Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений
На правах рукописи
Чирков Сергей Николаевич
Иммунохимическая и молекулярная диагностика
вирусных инфекций растений
03.00.06 – Вирусология
03.00.23 – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва
2009
Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Атабеков Иосиф Григорьевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Гнутова Раиса Васильевна доктор биологических наук, профессор Добров Евгений Николаевич доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Егоров Алексей Михайлович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН
Защита состоится _ июня 2009 года в _ часов на заседании совета Д.501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991 Москва ГСП 2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова
Автореферат разослан «_» мая 2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета И.А.Крашенинников кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В России большинство вегетативно размножаемых продовольственных, кормовых, технических и цветочно-декоративных культур хронически заражено вирусами, которые вызывают ощутимые потери урожая и заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции (Атабеков, 1984). Прогнозируется, что в обозримом будущем роль вирусных заболеваний будет возрастать в той мере, в которой будут снижаться потери урожая, вызываемые фитопатогенами другой этиологии и сорняками.
Кроме того, глобализация сельского хозяйства, расширение международного обмена семенным и посадочным материалом способствуют интродукции вирусов в новые регионы.
Среди обнаруженных за последнее десятилетие новых (emerging) инфекционных болезней растений почти половина имеет вирусную природу. Непрерывно увеличивается число известных вирусов, а глобальное потепление расширяет ареалы насекомых – переносчиков и способствует увеличению их численности (Thresh, 1982;
Шпаар и др., 1986;
Boonham et al., 2007).
В то же время хорошо известно, что использование свободного от вирусов («безвирусного») посадочного материала позволяет значительно повысить продуктивность сельскохозяйственных культур (Foster & Hadidi, 1998;
Waterworth & Hadidi, 1998). Таким образом, для радикального снижения вредоносности вирусных инфекций необходим перевод растениеводства на безвирусную основу.
Производство безвирусного семенного и посадочного материала основано на отборе здоровых растений с целью их последующего размножения. При тотальном заражении сорта растения оздоравливают от вирусов c помощью термотерапии и культуры меристем, однако существующие методы оздоровления не гарантируют избавления от патогена. Поскольку безвирусное растениеводство сосуществует с традиционными технологиями, при размножении оздоровленных растений, ввиду высокого инфекционного фона, не исключено их повторное заражение. Совершенно очевидно, что для отбора здоровых растений, контроля оздоровления, сертификации посадочного материала и постоянного мониторинга вирусного заражения с целью своевременного выявления и ликвидации очагов инфекции, ограничения распространения вирусов и предупреждения эпифитотий необходимо располагать чувствительными методами массовой диагностики вирусных инфекций. Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусов играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. Для предотвращения интродукции вирусов карантинная служба должна располагать быстрыми и чувствительными методами их диагностики. Высокочувствительные методы лабораторной диагностики вирусных инфекций необходимы также для обеспечения селекционной и генноинженерной работы по выведению новых сортов, устойчивых к вирусам. Таким образом, перспективы безвирусного растениеводства определяются доступностью методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций для сельскохозяйственной практики.
Следует подчеркнуть, что, как показывает весь мировой опыт, затраты на диагностику несоизмеримы с потерями от заражения вирусами и с расходами на искоренение инфекции.
Осознание значимости и масштабов проблемы вирусных инфекций сельскохозяйственных культур и начало работ по оздоровлению, развернувшихся в бывшем СССР в начале 80-х годов, показали, что ключевое звено этой работы – массовая диагностика вирусных инфекций – в нашей стране практически не обеспечено. Было очевидно, что для устойчивого развития безвирусного растениеводства в РФ необходима разработка высокочувствительных, производительных и надежных методов диагностики и средств для их применения с учетом реальных запросов сельскохозяйственной практики, нормативной базы отрасли и современных тенденций в развитии методов массовой диагностики вирусных инфекций растений.
В связи с усилением экономического значения вирусных инфекций, увеличением объема анализов и количества подлежащих определению вирусов возрастают требования к аналитическим характеристикам методов массовой диагностики, в первую очередь к их чувствительности и специфичности, обеспечивающих однозначность получаемых результатов. Первостепенное значение имеет производительность метода, т.е. возможность выполнять большое количество анализов за короткое время, которая определяется не только скоростью выполнения анализа и подготовительных процедур, но и удобством в работе при массовом применении. В наибольшей мере этим требованиям удовлетворяют методы, основанные на иммуноферментном анализе, полимеразной цепной реакции и дот гибридизации. Все большее внимание уделяется созданию таких методов анализа, которые позволяют одновременно выявлять все известные вирусы данной культуры в одном образце, что существенно ускоряет и удешевляет процедуру лабораторной диагностики. Наиболее перспективным решением этой задачи представляется развитие чиповой технологии.
Наконец, растет потребность в таких средствах диагностики, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно в месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки.
Целью наших исследований являлась разработка высокочувствительных методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных культур для развития безвирусного растениеводства в РФ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Усовершенствование известных и разработка новых эффективных методов препаративного выделения вирусов важнейших сельскохозяйственных культур с целью получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих антисывороток с высоким титром;
2) Разработка методов лабораторной диагностики вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных, овощных и цветочно-декоративных культур на основе иммуноферментного анализа, полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот;
3) Разработка методов внелабораторной диагностики вирусных инфекций на основе реакции агглютинации и иммунохроматографического анализа, а также наборов для иммуноферментного определения основных вирусов картофеля и вируса шарки сливы;
4) Практическое применение разработанных методов и средств диагностики вирусных инфекций для оздоровления, контроля качества и сертификации семенного и посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочных культур, а также для изучения распространенности ряда вирусных инфекций.
5) Изучение возможности индукции у растений устойчивости к вирусным инфекциям с помощью обработки хитозаном.
Научная новизна. Для экспрессного определения фитовирусов во внелабораторных условиях разработан новый метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест), основанный на коагглютинации вирусных частиц и протеин-А-содержащих клеток S.aureus, покрытых антителами к вирусу. Совместно с Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН впервые в России разработана технология получения мультимембранных композитов (тест-полосок) для внелабораторной диагностики вирусов растений методом иммунохроматографии, основанного на использовании поликлональных антител к вирусам и частиц коллоидного золота в качестве маркера.
Для экстракции вирусной РНК из зараженных растений разработан новый метод, основанный на выделении нуклеиновых кислот с помощью водорастворимого нетоксичного хаотропного агента трихлорацетата аммония и их очистке на целлюлозном сорбенте на основе хлопковой ваты. Разработан новый метод лабораторной диагностики вирусов растений, основанный на дот-гибридизации вирусной РНК или продукта ее амплификации c кДНК-зондом, меченным хлордиэтилентриаминоплатиной [диен(Pt)]. Для одновременной диагностики вирусов и вироида картофеля в одном образце разработана ДНК-микроплата (прототип ДНК-чипа), в ячейках которой фиксированы молекулы ДНК, комплементарные РНК вирусов и вироида, гибридизующиеся с тотальной РНК, меченной диен(Pt).
Установлено таксономическое положение вируса мягкой мозаики фасоли как представителя рода кармовирусов. Впервые показана возможность создания у растений устойчивости к заражению различными вирусами и вироидом посредством их обработки хитозаном, и изучены условия ее создания. Впервые изучено штаммовое разнообразие вируса шарки сливы в насаждениях косточковых культур в Европейской России и доказано наличие этого вируса на территории Крыма.
Практическое значение работы. Разработанные методы и средства диагностики вирусных инфекций были широко использованы в: аккредитованной испытательной лаборатории по вирусным и вироидным болезням в составе ЗАО «НВО Иммунотех» и в экспериментальном тепличном комбинате «Меристемные культуры» (Ставропольский край) для сертификации и контроля качества семенного картофеля, производимого в России и Республике Беларусь;
ВНИИ садоводства им. И.В.Мичурина (г. Мичуринск) для получения безвирусного посадочного материала и закладки насаждений плодовых и ягодных культур высших категорий качества;
Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства РАСХН (г. Москва) и Никитском ботаническом саду – Национальном научном центре (г. Ялта, АР Крым) для изучения распространенности вирусных заболеваний косточковых культур;
агрофирме «Колхоз им. С.М.Кирова»
(Московская обл.) и экспериментальном тепличном комбинате «Меристемные культуры» для получения и промышленного размножения оздоровленного посадочного материала различных сортов гвоздики;
Всероссийском центре карантина растений для диагностики карантинного вируса шарки сливы.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Cумы, 1982), V Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре растений «Ультраструктурная организация растений»
(Кишинев, 1983), VIII Всесоюзном совещании «Теория и практика использования иммунитета сельскохозяйственных культур к вирусным болезням» (Вильнюс, 1984), Всесоюзной конференции «Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства» (Алма-Ата, 1990), международных конференциях «Fundamental and Applied Problems in Phytovirology» (Ялта, 1994), «Сhitin and Chitosan»
(Гдыня, 1994), «Мolecular responses of plants to biotic and abiotic stresses» (Хельсинки, 1994), Пятой конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва – Щелково, 1999), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), международной научно-практической конференции «Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур» (Mосква, 2001), Шестой международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва – Щелково, 2001), всероссийском семинаре «Состояние и перспективы развития картофелеводства» (Москва, 2001), II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Шестой международной конференции Европейского хитинового общества (Познань, 2004), Первой Всероссийской школы-семинара «Современные достижения бионаноскопии»
(Москва, 2007), Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007), Международном конгрессе «Картофель. Россия-2007» (Москва, 2007), итоговой конференции «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007 – 2012 годы» (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), IX международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Алушта, 2008).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при поддержке международного проекта «Безвирусное растениеводство», INTAS (грант 96-1683), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» (госконтракт 43.050.11.1538), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 02-04-08026 инно, 04-04-08074 офи_а, 06-04- офи), Департамента науки и промышленной политики правительства г. Москвы (госконтракт 8/3-341н-06), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007 – 2012 годы» (госконтракт 02.512.11.2076).
Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ, в том числе 23 статьи в отечественных журналах, 7 статей в международных журналах, 6 статей в составе книг и сборников, 2 патента, 1 международная заявка на патент, 20 сообщений (тезисы конференций), 1 методические рекомендации.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, где сформулированы цели и задачи исследования, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, приложений и списка цитируемой литературы из 276 наименований. Работа изложена на 215 страницах и включает 68 рисунков и 37 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I. Иммунохимическая диагностика вирусных инфекций.
Единственным методом массовой диагностики вирусов растений в бывшем СССР в начале нашей работы был т.н. капельный метод, основанный на преципитации вирусных частиц иммунной сывороткой в жидкой среде (капле). Этот метод применяли для определения вирусов Х, S, M и Y картофеля (ХВК, SВК, МВК и YВК) в листьях сильно зараженных растений. Попытки использовать имеющиеся антисыворотки в более чувствительных методах анализа не были успешны ввиду невысокого специфического титра этих антисывороток и наличия в них антител к антигенам здорового растения (Бобкова и др., 1987). Это обстоятельство было обусловлено неэффективностью применяемых методов препаративного выделения вирусов, поскольку низкий выход вирусного препарата и недостаточная степень его очистки не позволяли получать моноспецифические сыворотки для разработки высокочувствительных методов диагностики. Кроме того, к большинству экономически значимых фитопатогенных вирусов антисыворотки в нашей стране вообще не были получены, и, следовательно, иммунохимические методы лабораторной диагностики многих вирусных инфекций не были и не могли быть разработаны. В этой связи, первым этапом нашей работы являлась разработка или усовершенствование методов препаративного выделения ряда вирусов, важных в практическом отношении, с целью получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих антисывороток для создания высокочувствительных иммунохимических методов диагностики вирусных инфекций.
Разработка и усовершенствование методов препаративного выделения вирусов растений и получение моноспецифических антисывороток.
Изолят неповируса кольцевой пятнистости малины (ВКПМ), полученный из Института фитопатологии Академии сельскохозяйственных наук бывшей ГДР (г. Ашерслебен), поддерживали и накапливали в растениях табака Nicotiana clevelandii L. или N. rustica L.
Изоляты неповирусов черной кольцевой пятнистости томатов (ВЧКПТ) и мозаики арабиса (ВМА), а также латентного садвавируса кольцевой пятнистости земляники (ЛВКПЗ) предоставлены H.Pospieszny (Institute for Plant Protection, Познань, Польша). Неповирусы накапливали в растениях лебеды Chenopodium quinoa Willd., а ЛВКПЗ в растениях огурца Cucumus sativus L. Дальневосточный изолят некровируса некроза табака (ВНТ), предоставленный Р.В.Гнутовой (Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток), накапливали в растениях фасоли Phaseolus vulgaris L. или Сh.quinoa. Изолят потивируса А картофеля B11 (АВК), предоставленный С. Мулетаровой (Центральная опытная станция по селекции и семеноводству картофеля, г. Пловдив, Болгария), размножали в растениях табака N.clevelandii. Изолят потивируса шарки сливы (ВШС) PPV-NAT, штамм D, предоставленный E.Maiss (Univ. Hannover, Германия), поддерживали и накапливали в растениях табака N.benthamiana. Изолят потивируса Y картофеля (YВК), штамм YВКО, предоставлен S.Marillonnet (Icon Genetics GmbH, Галле, Германия). Вирус накапливали в растениях табака N.tabacum с. Самсун. Изолят кармовируса мягкой мозаики фасоли (ВММФ) предоставлен C.I.Gabriel (US Plant Introduction Station, Glenn Dale, MD, США). Вирус поддерживали и накапливали в растениях фасоли Ph. vulgaris. Изоляты тобамовируса табачной мозаики (ВТМ) и флексивируса Х картофеля (ХВК) из коллекции каф. вирусологии МГУ имени М.В.Ломоносова размножали, соответственно, в растениях табака N.tabacum и дурмана Datura stramonium L. Кармовирус крапчатости гвоздики (ВКГ) выделяли из листьев растений гвоздики. Экспериментальные растения выращивали в теплице в контролируемых условиях.
Для препаративного выделения вирусов использовали общепринятые процедуры (Hull, 2002), с учетом особенностей каждого вируса. Вместе с тем, был выработан ряд общих приемов для повышения их эффективности. Предварительный отбор материала с максимальным содержанием вируса позволял выделять достаточное его количество из небольших навесок зараженных листьев, что ускоряло и облегчало процедуру выделения.
Применение 5% Тритона Х-100 (вместо органических растворителей) при экстракции нитевидных вирусов и их концентрирование путем ультрацентрифугирования на сахарозной подушке (вместо осаждения полиэтиленгликолем) существенно ускоряло процесс выделения и повышало выход вируса. Применение квазиравновесного зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сульфата цезия для очистки сферических вирусов также ускоряло процесс выделения и способствовало получению вирусных препаратов высокой степени очистки.
В результате разработки и применения эффективных методов препаративного выделения были получены очищенные препараты ВКПМ, ВЧКПТ, ВМА, ЛВКПЗ, ВШС и ВММФ. Кроме того, с целью ускорения процедуры получения вирусного препарата и повышения его выхода были модифицированы известные методы препаративного выделения и получены очищенные препараты ВНТ, АВК, YВК, ВКГ, ХВК и ВТМ. Высокие выход и степень очистки перечисленных вирусов и применение эффективных схем иммунизации животных (путем внутрикожных инъекций небольшого количества вируса или сочетанием внутривенной и внутрикожных инъекций) позволили получить моноспецифические кроличьи антисыворотки с высоким титром ко всем перечисленным вирусам.
Определение таксономического положения ВММФ.
Получение очищенного вирусного препарата открывает возможность изучения свойств вирусной частицы и ее отдельных компонентов. Именно эта работа представлялась весьма актуальной в отношении ВММФ, так как белковый компонент, структура и механизм экспрессии генома этого вируса не были изучены, в связи с чем его таксономическое положение выглядело неопределенным (Waterworth, 1981).
При электронномикроскопическом исследовании вирусного препарата на поверхности вириона можно было обнаружить оси симметрии 3-го (Рис. 1а) и 5-го (Рис.1b) порядков.
Спайки осей пятого порядка, образующие вершины икосаэдра, выступали над поверхностью вириона на 2 – 3 нм. Изучение негативно окрашенных пустых вирусных частиц показало, что толщина белкового капсида ВММФ составляет около 3 нм.
Рис. 1. Электронная микрофотография препарата ВММФ. Негативное окрашивание 2% фосфовольфрамовой кислотой. Увеличение 260000 х.
Методами электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблота с использованием антисывороток к очищенному препарату вируса и к белку оболочки установлено, что основной белок оболочки вируса имеет мол. м. 40 кДа (Рис. 2). Кроме того, на перегруженных полиакриламидных гелях выявлялись еще 2 минорные зоны с мол. м. 80 и 120 кДа. Антисыворотки к интактному вирусу и к основному белку оболочки ВММФ окрашивали все три белковых зоны. Таким образом, белковые зоны с мол. м. 80 и 120 кДа являются, по всей вероятности, олигомерами белка оболочки, частично ковалентно связанными в составе вирусной частицы.
Рис. 2. Электрофорез и иммуноблот препарата ВММФ.
Белки были окрашены в геле Кумасси (1, 2) или перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и окрашены антисывороткой к белку оболочки ВММФ (3) или нормальной кроличьей сывороткой (4). Слева –мол. масса белков-маркеров.
Анализ препарата РНК, выделенной из вирусных частиц, показал, что она практически не связывается с олиго-dT-целлюлозой и, следовательно, не содержит поли(А) последовательности.
При ультрацентрифугировании в градиенте концентрации сахарозы вирионная РНК седиментировала двумя зонами с пиками во фракциях 25 и 33 (Рис. 3А). Анализ этих фракций методом электрофореза (рис. 3Б) показал, что содержимое фракции 33 представляет собой, по всей вероятности, полноразмерную геномную РНК ВММФ длиной около 4200 нуклеотидов.
Более легкий пик состоит из молекул меньшего размера длиной 1000 – 2000 нуклеотидов.
А Б В Рис. 3. А: Анализ РНК ВММФ ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы (10 – 40%). Б: Анализ РНК ВММФ электрофорезом в 1% неденатурирующем агарозном геле. 1 – суммарная вирионная РНК;
2 – фракция 25 градиента;
3 – фракция 33 сахарозного градиента;
маркеры: РНК ХВК (6500 нт) и РНК ВМК (3234, 2865, 2114 и 876 нт). В: Анализ полипептидов, синтезируемых в бесклеточной белок-синтезирующей системе на матрицах отдельных фракций РНК ВММФ из сахарозного градиента, методом электрофореза в полиакриламидном геле.
Цифры под рисунком показывают номера фракций сахарозного градиента. Слева – мол. масса белков маркеров.
