Особенности метаболизма и структурно- функционального состояния эндотелия при геморрагической лихорадке с почечным синдромом
На правах рукописи
Байгильдина Асия Ахметовна
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА И СТРУКТУРНО-
ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЭНДОТЕЛИЯ
ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ
С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Челябинск - 2013
2
Работа выполнена на кафедре биохимии государственного бюджетного образова тельного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский гос ударственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Россий ской Федерации
Научный консультант: Камилов Феликс Хусаинович доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты: Терентьев Александр Александрович член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, заведующий кафедрой биохимии Высокогорский Валерий Евгеньевич доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Омская ГМА Минздрава России, профессор кафедры биохимии Бутолин Евгений Германович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Ижевская ГМА Минздрава России, заведующий кафедрой биохимии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образова тельное учреждение высшего профессионального образования «Российский уни верситет дружбы народов».
Защита состоится 25 июня 2013 года в 16.00 часов на заседании диссертацион ного совета Д 208.117.02 при государственном бюджетном образовательном учре ждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государ ственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджет ного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Че лябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохране ния Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д. 64.
Автореферат разослан «_» 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Тишевская Наталья Викторовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Природные очаги геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) расположены во многих странах мира (Слонова Р.А.
и соавт, 2006;
Ткаченко Е.А. и соавт., 2012;
Heyman P. et al., 2011, Vaheri A. et al., 2013). На территории России ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозов и первое – среди природно-очаговых инфекций: в настоящее время заболеваемость регистрируется в 74 из 89 административных регионов РФ и имеет тенденцию к дальнейшему распространению. По уровню заболеваемости лидирует Приволж ский Федеральный округ, и в течение многих лет самые высокие показатели реги стрируются в Республике Башкортостан, территория которой является одним из самых активных на Земле очагов ГЛПС, и составляет 40-60% заболеваемости по ГЛПС РФ (Онищенко Г.Г. и соавт., 2006).
Актуальность изучения патогенеза ГЛПС определяется появлением новых и активностью уже существующих очагов, отсутствием тенденции к снижению за болеваемости и периодически регистрируемыми вспышками. Немаловажен высо кий социально-экономический ущерб, наносимый этим заболеванием вследствие развития тяжелых осложнений, длительной потери трудоспособности реконвалес центов, заболеваемости среди лиц преимущественно трудоспособного возраста и высокой стоимости госпитального лечения.
Хантавирус - возбудитель ГЛПС обладает высоким тропизмом к эндотелию.
Повторяющиеся циклы его репликации в эндотелиоцитах сопровождаются их по вреждением с последующим развитием геморрагического синдрома, инфекцион но-токсического шока и острой почечной недостаточности как ведущих причин неблагоприятного исхода болезни (Загидуллин И.М., 2001;
Сиротин Б.З., 2005).
Различают несколько вариантов дисфункции эндотелия - вазомоторную, ге мостатическую, адгезионную, ангиогенную, и в конкретной клинической ситуации они чаще всего сочетаются. В связи с этим в крови больных может изменяться со держание одновременно нескольких субстанций эндотелиоцитарного происхож дения (Петрищев Н.Н. и соавт., 2007).
В литературе имеются сведения об изменении продукции некоторых соеди нений эндотелиального происхождения при ГЛПС – NO (Галиева А.Т., 2004;
Linderholm M. et al., 1996);
растворимой формы молекулы адгезии сосудистого эн дотелия (sVCAM-1), sICAM-2 и sICAM-1 (Qi B.T. et al., 2006;
Han Q., 2010), эндо телина-1 (ЭТ-1) (Yang B. et al., 1995), фактора Виллебранда (фВ) (Давидович И.М., 1996), простациклина (Мирсаева Г.Х. и соавт., 2000). Однако к настоящему време ни литературные данные об особенностях метаболического ответа сосудистой ин тимы как органа-мишени для хантавируса носят фрагментарный характер. Отсут ствует обобщенная биохимическая картина изменений метаболической активности эндотелия при ГЛПС, которая охватывает показатели разных функциональных си стем сосудистой интимы - вазорегуляции, адгезивности, гемостаза, ангиогенеза.
Не изучены характер взаимодействия соединений эндотелиоцитарного происхож дения друг с другом и влияние на их содержание в крови модуляторов синтеза в общей системе адаптации организма индивида к действию хантавируса. Не опре делена роль сдвигов метаболической активности эндотелия в развитии угрожаю щих для жизни осложнений заболевания.
Имеются литературные сведения о гистопатологии стенки кровеносных со судов малого калибра при ГЛПС, ассоциированной с серотипами хантавируса Hantaan, Amur и Seoul (Евсеев А.Н., 2010). Представляет интерес исследование со стояния и выраженности альтеративных изменений эндотелия кровеносных сосу дов среднего и крупного калибров, поскольку маловероятно, что вирус избира тельно повреждает внутреннюю выстилку только гемокапилляров. Учитывая факт существования метаболической и структурной гетерогенности эндотелия разных регионов кровеносной системы, является важным провести сравнительный анализ характера и выраженности его морфологических изменений в зависимости от ти па, калибра и органной локализации сосудов.
Восприимчивость к инфекционным агентам, в том числе и к хантавирусам, а также характер течения болезни генетически детерминированы (Frodsham A.J. et al., 2004;
Vannberg F.O. et al., 2011;
Chapman S.J. et al., 2012). Установлены ассоци ации полиморфных локусов генов главного комплекса гистосовместимости (Mustonen J. et al., 1998;
Korva M., 2011), цитокинов (Хабелова Т.А., 2007;
Mkel S. et al., 2001;
Maes P. et al. 2006), индуцибельной NO-синтазы (Хабелова Т.А., 2007), глутатион-S-трансферазы и цитохрома Р450 (Хасанова Г.М., 2012) с воспри имчивостью к ГЛПС и тяжестью ее течения. Учитывая выраженную эндотелио тропность хантавируса и отдельные литературные данные о различиях в содержа нии соединений эндотелиального происхождения в крови больных ГЛПС в зави симости от тяжести ее течения, представляет интерес изучение возможности гене тической детерминированности специфического ответа интимы кровеносных со судов. Выявление взаимосвязи полиморфных локусов генов сосудистой системы с предрасположенностью к дисрегуляции функции эндотелия при ГЛПС и тяжестью ее течения поможет приблизить к пониманию молекулярно-генетических основ патогенеза и клинической выраженности заболевания.
В рамках рассматриваемой проблемы требуют глубокого изучения взаимо связь метаболического ответа эндотелия в условиях действия хантавируса – воз будителя ГЛПС с генетическими предпосылками к развитию эндотелиопатии и последующим результированием сдвигов в его функциональной активности в ви димые, то есть структурные изменения в патогенезе заболевания.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является установление взаимосвязи изменений метаболической активности эндотелия, его структурно функционального состояния и их генетической детерминированности в патогенезе ГЛПС различной степени тяжести.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие за дачи:
1. Изучить состояние вазомоторной функции эндотелия при ГЛПС по уровню в крови эндотелина-1, оксида азота (II), активности ангиотензинпревращающего фермента и плазматического ренина в зависимости от периода и тяжести ее тече ния и установить их патогенетическую роль в изменениях системного артериаль ного давления в динамике болезни.
2. Исследовать состояние адгезионной активности эндотелия при ГЛПС по со держанию в крови VE-кадгерина, sVCAM-1 и характеру взаимосвязи между ними в зависимости от периода и тяжести течения заболевания.
3. Выявить характер ассоциации между уровнями sVCAM-1 и модуляторов его продукции – фактора некроза опухоли, интерлейкинов-1 и -4, ангиотензина II, NO, эндотелина-1 и фактора Виллебранда в зависимости от периода и тяжести те чения болезни.
4. Определить выраженность изменения гемостатической активности эндотелия при ГЛПС по содержанию в крови больных тканевого активатора плазминогена, ингибитора активаторов плазминогена 1 типа, фактора Виллебранда, характеру взаимосвязи и соотношения между ними и установить особенности ассоциативных связей между тканевым активатором плазминогена и ингибитором активаторов плазминогена 1 типа и индукторами их продукции – фактором некроза опухоли и интерлейкином-1 в зависимости от периода и тяжести течения заболевания.
5. Изучить активность процессов репаративного ангиогенеза при ГЛПС по содер жанию в крови циркулирующих эндотелиоцитов и сосудистого эндотелиального фактора роста, характеру взаимосвязи между ними и VE-кадгерина с сосудистым эндотелиальным фактором роста и циркулирующими эндотелиоцитами в крови больных в зависимости от периода и тяжести течения заболевания.
6. Установить характер взаимосвязи между концентрациями сосудистого эндоте лиального фактора роста и модуляторов его синтеза – фактора Виллебранда, фак тора некроза опухоли, NO, интерлейкина-1, ингибитора активаторов плазмино гена 1 типа, ангиотензина II у больных ГЛПС в зависимости от периода и тяжести течения ГЛПС. Оценить характер и выраженность структурного повреждения эн дотелия кровеносных сосудов в зависимости от их типа, калибра и органной лока лизации на светооптическом и ультрамикроскопическом уровнях на аутопсийном материале лиц, умерших от осложнений ГЛПС.
7. Провести исследование ассоциаций полиморфных локусов rs5370 гена эндоте лина-1 гена рецептора ангиотензина II типа (ET-1*G5665T), rs (ATRII*А1166С), rs1799768 гена ингибитора активаторов плазминогена 1 типа (PAI-1*4G(-675)5G) и rs1049970 гена VE-кадгерина (VE-cadherin*Т1550С) с тяже стью течения ГЛПС.
8. Охарактеризовать роль изменений метаболической активности эндотелия, ги стологического строения интимы кровеносных сосудов и полиморфных локусов генов сосудистой системы в патогенетических механизмах развития ГЛПС.
