Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов

На правах рукописи

Каплан Игорь Борисович

Сборка вирионов и распространение в растении разных

групп фитовирусов

03.02.02 – Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва

2010

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и на кафедре фитопатологии Корнельского университета (г. Итака, США)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Атабеков Иосиф Григорьевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Добров Евгений Николаевич доктор биологических наук, профессор Завриев Сергей Кириакович доктор биологических наук, профессор Рубцов Пётр Михайлович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится апреля 2010 года в часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу:

119991 Москва ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «_» марта 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.А.Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизма распространения вирусной инфекции в растении-хозяине является одной из ключевых проблем современной фитовирусологии, открывающей фундаментальные подходы к пониманию вирусоустойчивости растений и получению новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур. С другой стороны, в силу простоты организации вирусы растений служат удобной экспериментальной системой для изучения репликации и экспрессии вирусных геномов вообще.

Для активного межклеточного транспорта вирусного генома из зараженной клетки в соседнюю здоровую, происходящего в растениях через плазмодесмы, необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov and Dorokhov, 1984;

Atabekov and Taliansky, 1990). Вирусные транспортные белки, как принято считать в настоящее время, модифицируют и используют клеточную систему активного транспорта молекул растения-хозяина. В связи с этим, изучение вирусных ТБ и РНК-белок и белок-белковых взаимодействий важно для понимания процессов межклеточных взаимодействий в растениях.

Основными объектами настоящей работы служили вирусы, принадлежащие к трем таксономическим группам: Tobamo-, Bromo- и Luteoviruses. Организация геномов вирусов этих групп и их биологические особенности различны. Тем не менее, во всех трех группах межклеточный транспорт обеспечивается ТБ.

Специфическое взаимодействие нуклеиновой кислоты с белком является составной частью самых разных биологических процессов, к которым относится синтез белков и нуклеиновых кислот, самосборка надмолекулярных структур и т.д.

Удобной моделью для изучения РНК-белковых и белок-белковых взаимодействий является вирус табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV).

Преимущество TMV заключается в простоте строения (TMV состоит всего из двух компонентов: одноцепочечной РНК и одного типа структурного белка) и в возможности осуществления его сборки in vitro из РНК и белка (Fraenkel-Conrat and Williams, 1955). Для понимания тонких механизмов РНК-белкового узнавания при сборке TMV особый интерес представляет исследование различных мутантов. В связи с тем, что мутант Ni2519 является температурочувствительным (ts) одновременно по двум функциям (по сборке вирионов и транспорту вирусной инфекции), изучение свойств этого мутанта позволяет расширить наши представления, во-первых, об избирательности нуклеиново-белкового взаимодействия, и, во-вторых, о механизмах транспорта вирусной инфекции в растениях.

Вирус огуречной мозаики (cucumber mosaic virus, CMV) имеет чрезвычайно широкий спектр растений-хозяев и уже только по этой причине представляет большой интерес. Его штаммы обладают различной патогенностью и скоростью распространения по растениям;

выяснение причин таких различий имеет не только теоретический, но и практический интерес.

Вирус скручивания листьев картофеля (potato leafroll virus, PLRV) является самым опасным вирусным патогеном картофеля, из года в год нанося значительный экономический ущерб во всём мире. PLRV является флоэмно-ограниченным вирусом, способным репродуцироваться только в клетках флоэмы (проводящей ткани) и не обнаруживаемый в клетках мезофилла. Понимание механизмов распространения внутри растениий, а также механизма переноса инфекции от одного растения к другому растению тлями, необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов сборки вирусных частиц и распространения по растениям представителей трёх семейств фитовирусов.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Изучение причин образования дефектных вирусных частиц при сборке мутанта TMV Ni2519 in vitro при непермиссивной температуре и локализация участков инициации реконструкции в молекуле РНК Ni2519;

2. Изучение возможности комплементации ts-функций транспорта мутантов TMV Ni2519 и LS1 вирусом-помощником;

3. Изучение влияния транспортного белка TMV трансгенных растений на накопление чужеродного вируса крапчатости красного клевера (red clover mottle virus, RCMV);

4. Изучение влияния нефункциональных и гетерологичных вирусных транспортных белков трансгенных растений на репродукцию TMV;

5. Изучение причин отличий в накоплении CMV, его штаммов и мутантов в различных растениях;

6. Определение возможности комплементации дефектных по транспорту мутантов CMV в трансгенных растениях, экспрессирующих ТБ (3а белок);

7. Изучение возможности распростанения флоэмно-ограниченного вируса PLRV из проводящих тканей в клетки мезофилла в присутствии вируса-помощника;

8. Определение участков структурного белка PLRV, имеющих определяющее значение для сборки вирионов, распространения инфекции в растении и переносе вируса тлями.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что при непермиссивной температуре (33оС) в клетках растений табака Nicotiana tabacum, зараженных ts-мутантом TMV Ni2519, синтезируется вирионная РНК и функционально активный структурный белок. В результате реконструкции in vitro при 33о образуются дефектные вирусные частицы (ДВЧ), чувствительные к РНКазе (РНК нормальных вирионов TMV защищена от действия рибонуклеаз). Определено положение чувствительного к действию РНКаз сайта в составе ДВЧ. Показано, что причиной образования ДВЧ является множественная инициация сборки вирионов. Таким образом, можно предполагать, что ts-фенотип сборки этого мутанта обусловлен температурочувствительностью самой молекулы РНК, проявляющейся в одновременном функционировании двух участков инициации реконструкции при непермиссиовной температуре.

В ходе исследований установлено, что функция транспорта (распространение из клетки в клетку) мутантов Ni2519 и LS1 при непермиссиовной температуре может быть комплементирована вирусом-помощником. С другой стороны, комплементировать функцию сборки зрелых вирусных частиц у Ni2519 вирусом-помощником не удалось.

Показано также, что комплементация транспорта может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений, а также гетерологичными траснпортными белками в трансгенных растениях.

Показано, что нефункциональный ТБ, экспрессирующийся в трансгенных растениях, способен подавлять накопление близкородственного вируса, а полноценный ТБ может негативно сказываться на накоплении неродственных вирусов.

Продемонстрирована роль ТБ CMV в процессе транспорта вируса в ряде растений-хозяев, а также способность трансгенных по ТБ растений комплементировать не только различных мутантов CMV с дефектными ТБ, но и ряд других вирусов. В ходе детального изучения процесса формирования делеций в гене ТБ в составе дефектных РНК3 CMV в трансгенных растениях было обнаружено, что все конечные стабильные формы РНК3 мутантов имели исходную рамку считывания гена ТБ вне зависимости от характера первоначальной делеции.

Впервые продемонстрировано, что для межклеточного распространения CMV необходим лишь белок оболочки (СР) – но не сформированные вирионы.

С использованием мутантов по структурному белку PLRV определены аминокислотные последовательности, ответственные за сборку полноценных вирионов, за распространение инфекции в ряде растений-хозяев и за способность этого вируса передаваться от растения к растению вектором-насекомым (тлями).

Практическая значимость работы. Вирус табачной мозаики (TMV), вирус огуречной мозаики (CMV) и вирус скручивания листев картофеля (PLRV) имеют широкий круг растений-хозяев и относятя к числу важнейших патогенов селькохозяйстивенных культур, нанося значительный экономический ущерб. В работе исследованы механизмы сборки вирусных частиц и распространения вирусной инфекции в растениях, понимание которых необходимо для получения новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур и новых фундаменталных подходов к проблеме вирусоустойчивости растений в целом. В частности, результаты работы позволяют понять механизм транспорта вирусной инфекции в растениях, пораженных изученными вирусами, выяснить причины различной патогенности и скорости распространения по растениям-хозяевам CMV, механизм переноса PLRV от одного растения к другому растению тлями, что необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией, а также особености распространения вирусной инфекции в трансгенных растениях.

Полученные в работе данные вошли в курсы лекций, читаемых на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на II Всесоюзном симпозиуме «Штаммы вирусов растений» (Елгава, 1981), конференции «Вирусы микроорганизмов» (Пущино-на-Оке, 1981), IV Советско-Западногерманском симпозиуме «Структура генома» (Ереван, 1981), совещании ФЕБС «Структура и экспрессия вирусного генома» (Рига, 1991), Симпозиуме Х годовщины Центра Сельскохозяйственной Биотехнологии Отто Варбурга «Молекулярная биология в селекции растений: теоретические, практические и легальные аспекты» (Реховот, Израиль, 1994), Конференциях Американского Общества Фитопатологии (Нэшвил, Теннесси, 1993;

Монреаль, Канада, 1998;

Анахайм, Калифорния, 2004), Конференциях Американского Общества Вирусологов (Мэдисон, Висконсин, 1995;

Лондон, Онтарио, Канада, 1996), IX (Глазго, Шотландия, 1993) и X (Иерусалим, Израиль, 1996) Международных Вирусологических Конгрессах.

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 37 работ, в том числе статьи в отечественных журналах, 18 статей в иностранных журналах, 6 статей в составе книг и сборников, 10 сообщений (тезисы конференций).

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы:

введение, в котором формулируются цели и задачи исследования, аналитический обзор литературы о сборке, структуре геномов TMV, CMV и PLRV, о комплементационном анализе вирусов растений, описание материалов и методов исследования, экспериментальную часть, обсуждения результатов, выводы и список цитируемой литературы. Общий объем работы составляет … страниц, включая … таблиц и … русунков, список литературы содержит …. названий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Вирус табачной мозаики (TMV) 1. Изучение реконструкции вирионов мутанта Ni Многие ts-мутанты TMV содержат аминокислотные замены в белке оболочки (Jockusch, 1966). При непермиссивной температуре структурный белок таких ts мутантов денатурирует как in vivo, так и in vitro (Jockusch, 1968). С другой стороны, при непермиссивной температуре РНК таких мутантов реплицируется и они способны распространяться от клетки к клетке (Jockusch, 1966, 1968).