В бесклеточной белок-синтезирующей системе из клеток асцитной карциномы Кребс-2 и лизата ретикулоцитов кролика cуммарная РНК ВММФ направляла синтез 3 полипептидов с мол. м. 27, 40 и 79 кДа, а аналог кэпа m7GDP подавлял трансляцию. При трансляции отдельных фракций РНК ВММФ, извлеченных из сахарозного градиента, обнаружено, что синтез р79 направляется полногеномной РНК ВММФ (фракции 33 – 37) (Рис. 3В).
Возможность синтеза р27 с матриц тяжелых фракций РНК свидетельствует в пользу предположения об его трансляции также с полногеномной РНК. Синтез полипептида р (белка оболочки) направляется преимущественно более легкими фракциями (25 – 29), представляющими собой, вероятно, набор субгеномных РНК. Кроме того, легкие фракции ( – 31) направляли синтез еще двух полипептидов с мол. массой 7 и 8 кДа (не показаны).
Полученные результаты полностью соответствовали известным данным о структуре и механизме экспрессии генома кармовируса крапчатости гвоздики (ВКГ), а также о составе белковых продуктов, синтезируемых при трансляции вирионной РНК ВКГ in vitro (Мorris & Carrington, 1978), что позволило нам отнести ВММФ к представителям рода кармовирусов.
Разработка тест-систем для иммуноферментного определения вирусов растений.
Метод ИФА, в силу его очевидных достоинств (высокая чувствительность, возможность одновременного анализа большого количества образцов за короткое время, удобство в использовании), с момента возникновения занял ведущее место среди методов диагностики вирусных инфекций растений (Clark & Adams, 1977). Поэтому нашей целью была разработка сэндвич-варианта метода твердофазного ИФА в его планшетном формате для массовой экспресс-диагностики ряда вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных и цветочно декоративных культур.
В данной работе использовали очищенные нами препараты вирусов, а также вирусов S (SВК), М (МВК) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК), которые были предоставлены В.К.Новиковым. Им же были получены и предоставлены кроличьи антисыворотки к этим вирусам и к YВК. Фракцию IgG получали ионообменной хроматографией антисывороток на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 8,0. Конъюгаты IgG с пероксидазой хрена («Serva») получали периодатным методом (Nakane & Kawaoi, 1974), а конъюгаты IgG со щелочной фосфатазой («Sigma») и неорганической пирофосфатазой (НПФ) E. coli («Labmaster», Турку, Финляндия) – с помощью глутарового альдегида (Кэтти и Райкундалиа, 1991;
Baykov et al., 1988;
Mizenina et al., 1991).
Для диагностики ВШС была разработана тест-система ИФА на основе НПФ. Сообразно названию фермента, этот вариант анализа получил название «Пиротест-ИФА». Как известно, НПФ расщепляет молекулу субстрата (неорганического пирофосфата) на ионы ортофосфата, которые при добавлении стоп-реагента (раствора молибдата аммония и малахитового зеленого в кислой среде) окрашиваются в яркий зелено-синий цвет. В отсутствие ионов фосфата окраска стоп-реагента не изменяется и остается желтой. Важная особенность этого варианта ИФА заключается в том, что окраска (и оптическая плотность (ОП), измеряемая при длине волны 620 нм) отрицательных контролей остается неизменной в течение продолжительного времени (до 2 – 3 ч). Поскольку ОП в зараженных образцах за это время возрастает, удлинение времени инкубации планшетов после внесения стоп-реагента может быть использовано для повышения чувствительности анализа.
Рис. 4. Калибровочные кривые для определения ВШС.
А620 определяли через 10 мин (——) и через 60 мин (— —) после добавления стоп-реагента. Препарат вируса разводили до указанной концентрации экстрагирующим 1, буфером. Значения А620 в отрицательном контроле (осветленный экстракт из здоровых листьев косточковых культур) составляли 0,03 и 0,035 через 10 и 60 мин, 1, А 620 нм соответственно, и на рисунке не показаны.
0,8 Типичные калибровочные кривые, приведенные на рис. 4, показывают, что чувствительность 0, определения ВШС с помощью Пиротест-ИФА составляет, при оценке результатов через 10 мин, 4 – нг/мл, а при оценке через 60 мин 2 – 4 нг/мл. Крутизна 0,1 1 10 100 кривой титрования и низкий уровень сигнала в Концентрация ВШС, нг/мл отрицательном контроле обеспечивают такие различия в ОП между вируссодержащим образцом и отрицательным контролем, которые позволяют достоверно различать положительный и отрицательный результаты анализа даже при низкой концентрации вируса. Значения ОП в отрицательных контролях и незараженных образцах не возрастали по сравнению с 10-минутной инкубацией, в то время как при положительной реакции ОП увеличивалась в 1,5 – 2 раза. Кроме того, следует отметить, что при величине ОП в положительном образце 0,15, чувствительность выявления ВШС оказалась практически одинакова при визуальной и фотометрической оценке результатов. Это обстоятельство позволяет использовать Пиротест-ИФА в отсутствие специального фотометрического устройства («ридера») или соответствующего светофильтра для считывания результатов ИФА без ущерба для чувствительности анализа.
Важнейшим показателем качества разработанных диагностических тест-систем являются результаты их применения для анализа практического материала при сравнении с лучшими импортными аналогами, т.е. с диагностическими тест-системами фирм, продукция которых имеет давнюю и устойчивую репутацию на мировом рынке.
С этой целью мы сравнивали диагностические возможности Пиротест-ИФА и тест системы фирмы «Bio-Rad» (TAS-ELISA kit, Bio-Rad Phyto-Diagnostics, Франция), в которой в качестве ферментной метки используется щелочная фосфатаза, при определении ВШС в образцах различных косточковых культур из тепличной коллекции Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства (ВСТИСП) РАСХН (г. Москва). В другой работе сравнивали Пиротест-ИФА и тест-систему фирмы «Agdia» (DAS-ELISA kit, Cat No SRA 31505), в которой также используется щелочная фосфатаза, при анализе ВШС в образцах косточковых культур из коллекции Никитского ботанического сада, поддерживаемой на Южном берегу Крыма в открытом грунте.
Импортные тест-системы применяли в полном соответствии с инструкциями, используя, в частности, фирменный экстрагирующий буфер, входящий в состав набора. Результаты испытаний показали одинаковую достоверность выявления зараженных растений с помощью Пиротест-ИФА и двух импортных тест-систем. Таким образом, тест-система Пиротест-ИФА, разработанная для диагностики ВШС, по аналитическим характеристикам не уступала лучшим мировым аналогам и позволяла достоверно выявлять вирус в образцах листьев различных косточковых культур.
Тест-системы Пиротест-ИФА были разработаны также для диагностики ХВК, SВК, МВК, YВК, АВК и ВСЛК. Согласно действующему стандарту РФ, процедура сертификации предусматривает обязательную проверку зараженности семян картофеля этими вирусами с помощью ИФА. Типичные калибровочные кривые (рис. 5А) показывают, что тест-системы позволяют определять вирусы картофеля в концентрации несколько нанограмм в 1 мл.
Поскольку эти вирусы, включая ВСЛК, обычно накапливаются в зараженных растениях картофеля в большей концентрации, достигнутая чувствительность должна была обеспечить их надежное выявление в зараженных растениях. Лабораторные испытания тест-систем проводили при анализе пробирочных растений картофеля из коллекции ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха РАСХН и при практической работе по сертификации семенного картофеля. Результаты испытаний показали, что разработанные тест-системы позволяют выявлять все шесть вирусов в различных категориях семенного материала и пригодны для практического применения на всех стадиях производства безвирусного картофеля.
Для диагностики ВКПМ, ВМА, ВЧКПТ и ЛВКПЗ разработаны тест-системы ИФА с использованием в качестве ферментной метки пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и НПФ. Все тест-системы позволяли выявлять неповирусы в концентрации несколько нанограмм в 1 мл экстрагирующего буфера. Самая высокая чувствительность (1 нг/мл) была достигнута при диагностике ЛВКПЗ, что, по-видимому, было обусловлено высоким титром полученной антисыворотки. Достигнутые аналитические характеристики позволяли с высокой достоверностью выявлять неповирусы в экстрактах из листьев различных ягодных культур.
Для диагностики ВНТ, ВММФ, ВТМ и ВКГ были разработаны тест-системы ИФА на основе пероксидазы хрена. Чувствительность определения вирусов с помощью этих тест систем показана на рис. 5Б.
А Б 2, 2, 1,5 1, А А 1 0, 0, 1 10 100 1000 1 10 100 Концентрация вируса, нг/мл Концентрация вирусов, нг/мл Рис. 5А. Калибровочные кривые для определения вирусов X (), M (), Y (), S (), A () и ВСЛК (), добавленных в осветленный экстракт из здорового растения. А определяли через 10 мин после добавления стоп-реагента. Значения А620 в отрицательных контролях (осветленный экстракт из здоровых листьев картофеля) составляли 0,005 – 0,02 для разных сортов картофеля и на рисунке не показаны.
Рис. 5Б. Чувствительность определения очищенных препаратов ВНТ (), ВММФ (), ВТМ ( ) и ВКГ (о) в ИФА с ПХ в качестве ферментной метки. Время инкубации с субстратом (на основе 2,2’-Азино-ди(3-этил)бензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) 10 мин.
Оптическая плотность в отрицательных контролях (экстрактах из здоровых растений фасоли (ВНТ и ВММФ), табака с. Самсун (ВТМ) и гвоздики составляла, в среднем, 0,05 единицы и на рисунке не показана.