Научная новизна. Данная работа является первым систематическим иссле дованием взаимосвязи и взаимозависимости метаболической активности эндоте лия, генетических предпосылок к развитию его дисфункции, характера и выра женности структурных повреждений интимы кровеносных сосудов при ГЛПС раз личной степени тяжести.
Впервые дана обобщенная биохимическая картина сдвигов в метаболизме сосудистой интимы при ГЛПС в зависимости от периода и тяжести ее течения, охватывающая показатели систем вазорегуляции, гемостаза, репаративного ангио генеза и адгезионной активности. Выявлена сходная динамика изменений концен трации субстанций эндотелиоцитарного происхождения при среднетяжелом и тя желом неосложненном течении болезни с большей выраженностью выявленных отклонений от контроля при тяжелом варианте течения ГЛПС, а также их особая динамика при тяжелом осложненном течении болезни. Показана патогенетическая роль мультифункциональных соединений эндотелиального происхождения – NO, эндотелина-1 (ЭТ-1), АПФ-системы, фВ, фактора некроза опухоли (ФНО), ин терлейкина (ИЛ)-1 в общей системе метаболической перестройки интимы сосу дов при ГЛПС различной степени тяжести.
Выявлено коррелирующее со степенью тяжести ГЛПС снижение уровня ЭТ 1, увеличение концентрации стабильных метаболитов NO, повышение активности АПФ. Установлена ведущая патогенетическая роль АПФ в повышении артериаль ного давления у больных ГЛПС различной степени тяжести с высокой активно стью АПФ.
На основании исследования концентрации sVCAM-1 в крови больных ГЛПС в зависимости от периода и тяжести течения болезни и изучения характера ассо циации между уровнями этой адгезивной молекулы и модуляторов ее синтеза установлено, что при среднетяжелой и тяжелой неосложненной формах болезни происходит провоспалительная перестройка метаболической активности сосудистой интимы, сохраняющаяся вплоть до периода клинического выздоровления, выявлена низкая активность этого процесса при тяжелом ослож ненном течении заболевания. Дано биохимическое обоснование слабовыраженной инфильтрации макрофагами периваскулярного пространства при тяжелом ослож ненном течении ГЛПС как результата снижения продукции VCAM-1 в период раз гара болезни.
При ГЛПС выявлено коррелирующее со тяжестью течения болезни снижение уровня сосудистого эндотелиального кадгерина (VE-кадгерина) от начального периода к периоду восстановления диуреза и показано сохранение ба ланса в продукции кадгерина и VCAM-1 в системе обеспечения трансэндотели альной миграции моноцитов. Охарактеризована роль сосудистого эндотелиально го фактора роста (СЭФР) и VCAM-1 в снижении синтеза VE-кадгерина в динамике заболевания различной степени тяжести.
Показано, что низкая активность фибринолитических процессов в динамике ГЛПС различной степени тяжести обусловлена торможением продукции тканево го активатора плазминогена (ТАП) и ингибитора активаторов плазминогена 1 типа (ИАП-1) вследствие дисбаланса в системе регуляторы фибринолиза - индукторы их синтеза (ФНО и ИЛ-1).
На основе определения количества циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) в периферической крови больных ГЛПС установлена прямая зависимость между тяжестью течения болезни и степенью выраженности деэндотелизации со судов. Выявлено, что одной из причин слущивания эндотелиальных клеток (ЭК) является уменьшение степени связности между ними и подлежащими слоями со судистой стенки вследствие снижения продукции VE-кадгерина. Показана низкая активность процессов репаративного ангиогенеза в динамике болезни как резуль тата отсутствия стимулирующего влияния на синтез СЭФР со стороны проангио генных эффекторов и торможения его продукции комплексом антиангиогенных факторов.
Показано, что причиной особой динамики изменения концентрации соединений эндотелиоцитарного происхождения в крови больных при тяжелом осложненном течении ГЛПС является обширное повреждение эндотелия сосудов различных регионов кровеносной системы и выраженная ультраструктурная деструкция органелл эндотелиоцитов, что, в свою очередь, усугубляет сдвиги в метаболической активности сосудистой интимы. Впервые показано, что при Pu umala-ассоциированной ГЛПС повреждается эндотелий кровеносных сосудов не только мелкого, но и среднего и крупного калибров, но его деструкция в гемока пиллярах более выражена. Интима артериальных сосудов повреждается сильнее, чем венозных. Эндотелий интраорганных сосудов почек, надпочечников, печени, желудка, двенадцатиперстной кишки, миокарда повреждается в значительной сте пени, сосудов головного мозга – в меньшей степени, сосудов легких – практически не поврежден. Характер и выраженность ультраструктурных изменений ЭК иссле дованных сосудов не зависят от их типа, калибра и органной локализации и за ключаются в глубокой деструкции всех их органелл.
Впервые у больных ГЛПС проведен анализ полиморфных локусов генов со судистой системы - rs5370 гена ЭТ-1 (ET-1*G5665T), rs5186 гена рецептора ангио тензина (АТ) II типа 1 (ATRII*А1166С), rs1799768 гена ИАП-1 (PAI-1*4G( 675)5G) и rs1049970 гена VE-кадгерина (VE-cadherin*Т1550С) и изучена ассоциа ция вариантов генетического полиморфизма с тяжестью течения ГЛПС. Выявлена ассоциация минорного генотипа *Т/*Т (миссенс-мутации c.1550TC) гена VE кадгерина с риском развития тяжелой формы заболевания. Показана патогенети ческая связь между степенью выраженности деэндотелизации сосудов, генетиче ски детерминированной склонностью к усиленной десквамации ЭК и депрессией продукции компонентов системы фибринолиза в развитии ДВС-синдрома при тя желом течении ГЛПС.
Сформулирована концепция патогенеза ГЛПС как «болезни эндотелия», со гласно которой взаимозависимые и потенцирующие друг друга изменения его ме таболической активности и структурно-функционального состояния являются ос новой патохимических и патофизиологических сдвигов при различных клиниче ских формах течения заболевания, развития осложнений болезни с формировани ем синдрома полиорганной недостаточности.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные об особенно стях метаболического статуса эндотелия и его структурно-функциональном состо янии в динамике ГЛПС различной тяжести течения, ассоциации минорного гено типа *Т/*Т гена VE-кадгерина с риском развития тяжелой формы болезни, повре ждения интимы кровеносных сосудов всех калибров, различиях в степени выра женности деструкции эндотелия кровеносных сосудов разного типа и органной локализации не только существенно расширяют и дополняют имеющиеся пред ставления о ведущих механизмах развития болезни, но и являются основой для формирования новой концепции патогенеза ГЛПС как заболевания, первичным и ведущим звеном развития которого являются патохимические изменения активности эндотелия, которые обусловливают его структурное повреждение.
Количественные и качественные различия в содержании в крови больных ГЛПС различной степени тяжести ИАП-1, sVCAM-1, СЭФР, ЦЭК и активности АПФ в лихорадочный период болезни являются основанием для рассмотрения во проса о возможности включения панели из пяти маркеров функции эндотелия как дополнение к стандартным способам ранней диагностики заболевания и прогноза развития осложнений.
С целью выявления лиц группы риска развития тяжелой формы ГЛПС реко мендуется ДНК-анализ миссенс-мутации c.1550TC гена VE-кадгерина.
Выявление в динамике ГЛПС высокой активности АПФ на фоне высокого артериального давления в период полиурии является основанием для рассмотрения вопроса о целесообразности включения в комплексную патогенети чески обусловленную терапию ингибиторов АПФ.
Для контроля клинико-лабораторной эффективности терапии больных ГЛПС различной степени тяжести рациональным является включение в стандарт ный способ мониторинга лечения определение содержания в периферической кро ви ЦЭК как интегрального показателя степени повреждения эндотелия.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты и основные положения диссертационной работы включены в педагогическую практику и учебный процесс кафедр биохимии, гистологии, инфекционных болезней с курсом ИПО ГБОУ ВПО Башкирский ГМУ Минздрава России;
кафедры биохимии, ка федры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры анестезиологии и реанима тологии ГБОУ ВПО Омская ГМА Минздрава России;
кафедры биохимии ГБОУ ВПО Оренбургская ГМА Минздрава России;
кафедры биохимии ГБОУ ВПО Че лябинская ГМА Минздрава России;
кафедры поликлинической терапии ГБОУ ВПО Ижевская ГМА Минздрава России;
кафедр гистологии и нормальной физио логии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Характер изменений метаболического статуса и структурно-функционального состояния эндотелия кровеносных сосудов при среднетяжелом течении ГЛПС ука зывают на его активацию. Отсутствие ассоциации полиморфных локусов генов со судистой системы с развитием ГЛПС в среднетяжелой форме могут свидетель ствовать об адаптационно-приспособительном характере выявленных сдвигов с целью обеспечения динамического равновесия между адгезионной активностью сосудистой интимы, вазоконстрикцией и вазодилатацией, активностью системы фибринолиза для поддержания адекватной микроциркуляции в органах и тканях.
2. Тяжелая форма ГЛПС характеризуется выраженными сдвигами метаболической активности эндотелия и его значительными структурно-функциональными изме нениями, что свидетельствует о трансформации явлений эндотелиальной дис функции из адаптивных реакций в патологические. Осложненное течение болезни сопровождается выраженной дискоординацией функциональной активности эндо телия. Выявленные сдвиги являются патохимической основой нарушения вазомо торной реакции сосудов, снижения интенсивности провоспалительной перестрой ки метаболической активности сосудистой интимы при осложненном течении ГЛПС как необходимого звена синдрома системного воспалительного ответа, пре обладания реакций гемокоагуляции над реакциями фибринолиза, что результиру ется в нарушении микроциркуляции с развитием осложнений болезни и синдрома полиорганной недостаточности. Генетическим фактором предрасположенности к развитию ГЛПС в тяжелой форме является носительство минорного генотипа *Т/*Т гена VE-кадгерина как одной из возможных причин повышенной десквама ции ЭК.