Известны 3 ts-мутанта TMV по функции распространения инфекции, продуцирующие полноценный структурный белок при непермиссивной температуре:

Ni2519 (Jockusch, 1968), II-27 (Peters and Murphy, 1975) и LS1 (Nishiguchi et al., 1978).

Эти мутанты можно отличить от мутантов с tr (температурорезистентным) транспортным фенотипом (включая ts-мутанты по структурному белку) по типу продуцируемых некрозов на растениях табака Xanthi-NN при дифференциальной температурной обработке (ДТО). Инокулированные растения выдерживают 2 дня при 24°С, затем переносят на 32°С на 1-2 дня. При 32°С некрозы не образуются, т.к.

реакция некрозообразования является температурочувствительной (Samuel, 1931).

После возвращения на 24°С на инфицированных участках листа начинают образовываться некрозы. В результате некрозы, вызванные tr по транспорту штаммами TMV, значительно увеличиваются в размерах после инкубации при 32°С и при возвращении на 24°С (когда некротическая реакция вновь включается), в то время, как некрозы ts-мутантов по транспорту остаются мелкими, поскольку эти мутанты не способны распространяться при 32°С.

Мутант Ni2519 продуцирует значительные количества структурного белка в изолированных клетках заражённого листа при непермиссивной температуре (Bosch and Jockusch, 1972), однако при этом не происходит образования инфекционного вируса. Таким образом, Ni2519 дефектен сразу по двум функциям. Реконструкция TMV может быть условно подразделена на две фазы. Первая фаза (инициация реконструкции) состоит в образовании специфического комплекса между определенным участком молекулы РНК TMV (сайт начала сборки, origin of assembly – Oa) и белком оболочки в форме 2OS–агрегатов. Вторая фаза реконструкции (элонгация), по-видимому, менее специфична, чем первая, и заключается в одевании белком той части молекулы РНК TMV, которая находится за пределами Оа. Оа распложен на расстоянии 800-1000 нуклеотидов от 3’ -конца молекулы РНК, и сборка TMV происходит, таким образом, в двух направлениях из одной внутренней точки (Оа) РНК TMV (Otsuki et al. 1977).

Мы обнаружили, что температурочувствительной является стадия инициации реконструкции Ni2519. От температуры достройки первичного комплекса (неполный нуклеопротеидный комплекс, Н-НПК) инфекционность получаемого вируса практически не зависит (табл. 1).

Таблица 1. Воздействие температуры на разные этапы реконструкции Ni Компоненты Температура Температура Инфекционност инкубационной смеси получения Н-НПК достройки Н-НПК ь (инициация), оС (элонгация), оС РНК Белок 24 33 Ni2519 А 24 33 Примечание. Н-НПК получали в опытах по ограниченной (90-секундной) реконструкции. Реконструкцию проводили в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,3 при 24 о и 33о. Полученный Н-НПК выделяли центрифугированием и достраивали до полного вируса также при 24о и 33о. Инфекционность определяли как среднее для 6-8 листьев на половине листа растения N. glutinosa число некрозов, вызываемых реконструированным материалом в концентрации 50 мкг/мл. Приведены средние цифры для 2-5 независимых опытов.

Использование для реконструкции РНК и белка tr штамма показало, что на инфекционность вируса не влияет температура ни на одной стадии сборки.

Был проведён электронномикроскопический анализ структуры Н-НПК. Ранее (Butler et al., 1977;

Lebeurier et al., 1977), была определена структура Н-НПК для обычного, tr, штамма TMV: такие комплексы имеют два конца свободной РНК, находящиеся на одном конце растущего нуклеопротеида. Структура Н-НПК Ni2519, полученных при 33°, отличалась принципиально: они состояли из двух участков РНК, соединённых участком свободной РНК (Рис. 1). Реультаты свидетельствуют, что при непермиссивной температуре инициация реконструкции Ni2519 происходит не в одном, а как минимум в двух участках РНК.

Рис. 1. Электронные микрофо тографии неполных нуклео протеидных комплексов (Н-НПК), образованных при инициации реконструкции мутанта TMV Ni при 24о (А) и 33° (Б-З). Стрелками указано положение участков свободной РНК В связи с этим было важно изучить причины формирования дефектных вирусных частиц (ДВЧ) в процессе полной (а не ограниченной) реконструкции.

Рис. 2. Фракционирование в градиенте концентрации сахарозы (3-22%) РНК из частиц, реконструированных с использованием РНК tr штамма vulgare при 24о (А) и 33°(B), и РНК Ni2519 при 24о( C) и 33° (D). Перед выделением РНК частицы обрабатывали РНКазой.

Вертикальные стрелки соответствуют положению нативной РНК.

Горизонтальные стрелки указывают направление седиментации Сопоставление длин двух фрагментов РНК, защищённых от РНКазы в составе ДВЧ, указало на участок на расстоянии 600-800 нуклеотидов от одного из концов РНК как на незащищённый (Рис. 2). Способность 3’-конца РНК TMV быть аминоацилированным гистидином (Oberg and Philipson, 1972) позволила определить, что аминоацилируется только короткий фрагмент, т.е. чувствительный к РНКазе сайт находится на расстоянии 600-800 нуклеотидов от 3’-конца РНК Ni2519 (табл. 2).

Таблица 2. Гистидин-акцептирующая способность фрагментов РНК Ni Происхождение РНК Радиоактивность нерастворимого в ТХУ материала имп/мин на 100 мкл смеси, содержащей 0,25 мкКи 3Н гистидина Опыт I Опыт II Интактный Ni2519 1422 Ni2519, реконструированный при 24о 1535 Длинный фрагмент* Ni2519, 220 реконструированный Короткий фрагмент* 1520 при 33о Без РНК (контроль) 248 Интактный Ni2519;

образец без 148 – аминоацилирующих ферментов (контроль) Примечание. * – фрагменты РНК выделяли из обработанных РНКазой дефектных вирусных частиц (ДВЧ). Разделение фрагментов осуществляли центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы (см. рис. 2) Для более точной локализации участков инициации реконструкции был использован метод фингерпринта (Pedersen and Haseltine, 1980) c последующим определением нуклеотидной последовательности полученных олигонуклеотидов (Donis-Keller et al., 1977). Оказалось, что большинство олигонуклеотидов, защищаемых в составе Н-НПК Ni2519 (24°), группируются в районе 800-1000 нуклеотидов от 3’ конца. В составе Н-НПК Ni2519 (33°) представлены также олигонуклеотиды, расположенные в области 300-520 нуклеотидов от 3’-конца РНК. Этот участок (SERF) известен высоким сродством к структурному белку, которое проявляется только в составе фрагментированной РНК. Скорее всего, при непермиссивной температуре у Ni2519 SERF приобретает способность взаимодействовать с СР одновременно с нормальным участком инициации реконструкции (Оа), что и приводит к образованию ДВЧ (Рис. 3). Известен штамм коровьего горошка TMV, у которого инициация нормальной сборки вирионов происходит как раз в районе SERF (Fukuda et al., 1980).

Рис. 3 Предлагаемая схема образования дефектных вирусных частиц (ДВЧ) мутанта TMV Ni2519. a, b, c - стадии образования комплекса. RISI и RISII – участки инициации реконструкции. Стрелкой указан участок РНК, доступный действию РНКазы в составе ДВЧ 2. Комплементация вирусной транспортной функции Ранее нами было показано, что распространение мутанта Ni2519 из клетки в клетку может быть комплементировано штаммом-помощником TMV в условиях ДТО (Taliansky et al., 1982a). Но, поскольку Ni2519 является температурочувствительным не только по функции транспорта, но и по функции сборки вирионов (Taliansky et al., 1982b), интерпретация результатов по комплементации транспорта была неоднозначной. Поэтому для дальнейших экспериментов был выбран мутант TMV LS1, ts по функции транспорта, нормально репродуцирующийся в первоначально заражённых клетках при непермиссивной температуре (Nishiguchi et al., 1978).

Использовали две модельные системы. Первая была направлена на изучение комплементации распространения LS1 из клетки в клетку в тканях растения, предварительно системно зараженного tr вирусом. Два типа экспериментов были проведены в рамках первой модельной системы. (1) Использовали растение-хозяин, по-разному отвечавшее на инфекцию LS1 (некрозы) и вирус-помощник (системная реакция) при пермиссивной температуре (24°С). Комплементация происходила в условиях смешанной инфекции при непермиссивной для LS1 (32°С, факт комплементации выявлялся с помощью ДТО (24°32°24°С). (2) Распространение LS1 из клетки в клетку в присутствии вируса-помощника напрямую исследовали иммунофлуоресцентной микроскопией.

Во второй модельной системе рассматривался вирусный транспорт из проводящей системы стебля в клетки мезофилла растений предзаражённых вирусом помощником.

Комплементация распространения LS1 из клетки в клетку в условиях дифференциальной температурной обработки Ранее при комплементации распространения Ni2519 использовали U1 штамм TMV (Taliansky et al,, 1982a). В последующих экспериментах мы использовали не только этот штамм, но и неродственный вирус PVX (potato virus X, X-вирус картофеля).

Показано, что оба вируса-помощника позволяют мутанту LS1 распространяться из точки первоначального заражения при непермиссивной температуре. Эффективность комплементации LS1 (отношение количества увеличившихся в размерах некрозов по отношению к общему количеству некрозов) составляла при использовании в качестве помощника U1 TMV 50-70%, а PVX - 30-50%.

Обработка клеток мезофилла табака специфическими флуоресцентными антителами показала, что при 32°С только отдельные клетки обнаруживают присутствие LS1. При 24°С большое количество точек свечения относилось на счет двух и более соседних клеток. В том случае, когда листья растений табака были заражены одновременно LS1 и PVX, при 32°С обнаруживались кластеры из 3 и более светящихся клеток. То есть неродственный вирус способен комплементировать функцию транспорта LS1.