Таким образом, разработаны тест-системы на основе планшетного сэндвич-варианта ИФА для диагностики основных вирусов картофеля (ХВК, SВК, МВК, YВК, АВК, ВСЛК), неповирусов (ВКПМ, ВМА, ВЧКПТ), а также ЛВКПЗ, ВШС, ВНТ, ВТМ, ВММФ и ВКГ.
Аналитические характеристики тест-систем позволяют определять перечисленные вирусы в концентрации 2 – 16 нг/мл в очищенном препарате и в экстракте из зараженных растений и с высокой специфичностью выявлять зараженные растения картофеля, овощных, ягодных, плодовых и цветочных культур.
Разработка и характеристика наборов для иммуноферментного определения вирусов картофеля и вируса шарки сливы.
Высокая эффективность мониторинга вирусных инфекций может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их повседневной практической работе. Использование наборов, содержащих все необходимое для выполнения анализов, радикально расширяет сферу, географию и масштабы применения ИФА, существенно облегчает лабораторную диагностику вирусных инфекций в те сжатые сроки, которые обычно отводятся для этой работы, и способствует получению более достоверных результатов за счет стандартизации процедуры диагностики.
С учетом запросов практического растениеводства в России и сложившегося мирового опыта, нами, совместно с ЗАО «НВО Иммунотех», были разработаны наборы реагентов для ИФА основных вирусов картофеля (XВК, SВК, MВК, YВК, AВК и ВСЛК), а также ВШС (рис.
6). В этих наборах в качестве ферментной метки использовали НПФ. Решающее значение для выбора именно этого варианта анализа имели высокие чувствительность и специфичность тест-систем на основе Пиротест-ИФА, стабильность компонентов субстрата и возможность достоверной визуальной оценки результатов анализа.
Каждый набор включает 96-луночный полистироловый планшет, литой или стрипованный, с нанесенными антителами, в вакуумной упаковке и готовый для использования (на рисунке не показан).
Антитела к вирусу сорбируют на планшете заранее таким образом, что их активность после высушивания не снижается и сохраняется в течение всего срока годности наборов (не менее 6 мес).
Кроме того, в состав набора входят:
лиофильно высушенные положительный и отрицательный контроли;
концентрированные буферные растворы для промывания планшета и для экстракции вируса;
конъюгат кроличьих антител к вирусу с НПФ;
субстратный буферный раствор;
субстрат – пирофосфат натрия;
стоп-реагент, готовый для использования;
крышка для закрывания планшета или пленка для его заклеивания во время инкубации;
инструкция по применению набора. Таким образом, в комплектации набора предусмотрено все необходимое для выполнения анализа. Поскольку после вскрытия вакуумной упаковки в планшеты сразу вносят заранее приготовленные экстракты, анализ с помощью набора 40 – 44 образцов (в дубликатах) занимает один рабочий день. Наборы «Пиротест» были удостоены диплома I степени и медали «Лауреат ВВЦ»
Всероссийского выставочного центра и серебряной медали V Международного салона промышленной собственности «Архимед-2002».
Методы внелабораторной диагностики вирусных инфекций В последние годы растет потребность в таких методах диагностики, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно на месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки. Эта тенденция обусловлена тем, что инструментальные методы анализа должным образом могут быть использованы только в хорошо оснащенных центрах и лабораториях. Кроме того, лабораторный анализ занимает несколько суток. Это обстоятельство существенно осложняет работу, например, карантинных служб в тех случаях, когда требуется получить быстрый и однозначный результат анализа. В результате, диагностика вирусных инфекций основной массы возделываемых культур проводится только путем визуальной оценки симптомов заболевания. Эффективность маршрутных обследований насаждений с целью отбора проб для лабораторного анализа, фитосанитарного надзора или сертификации может быть значительно повышена при возможности быстрого и достоверного определения вируса непосредственно в полевых условиях.
Таким образом, для эффективного мониторинга вирусных инфекций необходимы быстрые и чувствительные неинструментальные методы анализа, которые могут быть использованы в массовых масштабах в лабораторных и, особенно, во внелабораторных условиях как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки. С этой целью мы разработали новый метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест) и метод иммунохроматографии на тест-полосках.
АБВ-тест АБВ-тест основан на коагглютинации вирусных частиц и клеток Staphylococcus aureus, покрытых антителами к определяемому вирусу. Антитела сорбируются на бактериальных клетках вследствие сродства Fc-фрагмента молекулы IgG к протеину А – белку клеточной стенки некоторых штаммов стафилококка, локализованному на поверхности бактериальной клетки;
антиген-связывающая активность антител остается при этом неизменной. В присутствии антигена клетки бактерий, нагруженные соответствующими антителами, агглютинируют, образуя видимые невооруженным глазом агрегаты (Kronvall, 1973).
Культуру Staphylococcus aureus непатогенного штамма Cowan 1, полученную в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, поддерживали и размножали на агаризованной среде Хоттингера. Клеточную массу смывали с поверхности агара, промывали и лиофилизировали. Иммунодиагностикум готовили, смешивая 1 объем 10% суспензии клеток стафилококка в PBS (0,01 М КH2PO4 0,14 М NaCl, pH 7,2 – 7,5) с 5 – объемами антисыворотки в рабочем разведении, приготовленном на PBS. Диагностикум был готов к употреблению непосредственно после смешивания компонентов.
При выполнении АБВ-теста каплю иммунодиагностикума объемом около 50 мкл смешивали на стеклянной пластинке с такой же каплей растительного экстракта или вирусного препарата. Агглютинация обычно проявлялась в течение 1 – 2 мин в виде белых хлопьев агрегированного стафилококка, различимых невооруженным глазом (рис.8). Размер хлопьев уменьшался, а время их формирования увеличивалось по мере снижения концентрации вируса в образце. При низкой концентрации вируса время оценки реакции продлевали до 5 – 10 мин.
Рис. 8. Реакция виробактериальной коагглютинации. А – Образование агрегатов клеток, покрытых антителами к ВКГ, в присутствии вируса, через 2 мин после смешивания иммунодиагностикума с очищенным вирусным препаратом ( мкг/мл). Б – отрицательный контроль (PBS).
А Б Аналитические характеристики АБВ-теста были определены с использованием очищенных вирусных препаратов и экстрактов из листьев растений, зараженных соответствующим вирусом (табл. 1).
Таблица 1.
Определение вирусов растений в АБВ-тесте Вирус Рабочее разведение Чувствительность Разведение экстракта, теста, мкг/мл 1) вызывающее агглютинацию 2) антисыворотки ВТМ 1/100 0,1 1/ ВЗКМО 1/100 0,1 1/ ВШМЯ 1/100 0,4 1/ ХВК 1/100 0,4 1/ YВК 1/200 0,4 1/ ВМК 1/100 0,4 1/ ВКГ 1/200 0,2 1/ 1) предельная концентрация вируса, выявляемая через 1 – 2 мин;
2) предельное разведение осветленного экстракта из листьев растений табака c. Cамсун (ВТМ, ВЗКМО), ячменя (ВШМЯ, ВМК), картофеля (ХВК, МВК, YВК) и гвоздики (ВКГ), через 1 – 2 мин. Препараты тобамовируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и бромовируса мозаики костра (ВМК), зараженные ими растения и антисыворотки к этим вирусам были предоставлены В.К.Новиковым.
Поскольку из всех белков сыворотки протеин А селективно связывает только IgG, использование аффинно очищенных антител позволяет значительно повысить чувствительность АБВ-теста (табл. 2).
Таблица 2.
Сравнение чувствительности определения вирусов в АБВ-тесте с использованием антисыворотки, ДЭАЭ-очищенных IgG и аффинно очищенных антител Чувствительность определения, мкг/мл *) Вирус Антисыворотка Фракция IgG Аффинные антитела ВТМ 0,1 0,1 0, ВЗКМО 0,1 0,1 0, *) Время анализа 2 мин. Рабочее разведение: антисыворотки - 1/100;
концентрация ДЭАЭ-очищенных IgG и аффинных антител - 10 мкг/мл.
Испытания АБВ-теста были проведены при диагностике ВКГ, который распространен на ремонтантной гвоздике практически повсеместно. Для его массовой диагностики применяют реакцию радиальной иммунодиффузии в агаровом геле и метод ИФА (Brunt & Martelli, 2008).
Мы сравнивали эффективность этих методов и АБВ-теста в условиях промышленного получения и размножения посадочного материала гвоздики, оздоровленного методом апикальной меристемы в меристемной лаборатории агрофирмы «Колхоз им. С.М.Кирова», и обнаружили, что АБВ-тест и ИФА выявляют зараженные растения гвоздики с одинаковой достоверностью.
Таким образом, АБВ-тест может быть использован для экспресс-диагностики вирусных инфекций в практике безвирусного растениеводства. Стабильность диагностикума в течение рабочего дня и возможность определения вирусов в неосветленных экстрактах открывают возможность для внелабораторного применения АБВ-теста, который не требует никакого оборудования, прост в выполнении и может быть использован как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки.
Определение вирусов растений методом иммунохроматографии.
Одним из наиболее перспективных методов внелабораторного анализа является метод иммунохроматографии (ИХА) в пористых мембранах (тест-полосках), на которые нанесены антитела и их конъюгаты с окрашенными коллоидными частицами, способные взаимодействовать с вирусом. Этот метод, называемый также «lateral flow device» или «strip test», был разработан для определения гормонов беременности в домашних условиях и получил широкое распространение для диагностики инфекционных заболеваний, аллергенов, наркотических веществ, токсинов, пестицидов и т.д. (Posthuma-Trumpie et al., 2009).
