Антонина естественная изменчивость и биосинтетическая активность актиномицетов streptomyces massasporeus

На правах рукописи

УДК: 579.873.71+579.253+579.222:577.1 БРАТУХИНА АНТОНИНА ЕСТЕСТВЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АКТИНОМИЦЕТОВ STREPTOMYCES MASSASPOREUS 03.00.07 – МИКРОБИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КИШИНЕВ, 2012

Работа была выполнена в лаборатории олеобиотехнологии Института микробиологии и биотехнологии АНМ, лаборатории санокреатологии пищеварительной системы Института физиологии и санокреатологии АНМ, на кафедре физиологии человека и животных ПГУ им. Т.Г. Шевченко.

Научный консультант:

БУРЦЕВА Светлана, доктор хабилитат биологических наук, профессор Научный консультант:

ШЕПТИЦКИЙ Владимир, доктор хабилитат биологических наук, доцент Официальные референты:

ЕМНОВА Екатерина, доктор хабилитат биологических наук, доцент, Институт генетики и физиологии растений АНМ КРИВОЙ Аурелия, доктор хабилитат биологических наук, профессор, Государственный университет Молдовы Состав Ученого специализированного совета:

РУДИК Валериу, председатель, доктор хабилитат биологических наук, профессор, академик ЧИЛОЧИ Александра, ученый секретарь, доктор биологических наук, доцент ЛУПАШКУ Галина, доктор хабилитат биологических наук, доцент СТАРЧУК Николай, доктор хабилитат ветеринарных наук, доцент КОРЧМАРУ Сергей, доктор биологических наук, доцент

Защита состоится „ 11 ” июля 2012, в на заседании Ученого специализированного совета DH 09.03.00.07 – 11 при Институте микробиологии и биотехнологии АНМ, MD-2028, Кишинев, ул. Академическая, 1;

тел/факс: +373 (22) 72 57 54;

e-mail: [email protected].

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Академии наук Молдовы им. А. Лупан (ул. Академическая, 5, MD 2028, Кишинев) и на веб-сайте НСАА (www.cnaa.md).

Автореферат разослан „ 31 ” мая 2012 г.

Ученый секретарь Ученого специализированного совета DH 09.03.00.07 – 11, ЧИЛОЧИ Александра, доктор биологии Научный руководитель, БУРЦЕВА Светлана, доктор хабилитат биологических наук, профессор Научный консультант, ШЕПТИЦКИЙ Владимир, доктор хабилитат биологических наук, доцент Автор БРАТУХИНА Антонина (© Братухина Антонина, 2012) КОНЦЕПТУАЛЬНЫЕ ОРИЕНТИРЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Актуальность темы. Актиномицеты рода Streptomyces являются продуцентами более половины из всех известных биологически активных соединений, нашедших свое применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и других отраслях [30]. Широкое использование стрептомицетов в качестве источников получения веществ с высокой биологической активностью является основной причиной изучения их изменчивости и стабилизации свойств. Это способствует решению как теоретических (выявление закономерностей вариабельности актиномицетов, определение их таксономической значимости критериев дифференциации, дальнейшее совершенствование систематики и т.д.), так и практических вопросов (увеличение выпуска продукции, изыскание новых полезных биологически активных соединений и др.) [14, 20, 30].

Необходимость улучшения ценных свойств стрептомицетов заставляет изыскивать помимо традиционных (усовершенствование сред, поиск природных стимуляторов роста и т.д.) и другие методы, способствующие повышению их биосинтетической активности.

Большой интерес проявляется и к электромагнитным излучениям (ЭМИ) различного происхождения, разной мощности и интенсивности [5, 18, 24].

Описание ситуации в области исследования и постановка задач исследования.

Стрептомицеты являются одной из наиболее продуктивных и перспективных групп в отношении внедрения биологически активных веществ различной химической природы и сферы применения [29]. По данным литературы, добавление комплексных препаратов микробного происхождения, в том числе и Streptomyces massasporeus, в рацион птицы и животных способствует увеличению привесов, повышению продуктивности, улучшению обмена веществ и положительно влияет на состояние иммунной системы [2, 3, 10, 11]. Это приобретает особое значение в связи с обострением проблемы стресса по мере индустриализации сельского хозяйства, поскольку доказана важная роль острого чрезмерного и хронического стресса в снижении продуктивности и резистентности организма животных к воздействию различных неблагоприятных факторов [26].

Известно, что для создания высокоэффективных биопрепаратов необходимо знание особенностей штаммов-продуцентов: морфолого-культуральных признаков, биосинтетической активности, изменчивости и условий для их сохранности. В появившихся в последние десятилетия экспериментальных работах отмечается повышение гетерогенности популяции в стационарной фазе роста, стареющих и длительно хранящихся микробных культурах [21, 34, 36]. Отмечается, что значительно меньшей изменчивости подвержены морфологические признаки по сравнению с культуральными и уровнем биосинтетической активности [8, 19, 38]. Обнаружение явления гомологических рядов в наследственной изменчивости актиномицетов предоставило возможность классифицировать фенотипически разнородные варианты по ориентирным признакам и выявлять их путем варьирования условий культивирования [20].

Многочисленными исследованиями показано, что значительный стимулирующий эффект на образование биологически активных веществ стрептомицетами, помимо изменений условий культивирования (состава среды, активной кислотности, температуры культивирования и т.д.), может оказывать воздействие ЭМИ [5, 24]. Накопленный к настоящему времени фактический материал о влиянии ЭМИ на биологические объекты является основанием для расширения диапазона поисков его прикладного использования.

Учитывая ранее сказанное, цель работы: изучение естественной изменчивости и биосинтетической активности культур актиномицетов Streptomyces massasporeus после длительного хранения и воздействия электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности, а также перспектив использования синтезируемых ими биологически активных веществ для повышения резистентности организма животных к действию стрессогенных факторов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

изучение естественной изменчивости и биосинтетической активности культур актиномицетов S. massasporeus после длительного хранения в лиофилизированном состоянии и на агаризованной среде Чапека;

изучение действия ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности на изменчивость и биосинтетическую активность актиномицетов S. massasporeus;

разработка условий культивирования для повышения биосинтетической активности штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06;

исследование влияния биологически активных компонентов биомассы и культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 на некоторые морфологические, функциональные, репродуктивные показатели и поведенческие характеристики белых крыс в условиях хронического стресса.

Методология научного исследования базируется на принципах и методах, которые широко используются в микробиологии. Естественную изменчивость изучали по методике В.Д. Кузнецова [19]. Ряд показателей биосинтетической активности изучали гравиметрическим, полярографическим и хроматографическими методами, описанными в работах [1, 4, 13, 37]. Антимикробные свойства изучали методом агаровых блоков [14]. В качестве источника ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности (мВт/см210мВт/см2) использовали генератор ЭМИ “Явь-1” (Россия) с длиной волны 5,6 мм (53,8 гГц) в непрерывном режиме работы. Физиологические эффекты исследовали по известным методикам, описанным в работах [17, 25, 28].

Обработку полученных данных проводили с использованием статистических методов с применением программ “Excel”, “Statistica” [23].

Научная новизна и оригинальность полученных результатов.

Впервые выявлен ряд внутривидовой изменчивости популяции пигментообразующих актиномицетов S. massasporeus и показаны изменения морфолого-культуральных свойств и биосинтетической активности актиномицетов в зависимости от способа хранения.

Впервые установлена перспектива использования ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности для уменьшения гетерогенности пигментообразующих актиномицетов S. massasporeus и повышения их биосинтетической активности.

Выявлена корреляция между степенью насыщенности липидов и активностью липоксигеназы у штамма S. massasporeus CNMN- Ac-06 в зависимости от концентрации фосфора в среде.

Впервые установлено, что биологически активные компоненты биомассы и культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 способствуют нормализации процесса всасывания активно транспортируемых пищевых веществ в тонкой кишке и увеличению прироста массы тела, а также облегчению выработки оборонительных условных рефлексов в условиях хронического стрессирования.

Оригинальность работы заключается в использовании ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности для уменьшения гетерогенности пигментообразующих стрептомицетов и увеличения их биосинтетической активности.

Научная проблема, рассматриваемая в исследовании, заключается в определении изменчивости штаммов S. massasporeus – продуцентов биологически активных веществ, возможности управления их синтезом и перспектив использования продуктов метаболизма.

Теоретическая значимость работы состоит в совершенствовании таксономии актиномицетов р. Streptomyces и показе возможности управления биосинтетическими процессами и гетерогенностью стрептомицетов при помощи ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности и изменения условий культивирования.

Изучены особенности действия веществ, синтезируемых S. massasporeus CNMN Ac-06, на некоторые морфологические, функциональные, репродуктивные показатели и поведенческие характеристики белых крыс в условиях хронического стресса, которые могут служить основой для разработки новых биопрепаратов, предназначенных для повышения интенсивности роста, плодовитости и резистентности макроорганизма к действию неблагоприятных факторов.

Прикладное значение. Выбраны и рекомендованы агаризованные питательные среды для поддержания штаммов S. massasporeus в лабораторных условиях, обеспечивающие хороший рост и максимальную однородность популяции;

предложены питательные среды для глубинного культивирования, повышающие биосинтетическую активность стрептомицетов;

установлены оптимальные параметры воздействия ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности, обеспечивающие максимальную однородность популяции пигментообразующих актиномицетов S. massasporeus и стимулирующие их биосинтетическую активность;

полученные результаты обозначили перспективу использования биомассы и культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac- для профилактики и коррекции стрессовых нарушений у теплокровных животных.

Основные научные результаты, выдвинутые на защиту:

1. Культивирование на средах АЧгл, КАА, СР-I, Гаузе, МПА позволяет выявить варианты, составляющие популяцию, а на средах КГА и ОА – хороший рост и наименьшую изменчивость.

2. Гомологический ряд внутривидовой изменчивости популяции S. massasporeus включает варианты: основной, блеклый, белый, олигоспоровый, альтерколерный, карликовый и аспорогенный.

3. Продуктивность и биосинтетическая активность актиномицетов S. massasporeus может быть увеличена путем изменения условий культивирования (состава среды, рН, температуры) и воздействием ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности.

