Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен- 2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях
ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА
На правах рукописи
ВОДОВОЗОВА
Елена Львовна
ФОТОАФФИННЫЕ ЛИПИДНЫЕ ЗОНДЫ С ДИАЗОЦИКЛОПЕНТАДИЕН-
2-ИЛКАРБОНИЛЬНОЙ МЕТКОЙ: СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В
МЕМБРАННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
03.00.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва – 2007
Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович доктор биологических наук, Торховская Татьяна Ивановна
Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится “ 10 “ октября 2007 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) по адресу: 117997, В-437, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН.
Автореферат разослан ““ сентября 2007 года
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук, профессор В.А. Несмеянов Актуальность темы. Метод фотоаффинного мечения (photoaffinity la beling, PAL) широко применяется в структурно-функциональных исследова ниях биологических систем. Он позволяет получить прямые доказательства пространственной близости молекулярных компонентов. Зонд, аналог при родного вещества, несущий фотофор (фотоаффинную фотоактивируемую фотореактивную метку), вводят в изучаемую систему и подвергают облуче нию. При фотолизе метки образуется высокореакционноспособный интерме диат – карбен, нитрен, бирадикал и др. – способный ковалентно связываться (сшиваться) с ближайшим фрагментом биомолекулы. Для детектирования продуктов реакции – модифицированной макромолекулы и, в конечном счете, участка ее модификации – зонд должен содержать репортерную группу (ра диоактивную, хромофорную, флуоресцентную, иммунореактивную). В итоге возможно определить, например, аминокислотные остатки (а.о.) белка, вхо дящие в контакт лигандом. Для получения такой информации чаще всего применяют рентгеновскую кристаллографию (РСА) и ЯМР высокого разре шения. Сейчас эти мощные методы анализа поддержаны технологиями полу чения рекомбинантных ДНК, которые позволяют получать миллиграммовые количества полипептидов и полинуклеотидов. Однако такой анализ невозмо жен или крайне затруднен в целом ряде случаев: при изучении комплексов транскрипционных факторов, рибосом, белков в составе везикул, локальных структурных образований цитоскелета и интегральных сигнальных комплек сов. Здесь PAL является важнейшим методом идентификации субъединиц и картирования активного центра, наряду и в дополнение к исследованиям с помощью точечного мутагенеза и связывания моноклональных антител. Глав ное преимущество PAL состоит в том, что оно применимо к нативным белкам.
Роль биологических мембран и липид-белковых комплексов в функцио нировании клетки и организма в целом сложно переоценить. Наряду с физи ческими методами изучения строения мембран – электронной микроскопией, спектроскопией ЯМР, применением ЭПР- или флуоресцентных зондов, – а также химическими – с использованием моно- и бифункциональных реаген тов, разработан метод исследования мембран с помощью фосфолипидных фо тоаффинных зондов (Khorana H.G., 1975;
Stoffel W., 1978;
Brunner J., 1980).
Развитие этого метода путем поиска новых высокочувствительных фотофоров и синтеза на их основе липидных зондов – актуальная задача мембранологии.
Требования, предъявляемые к фотофорам, включают: инертность в от сутствие актиничного света;
активацию в условиях, не разрушающих компо ненты биологической системы;
малое время жизни (меньше времени жизни лиганд-рецепторного комплекса) и высокую реакционную способность воз бужденного состояния;
минимальный размер;
доступность, то есть неслож ность синтеза. Зонд должен содержать репортерную группу, наличие которой существенно облегчает подготовку и анализ образцов даже при использова нии современных масс-спектрометрических (MS) методов идентификации продуктов PAL (Jahn O., 2004;
Kotzyba-Hibert F., 2006). В качестве фотофоров в мембранных исследованиях чаще всего применялись арилазиды и фенил диазирины. Первые довольно легко синтезировать, и они фотолизуются в мяг ких условиях, однако генерируемые при этом нитрены имеют невысокую ре акционную способность. Фенилдиазириновая и п-(3-трифторметилдиазири но)фенильная (Tfd) группы при фотолизе образуют высокоактивные карбены, но синтезы соединений, меченных этими фотофорами, трудны.
Домены мембраносвязанных белков и участки апобелков в липид белковых комплексах, контактирующие с гидрофобными зонами, обогащены неполярными а.о. Эффективное мечение этих областей возможно лишь при использовании фотофоров, реагирующих даже с неактивированными СН связями. Наше внимание привлекла диазоциклопентадиен-2-илкарбонильная (Dcp) группа. Синтез исходного соединения для ее введения – 2-диазоцикло пентадиенкарбоновой кислоты – не представляет большой трудности (Martin J.C., Bloch D.R., 1971). До наших работ Dcp-группа лишь однажды применя лась для создания зондов, причем нелипидной природы (Nielsen P.E., 1983).
Впервые синтез 14С- и 3H-меченых фосфатидилхолинов (РС) и сфингомиели нов, несущих Dcp-группу в -положении жирнокислотной цепи, был осуще ствлен в ИБХ РАН (Карюхина М.О., 1988) с использованием подходов, разра ботанных для зондов с 2-нитро-4-азидофенильной (Nap) меткой [2-8]. Сравне ние способности зондов, несущих в sn-2-положении остатки N-Nap-амино ундекановой и N-Dcp-аминододекановой кислот, ковалентно связываться с [14С]дипальмитоил-РС или [14С]холестерином в везикулах из димиристоил-РС, подтвердило более высокую активность Dcp-метки.
Цель исследования. Целью настоящей работы явились детальные ис следования фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы, разработка и усовершенствование методов синтеза разнообразных липидных зондов на ее основе, разработка метода получения зондов, содер жащих удобный в работе высокоактивный радионуклид (125I).
Другой важнейшей задачей было применение полученных зондов для изучения ряда мембранных биологических систем как с целью доказательства эффективности PAL с использованием Dcp-фотофора, так и для получения новых данных об организации различных липид-белковых комплексов. Дан ная часть работы проведена в сотрудничестве с коллегами из различных лабо раторий ИБХ РАН, а также других исследовательских учреждений.
Научная новизна и практическая ценность. Диссертация суммирует результаты оригинальных разработок и синтезов, которые формируют новое направление в рамках развития метода фотоаффинного мечения.
В настоящей работе впервые детально исследованы фотохимические свойства Dcp-группы. Показано, что она является высокоэффективной карбен генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, вы сокой реакционной способности и мягким условиям фотолиза известные и широко применяемые фотофоры [17,22,35,41,45].
Осуществлены синтезы новых 14С-меченых РС-зондов для мембранных исследований, содержащих Dcp-группу при концевом атоме углерода ациль ных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной голов ной группы. С помощью этих зондов исследована топография цитохрома Р 2В4 в мембране. Полученные данные хорошо коррелируют с результатами конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публи кациями авторов, применивших другие методы исследований [9,32].
В ходе разработки синтезов 14С-меченых зондов найден новый основ ный катализатор – 4-аминопиридин (4PyNH2) – для проведения реакции О ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических рас творителей. Применение 4PyNH2 в синтезах фосфо- и гликолипидов позволяет существенно увеличить выход при ацилировании малореакционноспособной вторичной ОН-группы глицерина, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых, дорогостоящих или нестабильных соединений [10-14,27,31,33].
Обнаружена способность Dcp-группы легко подвергаться иодированию в стандартных условиях окислительного процесса. Показано, что при этом фотохимическая активность сохраняется, и заметной потери иода при фотоли зе не происходит. Найденные свойства превращают Dcp-метку в высокоэф фективный и удобный в применении фотофор, который позволяет осуществ лять синтез нерадиоактивных зондов, а высокоактивный нуклид 125I вводить в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением. Положение радиоизотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов PAL. Эф фективность применения 125I-меченого Dcp-фотофора для зондирования мем бранных систем подтверждена на хорошо изученной биологической модели – вирионе гриппа [17,22,35,41,45].
Разработан синтез алифатической кислоты, несущей при -углероде Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь. Целевыми био молекулами в структурных исследованиях с применением PAL чаще всего яв ляются белки, и наличие сложноэфирной связи, лабильной в щелочной среде в отличие от пептидной, должно облегчить анализ продуктов фотомечения хро матографическими и MS методами. Кислота служит синтоном при получении различных зондов для изучения неполярной области липидного бислоя. Син тезирована и максимально короткая карбоновая кислота (в виде активирован ного эфира) с Dcp-оксигруппой, с помощью которой можно получать зонды для мечения полярных областей мембран и других биологических систем [22].
Новые ганглиозидные зонды [22,23,41], синтезированные на основе ли зоганглиозида GM1 и несущие 125I-Dcp-фотофор в ацильной части церамидно го остатка на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы применены для исследования взаимодействия различных субъединиц цитоки новых рецепторов с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах. По лучены сведения, важные для понимания механизма сборки рецептора интер лейкина-2 и проведения сигнала внутрь клетки [29,44].
С помощью нового зонда, несущего 125I-Dcp-фотофор в олигосахарид ной части молекулы ганглиозида GM1 вместо ацетила в остатке сиаловой ки слоты, определены фрагменты молекулы интерлейкина-4, взаимодействую щие с ганглиозидом. Исследования проведены в рамках изучения молекуляр ных механизмов иммуносупрессии ганглиозидами. Полученные данные в пер спективе могут быть использованы при создании пептидов для цитокинотера пии различных заболеваний [46].
Впервые для идентифицикации субъединиц мембранного субкомплекса F0 митохондриальной H+-АТР-азы, непосредственно контактирующих с липи дами мембраны, применен фотоаффинный фосфатидилхолин. Для многосубъ единичного интегрального белка MS метод анализа продуктов PAL липидным зондом был использован впервые [21,24,37,38].
В рамках изучения механизма взаимодействия потенциальных носите лей противоопухолевых препаратов – липосом, несущих углеводные детерми нанты – с клетками опухолей [14-16,18-20,26,30,31,34,36,39,40,42,43,48-52], разработан синтез неогликолипидных конъюгатов с Dcp-фотофором, предна значенных для встраивания в липидный бислой липосом [25]. Зондирование I-Dcp-мечеными липосомами показало, что на поверхности исследованных опухолевых клеток действительно есть рецепторы (предположительно, лекти ны), опосредующие взаимодействие с липосомами, оснащенными различными углеводными лигандами [28,47].
Результаты данной работы показывают, что диазоциклопентадиен-2 илкарбонил, будучи компактной, доступной, стабильной в отсутствие акти ничного света и фотолизующейся в мягких условиях меткой, кроме того обла дает высокой реакционной способностью наряду со свойством подвергаться прямому введению 125I, что обеспечивает удобство получения зондов и высо кую чувствительность метода. Указанные качества превращают Dcp-фотофор в ценный инструмент для биологических исследований.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 229 стр. текста.
