экстрактов из активированных клеток EL4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей м3’-ПЭ, с использованием антител к факторам транскрипции При проведении компьютерного анализа последовательности 3' нетранслируемой области гена ИЛ-5 человека мы не обнаружили мотивов, обладающих сходством с м3’-ПЭ. Футпринтинг 3'-нетранслируемой области гена человека также не выявил сайтов, взаимодействующих с ядерными белками Т-клеток. Негативный результат был получен и при компьютерном скрининге последовательностей интронов гена ИЛ-5 человека.

Таким образом, результаты проведенных исследований продемонстрировали наличие существенных различий в функциональной и структурной организации регуляторных областей генов ИЛ-5 мыши и человека. Ярким примером функциональных различий структурно схожих районов промоторов являются элементы мРЭ1/2 и РЭ1/2. Действительно, последовательности и локализация этих элементов весьма консервативны для генов ИЛ-5 мыши и человека. Однако в контексте промотора гена мыши мРЭ1/2 действуют как активаторы транскрипции, в составе промотора гена человека они выполняют функции транскрипционного репрессора. Очевидно, что причиной полярного различия функций являются регуляторные белки, взаимодействующие с этими элементами. К сожалению, нам не удалось идентифицировать факторы, активирующие мРЭ1/2. Однако данные предварительного анализа позволяют предположить, что такими факторами могут быть NF-kB подобные белки. Участие белков семейства NF-kB в активации экспрессии генов цитокинов хорошо документировано [Kulms et al., 2006]. Таким образом, данные предварительного анализа факторов транскрипции, активирующих мРЭ1/2, согласуются с результатами функционального тестирования этих элементов промотора.

Кроме того, следует обратить внимание, что состав и локализация регуляторных элементов генов мыши и человека существенно различается.

Так, в 3'-нетранслируемой области гена мыши расположен позитивный регуляторный элемент;

3'-нетранслируемая область гена человека не содержит аналогов этого элемента. Элемент GATA-400, обнаруженный в составе промотора гена человека (раздел 3.1), не имеет аналогов в последовательности гена мыши. В последовательности гена человека между позициями -244 и - локализован сайт связывания белков Octamer, участвующий в активации промотора [Mordvinov, Sanderson, 2001]. В соответствующем районе промотора гена мыши такой сайт отсутствует.

Вышеизложенные факты указывают на то, что механизмы регуляции экспрессии генов ИЛ-5 мыши и человека, по крайней мере, не идентичны.

Очевидно, различные виды нашли отличающиеся пути тонкой регуляции продукции ИЛ-5. Таким образом, экспериментальные данные, полученные при использовании клеток мыши, не всегда могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 в клетках человека.

6. Механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека ИЛ-5 принадлежит к семейству индукторов кроветворения и иммунного ответа, членами которого являются также ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-13 и ГМ-КСФ [Lampinen et al., 2004]. Гены, кодирующие эти белки, расположены на участке q31 хромосомы 5 человека и соответствующем районе 11-ой хромосомы мыши [McKenzie et al., 1993;

Willman et al., 1993]. В активированных Т лимфоцитах (субпопуляции Тх0 и Тх2) эти гены могут экспрессироваться одновременно [Abbas et al., 1996;

Stranick et al., 1997] и в литературе часто встречается выражение «активация экспрессии локуса Тх2 цитокинов» [Ansel et al., 2006;

