Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биологических микрочипов
На правах рукописи
НАСЕДКИНА
Татьяна Васильевна
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ У ЧЕЛОВЕКА
В НОРМЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ
03.00.03 – Молекулярная биология
03.00.15 - Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской Академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, г. Москва
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Олег Леонидович Поляновский доктор биологических наук, профессор Ольга Олеговна Фаворова член-корр. РАМН, доктор биологических наук Федор Львович Киселев
Ведущая организация:
ГУ Медико-генетический научный центр РАМН
Защита диссертации состоится «_» _2009 г.
в _ ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу 119991 г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта РАН.
Автореферат разослан «_» _2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета:
к.х.н. Крицын А.М
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Секвенирование генома человека и пост-геномный анализ открыли новую эру в биомедицинских исследованиях. Все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Это диагностика наследственных заболеваний, анализ генетических изменений в опухолевых клетках при уточнении диагноза и выборе терапии в онкологии. Получила развитие персонализированная медицина, которая изучает генетические особенности человека, его предрасположенность к различным заболеваниям и разрабатывает профилактические меры для их предупреждения. При лечении заболеваний с помощью современных лекарственных средств остро встает вопрос о переносимости лекарственных препаратов и предупреждении развития побочных реакций, что также может определяться генетическими характеристиками пациента. Этими проблемами занимается фармакогенетика, как одно из направлений персонализированной медицины. Также все чаще приходится прибегать к генетическому анализу при решении задач в области криминалистики и судебной медицины. Широкое использование молекулярно генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений.
Одним из наиболее перспективных подходов являются биологические микрочипы.
Биологические микрочипы (biological microarrays), как метод анализа генома, широко используют в самых разных областях молекулярной биологии, генетики, биомедицины, онкологии. Различные технологические платформы, используемые при создании биологических микрочипов, описаны в многочисленных статьях и подробных обзорах (Lee and Saeed, 2007;
Hardiman, 2006). Одной из наиболее известных является технология Affymetrix GeneChip (Santa Clara, США). Микрочипы Affymetrix содержат до 106 индивидуальных элементов (зондов) и используются для параллельного анализа более 200 000 полиморфных ДНК маркеров. Особенностью этого типа микрочипов является синтез олигонуклеотидных зондов прямо на поверхности кварцевых стекол с использованием метода фотолитографии. Также используют микрочипы, в которых на твердой подложке иммобилизованы предварительно синтезированные или выделенные фрагменты ДНК. Микрочипы, содержащие большое количество элементов, относятся к так называемым «микрочипам высокой плотности» и применяются, как правило, в исследовательских целях. Выявление ограниченного набора генетических маркеров, являющихся мишенью в диагностике, делает обоснованным переход к «микрочипам низкой плотности», содержащим десятки или одну - две сотни элементов. Как правило, в этих случаях используют микроскопические стекла с нанесенными и ковалентно пришитыми зондами. Особенностью технологии гидрогелевых биочипов является трехмерная структура ячеек геля, в которых иммобилизованы зонды (фрагменты ДНК или белки). Технология гидрогелевых биочипов развивается в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН с 1989 г. и является одной из наиболее востребованных платформ для разработки биочипов диагностической направленности.
В настоящем исследовании разработаны и апробированы следующие биочипы:
ЛК-биочип для выявления и идентификации хромосомных транслокаций;
ТКЛ-биочип для определения Т-клеточной клональности;
РМЖ-биочип для определения мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2, ассоциированных с наследственной формой рака молочной железы;
ПФ-биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации;
ПФ-биочип (NAT2) для определения полиморфизма в гене NAT2;
ПФ-биочип (Кардио) для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы и ИЛ-биочип для генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека.