4. Изучаемый штамм S. massasporeus CNMN-Ac-06 может служить основой при разработке биопрепаратов для повышения резистентности макроорганизма к действию стрессогенных факторов.

Внедрение научных результатов. Предложены питательные среды для хранения штаммов актиномицетов S. massasporeus в лабораторных условиях и параметры воздействия ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности, обеспечивающие наименьшую вариабельность, хороший рост и сохранность биосинтетической активности.

Основные результаты исследований внедрены в работу Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов ИМБ АНМ и в учебный процесс медицинского факультета ПГУ им. Т.Г. Шевченко.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Съезде товарищества микробиологов Украины (Одесса, 2004), XXX Румыно-Американском конгрессе (Кишинев, 2005), Международном симпозиуме (Москва, 2007), Международных научных конференциях (Одесса, 2006;

Кишинев 2011), Международных конференциях молодых ученых (Кишинев, 2004-2007;

Одесса, 2005;

Москва, 2006;

Тирасполь, 2007-2008;

Львов, 2008;

Пущино, 2005-2008, 2010).

Публикации. На основе материалов диссертации опубликовано 19 научных работ, из которых 5 в рецензируемых журналах (включая 3 без соавторов).

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 118 страницах основного текста, включая 44 рисунка и 14 таблиц. Работа содержит резюме на румынском, русском, английском языках, введение, 4 главы, общие выводы и рекомендации, библиографию из 210 наименований и 10 приложений.

Ключевые слова: стрептомицеты, изменчивость, аминокислоты, липиды, жирные кислоты, антимикробная активность, ЭМИ мм- диапазона низкой интенсивности, стресс.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. АКТИНОМИЦЕТЫ РОДА STREPTOMYCES – ПРОДУЦЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ КАК ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Данная глава включает детальный анализ научных публикаций и синтез накопленных знаний в исследуемой области. Особое внимание было уделено вопросам, касающимся естественной изменчивости и биосинтетической активности актиномицетов рода Streptomyces. Проанализировано действие различных факторов, влияющих на биосинтетическую активность микроорганизмов, в том числе и стрептомицетов.

Рассмотрены биологически активные вещества, синтезируемые актиномицетами рода Streptomyces, и их практическое значение.

2. ЕСТЕСТВЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ АКТИНОМИЦЕТОВ STREPTOMYCES MASSASPOREUS ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ Научная проблема, рассматриваемая в этой главе, заключается в определении естественной изменчивости и биосинтетической активности культур актиномицетов S. massasporeus в зависимости от способа хранения.

2.1. Естественная изменчивость штаммов S. massasporeus CNMN-Ac-06, S. massasporeus CNMN-Ac-07 и S. massasporeus CNMN-Ac-08 после хранения на агаризованной среде Чапека Согласно данным литературы, при частом культивировании или длительном хранении культур существенно увеличивается гетерогенность популяции [31, 38]. Для максимально полного выявления характера изменчивости культуры подбирают такую питательную среду, на которой его вариабельность проявляется в наибольшей степени.

Для поддержания штамма и стабилизации его свойств подбирают среду, на которой изменчивость штамма проявляется слабо или не проявляется вообще. В наших исследованиях была изучена изменчивость трех штаммов S. massasporeus после длительного хранения (6 лет) на агаризованной среде Чапека (+4С), не подвергавшихся длительному стабилизирующему отбору, и особенности их роста.

Объектом исследования являлись штаммы стрептомицетов из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов АНМ (депонированные 27.05.2010):

S. massasporeus CNMN-Ac-06, выделенный из почвы Молдовы, и два его варианта S. massasporeus CNMN-Ac-07 и S. massasporeus CNMN-Ac-08, изолированные при естественном рассеве S. massasporeus CNMN-Ac-06. Культуры хранили на агаризованной среде Чапека при температуре +4°С с периодическими пересевами в течение 6-ти лет.

Естественную изменчивость штаммов изучали путем посева спор на агаризованные среды: Чапека с глюкозой (АЧгл), овсяную (ОА), синтетическую среду Красильникова I (СР-I), картофельно-глюкозную (КГА), мясо-пептонную (МПА), крахмало-аммиачную (КАА), глюкозо-аммиачную (ПГ), Гаузе, описания и подсчета всех морфологических типов колоний [12]. Для обозначения окраски мицелия пользовались таблицей цветов Бондарцева [6]. В качестве критерия для оценки роста культур на агаризованных средах использовали показатели радиальной скорости роста (Кr) [16].

При рассеве спор штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 после хранения на разные агаризованные среды было выявлено 7 морфотипов колоний: основной, блеклый, белый, олигоспоровый, аспорогенный, карликовый и альтерколерный. Колонии всех типов изучаемого штамма на разных средах различались количественным соотношением, размером, цветом воздушного и иногда субстратного мицелия. Блеклые типы колоний зафиксированы на среде АЧгл, карликовые – на среде Гаузе, аспорогенные – на средах ПГ и МПА, альтерколерные – на средах СР-I и КАА. Наибольшую вариабельность штамма фиксировали на средах СР-I и АЧгл (4 -5 типов колоний), а наименьшую – на средах КГА и ОА. Кроме того, гетерогенность культуры четко фиксировали и при культивировании штамма на ферментационной среде M-I. Следует отметить, что при изучении естественной изменчивости S. massasporeus CNMN-Ac-06 до хранения были обнаружены 4 морфотипа колоний: основной, олигоспоровый, белый и альтерколерный [2].

Высев S. massasporeus CNMN-Ac-07 на агаризованные среды АЧгл, КАА, СР-I, Гаузе и МПА показал однородность популяции этого стрептомицета, тогда как на средах ОА, КГА и ПГ популяция изучаемого штамма была гетерогенна. Отмечено, что на среде КГА у колоний одинаковый светло-коричневый цвет субстратного мицелия и различный цвет воздушного мицелия. Колонии с воздушным мицелием сероватого цвета, в отличие от колоний с кремовым цветом, выделяют в среду пигмент розового цвета. Выделение пигмента и окрашивание среды в розовато-фиолетовый цвет отмечено на средах АЧгл, СР-I, ОА и Гаузе.

При изучении изменчивости S. massasporeus CNMN-Ac-08 отмечено, что у стрептомицета при выращивании на разных агаризованных средах изменяется цвет воздушного мицелия, а цвет субстратного мицелия постоянен. Зафиксированы колонии с цветом воздушного мицелия мышино-серого, серого, бледно-сероватого и белого.

Наибольшую гетерогенность штамм проявлял на средах КАА и Гаузе. Однородность отмечали на средах МПА и ПГ, но колонии были аспорогенные.

Анализ радиальной скорости роста показал, что штамм S. massasporeus CNMN Ac-06 лучше растет на средах АЧгл, ОА, КГА и КАА, а S. massasporeus CNMN-Ac-07 – на средах КГА, ОА и СР-I, где значения Кr колеблются в пределах 20,8-26,8 мкм/ч. У S. massasporeus CNMN-Ac-08 отмечен хороший рост почти на всех средах и принадлежит диапазону 20,8–32,3 мкм/ч, исключая значения Кr на средах ПГ и МПА.

Таким образом, проведенные исследования показали, что после множественных пересевов и длительного хранения на агаризованной среде Чапека (6 лет) популяция изучаемых штаммов на ряде сред гетерогенна. Полученные результаты согласуются с данными литературы, которые свидетельствуют, что у большинства микроорганизмов наблюдается популяционная изменчивость по фенотипическому проявлению экспрессии генов [21, 34]. Экспрессия генов изменяется при смене субстрата, что особенно актуально для поддержания коллекций микроорганизмов [31]. Разнообразие вариантов можно объяснить существованием в клетках регуляторов, наличие или отсутствие которых приводит к значительным перестройкам метаболизма клеток и, соответственно, к образованию определенных клонов клеток, формированию разных типов колоний [15].

2.2. Естественная изменчивость штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 после хранения в лиофилизированном состоянии Для более полной характеристики естественной изменчивости S. massasporeus CNMN-Ac-06 было проведено изучение вариантного состава популяции штамма после хранения в лиофилизированном состоянии (6 лет). Исследования показали, что после вскрытия ампулы с лиофилизированной культурой, ее регенерации и высева на 8 сред культура была однородной. Комплексу таксономических свойств, присущих основному варианту данного вида, соответствовали только колонии, выросшие на средах ОА и КГА.

На всех остальных средах колонии были аспорогенные. Пересев S. massasporeus CNMN Ac-06 на разные агаризованные среды через 3 месяца показал, что популяция штамма гетерогенна, а через 6 месяцев – данные были сходны с полученными при изучении гетерогенности после хранения на среде АЧгл.

Изучение естественной изменчивости штаммов S. massasporeus на разных агаризованных средах после хранения в лиофилизированном состоянии и на среде АЧгл, применяя классификацию и терминологию В.Д. Кузнецова [19, 20], позволило дополнить вариантный состав популяции Streptomyces massasporeus и выявить гомологический ряд их внутривидовой изменчивости (рис. 2.1).

основной белый альтерколерный Streptomyces massasporeus аспорогенный олигоспоровый карликовый блеклый Рис. 2.1. Вариантный состав популяции Streptomyces massasporeus.

Основной тип колоний характеризуется комплексом таксономических свойств, присущих данному виду [12]. У блеклого типа колоний цвет воздушного и субстратного мицелия выражен слабее по сравнению с основным вариантом. Белый тип колоний имеет белый цвет воздушного мицелия, а цвет субстратного мицелия и растворимого пигмента как у основного типа колоний. У олигоспорового типа колоний воздушный мицелий покрывает тонким налетом всю колонию или отдельные ее части разной окраски, а цвет субстратного мицелия и растворимого пигмента как у основного типа колоний.

Аспорогенные колонии отличаются от основного типа колоний только отсутствием воздушного мицелия, а аспорогенные апигментные – воздушного мицелия и пигментации.

Окраска моноколерных аспорогенных колоний обусловлена лишь одним, количественно превалирующим пигментом из комплекса пигментов, синтезируемых основным вариантом. Карликовые колонии мелкие, иногда точечные, а цвет субстратного мицелия и растворимого пигмента как у основного или блеклого типа колоний. Альтерколерный вариант обладает иной, нежели у основного типа колоний, окраской воздушного и субстратного мицелия и пигмента (рис. 2.1) [20].