Dean, 2006]. Однако есть факты, указывающие на то, что помимо системы инициации экспрессии всех генов данного локуса, существуют регуляторные механизмы, позволяющие адресованно индуцировать экспрессию отдельных генов, в частности, экспрессию гена ИЛ-5. Так, при скрининге аллореактивных Т-клеточных клонов, абсолютное большинство которых продуцировало широкий спектр лимфокинов, были обнаружены клоны, продуцирующие только ИЛ-5 [Warren et al., 1985]. При изучении эффекта цитокинов на первичные Т-клетки было показано, что стимуляция лимфоцитов с помощью ИЛ-2 индуцирует синтез мРНК ИЛ-5 и не влияет на экспрессию генов ИЛ-4 и ГМ-КСФ, ближайших соседей ИЛ-5 по локусу 5q - хромосомному локусу Тх2 цитокинов [Bohjanen et al., 1990]. При работе с Т клетками периферической крови пациентов, страдающих инфекционно аллергической формой бронхиальной астмы, установлено, что эти клетки секретируют повышенное количество ИЛ-5, в то время как уровень продукции других лимфокинов остаётся на низком уровне [Corrigan et al., 1992]. Таким образом, ген ИЛ-5 далеко не всегда ко-экспрессируется с генами других Тх цитокинов. Это подразумевает существование селективного контроля экспрессии отдельных генов лимфокинов или, по крайней мере, специфического контроля экспрессии гена ИЛ-5.

6.1. Механизм инициации транскрипции гена ИЛ-5 человека Инициация экспрессии большинства генов лимфокинов, в частности, активация синтеза мРНК не зависит от синтеза белка de novo. К этому большинству относятся и гены цитокинов, расположенные в локусе 5q31.

Исключением является лишь ген ИЛ-5. В ряде работ было показано, что индукция синтеза мРНК ИЛ-5 в первичных Т-клетках невозможна без синтеза белка de novo [Van Straaten et al., 1994;

Stranick et al., 1995;

Naora et al., 1995].

Рис. 6-1. Влияние CHX на синтез мРНК ИЛ-4, ИЛ-5 и -actin в интактных и активированных клетках PER-117 (пояснения в тексте) Важно отметить, что зависимость инициации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo сохранена и в клетках PER-117. Как показано на рис. 6 1, с помощью ОТ-ПЦР не удаётся обнаружить мРНК ИЛ-5 или ИЛ-4 в интактных клетках PER-117 (дорожка 1). Стимуляция клеток с помощью PMA в комбинации с CaI индуцирует синтез этих мРНК (дорожка 2).

Ингибитор белкового синтеза циклогексимид (cycloheximid, CHX) полностью блокирует активацию синтеза мРНК ИЛ-5, но не влияет на синтез мРНК ИЛ- (дорожка 3). Не влияет CHX и на синтез мРНК ИЛ-3, ИЛ-13 и ГМ-КСФ в клетках PER-117. Таким образом, инициация транскрипции гена ИЛ-5 в клетках PER-117 и первичных Т-клетках проходит, скорее всего, по сходным сценариям и наша клеточная модель может быть использована для исследования механизмов специфической регуляции экспрессии ИЛ-5.

Как упоминалось, CLE0 играет исключительно важную роль в активации промотора гена ИЛ-5 (рис. 4-2). Следовательно, мы вправе предположить, что именно с этим элементом с наибольшей вероятностью должны взаимодействовать регуляторные белки, участвующие в инициации экспрессии гена ИЛ-5.

Экспрессия ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть активирована с помощью реагентов, стимулирующих различные сигнальные пути (рис. 1-2).

Не исключено, что условия клеточной стимуляции влияют на белковый состав транскрипционного комплекса CLE0. В этом случае наиболее вероятным кандидатом на роль основного активатора транскрипции гена будет фактор, взаимодействие которого с CLE0 индуцируется в условиях всех используемых нами вариантов клеточной стимуляции.

При идентификации факторов транскрипции, связывающих CLE0 ИЛ- человека при различных условиях клеточной активации, было выяснено, что Oct-1-содержащий комплекс является конститутивным и образуется как в реакциях с ядерными белками из нестимулированных клеток, так и при исследовании экстрактов из активированных клеток (рис. 6-2). Следует отметить, что ни один из использованных вариантов клеточной стимуляции не влияет на интенсивность формирования Oct-1-содержащего комплекса.