Необходимость анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей. Всего лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки). Такой успех в лечении достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций различных цитостатических препаратов, а также рационализации терапии, основанной на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно генетических методов (Алейникова, 2002;
Карачунский и др., 2007). В настоящей работе при создании биочипа были выбраны 13 наиболее клинически значимых и часто встречающихся при лейкозах транслокаций: t(9;
22)BCR/ABL p190 и p210, t(12;
21)TEL/AML, t(1;
19)E2A/PBX, t(15;
17)PML/RARA, t(8;
21)AML/ETO, inv16 CBFB/MYH, t(4;
11)MLL/AF4 и другие транслокации с участием гена MLL. Каждая из этих транслокаций определяет вариант лейкоза с определенными клиническими характеристиками, характером течения заболевания, прогнозом и важна для выбора стратегии лечения (Pui C.H. et al., 2003).
Определение Т-клеточной клональности важно при диагностике Т-клеточных лимфом. Традиционные методы диагностики: цитология, гистология, иммунофенотипирование и иммуногистохимия во многих случаях не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией (Spagnolo et al., 2004). Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (TCR) в опухолевых Т-лимфоцитах. Появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением и развитием популяции клеток с одинаковой перестройкой генов TCR, что может быть зарегистрировано по гибридизации с соответствующими зондами на биочипе.
Наличие мутаций в высоко пенентрантных генах–супрессорах BRCA1 и BRCA ассоциируется с повышенным риском развития рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) у женщин (Miki et al., 1994;
Wooster et al., 1995). Эта модель уже является объектом генетического тестирования в странах Западной Европы и в Америке. Было показано, что в России распространен ряд герминальных мутаций (“germ-line founder mutations”), анализ которых позволяет эффективно выявлять лиц с высокой предрасположенностью к развитию заболевания (Gayther et al., 1997, Tereschenko et al., 2001;
Loginova et al., 2003;
Sokolenko et al., 2007). Однако эти работы были выполнены на сравнительно небольших выборках. Поэтому представляло интерес проведение масштабных исследований для получения более полной картины о частоте различных мутаций в генах BRCA1/2 и СHEK2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке, и также для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости.
За последнее время накоплено большое число данных о том, что генетический полиморфизм лежит в основе индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам, а также определяет наследственную предрасположенность к многофакторным заболеваниям. Именно поэтому анализ генетического полиморфизма является чрезвычайно актуальной задачей. Одними их наиболее широко исследуемых генов являются гены системы биотрансформации, белковые продукты которых принимают участие в метаболизме всех ксенобиотиков, поступающих в организм.
Выявление ассоциаций различных аллелей этих генов с конкретным заболеванием и ответом на лекарственную терапию позволяет не только выявлять механизмы заболевания и исследовать его природу, но и разрабатывать подходы к персонализированной медицине, т.е. лечению, учитывающему генетическую индивидуальность каждого пациента. Так, наследственная недостаточность фермента тиопурин-S-метилтрансферазы (TPMT), обусловленная инактивирующими однонуклеотидными заменами в гене TPMT, приводит к плохой переносимости лекарственных препаратов тиопуриновой группы (6–меркаптопурин, 6–тиогуанин и азатиоприн) (Lennard et al., 1992). Стандартные дозы этих лекарств высоко токсичны для больных с недостаточностью фермента, причем токсический эффект может быть фатальным (Lennard et al., 1987). В состав биочипа для определения индивидуальной переносимости лекарств также включены гены основных ферментов биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQO1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2, участвующие в метаболизме широкого спектра лекарственных препаратов. Имеются данные, что полиморфизм в генах системы биотрансформации вносит вклад в формирование некоторых онкологических заболеваний, например, таких как лимфомы и лейкозы, а также влияет на частоту и особенности развития рецидивов при лейкозах у детей (Skibola et al., 1999;
Krajinovic et al., 2000;
Krajinovic et al., 2002;
Gemmati et al., 2004). Исследование частоты аллелей указанных генов в российской популяции у больных и здоровых доноров позволяет выявить генетические факторы риска развития этих заболеваний или рецидива заболевания.
Дальнейшее развитие этот подход к оценке полиморфизма генома при многофакторных заболеваниях получил при создании ПФ-биочипа (Кардио), предназначенного для анализа полиморфизма некоторых генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, участвующих в регуляции кровяного давления.