Метод ИХА, в его современном и наиболее распространенном формате применительно к диагностике вирусов растений, выглядит следующим образом. Тест-полоска (рис. 9А) представляет собой мультимембранный композит, состоящий из впитывающей мембраны, погружаемой в образец (1);
мембраны для нанесения конъюгата антител с частицами коллоидного золота (2);
рабочей мембраны (3), на которой в аналитической зоне (4) фиксированы антитела к определяемому вирусу, а в контрольной зоне (5) антитела к IgG кролика (или мыши);
другой впитывающей мембраны (6), поддерживающей поток жидкости по полоске. Все мембраны монтируются на пластиковой подложке, обеспечивающей единство конструкции и механическую прочность тест-полоски, и покрыты сверху прозрачной пленкой или заключены в пластиковую кассету.
А Б В Г Д Рис. 9. Схема конструкции тест-полоски и возможных результатов анализа.
При погружении тест-полоски в экстракт вирус, продвигаясь по полоске с фронтом жидкости, связывается с конъюгатом, а затем с антителами, фиксированными в аналитической зоне. Концентрирование связанных с вирусом частиц коллоидного золота приводит к образованию в этом месте окрашенной полосы. Избыток конъюгата улавливается антивидовыми антителами, в результате чего в контрольной зоне тоже образуется окрашенная полоса (рис. 9Б). При отсутствии вируса в экстракте (здоровое растение) окрашенная полоса в аналитической зоне не образуется (рис. 9В). Если окрашенная полоса не образуется в контрольной зоне, тест признается недостоверным независимо от того, образовалась ли полоса в аналитической зоне (рис. 9Г, Д).
Высокая скорость анализа, занимающего всего несколько минут, высокая чувствительность определения вирусов, простота подготовки образцов и процедуры анализа давали основания полагать, что метод ИХА может быть эффективно использован во внелабораторных и полевых условиях. Однако, в России тест-полоски для диагностики вирусов растений не производились. Поэтому целью нашей работы, выполненной совместно с лабораторией иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН, было создание иммунохроматографических тест-систем для экспресс-диагностики вирусов растений с использованием в качестве маркера частиц коллоидного золота. В качестве модельных объектов были выбраны вирусы, различающиеся размером и формой вириона: сферические ВКГ и ВММФ, палочковидный ВТМ и три нитевидных вируса (ХВК, YВК и ВШС).
Частицы коллоидного золота (КЗ) диаметром 30 нм получали цитратным методом (Frens, 1973). Получение конъюгатов IgG с КЗ осуществляли по методике Hermanson (1995).
Для изготовления тест-полосок использовали наборы mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающие рабочую мембрану CNPC на ламинате с размером пор 15 мкм, мембрану для конъюгата, впитывающую сепарирующую мембрану для образца, конечную адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку на клейкой основе. Реагенты наносили на мембраны в количестве, при котором обеспечивается максимальная яркость окраски аналитической и контрольной зон и достигается минимальный порог детекции вируса при отсутствии неспецифического окрашивания аналитической зоны. Для формирования аналитической зоны использовали IgG из антисывороток к соответствующему вирусу, а контрольной зоны – козьи антитела к IgG кролика.
Для проведения ИХА тест-полоску погружали в анализируемую пробу на 1,5 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность.
Результат анализа оценивали визуально через 10 мин. На рис. 10 приведены результаты определения YВК, разведенного до определенной концентрации экстрагирующим буфером или неосветленным экстрактом из листьев здорового растения табака.
А Б 2,5 1,28 0,64 0,32 0,16 0,08 2,5 1,28 0,64 0,32 0,16 0, Рис. 10. Определение YВК в экстрагирующем буфере (А) и в экстракте из листьев табака (Б).
Цифры под рисунком показывают концентрацию вируса (мкг/мл). Время анализа 10 мин.
Эти результаты показывают, что чувствительность определения YВК в буферном растворе и в экстракте составила не менее 80 нг/мл. Таким образом, для достоверного выявления вируса не требуется осветления экстракта. Это обстоятельство имеет важное значение, поскольку очевидно, что при внелабораторном применении тест-полосок осветление экстракта не всегда возможно.
Чувствительность определения других вирусов, использованных в этой работе, варьировала в интервале от 0,08 до 2 мкг/мл в экстрагирующем буфере и в растительном экстракте и зависела главным образом от свойств поликлональных антител к соответствующему вирусу. Метод отличается высокой специфичностью: при анализе здоровых растений или зараженных неродственным вирусом, окрашенная полоса в аналитической зоне не появлялась (рис. 11). Это обстоятельство позволило создать лабораторный образец тест-полосок для одновременного определения трех вирусов - ХВК, YВК и ВТМ, путем формирования 3 аналитических зон на одной полоске. Поскольку время анализа при этом не увеличилось, применение мультиспецифичных тест-полосок способствует повышению производительности процедуры диагностики.
А Б Рис. 11. Специфичность определения ХВК (А) и ВТМ (Б). А: экстракт из листьев картофеля (1) и дурмана (2), зараженных ХВК;
3 – из листьев здорового картофеля. Б: 1 – экстракт из листьев табака, зараженного ВТМ;
2 – из здорового табака;
– из листьев табака, зараженного YВК. Время анализа – 10 мин.
1 2 3 1 2 Одной из очевидных проблем, возникающих при внелабораторном применении тест полосок, является необходимость быстрого получения в любых условиях экстракта, пригодного для анализа методом ИХА. С этой целью были разработаны наборы, включающие, помимо собственно тест-полоски, герметично упакованной в пакет из алюминевой фольги, также емкость для получения экстрактов, заполненную экстрагирующим буфером, и инструкцию по применению тест-полоски.
Таким образом, созданы иммунохроматографические тест-системы для определения фитопатогенных вирусов, позволяющие осуществлять их экспресс-диагностику в лабораторных и внелабораторных условиях с высокой чувствительностью и специфичностью.
Предварительное нанесение всех иммунореагентов на мембрану и возможность визуальной детекции окрашенных зон, образующихся в течение нескольких минут после нанесения образца, позволяют проводить анализ без вспомогательного и регистрирующего оборудования непосредственно на месте. Все необходимые манипуляции сводятся к приготовлению экстракта и нанесению образца на полоску. Простота выполнения анализа не требует от пользователя профессиональной подготовки.
II. Молекулярная диагностика вирусных инфекций.
Молекулярные методы анализа основаны на выявлении нуклеиновой кислоты вируса и наиболее востребованы в тех случаях, когда тест-системы на основе ИФА для диагностики данного вируса не разработаны, или для его обнаружения требуется чувствительность значительно более высокая, чем может обеспечить ИФА, или когда фитопатогены в принципе не могут быть выявлены иммунохимическими методами ввиду отсутствия у них белкa оболочки. Кроме того, молекулярные методы диагностики очевидным образом более предпочтительны при необходимости одновременного определения зараженности растения не только вирусными, но также грибными, бактериальными, вироидными и фитоплазменными инфекциями.
Разработка нового метода экстракции нуклеиновых кислот из вирусных частиц и из зараженных растений с помощью трихлорацетата аммония.
Одной из основных трудностей, лимитирующей применение молекулярных методов анализа для массовой диагностики, является необходимость выделения вирусной РНК из зараженного растения. Как известно, обычно для этой цели применяют фенол, гуанидинтиоцианат или смесь фенола с гуанидинтиоцианатом («Тризол»), которые эффективно депротеинизируют РНК и инактивируют рибонуклеазы. Технология RNeasy («Qiаgen»), основанная на применении гуанидинтиоцианата для экстракции РНК и силикагеля для ее выделения, не требует применения фенола и хлороформа и позволяет получить препарат РНК, лишенный примеси ДНК или полисахаридов и пригодный для большинства последующих работ.
Нами разработан метод выделения вирусной РНК из вирусных частиц и из зараженных растений, основанный на применении нового водорастворимого хаотропного агента трихлорацетата аммония (ТХАА) для депротеинизации РНК и целлюлозного сорбента на основе хлопковой ваты для ее очистки.
Нейтральный раствор ТХАА получали путем растворения сухой трихлоруксусной кислоты в водном растворе аммиаке. На его основе готовили экстрагирующий Буфер 1 (4 М ТХАА, 0,1 М Трис-HCl, 0,025 М ЭДТА, 1,5% Тритон Х-100) и промывающий Буфер 2 (4 М ТХАА, 0,1 М Трис-HCl). Целлюлозный сорбент представлял собой 100 мг хлопковой стерильной хирургической ваты, упакованной в стерильный одноразовый шприц объемом мл. Колонку монтировали в крышке стакана с отводом, присоединенным к водоструйному или механическому насосу. Сорбент промывали Буфером 2, 70% этанолом и подсушивали под негативным давлением. Для выделения РНК из вирусных частиц вирусную суспензию смешивали с Буфером 1, инкубировали 5 – 10 мин, добавляли изопропанол до конечной концентрации 70% и полученную смесь наслаивали на сорбент. Для выделения тотальной РНК из зараженных растений 200 мг свежих листьев гомогенизировали в 1 мл Буфера 1, инкубировали 10 - 20 мин и экстракт осветляли центрифугированием на настольной центрифуге. К осветленному экстракту добавляли изопропанол до конечной концентрации 70% и полученную смесь наслаивали на сорбент. Образцы проходили через колонку самотеком со скоростью 30 капель в минуту. После полного впитывания образца колонку промывали 70% изопропанолом и высушивали под негативным давлением. Связанную с сорбентом РНК элюировали MilliQ. Все операции выполняли при комнатной температуре, за исключением стадии элюции РНК, которую выполняли при 4°С.