Она состоит из введения, обзора литературы «Метод фотоаффинного мечения и его примение в структурно-биологических исследованиях», 10 глав, посвя щенных результатам и их обсуждению, экспериментальной части и выводов.
Работа иллюстрирована 41 рисунком, 16 схемами и 7 таблицами. Список ци тированной литературы включает 370 наименований.
1. Изучение фотохимических свойств Dcp-группы Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты (DcpOH) 1 осуществляли как описано (Martin J.C., 1971) (Схема 1). Кислоту 1 отделяли от 3-диазоцик лопентадиенкарбоновой кислоты 1 хроматографией на силикагеле. В отсутст вие УФ-облучения DcpOH может храниться годами, устойчива к действию мягких кислот и щелочей, надуксусной кислоты и других окислителей. Dcp Меченый жирный ацил реагирует с циклогексаном и iPrOH, и внедряется в Эффективность диазоциклопентадиен-3-илкарбонильной группы как фотофора сущест венно ниже, чем Dcp-группы (Nielsen P.E., 1983).
COOH 1. CO2 / -20 -30oC Na / iPrOH COOH + 2. H + Na SiMe3Cl / Py COOSiMe COOSiMe COOSiMe TosN3 / Pip COOH COOSiMe H2O + + COOH COOSiMe N N N N ~ 1.7 : Схема 1. Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты (1).
СН-связи в модельных мембранах (Карюхина, 1988). Продукты пришивки ре гистрировались молекулярными пиками MS, либо радиоактивностью на пла стинках ТСХ. Мы поставили задачу определить структуру аддукта Dcp-содер жащей молекулы с С6Н12 и получить количественные характеристики реакции фотолиза в циклогексане. Cпособность к внедрению в неактивированные СН связи – показатель максимальной реакционной способности фотофора.
При фотоактивации диазоциклопентадиен образует циклопентадиени лиден, карбен, основным состоянием которого является триплетное. Однако химические реакции в растворах протекают на базе синглетного состояния, и внедрение в СН-связи происходит очень эффективно (Ando W., 1973). Ход фо толиза зонда минимального размера DcpOMe (2) представлен на Рис. 1. Время полужизни (t1/2) диазогруппы в указанных условиях 30 сек. После фотолиза к раствору добавляли С6D12 и регистрировали спектр 1Н-ЯМР, с последующим анализом методом двойного резонанса (Рис. 2). С максимальным выходом об разовался самый неполярный продукт (ТСХ). Мы интерпретировали единст венный основной продукт (кроме смолы) как структуры 3а или 3б (Схема 2).
Положение сигнала протона циклогексила Н1 в очень слабом поле (3. м.д.) подтверждено двойным резонансом на соседних циклогексильных про тонах в сильном поле (1.53 м.д.) при изучении спектров в d4-метаноле.
О существовании изомеров по двойным связям замещенных циклопен тадиенов сообщалось ранее (Mironov V.A., 1963). Изомеры находятся в термо Рис. 1. Фотолиз DcpOMe 2 в циклогексане (6 мМ);
нм. Облучение светом ртутной лампы среднего давления мощности 30 Вт (макс 365 нм) на расстоянии 7 см, свето фильтр – стекло Пирекс.
_ Рис. 2. Спектры 1Н-ЯМР (C6D12) DcpOMe 2 до (верхний) и после (нижний) фо толиза в циклогексане;
фотолиз проводился до 80%-ной конверсии. Спектр не изменялся при хранении раствора несколько сут при 4 С.
динамическом равновесии;
их соотношения зависят от характера заместите ля(ей) 2 ;
переходы происходят путем переноса Н от С5 к соседнему С-атому.
COOMe COOMe COOMe a H H COOMe N 2 3a 3б Схема 2. а) h, 300 нм, 3 мин, циклогексан.
Например, метилциклопентадиенкарбоксилат представлен в основном 1,3-диеном (в на шем случае структура 3б).
При соотнесении интегральных интенсивностей сигналов эфира 2 до и после фотолиза продукт внедрения в СН-связь составил 42%. Фотолиз Tfd производного в C6Н12 дает ряд соединений, среди которых продукт внедрения в СН-связь – 58% для 2 мМ раствора и 28% для 30 мМ (анализ ГЖХ) (Brunner J., 1995). Следовательно, по реакционной способности карбены, генерируемые Dcp-группой и Tfd-меткой, признанной лучшим фотофором, сравнимы. Важно и то, что молярная экстинкция Dcp-группы (~16000, =314 нм) существенно выше, чем Tfd (~300, =353 нм;
t1/2 25 сек при облучении 3 мМ раствора в C6H12 ртутной лампой 450 Вт на расстоянии 4 см (Brunner J., 1980)). Этот факт делает Dcp-группу более привлекательной в качестве фотофора для изучения динамических и высоколабильных систем.
2. Синтез 14С-меченых 3 фосфолипидных зондов, содержащих Dcp-группу Мы поставили задачу оптимизации всех стадий синтеза Dcp-фосфоли пидов. Для синтеза длинноцепных зондов использовали разработанную ранее схему [2,3] (Схема 3). На заключительной стадии кислота 8 вводится в реак цию конденсации с лизо-РС или сфингозин-1-фосфохолином в присутствии DCC 4 и катализатора (DMAP, PPy, 4-пиперидинопиридин). В зависимости от реакционной способности OH- или NH2-группы и основности катализатора, ацилирующий интермедиат – О-ацилизомочевина – необратимо перегруппи ровывается в N-ацилмочевину, побочный продукт реакции. Сфингоидная NH2-группа реагирует довольно эффективно;
замена хроматографии на сили кагеле 5 гель-фильтрацией на липофильном сефадексе и разделением на обра щенной фазе позволила повысить выход сфингомиелина 10 до 60% (в 2 раза) при эквимольном количестве кислоты 8. Ацилирование же ОН-группы, осо бенно вторичной, протекает гораздо медленнее. Оптимизация этой реакции – важная задача в химии липидов, т.к. модифицированные фосфолипиды (фос фатидилэтаноламин, фосфатидилинозит и т.д.) обычно получают из РС фер ментативной переэтерификацией. Известные методы ацилирования втор-ОН 3 С-Меченые соединения мало подвержены радиолизу и имеют высокую эффективность жидкостно-сцинтилляционного счета, в отличие от 3Н-меченых.
Сокращения: DCC – дициклогексилкарбодиимид, DMAP – 4-диметиламинопиридин, PPy – 4-пирролидинопиридин, SDS-PAGE – электрофорез в полиакриламидном геле с до децил-сульфатом натрия, ТЕА – триэтиламин, DMSO – диметилсульфоксид, DMF – диме тилфор-мамид, TFA – трифторуксусная кислота.
Необратимая сорбция микромолярных количеств веществ на силикагеле в случае Dcp-ме ченых соединений усиливается темновой реакцией пришивки больше, чем Nap-меченых.
а,б COO Ca COOH N[14C] I в,г COOMe H2N[14C] д OH Cl O N2 O N е,ж,з H COOH N [14C] O N и + N O O OPO n O O к O H N [14C] O n = 1 (~72%) n = 3 (~28%) O N HO H O + N OPO H NH O H N [14C] O O N Схема 3. а) K[14C]N;
б) HCl;
в) Н2/Pt;
г) МеОН/HCl;
д) SO2Cl/Na2CO3;
е) DcpCl + 6/TEA;
ж) КОН, iPrOH-H2O;
з) HCl;
и) лизофосфатидилхолин, DCC/DMAP;
к) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP.
группы не лишены недостатков (низкие выходы, необходимость избытка про изводных жирных кислот). Развитие получил метод синтеза сложных эфиров глицерофосфолипидов из ангидридов кислот в присутствии DMAP (Khorana H.G., 1977). Но и применение более сильного катализатора PPy требует неко торого избытка ангидрида: в пересчете на саму жирную кислоту – более 2 экв.
Вариант, где лизо-РС, жирная кислота (небольшой избыток), DCC и катализа тор реагируют в 1 стадию дает приемлемые (20-50%), но маловоспроизводи мые выходы целевого РС (Молотковский Юл.Г., 1982).
Мы нашли, что введение 5-ти и более экв. PPy (но не DMAP) существен но ускоряет ацилирование лизо-РС [14С]пальмитиновой кислотой. Эффект был обусловлен примесным веществом в препарате фирмы Fluka – 4-аминопири дином (4PyNH2), который является побочным продуктом синтеза PPy. Сложно представить, чтобы соединение с первичной NH2-группой катализировало ре акцию ацилирования по ОН-группе. Однако показано (Joule J.A., 1972), что ацилирование 4PyNH2 проходит через стадию образования высокореакцион носпособного енамида по эндоциклическому атому N. Мы полагаем, что в ре зультате быстрого 1-N-ацилирования 4PyNH2 О-ацилизомочевиной образует ся енамид (*) (Схема 4), который и ацилирует гидроксил субстрата.
+ NH NH2 NH PPy или 4PyNH DCC CH3(CH2)1414COOH + - H+ N N N 14 CO CO CH3(CH2)14 CH3(CH2) (*) лизо-РС 4PyNH + N O NH14CO(CH2)14CH O OPO n O O O C N n = 1 (~72%) O n = 3 (~28%) (**) [14C]PC Схема 4. Механизм катализа O-ацилирования 4PyNH2 в присутствии DCC.
Данный механизм подтверждается тем, что катализ происходит лишь при вве дении избытка 4PyNH2 или его сочетания с более сильным основанием PPy (Табл. 1), что должно вызывать ускорение образования енамида. Побочный продукт при избытке 4PyNH2 более 4-5 экв. – продукт необратимой перегруп пировки енамида (*) в амид (**). Вещество выделено (FAB-MS: 334 [M]+).
Применение 4PyNH2 для получения зонда РС 9 (стадия и, Схема 3) дало увеличение выхода до 54% (против 17%). Первичный же гидроксил 1,2-дигли церида ацилируется количественно в присутствии 4PyNH2 в течение минут.
Синтез 14С-меченого РС 12, несущего Dcp-группу на близком расстоя нии от полярной головки, осуществляли на основе [1-14C]глицина (Схема 5).
Первый вариант (стадии а,б,в,г) – ацилирование лизо-РС Вос-[1-14C]глицином Таблица 1. Выходы [14C]PC при аци Время реакции, ч Катализатор лирования лизо-РС [14C]пальмитино 2 17 вой кислотой в присутствии DCC и PPy (5 экв.) 12 30 32 катализаторов.а_ а Из 2 мкмоль лизо-РС и экв. количества 4PyNH2 (5 экв.) 66 72 [ C]пальмитиновой кислоты после очи PPy (2.5 экв.) + 59 73 75 стки реакционной смеси гель-фильтра 4PyNH2 (2.5 экв.) цией и хроматографией на RP-18 полу 4PyNH2 (1 экв.) 3 3.5 3. чен [14C]РС (Схема 4) с выходом 58% в присутствии DCC и 4-пиперидинопиридина с последующим деблокировани ем и введением фотофора на последней стадии – дал выход РС 12 менее 1%.