Показано, что такие заболевания, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и др. могут возникать вследствие неблагоприятного сочетанного эффекта многих (нескольких) аллелей полиморфных генов (Naber and Siffert, 2004). Именно поэтому, разработка подхода для одновременного анализа полиморфизма нескольких генов имеет большое значение также и в изучении сердечно-сосудистой патологии.
ИЛ-биочип разработан для применения в другой области современной медицины – судебно-генетической экспертизы. Задачи идентификации личности встают не только при поиске преступника, оставившего следы на месте преступления, но и при опознании тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах. В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats) (Gill, et al., 1985). Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов. STR-анализ требует пока еще дорогого импортного оборудования. Поэтому актуальна разработка новых недорогих подходов, обеспечивающих скрининг большого количества образцов, но в тоже время обладающих высокой специфичностью и чувствительностью.
Таким образом, биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая как точечные мутации, так и некоторые хромосомные перестройки. Изучение генетических изменений человека в норме и при различных заболеваниях и разработка биочипов различной диагностической направленности для наиболее актуальных областей медицины позволяют поднять на более высокотехнологичный уровень, как современную клиническую диагностику, так и биомедицинские исследования в целом.
Цель исследования:
Целью диссертационной работы является разработка метода многопараметрического анализа различных генетических изменений у человека на основе технологии гидрогелевых биочипов для проведения эффективных молекулярно биологических и биомедицинских исследований, а также решения задач медицинской диагностики.
Задачи работы:
1. Выбрать наиболее клинически значимые хромосомные перестройки при лейкозах у детей и разработать биочип для их выявления и идентификации. Определить частоту встречаемости хромосомных перестроек у детей, жителей России, больных различными формами лейкозов, и создать на основе биочипа диагностическую тест-систему.
2. Разработать подход для анализа структурных перестроек локуса гамма-цепи Т клеточного рецептора с использованием биочипа и апробировать его для определения Т-клеточной клональности при диагностике Т-клеточных лимфом.
3. Разработать биочип для диагностики точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, и определить частоты данных мутаций у пациентов с РМЖ и/или РЯ, жителей европейской части России.
4. Разработать методические подходы для определения генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям на примере биочипа для определения полиморфизма в основных генах системы биотрансформации и биочипа для анализа полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы.
5. Определить частоты аллелей генов системы биотрансформации у здоровых жителей европейской части России и у больных лейкозами и лимфомами заболеваниями. Создать на основе биочипа диагностическую тест-систему.
6. Определить частоты аллелей, приводящих к дефициту ферментной активности TPMT, у жителей европейской части России. Изучить значение полиморфизма гена TPMT при лечении детей, больных лейкозами, препаратами тиопуринового ряда (6-меркаптопурин).
7. Разработать методические походы для генетической идентификации личности по анализу генетического полиморфизма на примере локусов HLA-DQA1, AB0 и AMEL. Определить частоты аллелей генов HLA-DQA1 и AB0, а также идентификационную информативность этих локусов для жителей европейской части России.
Научная новизна результатов.
Разработаны методические подходы для выявления различных изменений в геноме человека (хромосомных перестроек и точечных мутаций) на основе технологии гидрогелевых биочипов. Создан метод диагностики 13 транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием гибридизации на олигонуклеотидном биочипе.
Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом.
Разработан метод определения Т-клеточной клональности на основе гибридизации на биочипе. Показана возможность применения этого подхода в клинической диагностике Т-клеточных лимфом.
Разработан метод диагностики семи наиболее распространенных точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 (185delAG, 300TG, 4153delA и 5382insC в гене BRCA1, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, и 1100delC в гене СНЕК2). Определены частоты этих мутаций у пациентов с РМЖ, РЯ и первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН), жителей европейской части России, что представляет интерес для клинической онкологии.