Распространение вирусных частиц из проводящих тканей стебля в ткани листа При простом погружении срезанного стебля в вирусную суспензию не происходит проникновения вируса в ткани листьев и заражения растения (Matthews, 1970). Мы изучали влияние предсуществующей в растении вирусной инфекции (вирус помощник) на способность зависимого вируса проникать из проводящих тканей в клетки листа и реплицироваться в них. Предзаражение верхних листьев растений штаммом TMV U1 приводит к тому, что штамм TMV U2 приобретает способность проникать из проводящих тканей в лист. Это доказывается тем, что экстракты из таких листьев вызывают формирование некрозов на растениях N.sylvestris, что характерно для U2, (U1 на листьях этого растения вызывает системную реакцию).

Заражение верхних листьев растений томатов Lycopersicon esculentum сорта Маяк вирусом PVX позволяло L штамму TMV (томатный штамм TMV, wt по отношению к LS1, tr). проникать из проводящих тканей в ткани листа и там репродуцироваться: экстракт из листьев вызывает на N.sylvestris некрозы, что характерно для L, но не для PVX.

Таким образом, преинокуляция верхних листьев вирусом-помощником делает их восприимчивыми к заражению зависимым вирусом через проводящие ткани.

Следует отметить, что данный эффект не связан с механическим повреждением листьев: инокулированные буфером контрольные растения не обладали способностью к комплементации транспорта зависимого вируса.

Было интересно изучить способность ts-мутанта по транспорту LS1 в данной системе, используя его и как зависимый вирус, и как вирус-помощник. Вторым вирусом был выбран штамм TMV L. Для идентификации двух геномов использовали ДТО: на листьях N. glutinosa штамм L в этих условиях вызывает формирование крупных некрозов, а LS1 - мелких. Как и предпологалось, LS1 мог служить помощником для L только при пермиссивной температуре, в то же время L обеспечивал переход LS1 из проводящих тканей в ткани листа как при 24°С, так и при 32°С.

Таким образом мы показали, что в обеих модельных системах ts функция вирусного транспорта может быть комплементирована не только близкородственным tr штаммом TMV, но и неродственным вирусом – PVX. Из чего можно предположить, что вирусспецифическая транспортная функция вируса-помощника «открывает ворота»

зависимому вирусу путём модификации клеток растения-хозяина.

Влияние нефункциональных и гетерологичных вирусных транспортных белков трансгенных растений на репродукцию TMV Ранее было продемонстрировано, что комовирус RCMV может заражать растения-нехозяева в присутствии тобамовирусов (Malyshenko et al., 1988, 1989). Мы изучали возможность комплементации транспорта RCMV в растениях табака, экспрессирующих 30-kDa транспортный белок TMV. В таких растениях ts транспортная функция мутанта LS1 комплементируется и вирус приобретает способность распространяться по трансгенному растению при непермиссивной температуре. Оказалось, что эти растения не способны обеспечивать транспорт RCMV.

Но в том случае, если трансгенное растение одновременно инокулируют RCMV и LS при непермиссивной для LS1 температуре, RCMV приобретает способность накапливаться. Таким образом, для репродукции в клетках растения-нехозяина наличия только транспортного белка недостаточно: требуется либо полный геном TMV, либо какой-то другой, помимо ТБ, TMV-специфический фактор. Также нельзя исключить, что использованная в эспериментах линия трансгенных растений продуцировала достаточно ТБ для комплементации LS1, но недостаточно для комплементации RCMV.

Таблица 3. Накопление U1 штамма TMV в трансгенных растениях, экспрессирующих температурочувствительный транспортный белок Ni Линия Накопление U1 штамма TMV в старых листьях (мкг/г ткани) 24оC 33оС 33оС 24оС трансгенного растения I I II III IV V VI I II Tni-1 14,0 0,5 2,6 0,2 5,8 0,2 0,5 11,0 15, (Ni2519 TБ+) To-4 28,0 14,0 – – – – – 18,0 – (U1 TБ+) Tk-1 (TБ-) 05,0 12,0 46,0 64,0 25,0 54,0 20,0 20,0 22, Накопление U1 штамма TMV в молодых листьях (мкг/г ткани) Tni-1 57,0 13,0 85,0 11,7 15,0 10,5 – 72,0 – (Ni2519 TБ+) To-4 (U1 36,0 28,0 – – – - – 14,0 – TБ+) Tk-1 (TБ-) 42,0 38,0 92,0 12,0 11,0 125,0 – 24,0 – Примечание – растения выдерживали при указанной температуре 2 недели до инокуляции U1. В последней группе экспериментов растения выдерживали 2 недели при 33оС, а затем переносили на 24оС на 2 недели до инокуляции. Линия трансгенных растений Tni-1 продуцировала ТБ Ni2519, линия To-4 – ТБ tr штамма U1, а линия Tk- ТБ не экспрессировала. Содержание вируса определяли методом иммуноферментного анализа.

Было показано, что трансгенные растения табака, экспрессирующие транспортный белок мутанта Ni2519, (а) не обладают устойчивостью к штамму TMV U1 при пермиссивной для транспортного белка Ni 2519 температуре (24°С), (б) приобретают определённый уровень устойчивости к TMV U1 при 33°С (непермиссивная для ТБ мутанта температура) (табл. 3, 4).

Если вирусная транспортная функция не выполняется (белок не синтезируется или является дефектным), то в этом случае при инокуляции вирус остаётся блокированным в первично заражённых клетках. Продукция нефункционального или частично функционального транспортного белка в растении способна привести к ограничению распространения вируса дикого типа в таком растении за счёт конкуренции с нормальным транспортным белком: например, дефектный белок сохраняет способность связываться с РНК, но утрачивает способность взаимодействовать с плазмодесмами. Или наоборот. Подобного рода растения могут оказаться устойчивыми не только по отношению к близкородственному вирусу, но и к некоторым неродственным.

Таблица 4. Накопление U1 штамма TMV при 33°С в неинокулированных (системных) листьях растений табака, экспрессирующих транспортный белок Ni Порядковый Накопление U1 штамма TMV в растениях (мкг/г ткани) номер листа I II III - Tk-1 (TБ-) Tni-1 Tk-1 (TБ ) Tni-1 Tk-1 (TБ ) Tni- (Ni2519 (Ni2519 (Ni + + TБ+) TБ ) TБ ) 1 0,5 10,0 – – 1,8 3, 2 0,9 10,0 0,2 30,0 1,0 2, 3 0,3 8,0 0,2 35,0 1,2 3, 4 0,2 7,0 0,2 40,0 – – 5 0,2 8,0 – – 0,5 3, 6 – – 0,2 10,0 0,5 1, Примечание – см. Примечание к Таблице 3. В данных экспериментах растения на протяжении всего времени выдерживали при 33°С.

Были также тестированы растения табака, экспрессирующие ген 3а (транспортный белок) BMV (Brome Mosaic Virus, вирус мозаики костра) - члена семейства Bromoviridae. BMV способен служить помощником для распространения TMV в растениях ячменя (Hamilton and Nicols, 1977), а некоторые тобамовирусы способны комплементировать транспорт BMV из клетки в клетку в растениях фасоли и томатов (Taliansky et al., 1982e).

Наши результаты однозначно свидетельствуют, что накопление штамма U TMV в трансгенных растенях табака, экспрессирующих транспортный белок BMV было значительно снижено по сравнению с контрольными растениями (Табл. 5).

Таблица 5. Накопление TMV в инокулированных листьях трансгенных растений табака, экспрессирующих транспортный белок вируса мозаики костра (BMV) Линия Накопление U1 штамма TMV в старых листьях (мкг/г ткани) трансгенного I II III IV V растения Tbmv-1 0,5 2,0 0,6 0,2 0, (BMV TБ+) Tk-1 (TБ-) 25,0 18,0 12,7 2,5 42, Накопление U1 штамма TMV в молодых листьях (мкг/г ткани) Tbmv-1 1,0 7,0 – 1,3 – (BMV TБ+) Tk-1 (TБ-) 82,0 42,0 – 62,0 – Примечание – см Примечание к Таблице Вирус огуречной мозаики (CMV) CMV является икосаэдрическим вирусом растений с чрезвычайно широким спектром растений-хозяев – около 1000 видов (Lot et al., 1991). Как и другие представители семейства Bromoviridae, геном CMV состоит из трёх геномных РНК положительной полярности, которые кодируют 5 белков (Рис. 4). Белки 111- и 97 кDa, кодируемые РНК 1 и 2 соответственно, являются компонентами репликазы CMV (Hayes and Buck, 1990). РНК3 кодирует белок 3а (ТБ, 30-kDa), ответственный за транспорт из клетки в клетку и за дальний транспорт CMV, и белок оболочки (CP, 24 kDa), который транслируется с субгеномной РНК4 и также играет роль в распространеинн вируса (Suzuki et al., 1991). РНК2 наряду с белком 2а кодирует небольшой белок 2b (11 k-Da), транслирующийся с субгеномной РНК4А;

этот белок является супрессором сайленсинга (Ding et al., 1995a), что позволяет вирусу избегать защитные системы растения-хозяина. Как следствие, 2b оказывает существенное влияние на характер симптомов инфекции.

Рис. 4. Структура генома вируса огуречной мозаики (CMV). РНК 1, 2 и 3 геномные, РНК4 – субгеномная РНК структурного белка. РНК3 содержит ген 3а, кодирующий транспортный 3а белок, и ген структурного белка. РНК4А кодирует 2b белок, супрессор сайленсинга. ORF (open reading frame) – открытая рамка считывания.