Рис. 6-2. Влияние условий клеточной стимуляции и CHX на кинетику формирования комплексов CLE0 ИЛ- человека и ядерных белков из культур PER- (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из CHX-обработанных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами) Комплекс, содержащий фактор транскрипции AP-1, является индуцибельным. Условия клеточной активации не влияют на субъединичный состав этого комплекса - во всех случаях он состоит из белков JunD и Fra-2.

Комплекс, содержащий Oct-2, также является индуцибельным, однако, он формируется не при всех условиях клеточной стимуляции. Так, этот комплекс не образуется при PMA/cAMP активированной экспрессии ИЛ-5 (рис. 6-2).

Таким образом, индуцибельным компонентом транскрипционного комплекса CLE0, присутствующим при всех условиях клеточной стимуляции, является AP-1. Эти данные говорят о ключевой роли данного фактора в регуляции экспрессии гена ИЛ-5.

При исследовании кинетики формирования комплекса AP-1 было обнаружено, что интенсивность его образования зависит от условий клеточной стимуляции (рис. 6-2). PMA является слабым индуктором взаимодействия CLE0 с белками. Интенсивность формирования PMA активированного комплекса AP-1 нарастает медленно и достигает максимума только после 12 часов клеточной стимуляции. PMA в комбинации с cAMP индуцирует AP-1 гораздо быстрее – максимум интенсивности формирования комплекса в этом случае приходится на интервал между 6 и 12 часами клеточной стимуляции. Затем интенсивность формирования комплекса существенно снижается. Комплекс AP-1, индуцированный PMA в комбинации с CaI, достигает максимальной интенсивности после 12 часов клеточной стимуляции и остаётся на этом уровне, по крайней мере, следующие 6 часов.

Существует ли корреляция между кинетикой формирования комплекса AP-1 и экспрессией гена ИЛ-5 в клетках PER-117? Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели денситометрический анализ комплекса AP-1, индуцированного различными комбинациями клеточных стимуляторов, и определили кинетику продукции ИЛ-5 при этих условиях клеточной стимуляции.

На основании полученных данных можно заключить, что интенсивность формирования комплекса AP-1 прямо пропорциональна интенсивности продукции ИЛ-5 клетками PER-117 (рис. 6-3). Активация клеток с помощью одновременного использования PMA, cAMP и CaI обеспечивает наиболее высокий уровень индукции комплекса AP-1 (рис. 6-2) и самый высокий уровень экспрессии ИЛ-5 – более 500 пг/мл после 12 часов клеточной стимуляции.

Рис. 6-3. Кинетика продукции ИЛ-5 культурами PER-117 при различных условиях клеточной стимуляции (линии, левая ось) и кинетика формирования комплекса AP-1 CLE0 ИЛ-5 человека (столбцы, правая ось). Значения плотности комплекса AP-1 выражены как отношение денситометрических характеристик комплекса AP-1 к денситометрическим данным комплекса Oct-1 CLE0 ИЛ- CHX полностью подавляет образование комплексов AP-1 и Oct-2 (рис.

6-2), что указывает на зависимость их образования от синтеза белка de novo.

Однако, в отличие от AP-1, формирование Oct-2 содержащего комплекса CLE0 не коррелирует с экспрессией ИЛ-5 в клетках PER-117. Продукция ИЛ- регистрируется ещё до появления этого комплекса. Следовательно, ведущую роль в инициации транскрипции гена ИЛ-5 играют, вероятно, белки, входящие в комплекс AP-1.

Проверка этого предположения была начата с исследования влияния клеточной активации на синтез белков, взаимодействующих с CLE0 ИЛ-5.

Как показано на рис. 6-4, ядерные белки из интактных и активированных в различных условиях клеток, содержат Oct-1. Первые 12 часов клеточная активация не влияет на уровень содержания Oct-1, однако, затем содержание этого фактора снижается (дорожки 1-13).