На примере ХВК и ВТМ показано, что разработанный метод позволяет выделять вирусную РНК с выходом, близким к 100% от теоретического, с соотношением А260/А280 = 2,0 – 2,1, и лишенную признаков деградации (рис. 12А). Метод также позволяет выделять интактные клеточную и вирусную РНК из клеток зараженных растений (рис. 12Б). Выход тотальной РНК из листовой ткани растений табака и картофеля составлял, в пересчете на мг свежей листовой ткани, 40 – 60 мкг, с соотношением А260/А280 = 1,9 – 2,0. Следует отметить минимальную контаминацию препарата РНК клеточной ДНК.
А Б 18S рРНК 28S рРНК РНК ВТМ 1 2 1 2 3 Рис. 12. А. РНК ВТМ (1) и РНК ХВК (2), выделенные из очищенных вирусных препаратов. Б.
Выделение РНК ВТМ из экстракта листьев табака. 1- РНК ВТМ;
2 - РНК, выделенные из здоровых листьев табака;
3 – из здоровых листьев с подмешанным ВТМ;
4 - из листьев, зараженных ВТМ. РНК получали экстракцией 4 М ТХАА и очищали на целлюлозном сорбенте. Электрофорез в 1% агарозном геле в 0,5 Х ТАЕ – буфере («Fermentas»). Окраска бромистым этидием.
Разработанный способ выделения РНК дешев, не требует применения токсичных соединений и позволяет получать РНК высокого качества (А260/A280 = 1,9 – 2,1) при комнатной температуре. Выход РНК из очищенного вирусного препарата достигает 100%, а выход тотальной РНК соответствует обычному для упомянутых методов выделения;
при этом препарат РНК содержит значительно меньше ДНК, чем при экстракции фенолом. Процедура получения очищенного препарата РНК из одного образца занимает около 30 мин, причем возможно одновременное выделение РНК из нескольких образцов. Следует также отметить, что в известном способе очистки РНК с помощью целлюлозного сорбента последний готовят путем гомогенизации волокнистой хроматографической бумаги (Su & Comeau, 1999). Этот способ достаточно трудоемок;
кроме того, неравномерная структура получаемой суспензии существенно лимитирует скорость потока при хроматографии. В нашей работе мы применили хлопковую вату, которая обладала высокой сорбционной емкостью и обеспечивала необходимую скорость протекания образца по колонке.
Определение вирусов растений методом дот-гибридизации.
Методы, основанные на феномене дот-гибридизации, широко применяются для массовой диагностики вирусов растений в силу их высокой чувствительности и производительности. Разработанный нами метод основан на дот-гибридизации нуклеиновой кислоты вируса, фиксированной на нитроцеллюлозной мембране, с кДНК-зондом, меченным хлордиэтилентриаминоплатиной [(диен)Pt], и последующем выявлении образующихся гетеродуплексов в ИФА с помощью антител к (диен)Pt (Рис. 13). Поскольку метод включает стадии молекулярно-гибридизационного анализа (МГА) и иммуноферментного анализа (ИФА), он получил название МГА-ИФА-технологии.
А Б Рис. 13. А. Схема определения вирусов с помощью дот-гибридизации (МГА-ИФА технологии). Образец: вирусная РНК или ДНК, рекомбинантная плазмида со вставкой вирусной кДНК, вирусная кДНК, полученная и амплифицированная методом ОТ-ПЦР, тотальная клеточная РНК, выделенная из зараженных растений, и т.д. Б. Структурная формула (диен)Pt.
Известно, что (диен)Pt способна ковалентно связываться с N7-атомом гуанидина в молекуле ДНК или РНК и, таким образом, может быть использована для мечения нуклеиновых кислот. Введение платиновой метки не влияет на структуру меченой ДНК и на ее способность к гибридизации при условии, что плотность метки не превышает 1 молекулы (диен)Pt на 10 нуклеотидов (Van Belkum et al., 1994).
Метод в представленном на рис. 13 виде был разработан для диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) и нашел успешное применение в элитном семеноводстве картофеля (Кондакова и Дрыгин, 1999). Цель нашей работы состояла в разработке МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусных инфекций. В отличие от короткой и исключительно стабильной РНК вироида, вирусные РНК значительно менее стабильны и в десятки раз длиннее. Кроме того, вирусная РНК покрыта белком оболочки вируса, в то время как РНК вироидов такой оболочки лишена. В связи с этими принципиальными различиями были изучены возможность и условия применения МГА ИФА-технологии для детекции вирусов растений и определены аналитические характеристики метода.
Препарат (диен)Pt предоставлен Ю.Ф.Дрыгиным (НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ), а аффинно очищенные кроличьи антитела к ДНК-(диен)Pt – В.И.Киселевой (Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск) (Киселева и др., 1994). Рекомбинантные плазмиды со вставками вирусной кДНК были сконструированы С.В.Козловским и Р.А.Зиновкиным (табл. 3).
Таблица 3.
Характеристика рекомбинантных плазмид, использованных в работе.
Название Клонируемый Ген(ы) Вектор Штамм фрагмент1) вируса E.coli АВК 2472 – 4673 P3 + CI pDrive DH-5alfa МВК 5861 – 8006 TGB (1 – 3) + CP pDrive DH-5alfa SВК 7201 - 8378 CP + p11 pDrive DH-5alfa ВМЛ 400-1900 РНК-3 p35 + СР pDrive DH-5alfa YВК 1279 - 2636 HCPro pBlueScript II SK(+) XL-1 Blue XВК Полный геном pUC-19 JM ВСЛК 3161 – 5167 2b+3+4+5 pBlueScript II SK(-) JM ВТМ Полный геном pGEM5Zf(-) JM ВШС 9152-9787 СР + 3’-NTR + полиА pBlueScript II SK(-) XL-1 Blue 1) Позиции нуклеотидов в вирусной РНК. СР – ген белка оболочки;
3’-NTR – 3’-нетранслируемая последовательность;
TGB – тройной блок транспортных генов карлавирусов;
HCPro, P3, CI – гены хелперного компонента, протеазы и белка цитоплазматических включений потивирусов, соответственно;
р11 – ген обогащенного цистеином белка карлавирусов с неизвестной функцией;
р – ген, кодирующий белок с мол. массой 35 кДа.
Для синтеза кДНК-зондов, меченных (диен)Pt, к 40 мкл плазмидной ДНК (100 нг/мкл), денатурированной в кипящей водяной бане в течение 5 мин и быстро охлажденной во льду, добавляли 28 мкл MilliQ, 8 мкл 0,1 М NaClO4 и 4 мкл 0,5 мМ (диен)Pt. Таким образом, конечная концентрация ДНК в смеси составляла 50 нг/мкл, перхлората натрия – 10 мМ, и (диен)Pt – 25 мкМ. Смесь инкубировали в водяной бане 2,5 ч при 65°С. Препарат зонда содержали при +4С, а при необходимости длительного хранения при -20С.
Образцы РНК, выделенной из вирусов или из растений, и положительного контроля (серия разведений рекомбинантной плазмиды в MilliQ) денатурировали, наносили на нитратцеллюлозную мембрану Protran BA 85/21 (Schleicher & Schuell, 0,45 µm) и фиксировали облучением ультрафиолетовым светом. Мембраны инкубировали в предгибридизационном растворе (5Х SSC, 2Х раствор Денхардта, 0,1% додецилсульфат натрия) 2 ч при температуре 65°С. Зонд денатурировали 0,1 N NaOH в течение нескольких секунд и добавляли в предгибридизационную смесь в соотношении 1/1000 (объем/объем), так что конечная концентрация ДНК зонда составляла 50 нг/мл. Гибридизацию проводили в герметично запечатанных чашках Петри в течение 24 ч при температуре 65°С. Для обнаружения связавшегося с мишенью зонда использовали дот-вариант непрямого метода ИФА, в котором первичные антитела были против диен-платинированной ДНК, а в качестве вторичных использовали антитела к кроличьим IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Для выявления ферментативной активности использовали хемилюминесцентный субстрат пероксидазы.
Чувствительность метода определения вирусных РНК с помощью кДНК-зондов, меченных (диен)Pt, была изучена на примере детекции нескольких РНК, выделенных из очищенных вирусных препаратов с помощью разработанного нами метода (рис.14).
А Б 200 100 50 25 12,5 6,25 3,0 200 100 50 25 12,5 6,25 3, Рис. 14. Чувствительность определения РНК ВШС (А) и РНК ХВК (Б) методом дот гибридизации с кДНК-зондом, меченным (диен)Pt. 1. Рекомбинантная плазмида. 2. Вирусная РНК.
Цифры над рисунком показывают концентрацию нуклеиновой кислоты в образце (пг/мкл). Объем образца 0,8 мкл. Время экспозиции рентгеновской пленки с мембраной – 20 мин.
Результаты этих экспериментов показывают, что чувствительность метода позволяет обнаруживать 10 – 20 пг вирусной РНК в нанесенной пробе. Следует отметить, что чувствительность выявления РНК слабо зависела от длины вставки кДНК, которая для ВШС и ХВК составляла, соответственно, 650 и 6500 нуклеотидов (табл.3).
Метод позволяет специфично выявлять вирусную РНК в экстрактах из зараженных травянистых растений и из растений косточковых культур (рис. 15), причем уровень сигнала в МГА-ИФА соответствовал степени накопления вируса, определенной с помощью ИФА.