3. ГЛПС различной степени тяжести сопровождается усиленной десквамацией эн дотелия и запаздыванием процессов репаративного ангиогенеза, связанного с вы соким уровнем продукции антиангиогенных модуляторов, что характеризует неза вершенность воспалительного процесса в эндотелии вплоть до периода клиниче ского выздоровления.
4. Первичным фактором повреждения эндотелиальных клеток кровеносных сосу дов при ГЛПС является хантавирус, вторичными - медиаторы метаболического ответа организма на вирусную агрессию. Характер и выраженность структурного повреждения эндотелия кровеносных сосудов на светооптическом уровне зависят от их типа и органной локализации и не зависят от калибра. Характер и выражен ность ультраструктурных повреждений эндотелиоцитов исследованных кровенос ных сосудов не зависят от их типа, калибра и органной локализации и заключают ся в глубокой деструкции их органелл.
5. Ключевую позицию в патохимических механизмах развития ГЛПС занимает изменение метаболической активности сосудистой интимы, ведущее к активации и повреждению эндотелиоцитов с последующей их выраженной десквамацией.
Существенные изменения метаболической активности и структурно функционального состояния эндотелия при тяжелом течении болезни могут быть генетически детерминированы.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуж дены на Всероссийской научно-практической конференции «Геморрагическая ли хорадка с почечным синдромом: история изучения и современное состояние эпи демиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО» Микроген» (Уфа, 2006), Всероссийской научно практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Ки ров, 2007);
IX Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008);
конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. АМН СССР Д.А.
Жданова (Москва, 2008);
VI, VII и VIII Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных про блем медицины» (Астрахань, 2008, 2010, 2011);
VI Всероссийском съезде ВРНО АГЭ (Саратов, 2009);
научно-практической конференции биохимиков Урала, По волжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009);
Всероссийской научной конференции «Клиниче ская анатомия и экспериментальная хирургия в XXI веке» (Оренбург, 2009);
Все российской научной конференция «Молекулярно-генетические основы функцио нирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010);
Х Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010);
Республи канской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», посвященной 100-летию МУ ИКБ № 4 ГО г. Уфы РБ (Уфа, 2010);
VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010);
Международ ной конференции, посвященной 70-летию профессора А.К. Косоурова (Санкт Петербург, 2011);
Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной диагностике «Медицинская биохимия и клиниче ская лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных иссле дований» (Омск, 2011);
Международной научной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека. Актуальные проблемы биологии и медицины» (Астрахань, 2012);
XI Конгрессе Международной ассоциа ции морфологов (Самара, 2012);
III Международной научно-практической конфе ренции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012);
совместном заседании кафедр биологической химии, гистологии, инфекционных болезней с курсом ИПО, факультетской терапии, про педевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, лаборато рии физиологической генетики, лаборатории молекулярной биологии и нанобио технологии ФГБУН «Институт биохимии и генетики» УНЦ РАН, отдела морфоло гии ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России (Уфа, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 работ, из которых статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Мини стерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, в том числе 5 статей в журналах, входящих в международные базы цитирования;
получено 2 патента Российской Федерации на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков, 34 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав ре зультатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических реко мендаций и списка литературы, который включает 491 источник, из которых отечественных и 406 зарубежных.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь в проведении исследований и обсуждении результатов работы: научному консультанту, д.м.н., проф. Камилову Ф.Х. (ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России);
д.м.н., проф. Вагаповой В.Ш. (ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России);
ректору ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, д.м.н., проф. Тимербулатову В.М.;
гл. ин фекционисту Минздрава РБ, д.м.н., проф. Валишину Д.А. (ГБОУ ВПО БГМУ Мин здрава России);
директору ФГБУН ИБГ УНЦ РАН, академику АН РБ, д.б.н., про фессору Вахитову В.А.;
к.м.н. Сальманову А.А. (ГБУЗ БСМЭ Минздрава РБ);
д.м.н., проф. Исхакову Э.Р. (ФГКОУ ВПО УЮИ МВД России);
к.м.н. Исламгулову Д.В. (ФГБУН ИБГ УНЦ РАН);
гл. патологоанатому Минздрава РБ Ткаченко В.Н.
(ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова);
Рахмангулову М.Г. (ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова);
к.м.н. Ожгихину С.Н. (ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова);
д.м.н., проф. Семченко В.В.
(НИЦ CO РАМН, г. Омск);
с.н.с., к.б.н. Лебедевой А.И. (ФГУ ВЦГиПХ, г. Уфа);
с.н.с., д.б.н., проф. Мусиной Л.А. (ФГУ ВЦГиПХ, г. Уфа);
г.н.с., д.м.н., проф. Вик торовой Т.В. (ФГБУН ИБГ УНЦ РАН, ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России);
За риповой Р.М. (ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России);
д.х.н., проф. Кондратенко Р.М. (ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России), к.м.н. Булыгину К.В. (ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России);
всем коллегам по кафедре биохимии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследования метаболического статуса эндотелия проведено динамиче ское наблюдение за 137 пациентами (114 мужчин и 23 женщины) в возрасте 21- лет (средний возраст 35,0 [25,0;
47,0] лет), находившимися на стационарном лече нии в клинических отделениях ГБУЗ «Инфекционная клиническая больница № 4»
г. Уфы и в отделении гемодиализа ГБУЗ «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова» в 2005-2010 гг. Диагноз ГЛПС верифицирован методом флуо ресцирующих антител (МФА). Больные были информированы о цели исследова ния и от каждого из них получено согласие клинико (протокол экспериментального исследования и бланк информированного согласия были одобрены экспертным советом по биомедицинской этике ГОУ ВПО БГМУ Рос здрава, созданным по приказу ректора ГОУ ВПО БГМУ Росздрава № 186 от 07.11.2006.). Критерием исключения из исследования явилось наличие в анамнезе гипертонической болезни, атеросклероза, болезней сердца и сосудов, злокаче ственных и эндокринных заболеваний, заболеваний печени и почек. Среднетяже лая форма ГЛПС выявлена у 61 больного (44,5%), тяжелая без осложнений – у больных (31,4%), тяжелая с осложнениями – у 33 больных (24,1%). Пациентов с легкой формой ГЛПС в исследование не включали в связи со слабой выраженно стью клинических, биохимических и иммунологических показателей. Из общего числа осложнений инфекционно-токсический шок наблюдался в 20,4% случаев, острая почечная недостаточность с переводом на гемодиализ – в 16,8%, ДВС синдром – в 10,2%, острый эрозивный гастрит – в 1,5%, острая дыхательная недо статочность – в 1,5%, гематома почки – в 0,7%, носовое и желудочное кровотече ние – в 0,7%, токсико-метаболическая энцефалопатия с отеком мозга – в 0,7% слу чаев. В наблюдаемой группе имелся один случай летального исхода от осложне ний заболевания.
Группу контроля составили 44 практически здоровых добровольца (37 муж чин и 7 женщин) в возрасте 19-45 лет (средний возраст 32,2 [28,4;
36,1] лет). Кри терием включения в группу контроля явилось отсутствие в анамнезе перенесенной ГЛПС, заболеваний сердца и сосудов, печени, почек, ревматизма, злокачествен ных и эндокринных заболеваний.
В молекулярно-генетическом исследовании использованы образцы ДНК больных ГЛПС различной степени тяжести и 171 серонегативного донора из фон да ФГБУН ИБГ УНЦ РАН1. Донорами ДНК служили больные с серологически подтвержденным МФА диагнозом ГЛПС в возрасте 15-65 лет (средний возраст 41,2 [26,7;
51,3] лет), находившиеся на стационарном лечении в ГБУЗ «Инфекци онная больница № 4» г. Уфы в 2002-2005 гг. Среднетяжелая форма болезни диа гностирована у 175 (54,9%), тяжелая без осложнений – у 95 (29,8%), тяжелая с осложнениями – у 49 пациентов (15,3%). Группа серонегативных доноров, сфор мированная из числа жителей Республики Башкортостан, сопоставима с выборкой больных по возрасту и полу.
В генетическом исследовании использованы образцы ДНК больных ГЛПС и серонегативных доноров, со бранные к.м.н, ассистентом кафедры инфекционных болезней ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России Хабеловой Т. А. и переданные в распоряжение ФГБУН «Институт биохимии и генетики» УНЦ РАН.
Выражаем глубокую благодарность и искреннюю признательность директору ФГБУН «Институт биохимии и генетики» УНЦ РАН, академику АН РБ, д.б.н., профессору Вахитову Венеру Абсаттаровичу за предоставле ние для исследования образцов ДНК больных ГЛПС и серонегативных доноров.
Общая характеристика больных ГЛПС – доноров ДНК и серонегативных доноров приводится с любезного разрешения к.м.н., ассистента кафедры инфекционных болезней ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России Хабело вой Т.А.
Для гистологического исследования эндотелия кровеносных сосудов ис пользован аутопсийный материал от 16 лиц (13 мужчин и 3 женщины) с серологи чески подтвержденным МФА диагнозом ГЛПС, умерших от ее осложнений, в воз расте 22-76 лет (средний возраст 45,0 [31,0;
55,5] лет). Группу сравнения составил кадаверный материал, полученный от 6 лиц (5 мужчин, 1 женщина), умерших от острой травмы, несовместимой с жизнью, и не страдавших соматическими заболе ваниями, в возрасте 28-37 лет (средний возраст 34,0 [30,2;
35,4] лет).
Проведены следующие виды исследований.