Белки Jun D и Fra-2 не были обнаружены в ядрах интактных клеток. Все использованные варианты клеточной активации индуцируют появление этих факторов в составе ядерных белков. Однако сигнал Fra-2 регистрируется только после 6 часов клеточной стимуляции (рис. 6-4, дорожки 3, 7 и 11), в то время как сигнал Jun D появляется уже после 2 часов стимуляции (дорожки 2, 6 и 10). CaI и cAMP усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 (сравните дорожки 3-5, 7-9 и 11-13) и не влияют на синтез Jun D.

Рис. 6-4. Влияние клеточной активации на кинетику синтеза белков, взаимодействующих с CLE0 ИЛ-5 человека.

Пояснения в тексте Oct-2 присутствует в ядрах интактных клеток. Клеточная стимуляция с использованием только PMA или PMA в комбинации с CaI ведёт к увеличению содержания этого фактора в составе ядерных белков (рис. 6-4, дорожки 1-5 и 10-13). Важно отметить, что CaI существенно усиливает действие PMA. Интересно, что cAMP таким эффектом не обладает. Первые часов клеточная стимуляция с помощью PMA в комбинации с cAMP не влияет на содержание Oct-2 в ядрах клеток PER-117. К 18-ти часам в ядерных фракциях, полученных из этих культур, содержание Oct-2 снижается.

На основании полученных данных можно заключить, что в результате активации клеток PER-117, независимо от условий стимуляции, происходит инициация синтеза de novo AP-1-формирующих белков Jun D и Fra-2. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования формирования активного ДНК-белкового комплекса CLE0, обеспечивающего транскрипцию гена ИЛ-5 (рис. 6-2). Таким образом, результаты проведённых экспериментов указывают на ключевую роль Jun D и Fra-2 в механизме зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo. Действительно, остальные участники ДНК-белкового комплекса CLE0 ИЛ-5, факторы транскрипции Oct 1 и Oct-2, постоянно присутствуют в ядрах клеток PER-117. После 12 часов стимуляции клеток, содержание Oct-1 снижается. Эффект клеточной активации на синтез Oct-2 зависит от условий стимуляции. Активация с помощью только PMA или PMA в комбинации с CaI усиливает синтез этого белка, в то время как стимуляция PMA в комбинации с cAMP приводит к снижению содержания Oct-2. Эти факты указывают на то, что механизм зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo не связан с продукцией факторов Oct-1 и Oct-2.

Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что в значительной мере, если не полностью, механизм зависимости активации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo базируется на зависимости инициации транскрипции гена от синтеза de novo субъединиц CLE0 ИЛ-5 связывающего фактора AP-1. Несомненно, что этот механизм представляет собой весьма важный, но далеко не единственный уровень контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5. Вполне вероятно, что очередной уровень системы контроля может опираться на механизмы регуляции экспрессии генов Jun D и Fra-2. Каков индивидуальный вклад механизмов регуляции экспрессии каждого из этих генов в систему контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5?

Чтобы ответить на этот вопрос мы провели исследование синтеза мРНК Jun D и Fra-2 в клетках PER-117. Как видно на рис. 6-5, интактные клетки PER-117 содержат мРНК Jun D и не содержат мРНК Fra-2 (дорожка 1).

Клеточная стимуляция с помощью PMA в комбинации с CaI инициирует синтез мРНК Fra-2 и усиливает синтез мРНК Jun D (дорожка 2). Эти данные говорят о конститутивном характере экспрессии гена Jun D и индуцибельном Fra-2.

Рис. 6-5. Влияние двухчасовой стимуляции с помощью PMA в комбинации с CaI на синтез мРНК Jun D и Fra- в клетках PER- Итак, данные экспериментов по исследованию синтеза мРНК и белков Jun D и Fra-2 позволяют представить следующую схему инициации транскрипции гена ИЛ-5. В результате клеточной стимуляции происходит активация экспрессии гена Fra-2 и трансляции мРНК Jun D. Вероятно, нестимулированные клетки содержат значительное количество мРНК Jun D, что приводит к наработке в активированных клетках избыточного количества белка, необходимого для сборки CLE0 ИЛ-5 связывающего фактора AP-1.