А Б 2000 400 80 16 3,2 0,6 0, В Г 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 15. А. Определение ВТМ в листьях табака N. tabacum c. Самсун. В7 – рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ВТМ, 100 пг/мкл;
Г7 – отрицательный контроль (рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ХВК, 100 пг/мкл);
В(5,6) – здоровое растение;
В(1,2), В(3,4), Г(1,2), Г(3,4), Г(5,6) – образцы нуклеиновых кислот, выделенных из листьев разных ярусов зараженного растения, в дубликатах. Б. Определение ВШС в листьях сливы (с. Яичная Синяя). 1:
рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ВШС. 2: Нуклеиновая кислота, выделенная фенольным методом (1 – 4) и с помощью ТХАА (5 – 8) из (одних и тех же) здоровых (1, 2, 5, 6) и зараженных (3, 4, 7, 8) листьев. Цифры над рисунком показывают концентрацию плазмиды в нанесенном образце (пг/мкл).
Таким образом, разработанный вариант метода дот-гибридизации позволяет обнаруживать 10 – 20 пг РНК различных вирусов и достоверно выявлять ВТМ, а также ХВК, YВК и ВСЛК (не показано) в экстрактах из листьев зараженных растений, в т.ч. ВШС в экстрактах из листьев косточковых культур. Продолжительность анализа составляет 2 – суток, а количество одновременно анализируемых образцов лимитируется главным образом, необходимым для экстракции РНК.
Для синтеза зондов было использовано комплексное соединение двухвалентной платины – (диен)Pt. Выбор метки определялся чрезвычайной простотой процедуры мечения, заключающейся в простом смешивании ДНК и (диен)Pt и инкубации в мягких условиях.
Поскольку (диен)Pt количественно связывается с ДНК, отпадает необходимость дополнительной очистки зонда. Внедрение (диен)Pt в молекулу ДНК практически не влияет на специфическую гибридизацию кДНК-зонда с РНК мишени. Важным достоинством диен платиновой метки является высокая иммуногенность ее комплекса с ДНК, что позволяет получать аффинные антитела, специфично узнающие любую ДНК, меченную (диен)Pt.
Следует отметить высокую стабильность метки: срок годности ДНК-зондов, меченных (диен)Pt, составляет не менее 6 мес при хранении при -20°С (срок наблюдений).
Разработка ОТ-ПЦР-МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусов.
Известно, что сочетание амплификации мишени с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и амплификации сигнала посредством детекции ампликонов с помощью дот-гибридизации, ИФА или флуоресцентных зондов открывает возможность радикального повышения чувствительности определения вирусов. С этой целью на модели ХВК были изучены, совместно с Р.А.Зиновкиным и О.А.Кондаковой (каф.
вирусологии биологического факультета МГУ), возможности диагностического анализа, основанного на сочетании методов ОТ-ПЦР и МГА-ИФА.
В качестве матрицы для проведения ОТ-ПЦР использовали ряд последовательных десятикратных разведений РНК ХВК в MilliQ, начиная с 2 пг/мкл и вплоть до концентрации х 10-6 пг/мкл. Для выполнения ОТ-ПЦР использовали обратный вирусспецифический праймер 5’-ACCTTGCGCTTGCCAGTTAG-3’, соответствующий позициям 6085 – 6105 в геномной РНК ХВК, и прямой праймер 5’-CCGGATGGGGATTTCTTTAGTA-3’, соответствующий позициям 5755 – 5777. В ПЦР брали 1/10 объема продукта обратной транскрипции. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый при температуре 94°С – 40 сек, 57°С – сек, 72°С – 40 сек. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, окрашенном этидиумбромидом, и с помощью МГА-ИФА-технологии (рис. 16).
А Б 1 2 3 4 5 6 М 1 2 3 Рис. 16. А. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле. 1 – отрицательный контроль ОТ;
2 – 0,03 фг РНК ХВК;
3 – 0,1 фг РНК ХВК;
4 – 1 фг РНК ХВК;
5 – 10 фг РНК ХВК;
6 100 фг РНК ХВК;
М – маркеры мол. массы (GeneRuler 1kb Ladder, «Fermentas»). Стрелкой показано положение ампликона ожидаемого размера 351 нуклеотид. Б. МГА-ИФА продуктов ОТ-ПЦР РНК ХВК. 1 – 3: 10, 1 и 0,1 фг РНК ХВК в образце для ОТ, соответственно;
4 – отрицательный контроль ОТ.
Результаты этих экспериментов показывают, что вирусные РНК, полученные с помощью ТХАА, пригодны для амплификации с помощью ОТ-ПЦР. Метод ОТ-ПЦР позволял выявлять 1 фг вирусной РНК в пробе, что соответствует уровню детекции молекул вирусной РНК для реакции ОТ и 30 молекул кДНК в полимеразной цепной реакции (Рис. 16А). При гибридизации продуктов ПЦР со специфическим кДНК-зондом методом МГА-ИФА была достигнута чувствительность 0,1 фг, что соответствует уровню детекции молекул вирусной РНК в исходной реакции обратной транскрипции, или 3 молекул кДНК после их размножения с помощью ПЦР (Рис.16Б). Таким образом, детекция ампликона с помощью дот-гибридизации позволяет на порядок повысить чувствительность определения вируса (по сравнению с методом электрофореза) и его специфичность. В результате совокупного применения методов амплификации мишени и усиления сигнала показана возможность выявления одиночных молекул РНК вируса в анализируемой пробе.
Диагностика вируса шарки сливы с помощью полимеразной цепной реакции.
Исключительно высокая вредоносность ВШС вызывает необходимость разработки все более совершенных методов его выявления и унификации процедуры диагностики с целью предупреждения распространения вируса с посадочным материалом косточковых культур. В этой связи по инициативе Европейской организации по защите растений (EPPO) разработан протокол, регламентирующий правила сбора образцов для анализа, а также методы диагностики и процедуры их применения для обеспечения максимально надежного определения ВШС (EPPO, 2004;
Cambra et al., 2008). В частности, согласно этому протоколу, для официального подтверждения обнаружения ВШС положительный результат должен быть получен не менее чем двумя альтернативными методами анализа, среди которых ведущая роль отводится ОТ-ПЦР. Причина заключается в том, что при низкой концентрации вируса (в пробирочных растениях, отдельных частях взрослых деревьев и т.д.) для его надежного выявления необходимо применение методов диагностики, обладающих чувствительностью более высокой, чем у ИФА.
Целью нашей работы являлась разработка метода ОТ-ПЦР для выявления ВШС в пробирочных растениях, в частности, в растениях, оздоравливаемых культурой меристем. В качестве положительного контроля использовали растения табака N. benthamiana, экспериментально зараженные NAT-изолятом ВШС, и листья взрослого дерева войлочной вишни Prunus tomentosa с характерными симптомами шарки. Отрицательным контролем служили экстракты из свежих листьев вишни P. cerasus клонового подвоя П7, не зараженного ВШС. Вирус определяли в пробирочных растениях сливы P. domestica, оздоровленных методом термотерапии и культуры апикальных меристем, и в пробирочных растениях нескольких сортов сливы, зараженных ВШС. Все растения косточковых культур были из коллекции ВСТИСП. Наличие или отсутствие вируса во всех использованных в работе растениях было предварительно подтверждено методом ИФА с помощью набора «Bio-Rad» и стандартным индикаторным тестом на листьях персика сорта GF-305.
Тотальную РНК экстрагировали из 0,1 г свежей листовой ткани, измельченной в жидком азоте, методом фенольно-хлороформенной депротеинизации с додецилсульфатом натрия.
ОТ-ПЦР выполняли по методике Wetzel et al.(1991), используя новую пару праймеров:
обратный праймер (5’-CAACAACGTTGGACTCACC-3’), комплементарный нуклеотидам 8568-8550 в гене NIb (репликазы) РНК NAT-изолята ВШС, и прямой праймер (5’ CACTCCTTAAGCTTGGACAC-3’), соответствующий позициям 8011-8030 в гене NIb («Синтол», Россия), а также обратную транскриптазу AMV («Promega») и Taq-ДНК полимеразу («Invitrogen»). ПЦР выполняли на амплификаторе Amply-25 (ООО «Компания Биоком», Россия). В качестве положительного контроля ПЦР использовали рекомбинантную плазмиду pGEM3-PPVNAT65 (предоставленную E. Maiss, Univ. Hannover, Германия), со вставкой кДНК-копии гена NIb ВШС. Реакция состояла из 35 циклов, каждый из которых осуществляли при температурах: 96°С - 1 мин, 50°С – 30 сек, 72°С - 1 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле.
А Б 1 2 34 5 6 7 8 М Рис. 17. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в геле агарозы. А: 1 – отрицательный контроль;
2, 3 – положительный контроль (экстракт из листьев табака и войлочной вишни, соответственно);
4, 5 – экстракт из замороженных листьев войлочной вишни;
6, 7, 8 – экстракты из пробирочных растений сливы сортов: Память Тимирязева, Евразия, Яичная Синяя. Б: 1 – плазмида рGEM3-PPVNAT65;
пробирочные растения сливы сортов: Тульская черная (2), Яичная синяя (3), Евразия (4);
Утро, клоны 1 и 2 (5, 6), Ренклод советский (7), Скороспелая красная (8). М – маркеры мол. массы (1 kb DNA ladder, «Gibco BRL»). Стрелка указывает положение ампликона ожидаемого размера 560 пар нуклеотидов.
С помощью ОТ-ПЦР ВШС был обнаружен в экстрактах из растений табака N.
benthamiana и свежих листьев войлочной вишни (рис.17А, дорожки 2 и 3, соответственно).