Тогда мы применили схему синтеза РС 9 (стадии д,е,ж,з,и;
Схема 5). Пони женная активность производных -аминокислот и стерические трудности взаимодействия в положении sn-2 обусловили лишь 50% конверсию при аци лировании лизо-РС в присутствии 4PyNH2/PPy. РС 12 дополнительно очища ли хроматографией на Al2O3, так как зонд по размерам и гидрофобности мало д,е ж,з H 14 H2N COOH COOMe N O N а,б + N O O OPO и n O O O H C N O O в,г O + N O O OPO n O O O H n = 1 (~72%) C N n = 3 (~28%) O O N Схема 5. а) Boc2O;
б) лизо-РС, DCC/4-пиперидинопиридин;
в) TFA;
г) DcpOH, DCC/4-пиперидинопиридин;
д) МеОН/HCl;
е) DcpCl/TEA;
ж) КОН, iPrOH H2O;
з) HCl;
и) лизо-РС, DCC/4PyNH2+PPy.
отличается от лизо-РС. Тем не менее, выход в 26% на этой стадии в 3 раза больше наших прежних результатов;
выход, исходя из [1-14C]глицина, – 12 %.
3. Изучение топографии цитохрома Р-450 2В4 в мембране Среди биологических катализаторов цитохром Р-450 (CYP) – универ сальная гемсодержащая монооксигеназа – не имеет себе равных по множеству изоформ, индукторов, субстратов и типов катализируемых реакций. Полипеп тидная цепь мономерного гемопротеина (44–60 кДа) содержит 45–55% непо лярных а.о. Среди мембранных ферментов CYP изучены наиболее тщательно, но относительно их топологии в липидом бислое полной ясности ко времени нашей работы не было. Мембранные CYP на N-концевом фрагменте цепи не сут короткий гидрофобный участок от 12 до 21 а.о. Он выполняет роль якор ного пептида и содержит сигнальную последовательность, ответственную за встраивание белка в мембрану. За ним расположена стоп-сигнальная последо вательность (а.о. 18-29 для CYP2В4), останавливающая встраивание пептида.
Были приняты минимум две модели ориентации в мембране микросомального CYP, построенные на основании расчета конформаций цепи с учетом вторич ной структуры и гидрофобности, или по результатам трипсинолиза CYP2В4 в протеолипосомах, а также мечения сайт-специфическим флуоресцентным реа гентом и моноклональными антителами к а.о. стоп-сигнального пептида. Об щим было то, что большая часть гемопротеина находится вне липидного бис лоя эндоплазматического ретикулума (ЭР): субстрат-связывающий участок контактирует с липидами, а гем расположен параллельно плоскости мембраны между двумя спиральными высококонсервативными последовательностями 287-307 и 435-466, связанными с поверхностью мембраны. Отличия были в организации мембраносвязанного N-концевого фрагмента: в одной модели предполагался трансмембранный якорь в виде спиральной шпильки из первых ~46 а.о., пронизывающей мембрану, где N-конец локализуется на цитоплазма тической стороне ЭР (Nelson D.R., 1988), а в другой – один трансмембранный пептид с выступающим в просвет ЭР N-концом (Vergeres G., 1991).
Мы сопоставили эти модели с результатами зондирования микросо мального CYP2В4 (491 а.о., ~49 кДа) в протеолипосомах, сформированных из яичного РС и фосфолипидов, несущих фотофоры на различном расстоянии от полярных головок (РС-зонд, 9:1): Dcp-PC-зондов 9 и 12, и короткоцепного Nap-сфингомиелина 13, синтезированного нами ранее. После облучения про теолипосомы разрушали детергентом HO H O + N 10 (SDS) и освобождали от несвязаших OPO H NH O ся ковалентно липидов экстракцией H C N O органическими растворителями. Де 13 N3 натурированный белок растворяли в O2N 70%-ной НСООН и обрабатывали BrCN. Лиофилизованную смесь пептидов растворяли в 30% НСООН в iPrOH и подвергали пред-ВЭЖХ на колонке с фазой Superose 12 в той же системе.
Хроматограммы приведены на Рис. 3a-c. Связывающий участок для РС 9, зон дирующего неполярную область мембраны, представлен узким пиком (Рис.
3a). В случае РС 12 и сфингомиелина 13 (Рис. 3b и 3c, соответственно), несу щих фотофоры вблизи от поверхности мембраны, видны три разделяющихся пика. На колонку наносили равные количества белка (~ 7 мг), следовательно PAL заглубленным в мембрану фотофором прошло наиболее эффективно (до 6000 имп/мин). В обоих случаях PAL у поверхности большая часть липидов (до 2000 имп/мин) связывалась с сегментом, локализованным в последова тельности 273-313 (первый из трех меченых пиков на Рис. 3b и 3c). Два других участка связывания включали 700-1200 имп/мин. Эффективность PAL для зондов 12 и 13 мало отличалась, вероятно, из-за тушения карбенов и нитренов водой, содержащейся в приповерхностной зоне мембран. Далее анализирова ли фракции с наибольшей радиоактивностью: их разделяли на колонке Ul trapore C3RSC (Рис. 3d-f). Пептиды идентифицировали по последовательности 5-ти N-концевых а.о. Единственным пептидом, меченным зондом РС 9 ока зался N-концевой фрагмент 1-46 (Рис. 3d). Зонды 12 и 13 (Рис. 3e и 3f) метили одни и те же пептиды: 273-314, 427-491 и 1-46 – 1-й, 2-й и 3-й пики радиоак тивности, соответственно. Три липидных зонда связывались лишь с тремя пептидами. Следовательно, большая часть полипептидной цепи CYP2В4 экс понирована в водную среду.
Анализ фрагмента 21-119 на наличие В-эпитопов с помощью метода пептидного сканирования PEPSCAN показал высокую плотность сайтов с ан тигенной активностью. Следовательно, только фрагмент 1-20 глубоко погру жен в мембрану или даже пронизывает ее. По данным компьютерного моде Дальнейшая работа проведена сотрудниками Института биомедицинской химии РАМН, Москва, в содружестве с Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, Germany.
Рис. 3. Хроматографическое разделение BrCN-пептидов модифицированного цитохрома P-450 2B4. (a-c) Разделение на Superose 12 после фотоаффинного мечения зондами PC 9 (a), РС 17 (b), SM 18 (c). (d-f) Разделение пептидов, свя занных с зондами PC 9 (d), РС 17 (e), SM 18 (f) на колонке Ultrapore C3 RPSC.
(из Eur. J. Biochem. 1994, 222, 485) лирования (Рис. 4), последовательности 21-119, 273-314 и 428-491 большей частью локализованы на той же стороне молекулы, что и гидрофобная N концевая спираль. Так как другие части фрагментов 273-314 и 428-491 нахо дятся в зонах связывания субстрата и гема, возможно, структурные изменения поверхности мембраны влияют на каталитическую активность CYP2В4.
Рис. 4. Компьютерное моделирование простран ственной структуры цитохрома Р-450 2В4.
(из Eur. J. Biochem. 1994, 222, 488) Наиболее вероятные кандидаты для взаимодейст вия с мембраной – сайты в районе а.о. 283-292 и 471-480. Регуляция скорее всего осуществляется через первый сайт – торцевой участок -спирали, который, попадает непосредственно в сайт лока лизации гема. -Спирали предшествует -изгиб.
Сайт связывания с мембраной, расположенный вблизи С-конца, имеет неупорядоченную кон формацию, и изменения в организации липидного бислоя инициированные в этой области, не могут эффективно передаваться на большое расстояние.
Наши результаты хорошо коррелируют с данными, полученными позже приизучении площади внедрения молекулы CYP2В4 в монослой из дипальмито-илфосфатидилэтаноламина с помощью фосфатидилэтаноламиновых / РС монослоев Лэнгмюра-Блоджета (Sligar S.G., 1998), и с результатами определения сайта, формирующего канал доступа суб страта в мембране, полученными для другого CYP – простагландин-I2-синтазы (Wu J., 2003) – при изучении взаимо-действия синтетических пептидов с ми целлами из додецил-РС с помощью двумерного 1H-ЯМР.
4. Иодирование диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы Для увеличения чувствительности PAL требуется применение высоко активных изотопов. Но такой зонд должен быть использован сразу после при готовления. Выход из этого затруднения – синтез холодного зонда, который может сохраняться долго и в который изотоп можно ввести прямо перед опы том. Введение радиометки в остаток фотофора облегчает анализ продуктов сшивки. Наиболее подходящим изотопом можно считать 125I, который вводит ся в ароматическое ядро, активированное электронодонорным заместителем, путем окислительного иодирования. В реакцию при этом вступает иод-катион I+, образующийся при окислении иодида подходящим агентом (гипохлорит, хлорамин T (Greenwood F.C., 1963), Н2О2 + лактопероксидаза (Bayse G.S., 1971), надуксусная кислота (Moerlein S.M., 1988)). Разработаны методы функ ционализации ряда фотофоров, в том числе бензофенонового (Prestwich G.D., 1994) и Tfd (Brunner J., 1995), позволяющие вводить в них 125I, однако эти мо дификации значительно усложняют синтез меток и зондов. Поэтому для РАL чаще применяют производные доступных арилазидов, легко подвергающихся радиоиодированию, хотя они существенно уступают карбен-генерирующим фотофорам. Прямое иодирование Tfd-алкоксипроизводных (Hashimoto M., 2006) с использованием комбинации I2 и (CF3COO)2IPh в СH3CN сложно адап тировать к условиям радиоиодирования зондов (микромоли), когда источни ком 125I является коммерческий препарата Na125I (2000 Ки/ммоль, 0.5 нмоль).
Мы обнаружили, что Dcp-метка может быть легко иодирована в услови ях окислительного процесса, причем в реакцию одинаково легко вступает как сама кислота DcpOH 1, так и ее производные. Способность диазоциклопента диена вступать в реакции электрофильного замещения известна (Cram D.J., 1963), однако прямое галогенирование еще не было описано. Мы исследовали продукт(ы) иодирования субстрата-зонда минимального размера DcpОМе (Схема 6;
избытки реагентов увеличивают выходы продуктов иодирования):
R a 14 R1 = I, R2 = H (76%) COOMe 15 R1 = H, R2 = I (20%) R2 COOMe N2 16 R1 = R2 = I (4%) N Схема 6. а) NaI (10 экв.), хлорамин Т (12 экв.), МеОН.
Разделением ВЭЖХ были получены индивидуальные продукты: 4-моно- (14), 5-моно- (15) и 4,5-дииодпроизводные (16) (Схема 6;
1Н-ЯМР и MS см. Табл.