Для проверки этого предположения мы провели ингибиторный анализ экспрессии репортёрной конструкции -509/+44, несущей ген люциферазы под контролем промотора гена ИЛ-5 человека, с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D. Источником антисмысловых РНК служили плазмиды, несущие фрагменты кДНК Fra-2 и Jun D в обратной ориентации, pSI-аFra-2 и pSI-аJun D. Эти конструкции были выполнены на основе экспрессионного вектора pSI, использованного при проведении ингибиторного анализа в качестве контрольной плазмиды.

Рис. 6-6. Влияние антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D на активность промотора гена ИЛ-5 человека (кратности индукции определена относительно уровня активности люциферазы в нестимулированных клетках, трансфицированных репортёрной плазмидой и вектором pSI) Как показано на рис. 6-6, в результате экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Fra-2, активность люциферазы существенно снижается по сравнению с уровнем люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных контрольным вектором. При экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Jun D, такого эффекта не наблюдалось. Эти результаты поддерживают предположение об избыточном содержании мРНК Jun D в активированных Т клетках и ещё раз свидетельствуют о том, что белком, регулирующим интенсивность формирования комплекса AP-1, и, соответственно, уровень экспрессии гена ИЛ-5 является Fra-2.

Результаты исследований, изложенные в данном разделе, позволяют утверждать, что ключевым транскрипционным фактором, контролирующим инициацию экспрессии гена ИЛ-5 человека, является AP-1. Действительно, данные экспериментов по изучению кинетики взаимодействия CLE0 с ядерными белками и влияния условий клеточной стимуляции на это взаимодействие демонстрируют, что именно AP-1-содержащий комплекс формируется первым, независимо от условий активации клеток. Более того, существует прямая корреляция между кинетикой формирования комплекса AP-1 и активностью экспрессии гена ИЛ-5 в клетках PER-117. Таким образом, можно заключить, что AP-1 контролирует не только инициацию транскрипции гена, но и уровень её активности. Следовательно, существует прямая зависимость между условиями клеточной стимуляции, определяющими активность экспрессии гена ИЛ-5, и интенсивностью синтеза, по крайней мере, одной из субъединиц AP-1.

Нам удалось показать, что такой субъединицей является Fra-2. CaI и cAMP усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 и не влияют на синтез Jun D. Интересно, что индукция экспрессии гена Fra-2 полностью зависит от клеточной стимуляции - интактные клетки PER-117 не содержат мРНК Fra-2.

Здесь уместно вспомнить, что активация экспрессии гена ИЛ-5 невозможна без синтеза белка de novo. Это ставит ген ИЛ-5 в особое положение по сравнению с другими генами цитокинов и позволяет говорить о существовании уникальной системы запуска экспрессии ИЛ-5. Согласно нашим данным такая уникальная система базируется на жестком контроле инициации транскрипции ИЛ-5. Жесткость заключается в том, что клеточная активация инициирует экспрессию Fra-2, который в свою очередь запускает экспрессию ИЛ-5. Роль Fra-2 как фактора, лимитирующего как инициацию, так и уровень активности экспрессии гена ИЛ-5 была подтверждена в экспериментах с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D.

Следует отметить, что полученные данные могут иметь существенное значение не только при планировании дальнейших академических исследований регуляции экспрессии гена ИЛ-5, но и при проведении прикладных работ, направленных на создание нового поколения фармакологических препаратов для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.

6.2. Механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 человека дексаметазоном В настоящее время для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, активно используются синтетические глюкокортикоиды, в частности, дексаметазон. В результате применения этих препаратов у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al., 1991;

Greenfeder et al., 2001]. В бронхиально-альвеолярных смывах снижается также и количество Т клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al., 1993]. Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов при лечении аллергических заболеваний, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью.