Таким образом, в результате исследований выявлен ряд внутривидовой изменчивости S. massasporeus. Показано, что лиофилизация спор является эффективным методом для стабилизации морфолого-культуральных свойств S. massasporeus CNMN- Ac-06.

2.3. Изменение биосинтетической активности актиномицетов Streptomyces massasporeus после длительного хранения Известно, что неразрывно с морфологической дифференциацией и по определенному временному плану в специализированных структурах стрептомицетов происходят метаболические изменения, наиболее выраженным из которых является биосинтез биологически активных веществ. Поддержание стабильного уровня биосинтетической активности при хранении штаммов-продуцентов является обязательным условием. В литературе описаны различные способы хранения микроорганизмов, однако ни один из них не является универсальным [27, 38]. Показано, что необходимо индивидуально подбирать наиболее эффективные условия хранения для каждого конкретного штамма [27]. В связи с этим было изучено влияние длительного хранения (6 лет) актиномицетов S. massasporeus в лиофилизированном состоянии и лабораторных условиях на среде АЧгл на ряд показателей биосинтетической активности (образование биомассы, липидов, жирных кислот (ЖК), аминокислот (АК)) и антимикробные свойства.

2.3.1. Накопление биомассы, синтез липидов и аминокислот штаммом S. massasporeus CNMN-Ac-06 после хранения в лиофилизированном состоянии Следует отметить, что до лиофилизации высокий выход биомассы (12,1±0,7 г/л), липидов и аминокислот наблюдался при культивировании S. massasporeus CNMN-Ac- на среде М-I [2]. Основываясь на этих данных, после вскрытия ампулы с лиофилизированной культурой и ее регенерации культивирование проводили на этой среде.

Опыты показали, что количество образуемой биомассы на среде М-I после лиофилизации уменьшилось на 24,8%, а содержание липидов в ней снизилось незначительно (5,9±0,3 и 5,3±0,6% соответственно). Качественный и количественный состав липидов после лиофилизации также не изменился, за исключением незначительного увеличения суммарной фракции глицеридов (на 8,0±0,2%) [8]. При этом в жирнокислотном составе липидов биомассы отмечено уменьшение количества миристиновой (C14:0), пентадекановой (C15:0), пальмитоолеиновой (C16:1), пальмитиновой (C16:0), стеариновой (C18:0), олеиновой (C18:1) кислот и выявлена линолевая кислота (С18:2) в количестве 17,6±0,9% от суммы жирных кислот (рис. 2.2).

% от суммы ЖК количество ЖК, 3:0 4:0 5:0 6:1 6:0 7:2 7:1 7:0 8:1 8: 8: С1 С1 С1 С1 С1 С1 С1 С1 С1 С C до лиофилизации культуры после хранения культуры в лиофилизированном состоянии Рис. 2.2. Содержание основных жирных кислот липидов в биомассе штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 при культивировании на среде M-I до лиофилизации и после хранения в течение 6-ти лет.

Анализ аминокислотного состава S. massasporeus CNMN-Ac-06 после хранения в лиофилизированном состоянии выявил значительное уменьшение содержания в биомассе стрептомицета таких незаменимых АК как, метионин, изолейцин, лизин, гистидин и аргинин, и увеличение количества иммуноактивных АК: треонина, серина, аланина, валина, цистина, аспарагиновой и глутаминовой кислот (рис. 2.3).

количество АК, мг/г в АСБ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 аминокислота до лиофилизации культуры после хранения культуры в лиофилизированном состоянии Аминокислота: 1* - метионин, 2* - изолейцин, 3*- лизин, 4* - гистидин, 5* - аргинин, 6* - фенилаланин, 7* - лейцин, 8* - треонин, 9* - валин, 10 - аспарагиновая кислота, 11 - глутаминовая кислота, 12 - аланин, 13 - цистин, 14 - серин, 15 - -аминомасляная кислота, 16 - пролин, 17 - глицин, 18 – тирозин. * - незаменимые АК, - иммуноактивные АК.

Рис. 2.3. Аминокислотный состав биомассы штамма S. massasporeus CNMN-Ac- при культивировании на среде М-I до лиофилизации культуры и после хранения в течение 6-ти лет.

Таким образом, длительное хранение штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 в лиофилизированном состоянии (6 лет) вызывает снижение продуктивности биомассы при неизменности процесса липидообразования (качественного и количественного состава липидов), а также увеличение доли иммуноактивных аминокислот на фоне снижения количества незаменимых аминокислот [8]. Стимуляцию образования иммуноактивных аминокислот и уменьшение некоторых жирных кислот в клетках можно объяснить ответной реакцией на длительное хранение и воздействие факторов, возникающих на этапах лиофилизации, а также одним из проявлений процессов репарации [27].

2.3.2. Накопление биомассы, липидообразование и антимикробная активность штаммов S. massasporeus CNMN-Ac-06, S. massasporeus CNMN-Ac-07 и S. massasporeus CNMN-Ac-08 после хранения на агаризованной среде Чапека Проведенное ранее изучение физиолого-биохимических особенностей 3-х штаммов актиномицетов S. massasporeus показало, что основная культура S. massasporeus CNMN Ac-06 больше накапливает биомассы, вариант S. massasporeus CNMN-Ac-07 отличается от основной культуры антибиотическими свойствами, а вариант S. massasporeus CNMN Ac-08 – жирнокислотным составом и наименьшим коэффициентом насыщенности липидов биомассы [2]. Культивирование изучаемых стрептомицетов на ферментационной среде М-I после хранения на среде АЧгл (6 лет) показало, что наиболее высокий выход биомассы был у S. massasporeus CNMN-Ac-06 (8,1±0,7 г/л), а наименьший – у варианта S. massasporeus CNMN-Ac-07 (5,6±0,4 г/л). Отмечено, что вариант S. massasporeus CNMN Ac-08 синтезировал больше липидов по сравнению с основной культурой (6,1±0,3% и 5,3±0,6% соответственно в АСБ), а вариант S. massasporeus CNMN-Ac-07 – меньше (3,4±0,4% в АСБ) [9]. Анализ состава ЖК липидов биомассы S. massasporeus CNMN-Ac 06 и его вариантов показал, что преобладающими являлись i-C15:0, a-C15:0, i-C16:0, C16:0, C18: и C18:2. Максимальное количество ненасыщенных ЖК выявлено у варианта S. massasporeus CNMN-Ac-08 (рис. 2.4). При этом коэффициент насыщенности липидов биомассы у S. massasporeus CNMN-Ac-08 составлял 0,9±0,2 и был меньше в 1,9 раз по сравнению с основной культурой.

% от суммы ЖК количество ЖК, 30 S. massasporeus CNMN-Ac- S. massasporeus CNMN-Ac- S. massasporeus 4:0 4:0 -15:0 15:0 15:0 -16:0 16:1 16:0 -17:1 -17:0 17:0 17:0 18:2 18:1 18:0 CNMN-Ac- i-1 C 1 s a- a i C Ci C Ci Ci C C C C C ci C C C C Рис. 2.4. Содержание основных жирных кислот липидов в биомассе штаммов S. massasporeus при культивировании на среде М-I после хранения на агаризованной среде Чапека в течение 6-ти лет.

Определение антимикробной активности изучаемых культур после длительного хранения на среде АЧгл показало, что метаболиты штамма S. massasporeus CNMN-Ac- и S. massasporeus CNMN-Ac-07 подавляли рост всех исследуемых тест-культур. При этом метаболиты S. massasporeus CNMN-Ac-07 сохранили более высокую антимикробную активность по отношению к B. subtilis, X. campestris и A. alternata (таб. 2.1).

Таблица 2.1. Антимикробные свойства штаммов S. massasporeus после длительного хранения на агаризованной среде Чапека Диаметр зон задержки роста тест-культур, мм S. massasporeus S. massasporeus S. massasporeus Тест-культуры CNMN-Ac-06 CNMN-Ac-07 CNMN-Ac- до после до после до после хранения хранения хранения хранения хранения хранения (1999 г.) (2005 г.) (1999 г.) (2005 г.) (1999 г.) (2005 г.) Bacillus subtilis 10,0 12,0±0,9 15,0 15,0±0,6 10,0 10,0±0, Xanthomonas campestris 18,0±0,6 22,0±0,3 12,0±0, Corynebacterium michiganense 24,0±0,7 16,0±0,6 17,0±0, Erwinia carotovora 26,0±0,3 24,0±0,7 16,0±0, Pseudomonas syringae 22,0±0,9 18,0±0,7 16,0±0, Aspergillus niger 10,0 12,0±0,5 10,0 11,0±0,9 10,0 Alternaria alternatа 10,0 14,0±0,6 19,0 18,0±0,5 10,0 14,0±0, Fusarium solani 17,0 16,5±0,6 18,0 14,0±0,6 10,0 Botrytis cinerea 17,0±0,8 13,0±0,5 Примечание: в колонках за 1999 год – данные [2], ‘–’ - исследования не проводились.

Таким образом, длительное хранение штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 и его вариантов S. massasporeus CNMN-Ac-07 и S. massasporeus CNMN-Ac-08 на агаризованной среде Чапека (6 лет) и периодические пересевы не повлияли на физиолого-биохимические особенности изучаемых культур.

3. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА БИОСИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ АКТИНОМИЦЕТОВ STREPTOMYCES MASSASPOREUS Изучение закономерностей биосинтеза необходимых продуктов жизнедеятельности и выяснение условий развития организма, обеспечивающих преимущественное образование интересующих биологически активных веществ (БАВ), дает возможность регулировать биосинтетическую деятельность микроорганизма и давать ей нужное направление [14]. Научная проблема, рассматриваемая в этой главе, заключается в определении факторов, влияющих на изменчивость и биосинтетическую активность актиномицетов S. massasporeus, и разработке условий культивирования для ее повышения у штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06.