2). При иодировании меняется УФ-спектр: макс эфира 2 314 нм смещается для продуктов 14, 15 и 16 – макс 322, 316 и 328 нм, соответственно 7. Кислота 1 и Dcp-аминопроизводные образуют смеси моно- и дииодпродуктов вне зависи мости от соотношения NaI–субстрат в интервале 0.5–10 (мол.).
Молярные коэффициенты экстинкции для эфиров 2, 14–16 определить сложно из-за их летучести;
значения должны быть близки найденным для метил-11-(Dcp-окси)ундеканоата (макс 314 нм, 15000, EtOH) и смеси продуктов его иодирования (макс 326 нм, 16700).
Таблица 2. 1Н-ЯМР (500 МГц, С6D12, 25oC;
/м.д., J/Гц) и MS (электронный удар, 70 эВ) характеристики соединений 2, 14, 15 и 16.
Н-3 Н-4 Н-5 СН3 m/z (%) 149 (100, M+-H), 121 (40, M+-H-N2);
2 6.62 5.91 6.79 3. с (3H) C7H6N2O2 (M+) соотв. 150. дд (1H) дд (1H) дд (1H) J3,4=3.15 J4,5=4.64 J5,3=1. J3,5=1.95 J4,3=3.15 J5,4=4. 276 (90, M+), 233 (100, M+-N2-Me);
14 6.66 — 6.91 3. с (3H) C7H5N2IO2 (M+) соотв. 275. д (1H) д (1H) J3,5=2.20 J5,3=2. 276 (85, M+), 233 (100, M+-N2-Me);
15 6.51 6.17 — 3. с (3H) C7H5N2IO2 (M+) см. выше д (1H) д (1H) J3,4=3.42 J4,3=3. 402 (62, M+), 359 (90, M+-N2-Me);
16 6.70 — — 3. с (3H) C7H4N2I2O2 (M+) соотв. 401. с (1H) Важный вопрос – сохранение фотофором своих свойств после иодиро вания, так как тяжелые атомы облегчают интеркомбинационную конверсию возбужденного синглетного состояния в триплетное, реакции которого могут приводить к простому отрыву протона (Turro N.J., 1978). Существен и вопрос об устойчивости CI-связи. Фотолиз смеси соединений 14–16 в С6Н12 сопрово ждался изменениями УФ-спектра (Рис. 5). Индивидуальные эфиры 14, 15 и подвергали фотолизу в С6Н12 3 мин и анализировали реакционные смеси, как описано для эфира 2. Кроме небольшого количества смолы (ТСХ), образова лись неполярные продукты пришивки карбена к циклогексану (MS). Харак терный спектр 1Н-ЯМР представлен на Рис. 6. Мы предложили для фотореак Рис. 5. Фотолиз иодированного DcpOMe (14+15+16) в цикло гексане (6 мМ);
320 нм (светофильтр – насыщенный aq. CuSO4).
Рис. 6. Спектры 1Н-ЯМР (C6D12) 5-иодо-DcpOMe 15 до (верхний) и после (нижний) исчерпывающего фотолиза в циклогексане;
анализ методом двойно го резонанса.
ции Схему 7. Механизм изомерных превращений, приводящих к образованию соединений 17–19, пока не выяснен. Отметим главное – отсутствие сигналов эфиров 3а (3б) (Рис. 2);
иодфторфенилазиды при фотолизе образуют 8% деиодированного продукта СН-внедрения (Keana J.F.W., 1992). Вероятно, по аналогии с иодфенилдиазиринами (Brunner J., 1995), отсутствие заметных по I I 18a + + COOMe COOMe C6H11 C6H 17a 17б ~ 1.0 : 0.5 : 0. a 15 + + 17б COOMe COOMe I I 16 C6H11 C6H 18a 18б ~ 1.0 : 0.4 : 0. I COOMe I C6H Схема 7. а) h, 320 нм, 3 мин, циклогексан терь иода обусловлено более длинноволновой областью поглощения иодиро ванного Dcp-хромофора, по сравнению с фенилазидами, что ускоряет фотоак тивацию в условиях PAL.
При сравнение интегральных интенсивностей сигналов в спектрах 1Н ЯМР эфиров 14–16 до и после фотолиза в С6Н12 (6 мМ) найдены выходы про дуктов (17аб, 18а), (18аб, 17б) и 19 — 30, 30 и 26 %, соответственно. Эффек тивность внедрения в неактивированную СН-связь иодированной Dcp-метки немного ниже, чем неиодированной (ср. 42%), 8 но достаточно высока, чтобы предположить, что при фотолизе фотофор реагирует как синглетный карбен.
При анализе результатов PAL наличие 125I-Dcp-метки в виде смеси мо но- и дииодпроизводных можно не учитывать. Для увеличения включения нуклида 125I в субстрат коммерческий препарат Na125I (без носителя, 1 мКи ~ 0.5 нмоль) используют без разбавления холодным I–, и иодированной оказы вается ничтожная доля зонда. Мечение 125I необходимо при разделении про дуктов ограниченного протеолиза методами электрофореза и ВЭЖХ. При дальнейшем анализе меченого пептида с помощью MS сигналы молекул, свя завшихся с иодированным Dcp-фотофором, зарегистрировать невозможно.
5. Синтез фосфатидилхолинового и ганглиозидных зондов Мы синтезировали Dcp-меченые аналоги липидов, предназначенные для последующего радиоиодирования: длинноцепной фосфатидилхолин 23 (Схе ма 8) и ганглиозиды 27 и 28, несущие фотофор на различном расстоянии от углеводной части молекулы (Схема 9). Ганглиозиды гликосфинголипиды, несущие один или несколько остатков сиаловой кислоты обязательные ком поненты плазматических мембран эукариот;
они играют важную роль в про цессах межклеточного узнавания, модулируют клеточный рост и дифферен циацию, выполняют функцию рецепторов, участвуют в переносе информации и в процессах апоптоза (Hakomori S.-I., 1990;
Spiegel S., 2003). Определяющая роль здесь принадлежит углеводной части молекулы, но конформационные изменения затрагивают и рецепторы, находящиеся вблизи церамидной части ганглиозида внутри клеточной мембраны. Важно, что введение метки в цера мидную часть молекулы не нарушает структуру олигосахаридной детерми Ср.: для метил-4-азидо-2-иодо-3,5,6-трифторбензоата – 12% (препаративная ТСХ) (Keana J.F.W., 1992), для 2-иодо-4-[3-(трифторметил)-3Н-диазирин-3-ил]бензилацетата – 48% (ГЖХ/MS) (Brunner J., 1995), при исходных концентрациях 2 мМ в циклогексане.
нанты, и зонд сохраняет специфичность исходного ганглиозида.
Наличие лабильной связи между фотофором и остальной частью моле кулы зонда существенно облегчает анализ продуктов PAL. Поскольку чаще всего изучаются липид-белковые взаимодействия, подходящей является сложноэфирная связь, лабильная, в отличие от пептидной, в условиях щелоч ного гидролиза. Мы разработали синтез жирной кислоты с Dcp-оксигруппой при -углероде 22, являющейся синтоном при получении липидных зондов, предназначенных для изучения центральной части мембран. Длина ацильной цепи с меткой соответствует длине пальмитоильного остатка, присутствую щего в природных фосфо- и гликосфинголипидах. 11-Гидроксиундекановую кислоту получали из доступной 11-аминоундекановой реакцией дезаминиро вания под действием HNO2 (выход 38 %). Попытки получить эфир 21 путем а,б,в COOH COOMe H2N TfO г Tf = CF3SO2 O COOMe O N2 д,е O COOH O N2 ж O + N n n = 1 (~72%) O O n = 3 (~28%) N O O OPO O O O Схема 8. а) HNO2/Н2О, 100о;
б) MeOH-HCl;
в) Tf2O/Py, –10оС;
г) DcpOH/TEA, ацетон;
д) KOH, iPrOH-H2O, 22оС;
е) HCl;
ж) лизо-РС, DCC/4PyNH2.
ацилирования -ОН метил-11-гидроксиундеканоата хлорангидридом DcpCl или конденсацией с DcpOH + DCC (Схема 8) успеха не имели. Для создания сложноэфирной связи мы активировали спиртовую компоненту: получили трифлат 20 (выход 86% без очистки) и ввели в реакцию с DcpОН с небольшим избытком TEA;
выход эфира 21 50 % (MS, 1Н-ЯМР). Омыление эфира 21 вели до появления следов DcpОН (20 ч): скорость щелочного гидролиза эфира псевдоароматической Dcp-кислоты 1, гораздо ниже, чем эфира алифатической кислоты. Двукратной хроматографией на силикагеле и обращенной фазе вы деляли кислоту 22 (выход 40%), конденсировали ее с 1 экв. лизо-РС в присут ствии DCC и 4PyNH2 (5 экв) и получали зонд 23 с умеренным выходом 44% (1Н-ЯМР, MS высокого разрешения).
Ганглиозидные зонды 27 и 28 (Схема 9) получали ацилированием лизо ганглиозида GM1 (лизо-GM1 – дезацилированный по сфингоидной NH2-груп пе ганглиозид GM1) п-нитрофениловыми (Np) эфирами в DMSO в присутст вии ТЕА. Обычно для этой реакции применяют N-гидроксисукцинимидные, пентафторфенильные и др. эфиры, как правило, в DMF (Sonnino S., 2004). Мы нашли, что Np-эфиры жирных кислот в DMSO реагируют с лизо-GM1 количе ственно. Кислоту 22 превращали в Np-эфир 24 обработкой п-нитрофенилтри фторацетатом и на силикагеле выделяли эфир 22 (выход 50%), который с не большим избытком (1.2 экв.) вводили в реакцию с лизо-GM1. После полной конверсии лизо-GM1 (12-16 ч) зонд 27 выделяли гель-фильтрацией;
выход 98% (1 мкмоль;
определяли по УФ-поглощению Dcp-метки).
а 22 O COONp O N N2 O в г COOH COONp COONp O I I б б OH HO OH HO O O O OH HO OH HO H O OH O O CH3CONH O O HO n H NH -OOC OH O OH O O O m OH O N 27 m = 10 n = 1 (~60%) OH HO n = 3 (~40%) 28 m = HNCOCH HO Схема 9. а) CF3COONp/Py;
б) лизо-GM1/TEA;
в) HONp, DCC;
г) DcpOH/TEA.