Разработан биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации. Определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A (4887СА, 4889AG, 6235TC), CYP2D6 (1934GA, 2637delA), GSTT1 (делеция), GSTM (делеция), MTHFR (677CT, 1298AC), MTRR (66AG), NQO1 (609CT), CYP2C (430СT, 1075CT), CYP2C19 (681GA) и NAT2 (341TC, 481СТ, 590GA, 857GA) у взрослых, больных НХЛ или В-ХЛЛ, жителей европейской части России, и проведено сравнение с группой здоровых лиц. Показано, что полиморфные варианты гена CYP1A (4887СА, 4889AG, 6235TC) и «нулевой» GSTM1 генотип чаще встречаются у больных НХЛ и В-ХЛЛ, чем у здоровых индивидов и, таким образом, могут рассматриваться как факторы риска развития этих заболеваний.
Проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQO1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей, больных острыми лейкозами, и здоровых индивидов. Впервые показано, что генотип NAT2 341T/T,481C/C,590G/G, а также сочетание данного генотипа с «нулевым» GSTT генотипом, «нулевым» GSTM1 генотипом и двойным «нулевым» GSTT1/GSTM генотипом встречается чаще у больных лейкозами, чем у здоровых доноров и, таким образом, может рассматриваться, как фактор риска развития лейкозов у детей. Также обнаружено, что генотип MTRR 66G/G встречается реже у девочек, больных острыми лейкозами, по сравнению с группой здоровых доноров женского пола и, таким образом, может рассматриваться как фактор, предотвращающий развитие лейкозов у девочек.
Определены частоты аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQO1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей с первично диагностированным острым лейкозом и в рецидиве заболевания. Показана ассоциация генотипа CYP1A1 *1/*2А и «ненулевого» GSTT1 генотипа с развитием рецидива ОЛЛ. При анализе частот аллелей гена NAT2 впервые обнаружено, что у пациентов с рецидивом ОЛЛ чаще встречается генотип NAT2 341C/-, 481T/-,590G/G,857G/G, тогда как у пациентов с рецидивом ОМЛ – генотип 341T/T,481C/C,590A/- (по сравнению с пациентами с первично диагностированным ОЛЛ и ОМЛ, соответственно).
Разработан ПФ-биочип (NAT2) для анализа полного спектра полиморфных замен в гене NAT2 и впервые у представителей российской популяции проведен детальный анализ полиморфизма гена NAT2.
Впервые на большой выборке определены частоты аллелей и генотипов гена TPMT у детей с онкогематологическими заболеваниями и здоровых доноров в европейской части России. Проведено сравнение этих данных с частотами аллелей и генотипов, полученными для других популяций. Показано, что самым частым аллелем, связанным с дефицитом ферментной активности, является TPMT*3А (85,7% от всех исследованных аллелей), а более редкими аллелями TPMT*3С (9,5%) и TPMT*2 (4,8%).
Это согласуется с ранее полученными данными для популяций Европы и Америки.
Разработан и апробирован биочип для определения полиморфизма в генах ренин ангиотензиновой системы - ПФ-биочип(Кардио).
Разработан биочип для идентификации личности (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать 9 аллелей гена HLA-DQA1, 5 аллей АВ0 и 2 аллеля гена AMEL. Проведено исследование основных параметров информативности локусов HLA-DQA1 и AB0 и показано, что средняя вероятность идентификации личности с помощью ИЛ-биочипа составляет 99,6%.
Практическая значимость работы.
Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора (регистрационное удостоверение № ФС 012б2006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. ЛК-Биочип используется в гематологических клиниках для уточнения диагноза, определения прогноза заболевания и выбора терапии. РМЖ-биочип позволяет быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать мутации в генах BRCA1/2 и CHEK2 и также используется в онкологической практике. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК помогает выбрать эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкологического заболевания. У здоровых носителей это позволяет выбрать тактику проведения клинического мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний.
Диагностическая тест–система ПФ–биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике (регистрационное удостоверение № ФС 012б2006/5317–06 от 28 декабря 2006 г.). ПФ-биочип используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН и в ГУ Научном центре здоровья детей РАМН для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе тиопуринам, а также риска развития некоторых многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта. ПФ-биочип (Кардио), определяющий полиморфизм в генах ренин-ангиотензиновой системы, также используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН для анализа генетической предрасположенности к развитию осложнений при беременности у женщин.