3.1. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности на изменчивость и биосинтетическую активность актиномицетов Streptomyces massasporeus Согласно данным литературы, облучение ЭМИ миллиметрового (мм-) диапазона может при определенных условиях оказывать стимулирующее действие на динамику клеточного размножения микроорганизмов, физиологические и биохимические свойства клеток [5, 24]. В связи с этим было изучено влияние воздействия низкоинтенсивного ЭМИ мм- диапазона на характер изменчивости и рост актиномицетов S. massasporeus, а также биосинтез липидов, аминокислот и изменение антимикробных свойств.

Исследования показали, что после воздействия на S. massasporeus CNMN-Ac- ЭМИ мм- диапазона и пересева спор на среду АЧгл, на которой ранее фиксировали наибольшую гетерогенность, популяция представлена колониями 4 типов. Количество и соотношение типов колоний зависело от времени облучения. Наибольшее количество морфотипов фиксировали после облучения культуры в течение 15-ти минут. Облучение стрептомицета в течение 3-х, 5-ти и 10-ти минут вызывало появление только основного и олигоспорового типов колоний (таб. 3.1). При этом положительное влияние на рост S. massasporeus CNMN-Ac-06 оказывало облучение штамма в течение 5-ти и 10-ти минут.

Значения радиальной скорости роста принадлежали диапазону 23,8-26,8 мкм/ч на 7-е сутки роста, 14,9-16,4 мкм/ч – на 14-е сутки роста и 10,4 мкм/ч – на 21-е сутки роста по сравнению с контрольными (23,8 мкм/ч, 11,9 мкм/ч и 8,9 мкм/ч соответственно).

Таблица 3.1. Влияние времени воздействия ЭМИ мм- диапазона низкой интенсивности на гетерогенность S. massasporeus CNMN-Ac-06 при выращивании на среде АЧгл Время воздействия ЭМИ мм- диапазона Соотношение Контроль типов колоний, % (0 мин.) 1 мин. 3 мин. 5 мин. 10 мин. 15 мин. 30 мин.

основной 71,9±0,9 88,0±1,3 75,0±0,6 90,2±1,5 87,1±1,8 81,0±1,6 74,5±0, олигоспоровый 15,8±0,8 8,8±0,7 25,0±1,3 9,8±0,9 12,9±0,5 6,0±0,9 10,2±1, 12,0±0,4 15,3±0, белый 10,5±0,5 3,2±0, 1,0±0,2 аспорогенный 1,8±0, Уменьшение гетерогенности в популяции S. massasporeus CNMN-Ac-06 после воздействие ЭМИ мм- диапазона в течение 3-х, 5-ти и 10-ти минут по сравнению с контролем можно объяснить ответной реакцией культуры на облучение, проявляющейся в изменении ее развития и роста в зависимости от времени обработки. Так, исследованиями показано, что обработка посевного материла S. xanthochromogenes ЭМИ оказывает влияние на развитие культуры в жидкой среде, начиная от образования ростовой трубки и до образования микроколоний, а также изменяет способность прорастания спор как в жидкой питательной среде, так и в почве. 15-секундное облучение споровой суспензии приводило к угнетению роста культуры по сравнению с контролем, а 30-секундное – к стимуляции [18].

Изучение влияния низкоинтенсивного ЭМИ мм- диапазона на ряд показателей биосинтетической активности изучаемых стрептомицетов показало, что облучение вызывает стимуляцию липидообразования у S. massasporeus CNMN-Ac-06 и S. massasporeus CNMN-Ac-08, но при этом уменьшается выход их биомассы. Содержание липидов в биомассе этих штаммов после облучения ЭМИ мм- диапазона увеличивалось на 19,4-51,2% и 11,2-177,2% по сравнению с контролем соответственно (таб. 3.2).

Таблица 3.2. Влияние времени воздействия ЭМИ мм-диапазона низкой интенсивности на накопление биомассы и липидообразование штаммов S. massasporeus Время Липиды Биомасса облучения, АСБ Х±m, Х±m, % к контр. % к контр. % к контр.

мин. Х±m, г/л % в АСБ мг/л Streptomyces massasporeus CNMN-Ac- 5,90±0,40* 5,99±0,19* 348,23±2,56* 1 72,13 123,76 88, 6,41±0,44* 6,70±0,50* 3 78,36 138,43 421,77±2,17* 107, 6,90±0,12* 7,32±0,55* 493,63±9,53* 5 84,35 151,24 125, 7,72±0,16 6,30±0,37* 479,57±7,43* 10 94,38 130,17 122, 7,12±0,30 5,91±0,12* 416,97±13, 15 87,04 122,11 106, 6,22±0,17* 5,78±0,34 357,07±9, 30 76,04 119,42 90, Контроль 8,18±0,43 4,84±0,36 392,63±9, 100,0 100,0 100, Streptomyces massasporeus CNMN-Ac- 5,38±0,41 4,44±0,51 174,87±4, 1 104,06 94,87 99, 5,58±0,67 4,09±0,44 164,93±2, 3 107,93 87,39 93, 6,54±0,33* 3,80±0, 5 126,50 81,20 170,87±7,29 97, 6,76±0,47* 3,63±0,13 174,26±4, 10 130,75 77,56 99, 6,03±0,10* 3,02±0,11* 135,36±3,56* 15 116,63 64,53 77, 5,31±0,43 2,79±0,24* 124,41±4,45* 30 102,71 59,62 70, Контроль 5,17±0,29 4,68±0,55 175,73±9, 100,0 100,0 100, Streptomyces massasporeus CNMN-Ac- 6,74±0,18 6,10±0,64 341,03±8, 1 98,39 111,16 108, 6,11±0,25 6,70±0,74 341,17±8, 3 89,20 122,04 108, 5,49±0,16* 14,29±1,19* 644,77±8,55* 5 80,15 260,29 204, 5,73±0,18* 15,22±1,16* 10 83,65 277,23 725,73±9,23* 230, 5,97±0,14* 13,81±1,20* 679,77±6,45* 15 87,15 251,55 215, 6,37±0,29 9,62±0,81* 487,13±4,11* 30 92,99 175,23 175, Контроль 6,85±0,28 5,49±0,57 314,87±7, 100,00 100,0 100, * – достоверные различия между контрольными и опытными значениями (Т952,78);

Х – среднее арифметическое значение, m – стандартная ошибка.

У S. massasporeus CNMN-Ac-07 воздействие ЭМИ мм- диапазона вызывало противоположный эффект: способствовало стимуляции накопления биомассы (на 7,9-30,8%) и уменьшению содержания в ней липидов (на 5,1-40,4%). Максимальное увеличение накопления биомассы и образования липидов отмечали после воздействия ЭМИ мм- диапазона на исследуемые культуры в течение 5-ти и 10-ти минут (таб. 3.2).

Характер влияния ЭМИ мм-диапазона низкой интенсивности на соотношение основных липидных фракций изучаемых культур имел ряд особенностей: увеличение количества фосфолипидов и стеринов у S. massasporeus CNMN-Ac-06 происходило при всех экспозициях воздействия, а триглицеридов – после облучения штамма в течение 3-х минут. Максимальное количество фосфолипидов и стеринов превышало на 19,5 и 27,4 % контрольные значения после воздействия ЭМИ мм- диапазона на S. massasporeus CNMN Ac-06 в течение 15-ти и 10-ти минут соответственно. У S. massasporeus CNMN-Ac- выявлено увеличение только фракции стеринов на 19,9% по сравнению с контролем после облучения культуры в течение 5-ти минут. Воздействие ЭМИ мм- диапазона в течение 1-й, 3-х и 5-ти минут способствовало увеличению фосфолипидов у S. massasporeus CNMN-Ac-08 на 6,1-13,7% по сравнению с контролем, а количество стериновой фракции увеличивалось при всех экспозициях воздействия на этот штамм и превышало на 10,1-51,5% контрольные значения (рис. 3.1).

фосфоли фракции, % к контролю количество липидной пиды 100 стерины триглице риды контроль 0 мин.

мин.

а б 1 3 5 10 15 1 3 5 10 15 ) ЭМИ мм- диапазона низкой интенсивности Рис. 3.1. Влияние времени воздействия на содержание основных липидных фракций в биомассе S. massasporeus CNMN-Ac-06 (а) и S. massasporeus CNMN-Ac-08 (б).

Анализ содержания общего белка и аминокислот в биомассе и культуральной жидкости (КЖ) S. massasporeus CNMN-Ac-06 показал, что воздействие ЭМИ мм диапазона низкой интенсивности носит разнонаправленный характер, вызывая их увеличение в КЖ штамма и уменьшение – в биомассе. Отмечено, что облучение ЭМИ мм диапазона в течение 10-ти, 15-ти и 30-ти минут существенно увеличивает количество лизина (в 1,9-3,2 раза), треонина (в 1,9-2,7 раза), валина (в 3,3-5,5 раза), метионина (в 1,7-3,9 раза), изолейцина (в 2,1-3,9 раз), лейцина (в 1,9-6,2 раза), фенилаланина (в 3,0-6, раза), гистидина (в 1,5-1,6 раза) и аргинина (в 1,4-4,4 раза) в КЖ штамма по сравнению с контролем. При этом максимальное содержание незаменимых, иммуноактивных и серосодержащих аминокислот в КЖ штамма возрастает в 2,1-3,7 раза и отмечено после его облучения в течение 10-ти минут.

Определение антимикробной активности S. massasporeus CNMN-Ac-06 после облучения ЭМИ мм- диапазона показало, что она уменьшается по отношению к исследуемым тест-культурам бактерий и грибов. Воздействие ЭМИ мм- диапазона на S. massasporeus CNMN-Ac-07 вызывало уменьшение антимикробной активности по отношению к фитопатогенным бактериям и увеличение – по отношению к фитопатогенным грибам: F. solani, F. graminearum и A. niger. Замечено увеличение зон задержки роста B. cinerea (на 12,5-20,8%) при всех экспозициях облучения и A. alternata (на 13,2%) после облучения культуры в течение 10-ти минут по сравнению с контролем.

Таким образом, исследования показали, что эффект воздействия ЭМИ мм диапазона низкой интенсивности на актиномицеты S. massasporeus зависит от штамма и продолжительности времени воздействия на культуру [7]. Установленные эффекты можно объяснить тем, что изучаемые штаммы обладают индивидуальными особенностями и, как следствие, неодинаковой чувствительностью к воздействию ЭМИ мм- диапазона низкой интенсивности. В результате, это приводит в одних случаях к стимуляции роста стрептомицета и синтеза им биологически активных веществ, в других – к подавлению, а в третьих – вызывает разнонаправленные изменения.