Зонд 28, несущий метку вблизи от полярной головки ганглиозида, полу чали немного иначе. Синтезировать Np-эфир иодуксусной кислоты 25 анало гично эфиру 24 с использованием п-нитрофенилтрифторацетата не удалось, так как реагент мало отличается по хроматографическим свойствам от целево го продукта. Эфир 25 получали конденсацией ICH2COOH с п-нитрофенолом в присутствии DCC. Вещество ранее не описано (1Н-ЯМР;
элементный анализ;
т. пл.). Эфир 25 вводили в реакцию с DcpОН в сухом ацетоне в присутствии ТЕА и хроматографией на силикагеле выделяли продукт 26 (выход 84%). Ко роткоцепной зонд 28 получали из лизо-GM1 аналогично зонду 27. Несколько меньший выход (88 %) связан, очевидно, со стерическими затруднениями при ацилировании NH2-группы сфингозинового основания. Структуры зондов 27 и 28 подтверждены спектрами 1Н-ЯМР и MS высокого разрешения. Высокие выходы мы объясняем преимуществами использования DMSO в качестве рас творителя для реакции лизоганглиозида с Np-эфирами 22 и 26, а также приме нением для очистки микромольных количеств целевого продукта гель-фильт рации вместо адсорбционной или обращенно-фазовой хроматографии.
Для точного определения высокоаффинных сайтов связывания при изу чении лиганд-рецепторных взаимодействий желательно расположить фотофор в олигосахаридной части ганглиозида, не нарушая его сродство к изучаемому рецептору. Мы получили GM1-зонд 30, несущий компактную Dcp-группу вместо ацетильной при N-5 остатка нейраминовой кислоты 9 (Схема 10). В ка честве исходного синтона рационально использовать дезацетил-GM1, кото рый присутствует как промежуточный продукт в ходе модификаций GM1 с целью получения из него различных производных по церамидному остатку. Np-эфир DcpOH 29 (получен впервые;
выход 64%;
1Н-ЯМР) в реакцию с дезацетил-GM1 вводили сначала с небольшим избытком (1.33 экв.). Попытки провести эту реакцию аналогично ацилированию лизо-GM1 при получении зондов 27 и 28, не имели успеха. Очевидно, NH2-группа дезацетилированной сиаловой кислоты, соединенной с остатком галактозы, находящимся внутри пентасахаридной головной группы, стерически экранирована. Важную роль здесь могут играть водородные связи. Реакцию вели в среде тщательно пере гнанного сухого DMF в присутствии TEA при 50oC в течение 90 ч, дважды Сиаловые кислоты – N-5-ацильные производные нейраминовой кислоты.
Лизоганглиозид GM1 и дезацетил-GM1 любезно предоставлены к.х.н. И.И. Михалевым (лаборатория химии липидов ИБХ РАН).
прибавляя дополнительные количества эфира 29 (1.33 и 0.3 экв.) до полной конверсии дезацетил-GM1. Гель-фильтрацией и хроматографией на обращен ной фазе выделяли зонд 30 (выход 23% по УФ-поглощению Dcp-метки). Не высокий выход может объясняться недостаточной чувствительностью детек тирования конверсии исходного дезацетил-GM1 в условиях работы с субмик OH HO OH HO O O O OH HO OH HO H O OH O O CH3CONH O n O HO H NH -OOC OH O OH O O OH OH HO NH дезацетил-GM HO а DcpOH ONp O N б OH HO OH HO O O O OH HO OH HO H O OH O O CH3CONH O n O HO H NH -OOC OH O OH O O OH OH HO n = 1 (~60%) NH HO 30 n = 3 (~40%) O N Схема 10. а) CF3COONp/Py;
б) DcpONp 29/TEA, DMF, 50oC, 90 ч.
ромольными количествами. Структура зонда подтверждена MS ESI (молеку лярный ион m/z 1622.2). Очевидно, при использовании зонда 30 для структур но-биологических исследований необходимо в каждом случае проводить кон троль сохранения аффинности этого аналога GM1 к изучаемому рецептору.
6. Фотоаффинное зондирование белков мембраны вируса гриппа Для проверки способности 125I-меченого Dcp-фотофора в составе РС зондировать интегральные белки мы выбрали хорошо изученную биологиче скую систему – вирион гриппа (Wilson J.A., 1981). Оболочка вирусной части цы образована липидным бислоем и двумя гликопротеинами - гемагглютини ном (НА) и нейраминидазой (NA), собранными в шипы, выступающие на по верхности. Мономер НА состоит из двух субъединиц, связанных SS-связью:
малой субъединицы НА2, проникающей глубоко в неполярную область ли пидного бислоя, и большой полярной субъединицы НА1. Внутренняя поверх ность вирусной мембраны выстлана матриксным белком (М1), который кон тактирует с нуклеокапсидным белком (NP). Был использован хорошо изучен ный штамм вируса гриппа типа А – вирус классической чумы птиц (FPV).
Применив в качестве окислителя надуксусную кислоту, аналогично ра диоиодированию Tfd-производного (Brunner J., 1995), мы получили 125I меченый РС-зонд 23 с высокой удельной радиоактивностью (~500 Ки/ ммоль;
выход 90% из исходного Na125I). Для сравнения, с помощью хлорамина Т вы сокое включение 125I (48% для зонда 23) достигалось лишь при соотношении NaI – хлорамин Т – Dcp-субстрат, ~ 1:10:100, подобно мечению тирозина (Farah K., 1998). Мы не отделяли 125I-зонд от исходного РС 23, так как ВЭЖХ (препаративная ТСХ в данном случае неэффективна) субнаномольных коли честв Dcp-субстрата усложнила бы всю процедуру и привела к потерям зонда.
Рис. 5. Фотоаффинное мечение белков вируса гриппа (FPV) (125I)PC-зондом 23. Суспензию виру са (0.1 мг белка) инкубировали с зондом (0. нмоль, 80 мкКи) 3 ч при 37оС, затем подвергали облучению 5 мин при 320 нм. После делипиди зирования смесью CHCl3–MeOH, 1:3, материал разделяли в 12.5% SDS-PAGE в восстанавливаю щих условиях. Гель окрашивали кумасси голубым (левая полоса), затем проводили авторадиографию (правая полоса) в течение 24 ч при –70оС. Справа указаны массы белков-стандартов (кДа).
I-РС 23 встраивали в наружный монослой мембраны вириона 11 инку бацией мицеллярного раствора в вирусной суспензии (зонд – вирусный РС ~ 1:100, мольн.), как описано (Молотковский Юл.Г., 1984). После фотолиза не связавшиеся липиды удаляли экстракцией органическими растворителями, а остаток анализировали SDS-PAGE в стандартной системе (Laemmli U.K., 1970), где поведение белков FPV хорошо изучено. Представленные на Рис. Образцы вируса очищены и любезно предоставлены к.х.н. Л.В. Мочаловой (ИБХ РАН).
электрофореграмма и авторадиограмма показывают, что единственным ме ченным белком оказалась субъединица HA2. Такая картина PAL полностью согласуется с общепринятой моделью организации вирусной оболочки.
Таким образом, Dcp-фотофор является эффективной карбен-генерирую щей меткой и одновременно может служить носителем высокоактивного ра диоизотопа 125I, который легко ввести в фотоаффинный зонд непосредственно перед его использованием для структурных исследований.
7. Взаимодействие различных субъединиц рецепторов интерлейкинов- и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах Явление сброса (шеддинга) ганглиозидов опухолевыми клетками описа но давно, и его биологическая роль изучена (Hakomori S., 1996): циркулируя в кровотоке, ганглиозиды ингибируют некоторые иммунные ответы и стимули руют развитие опухолей, защищая их от разрушения иммунокомпетентными клетками. Однако механизмы осуществления шеддинга и иммуносупрессии изучены недостаточно. Ганглиозиды являются мощными ингибиторами цито кин-опосредованной пролиферации мышиных и человеческих Т-клеток. При чем ингибирование, например, GM1 осуществляется по смешанному типу (конкурентному и неконкурентному), что предполагает помимо прямого взаи модействия с цитокинами и другие типы ингибирующего влияния на проли ферацию Т-клеток. Экзогенные ганглиозиды, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток IL-2-зависимой лимфоидной линии (СTLL-2;
активирован ные Т-лимфоциты), способны интенсивно маскировать -, - и -субъединицы рецепторов интерлейкинов 2 (IL-2R) и -4 (IL-4R) от последующего связывания с антителами к соответствующим субъединицам рецепторов(Молотковская И.М., 1996). Особенно ярко эффект проявляется при инкубации клеток с ганг лиозидом GM1. Однако на основании наблюдаемого феномена нельзя сделать вывод о локализации ганглиозидов в ближайшем липидном окружении изу чаемых рецепторов, поскольку нельзя строго показать отсутствие их интерна лизации или шеддинга. Для проверки предположения о непосредственном взаимодействии ганглиозида с субъединицами IL-2R и IL-4R мы применили (125I)Dcp-аналоги GM1 27 и 28, зондирующие мембрану на различной глубине.
Мицеллы из смеси зондов с ганглиозидом GM1 (1:100) инкубировали мин с клетками, подвергали облучению и проводили электрофорез отдельных субъединиц IL-2R и IL-4R, полученных иммунопреципитацией с соответству ющими антителами. Для короткоцепного зонда 28 была также проведена ре гистрация результатов PAL компонентов всей фракции плазматических мем бран, выделенной из клеток после мечения. 12 На авторадиограмме (Рис. 6) оп ределяется полоса белка с массой ~ 75 кДа, соответствующая -субъединице IL-2R (Рис. 6б, 3). Эта полоса обнаруживается электрофорезом иммунопреци питата с антителами к -субъединице IL-2R после проведения PAL зондом 27.
В то же время, иммунопреципитаты, полученные после PAL короткоцепным зондом 28 не выявили на авторадиограмме полосы ни для одного из использо ванных антител (данные не приведены). Иммунопреципитация проводится ан тителами, специфичными к определенному эпитопу белковой молекулы. Зонд 28 мог непосредственно сшиться либо с эпитопом, либо ковалентно связав шийся ганглиозид мог его маскировать, делая невозможным извлечение про дуктов PAL иммунопреципитацией. Поэтому был проанализирован весь пул белков плазматических мембран после PAL 125I-GM1-зондом 28 и на автора диограмме удалось зарегистрировать полосу, соответствующую по массе субъединице IL-2R (Рис. 7б, 2). Карбен, образуемый зондом 28, гораздо более доступен для тушения водой из-за малой глубины погружения в бислой, что может быть причиной его слабой по сравнению с зондом 27 сшивки с IL-2R (Рис. 6б, 3). Это обусловливает и появление прореагировавших с водой моно меров, которые вместе с липидными димерами образуют на авторадиограммах яркую полосу в области соединений с низкими массами в образце липидного экстракта плазматических мембран (Рис. 7б, 4). В образце делипидизирован ных мембран (Рис. 7б, 3) сшивка зонда 28 с IL-2R не детектируется, вероят но, из-за частичной потери модифицированного ганглиозидом белка в органи ческий экстракт и выхода за пределы чувствительности.
В настоящее время широко обсуждается проблема сборки IL-2R;
име ются разные данные относительно локализации - и -субъединиц рецептора до и после получения клетками сигнала от лиганда (IL-2). Наши результаты свидетельствуют о том, что в клетках линии СТLL-2, не активированных IL-2, ганглиозид GM1 локализуется в ближайшем липидном окружении -субъеди ницы IL-2R. Кроме того, получены косвенные доказательства сшивки корот коцепного зонда 28 с пептидом IL-2R, расположенным на С-конце субъеди Работа проведена И.В. Холоденко в лаборатории межклеточных взаимодействий ИБХ РАН под руководством к.б.н. И.М. Молотковской (Дисс. на соискание уч. ст. к.б.н., 2006).