Разработанный ИЛ-биочип позволяет проводить идентификацию биологических следов, содержащих ДНК со средней вероятностью идентификации 99,6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно медицинской практике при экспертизах, позволяющих сузить круг подозреваемых или при опознании тел погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови AB0 (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида, что является важной информацией для следователя при поиске преступника.
Личный вклад автора.
Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.
Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на Российских симпозиумах с международным участием “Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний” (Москва, 2002, 2007, 2008, 2009), 14–й Всемирной конференции по семейным формам РМЖ и РЯ (Мадрид, 2003), Европейских конференциях по генетике человека (Бирмингем, 2003;
Мюнхен, 2004;
Прага, 2005;
Амстердам, 2006;
Ницца, 2007;
Барселона, 2008), 6-ой Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), конференции Европейского совета по медицинской онкологии (Будапешт, 2005), 7-ой Международной конференции молодых онкологов “Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии” (Киев, Украина, 2006), Международной конференции “Генетика в России и мире”, посвященной 40-летию ИОГен РАН (Москва, 2006), 3-ей Международной конференции “Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине” (Новосибирск, 2006), 11-ом Конгрессе педиатров России “Актуальные проблемы педиатрии” (Москва, 2007), Международной конференции по геному человека (Хельсинки, 2006), международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), 10-м Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006), Международном симпозиуме “Advanced Microarray Technologies” (Барселона, 2008). Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН, в ГНЦ РАМН, РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, МНИОИ им. П.А.Герцена.
По теме диссертации, помимо тезисов конференций, опубликовано 33 статьи, одна глава в зарубежном сборнике и два патента. 12 статей опубликованы в зарубежных рецензируемых журналах, 21 – в отечественных реферируемых журналах. Из числа опубликованных статей - 28 (12 зарубежных и 16 в изданиях, выпускаемых в Российской Федерации) напечатаны в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на _365_ страницах машинописного текста, содержит _32таблицы и _43 рисунка. Диссертация содержит разделы “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты и обсуждение”, “Заключение” и “Выводы”. Список литературы включает _351_ источник, из них _60 работ на русском языке, _291 – на иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Пациенты.
Образцы биологического материала представляли собой костный мозг, образцы опухолевой ткани, периферическую кровь или слюну. Весь материал был собран с соблюдением процедуры информированного согласия. В случае использования биологического материала пациентов до 18 лет информированное согласие об участии в исследовании было получено у родителей (опекунов) каждого пациента. При проведении популяционных исследований каждый донор заполнял анкету с указанием своей этнической принадлежности, а также этнической принадлежности родителей, бабушек и дедушек.
Анализ последовательностей, дизайн и синтез праймеров и зондов.
Выбор последовательностей проводили с использованием Интернет-ресурсов NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и Ensembl (www.ensembl.org). Выбор праймеров и зондов проводили с использованием программы Oligo 6 и с учетом следующих положений.
• Выбранные олигонуклеотидные зонды для иммобилизации на биочипе не должны содержать участки, гомологичные другим последовательностям в геноме, чтобы избежать перекрестной гибридизации.
• Олигонуклеотидные зонды не должны содержать высокостабильных вторичных структур типа “шпильки”. Как известно, олигонуклеотиды, образующие внутренние вторичные структуры, могут гибридизоваться со значительно меньшей эффективностью.
• Разброс расчетных температур плавления всех олигонуклеотидов биочипа не должен превышать 2-3оС.
Праймеры и олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Для иммобилизации по 3’-концу олигонуклеотидов вводили спейсер со свободной аминогруппой, используя 3’-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, США).
Изготовление биочипов.
Биочипы были изготовлены методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля (www.biochip.ru).
Для нанесения капель геля на подложку из пластика использовали робот Affymetrix GMS 417 Arrayer (Affymetrix, США). Размер ячеек биочипа после полимеризации составлял 150 мкм.
Зонды наносят на поверхность микрочипа в определенной последовательности, таким образом, микрочип представляет собой упорядоченную матрицу, в которой заранее определен каждый элемент.