Данный рисунок сделан согласно Roossinck (2001) с модификациями РНК3 CMV кодирует два белка: 30-kDa 3а белок, дефекты которого не влияют на репликацию в протопластах, но влияют на локальный (от клетки к клетке) и системный (от инокулированного листа к неинокулированному) транспорт вируса, а также 24-kDa белок оболочки (СР), который влияет на накопление вируса в протопластах и на локальный и системный транспорт (Suzuki et al., 1991). По аналогии с другими вирусами и на основе алаймента последовательностей белков, 3а ген считался кодирующим транспортный белок, отвечающий за локальный и, возможно, системный транспорт по растению (Davies and Symons, 1988;

Melcher, 1990;

van der Kuyl et al., 1991;

Poirson et al., 1993). Способность 3а белка перемещаться и переносить РНК из клетки в клетку, как и увеличивать размер плазмодесм, была ранее продемонстрирована (Vaquero et al., 1994;

Ding et al., 1995). C другой стороны, для эффективного локального транспорта CMV, в отличии от TMV, требуется СР, так что вполне можно было ожидать различий свойств транспортных белков этих вирусов.

Поэтому мы изучали способность трансгенных растений комплементировать транспорт мутантов CMV по гену транспортного белка и определяли участки гена 3а, необходимые для вирусного транспорта.

Характеристика мутантов по 3а белку Для изучения роли 3а белка на основе биологически активного клона РНК3 Fny CMV были сконструированы мутанты по гену 3а (Рис. 5). Далее РНК транскрипты различных мутантных кДНК3 клонов транслировали в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кролика Трансляция транскрипта дикого типа (wt) выявила три основных полипептида: 3а, СР и белок промежуточного размера, по всей видимости являющийся продуктом трансляции со второго AUG кодона (аминокислота 35) гена 3а, всего кодирующего 279 аминокислот. Этот третий белок и СР были основными продуктами трансляции у РНК двух мутантов, у которых либо был удалён первый инициаторный кодон (AUG), либо имелся сдвиг рамки после четвёртой аминокислоты (AUG-fs). РНК мутант HpaI, имевшего делецию С-концевых аминокислот, при трансляции давала продукт заметно короче продукта мутанта AUG (минус 34 аминокислоты с N-конца).

Рис. 5. Внесение мутаций в ген транспортного белка (3а) CMV;

способность мутантных вирусов заражать трансгенные 3а(+) и нетрансгенные 3а(-) растения табака.

NTR – 5’-нетранслируемый район, IСR – интерцистронный район между генами 3а и структурного белка. Transgenic plants – обозначен участок, использованный для получения 3а трансгенных растений РНК3 мутанта с делецией 70 С-концевых аминокислот (E-H) давала при трансляции белок несколько меньшего размера, чем wt СР (218 аминокислот), – 3а белок этого мутанта содержит 208 аминокислот. Трансляция мутанта со сдвигом рамки Nhe-fs приводила к образованию белка из 175 аминокислот, дополнительная полоса с молекулярной массой 35-kDa предположительно является димером продукта трансляции. Мутант KpnI имел делецию 167 аминокислот (без сдвига рамки трансляции РНК, аминокислоты 7-173). Ожидавшийся белок размером аминокислот не был обнаружен: возможно, причиной тому было удаление всех метионинов за исключением инициаторного.

Транскрипты РНК3 различных мутантов совместно с транскриптами РНК1 и РНК2 вводили в протопласты табака методом электропорации. Все мутанты эффективно реплицировались в протопластах. Мутанты с большими делециями (E-H и KpnI), как и ожидалось, продуцировали РНК3 значительно меньшего размера, чем остальные, при этом размер РНК4 был для всех мутантов и wt неизменным (Рис. 6).

Рис. 6 Продукция вирусных РНК CMV в протопластах, изолированных из нетранс генных растений табака.

Трансфекцию осуществляли электропорацией. Варианты мутантных РНК3 перед заражением смешивали с транскриптами РНК1 и 2.

Зондом для детекции являлась меченая РНК, комплементарная 3’-концу всех 4 РНК CMV. Стрелками указаны положения полноразмерных РНК1-2, РНК3 и РНК4.

Комплементация 3а мутантов в растениях, экспрессирующих 3а белок При заражении нетрансгенных растений табака транскриптами РНК1, 2 и мутантной РНК3, только wt и мутант HpaI были способны накапливаться и вызывать типичные симптомы инфекции CMV. Когда заражали 3а-трансгенные растения, то все мутанты эффективно реплицировались и системно распространялись по растению. Все мутанты, кроме HpaI, вызывали только сильное просветление жилок, а не ярко выраженные симптомы, характерные для CMV;

HpaI вызывал симптомы, неотличимые от wt. Однако с помощью гибридизации было продемонстрировано, что мутанты накапливаются до сравнимых с wt уровней (Рис. 7). Через 2-3 недели после инокуляции из растений выделяли вирусы и их количество у мутантов также было сравнимо с количеством вируса дикого типа. Когда полученными вирусными препаратами инокулировали нетрансгенные растения, то инфекции не наблюдалось (кроме HpaI) (Рис. 5), что свидетельствует об отсутствии рекомбинации мутантного вируса с трансгеном.

Рис. 7. Накопление вирусных РНК мутантами CMV в трансгенных растенях табака, экспрессируюших транспортный белок CMV.

Детекцию проводили при помощи меченой РНК, комплементарной 3’-концу всех 4 РНК CMV Накопление мутантных вирусов до уровня дикого вируса было достаточно неожиданным,т.к. уровень 3а белка в трансгенных растениях ниже такового в заражённых растенияхи вызываемые дефектными мутантами симптомы заметно более мягкие, чем у wt. Для сравнения кинетики накопления мутантов с wt, был выбран мутант KpnI – накопление вирусных РНК сравнивали в инокулированных и системных листьях 2, 4 и 6 дней после заражения растений. Через 6 дней уровень накопления вирусных РНК как в инокулированных, так и в системных листьях был примерно одинаковым (Рис. 8). С другой стороны, на 2-ой и 4-ый день после инокуляции KpnI отставал от wt, что, возможно, связано с ограниченным количеством доступного трансгенного 3а белка.

Рис. 8 Сравнение скорости накопления вирусных РНК мутанта KpnI и wt CMV в трансгенных растениях через 2, 4 и 6 дней после заражения. sys – системные листья, inoc - инокулированные. Детекцию осуществляли меченой РНК, комплементарной 3’-концу всех РНК CMV Определение аминокислотных последовательностей 3а белка, необходимых для осуществления его функции вирусного транспорта Мутант KpnI, у которого отсутствуют аминокислоты 7-173, мог распространяться только в трансгенных растениях. У него отсутствовили 2/3 N концевого района 3а белка. Мутант Nhe-fs, содержащий сдвиг рамки после аминокислоты 175, обладал таким же фенотипом. Таким образом, треть С-концевого района 3а белка содержит важные последовательности. Мутант E-H содержал делецию 70 С-концевых аминокислот и тоже был неспособен реплицироваться и распространяться в нетрансгенных растениях. Однако мутант HpaI, у которого отсутствовали 43 С-концевых аминокислоты, сохранял способность заражать нетрансгенные растения и вызывать ярко выраженные симптомы. Анализ нуклеотидной последовательности вирусного потомства из растений подтвердил присутствие изначально внесённой делеции.

У мутанта AUG был удалён первый AUG-кодон, второй AUG-кодон (в той же рамке считывания) находится на позиции аминокислоты 35. И хотя такая РНК давала продукт в белоксинтезирующей системе, мутант был неспособен заражать нетрансгенные растения. Таким образом, первые 34 аминокислоты белка 3а содержат последовательность, необходимую для вирусного транспорта.

Мутант AUG-fs содержал вставку 4 нуклеотидов, приводящую к сдвигу рамки считывания после 4-ой аминокислоты. Мутант не заражал нетрансгенные растения, но в трансгенных растениях спустя 3 недели после заражения происходило изменение симптомов инфекции: на смену просветлению жилок приходили выраженные симптомы CMV (яркая мозаика и нарушение формы листа). Выделенный вирус был способен заражать нетрансгенные растения. Секвенирование гена 3а вирусного потомства выявило делецию одного из 4 нуклеотидов исходной инсерции, что приводило к восстановлению рамки считывания белка 3а с добавлением одной аминокислоты (Gln) после 4-ой. В нетрансгенных растениях такой вирус лишь незначительно отставал по времени появления симптомов от wt.

Комплементация транспорта гетерологичных вирусов в 3а-трансгенных растениях Мы также тестировали ряд вирусов в трансгенных растениях табака на предмет возможности комплементации их транспорта в табаке. Из всех использованных вирусов только BMV (вирус мозаики костра) и PSV (вирус задержки роста арахиса) приобретали способность к локальному распространению в инокулированном листе;

оба этих вируса относятся к тому же семейству Bromoviridae, что и сам CMV.

Образование делеций в дефектных РНК3 при пассаже в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген 3а CMV Дефектные интерферирующие (DI) РНК, оказывающие влияние на накопление вирусных геномных РНК, описаны для ряда вирусов растений (Simon and Bujarski, 1994;

Graves et al., 1996;

Simon and Nagi, 1996, White, 1996). Однако у членов семейства Bromoviridae были обнаружены дефектные (D) РНК, не интерферирующие с накоплением материнского вируса (Graves et al., 1996). В случае Fny штамма CMV были описаны две D-РНК, содержащие делеции в гене 3а с сохранением рамки считывания, накапливающиеся в присутствии wt РНК3 (Graves and Roossinck, 1995). В более ранних исследованиях такие РНК не обнаруживались (Roossinck and Palukaitis, 1990). Кроме того, никаких природных D-РНК у РНК1 и РНК2 не было описано (Hayes and Buck, 1990).

Принято считать, что D-РНК растительных вирусов образуются в результате рекомбинации, включающей смену матриц (Nagy and Simon, 1997). D-РНК CMV могут образовываться как в результате гомологичной, так и негомологичной рекомбинации (Graves et al., 1996). С целью дальнейшего изучения этой проблемы 3а мутанты РНК (Рис. 5) подвергали многократным пассажам в трансгенных растениях (Рис. 10 и 11).