3.2. Влияние условий культивирования на биосинтетическую активность актиномицетов Streptomyces massasporeus При выявлении потенциальных возможностей микроорганизмов образовывать биологически активные вещества (БАВ) подбору сред уделяют самое серьезное внимание.

Важнейшими причинами повышенного внимания к использованию соевой муки в качестве питательной основы являются ее доступность, уникальный химический состав, высокая биологическая ценность и низкая стоимость [22].

Решающим критерием пригодности среды является содержание в ней веществ, которые могут быть использованы для синтеза биологически активных веществ микроорганизмом. Поэтому были проведены исследования для выяснения влияния соевой муки как дополнительного компонента среды культивирования SP-I на накопление биомассы, биосинтез липидов и аминокислот штаммов S. massasporeus CNMN-Ac-06, S. massasporeus CNMN-Ac-07 и S. massasporeus CNMN-Ac-08.

Результаты исследований показали, что культивирование изучаемых штаммов на среде SP-I способствует стимуляции накопления биомассы и процесса липидообразования у S. massasporeus CNMN-Ac-06 в 1,7 и 2,6 раза, а у S. massasporeus CNMN-Ac-08 в 1,8 и 1,7 раза по сравнению с культивированием на среде M-I соответственно (таб. 3.3).

Таблица 3.3. Накопление биомассы и липидообразование штаммами S. massasporeus при культивировании на средах М-I и SP-I Биомасса Липиды Среда M-I Среда SP-I Среда M-I Среда SP-I Культура АСБ АСБ % к Х±m на Х±m, Х±m, % к Х±m Х±m, г/л Х±m, г/л среде M-I % в АСБ % в АСБ на среде M-I S. massasporeus 7,18±1,07 12,27±1,19* 4,96±0,90 12,81±1,64* 170,89 258, CNMN-Ac- S. massasporeus 4,76±1,10 4,81±0, 5,56±0,54 116,81 5,01±0,62 104, CNMN-Ac- S. massasporeus 5,58±1,41 9,98±0,70* 5,25±0,45 8,99±0,73* 178,85 171, CNMN-Ac- Среда культивирования Углерод, г/л Азот, г/л Фосфор, г/л Примечание:

Среда M-I 10,18 0,49 0, Среда SP-I 18,06 1,01 0, * – достоверные различия между контрольными (среда M-I) и опытными (среда SP-I) значениями (Т952,78);

Х – среднее арифметическое значение, m – стандартная ошибка.

Анализ количества основных липидных фракций выявил, что присутствие соевой муки в среде SP-I способствует увеличению фракции фосфолипидов у изучаемых штаммов на 21,3–56,8%, стеринов у S. massasporeus CNMN-Ac-06 на 28,4% и у S. massasporeus CNMN-Ac-08 на 10,5% и практически не влияло на содержание в липидах фракции триглицеридов по сравнению с культивированием на среде M-I.

Изучение аминокислотного состава биомассы показало, что при культивировании на среде SP-I у S. massasporeus CNMN-Ac-06 увеличивается количество общего белка (на 32,4%), отдельных АК и суммарное содержание незаменимых (на 28,6%), иммуноактивных (на 29,6%) и протеиногенных (на 32,4%) АК, а у S. massasporeus CNMN-Ac-07 – отдельных АК и суммарное содержание незаменимых АК (на 11,8%) по сравнению с таковыми при культивировании на среде М-I. У S. massasporeus CNMN Ac-08 культивирование на среде SP-I вызывало противоположный эффект: уменьшение количества как общего белка в биомассе, так и аминокислот.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что соевая мука как дополнительный компонент среды SP-I оказывает положительное влияние с различным уровнем эффективности действия. Существенное увеличение накопления биомассы и содержания в ней липидов, незаменимых и иммуноактивных АК у S. massasporeus CNMN Ac-06 при культивировании на среде SP-I явилось основанием для дальнейшего определения потенциальных возможностей этого штамма.

Известно, что хорошему росту микроорганизма и высокому уровню его биосинтетической активности способствует оптимальное содержание фосфора в среде.

Кроме того, на способность микроорганизма образовывать биоактивные вещества оказывает влияние активная кислотность (рН) и температура среды [14]. Поэтому в дальнейшем была проведена серия опытов для определения оптимальной концентрации фосфора в среде, температуры и рН среды SP-I, способствующие увеличению количества биомассы и повышению доли липидов в ней у S. massasporeus CNMN-Ac-06.

Дополнительным источником фосфора в среде культивирования SP-I являлось соединение K2HPO4, которое добавляли в среду в количестве 1,0;

3,0 и 5,0 г/л.

Исследования показали, что рост биомассы и процесс липидообразования происходили наиболее активно при культивировании на среде SP-I с добавлением 3,0 г/л двузамещенного фосфата калия. Продуктивность липидов при этом была больше в 2, раза. Замечено, что добавление в среду соли фосфора (K2HPO4) способствовало также увеличению ненасыщенных ЖК липидов биомассы и активности липоксигеназы, которая коррелировала с содержанием полиеновых ЖК (таб. 3.4). В вариантах, где была зафиксирована высокая активность липоксигеназы, наблюдался и более высокий уровень содержания полиненасыщенных ЖК, что можно объяснить участием фермента в их метаболических превращениях [37].

Изучение влияния температуры и уровня начальной рН среды на продуктивность S. massasporeus CNMN-Ac-06 показало, что штамм лучше культивировать при температуре 27С и рН среды 7,0±0,5. Количество биомассы при росте в данных условиях было максимальным и составляло 14,4±0,1 г/л. Изменение этих показателей среды приводило к резкому уменьшению продуктивности биомассы штамма.

Таблица 3.4. Накопление биомассы и липидообразование штаммом S. massasporeus CNMN-Ac-06 при культивировании на средах с разной концентрацией фосфора Биомасса Липиды Среда Фосфо- Активность липиды, липоксигеназы, АСБ %к Х±m, %к Х±m, %к SP-I+ контр. % к конт. ед/мг белка Х±m, г/л контр. % в АСБ контр. г/л K2HPO SP-I (контр.) 10,55±0,27 100,0 7,84±0,59 100,0 0,83±0,08 100,0 0,38±0, 100, SP-I + 1 г 10,83±0,38* 102,65 13,01±0,68*165,94 1,41±0,11* 169,88 109,68 0,61±0,02* SP-I + 3 г 11,93±0,16* 113,08 13,79±0,79* 175,89 1,64±0,11* 197,59 118,38 0,50±0,01* SP-I + 5 г 13,02±0,44* 123,41 4,81±0,65* 61,35 0,63±0,05 75,90 103,47 0,42±0,02* SP-I+1 г SP-I+3 г SP-I+5 г Примечание: SP-I Среда культивирования (контр.) K2HPO4 K2HPO4 K2HPO Содержание фосфора в среде, г/л 0,20 0,43 0,88 1, * - достоверные различия между контрольными и опытными значениями (Т 952,78);

Х – среднее арифметическое значение, m – стандартная ошибка.

Таким образом, установлено, что оптимальными условиями для накопления биомассы и содержания в ней липидов являются культивирование S. massasporeus CNMN Ac-06 на среде SP-I с добавлением 3,0 г/л К2HPO4 при температуре 27С и рН среды 7,0±0,5.

4. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ШТАММА STREPTOMYCES MASSASPOREUS CNMN-Ac- Исследованиями показано, что добавление к рациону биомассы или культуральной жидкости штамма S. massasporeus способствует интенсификации роста птицы и повышению эффективности использования корма, а также положительно влияет на процесс кроветворения и состояние иммунной системы организма цыплят-бройлеров [2, 10, 11]. Однако основной проблемой внедрения препаратов микробного происхождения остается недостаточная изученность механизмов их действия на организм.

Научная проблема, рассматриваемая в этой главе, заключается в определении эффективности биоактивных компонентов БМ и КЖ штамма S. massasporeus CNMN Ac-06 на некоторые морфофункциональные и поведенческие характеристики макроорганизма в условиях хронического стресса.

Согласно полученным результатам, биомасса штамма S. massasporeus CNMN Ac-06 содержит незаменимые (66-85 мг/г), иммуноактивные (114-148 мг/г) и серосодержащие (11-12 мг/г) аминокислоты, липиды (14-19 % в АСБ), включая фосфолипиды (12-18 % в липидах) и стерины (10-13 % в липидах), ненасыщенные жирные кислоты (40-45 % в липидах), ферменты, а также вещества с антимикробными свойствами.

В составе КЖ обнаружено значительное количество незаменимых (50-55 мг/л), иммуноактивных (82-85 мг/л) и серосодержащих (8-10 мг/л) аминокислот, ферменты и другие физиологически важные соединения.

Опыты показали, что кормление экспериментальных животных кормом с добавлением БМ в обычных физиологических условиях приводит к достоверному увеличению массы их тела (на 23,9-32,2 %), в отличие от КЖ. Поэтому в экспериментах по изучению морфофункциональных особенностей макроорганизма в условиях хронического стресса мы решили использовать биомассу.

Изучение влияния биоактивных компонентов БМ штамма S. massasporeus CNMN Ac-06 на динамику массы тела в условиях теплового стресса проводили на самцах белых крыс породы Вистар, взятых в 4-х недельном возрасте и содержащихся в условиях вивария. Для проведения эксперимента животные были разбиты на 2 опытные группы, каждая из которых включала 2 подгруппы по 12 крыс в каждой. Животные 2-ой и 4-ой подгрупп к основному рациону питания получали предварительно в течение месяца, а затем – на протяжении эксперимента высушенную БМ в дозе 250-300 мг/кг живого веса.

Тепловой стресс моделировали пребыванием экспериментальных животных в жаркий период года в помещении без вентиляции воздуха в течение 14-ти суток.

Температура воздуха в помещении в дневное время суток (на протяжении 4-х часов) составляла 36-38С. Животные опытной группы №1 в течение всего периода эксперимента и опытной группы №2 в до- и постстрессовый период времени содержались в помещении с системой кондиционирования воздуха (в течение суток t=20-22С).