- биохимические:
Количественное определение ЭТ-1 в плазме крови – методом иммунофер ментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы «Endothelin ELISA» ком пании «Biomedica Group» (Австрия).
Количественное определение стабильных метаболитов NO в сыворотке кро ви – по реакции с реактивом Грисса с использованием тест-системы «Total NO/Nitrite/Nitrate Assay» компании «R&D; Systems» (США).
Количественное определение активности АПФ в сыворотке крови – кинети ческим методом с использованием тест-системы «ACE kinetic» компании «Bhl mann» (Швейцария).
Количественное определение активности ренина в плазме крови – радиоим мунологическим методом с использованием тест-системы «Angiotensin I RIA KIT»
компании «Immunotech» (Чехия).
Количественное определение VE-кадгерина в сыворотке крови – методом ИФА с использованием тест-системы «human VE-cadherin ELISA» компании «Bender MedSystems» (Австрия).
Количественное определение sVCAM-1 в сыворотке крови – методом ИФА с использованием тест-системы «human sVCAM-1 ELISA» компании «Bender MedSystems» (Австрия).
Количественное определение антигена фВ в плазме крови – методом ИФА с использованием тест-системы «vW Antigen ELISA» компании «Technoclone» (Ав стрия).
Количественное определение антигена ТАП в плазме – методом ИФА с ис пользованием тест-системы «tPA Antigen ELISA» компании «Technoclone» (Ав стрия).
Количественное определение антигена ИАП-1 в плазме крови – методом ИФА с использованием тест-системы «PAI-1 Antigen ELISA» компании «Technoclone»
(Австрия).
Количественное определение СЭФР в сыворотке крови – методом ИФА с ис пользованием тест-системы «human VEGF» компании «Biosource» (США).
Количественное определение ИЛ-1 и -4 и ФНО в сыворотке крови – мето дом ИФА с использованием тест-систем соответственно «Интерлейкин-1бета ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-4-ИФА-БЕСТ» и «Альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ» произ водства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).
- молекулярно-генетические:
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови – методом фенольно хлороформной экстракции (Mathew С.С., 1984).
Исследование полиморфных локусов генов ЭТ-1, рецептора АТ II типа 1, VE кадгерина, ИАП-1 – методами полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и по лиморфизма длины рестрикционных фрагментов.
- гистологические:
Определение количества ЦЭК в периферической крови – по методу J. Hlado vec (1976).
Фенотипическая верификация ЦЭК – методом иммуногистохимии с исполь зованием очищенных моноклональных антител против маркерного антигена эндо телиоцитов СD31 (PECAM-1) компании «Dako» (США).
Забор аутопсийного материала проводился не позднее, чем через 4 часа после констатации биологической смерти. Материал для исследования на светооптиче ском уровне фиксировался в 10% забуференном формалине (рН 7,0), аутоптаты промывались, проводились по спиртам возрастающей концентрации и заливались в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивались по методу Маллори, гематокси лином и эозином, по Ван-Гизону. Микроскопические исследования проводились с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM PASCAL фирмы «Carl Zeiss» (Германия). Для электронно-микроскопического ис следования аутоптаты фиксировались в 2,5% растворе глутаральдегида на фос фатном буфере (pH 7,4), постфиксировались 1% раствором четырехокиси осмия, обезвоживались в спиртах возрастающей концентрации и заливались в эпон- по Уикли (Уикли Б., 1975). Срезы толщиной 1 мкм готовились на ультратоме LKB-III 8800 (Швеция), контрастировались 2% водным раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца по Рейнольдсу (Reynolds E.S., 1963) и анализировались в трансмиссионном микроскопе JEM-100 CX II фирмы “JEOL” (Япония) при уве личении 5200-29000 раз.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с ис пользованием методов параметрической и непараметрической статистики и соот ветствующего программного обеспечения (Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., 2004), SPSS 13.0 for Windows, «RxC» на основе алгоритма точного двустороннего критерия Фишера Р (F2) (Roff P.A., 1989). Для оценки количественных показателей исполь зовались методы непараметрической статистики: определялись медиана, интерк вартильный интервал (25-й и 75-й процентили), максимальное и минимальное зна чения. Статистическая значимость межгрупповых различий средних величин оце нивалась по критерию U Манна-Уитни с поправкой False Discovery Rate (FDR) для множественных сравнений (Benjamini Y., Hochberg Y., 1995). Взаимосвязь двух количественных признаков оценивалась с помощью корреляционного анализа по Спирмену. Правильность распределения частот генотипов и аллелей определялась соответствием равновесию Харди-Вайнберга. Доверительные интервалы частот аллелей и генотипов рассчитывались на основе точной формулы с использованием F-распределения (Животовский Л.А., 1984). При попарном сравнении частот гено типов и аллелей в группах больных и в контроле использовался критерий хи квадрат (2) для таблиц сопряженности 22 с поправкой Йетса на непрерывность (Леонов В.П., 1998). Если частота хотя бы в одной ячейке таблицы была меньше или равна 5, применялся точный критерий Фишера. Сила ассоциаций с тяжестью течения ГЛПС оценивалась в значениях показателя отношения шансов (Оdds Ratio, OR) (Бабич П.Н., 2005). Проверка статистических гипотез проходила при критическом уровне значимости р=0,05. В случае множественных сравнений кри тический уровень значимости р вычислялся по методу FDR.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Метаболическая активность эндотелия при ГЛПС Динамика содержания маркеров вазомоторной функции эндотелия – ЭТ-1, оксида азота (II), активности АПФ и плазматического ренина Во всех исследуемых группах больных выявляется статистически значимо низкий уровень ЭТ-1 на всем протяжении болезни с максимумом в период лихо радки (рис. 1а). Чем тяжелее протекает болезнь, тем более выражено снижение продукции пептида. Содержание NO при всех формах тяжести ГЛПС возрастает от начального периода к периоду разгара болезни с последующим снижением к периоду восстановления диуреза (рис. 1б). Перепады его концентрации при пере ходе от одного периода к другому наиболее значительны при тяжелой неослож ненной форме ГЛПС. При тяжелом осложненном течении заболевания содержание окиси азота в крови статистически значимо высокое во все периоды болезни, за исключением начального.
а) б) Рис. 1. Концентрация ЭТ-1 (а) и NO (б) в крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии. Здесь и далее: 1 – кон троль, 2 – период лихорадки, 3 - период олигурии, 4 – период полиурии, 5 – период восстанов ленного диуреза. I – среднетяжелая форма, II – тяжелая форма без осложнений, III – тяжелая форма с осложнениями. Статистическая значимость различий по сравнению: * - с контролем, • - с предыдущим периодом (р0,05);
+ - со среднетяжелой формой (р0,05), о – с тяжелой формой без осложнений (р0,05);
пунктирная линия – медианное значение для контроля.
(а) * - р0,05 с поправкой FDR, (б) * - р0,045 с поправкой FDR.
Динамика изменения активности АПФ сходна с таковой для концентрации NO, и наиболее выраженные перепады активности энзима при переходе от одного периода болезни к другому также наблюдаются при тяжелом неосложненном те чении ГЛПС (рис. 2а). При тяжелой осложненной форме болезни гиперактивность энзима регистрируется на протяжении всего заболевания.
а) б) Рис. 2. Активность АПФ (а) и ренина (б) в крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии.
(а) * - р0,042 с поправкой FDR, (б) * - р0,037 с поправкой FDR.
При всех формах клинического течения ГЛПС выявляется сходная динамика изменения активности плазматического ренина с максимумом в период лихорадки и постепенным снижением к периоду восстановления диуреза до уровня, стати стически значимо ниже контрольного (рис. 2б). Полученные результаты свиде тельствуют о развитии при ГЛПС различной степени тяжести вазомоторной фор мы дисфункции эндотелия.
Между ЭТ-1, NO и АПФ, а также между АПФ и ренином существует тесная метаболическая и функциональная связь, заключающаяся во взаимной активации либо ингибировании продукции/активности друг друга. Корреляционный анализ между концентрациями агонистов ЭТ-1 и АПФ выявил усиление положительной связи при среднетяжелой форме от средней в начальный период болезни до стати стически значимо сильной в период олигурии (R=+0,8, р=0,03), в последующие же периоды она становится статистически незначимо отрицательной. При тяжелой неосложненной форме связь статистически незначимо положительная, за исклю чение периода клинического выздоровления (R=-0,8, р=0,01) Тяжелая осложнен ная форма характеризуется попеременным изменением силы и знака коэффициен та Спирмена при переходе от одного периода к другому, и только в период поли урии связь статистически значимо положительная (R=+0,8;
р=0,04).
В паре антагонистов АПФ/NO в динамике ГЛПС различной степени тяжести выявлена премущественно слабая и средняя положительная связь, за исключени ем периодов лихорадки (R=-0,9, р=0,01) и полиурии среднетяжелой формы (R=+0,8, р=0,01), восстановленного диуреза тяжелой осложненной формы (R=+0,8, р=0,03).
В системе антагонистов ЭТ-1/NO в динамике ГЛПС различной степени тя жести наблюдается преимущественно слабая и средняя отрицательная корреляция.
В системе ренин/АПФ при среднетяжелом течении ГЛПС положительная корреляция средней силы в начальный период сменяется на отрицательную в остальные периоды, причем статистически значимую в периоды олигурии (R=-0,8, р=0,03) и восстановленного диуреза (R=-0,9, р=0,002). Тяжелая неосложненная форма начинается с сильной отрицательной связи между этими субстанциями (R= 0,8, р=0,01), однако она затем сменяется статистически незначимой положитель ной связью в олигурический период и такой же отрицательной связью в остальные стадии болезни. При присоединении осложнений сильная отрицательная корреля ция в период лихорадки (R=-0,9, р=0,01) меняется на положительную от средней степени выраженности в период олигурии до сильной в последующие стадии ГЛПС – полиурии (R=+0,8, р=0,03) и восстановленного диуреза (R=+0,8, р=0,002).