Была изучена стабильность исходных вариантов РНК3, среди которых были как мутанты со сдвигом рамки, так и с сохранением рамки считывания гена 3а.

РНК3 wt состоит из 2216 нуклеотидов;

РНК мутантов Nhe-fs и [M]-Nhe-fs (M штамм CMV) содержали делецию 8 нуклеотидов, приводящую к сдвигу рамки считывания;

E-H содержал делецию в 202 нуклеотида;

KpnI делецию в нуклеотид и AUG – в 12 нуклеотидов. Эти РНК смешивали с транскриптами РНК1 и РНК2 и иинокулировали трансгенные растения табака. На протяжении 6 пассажей было обнаружено делетирование дополнительных последовательностей гена 3а, приводившее во всех случаях к восстановлению рамки считывания (Рис. 11).

1. Дефектные РНК3, образующиеся при пассаже мутанта Nhe-fs Исходная делеция мутанта Nhe-fs составляла 8 нуклеотидов и приводила к сдвигу рамки считывания, в результате трансляция белка терминировалась после аминокислоты 175 (из 279 у 3а белка wt). В результате одного пассажа в 3а трансгенных растениях (2 недели) мутантная РНК3 накапливалась в количествах, сравнимых с wt. Электрофоретическая подвижность обеих РНК3 не отличалась. Однако после 6 пассажей РНК3 мутанта, неотличимая по размеру от РНК wt, полностью исчезала и замещалась новой РНК, по размеру находящейся между РНК3 и РНК4. При анализе потомства РНК3 мутанта после 3 пассажей оказалось, что наряду с полноразмерной РНК3 (-8 нуклеотидов) появляется укороченный вариант (Рис. 10, 11).

Укороченная РНК3 после 3 пассажей была несколько больше по размеру, чем после 6.

Во всех случаях уровень накопления всех РНК CMV был практически одинаковым, что свидетельствовало об отсутствии интерференции новых вариантов РНК3 с репликацией или инкапсидированием РНК1, 2 и 4.

2. Рекомбинация дефектных РНК3 мутанта [M]-Nhe-fs в трансгенных растениях При пассажах мутантов с дефектными РНК3 в трансгенных растениях иногда наблюдалось резкое изменение симптомов: просветление жилок сменялось типичной для wt мозаикой (Рис. 9). Вирусное потомство из таких растений было способно заражать нетрансгенные растения. Для выявления возможной рекомбинации испоьзовали РНК3 мутанта М-штамма CMV, несущую ряд нуклеотидных замен по сравнению со штаммом Fny (источник трансгена). Из 1000 трансгенных растений, инокулированных мутантом [M]-Nhe-fs (Рис. 11), со временем 9 растений приобрели симптомы дикого типа штамма М. Определение нуклеотидной последовательности вирусного потомства (инкапсидируемых РНК) показало, что рекомбинация происходила в межцистронном районе РНК3 (IСR, Рис. 5) и во всех случаях была точной (без вставки или делеции нуклеотидов). Рекомбинантные РНК3 содержали ген 3а Fny и ген белка оболочки М-CMV. Следует отметить, что образующаяся в результате рекомбинации РНК3 полностью вытесняла исходную мутантную форму, т.е.

даже в трансгенных растениях она обладала селективным преимуществом.

А Б Рис. 9 Экспрессирующие ТБ CMV трансгенные растения, заражённые мутантом [M]-Nhe-fs. А – растение на ранней стадии проявления симптомов рекомбинантного вируса, на одном из верхних листьев видны две яркие точки;

Б – слева растение с типичными для мутантов, содержащих дефектные (D) РНК3, симптомами ;

справа растение, в котором произошла рекомбинация D-РНК3 с трансгеном 3. Дефектные РНК3, образующиеся при пассаже мутанта E-H Данный мутант содержал делецию 202 нуклеотидов, приводящую к сдвигу рамки считывания. Мы проводили 6 пассажей в трансгенных растениях табака, в каждом из которых спустя 2 недели после инокуляции все 4 РНК мутанта накапливались до уровней дикого типа CMV. Уровень накопления при первом и шестом пассаже практически не менялся. Однако при шестом пассаже уже не обнаруживалось РНК с делецией в 202 нуклеотида - она была полностью вытеснена новой D-РНК3, которая лишь незначительно превосходила по размеру субгеномную РНК4. Секвенирование РНК3 из преаратов вируса показало, что РНК3 была полностью заменена на один тип D-РНК3, содержащий делецию 943 нуклеотидов: делеция простирается на нуклеотиды 91-1033 или 92-1004 (Рис. 10, 11). Таким образом, делетированию подвергается не только кодирующая область гена 3а, но дополнительно 28 нуклеотидов 5’ нетранслируемой области (NTR) и 79 из интерцистронного района (IGR). Как и в случае ряда других D-РНК3, фланкирующие делецию районы содержат последовательности, состоящие из одного типа нуклеотидов Рис. 10. Образование делеций в дефектных РНК3.

А - после первого пассажа (2- недели), В – после 6 пассажей в растениях, экспрессирующих транспортный белок CMV. healthy – здоровое растение.

Треугольниками обозначены вновьобразованные РНК.

Детекцию проводили при помощи меченой РНК, комплементарной 3’-концу всех 4 РНК CMV 4. Дефектные РНК3, образующиеся при пассаже мутанта KpnI Мутант KpnI содержал делецию без сдвига рамки размером в 501 нуклеотид [нуклеотиды 137-637], исключающую аминокислоты 7-172 из 279 аминокислот белка 3а. Мутант подвергали серии из 6 пассажей так же, как и в случае других мутантов. И хотя не наблюдалось изменения в размере исходной РНК, секвенирование потомства из двух растений выявило наличие дополнительной делеции [нуклеотиды 656(9)-685(8)] (Рис. 11).

5. Полноценная РНК3, образующаяся при пассаже мутанта AUG AUG был способен заражать только трансгенные растения (Рис. 5). Однако спустя несколько недель слабые симптомы на трансгенных растениях сменялись на сильные, типичные для дикого типа, и потомство мутантного вируса приобретало способность заражать нетрансгенные растения. Определение нуклеотидной последовательности РНК3 в вирусных препаратах показало, что последовательность AUU в непосредственной близости перед 12-нуклеотидной делецией (включающей в себя инициаторный кодон AUG), мутировала в AUG. А так как этот новый AUG находился в рамке трансляции 3а, то образующийся белок являлся белком 3а, у которого только 2-ая и 3-ья аминокислоты отличались от wt: аланин был замещён фенилаланином, а серин – аргинином. Пассаж псевдоревертанта AUG в трансгенных растениях не приводил к изменению размера РНК3 и никакого образования делеций или прочих изменений не наблюдалось (Рис. 11). Потомство псевдоревертанта сохраняло способность заражать нетрансгенные растения и вызывать симптомы, неотличимые от вируса дикого типа. Таким образом, вариант РНК3, кодирующей функциональный транспортный белок, не подвергается делеции в трансгенных растениях, где транспортная функция комплементируется продуктом трансгена, т.е.

даже в условиях комплементации вирус, кодирующий полноценный 3а белок, имеет селективное преимущество по сравнению с мутантом, чей транспорт комплементируется in trans.

Рис. 11. Сравнение делеций мутантов РНК3 CMV до и после пассажей в трансгенных растениях табака, экспрессирующих транспортный белок (3а) CMV. Некодирующие участки закрашены. NTR – 5’–нетранслируемый район, IGR - интерцистронный район между генами 3а и структурного белка. Цифры указывают границы делеций.

Последние две РНК (D-RNA 3 and 3, ) иногда образуются в нетрансгенных растениях, но существуют только в присутствии полноценной РНК3.

* -новый AUG кодон, формируемый в РНК3 мутанта AUG при пассажах в трансгенных растениях Образование делеций в РНК3 при пассаже в нетрансгенных растениях табака и инкапсидирование таких РНК Ранее были описаны две D-РНК3, обнаруженные в нетрансгенных растниях табака (Graves and Roossinck, 1995;

см. «Образование делеций в дефектных РНК3 при пассаже в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген 3а CMV» и Рис. 11).

Нами были обнаружены и охарактеризованы ещё две похожих D-РНК3 из нетрансгенных растений:

D-RNA 3-1 штамма Fny [делеция нуклеотидов 296(7)-634(5)] и [M] D-RNA 3-2 штамма М [делеция 303-713]. Обе этих D-РНК3 возникали и сохранялись в присутствии wt РНК3 при пассировании в растениях табака, но исчезали при заражении растений кабачка: следы таких D-РНК3 можно было обнаружить только в инокулированных семядолях кабачка и только с помощью особовысокочувствительного метода RT-PCR.

В верхних, системных, листьях кабачка D-РНК3 не детектировались. Вирусные частицы, выделенные из заражённых семядолей, не содержали D-РНК3.

Рис. 12. Анализ методом RT-PCR репликации и инкапсидирования D-РНК3-1 в семядолях (c) или в системных листьях (l) растениий кабачка (squash), и в системных листьях табака.

(а) из заражённых препаратами CMV с D-РНК3-1 (+) или без (-) растений через 2 недели выделяли вирус, а затем из вируса выделяли РНК;

(b) тотальную РНК из растений выделяли через неделю после инокуляции;

Продукты RT-PCR анализировали электрофорезом в агарозном геле.

М – маркёры размера (1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600 и нуклеотидных пар) Таким образом, отсутствие D-РНК3 в листьях кабачка, системно заражённых CMV, обусловлно отсутствием инкапсидирования D-РНК3 в данном растении-хозяине, что приводит к неспособности дефектной РНК3 системно распространяться.