Рис. 6. 10% SDS-PAGЕ белков ак тивированных Т-лимфоцитов после PAL клеток 125I-GM1-зондом 27 и иммунопреципитации (а) и резуль таты авторадиографии (2 мес) (б): – стандарты Sigma;
2 – белки клеток после фотомечения и последующей иммунопреципитации антителами к -субъединице IL-2R;
3 – то же, но с антителами к -субъединице;
4 – то же, но с антителами к -субъеди нице;
5 – то же, но с антителами к IL-4R. Окрашивание серебряным реагентом;
60 мкг белка/дорожка.
Рис. 7. 10% SDS-PAGЕ белков мем бран активированных Т-лимфоци тов после фотомечения 125I-GM1 зондом 28 (а) и результаты автора диографии (2 мес) (б): 1 – стандар ты Sigma;
2 – белки плазматических мембран после PAL;
3 – то же, но с последующим делипидизированием CНCl3-MeOH (1:3);
4 – органиче ский экстракт.
ницы. Таким образом, применение зондов с фотофорами, расположенными в -положении жирнокислотных остатков различной длины, позволяет опреде лить места взаимодействия с рецептором со значительной точностью.
8. Определение фрагментов молекулы IL-4, участвующих во взаимодей ствии с ганглиозидом GM Молекулярные механизмы иммуносупрессии ганглиозидами связывают, в том числе, с их прямым взаимодействием с IL-2 и IL-4: ганглиозиды пере хватывают цитокины, необходимые для активации Т-лимфоцитов, усугубляя иммуносупрессию, развивающуюся при опухолевой патологии. В данной ра боте мы применили GM1-зонд 30, несущий метку в олигосахаридной части молекулы, для идентификации сайта(ов) связывания IL-4. В перспективе по лученная информация может быть полезной для создания новых препаратов, способных эффективно перехватывать циркулирующие в крови свободные ганглиозиды, но лишенных недостатков молекул рекомбинантного интерлей кина. Ранее с помощью зонда GD1b, несущего арилазидный фотофор в глице риновом остатке концевой сиаловой кислоты, был установлен сайт связыва ния ганглиозидов в молекуле токсина столбняка (Shapiro R.E., 1997).
Изучение влияния замены ацетила нейраминовой кислоты в молекуле GM1 Dcp-группой на сродство к IL-4 с помощью кинетического анализа в функциональных тестах с Т-лимфоцитами потребовало бы существенных ко личеств зонда. В качестве модельных исследований мы проверили, образует ли GM1 30 в условиях PAL продукт сшивки с В-субъединицей холерного ток сина (CTB), который можно зарегистрировать с помощью MALDI-MS 13. GM – высокоаффинный рецептор СТВ, причем во взаимодействии участвует сиа лильный остаток (Sia). После РАL (СТВ/зонд 30, 2:1, мольн.) в масс-спектре наряду с молекулярным (m/z 11622.4) и двухзарядным (m/z 5812.3) пиками ис ходной субъединицы было отмечено появление пиков одно- (m/z 11724.8;
11775.3;
11965.9;
12002.9) и двухзарядных ионов (m/z 5862.3;
5888.6;
5930.7;
5984.9) производных CTB, несущих фрагменты зонда. Фрагментация ближе всего соответствует отщеплению модифицированной Sia-группы по глико зидной связи, что чаще всего и происходит с молекулой GM1 в условиях MS MALDI. Полученные данные косвенно свидетельствуют о возможности при менения аналога GM1 30 для изучения взаимодействия ганглиозида с IL-4.
Прежде чем приступить к PAL молекулы человеческого rIL-4, был про веден полный MS-анализ белка и его фрагментов после протеолиза эндопро теиназой Glu-C. Применение данного фермента позволило получить важные для нашего исследования регистрируемые фрагменты петлевых участков.
Смесь rIL-4 и 125I-GM1-зонда 30 в PBS (10 нмоль/10 нмоль/0.5 мл) инку бировали 1 ч при 37оС, фотолизовали, высаживали белок ультрацентрифуги рованием и подвергали протеолизу эндопротеиназой Glu-C. Полученные фрагменты разделяли с помощью ВЭЖХ, отбирали фракции характеризую щиеся высоким поглощением амидной связи и радиоактивностью (до имп/мин) одновременно, и подвергали их MS-MALDI-анализу.
Работа проведена совместно с сотрудниками лаборатории межклеточных взаимодейст вий отдела иммунологии (см. сноску 11) и группы масс-спектрометрии ИБХ РАН под ру ководством д.ф.-м.н. В.А. Олейникова.
В результате пришивки Dcp-зонд образует производное, содержащее циклопентадиенкарбонильный остаток («cp»). В условиях MS MALDI моле кула Dcp-GM1 реагирует с матрицей и расщепляется по амидной связи («cp»– остаток Sia) или по гликозидной связи Sia2-3Gal. Расчеты ожидаемого увели чения масс пептидов приведены в Табл. 3. С учетом данных MS MALDI про Таблица 3. Массы фрагментов GM1-зонда 30, ожи Масса, Да Фрагмент «cp» + H+ 92 даемых в составе комплексов пептид – фрагмент «cp» + Na+ 114 зонда (фрагментация в процессе MS MALDI).
«cp» + K+ Sia + H+ Sia + Na+ теолитических фрагментов rIL-4, были рассчитаны Sia + K+ Sia-O + H+ массы ожидаемых пиков меченых пептидов. Отсут Sia-O + Na+ 379 ствие в MS фрагментов, содержащих церамидную Sia-O + K+ часть подтверждается отсутствием парных пиков, отличающихся на 28 Да (зонд 30 содержит две формы сфингозинового осно вания, отличающие длиной на два метилена, Схема 10). Был выявлен ряд ме ченых пептидов (в том числе, приведенные в Табл. 4): 1-8 (KCDITLQE), 122 128 (KYSKCSS), 19-25 (QKTLCTE), 41-42 (KE), 103-109 (ANQSTLE) и 110 113 (NFLE). По данным РСА (Muller T., 1995), эти фрагменты IL-4 содержат а.о., экспонированные в раствор, и находятся в неупорядоченных петлевых участках цепи (за исключением фрагмента 41-42, образующего начало спирали, и 103-109 – содержащего короткую -структуру 106-108).
Анализ локализации фрагментов 19-25 и 103-113 на модели простран ственной структуры молекулы rIL-4 показал, что они располагаются на двух Расчет, MS, m/z, Отнесение Да Да Таблица 4. Сравнение расчетных (19-25) + («cp» + H+) 913.41 - и экспериментальных масс сши + («cp» + Na+) 935.39 937.17 вок пептидный фрагмент IL-4 – + («cp» + К+) 951.37 953.24 фрагмент зонда GM1 30.
(103-109) + («cp» + H+) 853.38 854. + («cp» + Na+) 875.36 876. + («cp» + K+) 891.34 892. антипараллельных петлях, сбли (110-113) + (Sia + H+) 862.27 женных в пространстве. Очевид + (Sia + Na+) 884.25 887. + (Sia + K+) 901.23 903.27 но, эти фрагменты образуют со + (Sia-O + H+) 878.27 881. ставной сайт-ловушку для взаи + (Sia-O + Na+) 900.25 903. + (Sia-O + K+) 916.23 919.28 модействия с олигосахаридной частью молекулы ганглиозида. Участки 1-8 и 122-128 – N- и C-концевые, то есть наиболее доступные для неспецифического взаимодействия, а фрагмент 41-42 находится в начале -спирали, которая формирует жесткий каркас, ма лодоступный для связывания.
9. Идентификация субъединиц F0-сектора митохондриальной H+-АТР азы, контактирующих с липидами мембраны Синтез и гидролиз АТР, сопряженные с транслокацией протонов через мембрану по градиенту электрохимического потенциала (Н+), осуществля ется ферментом F1F0-ATP-азой (Н+-АТР-аза F-типа). Несмотря на некоторые отличия в субъединичном составе и каталитических характеристиках, F1F0 ATP-азы митохондрий, бактерий и хлоропластов близки по строению и меха низму действия. Структурно и функционально их подразделяют на интегри рованный в мембрану F0-сектор, осуществляющий перенос протонов, и пери ферический каталитический F1-сектор, несущий центры синтеза и гидролиза АТР. Пространственная структура фермента напоминает гриб: F1-комплекс составляет сферическую глобулу «шляпки», от нее отходит «ножка», состоя щая из субъединиц F1- и F0-комплекса. Фермент митохондрий (КФ 3.6.1.34) содержит более 15 типов субъединиц;
F1-АТР-аза хорошо изучена (РСА, Abrahams J.P., 1994). Строение сектора F0 менее изучено. Считается, что в ми тохондриях млекопитающих он состоит минимум из 10 субъединиц (a, b, c, d, e, f, g, F6, A6L и OSCP), стехиометрия и топография которых полностью не ясны. В наиболее популярной ко времени нашей работы модели субъединицы а и b расположены снаружи кольца с12-олигомера (Engelbrecht S., 1997).
Для идентификации субъединиц сектора F0, контактирующих с липида ми внутренней мембраны митохондрий, мы применили [14С]РС-зонд 9 и (125I)PC-зонд 23 в модельной системе – протеолипосомах из смесей димири стоил-РС – дипальмитоил-РС –зонд, 1 : 0.81 : 0.20.0025, и F1F0-комплекса митохондрий сердца быка (белок–липид, 1 : 4 по массе). 14 Протеолипосомы получали методом диализа смеси компонентов с дезоксихолатом;
реконструи рованный фермент сохранял активность. Однозначные результаты при анали зе продуктов PAL методом SDS-PAGE не были получены;
не удалось иденти Работы проведены Л.Г. Зайцевой в ИБХ РАН и на кафедре биоорганической химии био логического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством к.х.н. Т.В. Овчинни ковой и к.х.н. В.А. Гринкевича (Дисс. на соискание уч. ст. к.х.н., 2000).
фицировать субъединицы, которые при делипидизировании протеолипосом экстрагировались вместе с липидами. Поэтому мы применили MS MALDI – метод, который до нас не использовался для анализа состава полисубъеди ничных мембранных белковых комплексов и липид-белковых аддуктов 15.