Анализ данных прироста массы тела белых крыс в период теплового стресса показал, что под воздействием экстремально высокой температуры окружающей среды экспериментальные животные подгруппы №3, получавшие стандартный рацион питания, заметно теряли в весе. При этом у животных подгруппы №1, не подвергавшихся тепловому стрессу, наблюдается положительная динамика привесов. Обнаружено, что добавление к корму биомассы S. massasporeus CNMN-Ac-06 способствует повышению массы тела экспериментальных животных как в условиях теплового стресса (подгруппа №4), так и в обычных условиях (подгруппа № 2) (рис. 4.1).

Опытная группа №1 Опытная группа № (животные не подвергались (животные подвергались тепловому стрессу) тепловому стрессу) * *** 15 * ** 12 * * 9 * * * 6 3 1 2 3 4 5 6 7 8 0 - 1 2 3 4 5 6 7 8 дострессовый стрессовый пострессовый период 3 подгруппа (стандартный рацион питания) 1 подгруппа (стандартный рацион питания) 4 подгруппа (стандартный рацион питания + БМ) 2 подгруппа (стандартный рацион питания + БМ ) По оси абсцисс – неделя эксперимента. По оси ординат – прирост массы тела, г.

* - достоверные различия между контролем и опытом (Р0,05).

Рис. 4.1. Динамика прироста массы тела белых крыс при скармливании биомассы штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 в условиях теплового стресса.

Изучение влияния биоактивных компонентов БМ штамма на всасывание пищевых веществ в тонкой кишке проводили на крысах-самцах массой 180-220 г, которым предварительно в течение месяца, а затем на протяжении эксперимента добавляли БМ в дозе 250-300 мг/кг живого веса к стандартному рациону питания. В качестве стрессора использовали жесткую иммобилизацию животных. Контролем служили животные, содержащиеся в обычных условиях и не подвергавшиеся стрессированию. Процессы всасывания в тонкой кишке изучали по методикам, описанным в работах [25, 28].

Полученные результаты показали, что в условиях хронического стрессирования наблюдается существенная редукция активности транспортных систем для глюкозы и глицина. Кормление белых крыс кормом с добавлением БМ штамма S. massasporeus способствует частичной нормализации всасывания активно CNMN-Ac- транспортируемых нутриентов (глюкозы и глицина) в тонкой кишке в условиях хронического иммобилизационного стрессирования. Начиная с 7-15-х суток стрессирования у животных, которым добавляли в корм БМ, обнаружены заметно более высокие значения интенсивности транспортного процесса. Этот эффект сохраняется до окончания хронического стрессирования, хотя на 45-е сутки становится несколько меньшим, чем на 15-е сутки стрессирования.

Известно, что стрессовые воздействия, независимо от их природы, приводят к инициированию процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ). При этом наблюдается угнетение антиоксидантной защиты в различных органах и тканях организма. Показано, что увеличение интенсивности ПОЛ, сопровождающееся истощением антиоксидантных систем, является одним из факторов, приводящих к угнетению всасывания пищевых веществ в тонкой кишке при стрессе [28]. В последние десятилетия из различных штаммов стрептомицетов выделен ряд «новых» ингибиторов ПОЛ и доказано их значение как мощных антиоксидантных веществ в условиях индукции липидной пероксидации [11, 33, 35]. Согласно проведенным нами исследованиям, биомасса штамма S. massasporeus CNMN-06 содержит фосфолипиды и серосодержащие АК, обладающие, как известно, выраженными антиоксидантными свойствами, и иммуноактивные и незаменимые АК, моно- и полиненасыщенные ЖК, оказывающие адаптогенное и стресс-протекторное действие. Исходя из этого, можно предположить, что нормализация всасывания активно транспортируемых нутриентов (глюкозы и глицина) в тонкой кишке животных, скармливаемых биомассой штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06, при стрессе связана с подавлением действия ПОЛ ее биоактивными компонентами. Кроме этого, известно, что стрептомицеты синтезируют ряд веществ, обладающих нейропротекторным действием [33, 35]. Поэтому нельзя исключить, что вышеуказанный эффект может быть связан и с защитным по отношению к влиянию хронического стрессирования действием биоактивных компонентов биомассы штамма на нейрональные структуры, ответственные за регуляцию процесса всасывания в тонкой кишке.

Таким образом, длительное скармливание биомассы штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 экспериментальным животным способствует повышению прироста их массы тела в условиях хронического стресса, что связано, в частности, с нормализацией всасывания активно транспортируемых пищевых веществ в тонкой кишке.

Исследование действия биологически активных компонентов БМ и КЖ штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 на нейрофизиологические аспекты оборонительного поведения экспериментальных животных проводили на белых лабораторных крысах породы Вистар обоих полов, взятых в 4-х недельном возрасте и содержащихся в условиях вивария. Для проведения эксперимента животные (как самцы, так и самки) были разбиты на 3 группы по 12 крыс одного пола в каждой группе: контрольная и 2 опытные. В опытных группах животные предварительно в течение 90 дней, а затем – на протяжении эксперимента к основному рациону питания получали высушенную БМ или КЖ штамма в дозах 250-300 мг/кг и 10-12 мл/кг (в 1 мл КЖ содержится 8,12 мг абсолютно сухого вещества) живого веса соответственно. Животные контрольной группы получали в тот же промежуток времени стандартный рацион питания. В опытах использовался метод выработки искусственного экстерорецепторного рефлекса, а именно: условной двигательной реакции активного избегания болевого стимула, описанного в работе [17].

Опыты показали, что длительное скармливание БМ и КЖ самцам белых крыс приводит к существенному облегчению выработки оборонительных условных рефлексов активного избегания в экстремальных условиях действия болевого электрокожного раздражителя. Особенно существенные различия в числе актов активного избегания между животными контрольной и опытных групп наблюдались на начальном этапе формирования условнорефлекторных связей (на 3-и и 4-е дни эксперимента). Количество условнорефлекторных побежек у крыс опытных групп было выше в 2-3 раза (рис. 4.2).

общем количестве побежек, доля условных рефлексов в ** * * * * ** ** % * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 стандартный рацион питания + БМ дни эксперимента стандартный рацион питания + КЖ контроль (стандартный рацион питания) * – достоверные различия между контролем и опытом (Р0,05).

Рис. 4.2. Динамика выработки оборонительных условных рефлексов у самцов белых крыс при длительном скармливании БМ и КЖ штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06.

Положительный эффект действия биологически активных компонентов биомассы и культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 на процесс выработки условнорефлекторных реакций активного избегания полностью подтвердился в последующих опытах на самках белых крыс [29].

С одной стороны, столь выраженный эффект длительного скармливания БМ и КЖ штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 можно объяснить высоким содержанием в них таких аминокислот, как глутаминовая, аспарагиновая, глицин, пролин, которые, выполняя функции нейромедиаторов и нейромодуляторов в различных отделах головного мозга, участвуют в механизмах нейропластичности при обучении [32].

С другой стороны, необходимо учитывать, что болевой электрокожный раздражитель является достаточно сильным стрессовым фактором для подопытных животных и особенно на начальном этапе обучения. Ранее было отмечено, что в последние годы из различных штаммов стрептомицетов выделены ингибиторы ПОЛ и показано их значение как мощных нейропротекторных веществ в условиях индукции липидной пероксидации [33, 35].

Исходя из этого, можно предположить, что зафиксированный в работе эффект облегчения выработки условнорефлекторного избегания обусловлен нейропротекторным действием входящих в состав биомассы и культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 антиоксидантов по отношению к индуцируемой в условиях болевого стрессирования активации свободнорадикального окисления.

Наряду с этим было установлено, что добавление в корм экспериментальным животным как БМ, так и КЖ штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 в течение 90 суток способствует повышению плодовитости (на 20-25%) в обычных физиологических условиях.

Таким образом, полученные результаты открывают перспективу для использования биомассы штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 в целях разработки биопрепаратов для профилактики и коррекции стрессовых нарушений, повышения интенсивности роста и плодовитости сельскохозяйственных животных.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ И РЕКОМЕНДАЦИИ Выполненное по теме диссертации исследование, связанное с определением естественной изменчивости и биосинтетической активности штаммов актиномицетов Streptomyces massasporeus, расширяет существующие знания об изменчивости вида S. massasporeus, способствуя совершенствованию таксономии пигментообразующих актиномицетов, и показывает возможности управления их изменчивостью и синтезом биологически активных веществ, которые могут быть использованы для нужд сельского хозяйства, с помощью ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности и изменений условий культивирования. Результаты исследований можно представить в виде следующих выводов:

1. Характер и размах изменчивости актиномицетов Streptomyces massasporeus зависят от способа хранения и питательной среды, на которой культивируется штамм.

Однородность, хороший рост и споруляцию культуры после длительного хранения обеспечивает культивирование штаммов на агаризованных средах: S. massasporeus CNMN Ac-06 и S. massasporeus CNMN-Ac-08 – на картофельно-глюкозном и овсяном агарах, S. massasporeus CNMN-Ac-07 – на крахмало-аммиачном и овсяном агарах.

2. Гомологический ряд внутривидовой изменчивости популяции S. massasporeus включает варианты: основной, блеклый, белый, олигоспоровый, альтерколерный, карликовый и аспорогенный, различающиеся морфолого-культуральными свойствами и биосинтетической активностью.

3. Установлено, что после хранения на агаризованной среде Чапека отличительные физиолого-биохимические особенности штаммов S. massasporeus остаются неизменными, а лиофилизация способствует стабилизации морфолого-культуральных свойств и биосинтетической активности изучаемых стрептомицетов.

4. Воздействие ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности уменьшает гетерогенность пигментообразующих актиномицетов Streptomyces massasporeus и способствует стимуляции накопления биомассы, содержания в ней общих липидов, в том числе фосфолипидов и стеринов, увеличению количества общего белка, незаменимых и иммуноактивных аминокислот в культуральной жидкости и повышению антимикробной активности по отношению к фитопатогенным грибам в зависимости от штамма и времени облучения.