Определение последовательностей транспортного белка CMV, влияющих на накопление и ситемную инфекцию вируса в растениях табака Считается, что белок 3а CMV не имеет никаких функций кроме обеспечения вирусного транспорта в процессе инфекции (Suzuki et al., 1991). В связи с этим маловероятно, что мутации в этом белке могут иметь плейотропное действие на другие вирусные функции. Тем не менее, некоторые различия в аминокислотной последовательности транспортного белка могут по-разному проявляться в разных растениях-хозяевах (Zhang and Palukaitis, 1993), свидетельствуя о том, что взаимодействие между 3а белком и данным видом растения может зависеть от изменения всего нескольких аминокислот 3а белка. Подобные наблюдения были сделаны и для 3а транспортного белка бромовирусов (De Jong et al., 1995;

Fujita et al., 1996).

Мы обнаружили, что в системно заражённых (неинокулировынных) листьях табака многие штаммы CMV, включая Fny, не накапливаются равномерно, а проявляют некую цикличность: т.е. листья с высоким содержанием вируса и яркими симптомами перемежаются с бессимптомными листьями с низким вирусным титром.

В противоположность этому штамм Sny не проявляет цикличности симптомов и имеет менее выраженные различия в накоплении вируса в разных листьях. Таким образом, штамм Sny более равномерно распределён в заражённых растениях табака, чем Fny;

кроме того, растения в случае Sny содержали более высокий уровень ТБ 3а – что наблюдалось также в протопластах кабачка, и было менее ярко выражено в табачных протпластах. Исследованные нами штаммы также различались по способности системно распространяться в растениях кабачка (Roossinck and Palukaitis, 1990):

инфекция Sny ограничивалась инокулированными семядолями, но не проникала в листья. Повышенный уровень продукции 3а белка Sny не обеспечивает системного распространения Sny;

и табаке 3а белок Sny накапливался в больших количествах чем 3а Fny, но это также не сказывалось на скорости распространения системной инфекции.

Мы определяли отличия ТБ двух штаммов, определяющие повышенную продукцию ТБ Sny по сравнению с Fny в табаке и более равномерное накопление Sny в листьях разных уровней этого растения-хозяина, а также приводили к неспособности Sny заражать кабачки системно.

Поскольку транспортный белок CMV транслируется с РНК3, было логично предположить, что РНК3, содержит последовательности, отвечающие за различия в накоплении 3а белков двух штаммов. Заражение растений табака транскриптами РНК и 2 штамма Fny вместе с транскриптом РНК3 штамма Sny вызывало сильные симптомы (нарушение формы листьев и подавление роста растений). Уровень вирусспецифических РНК в случае Fny был сходным с псевдорекомбинантом FFS. Тем не менее, иммуноблот-анализом детектировалось в 25 раз больше 3а белка в случае инокуляции псевдорекомбинантом, хотя уровнь накопления СР практически не отличался. Таким образом, РНК3 Sny в составе псевдорекомбинанта FFS обуславливала фенотип, отвечающий за гиперпродукцию 3а белка в табаке. Для определения последовательностей РНК3 Sny, ответственных за высокий уровень 3а белка, нами был сконструирован ряд химерных Sny/Fny РНК3 (в том числе F/S и S/F, котроые содержали ТБ и СР разных штаммов). Анализ этой пары химер показал, что ярко выраженные симптомы, вызываемые ими на табаке, не являются следствием изменения уровня накопления самого белка 3а, а, скорее, обусловлены различиями последовательностей генов белков оболочки двух штаммов или граничащих с ними последовательностями. Эксперименты по инфекционности подтвердили предположение, что высокий уровень продукции 3а белка может быть картирован на 5’- половине РНК3, а степень выраженности симптомов инфекции определяется 100 N концевыми аминокислотами СР. Повышенное накопление 3а белка определялось районом 1294 5’-концевых нуклеотидов РНК3 Sny, содержащим ген 3а и граничащие с ним нетранслируемые последовательности.

Последовательности транспортного белка CMV, контролирующие системную инфекцию в растениях кабачка Псевдорекомбинант FFS, содержащий РНК3 штамма Sny, как и сам штамм Sny, эффективно заражал растения табака системно, но не давал системной инфекции в кабачках: на инокулированных семядолях образовывались некрозы, вирус в них накапливался на уровне Fny, но верхние листья не проявляли симптомов и не обнаруживали присутствия ни вирусных РНК, ни белков (Рис. 13). Это означает, что не распространение инфекции за пределы инокулированных семядолей кабачка происходит не из-за неспособности FFS реплицироваться в них. Это также свидетельствует, что происходит распространение псевдорекомбинанта от клетки к клетке в пределах семядолей.

Следующим этапом исследования было выяснение того, определяется ли ограничение накопления Sny только в семядолях различиями в последовательностях транспортного или структурного белка двух штаммов.

Рис. 13. Накопление РНК, транспортного и структурного белков в растениях кабачка, зараженных 3 вирусами, содержащими три варианта РНК3 CMV. Определение проводили через 7 дней после заражения в семядолях (c) или в системных листьях (l).

А – детекция вирус специфических РНК при помощи меченой РНК, комплементарной 3’-концу всех 4 РНК CMV.

В – детекция транспортного (3а) и структурного (СР) белков методом иммуно блота с исполь-зованием соответствующих антисывороток. Треуголь никами указано положение соответствующего белка Использование химерных РНК3 (F/S и S/F) показало, что ограничение транспорта не определяется различиями в генах СР, а, по-видимому, определяется геном 3а Sny. Ранее в экспериментах по изучению поведения этих штаммов в табаке нами были обнаружены три отличия в аминокислотных последовательностях 3а белка (аминокислоты 51, 170 и 240): гиперпродукцию 3а и цикличность симптомов инфекции в листьях растений определяли аминокислоты 51 и 240. В кабачке ни аминокислоты 51, 240, ни комбинации 51/170, 170/240 по отдельности не определяли способность к системному распространению. Это позволило предположить, что либо сочетание 51/240, либо наличие всех трёх аминокислот Sny (51/170/240) блокирует дальний транспорт в кабачке. Замена всех трёх аминокислот 3а белка Sny в химере S/F на аминокислоты Fny приводит к появлению способности такого вируса распространяться в кабачке, что подтверждает ранее сделанное предположение об отсутствии влияния нетранслируемыех последовательностей РНК3 и структурного белка Sny CMV на системную инфекцию в этом хозяине.

Для окончательной локализации критических аминокислот использовали двойной мутант, содержавший аминокислоты штамма Sny Lys51 и Phe240. Такой мутант был способен системно заражать растения табака, но не распространялся по растению за пределы инокулированных семядолей кабачка, что сидетельствует о совместном влиянии аминокислот 51 и 240 на взаимодействия вируса с растением хозяином, приводящие к ограничению системного транспорта CMV в кабачке.

Затем мы исследовали влияние замен в аминокислотной последовательности белка 3а на скорость распространения инфекции в семядолях кабачка (локальный транспорт, от клетки к клетке). Количество вирусных РНК через 7 дней после инокуляции было примерно одинаковым (Рис. 12 А), было важно оценить скорость распространения штаммов и мутантов в пределах семядолей. Для этого делали отпечатки семядолей на нитроцеллюлозу после удаления нижнего эпидермиса.

Рис.14. Анализ распространения CMV и ряда его мутантов в семя долях кабачка (отпечатки на нитроцеллюлозе после удаления нижнего эпи дермиса) 5 (А) и (В, С) дней после инокуляции.

Healthy – неино кулированная семядоля.

Присутствие вируса детекти ровали меченой РНК, компле ментарной 3’ концу всех 4 РНК CMV (А и В).

Та же самая мембрана В была впоследствии использована для детекции СР методом иммуноблота – С Те вирусы, которые не заражали кабачок системно, были на 5-ый день в значительной степени ограничены размерами некрозов, вызываемых на семядолях. На 9-ый день мутант F51/240 существенно накапливался и распространялся в семядолях, тем не менее не вызывая системной инфекции в растении (Рис. 14, В и С). Накопление вирусных РНК мутанта коррелировало с накоплением СР, однако вирусные РНК и белки не обнаруживались в основных сосудах семядолей (в отличие от Fny).

Влияние продукта РНК1 (белка 1а) на кинетику накопления CMV в растениях кабачка Детерминанты, определяющие круг растений-хозяев, были ранее картированы на РНК2 и РНК3, тогда как быстрое проявление симптомов вирусной инфекции в растениях кабачков связывали с РНК1 (Palukaitis et al., 1992). Оба вышеназванных фенотипа сильно зависят от сорта растения и могут отражать какие-то высоко специфические взаимодействия между вирусом и растением-хозяином.

Мы сравнивали скорость накопления вирусных РНК двух штаммов (Fny и Sny) в семядолях: у штамма Fny оно происходило значительно быстрее, однако к 6 дню уровень выравнивался. В то же время в изолированных протопластах кабачков РНК и белки обоих штаммов накапливались с одинаковой скоростью. В дальнейшем для исключения влияния продуктов РНК2 и 3 на скорость распространения по растению, нами вместо Sny был использован псевдорекомбинантный вирус, содержавший РНК штамма Sny и РНК2 и 3 Fny (SFF).

Для изучения различий в репликации и распространении двух штаммов в семядолях кабачков применялся метод отпечатков: у заражённых семядолей удаляли нижний эпидермис, а затем делали отпечатки на нитроцеллюлозу. Вирусные РНК детектировали гибридизацией, а СР (белок оболочки) методом иммуноблота. Хотя количество сайтов инфекции у Fny и Sny было примерно равным, размер поражённых Fny участков увеличивался намного быстрее. Это касалось и вирусных РНК, и СР.

Таким образом, не только РНК2 и 3, но и РНК1 (и продуцируемый ею белок 1а) оказывает влияние на скорость распространения CMV в растениях.