В спектре F1F0-ATP-азы, как стандарта (Рис. 8А), почти все субъедини цы присутствуют в виде молекулярных ионов: пики с m/z 5662, 7975, 8233, 8972, 9328, 10267, 11344, 15129, 18626, 20947, 24765, 30194, 33155, 51622, 55203 с учетом точности метода (0.5 % для М 10-56 кДа) можно соотнести с молекулярными ионами субъединиц (М 5651 Да), A6L (7964), e (8189), F g (11328), (15065), d (18603), OSCP (20967), a/b, (8958), A1 (9582), f (10209), (30141), T (32836), (51595), (55161), соответственно. Кроме того, некото рые субъединицы в условиях получения данного MS образуют двухзарядные Рис. 8. МS MALDI белкового осадка модифицированной в протеолипосомах II типа Н+-АТРазы митохондрий сердца быка (Б) и стандарта (А). * – субъеди ница с «растрепанным» N-концевым участком;
Т – ADP/ATP-транслокатор.
(m/z 27685, 25851, 12380 и 3834 – -, -, a-/b- и с-субъединицы) и трехзаряд ный (m/z 17253, -субъединица) ионы. Разрешающая способность прибора (Vision 2000, Thermo BioAnalysis, США) не позволила зафиксировать субъе Работа проведена сотрудниками группы масс-спектрометрии ИБХ РАН Н.Б. Поляковым и М.И. Титовым под руководством д.х.н. С.Е. Есипова.
диницы а (М 24815 Да с учетом N-концевого формилирования) и b (М Да) раздельно: они дают усредненный пик с m/z 24765. Субъединица с дает кластерный ион [М + K]+ (m/z 7649). Причем она никогда не наблюдалась без катионов (К+, Na+), что подтверждается и в других работах (Griffiths D., 1996).
Протеолипосомы I типа получали на основе димиристоил-РС – пальми тоил/олеоил-РС, 1:1;
II тип содержал также нерадиоактивный аналог РС-зонда 9 (10% от РС). Важно, что в MS зонда есть пики молекулярных ионов с m/z 812.5 (Z1, 72%;
см. схему 3, n=1) и m/z 841 (Z2, 28%;
n=3). Оба типа протео липосом облучали и делипидизировали смесью CHCl3–МеОН, 1:2. Собирали отдельно белковый осадок, водную и органическую фазы;
их лиофилизовали и растворяли в 75% НСООН, затем обессоливали гель-хроматографией и ана лизировали MS MALDI.
В MS белкового осадка протеолипосом I типа присутствовали пики мо лекулярных ионов субъединиц, f, g,, d, OSCP,,,, a/b и кластерных ио нов [M + K]+ – c и f. Пик с m/z ~12400 может быть наложением пиков [a]2+ и [b]2+. Сравнение спектров стандарта и белкового осадка показало значитель ное уменьшение содержания субъединиц с и F6. Спектр водной фракции со держал, в основном, фактор F6. В MS органического экстракта (Рис. 9A) были найдены пики, соответствующие [а]+, [а]2+, [c + K]+и [c + 2K]2+ (m/z 24825, 12416, 7650 и 3838). Пик с m/z 15353, вероятно, относится к -субъединице.
Анализировали продукты фотомечения Н+-АТРазы в протеолипосомах II типа. В MS белкового осадка (Рис. 8Б) присутствует полный набор пиков, характерных для этой фракции немодифицированного фермента. Появились и новые пики, отсутствующие в стандарте (Рис. 8А). Пик 2 с m/z 8297 можно объяснить присоединением зонда к субъединице с (m/z 7608), хотя прираще ние массы составляет ~690 Да, а не ожидаемые 785 (Z1-28) или 813 (Z2-28).
Очевидно, в растворе 75% НСООН, где готовят образцы для MS MALDI, фос фоэфирная связь гидролизуется и ковалентно связанный PC теряет остаток фосфохолина (166 Да), превращаясь в диглицерид. Тогда приращение массы для зонда Z1 – 620, а для Z2 – 648 Да, что с учетом ошибки измерения и де тектирования с-субъединицы только в виде кластерных ионов, хорошо согла суется с полученным результатом и доказывает непосредственный контакт олигомера с-субъединицы с липидным бислоем. Появление плохо разрешен ных пиков 3 в районе 13348 m/z, а также отсутствие пика [a]2+/[b]2+ позволяет сделать вывод о множественной модификации субъединиц а или b и, следова тельно, их контакте с липидами мембраны.
В MS органического экстракта (Рис. 9Б) не были идентифицированы пики [a]+ и [a]2+ (субъединица b не экстрагируется). Очевидно, а-субъединица промодифицировалась практически полностью, причем множественность сшивок подтверждается пиками с m/z 13701 (4, Рис. 9Б) и 13348 (3, Рис. 8Б).
Появились пики 2 и 3 (m/z 8302 и 8959, Рис. 9Б), соответствующие (с потерей фосфохолина) пришивке одной или двух молекул зонда к субъединице с. При веденные спектры (Рис. 8 и 9), позволяют рассчитать, что немодифицирован ными осталось ~15% всего количества с-субъединиц, то есть 2 из 12-ти.
Рис. 9. МS MALDI хлороформ-метанольных фракций модифицированной (Б) и немодифицированной (А) Н+-АТРазы митохондрий сердца быка в протеоли посомах типа II и I, соответственно.
Из значения m/z 13348 (Рис. 8Б) следует, что стехиометрия продукта сшивки РС-зонд/а-субъединица 3:1. Субъединица а присутствует в F1F0 комплексе в одной копии, причем основная часть ее молекулы погружена в липидный бислой, и как предполагается, образует 6-7 трансмембранных спиральных тяжей. Субъединица а выполняет как бы роль статора для ротора, образованного 12 с-субъединицами (Fearnley I.M., 1986). Наши результаты показывают, что этот статор – компактное образование, экранирующее от контактов с липидами довольно незначительную часть ротора с12-олигомера.
10. Поиск лектинов на поверхности опухолевых клеток Клетки опухолей экспонируют на своей поверхности лектины, специфи ческие углевод-связывающие белки, которые на нормальных клетках отсутст вуют или экспрессируются в малой степени (Gabius H.-J., 1988). Это явление было предложено использовать для доставки носителей лекарств к опухолям (Monsigny M., 1988). Углеводные лиганды имеют невысокое сродство к лекти нам (Kd ~1 мM), но оно резко возрастает при переходе к олиго- или полива лентным (с множеством углеводных остатков) гликоконъюгатам за счет фор мирования многоточечных контактов с лектинами, как это происходит в при роде. Липосомы как носители лекарств особенно подходят для оснащения их липидного бислоя углеводными лигандами, которые за счет латеральной диф фузии стягиваются и подстраиваются под структурированные на поверхности клетки молекулы лектина (Zalipsky S., 1996). Мы использовали липосомы со встроенными в мембрану липофильными гликоконъюгатами для доставки ли пидных пролекарств к злокачественным клеткам in vitro и in vivo и показали перспективность такого подхода [20]. Специфичность лектинов опухолевых клеток определяли с помощью флуоресцентных углеводных зондов. Внутриклеточный транспорт лекарственных липосом и эффективность действия доставленного препарата зависят от механизма их рецепции клетка ми. В нашем случае, липосомы, вероятно, связываются с мембранными лекти нами. Мы решили выявить эти рецепторы с помощью PAL и с этой целью разработали синтез неогликолипидных зондов (38-41, Схема 11), предназна ченных для встраивания в липидный бислой липосом. Расположение Dcp метки в непосредственной близости от остатка углевода позволяет полностью сохранить его структуру. Детерминанты трисахарид A (Аtri) 38, сиалил LewisX (SiaLeX) 39 и сульфат-LewisА (SuLeA) 40 определены нами для клеток меланомы М3 и лейкоза HL-60, соответственно. Зонд 41, несущий неактивный пентаол, предназначен для контроля неспецифического связывания.
Проведена серия PAL-экспериментов с клетками и 200-нм-липосомами состава: яичный РС – фосфатидилинозит – (125I)зонд 38-41, 8:1:0.5-1 (мольн.).
Для детектирования связывания с рецепторами на поверхности, клетки инку бировали с липосомами 5-10 мин при 20оС;
заметное накопление фосфолипи Углеводные флуоресцентные зонды – конъюгаты моно- и олигосахаридов с флуоресце ин-меченым полиакриламидом – и 3-аминопропилгликозиды синтезированы в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН (зав. лабораторией проф. Н.В. Бовин).
O O а б,в Cl OH O O O Cl O HO n n O O n = 9 - O COO OH O ROH O O n O COO г ж,г д e RONp COONp RNH COOH RNH COOH RNH ROH Гликозид 34 O NH NH NH Boc O NH O или O аминоглюцит N Fuc1- Gal1- O NH GalNAc1- трисахарид А Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc- O NH Fuc1 O O OOCC17H H OH N O OH O O n CH O OH O H3C O O HO O OH OOCC17H OHOH NH O O O HO O O полиэтиленгликольный HN O OH OH OH O спейсер мембранный CH NH я корь cиалил-LewisX O O Fuc1-4 O GlcNAc1- O NH HSO3-3Gal1- необходим для эффективного N взаимодействия углевода с cульфат-LewisА рецептором на поверхности клетки-мишени OH OH OH OH OH NH аминоглюцит Схема 11. а) SOCl2/Na2CO3;
б) rac-1,2-диолеоилглицерин, 0.1 экв;
в) вода;
г) CF3COONp/Py;
д) -Вос-лизин, TEA, DMSO;
е) TFA;
ж) DcpOCH2COONp 26.
дов липосом в цитоплазме начинается через 30 мин инкубации при 37оС [26].
На Рис. 10а представлены электрофореграммы и авторадиограммы белков клеток М3 после инкубации с Аtri-липосомами. Соответствующие профили радиоактивного счета приведены на Рис. 10б. Основной уровень PAL – в зоне самых легких (14-15 кДа) и массовых белков. Еще один пик приходится на слабую полосу при ~18 кДа (профиль 1, Рис. 10б). Инкубации в присутствии свободного углевода, в прямой зависимости от его количества, привели к яв ному снижению уровней PAL (Рис. 10а,2А,3A;
Рис. 10б, профили 2,3). Наибо лее выражен эффект ингибирования для 18-кДа-зоны (Рис. 10б).
Рис. 10. PAL белков клеток М3 Аtri-липосомами (зонд 38). 12.5% SDS-PAGE после однократного делипидизирования (CНCl3–MeOH, 1:3);
а – электрофоре граммы (слева) и авторадиограммы: 1 и 1А – инкубации клеток с липосомами 5 мин, 2 и 2А – то же в присутствии 10 экв свободного трисахарида А, 3 и 3А – то же в присутствии 100 экв.;
б – профили радиоактивности электрофоре грамм, соответствующие а. Cтрелки слева и внизу – стандарты Sigma.
PAL в мембранных системах неизбежно сопровождается большим ко личеством липид-липидных кросс-сшивок, которые захватываются денатури рованными белками при делипидизировании и даже в условиях SDS-PAGE продолжают ими удерживаться. После дополнительной экстракции (CНCl3– MeOH, 1:3) стало очевидным, что уровень PAL в области 18 кДа при 5-мин инкубации с клетками – наибольший (Рис. 11б, профиль 1). Избыток амино глюцита не подавлял PAL 18 кДа-белка (Рис. 11а,3,3А;
ср. Рис. 10а,1А,2А,3А).