Известно, что дексаметазон обладает способностью активировать механизмы, понижающие эффективность экспрессии генов цитокинов на транскрипционном, посттранскрипционном и даже посттрансляционном уровнях [Peppel et al., 1991;

Adcock et al., 2001]. Не исключено, что эффект дексаметазона на продукцию ИЛ-5 является результатом суммарного действия всех перечисленных механизмов. Однако регуляция экспрессии гена ИЛ-5 происходит на транскрипционном уровне, поэтому вероятнее всего, что основными мишенями дексаметазона в случае ИЛ-5 является именно механизмы транскрипции.

Глюкокортикоиды регулируют транскрипцию генов как с использованием механизма прямого воздействия на промоторную активность гена-мишени, так и опосредовано, активируя экспрессию белка, обладающего свойствами транскрипционного регулятора гена-мишени. Происходит это следующим образом: после проникновения в клетку глюкокортикоиды образуют комплекс с цитоплазматическим глюкокортикоидным рецептором (ГР). Этот комплекс, который чаще называют активированный ГР, перемещается в ядро, где он действует уже как фактор транскрипции.

Промоторы ряда генов содержат регуляторные элементы, при взаимодействии с которыми активированный ГР способен инициировать, усиливать или подавлять транскрипцию этих генов [Hayashi et al., 2004;

Barnes, 2006].

Необходимо отметить, что согласно проведённому нами и другими авторами компьютерному анализу последовательности гена ИЛ-5 человека, его регуляторные области не содержат элементов, связывающих активированный ГР. Следовательно, весьма маловероятно, что эффект глюкокортикоидов, в частности, дексаметазона на экспрессию ИЛ- достигается в результате прямого взаимодействия активированного ГР с промотором гена. Скорее всего ингибирующее действие дексаметазона на транскрипцию ИЛ-5 осуществляется либо с помощью белка репрессора, экспрессия которого инициирована или усилена этим глюкокортикоидом в активированных Т-клетках, либо в результате подавления активированным ГР экспрессии факторов, обеспечивающих транскрипцию ИЛ-5.

В задачи данного этапа нашей работы входили идентификация регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека, активность которых подавляется дексаметазоном, и исследование механизма этого подавления. В частности, наше внимание было сфокусировано на решении вопроса о том, является ли эффект дексаметазона следствием прямого действия глюкокортикоида на факторы, участвующие в активации транскрипции ИЛ-5, или в данном случае задействованы белки-посредники, ингибирующие взаимодействие факторов транскрипции и регуляторных элементов гена.

Для определения участка промотора, содержащего дексаметазон чувствительные регуляторные элементы гена ИЛ-5, были использованы репортёрные конструкции, экспрессирующие люциферазу под контролем различных по размеру фрагментов промотора гена ИЛ-5 человека.

Репортёрные конструкции транфицировали в клетки PER-117, часть клеток обрабатывали дексаметазоном. Обработанные глюкокортикоидом и контрольные культуры активировали различными комбинациями клеточных стимуляторов и после 16-ти часовой инкубации в стандартных условиях определяли в них уровень активности люциферазы.

В результате проведения этой серии экспериментов было установлено, эффект дексаметазона на экспрессию конструкций, содержащих первые 2000, 1300, 509 и 60 (конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию репортёрного гена в клетках, активированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28. В культурах же, стимулированных PMA в комбинации с CaI, дексаметазон не влияет на активность экспрессии этого гена (рис. 6-7). Эти данные согласуются с результатами, полученными при определении чувствительности экспрессии гена ИЛ-5 к действию дексаметазона в первичных Т-лимфоцитах человека и клетках PER- (раздел 1) и ещё раз указывают на то, что в определённых условиях клеточной активации дексаметазон не влияет на активность промотора гена ИЛ- человека.