Таким образом, в динамике ГЛПС различной степени тяжести сохраняется баланс в системе ЭТ-1/NO, развивается дисбаланс в паре АПФ/NO и равновесие в системах ЭТ-1/АПФ и ренин/АПФ выявляется только при среднетяжелом и тяже лом неосложненном течении болезни.
Исследуемые вазорегуляторы контролируют системный тонус сосудов, и продукция части из них также находится под регулирующим влиянием артериаль ного давления (АД). Корреляционный анализ между ними и величиной среднего АД, рассчитанного по формуле Хикема (Савицкий Н.Н., 1974), в зависимости от периода и тяжести течения ГЛПС выявил разный характер их взаимосвязи. При среднетяжелой и тяжелой неосложненной формах ГЛПС между уровнем эндоте лина-1 и средним АД больных выявлена статистически незначимая преимуще ственно положительная корреляция. При тяжелой форме с осложненным течением слабая положительная связь в период лихорадки и сильная – в олигурический пе риод (R=+0,9, р=0,02) сменяется слабой и средней отрицательной корреляцией в остальные стадии болезни. Между содержанием NO в периферической крови больных ГЛПС и уровнем их среднего АД наблюдается статистически незначимая положительная корреляция, за исключением периодов олигурии (R=+0,9, р=0,03), полиурии (R=+0,9, р=0,02) и восстановленного диуреза (R=+0,8, р=0,04) тяжелой осложненной формы болезни. Корреляционная связь между активностью АПФ в крови больных ГЛПС и величиной их среднего АД в динамике заболевания пре имущественно положительная, причем статистически значимо сильная в периоды полиурии среднетяжелой, лихорадки тяжелой неосложненной и восстановленного диуреза осложненной формы (R=+0,8, р=0,04 для каждого из них). Корреляцион ная связь между величиной среднего АД больных и активностью плазматического ренина в их крови во все периоды ГЛПС различной степени тяжести положитель ная ГЛПС, причем статистически значимо сильная в период восстановленного ди уреза осложненной формы болезни (R=+0,8, р=0,01). Таким образом, повышенное АД у больных ГЛПС, особенно выраженное в период полиурии, связано с высокой активностью АПФ. Несмотря на вазодилатирующий эффект ЭТ-1 в низких кон центрациях и NO, они не вносят заметный вклад в поддержание системного тонуса сосудов у больных ГЛПС. В динамике болезни при всех формах тяжести сохраня ется регулирующее влияние АД на продукцию ренина.
Динамика содержания маркеров адгезионной активности эндотелия – VE-кадгерина, VCAM-1, ФНО, ИЛ-1 и - ГЛПС различной степени тяжести сопровождается снижением концентрации VE-кадгерина в динамике болезни, особенно выраженным при тяжелом течении заболевания (рис. 3а).
а) б) Рис. 3. Концентрация VE-кадгерина (а) и sVCAM-1 (б) в сыворотке крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии. (а) * - р0,02 с поправкой FDR, (б) * - р0,046 с поправкой FDR.
Содержание sVCAM-1 в крови больных ГЛПС со среднетяжелым и тяжелым неосложненным течением статистически значимо повышено на всем протяжении болезни, что свидетельствуют об активации эндотелия и провоспалительной пере стройке его метаболизма (рис. 3б). При переходе от лихорадочного к олигуриче скому периоду тяжелой формы ГЛПС с осложнениями концентрация VCAM- снижается на два порядка, что указывает на снижение провоспалительной актив ности эндотелия.
Рекрутирование и адгезия моноцитов на эндотелии, происходящие при непосредственном участии VCAM-1, предполагают локальное повышение его про ницаемости для обеспечения эффективной экстравазации этих клеток (Muller W.A., 2009). Это, в свою очередь, должно вызвать реципрокное торможение про дукции VE-кадгерина. Корреляционный анализ по Спирмену между концентраци ями этих адгезивных молекул в динамике ГЛПС различной степени тяжести вы явил отрицательную связь средней силы, что доказывает сохранение определенно го баланса в их синтезе и секреции.
Наши данные о содержании ФНО, ИЛ-1 и ИЛ-4 в крови больных ГЛПС в зависимости от периода и тяжести ее течения согласуются с результатами, полу ченными другими исследователями (Saksida A. et al, 2011;
Wang P.-Z. еt al., 2012).
Каскад воспалительной реакции эндотелия, иницируемый хантавирусом, в последующем регулируется растворимыми медиаторами воспаления - ФНО, ИЛ 1 и -4, АТ II, ЭТ-1, фВ, NO (Pueyo M.E. et al., 2000;
Lee S.K. et al., 2002;
Li L. et al., 2003;
Jiang B. et al., 2004;
Gao X. еt al., 2008;
Ohanian J. et al., 2012). Первые шесть являются стимуляторами, а NO - ингибитором синтеза VCAM-1. фВ повы шает адгезивность эндотелия для лейкоцитов.
По данным корреляционного анализа, наибольшая согласованность между уровнями sVCAM-1 и модуляторами ее продукции наблюдается при среднетяже лом течении ГЛПС. Выявляется средняя и слабая положительная корреляция с уровнями индукторов синтеза – ФНО, ИЛ-1 и -4, AT II и NO как ингибитора синтеза, положительная ассоциация средней силы с фВ, положительная связь с NO;
ЭТ-1, судя по его низкой концентрации в динамике болезни, не стимулирует продукцию адгезивной молекулы. Следовательно, при среднетяжелом течении ГЛПС эндотелий сохраняет способность к адекватной провоспалительной пере стройке в условиях вирусной инвазии.
Тяжелая неосложненная форма ГЛПС сопровождается меньшей степенью сбалансированности в уровне регуляторов воспаления эндотелия. Сильная поло жительная связь между уровнями sVCAM-1 и фВ наблюдается только в стадию олигурии (R=+0,8, р=0,03), в остальные фазы болезни связь положительная сред ней силы;
статистически незначимую положительную связь с адгезивной молеку лой обнаруживает NO;
ИЛ-1 и -4 в динамике болезни меняют характер связи с sVCAM-1 со слабой положительной на отрицательную, с AT II на всем протяже нии болезни выявляется отрицательная корреляция средней силы;
ЭТ-1, судя по низкому уровню в крови в динамике болезни, не стимулирует ее синтез.
При осложненном течении ГЛПС между уровнем sVCAM-1 и ИЛ-1 выяв ляется статистически незначимая положительная корреляция. Связь между концентрациями адгезивной молекулы и остальных модуляторов ее синтеза отрицательная от слабой и средней до сильной в период полиурии для ФНО (R= 0,8, р=0,03), олигурии и полиурии для NO (соответственно R=-0,9, р=0,003 и R= 0,8, р= 0,002), олигурии для фВ (R=-0,8, р=0,03), лихорадки и восстановленного диуреза для АТ II (соответственно R=+0,9, р= 0,002 и R=-0,8, р=0,02).
Комплекс выявленных изменений свидетельствует о развитии при ГЛПС различной степени тяжести адгезионной формы дисфунции эндотелия с явления ми декомпенсации при тяжелом осложненном течении болезни. Важнейшим усло вием реализации провоспалительной перестройки метаболизма эндотелия является целенаправленное и согласованное взаимодействие между регуляторами воспали тельного ответа. Баланс в их продукции и характер корреляционных связей между ними дают основание предположить, что при среднетяжелой и тяжелой неослож ненной формах ГЛПС сохраняется согласованность в их синтезе и взаимодействии для эффективного противодействия хантавирусу. Дисрегуляция в функционирова нии данной системы при тяжелом течении болезни может явиться причиной раз вития тяжелых осложнений.
Динамика содержания маркеров гемостатической активности эндотелия – ТАП и ИАП- Уровень ТАП при среднетяжелом и тяжелом неосложненном течении ГЛПС статистически значимо высокий в начальный период и низкий во все остальные периоды болезни (рис. 4а). При тяжелой осложненной форме его содержание оста ется статистически значимо сниженным на всем протяжении заболевания. Изме нение концентрации ИАП-1 при среднетяжелой и тяжелой неосложненной формах ГЛПС имеет волнообразную динамику с максимумом в период лихорадки и ми нимумом в период восстановленного диуреза. В лихорадочный период тяжелого осложненного течения болезни его уровень статистически значимо низкий, а в по следующие периоды нормализуется (рис. 4б).
а) б) Рис. 4. Концентрация антигенов ТАП (а) и ИАП-1 (б) плазме крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии.
(а) * - р0,05 с поправкой FDR, (б) * - р0,025 с поправкой FDR.
Корреляционный анализ между концентрациями ТАП и ИАП-1 выявил пре имущественно отрицательную связь средней силы, что соответствует характеру метаболических отношений между этими регуляторами фибринолиза.
Для оценки равновесия в системе ТАП-ИАП-1 информативным является вы числение количественного соотношения между ними. Увеличение этого индекса по сравнению с контролем может указывать на тенденцию к усилению фибрино лиза и наоборот. В динамике ГЛПС независимо от тяжести ее течения этот показа тель снижается от начального периода к разгару болезни с последующей тенден цией к повышению к периоду восстановления диуреза (табл. 1).