Уловить момент образования лиганд-рецепторного комплекса в услови ях стационарного (steady-state) фотолиза невозможно, что приводит к усиле Рис. 11. PAL белков клеток М3 Аtri-липосомами (зонд 38). 13.5% SDS-PAGE после двухкратного делипидизирования;
а – электрофореграммы (слева) и ав торадиограммы: 1 и 1А –инкубация клеток с липосомами 5 мин, 2 и 2А – то же 30 мин, 3 и 3А – то же 5 мин в присутствии 500 экв аминоглюцита;
ЦМ – элек трофореграмма белков фракции цитоплазматических мембран клеток М3;
б – профили радиоактивности электрофореграмм, соответствующие а.
нию неспецифического PAL. Его проверяли с помощью зонда 41. Кроме зоны 14-15 кДа, основные пики – ~28 и 34 кДа (профиль 1, Рис. 12). Следовательно, PAL в этих зонах Аtri-зондом 38 (Рис. 10 и 11) является неспецифическим.
Рис. 12. PAL белков клеток М липосомами с контрольным зон дом 41: 1 – инкубация 10 мин;
2 – после фотолиза липосом с зондом 41 в отсутствие клеток, с после дующим совместным делипиди зированием с разрушенными SDS клетками;
13.5% SDS-PAGE.
Для контроля фоновой радиоактивности дисперсии липосом облучали, разрушали SDS, а затем смешивали с разрушенными SDS клетками и дважды делипидизировали. Распределение радиоактивности после SDS-PAGE (Рис.
12, профиль 2) свидетельствует, что пик в зоне ~15 кДа действительно объяс няется трудностью отделения белков от липофильных молекул.
На Рис. 13 и 14 представлены профили радиоактивности белков после PAL клеток М3 SiaLeX-липосомами и клеток HL-60 SuLeA-липосомами, соот ветственно. По сравнению с Аtri-липосомами (Рис. 10 и 11), картины мечения усложнились, и основные пики смещены в сторону более высоких масс. Од нако ряд пиков можно вычесть: область фона – 14-15 кДа;
пики неспецифиче ского мечения ~28 и 34 кДа для клеток М3 (Рис. 12) и ~19, 21, 28 и 31 кДа клеток HL-60 (данные не приведены). Для клеток М3 и Аtri-зонда 38 главным меченным оказался минорный белок с массой ~18 кДа, в случае SiaLeX-зонда 39 – белки ~43, ~60, ~64 и ~80 кДа, а для клеток HL-60 и зонда SuLeA 40 – белки ~36, ~43, ~48, ~54, ~66 и область 75-85 кДа. Так как возрастающие кон центрации свободных углеводов подавляют PAL (Рис. 10 и 13, профили 2,3;
Рис. 14, профиль 2), мы полагаем, что оно отражает специфические взаимо Рис. 13. PAL клеток М SiaLeX-липосомами (зонд 39): 1 – инкубация мин;
2 – то же в присут ствии 10 экв. свободного SiaLeX;
3 – то же в при сутствии 100 экв.;
4 – ин кубация 30 мин;
13.5% SDS-PAGE.
действия. Более длительные инкубации во всех случаях (Рис. 11а,2А;
Рис. 11б профиль 2;
Рис. 13, профиль 4;
Рис. 14, профиль 3) изменяют профили мече ния, поскольку зонды уже взаимодействуют с внутриклеточными белками.
Белки, связывающие зонды, обнаруживаются в плазматических мембра нах клеток при SDS-PAGE (для М3 – Рис. 11а,ЦМ). Их можно соотнести с из вестными лектинами млекопитающих. Найденный на клетках М3 рецептор Atri-липосом с массой ~18 кДа может относиться к семейству галектинов – Рис. 14. PAL клеток HL- SuLeA-липосомами (зонд 40): 1 – инкубация 10 мин;
2 – то же в присутствии экв. свободного SuLeA;
3 – инкубация 30 мин;
13.5% SDS-PAGE.
лектинов экстрацеллюлярного матрикса, специфически связывающих -галак тозиды;
идентифицировано 14 галектинов с массами от 14 до 36 кДа (Gabius H.-J., 2004). Вероятно, что пик зоны ~75-85 кДа в профиле PAL SuLeA-липосо мами белков клеток лейкоза HL-60, сохраняющий свою интенсивность при разных временах инкубаций (Рис. 14, профили 1 и 3), относится к семейству селектинов. Эти лектины специфичны к фукозилированным/сульфатирован ным эпитопам и после связывания с лигандами не подвергаются эндоцитозу (Gabius H.-J., 1997). Масса L-селектина лимфоцитов – 74 кДа.
Отметим, что публикаций о применении фотоаффинных углеводных зон дов пока мало. Например, с помощью PAL авторы (Hashimoto M., 2001) иска ли транспортер глюкозы на поверхности клетки и перед детектированием вы деляли его из сложной смеси клеточных белков с помощью иммунопреципи тации, то есть было известно, какой именно рецептор надо искать.
Наши результаты позволяют сделать вывод, что на поверхности опухо левых клеток экспонированы рецепторы, которые опосредуют взаимодействие с липосомами, оснащенными углеводными детерминантами.
ВЫВОДЫ 1. Впервые детально исследованы фотохимические свойства диазоциклопен тадиен-2-илкарбонильной (Dcp) группы. Показано, что она является высоко эффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду парамет ров, в том числе, компактности и реакционной способности при возбуждении актиничным светом, известные и широко применяемые фотофоры. Сущест венно, что фотолиз этой группы проходит в мягких условиях, не повреждаю щих белки и нуклеиновые кислоты. Высокая реакционная способность осо бенно важна при зондировании мембранных систем, обогащенных неактиви рованными СН-связями.
2. Обнаружена способность Dcp-группы подвергаться прямому иодированию в условиях окислительного процесса, при этом фотохимические свойства со храняются. Указанное качество превращает Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, поскольку позволяет проводить синтез хо лодных зондов с последующим введением высокоактивного радиоизотопа 125I в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением в биологиче ской системе. Положение изотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов фотомечения. Эффективность применения радиоиодированного Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена с помо щью фосфатидилхолинового зонда на хорошо изученной биологической мо дели – вирионе гриппа.
3. Предложен новый основный катализатор – 4-аминопиридин – для проведе ния реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде ор ганических растворителей. Применение 4-аминопиридина особенно эффек тивно в синтезах фосфо- и гликолипидов и позволяет существенно увеличить выход при ацилировании вторичного гидроксила глицеридного остатка, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых или дорогостоящих соединений.
4. Разработаны синтезы новых 14С-меченых фосфатидилхолиновых зондов, содержащих Dcp-группу при концевом атоме углерода ацильных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы. Зон ды предназначены для мембранных исследований на различной глубине по гружения в липидный бислой.
5. Разработан синтез нового фосфатидилхолинового зонда, несущего в sn- положении алифатическую кислоту, содержащую при -углероде Dcp фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, лабильную в щелоч ной среде, что облегчает анализ продуктов фотомечения. Кислота служит син тоном при получении различных липидных зондов, предназначенных для изу чения неполярной области мембран.
6. Разработаны синтезы новых ганглиозидных зондов на основе лизоганглио зида GM1, несущих Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, в церамидном остатке на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы. Синтез оптимизирован для субмикромолярных количеств.
7. С помощью 14С-меченых фосфолипидных зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране. Результаты хорошо коррелируют с данными расчетов конформационного анализа, а также подтверждаются более поздни ми публикациями других исследователей, применивших независимые методы.
8. С помощью 125I-меченых ганглиозидных зондов исследовано взаимодейст вие субъединиц рецепторов интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в ак тивированных Т-лимфоцитах (клетки линии СTLL-2). Полученные данные важны для понимания механизма сборки рецепторов и проведения сигнала.
9. В рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглио зидами, определены сайты связывания интерлейкина-4 с 125I-меченым GM1 зондом – новым аналогом GM1, несущим Dcp-фотофор вместо ацетила в ос татке сиаловой кислоты. Показано, что ганглиозид взаимодействует с фраг ментами 19-25 (QKTLCTE) и 103-113 (ANQSTLENFLE).
10. С помощью фосфатидилхолинового зонда идентифицированы субъедини цы субкомплекса F0 митохондриальной H+-АТР-азы, контактирующие с липи дами мембраны.
11. С целью изучения механизма взаимодействия липосом, оснащенных угле водными детерминантами (адресных липосом), с опухолевыми клетками раз работан метод синтеза фотоаффинных неогликолипидных зондов, предназна ченных для встраивания в липидный бислой липосом.
12. Фотоаффинное зондирование показало, что взаимодействие адресных ли посом с опухолевыми клетками опосредовано рецепторами, экспонированны ми на поверхности исследованных клеток;
некоторые из этих рецепторов мо гут быть отнесены к известным лектинам клеток млекопитающих.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Обзор 1. Водовозова Е.Л.. Метод фотоаффинного мечения и его применение в структур но-биологических исследованиях. Биохимия 2007, 72 (1), 5-26.
Статьи 2. Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфатидилхолинов и сфингомиелинов с различным расстоянием между меткой и полярной группировкой. Биоорган. химия 1984, 10 (12), 1688-1694.
3. Водовозова Е.Л., Шевченко В.П., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфолипидов с высоким уровнем тритиевой метки. Биоорган.
химия 1984, 10 (12), 1698-1699.
4. Молотковский Юл.Г., Маневич Е.М., Водовозова Е.Л., Букринская А.Г., Бер гельсон Л.Д. Изучение молекулярной организации мембраны вируса гриппа с помощью фотореактивных и флуоресцентных фосфолипидных зондов. Биол.
мембраны 1985, 2 (6), 566-574.
5. Bukrinskaya A.G., Molotkovsky J.G., Vodovozova E.L., Manevich Y.M., Bergelson L.D. The molecular organization of the influenza virus surface. Studies using photore active and fluorescent labeled phospholipids probes. Biochim. Biophys. Acta 1987, 897, 285-292.
6. Slepushkin V.A., Starov A.I., Bukrinskaya A.G., Imbs A.B., Martynova M.A., Kogtev L.S., Vodovozova E.L., Timofeeva N.G., Molotkovsky J.G., Bergelson L.D. Interac tion of influenza virus with gangliosides and liposomes containing gangliosides. Eur.
J. Biochem. 1988, 173, 599-605.
7. Мартынова М.А., Маневич Е.М., Водовозова Е.Л., Музя Г.И., Безуглов В.В., Мо лотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Взаимодействие простагландинов с липо протеинами низкой плотности крови человека. Биохимия 1988, 53 (5), 721-727.