Рис. 6-7. Активность люциферазы в культурах PER-117, трансфицированных конструкциями, содержащими первые 2000 (А), 1300 (Б), 509 (В) и 60 (Г, конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 человека. Обозначения: К – нестимулированные культуры;

PMA, PMA/CaI и т.д. – стимуляция различными комбинациями клеточных активаторов;

белые столбцы – без дексаметазона;

заштрихованные столбцы – обработка дексаметазоном Поскольку дексаметазон обладал практически одинаковым эффектом на экспрессию репортёрных конструкций, использованных в данных экспериментах, можно заключить, что мишенью дексаметазона в контексте промотора гена ИЛ-5 является CLE0, регуляторный элемент, обеспечивающий экспрессию минимальной плазмиды CLE0/TATA.

При проведении данной работы было показано, что CLE0 выполняет функции ключевого регуляторного элемента промотора гена ИЛ-5 человека (раздел 4). Не исключено, что механизм подавления экспрессии гена ИЛ- дексаметазоном может включать ингибирование формирования транскрипционного комплекса CLE0. В ходе экспериментальной работы было выяснено, что аналогично действию дексаметазона на продукцию ИЛ-5, синтез мРНК этого цитокина и активность ИЛ-5 промотора в составе репортёрных плазмид, эффект этого глюкокортикоида на формирование белковых комплексов CLE0 зависит от условий клеточной активации.

Нарушения взаимодействия CLE0 и факторов транскрипции возникают в клетках, стимулированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28, в то время как в PMA/CaI активированных культурах дексаметазон не оказывает влияния на ДНК связывающую активность CLE0 (рис. 6-8).

Рис. 6-8. Влияние дексаметазона (Декс) на белоксвязывающую активность элемента CLE0 ИЛ- человека (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из PMA/cAMP стимулированных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами) На основании представленных выше данных можно предположить, что чувствительность или устойчивость транскрипции гена ИЛ-5 к действию дексаметазона зависит от спектра веществ, синтез которых индуцирует этот глюкокортикоид в клетках при различных условиях клеточной активации.

Вполне возможно, что в реализации репрессорного механизма важную роль играет белок (или белки), синтез которого успешно проходит в PMA, PMA/cAMP и PMA/CD28 стимулированных культурах. В отличие от этого, клеточная активация с помощью PMA в комбинации с CaI отменяет глюкокортикоидзависимый синтез белка, подавляющего транскрипцию гена ИЛ-5, или экспрессия такого белка в PMA/CaI стимулированных культурах значительно понижена. В подобных условиях механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 эффективно реализоваться не может.

Ранее было показано, что в Т-клетках дексаметазон индуцирует экспрессию белка GILZ [D'Adamio et al., 1997]. Интересно, что GILZ обладает способностью взаимодействовать с фактором транскрипции AP-1.

Предполагается, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления TCR-индуцированной экспрессии генов ИЛ-2 и рецептора ИЛ-2 лежит прямое взаимодействие GILZ с AP-1. В результате этого взаимодействия AP-1 теряет свою ДНК-связывающую и, как следствие, регуляторную активность [Mittelstadt et al., 2001]. Эти факты позволяют предположить, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции гена ИЛ- также лежит прямое взаимодействие GILZ с AP-1.

Проверку данного предположения мы начали с исследования возможности индукции синтеза мРНК GILZ в клетках PER-117. Установлено, что синтез этой мРНК происходит только в обработанных дексаметазоном культурах, стимулированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28.

В нестимулированных клетках или культурах, обработанных дексаметазоном и активированных PMA в комбинации с CaI, обнаружить мРНК GILZ не удаётся (рис. 6-9). Таким образом, условия индукции мРНК GILZ дексаметазоном совпадают с условиями, при которых экспрессия гена ИЛ- чувствительна к действию этого глюкокортикоида. Использование CaI в качестве ко-активатора приводит к блокаде PMA-индуцированного синтеза мРНК GILZ.