Для распространения CMV из клетки в клетку нужен белок оболочки (СР), но не вирионы У бромовируса хлоротической крапчатости коровьего горошка (CCMV), достаточно близкого к CMV, 25 N-концевых аминокислот СР находятся на внутренней et al., поверхности сферической вирусной частицы (Speir 1995), что, предположительно, верно и для CMV;

эти аминокислоты в силу их расположения могут либо взаимодействовать с вирусными РНК и способствовать сборке вирусных частиц, либо участвовать в межсубъединичных белок-белковых взаимодействиях и способствовать стабилизации вирионов (Wikoff et al., 1997). Кроме того, известно, что аминокислоты 29-33 СР CCMV и гомологичные им аминокислоты 38-42 CMV играют ключевую роль в формировании и стабильности вирионов (Speir et al., 1995;

Wikoff et al., 1997). Для выяснения роли N-концевых аминокислот структурного белка в связывании РНК и формировании вирионов нами были получены два делеционных мутанта с сохранением рамки считывания: с делецией аминокислот 15-40 (Sal-Nru) или 26-40 (Sac-Nru). Кластер основных аминокислот вблизи N-конца СР расположен между аминокислотами 11 и 22, таким образом 5 из 9 аминокислот этого кластера были удалены у мутанта Sal-Nru, но оставались у Sac-Nru. В растениях N. clevelendii и N.

benthamiana оба мутанта вызывали ситемную инфекцию;

wt CMV и Sac-Nru вызывали схоже симптомы, а инфекция Sal-Nru развивалась более медленно и симптомы были менее выражены. После множественных пассажей в табаке мутант Sal-Nru приобретал способность системно заражать растения табака. Секвенирование такого потомства, обозначенного как Sal-Nru*, подтвердило наличие исходной делиции аминокислот 15-40 и не обнаружило мутаций вблизи границ делеции. Тем не менее, в удалённых районах СР было обнаружено три аминокислотных замены: Asp-81 ( GAC) был заменён на Glu (GAA ), Leu-166 (CUG ) на Val (GUG) и Met-173 (AUG ) на Arg (AGG ). Никаких других, кроме перечисленных, нуклеотидных замен не наблюдалось.

В растениях лебеды Chenopodium quinoa wt CMV вызывал некрозы, но не вызывал системной инфекции. Sac-Nru также вызывал образование некрозов, но более мелких;

Sac-Nru вызывал только очень мелкие хлоротические точки. Sal-Nru* вызывал некрозы, по размеру промежуточные между Sal-Nru и Sac-Nru.

В растениях табака штамм Fny CMV вызывет системную мозаику наряду с подавлением роста растений и деформацией листовой пластинки, без каких-либо симптомов на инокулированном листе. Sac-Nru также вызывал сильновыраженные симптомы, хотя и отличные от wt CMV, и появлявшиеся на 2-3 дня позднее. Sal-Nru вызывал хлоротические круги на инокулированных листьях, но не вызывал системной инфекции. Sal-Nru* не вызывал симптомов на инокулировынных листьях, но вызывал симптомы на верхних, неинокулированных листьях (хотя эти симптомы и отличались от таковых wt CMV или Sac-Nru), т.е. этот мутант вновь приобретал способность системно заражать табак.

В кабачке wt CMV иногда вызывал некрозы на инокулированных семядолях, сильное замедление роста и ярковыраженную мозаику на листьях.. Sac-Nru также вызывал системную мозаику, хотя и с некоторым запозданием;

подавление роста растения было менее выраженным. Симптомы на семядолях выражались в образовании крупных хлоротических участков, которые позднее некротизировались. Sal-Nru* вызывал только точечные некрозы на семядолях, Sal-Nru не вызывал никаких. Ни Sal-Nru*, ни Sal-Nru не не заражали растения кабачка системно. Таким образом, различные мутации СР CMV по-разному влияют на системное распространение вируса в растениях N. clevelendii (и N. benthamiana) по сравнению с табаком и кабачком.

Структура вирионов делеционных мутантов по СР После ультрацентрифугирования экстрактов из растений N. benthamiana, заражённых wt CMV и делеционными мутантами по СР, методом иммуноэлектронной микроскопии были обнаружены вирусные частицы. Типичные вирионы были обнаружены у wt CMV и Sac-Nru. Вирусных частиц не наблюдалось в случае Sal Nru. В растениях, заражённых Sal-Nru*, наблюдались два типа вирусоподобных частиц, отличавшихся по размеру от частиц wt CMV. Таким образом, делеция 15 N концевых аминокислот допускает формирование вирусных частиц, тогда как делеция 26 аминокислот нарушает сборку вирионов. В то же время, аминокислотные замены в Sal-Nru* по сравнению с Sal-Nru позволяют частично восстановить функцию сборки вирионов (но - двух типов). Вирусоподобные частицы, выделенные из растений N.

benthamiana, анализировали методом электрофореза в агарозном геле, при котором разделение происходит в зависимости от поверхностного заряда и гидродинамического объёма частиц, а не от их плотности: результат коррелировал с данными электронной микроскопии.

Выделение РНК из препаратов частиц Sac-Nru и Sal-Nru* почти всегда давало отрицательные результаты. Лишь в одном из четырёх экспериментов удалось выделить вирусные РНК из препаратов вирионов Sac-Nru. Скорее всего, и мутант Sal-Nru* формирует нестабильные вирусные частицы, в составе которых РНК не защищена, а Sal-Nru пристутствует в клетке в какой-то форме комплекса РНК:белок, отличной от вирионов. Кинетика накопления wt CMV и трёх мутантов разнилась, при этом количество РНК коррелировало с количеством СР: wt CMV и Sal-Nru* имели высокий уровень, тогда как в случае Sac-Nru и Sal-Nru количество вирусных РНК (особенно – РНК1 и РНК2) и структурного белка заметно снижалось через месяц после заражения растений.

В экспериментах in vitro исследовали способность структурных белков мутантов связываться с РНК3. В предварительных экспериментах определяли количество белка специфической к СР сывороткой, затем выравнивали его количество в наносимых образцах и, после электрофореза в полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозу;

мембраны обрабатывали меченой РНК3. Способность мутанта Sac Nru связываться с вирусной РНК была несколько ниже, чем у wt CMV, тогда как белки Sal-Nru и Sal-Nru* в присутствии 0,3М NaCl не формировали стабильных комплексов с РНК (Рис. 15).

Рис. 15. Связывание in vitro РНК3 CMV с капсидным белком дикого типа и белками ряда мутантов. Тотальный белок из экстрактов заражённых растений фракционировали в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозу. Детекцию осуществляли либо антисывороткой к белку (А), либо радиоактивно меченной РНК3 (В, С) – в этом случае мембрану перед радиоавтографией трижды промывали 0,3М NaCl. Мембраны В и С из двух независимых экспериментов. Треугольник указывает положение 29-kDa маркёра. Правая дорожка – здоровое растение.

Причиной медленного распространения по растению мутанта Sal-Nru в тех растениях, в которых он всё же способен распространяться за пределы инокулированного листа, может быть его распространение от клетки к клетке по растению, а не замедленниеый дальнего транспорта через флоэму – тпкое распространение обычно приводит к гораздо более быстрой системной инфекции.

Вирус скручивания листьев картофеля (PLRV) Представители семейства Luteoviridae формируют вирионы с икосаэдрическим типом симметрии, содержащие плюс-РНК размером около 6-kb. Их распространение ограничено клетками флоэмы – проводящей ткани растения, обеспечивающей транспорт ассимилятов. Передача вируса от одного растения к другому осуществляется тлями и не может быть достигнута механическим инфицированем ни соком заражённого растения, ни очищенным вирусным препаратом. Хотя PLRV и сохраняет инфекционность в организме тлей довольно продолжительное время, в тлях он не реплицируется (Gray and Gildow, 2003).

Преодоление флоэмного ограничения инфекции PLRV Известно, что флоэмно-ограниченные вирусы способны эффективно реплицироваться в протопластах, изолированных из мезофилла листьев растений (Kubo and Takanami, 1979;

Mayo et al., 1982), и, вероятно, в клетках эпидермиса, первично инфицированных при механической инокуляции, хотя в соседних клетках они не обнаруживаются (Kubo, 1981). Можно было предположить, что отсутствие флоэмно ограниченных вирусов в тканях мезофилла и эпидермиса листа обусловлено блокированием транспортной функции, обеспечивающей перенос вирусного материала из флоэмы в ткани паренхимы. В таком случае при определённой комбинации вирусов, один из которых способен преодолевать барьер между флоэмой и паренхимой, зависимый вирус в условиях смешанной инфекции также сможет преодолеть этот барьер, используя транспортную функцию вируса-помощника.

Для выснения возможности комплементации транспортной функции PLRV и приобретения им способности системно распространяться в клетках мезофилла листьев растений дурмана (Datura stramonium), предварительно заражённых потэксвирусом PVX или тобамовирусом TMV, такие растения заражали PLRV. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствуют о резком повышении накопления PLRV в листьях смешанно инфицированных растениях – более чем в 16 раз. Для подтверждения возможности распространения PLRV при совместной инфекции с PVX в паренхиме, из заражённых растений изолировали протопласты: в них было обнаружено присутствие антигена PLRV. Аналогичные результаты были получены и при заражении D. stramonium, предварительно инфицированных TMV при повышенной температуре (32°С, т.е. в условиях, когда TMV системно распространяется в этом растении), а также в растениях Physalis floridana, предзаражённых PVX.

Влияние различных последовательностей структурного белка (СР) PLRV на сборку и стабильность вирионов, на способность вируса распространяться по растению и передаваться тлями Вирионы представителей семейства Luteoviridae состоят из двух структурных белков: основного СР (22-24-kDa), кодируемого ORF3, и минорного белка, образующегося в результате иногда происходящей супрессии терминирующего кодона гена СР. Этот белок, обозначаемый RTP (readthrough protein, ORF3+ORF5, CP+RTD, Рис. 16), также входит в состав вирусных частиц, хотя его количество в вирионе, состоящем из 180 субъедениц СР, до сих пор не определено. Вирионы могут образовываться и в отсутствии RTP, но они обладают пониженной эффективностью распространения по растению и не переносятся тлями (Reinbold et al., 2001).