5. Наилучшей средой для накопления биомассы и образования биологически активных веществ (фосфолипидов и стеринов, ненасыщенных жирных кислот, незаменимых и иммуноактивных аминокислот) актиномицетами Streptomyces massasporeus является среда SP-I, содержащая соевую муку как дополнительный источник углерода, витамины и микроэлементы.

6. Оптимальными условиями для накопления биомассы и образования биологически активных веществ актиномицетом S. massasporeus CNMN-Ac-06 являются культивирование штамма на среде SP-I с добавлением 3,0 г/л соли фосфора (K2HPO4) при температуре 27С и рН среды 7,0.

7. Добавление в корм биомассы и, в ряде случаев, культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 экспериментальным животным способствует увеличению прироста массы их тела и плодовитости в обычных физиологических условиях;

интенсификации процессов всасывания активно транспортируемых пищевых веществ в тонкой кишке и увеличению прироста массы тела в условиях хронического стрессового воздействия;

облегчению процесса обучения навыкам оборонительного поведения в условиях периодического воздействия стрессогенного фактора.

Практические рекомендации 1. Для хранения в лабораторных условиях культур актиномицетов S. massasporeus рекомендуются картофельно-глюкозный и овсяный агары, обеспечивающие хороший рост, споруляцию и однородность культуры.

2. Для уменьшения гетерогенности пигментообразующих стрептомицетов рекомендуется воздействие ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности.

Предложения на перспективу. Основные результаты диссертации “Естественная изменчивость и биосинтетическая активность актиномицетов Streptomyces massasporeus” представляют перспективу развития исследований, направленных на разработку комплексного биопрепарата на основе биомассы и культуральной жидкости штамма S. massasporeus CNMN-Ac-06 с повышенным содержанием биологически активных веществ, способствующих увеличению прироста массы тела, плодовитости и стрессорезистентности животных.

Личный вклад автора заключается в анализе литературы по теме диссертации, выполнении экспериментальной работы, статистической обработке и анализе полученных данных, обобщении и интерпретации результатов, подготовке материалов докладов и публикаций. Часть исследований была выполнена совместно с сотрудниками Института физиологии и санокреатологии АНМ и Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.

Заболотного НАНУ, что нашло отражение в списке публикаций по теме исследования.

В планировании основных направлений работы и обсуждении полученных результатов принимали участие научный руководитель, д.х.б.н, проф. Бурцева С.А. и научный консультант, д.х.б.н. Шептицкий В.А.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Bureva S.. a. Selectarea tulpinilor noi de streptomicete – produceni activi ai lipidelor. n:

Buletinul AM. tiine biologice i chimice, 1994, nr 5, p. 21-24.

2. Todera A. Particularitile fiziologo-biochimice i biotehnologice ale tulpinii Streptomyces massasporeus 36 ca productor al substanelor biologic active. Autoref. tezei de dr. t. biologiсe.

Chiinu, 2000. 21 р.

3. Бажов Г.М., Бакирева Л.А. Практическое свиноводство. Краснодар, 2002. 155 с.

4. Бауэр Г. и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Москва:

Мир, 1988. 687 с.

5. Бецкий О.В., Кислов В.В., Лебедева Н.Н. Основные результаты экспериментальных исследований взаимодействия низкоинтенсивных миллиметровых волн на биологические объекты. В: Миллиметровые волны и живые системы. Сборник работ. Москва, 2004, с. 70-100.

6. Бондарцев А.С. Шкала цветов. Москва-Ленинград: Изд-во АН СССР, 1954. 28 с.

7. Братухина А.А. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности на рост, липидообразование и антимикробные свойства стрептомицета Streptomyces massasporeus CNMN-36. В: Buletinul AM. tiinele vieii, 2006, nr 3 (300), p. 148-155.

8. Братухина А.А. Влияние лиофилизации на биосинтетическую активность Streptomyces massasporeus CNMN-36. В: Buletinul AM. tiinele vieii, 2007, nr 3 (303), p. 117-121.

9. Братухина А. и др. Сравнительное изучение продуктивности липидов, синтезированных штаммами Streptomyces massasporeus. В: Analele tiinifice ale Universitii de Stat din Moldova, 2006, p. 181-183.

10. Бурцева С.А. Биологически активные вещества стрептомицетов (биосинтез, свойства, перспективы применения). Автореф. диссер. док. хаб. биолог. наук. Кишинев, 2002. 35 с.

11. Бурцева С.А. и др. Повышение резистентности бройлеров биопрепаратами, содержащими иммуноактивные аминокислоты, на основе стрептомицетов. В: Contribuii n formarea structurilor inovaionale de dezvoltare devansat. Materialele Mesei Rotunde i Conf.

Interna. Chiinu, 2004, с. 431-436.

12. Валагурова Е.В., Козырицкая В.Е., Иутинская Г.А. Актиномицеты рода Streptomyces.

Описание видов и компьютерная программа их идентификации. Киев: Наукова Думка, 2003. 645 с.

13. ГОСТ Р 1486-99. Получение метиловых эфирных жирных кислот. В: Гост. станд. Рос.

Федерации. Введ. 01.01.01. Москва, 2001, с. 2-3.

14. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. Определение антибиотической активности микроорганизмов. Москва: Наука, 2004. 155 с.

15. Ефременкова О.В. и др. Поиск А-факторзависимых вариантов в популяциях актиномицетов. В: Микробиология, 2003, т. 72, № 6, с. 766–769.

16. Закалюкина Ю.В., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Особенности роста и морфологической дифференцировки ацидофильных и нейтрофильных почвенных стрептомицетов. В:

Микробиология, 2004, т. 73, № 1, с. 89-93.

17. Зарайская И.Ю. Системный анализ оборонительного поведения крыс Вистар при обучении двустороннему активному избеганию. В: Журнал ВНД, 1995, т. 45, с. 472-478.

18. Комарова А.С. и др. Влияние электромагнитных микроволн на прорастание спор Streptomyces xanthochromogenes в торфяной почве и в жидкой питательной среде. В:

Почвоведение, 2010, № 1, с. 83-86.

19. Кузнецов В. Д. Изучение изменчивости актиномицетов – продуцентов антибиотиков и других биологически активных веществ. В: Антибиотики, 1972, № 7, с. 666-671.

20. Кузнецов В.Д., Филиппова С.Н. Гомологические ряды в наследственной изменчивости и вопросы систематики актиномицетов. В: Юбилейный сборник к 70-летию Института. Труды Инст-та Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Москва, 2004, вып. 12, с. 249-268.

21. Милько E.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. Москва: МГУ, 1991. 144 с.

22. Мякушко Ю.П., Баранова В.Ф. Соя. Москва: Колос, 1984. 332 с.

23. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии. Москва: РАМН, 2000. 52 с.

24. Тамбиев А.Х. и др. Возможность стимуляции роста цианобактерий, микроводорослей и актиномицетов с помощью КВЧ-излучения. В: Биологические ресурсы и устойчивое развитие. Материалы междунар. конференции. Пущино, 2001, с. 212-213.

25. Физиология адаптационных процессов. Москва: Наука, 1986. 635 с.

26. Фурдуй Ф.И. и др. Стресс и адаптация сельскохозяйственных животных в условиях индустриальных технологий. Кишинев: Штиинца, 1992. 223 с.

27. Цуцаева А.А., Ананьина А.Е. Влияние условий хранения на свойства криоконсервированной и лиофилизированной культуры Streptomyces fradiae. В: Проблемы криобиологии, 2001, № 1, с. 51-59.

28. Шептицкий В.А. Мембранное пищеварение и всасывание углеводов в тонкой кишке при стрессе. В: Бюллетень ассоциации традиционной медицины РМ, 2004, №8, с. 22-30.

29. Шептицкий В.А., Братухина А.А., Бурцева С.А. Условнорефлекторная деятельность белых крыс при длительном потреблении биопрепаратов на основе метаболитов Streptomyces massasporeus. В: Buletinul AM. tiinele vieii, 2007, nr 2 (302), p. 7-12.

30. Berdy J. Bioactive microbial metabolites. In: J. Antibiotics, 2005, vol. 58, р. 1-26.

31. Brandt B.W. et al. Modelling microbial adaptation to changing availability of substrates. In:

Water Research, 2004, vol. 38, p. 1003-1013.

32. Bremner J. Does stress damage the brain? In: Biological Psychiatry, 1999, vol. 45, р. 797-805.

33. Kato S. et al. Pyrrolostatin, a novel lipid peroxidation inhibitor from Streptomyces chrestomyceticus. In: J. Antibiotics, 1993, vol. 46, is. 6, р. 892-899.

34. Kelly A.F. et al. Survival of Campylobacter jejuni during stationary phase: evidence for the absence of a phenotypic stationaryphase response. In: Applied and Environmental Microbiology, 2001, vol. 67, p. 2248-2254.

35. Kim W.G. et al. Benzastatins H and I, new benzastatin derivatives with neuronal cell protecting activity from Streptomyces nitrosporeus. In: J. Antibiotics, 2001, vol. 54, is. 6, р. 513-516.

36. Pinto L.S. et al. Morphology and viability analysis of Streptomyces clavuligerus in industrial cultivation systems. In: Bioprocess and Biosystems Engineering, 2004, vol. 26, p. 177-184.

37. Schewe Т., Kuhn Н., Rappopori S. Lipoxygenases: measurement, characterization and properties. Prostaglandins and related substances. А practical approach. Washington: Oxford IRL Press LTD, 1987. 684 р.

38. Yocheva L. et al. Influence of the long-term preservation on some biological features of three Streptomycetes strains, producer of antibiotic substances. In: J. Culture Collections, 2000 2002, vol. 3, p. 25-32.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Научные статьи в рецензионных журналах 1. Братухина А.А. Продуктивность биомассы и липидов штамма Streptomyces massasporeus CNM-36. В: Analele tiinifice ale Universitii de Stat din Moldova, 2005, p. 228-231. 0,4 а.л.

2. Братухина А.А. Влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности на рост, липидообразование и антимикробные свойства стрептомицета Streptomyces massasporeus CNMN-36. В: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii, 2006, nr 3 (300), p. 148-155. 0,65 а.л.

3. Братухина А., Бурцева С., Валагурова Е., Козырицкая В. Сравнительное изучение продуктивности липидов, синтезированных штаммами Streptomyces massasporeus. В:

Analele tiinifice ale Universitii de Stat din Moldova, 2006, p. 181-183. 0,35 а.л.