А Б 100 мкм 200 мкм Рис. 1. Биочип с трехмерными гелевыми ячейками. A – общий вид;
Б – схематичное изображение, показывающее расположение и размеры ячеек. Гелевые ячейки полусферической формы химически пришиты к твердой поверхности, в каждой ячейке иммобилизованы молекулы зонда одного типа.
Выделение ДНК и РНК.
РНК выделяли из лейкоцитов костного мозга больных лейкозом экстракцией кислым фенолом или с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). ДНК из лейкоцитов периферической крови или костного мозга выделяли с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя или согласно методике, приведенной в руководстве (Sambrook et al., 1989). Для выделения ДНК из образцов слюны использовали набор реагентов для выделения OrageneTM DNA Self-Collection Kit (DNA Genotek, Канада) в соответствии с инструкцией, приложенной к набору.
Обратная транскрипция.
РНК (2 мкг), выделенную из клеток больных лейкозами, инкубировали при 700С в течение 5 мин со смесью праймеров, специфичных к анализируемым транслокациям и гену тирозинкиназы ABL, постоянно экспрессирующегося во всех клетках. Обратную транскрипцию проводили с использованием фермента обратной транскриптазы MMLV.
Полученную кДНК использовали как матрицу в мультиплексной ПЦР, проходящей с участием нескольких пар праймеров в одной пробирке.
Проведение полимеразной цепной реакции.
Использовали вариант «гнездной» ПЦР в два этапа. В ПЦР-смесь стандартного состава (Силекс, Россия) добавляли праймеры, специфичные к исследуемым генам в количестве 10-25 пкмоль на одну пробирку. Всю смесь нагревали при 940С в течение мин, затем проводили 20-40 циклов амплификации по следующей схеме: 940С, 30 с;
600С, 30 с;
720С, 1 мин. В 25 мкл ПЦР-смеси второго этапа вносили 1-2 мкл продукта первого этапа ПЦР. Состав ПЦР-смеси и условия ПЦР были те же, с той разницей, что на втором этапе один из праймеров в каждой паре присутствовал в меньшей концентрации, так, чтобы реакция проходила асимметрично.
Флуоресцентное мечение ПЦР-продукта.
Флуоресцентное мечение проводили на втором этапе ПЦР двумя способами. В первом случае использовали праймер, содержащий на 5’-конце краситель пентаметинового ряда (Cy-5). При этом праймер, содержащий флуоресцентную метку, добавляли в ПЦР-смесь в более высокой концентрации (5-20 раз), чем немеченый праймер, таким образом, чтобы преимущественно нарабатывалась одна меченая цепь.
При другом подходе оба праймера на втором этапе были немечеными, но концентрация одного из них была в 5-20 раз больше, так чтобы нарабатывалась преимущественно одна цепь ДНК, при этом флуоресцентную метку содержал один из дезоксинуклеотидтрифосфатов, встраивающихся в de novo синтезируемую ДНК-цепь, а именно, Cy5-дУТФ.
Гибридизация на биочипе.
Для гибридизации меченого продукта на биочипе использовали смесь с общим объемом 30-35 мкл, которая состояла из 6хSSPE (Promega, США), 10-25% формамида (Sigma, США) и флуоресцентно меченного амплификата.
A N N NNNNNNN NNNNNNN NNNNNNNN A NNNNNNNN NNNNNNNN G NNNNNNNN NNNNNNNN T NNNNNNNN Рис. 2. Схема аллель-специфичной гибридизации на биочипе. В процессе гибридизации происходит специфическое взаимодействие молекул-зондов и молекулы мишени по принципу комплементарности. Для того, чтобы выявить возникающие в ходе гибридизации стабильные структуры и определить, с каким зондом произошло взаимодействие, молекулы-мишени предварительно метят флуоресцентным красителем.
Таким образом, картина гибридизации представляет собой картину распределения флуоресцентных сигналов, наиболее ярких в точках специфического связывания зонда и мишени.
Гибридизационную смесь полностью денатурировали в течение 5 минут при 950С, быстро охлаждали во льду, наносили на биочип под крышку гибридизационной камеры и инкубировали в течение 10-12 часов при 370С. Использовали также гибридизационную смесь, содержащую 1,0-1,5 М раствор гуанидин-изотиоцианата.