Таблица Соотношение ТАП/ИАП-1 при ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии Форма заболевания Период заболевания среднетяжелая тяжелая без осложнений тяжелая с осложнениями 1,6 [0,9;
3,9] 1,3 [1,1;
1,6] 0,5 [0,4;
1,6] лихорадки р=0,03 р=0,01;
р1=0,2 р=0,6;
р1=0,01;
р2=0, 0,09 [0,09;
0,2] 0,2 [0,17;
0,28] 0,1 [0,1;
0,1] олигурии р=0,001 р=0,02;
р1=0,03 р=0,002;
р1=0,02;
р2=0, 0,11 [0,1;
0,2] 0,14 [0,13;
0,23] 0,1 [0,1;
0,2] полиурии р=0,04 р=0,01;
р1=0,6 р=0,001;
р1=0,01;
р2=0, восстанов 0,12 [0,12;
0,2] 0,33 [0,15;
1,9] 0,5 [0,3;
0,9] ленного р=0,04 р=0,03;
р1=0,001 р=0,2;
р1=0,02;
р2=0, диуреза контроль 0,7 [0,5;
0,8] Примечание: р – статистическая значимость различий с контролем (р0,033 с поправкой FDR), р1 статистическая значимость различий со среднетяжелой формой, р2 – статистическая значимость различий с тяжелой формой без осложнений.
Низкие значения соотношения ТАП/ИАП-1 при ГЛПС, особенно выраженные при осложненном течении болезни, свидетельствуют, по-видимому, об ослаблении активности процессов фибринолиза.
Основными индукторами синтеза ТАП и ИАП-1 в условиях воспаления яв ляются ФНО и ИЛ-1 (van der Poll T. еt al., 2001;
Shebuski R.J. et al., 2002). При среднетяжелом течении ГЛПС между концентрациями ТАП и этих цитокинов вы является отрицательная корреляция средней силы, а в период олигурии – сильная (R=-0,8, р=0,03). При тяжелой неосложненной форме болезни связь во все перио ды болезни, за исключением начального, становится статистически значимо отри цательной: для ФНО ИЛ-1 в периоды олигурии - соответственно R=-0, (р=0,004) и R=-0,8 (р=0,002), полиурии - соответственно R=-0,8 (р=0,006) и R=-0, (р=0,0006), восстановленного диуреза - соответственно R=-0,8 (р=0,01) и R=-0, (р=0,003).
В системе ИАП-1 – провоспалительные цитокины выявлена положительная связь средней силы при среднетяжелой форме ГЛПС и сильная положительная - в период лихорадки тяжелого неосложненного течения болезни (R=+0,8, р=0,02). Во все остальные периоды тяжелой неосложненной формы и при тяжелом осложнен ном течении заболевания обнаруживается преимущественно средняя отрицатель ная, а также сильная отрицательная связь с ФНО (R=-0,8, р=0,007) и ИЛ-1 (R= 0,8, р=0,01) в лихорадочный период болезни.
К группе ранних тромборегуляторов эндотелиоцитарного происхождения относится фВ. Его концентрация в крови больных ГЛПС различной степени тяже сти, по нашим данным, преимущественно статистически значимо превышает кон троль на всем протяжении болезни, что согласуется с результатами И.М. Давидо вича (1996).
Таким образом, изменения в крови концентрации маркеров гемостатической активности эндотелия - ТАП, ИАП-1и фВ в динамике ГЛПС различной степени тяжести свидетельствуют о развитии гемостатической формы его дисфункции.
Сохранение отрицательной корреляции между регуляторами фибринолиза практи чески на всем протяжении болезни можно трактовать как тенденцию к сохране нию определенного баланса в функционировании системы ТАП – ИАП-1. Низкое значение соотношения ТАП/ИАП-1, особенно выраженное при осложненном те чении ГЛПС, свидетельствует об ослаблении активности процессов фибринолиза.
ФНО и ИЛ-1 как индукторы синтеза ТАП и ИАП-1 при всех формах тяжести за болевания не проявляют положительную ассоциацию с уровнями этих регулято ров фибринолиза.
Динамика содержания маркеров структурной целостности эндотелия и репаративного ангиогенеза – ЦЭК и СЭФР а) б) Рис. 5. Содержание ЦЭК (а) в крови и концентрация СЭФР (б) в сыворотке крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекар ственной терапии. (а) * - р0,046 с поправкой FDR, + - р0,033 с поправкой FDR;
(б) * р0,025 с поправкой FDR.
Во всех исследованных группах больных обнаруживается статистически значимое повышение содержания ЦЭК, за исключением периода восстановленно го диуреза осложненной формы ГЛПС (рис. 5а). Уровень СЭФР в динамике болез ни различной степени тяжести не превышает контроль, за исключением периода полиурии среднетяжелого течения, а в лихорадочный период среднетяжелого и тяжелого неосложненного течения - статистически значимо ниже него (рис. 5б).
Корреляционная связь между уровнями ЦЭК и VE-кадгерина при ГЛПС раз личной степени тяжести преимущественно статистически значимая отрицательная (табл. 2).
Таблица Корреляционная зависимость между содержанием ЦЭК и концентрацией VE кадгерина при ГЛПС различной степени тяжести по Спирмену, R Форма заболевания Период заболевания среднетяжелая тяжелая без осложнений тяжелая с осложнениями лихорадки +0,5;
p=0,3 -0,7;
p=0,05 -0,8;
p=0, олигурии -0,8;
p=0,007 -0,7;
p=0,08 -0,8;
p=0, полиурии -0,8;
p=0,006 -0,8;
p=0,007 -0,9;
p=0, восстановленного -0,9;
p=0,004 -0,9;
p=0,001 -0,7;
p=0, диуреза Возможно, одной из причин усиленного слущивания ЭК является некоторое снижение количества экспонированных на их поверхности молекул VE-кадгерина с последующим уменьшением степени связности между ними и подлежащими слоями сосудистой стенки.
Между уровнями ЦЭК и СЭФР в динамике ГЛПС различное степени тяже сти выявляется преимущественно положительная связь слабой и средней силы, что свидетельствует о том, что СЭФР если и вовлекается в процесс восстановления интимы сосудов в острой фазе ГЛПС, то, возможно, только в слабой степени.
Одним из механизмов стимуляции эндотелиальным ростовым фактором ре парации эндотелия и регуляции проницаемости стенки сосудов является активация им интернализации VE-кадгерина с последующим уменьшением количества экс понированных молекул (Dejana E. et al., 2009). При среднетяжелом и тяжелом неосложненном течении болезни в системе СЭФР – VE-кадгерин в острую фазу болезни обнаруживается преимущественно сильная отрицательная корреляцион ная связь (табл. 3).
Таблица Корреляционная зависимость концентрациями СЭФР и VE-кадгерина при ГЛПС различной степени тяжести по Спирмену, R Форма заболевания Период тяжелая тяжелая заболевания среднетяжелая без осложнений с осложнениями лихорадки -0,9;
p=0,006 -0,3;
p=0,6 +0,3;
p=0, олигурии -0,6;
p=0,2 -0,8;
p=0,005 +0,2;
p=0, полиурии -0,8;
p=0,004 -0,9;
p=0,002 +0,3;
p=0, восстановленного +0,1;
p=0,8 +0,2;
p=0,6 -0,1;
p=0, диуреза Следовательно, продукция VE-кадгерина при этих вариантах клинического течения заболевания снижается не только как ответ на повышение синтеза VCAM 1, но и под влиянием СЭФР. Это отражает сохранение согласованности в действии этих эффекторов и отсутствие дисбаланса в их продукции. При тяжелой ослож ненной форме заболевания корреляция между ними слабая положительная, что характеризует нарастание явлений дисрегуляции в функционировании системы СЭФР - VE-кадгерин.
Практически все про- и антиангиогенные модуляторы реализуют свой эф фект путем регуляции синтеза СЭФР либо его рецепторов. Из числа антиангио генных субстанций оценены эффекты фВ (Starke R.D. et al., 2011) и АТ II, однако по мнению одних исследователей, последний стимулирует экспрессию СЭФP (Shihab F.S. et al., 2002;
Ferrara N. et al., 2003), по данным других - тормозит (Lee E.Y. et al., 2004). Среди проангиогенных регуляторов рассмотрены NO (Dulak J. et al., 2000;
Cooke J.P. et al., 2002), однако, по данным H. Kimura et al., он в условиях in vitro в малых количествах активирует продукцию СЭФР, а в больших - ингиби рует (Kimura H. еt. аl., 2003);
ИЛ-1 (El Awad B. et al., 2000;
Tanaka T. et al., 2000;
Rosell A. et al., 2009) и ЭТ-1 (Salani D. et al., 2000). Среди регуляторов ангиогенеза с явным дозозависимым эффектом выбраны ФНО (кратковременная экспозиция ЭК его малыми дозами стимулирует синтез СЭФР, а длительная и высокими коли чествами – тормозит) (Амчиславский Е.И., 2006) и ИАП-1 (в физиологических концентрациях оказывает антиангиогенный, а в высоких – проангиогенный эф фект (Loskutoff D.J. et al., 1999;
Devy L. et al., 2002). Одним из условий реализации проангиогенного эффекта СЭФР является стимуляция им синтеза ТАП (Pepper M.S. et al., 2001).
При среднетяжелой форме ГЛПС между уровнями СЭФР и фВ наблюдается отрицательная корреляция средней силы. Между СЭФР и АТ II выявляется силь ная положительная связь в первые два периода болезни (в лихорадочный период R=+0,9, р=0,0007, в олигурический – R=+0,8, р=0,005) и средняя положительная в остальные фазы болезни. Корреляционная связь СЭФР с NO, ИЛ-1 и ФНО пре имущественно отрицательная средней силы. Обнаруживается отрицательная кор реляция между ИАП-1 и СЭФР в первые два периода ГЛПС, причем статистиче ски значимая в период лихорадки (R=-0,8, р=0,006) и последующая ее смена ее на положительную. Статистически значимо низкую концентрацию ЭТ-1 в динамике болезни на фоне содержания СЭФР в пределах физиологических колебаний можно трактовать как отсутствие регуляторного воздействия пептида на синтез цитокина.