4. Братухина А.А. Влияние лиофилизации на биосинтетическую активность Streptomyces massasporeus CNMN-36. В: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii, 2007, nr 3 (303), p. 117-121. 0,55 а.л.

5. Шептицкий В.А., Братухина А.А., Бурцева С.А. Условнорефлекторная деятельность белых крыс при длительном потреблении биопрепаратов на основе метаболитов Streptomyces massasporeus. В: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii, 2007, nr 2 (302), p. 7-12. 0,5 а.л.

Статьи в национальных журналах 6. Шептицкий В.А., Братухина А.А. Влияние метаболитов Streptomyces massasporeus на динамику массы тела и всасывание пищевых веществ в тонкой кишке при хроническом стрессе. В: Вестник науки Приднестровья. Тирасполь, 2011, №1, с. 91-99. 0,73 а.л.

Статьи в международных сборниках 7. Maslobrod S.N., Bureva S.A., Calci E.D., Postolachi O.M., Bratuhina A.A., Godina O.

Evaluarea aciunii iradierii milimetrice asupra activitii fiziologice a streptomicetelor. In: The 30th Annual Congress of the American Romanian Academy of Arts and Sciences (ARA).

Proceedings. Chiinu, 2005, p. 93-95. 0,5 а.л.

8. Бурцева С., Гараева С., Братухина А., Постолакий О., Постолатий Г., Редкозубова Г., Растимешина И. Повышение резистентности бройлеров биопрепаратами, содержащими иммуноактивные аминокислоты, на основе стрептомицетов. В: Contribuii n formarea structurilor inovaionale de dezvoltare devansat. Materialele Mesei Rotunde i Conf. Interna.

Stiinifico-Practice. Chiinu, 2004, p. 431-436. 0,4 а.л.

9. Бурцева С.А., Маслоброд С.Н., Гараева С.Н., Братухина А.А., Постолакий О.М.

Биологический эффект электромагнитных волн слабого напряжения в миллиметровом диапазоне на стрептомицеты. В: Миллиметровые волны в медицине и биологии. Сборник трудов 14-го Рос. Симпозиума с международ. участием. Москва, 2007, с. 308-312. 0,4 а.л.

10. Шептицкий В.А., Бурцева С.А., Братухина А.А., Аганова Е.А. Условнорефлекторная деятельность белых крыс при длительном потреблении биопрепаратов на основе метаболитов стрептомицетов. В: Медико-биологические и социальные проблемы современного человека. Материалы I Междунар. науч. конф. молодых ученых и студентов. Тирасполь, 2007, с. 43-46. 0,3 а.л.

11. Шептицкий В.А., Былич Л.Г., Братухина А.А., Чебан Л.И. Особенности всасывания моносахаридов в тонкой кишке при хроническом стрессе. В: Медико-биологические и социальные проблемы современного человека. Материалы II Междунар. науч. конф.

молодых ученых и студентов. Тирасполь, 2008, с. 267-273. 0,5 а.л.

Тезисы национальных научных форумов 12. Братухина А.А. Изменение антимикробной активности у Streptomyces massasporeus CNM-36 под влиянием электромагнитного поля миллиметрового диапазона. В: Conferina Internaional a Tinerilor Cercettori. Rezumatele Lucrrilor. Chiinu, 2005, p. 110. 0,05 а.л.

13. Братухина А.А. Аминокислотный состав биомассы стрептомицета Streptomyces massasporeus CNMN-36. В: IV Edition of the International Conference of Young Reserchers.

Scientific Abstracts. Chiinu, 2006, p. 40. 0,05 а.л.

14. Братухина А.А., Бурцева С.А. Продуктивность штаммов Streptomyces massasporeus на средах разного состава. В: Biotehnologia microbiologic – domeniu scientointensiv al tiinei contemporane. Conf. t. Intern. Chiinau, 2011, p. 132-133. 0,12 а.л.

Тезисы международных научных форумов 15. Братухина А.А. Изменение аминокислотного состава биомассы штамма Streptomyces massasporeus CNMN-36 под воздействием электромагнитного поля миллиметрового диапазона. В: Актуальные аспекты современной микробиологии. Тезисы II Междунар.

молодеж. школы-конф. Москва, 2006, с. 74-75. 0,06 п.л.

16. Братухина А.А., Бурцева С.А. Антибиотические свойства стрептомицетов после длительного хранения на агаризованных средах. В: Биология – наука ХХI века. Сборник тезисов 12-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых. Пущино, 2008, с. 253. 0,06 а.л.

17. Bratuhina A.A., Sheptitsky V.A., Burtseva S.A., Namolovan L.N. The pecularites of white rats defensive behaviour under the long-term consumption of biopreparations on the basis of Streptomyces exometabolits. В: Молодь i поступ бiологii. Збiрник тез IV Мiжнар. наук.

конф. cтудентiв та аспiрантiв. Львiв, 2008, с. 458. 0,05 а.л.

18. Братухина А.А., Бурцева С.А. Жирнокислотный состав липидов биомассы штамма Streptomyces massasporeus CNMN-36 и его естественных вариантов. В: Биология – наука ХХI века. Сборник тезисов 14-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых.

Пущино, 2010, т. 1, с. 232-233. 0,06 а.л.

19. Братухина А.А. Изменчивость штамма Streptomyces massasporeus CNMN-36 после хранения в лабораторных условиях на агаризованной среде Чапека. В: Биология – наука ХХI века. Сборник тезисов 14-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых.

Пущино, 2010, т. 2, с. 217. 0,05 а.л.

ADNOTARE Bratuhina Antonina “Variabilitatea natural i activitatea biosintetic a actinomicetei Streptomyces massasporeus”. Teza de doctor n biologie, Chiinu, 2012. Introducere, patru capitole, concluzii generale i recomandri, bibliografie din 210 titluri, 10 anexe, 118 pagini de text de baz, 44 figuri, 14 tabele. Rezultatele obinute sunt publicate n 19 lucrri tiinifice.

Cuvintele-cheie: streptomicete, variabilitate, aminoacizi, lipide, acizi grai, activitatea antimicrobian, UEM n diapazon milimetric de intensitate joas, stres.

Domeniul de studiu: 03.00.07 – Microbiologie.

Scopul cercetrilor: studierea variabilitii naturale i activitii biosintetice a tulpinilor de actinomicete Streptomyces massasporeus dup pstrare ndelungat i sub influena undelor electromagnetice n diapazon milimetric de intensitate joas, precum i a perspectivelor de utilizare a substanelor biologic active sintetizate, pentru sporirea rezistenei organismului animalelor la aciunea factorilor de stres.

Obiectivele: studierea variabilitii naturale i activitii biosintetice a tulpinilor S. massasporeus dup pstrarea ndelungat n stare liofilizat i pe mediul solid Czapek;

studierea aciunii UEM n diapazon milimetric de intensitate joas asupra variabilitii i activitii biosintetice a actinomicetelor S. massasporeus;

elaborarea condiiilor de cultivare pentru sporirea activitii biosintetice a tulpinii S. massasporeus CNMN-Ac-06;

studierea influenei substanelor biologic active, coninute n biomasa i lichidul de cultur a tulpinii S. massasporeus CNMN- Ac-06, asupra unor indici morfologici, funcionali, reproductivi i caracteristicilor comportamentale ale obolanilor albi n condiii de stres cronic.

Problema tiinific const n determinarea variabilitii tulpinilor S. massasporeus – productoare de substane biologic active, posibilitatea de dirijare cu sinteza lor i perspectivele de aplicare.

Noutatea i originalitatea tiinific. n premier a fost identificat variabilitatea intraspecific n populaia de actinomicete productoare de pigment S. massasporeus i artate modificrile caracterelor morfo-culturale i a proprietilor biosintetice n dependen de condiiile de pstrare. Pentru prima dat a fost stabilit perspectiva utilizrii UEM n diapazon milimetric de intensitate joas pentru micorarea gradului de eterogenitate la actinomicetele productoare de pigment S. massasporeus i sporirea activitii lor biosintetice. А fost stabilit corelaia ntre gradul de saturare a lipidelor i activitatea lipoxigenazei la tulpina S. massasporeus CNMN-Ac-06 n funcie de concentraia fosforului n mediul de cultivare. Pentru prima dat s-a determinat, c substanele biologic active, coninute n biomasa i lichidul de cultur al tulpinii S. massasporeus CNMN-Ac-06, contribuie la normalizarea procesului de absorbie a nutrienilor prin transport activ n intestinul subire, asigur creterea n greutate, fecunditatea animalelor homeoterme n condiii obinuite i faciliteaz dezvoltarea unor reflexe defensive n condiii de stres cronic.

Semnificaia teoretic a lucrrii const n completarea taxonomiei actinomicetelor din genul Streptomyces i dirijarea proceselor biosintetice i eterogenitii culturii prin aplicarea UEM n diapazon milimetric de intensitate joas i modificarea condiiilor cultivrii.

Au fost studiate particularitile aciunii substanelor sintetizate de S. massasporeus CNMN Ac-06 asupra unor indici morfologici, funcionali, reproductivi i caracteristicilor comportamentale ale obolanilor albi n condiii de stres cronic i evideniate principiile, ce vor servi ca baz tiinific pentru elaborarea de noi biopreparate destinate sporirii intensitii creterii, fecunditii i rezistenei macroorganismului la aciunea factorilor extremi.

Valoarea aplicativ. Au fost selectate i recomandate medii nutritive solide pentru meninerea tulpinilor S. massasporeus n condiii de laborator, care asigur o cretere bun i omogenitate maxim n populaie. Au fost propuse medii nutritive pentru cultivarea submers, care sporesc activitatea biosintetic a streptomicetelor. Au fost stabilii parametrii optimi de aciune a UEM n diapazon milimetric de intensitate joas, care asigur omogenitatea maxim n populaia S. massasporeus i stimuleaz activitatea biosintetic. Rezultatele obinute au conturat perspectiva utilizrii biomasei i lichidului de cultur al S. massasporeus CNMN-Ac-06 pentru prevenirea i corectarea tulburrilor provocate de stres la animalele homeoterme.