ORF4, перекрывающаяся в другой рамке с геном белка оболочки, кодирует 17 kDa ТБ PLRV, чья роль в распространении вируса была продемонстрирована в ряде растений-хозяев (Lee et al., 2002).

Использование специально сконструированного на основе PLRV вектора позволило с высокой эффективностью получать различные мутанты при гомологичной рекомбинации в дрожжах. Таким образом был получен ряд мутантов, в том числе – RT, содержавший делецию, исключавшую трансляцию домена RT, но по-прежнему продуцирующий полноценный белок оболочки.

Рис. 16. Организация генома PLRV и описание СР мутантов в двух кислотных доменах. Аминокислотные замены подчёркнуты. Жирным выделены консервативные для лютеовирусов аминокислоты, курсивом – кислые. Указаны номера заменённых аминокислот, а также названия мутантов. Строчные буквы в названии мутантов соответствуют заменённым аминокислотам Остальные мутации были локализлвывались в самом СР (Рис. 16). На основании известных структур вирионов и структурных белков РНК-содержащих вирусов с икосаэдрической симметрией, СР может быть разделён на N-концевой аргинин богатый домен и поверхностный домен, содержащий остальную часть молекулы белка (Dolja and Koonin, 1991). Обычно заряженный аргинин-богатый домен вовлечён во взаимодействие с РНК. Хотя последовательности в составе поверхностного домена белков небольших икосаэдрических вирусов растений заметно отличаются, вторичная и третичная структура этих участков консервативна. У двух представителей рода Palerovirus, которому относится PLRV, из семейства лютеовирусов выявлены консервативные районы в поверхностном домене белка оболочки (Mayo and Ziegler Graff, 1996), и на этом основании были построены несколько моделей структуры вирионов (Brault et al., 2003, Terradot et al., 2001).

Первоначально мы подвергали мутационному анализу были два «кислых»

домена СР, локализованных в центральной и С-концевой частяхразделённых аминокислотами, и, предположительно, вовлечённых в белок-белковые взаимодействия на поверхности вирионов (Рис. 15). 11 точечных мутантов с помощью агроинокуляции тестировали на способность накапливаться в агроинфильтрированных тканях растений, формировать вирусные частицы, системно распространяться по растениям и переноситься тлями. За единственным исключением все, представлявшие интерес, аминокислоты были заменены на аланин. Замена любой из 3 аминокислот EWH (170 172) или D177 нарушала способность СР формировать стабильные вирионы и способность системно распространяться в 4 использованных растениях-хозяевах.

Аланиновые замены кислых аминокислот E109, D173 и E176 отрицательно сказывались на накоплении вируса в агроинфильтрированных тканях, эффективности системного распространения по растениям, эффективности переноса тлями, но не оказывали влияния на стабильность вирионов. В качестве дополнительных контролей использовались вышеописанный мутант RT и СРRD: последний продуцировал только полноразмерный RTP, но не 22-kDa СР, и не образовывал вирионов.

N. benthamiana Инфильтрация листьев агробактериями, содержащими инфекционные кДНК клоны различных мутантов PLRV, приводила к практически синхронной инфекции всех клеток и позволяла оценить уровень репликации РНК и трансляции структурных вирусных белков. СР и RTP выявляли Вестерн блот анализом в грубых экстрактах, т.к. при агроинфильтрации, в отличии от системно заражённых растений, инфекция не ограничена исключительно клетками флоэмы и титр вируса высокий. Нозерн гибридизацией с использованием рибопробы, комплементарной 3’ концевому участку, общему для всех РНК PLRV, была продемонстрирована способность всех мутантов реплицироваться. Уровень накопления РНК мутантов не отличался от такогого у wt. Для определения способности мутантов формировать вирионы использовали два подхода: РНКазо-чувствительность вирусного потомства в заражённых тканях, и способность формировать вирионы. Анализ РНКаза чувствительности показал, что ряд мутаций приводил к полной потере способности формировать вирионы или к формированию нестабильных вирусных частиц (Рис. 16).

Особенно ярко это проявилялось при аланиновых заменах E170 (мутант VeW), W (мутант EwH), H172 (мутант WhD) и D177 (мутант EdQ). Кроме того, двойная замена E176 и D177 (Sed) и замена всех 4 аминокислот во втором домене (CPall) приводила к пониженной протекции РНК. Способность формировать вирионы определяли методом иммуноферментного анализа. Только вирионы PLRV, а не свободный СР, определяются этим методом при использовании коммерческих тест-наборов фирмы Agdia (США), содержащих поликлональные антитела.

СРRD служил негативным контролем при определении РНКазо чувствительности, т.к. не образовывал вирионов и его РНК не была защищена от действия РНКаз;

RT и wt служили положительными контролями, т.к. оба формировали стабильные вирусные частицы. Защищённость вирусных РНК у мутантов V169 (GvE), E109 (HeY), D173 (HdS), S174+S175 (DssE), E176 (SeD) была сравнима с таковой у дикого типа. Однако, данный способ определения - чувствительности к РНКазе является скорее качественным, чем количественным. Данные иммуноферментного анализа подтвердили формирование вирионов вышеперечисленными мутантами. Неожиданным результатом стало инкапсидирование субгеномной РНК структурного белка, но это может быть объяснено очень высокой концентрацией вирусных белка и РНК в агроинфильтрированных растительных тканях.

Хотя уровень трансляции СР у всех мутантов был примерно одинаковым, трансляция или стабильность RTP либо была понижена, либо вообще отсутствовала у тех мутантов, которые являлсь дефектными по функции сборки вирионов. Замена на аланин E176 (SeD) не сказалась на накоплении RTP, тогда как замена D177 (мутант EdQ) подавляла продукцию RTP;

двойная замена E176 и D177 (Sed) частично восстанавливала продукцию RTP. В отсутствии RTР иногда наблюдалась продукция белка с молекулярной массой примерно 40 kDa. Этот белок выявляется при помощи антител к структурному белку, то есть он либо является продуктом преждевременной терминации синтеза RTP, либо димером СР (Рис. 16).

Рис. 17 Структурные белки и РНК ряда мутантов PLRV, накапливающиеся в растениях N. benthamiana. (a) иммуноблот-анализ экстрактов агроинфильтрированных растений. Для детекции использовались моноклональные антитела к СР. Mock – лист растения N. benthamiana, инфильтрированный не несущей вирусного генома агробактерией. Отмечено положение основных белков, выявляемых антителами.

(b,c) - RT-PCR анализ вирусной РНК после инкубации с эндогенными РНКазами (b) или без инкубации (с). Был амплифицирован ген СР и часть RT.

Кроме перечисленных мутантов были получены ещё 12 с точечными мутациями в различных областях СР (Рис. 17). Девять из них не формировали вирионов и не заражали системно 4 вида растений. Из четырёх, формировавших вирионы и системно распространявшихся, у 2 эффективность переноса тлями оказалась пониженной.

Мутации, интерферировавшие с образованием вирионов, находились в области предполагаемого взаимодействия белковых субъединиц в составе вириона.

Мы осуществляли выделение вирусных препаратов ряда мутантов из агроинфильтрированных листьев N. benthamiana. Оказалось, что мутанты, не способные распространяться системно (но накапливающие количества СР, сравнимые с wt, при агроинфильтрации, Рис. 17), не способны формировать стабильные вирусные частицы. Это видно и из результатов центрифугирования в градиенте сахарозы в процессе очистки (Рис. 18а), и из электронномикроскопического анализа фракций, соответствующих содержащим стабильные вирионы фракциям (Рис. 18b).

Рис. 18.

(a) Спектры УФ поглощеня препа ратов дикого типа (wt) и трёх мутантов PLRV после центрифуги рования в градиенте концентрации са харозы (10-40%), стрелками указано ожидаемое поло жение вируссодер жащего пика;

(b) электронные микрофотографии соответствующих фракций Таким образом, в результате описанных выше экспериментов установлено, что образование стабильных вирионов во всех случаях необходимо для системной инфекции PLRV. Для переноса вируса тлями также был необходим белок RT: мутант RT формировал высокостабильные вирионы (Рис. 17b и 18 a,b), но не переносился от растения к растению тлями (единственный источник распространения данного вируса в природе).

Выводы 1. Установлено, что причиной образования дефектных частиц у температурочувствительного (ts) мутанта вируса табачной мозаики (TMV) Ni является инициация сборки вируса одновременно в двух участках – нормальным сайте инициации Оа и криптическом сайте (вероятно SERF), активным только при непермиссивной температуре.

2. Продемонстрирована возможность копмплементации транспортной функции двух ts мутантов TMV Ni2519 и LS1 другими вирусами. Установлено, что комплементация может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений.

3. Показано, что трансгенные растения, экспрессирующие нефункциональные вирусные транспортные белки, могут блокировать распространение как близкородственных, так и отдалённых вирусов.

4. Определены особенности механизмов распространения вируса огуречной мозаики (CMV) в различных растенях-хозяевах. В частности, продемонстрирована комплементация функции транспорта различных мутантов траспортного белка CMV (3а) в трансгенных растениях, продуцирующих транспортный белок, и формирование делеционных мутантов в таких растениях.

5. Обнаружено, что растения, трансгенные по траспортному белку CMV, способны комплементировать межклеточный транспорт таких вирусов как вирус мозаики костра (BMV) и вирус задержки роста арахиса (PSV).

6. Доказано, что для распространения CMV из клетки в клетку нужен белок оболочки (СР), но не цельные вирионы.

7. Установлено, что в присутствии вируса-помощника флоэмно-ограниченный вирус скручивания листьев картофеля (PLRV) приобретает способность распространяться из проводящих тканей растений в клетки мезофилла и репродуцироваться в них;

8. Изучено влияние мутаций в различных участках структурного белка PLRV на сборку и стабильность вирионов, а также на способность вируса распространяться по растению и передаваться тлями.