Между ТАП и СЭФР выявляется отрицательная связь средней силы.
При тяжелом неосложненном течении ГЛПС характер связей между СЭФР и регуляторами его продукции, а также корреляционные взаимоотношения в систе ме СЭФР – ТАП аналогичны таковым при среднетяжелой форме, однако связь между АТ II и СЭФР преимущественно средняя и слабая положительная, а с ИАП 1 наблюдается преимущественная разнонаправленная слабая связь.
Система взаимоотношений между модуляторами ангиогенеза и СЭФР, а также между ростовым фактором и ТАП при тяжелом осложненном течении ГЛПС практически не отличаются от других форм тяжести. Реверсии силы и знака корреляции между СЭФР и АПФ-системой при переходе от периода к периоду мо гут отражать дискоординацию в работе системы АТ II – СЭФР.
Таким образом, при ГЛПС наблюдается выраженная интенсивная деэндоте лизация сосудов и низкая активность процессов репаративного ангиогенеза, что указывает на незавершенность воспаления эндотелия к периоду восстановленного диуреза. Обнаруженные изменения содержания в крови ЦЭК и СЭФР характери зуют развитие при этом заболевании ангиогенной формы дисфункции эндотелия.
Морфологические изменения эндотелия кровеносных сосудов больных ГЛПС с тяжелым осложненным течением болезни Результаты исследования выявили выраженные особенности метаболиче ского статуса эндотелия при тяжелом течении ГЛПС с осложнениями. Для выяс нения причины и последствий этого проведено изучение у этой группы больных состояния эндотелия кровеносных сосудов на светооптическом уровне и оценка характера повреждения органелл ЭК на ультраструктурном уровне.
Изучение гистологического строения эндотелия кровеносных сосудов на аутопсийном материале больных ГЛПС проводили в сравнении с соответствую щей гистологической нормой. На всех исследованных препаратах морфологиче ского контроля эндотелий кровеносных сосудов разных типов, калибров и орган ной локализации не изменен, признаки его десквамации не обнаружены. Базальная мембрана и периваскулярная ткань также не изменены. Ультрамикроскопические изменения цитоплазмы и органелл ЭК не выявлены.
При осложненном течении ГЛПС обнаружены повреждения эндотелия кро веносных сосудов не только мелкого калибра, как следует из литературных дан ных, но также и сосудов среднего и крупного калибров.
В крупных сосудах - грудной аорте, общей сонной артерии и бедренной вене - повреждается только эндотелий. Грудная аорта подвергается полной деэндотели зации. В общей сонной артерии эндотелий также практически полностью отсут ствует, и только единичные ЭК находятся в отрыве от субэндотелиального слоя.
Эндотелий в бедренной вене практически полностью сохранен, обнаружены толь ко отдельные участки его десквамации. Гистоструктура остальных оболочек сте нок магистральных сосудов не изменена.
Выявлены существенные различия в степени повреждения эндотелиальной выстилки интраорганных кровеносных сосудов. В сосудах миокарда, коркового и мозгового вещества почек, надпочечников, печени, собственной и мышечной пла стинок слизистой оболочки желудка и пронизывающих слои стенки желудка;
сли зистой оболочки и подслизистой основы двенадцатиперстной кишки выявляются слущенные ЭК как виде целых пластов, так и по отдельности и обнажение субэн дотелиального слоя/базальной мембраны. В кровеносных сосудах головного мозга клетки эндотелия десквамируются местами, а в сосудах легких явления деэндоте лизации не обнаружены.
Найдены различия в степени повреждения интимы сосудов разного типа в пределах одного и того же органа. В артериях и артериолах эндомизия миокарда имеются признаки активного слущивания эндотелиоцитов как в виде единичных клеток, так и в виде симпластов с фрагментами субэндотелиального слоя, в то время как в капиллярах и венулах явления деэндотелизации не обнаружены. Ин тима кровеносных сосудов эпителия слизистой оболочки желудка подвергается более интенсивной десквамации, чем сосудов ее собственной и мышечной пласти нок. Таким образом, при ГЛПС эндотелий артериальных сосудов повреждается значительнее, чем венозных.
Помимо повреждения внутренней оболочки, в интраорганных кровеносных сосудах миокарда, надпочечников, коркового и мозгового вещества почек, печени, желудка, двенадцатиперстной кишки, головного мозга, обнаруживаются признаки деструкции и других оболочек. Выявляются отечность и расслоение базальной мембраны капилляров с участками фрагментации и разрывов, утолщение и рас щепление субэндотелиального слоя, гиалиноз стенок крупных сосудов, разрывы их стенки, утолщение мышечного слоя и фиброз внутренней оболочки, отек и кле точная инфильтрация стенки сосуда.
Наибольшая выраженность альтерации стенки кровеносных сосудов вплоть до их разрывов с обширными кровоизлияниями в перивазальное пространство об наруживается в кровеносных сосудах собственной и мышечной пластинок слизи стой оболочки желудка, слизистой оболочки и подслизистой основы двенадцати перстной кишки и приносящих сосудах эндомизия миокарда.
Выявляются выраженные изменения периваскулярного пространства крове носных сосудов исследованных органов, включающие выраженную отечность, очаговые кровоизлияния, явления диапедеза эритроцитов и геморрагического про питывания, очаги фиброза, инфильтрацию лимфоцитами, единичными моноцита ми, макрофагами и плазмоцитами. Обращает на себя внимание отсутствие в при лежащих к сосудам тканях выраженной лимфоцитарно-макрофагальной инфиль трации на фоне клинической картины острой вирусной инфекции и явлений син дрома системной воспалительной реакции у больных, кадаверный материал кото рых использовался для морфологического исследования. Причиной этого являет ся, по нашим данным, снижение продукции клетками эндотелия молекул VCAM-1, что обусловлено, во-первых, снятием при осложненном течении ГЛПС стимули рующего влияния ФНО и ИЛ-1 на синтез этой адгезивной молекулы, во-вторых, его обширным повреждением.
Электронно-микроскопическое исследование выявило стереотипность структурной реорганизации эндотелиоцитов, не зависящей от типа, калибра и ор ганной локализации кровеносных сосудов. Различия касаются только степени их связанности с базальной мембраной или субэндотелиальным слоем. Обнаружива ются кариопикноз и кариолизис, расширение перинуклеарного пространства, гру бая деструкция митохондрий и эндоплазматического ретикулюма, нарушение це лостности цитоплазматической мембраны, редукция рибосом, заполнение цито плазмы везикулами, вакуолями, фаголизосомами с остаточными и миелиновыми тельцами, липидными каплями. В цитозоле ЭК обнаруживаются вирионы и кри сталлические решетки как результат репродуктивной активности хантавирусов.
Включения вирусов выявляются также в толще отечной и расслоившейся базаль ной мембраны. Межклеточные промежутки расширены, определяется интерстици альный отек.
Выявленные грубые ультраструктурные изменения ЭК абсолютно несовме стимы с сохранением их метаболической активности. Это, на наш взгляд, объясня ет особый характер метаболической активности эндотелия при тяжелом ослож ненном течении ГЛПС, заключающийся в более выраженном, чем при среднетя желой и тяжелой неосложненной формах ее течения, снижении уровня в крови большинства эндотелийпродуцируемых субстанций и отсутствии определенных закономерностей в динамике изменения концентрации этих соединений в крови при переходе от одного периода болезни к другому.
Анализ ассоциации полиморфных локусов генов сосудистой системы с тяжестью течения ГЛПС Во всех изученных выборках распределение частот генотипов соответствует распределению Харди-Вайнберга (р0,05).
Различия в распределении частот генотипов и аллелей полиморфных локу сов rs5370 гена ЭТ-1 (ET-1*G5665T), rs5186 гена рецептора АТ II типа 1 (ATRII *А1166С), rs1799768 гена ИАП-1 (PAI-1*4G(-675)5G) между больными ГЛПС и серонегативными донорами, а также между группами больных различной степени тяжести статистически незначимы. Это свидетельствует об отсутствии ассоциации данных ДНК-локусов с предрасположенностью к ГЛПС и тяжестью ее течения.
Выявлено отсутствие различий в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1049970 гена VE-кадгерина (VE-cadherin* Т1550С) между больными со среднетяжелой формой ГЛПС и серонегативными донорами. В груп пе больных с тяжелым течением ГЛПС наблюдается статистически значимое уве личение частоты минорного генотипа *T/*T (рис. 6).
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% OR=10. *+ 20% OR=6. *+ 10% 0% *C/*C *C/*T *T/*T *C *T серонегативные доноры среднетяжелая форма тяжелая форма без осложнений тяжелая форма с осложнениями Рис. 6. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1049970 гена VE-кадгерина (VE-cadherin*Т1550С) у больных ГЛПС различ ной степени тяжести и серонегативных доноров. p0,05 по сравнению: * - с се ронегативными донорами;
+ - с больными со среднетяжелой формой.
Так, при тяжелой неосложненной форме частота встречаемости этого гено типа составляет 7,4%, что статистически значимо выше значений для контроля – 1,3% (2=6,4, p=0,04, df=2) и группы больных со среднетяжелой формой – 1,1% (2=7,71, p=0,021;
df=2;
OR=6,8;
CI95%=2,89-14,79). У больных с тяжелым ослож ненным течением ГЛПС данный генотип встречается еще чаще - в 11,1% случаев, что также статистически значимо отличается как от группы серонегативных доно ров (2=10,4;
p=0,006;
df=2;
OR=10,8;
CI95%=3,71-24,05), так и от выборки боль ных со среднетяжелым течением болезни (2=12,1;
p=0,002;
df=2;
OR=10,8;
CI95%=1,8-83,9). Следовательно, генотип *Т/*Т гена VE-кадгерина является гене тическим маркером, ассоциированным с тяжелым течением ГЛПС. Наличие у больных с тяжелой формой болезни этого генотипа гена кадгерина, снижение про дукции адгезивной молекулы, выраженная десквамация эндотелия и сильная от рицательная корреляция между уровнями ЦЭК и адгезивной молекулой позволяют предположить, что у данной группы больных имеется предрасположенность в об легченному слущиванию ЭК как результат синтеза кадгерина с измененной пер вичной структурой из-за наличия миссенс-мутации c.1550TC в его гене.