Рис. 6-9. Влияние дексаметазона (Декс) на синтез мРНК GILZ в культурах PER-117, стимулированных различными комбинациями клеточных активаторов Полученные данные указывают на прямую корреляцию между синтезом мРНК GILZ и эффектом дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5, что косвенно подтверждает предположение о возможном участии белка GILZ в реализации дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции ИЛ-5.

Для того чтобы получить прямые свидетельства влияния GILZ на активность промотора гена ИЛ-5, мы использовали репортёрный анализ в комбинации с эктопической экспрессией данного белка. В результате были получены данные, демонстрирующие, что в PMA/cAMP-стимулированных клетках PER-117 GILZ подавляет активность промотора гена ИЛ-5 (рис. 6-10).

Аналогичные результаты получены и при проведении экспериментов с использованием PMA/CD28-стимулированных клеток.

Рис. 6-10. Влияния GILZ на экспрессию репортёрных конструкций, содержащих первые 509 (А, плазмида -509/+44) и 60 (Б, плазмида CLE0/TATA) п.о.

промотора гена ИЛ-5 человека в нестимулированных (Н/клетки) и PMA/cAMP активированных культурах PER-117. Для эктопической продукции GILZ использована конструкция pcDNA3.1-GILZ, содержащая кДНК GILZ. В контрольных экспериментах данная конструкция была заменена на плазмиду pcDNA3.1-LacZ, содержащую кДНК LacZ, и базовый вектор pcDNA3. Следует отметить, что ингибирующий эффект GILZ на экспрессию конструкции -509/+44 практически не отличается от эффекта этого белка на активность конструкции CLE0/TATA. Это подтверждает данные, полученные в экспериментах по определению мишени дексаметазона в контексте промотора гена ИЛ-5, и указывает на то, что GILZ полностью блокирует активность CLE0.

Роль GILZ как ингибитора активности CLE0 ИЛ-5 была подтверждена с помощью экспрессии репортёрной конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI стимулированных клетках PER-117. Как упоминалось выше, в этих условиях клеточной активации дексаметазон не индуцирует экспрессию гена GILZ и, очевидно, как следствие, не влияет на экспрессию репортёрных плазмид в клетках PER-117. Однако избыточная продукция GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI-стимулированных клетках PER-117 (рис.

6-11). Таким образом, в условиях блокады экспрессии гена GILZ с помощью CaI эктопическая продукция этого белка приводит к подавлению активности CLE0 ИЛ-5.

Рис. 6-11. Влияния GILZ на экспрессию репортёрной конструкции CLE0/TATA в нестимулированных и PMA/CaI-активированных культурах PER-117.

Пояснения к обозначению экспрессионных конструкций в подписи рис. 6- Ещё одно доказательство того, что подавление активности CLE0 ИЛ- является следствием именно эктопической продукции GILZ, было получено в экспериментах с использованием культуры клеток Jurkat. Дело в том, что эти клетки не содержат функционально активный глюкокортикоидный рецептор [Northrop et al., 1992]. Следовательно, в культуре Jurkat дексаметазон не может инициировать активность какого-либо механизма, модифицирующего транскрипцию генов. Действительно, обработка клеток Jurkat дексаметазоном при любых условиях клеточной стимуляции не влияет на активность экспрессии репортёрных конструкций, использованных в данном исследовании (рис. 6-12А). Однако эктопическая продукция белка GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI стимулированных клетках Jurkat (рис. 6-12Б). Аналогичные результаты получены для PMA/cAMP- и PMA/CD28-стимулированных клеток Jurkat.

Данные результаты ещё раз указывают на то, что GILZ обладает способностью подавлять транскрипцию гена ИЛ-5, в частности, ингибировать активность CLE0, ключевого регуляторного элемента промотора.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.