Размер ампликона (560 п.н.) соответствовал расчетам, произведенным при подборе праймеров. В экстрактах из тех же листьев, предварительно замороженных при -20°С, ВШС обнаружить не удалось (дорожки 4, 5). Не обнаружено зон соответствующего размера в экстрактах из листьев вишни П7, не зараженной ВШС (рис.59А, дорожка 1) и в пробирочных растениях сливы, оздоровленных культурой апикальных меристем (дорожки 6, 7 и 8).
Те же условия реакции были использованы для выявления вируса в листьях пробирочных растений сливы, зараженных ВШС. Результаты, представленные на рис.17Б, показывают, что разработанный вариант ОТ-ПЦР позволяет достоверно выявлять ВШС в пробирочных растениях косточковых культур. Таким образом, разработанный метод позволяет осуществлять эффективный контроль процесса оздоровления от ВШС уже на самых ранних его этапах и избегать неоправданных затрат при дальнейшем размножении неоздоровленных растений.
Использованные в нашей работе праймеры были выбраны с таким расчетом, чтобы амплифицировалась консервативная последовательность внутри гена вирусной РНК полимеразы, что, как предполагалось, должно было обеспечить выявление любого изолята ВШС вне зависимости от его штаммовой принадлежности. Результаты нашей работы, по видимому, соответствуют этим предположениям. В то же время следует заметить, что электрофоретическая подвижность продуктов ОТ-ПЦР и, следовательно, их размер, несколько различались в зависимости от сорта сливы. Возможно, разные сорта в коллекции заражены разными изолятами ВШС, обладающими некоторой вариабельностью внутри этой достаточно протяженной нуклеотидной последовательности в гене вирусной РНК полимеразы.
Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНК-микроплаты.
Одной из ведущих тенденций современного развития методов диагностики вирусных инфекций является разработка подходов, которые позволяют определять все важнейшие патогены данной культуры одновременно в одном образце. Наиболее перспективным решением этой задачи является чиповая технология, которая имеет в этом отношении практически неограниченный потенциал. Однако, в настоящее время создание и применение биочипов связано с серьезными техническими трудностями, а чувствительность анализа недостаточно высока в сравнении с другими методами молекулярной диагностики, особенно ПЦР. По этой причине ДНК-чипы пока не нашли широкого применения для диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных растений. В этой связи целью нашего исследования, выполненного совместно с О.А.Кондаковой, была разработка более простого аналога ДНК-чипа – т.н. ДНК-микроплаты для одновременной диагностики основных вирусов и вироида картофеля в одном образце.
Для приготовление ДНК-микроплаты использовали нитратцеллюлозную разлинованную мембрану Protran BA 85/21 (Schleicher & Schuell, 0,45 µm). Рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку соответствующей кДНК (ХВК, SВК, МВК, YВК, АВК, ВСЛК, ВВКК и ВМЛ), или продукты ОТ-ПЦР-амплификации РНК ХВК денатурировали, наносили на мембрану в центр квадрата (ячейку микроплаты), и фиксировали облучением ультрафиолетовым светом. Получение и клонирование кДНК вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) было выполнено П.А.Ивановым, а фрагментов кДНК РНК ХВК различной длины с помощью обычной и асимметричной ОТ-ПЦР - Р.А.Зиновкиным (каф.
вирусологии биологического факультета МГУ).
Процесс диагностического анализа с помощью ДНК-микроплаты выглядит следующим образом (Рис. 18). Тотальную РНК выделяют из листьев картофеля, зараженных вирусами и вироидом, любым из известных методов (например, с помощью ТХАА и хроматографии на целлюлозном сорбенте), и модифицируют диен(Pt). Нами впервые было показано, что диен платиновая метка прочно и количественно связывается с РНК и выявляется антителами к платинированной ДНК с примерно такой же чувствительностью, как и в составе меченой ДНК. Меченая тотальная РНК гибридизуется с рекомбинантными ДНК, фиксированными на нитратцеллюлозной мембране. Образовавшиеся гетеродуплексы выявляют с помощью ИФА, как описано выше для МГА-ИФА-технологии.
Пероксидаза хрена Хемилюминесцентный Рис. 18. Принципиальная схема ДНК субстрат микроплаты. Образец: тотальная Антитела к (диен) Pt Регистрация эмиссии клеточная РНК, выделенная из на рентгеновской зараженных растений и меченная (диен)Pt.
пленке (диен) Pt образец рекомбинантная плазмида мембрана Для изучения гибридизационных свойств «платинированной» РНК была использована следующая методика. К препарату тотальной РНК, выделенной из листовой ткани здорового растения картофеля, подмешивали различное количество очищенной РНК ХВК. Смесь РНК платинировали и использовали в гибридизации с ДНК-микроплатой.
Результаты этих модельных экспериментов (рис. 19) показывают, что платинированная РНК ХВК может быть с высокой специфичностью выявлена в гибридизации с ДНК, фиксированной в ячейках микроплаты, в концентрации по меньшей мере 10 пг/мкл.
Очевидно, что чувствительность выявления платинированной РНК зависит от количества и природы продукта, иммобилизованного в ячейке чипа. Наиболее эффективно платинированная РНК выявляется в гибридизации с рекомбинантной плазмидой: совершенно очевидно, что даже при количестве нанесенной плазмиды 50 нг, предел детекции мишени находится значительно ниже достигнутого в данном эксперименте. При фиксации в ячейках микроплаты продуктов ПЦР наилучшие результаты, как следует из рисунка, были достигнуты при использовании самого длинного фрагмента длиной 614 нуклеотидов, что, по-видимому, объясняется большей эффективностью гибридизации меченой РНК с более длинной кДНК, фиксированной в ячейке.
А Б В 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 Рис. 19. Определение платинированной РНК ХВК с помощью ДНК-микроплаты. Верхний и средний ряд: кДНК ХВК. 1 - плазмида со вставкой кДНК ХВК;
2, 3, 4 - двунитевой продукт ПЦР длиной 614, 470 и 321 нуклеотид, соответственно;
5, 6, 7 – однонитевой продукт ПЦР длиной 614, и 321 нуклеотид, соответственно. Верхний ряд – 500 нг кДНК в ячейке микроплаты;
средний ряд – нг кДНК в ячейке микроплаты. Нижний ряд: отрицательный контроль (рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ВВКК);
1 – 500 нг;
2 – 50 нг плазмиды в ячейке микроплаты. Концентрация РНК ХВК во фракции нуклеиновых кислот, выделенных из здорового растения картофеля: 1000 (А), 100 (Б) и 10 (В) пг/мкл.
Испытание эффективности ДНК-микроплаты при диагностике вирусных и вироидных заболеваний картофеля было проведено на растениях картофеля, зараженных различными патогенами (как было предварительно установлено с помощью ИФА). Результаты испытаний, представленные на рис. 20, показали полное соответствие результатов выявления вирусов методом ИФА и с помощью ДНК-микроплаты. Кроме того, ДНК-микроплата позволяет одновременно выявлять и вироид, установить наличие которого с помощью ИФА невозможно из-за отсутствия белковой оболочки.
Таким образом, ДНК-микроплата позволяет одновременно выявлять вирусы и вироид картофеля в одном образце с чувствительностью не менее 10 пг РНК вируса или вироида;
продолжительность анализа составляет не более 3 суток;
срок годности препаратов РНК, меченных диен-платиной, и ДНК-чипа - 6 мес при хранении при -20°С (срок наблюдений).
В настоящее время при конструировании ДНК-чипов для определения вирусов растений в качестве ДНК-зондов используют продукты ПЦР или синтетические однонитевые олигонуклеотиды, комплементарные выявляемой мишени. В нашей работе мы также показали возможность использования продуктов обычной и асимметричной ПЦР для высокочувствительного выявления РНК ХВК в смеси с тотальной РНК, выделенной из листьев картофеля. В то же время, использование в качестве зонда рекомбинантной плазмиды, содержащей полногеномную вставку кДНК ХВК, способствовало значительному повышению чувствительности анализа. Таким образом, применение рекомбинантной плазмиды в качестве зонда оправдано повышением чувствительности метода, особенно в том случае, когда уже имеются необходимые клонированные рекомбинантные ДНК, а количество выявляемых патогенов сравнительно невелико.
А Б В ВМЛ YВК MВК SВК АВК ВСЛК ВВКК ХВК Рис. 20. Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНК-микроплаты. Слева: список и локализация нанесенных рекомбинантных плазмид;
А – Растение, зараженное (по результатам ИФА) ХВК и МВК;
Б – незараженное;
В – зараженное МВК.
Применение ДНК-микроплаты дает возможность одновременной диагностики вирусов и вироида в анализируемом образце и, таким образом, позволяет обеспечить, значительно ускорить и существенно удешевить процедуру сертификации семенного картофеля. Следует подчеркнуть, что ДНК-микроплата позволяет повысить эффективность диагностического анализа пропорционально количеству ячеек, содержащих соответствующую рекомбинантную ДНК со вставкой кДНК вироида или вируса и может являться прототипом для конструирования ДНК-чипов для диагностики вироидных и вирусных инфекций любого экономически важного сельскохозяйственного растения.
III. Применение разработанных методов диагностики для решения практических задач безвирусного растениеводства.
Разработанные методы диагностики были использованы для контроля качества и сертификации семенного картофеля, получения безвирусного посадочного материала ягодных, плодовых и цветочно-декоративных культур, диагностики карантинных объектов.
Наиболее широкое применение получили метод ИФА и АБВ-тест.
Диагностика вирусных инфекций в элитном семеноводстве картофеля.