Таким образом, на основании результатов исследования метаболического статуса эндотелия в динамике ГЛПС различной степени тяжести, вероятности ге нетической предрасположенности особенностей его реагирования на первичное воздействие хантавируса Puumala, гистоструктуры эндотелия кровеносных сосу дов разного типа, калибра и органной локализации предлагается концепция пато генеза ГЛПС как «болезни эндотелия». Ключевую роль в патохимических меха низмах развития ГЛПС играет изменение метаболической активности сосудистой интимы, ведущее к активации эндотелиоцитов, их повреждению и последующей деэндотелизации кровеносных сосудов с развитием генерализованной эндотелио патии, выраженность которой прямо коррелирует с тяжестью течения болезни.
При ГЛПС развивается вазомоторная форма дисрегуляции функции сосуди стой интимы, проявляющаяся в изменении продукции ЭТ-1, NO и АПФ. Эти суб станции во взаимосвязи друг с другом оказывают влияние на величину среднего АД и обусловливают его значительные колебания в динамике болезни. Домини рующим фактором, влияющим на системный тонус сосудов при ГЛПС, является АПФ. NO при избыточной продукции способен окисляться в пероксинитрин анион, обладающий свойствами мощного вазоконстриктора, и это, по нашему мнению, может играть определенную патогенетическую роль в повышении си стемного тонуса сосудов. Вазоконстрикция, наблюдаемая практически на всем протяжении болезни, результируется в развитии циркуляторной гипоксии с нару шением оксигенации тканей. Вероятно, ЭТ-1 в низкой концентрации и NO вносят вклад только в локальную вазодилятацию мелких сосудов с повышением их про ницаемости. Это усиливает выраженность синдрома капиллярной утечки с после дующим усугублением гемодинамических расстройств.
ГЛПС сопровождается развитием адгезионной формы дисфункции эндоте лия, которая является не только важным элементом синдрома системной воспали тельной реакции, но и усугубляет патологические явления, связанные с вазомо торной дисфункцией сосудистой интимы. Снижение продукции VE-кадгерина как этапа процесса экстравазации лейкоцитов ведет к снижению степени связности ЭК между собой, формированию межклеточных пор и, как следствие, – повышению проницаемости сосудов с усилением плазморрагии. Уменьшение синтеза этой ад гезивной молекулы способно не только усугубить процесс капиллярной утечки, но и усилить деэндотелизацию кровеносных сосудов с обнажением субэндотелиаль ного слоя/базальной мембраны, и, следовательно, повысить тромбогенность сосу дистой стенки. Повышение продукции VCAM-1 при среднетяжелой и тяжелой неосложненной формах ГЛПС как ответ на стимуляцию ЭК со стороны ФНО и ИЛ-1 и адгезивности сосудистой интимы для лейкоцитов под действием фВ под держивают ее воспаление на всем протяжении болезни. С этих позиций снижение синтеза VCAM-1 при тяжелом осложненном течении ГЛПС ассоциируется с не благоприятным прогнозом.
Многократные циклы репродукции хантавируса внутри ЭК сопровождаются повреждением значительной их части. Вторичными факторами повреждения ЭК, усиливающими первичное альтеративное действие вируса, являются ФНО, АТ II и активные формы кислорода, включая пероксинитрит-анион. Продукция этих со единений при всех формах тяжести ГЛПС повышена. Все это вкупе с некоторым снижением продукции/экспонирования молекул VE-кадгерина результируется в отслоении поврежденных клеток интимы кровеносных сосудов и появлением их в сосудистом русле в виде ЦЭК. Их количество в периферической крови коррелиру ет с тяжестью течения болезни. По данным гистологических исследований, при осложненном течении ГЛПС эндотелий отслаивается как целыми пластами, так и в виде симпластов с фрагментами субэндотелиального слоя. Это создает условия для активации реакций коагуляционного гемостаза. С одной стороны, нарушение структурной целостности ЭК (как было показано нами при электронно микроскопическом исследовании) ведет, по литературным данным, к высвобожде нию тканевого фактора, и это является пусковым моментом активации «внешнего»
пути свертывания крови. С другой, - обнажение базальной мембраны/субэндоте лиального слоя сопровождается экспонированием тромбогенных субстанций, и, прежде всего, коллагена IV типа, с последующей активацией «внутреннего» пути свертывания крови. С третьей, - повреждение плазматической мембраны слущен ных ЭК результируется в экспонировании мембранных фосфолипидов, которые являются дополнительными сайтами для активации процесса свертывания крови по хагеманзависимому пути. Помимо этого, повреждение и воспаление эндотелия всегда сопровождаются повышением его прокоагулянтного потенциала.
При ГЛПС, помимо коагуляционного, активируется еще и сосудисто тромбоцитарный гемостаз, поскольку морфологически выявляются обнажение ба зальной мембраны/субэндотелиального слоя и разрывы стенки мелких кровенос ных сосудов. Все перечисленное вкупе с усилением прокоагулянтных свойств функционально активной части эндотелия из-за развития в ней воспалительной реакции сопровождается снижением активности системы фибринолиза в виде торможения продукции ТАП и ИАП-1, которое тем более выражено, чем тяжелее протекает заболевание и обширнее повреждение эндотелия. Это состояние, харак теризуемое как гемостатическая форма дисрегуляции функции эндотелия, при среднетяжелой форме ГЛПС выражено незначительно в силу низкой степени де сквамированности сосудистой интимы и сохранения баланса в функционировании исследованных компонентов системы фибринолиза. Тяжелая форма болезни со провождается большей выраженностью геморрагических явлений из-за более ин тенсивного слущивания эндотклиоцитов и высокой степени их альтерации. Одна ко, несмотря на это, при тяжелой неосложненной форме болезни все же выявляет ся тенденция к сохранению баланса в функционировании системы фибринолиза.
При тяжелом осложненном течении ГЛПС коагуляционные расстройства приобретают крайнюю степень выраженности вплоть до развития ДВС-синдрома и обширных кровоизлияний в органы и ткани и наружных кровотечений, что обу словлено нарастающей структурно-функциональной несостоятельностью эндоте лия и, как результат, - дезинтеграцией в функционировании системы гемостаза.
Нарушение проходимости сосудов из-за формирования тромботических масс, со стоящих из гемостатических пробок и десквамированных эндотелиоцитов, ведет к нарушению кровоснабжения органов и тканей, что клинически результируется в виде синдрома полиорганной недостаточности. Кроме того, если учесть, что диа метр капилляров составляет 2-15 мкм, а диаметр десквамированного эндотелиоцита – 30-50 мкм, можно предположить, что эти клетки при их значи тельном количестве и отслоении их целыми симпластами даже с фрагментами субэндотелия могут быть самостоятельной причиной нарушения проходимости сосудов микроциркуляторной сети. Этот фактор, на наш взгляд, приобретает осо бое значение в нарушении кровоснабжения органов с достаточно развитым мик роциркуляторным руслом – почек, надпочечников, печени, миокарда, гипофиза, стенки желудка и кишечника и др.
Патологические процессы, развивающиеся на уровне эндотелия при всех формах тяжести ГЛПС, остаются незавершенными вплоть до периода восстанов ления диуреза, поскольку продукция субстанций, ответственных за его репарацию, остается сниженной. Усиленная десквамация не сопровождается реакцией повы шения образования СЭФР из-за обширного повреждения эндотелия как основного его продуцента и дисбаланса в синтезе про- и антиангиогенных модуляторов син теза ростового фактора с существенным преобладанием вторых.
Выявленные морфологические изменения внутренней выстилки кровенос ных сосудов различного типа, калибра и органной локализации могут быть оха рактеризованы как признаки альтеративно-деструктивного панваскулита. Харак тер и выраженность повреждения эндотелия и наличие разрывов сосудистой стен ки, изменения перивазального пространства неизбежно должны сопровождаться сдвигами метаболической и функциональной активности различных органов и тканей. С одной стороны, обнажение субэндотелиального слоя /базальной мем браны на значительном протяжении обеспечивает появление обширного поля для активации реакций коагуляционного гемостаза. С другой стороны, при отслоении эндотелия в виде целого пласта не представляется возможным сохранение ее функциональной активности как органа. С третьей, - частичное или полное слу щивание эндотелия - естественного динамического барьера, в норме осуществля ющего хорошо сбалансированную регуляцию проницаемости сосудов, является одним из факторов повышения их проницаемости при ГЛПС. С четвертой, - выра женное повреждение эндотелия кровеносных сосудов несовместимо с адекватной тканевой перфузией, что, по нашему мнению, является одной из причин развития при ГЛПС синдрома полиорганной недостаточности.
Описанный комплекс изменений метаболической активности сосудистой интимы во взаимосвязи с ее структурным повреждением и возможной генетиче ской предрасположенностью к развитию тяжелой формы болезни, являющейся ос новой предложенной концепции патогенеза ГЛПС как «болезни эндотелия», пред ставлен в виде обобщенной схемы на рисунке 7.
ВЫВОДЫ 1. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом характеризуется выражен ными изменениями метаболического статуса эндотелиоцитов, приводящими к сдвигам в вазомоторной, адгезионной, гемостатической и ангиогенной активности сосудистой интимы и определяющими тяжесть клинического течения заболевания.