Схема аллель-специфичной гибридизации в ячейках биочипа приведена на рис. 2.
После завершения инкубации гибридизационную смесь удаляли. Биочип отмывали в 1хSSPE буфере (Promega, CША) в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого поверхность биочипа высушивали сжатым воздухом и проводили регистрацию флуоресцентных сигналов.
Анализ изображения.
Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного прибором с зарядовой связью (ПЗС) и программным обеспечением Imageware (ИМБ РАН, Россия). На изображение биочипа накладывали сетку из окружностей, соответствующих размеру ячеек. В качестве исходных данных использовали нормированные сигналы флуоресценции Jm = (Im – I0)/(Bm – I0), где Im – интенсивность сигнала на единицу площади внутри соответствующей ячейки, Bm – интенсивность сигнала на единицу площади вне ячеек, отражающая распределение освещенности микрочипа, I0 – темновой ток ПЗС матрицы, а m – номер ячейки чипа. Алгоритм дальнейшей обработки сигналов зависел от конкретной исследовательской задачи.
Секвенирование.
Прямое секвенирование проводили на базе Центра коллективного пользования «Геном» ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).
Статистический анализ данных.
Для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга использовали стандартный метод 2 (Вейр, 1995). При сравнении частот аллелей и генотипов и оценке связи аллелей генов с риском развития лимфом и лейкозов использовали двусторонний точный тест Фишера (программа GraphPad InStat).
Оценку относительного риска развития заболевания при определенном генотипе в ретроспективных исследованиях случай-контроль (OR - odds ratio, отношение шансов) рассчитывали по формуле: OR = a/b деленное на c/d, где a = n1, b = N – n1, с = n2, d = N2 - n2;
N1 и N2- численность выборки, n1 и n2 - числа особей с изучаемым признаком в этих двух выборках. В приведенных в данной работе расчетах значение OR указано с 95%-ным доверительным интервалом. Критический уровень значимости для отвержения нулевой гипотезы принимали равным 0,05. Бессобытийную выживаемость у больных лейкозом рассчитывали с момента начала исследования до возникновения события, которыми считались рецидив, смерть, потеря из-под наблюдения в соответствии с методом Kaplan-Meier.
Характеристика диагностического метода.
Для характеристики разработанных методических подходов использовали следующие понятия: аналитическая чувствительность метода (минимальное количество биологического материала, необходимое для проведения теста), точность метода (доля правильных результатов теста, в сумме истинно положительных и истинно отрицательных результатов теста, в общем количестве результатов теста), специфичность метода (доля истинно отрицательных результатов, выявленных в данном тесте, среди всех отрицательных результатов теста) и чувствительность метода (доля истинно положительных результатов, выявленных в данном тесте, среди всех положительных результатов теста) (Реброва, 2006).
II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ НА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОМ БИОЧИПЕ.
Специфические хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных или слившихся генов, являются независимыми диагностическими и прогностическими маркерами при лейкозах, которые используют для определения прогноза и выбора стратегии лечения. Хромосомные аберрации встречаются примерно в 40-50% случаев острых нелимфобластных лейкозов (ОНЛЛ) и 30-40% случаев острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). При анализе хромосомных аберраций традиционно используют цитогенетический метод, однако он трудоемок и не всегда надежен. Также распространен метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), однако он является достаточно дорогим и неудобен при анализе нескольких транслокаций одновременно. В методе обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с праймерами на отдельные транслокации мишенью является химерная мРНК, экспрессирующаяся в опухолевых клетках, несущих транслокации. Метод ОТ-ПЦР более чувствителен, чем микроскопические методы определения аберраций, однако при одновременном анализе на наличие нескольких перестроек является затратным по времени и по количеству анализируемого материала. Для быстрой и эффективной диагностики лейкозов разработан подход, основанный на гибридизации на биологическом микрочипе, позволяющий анализировать большое количество химерных транскриптов одновременно. Основой анализа является комбинированный подход, включающий обратную транскрипцию РНК пациента с последующей мультиплексной амплификацией продуктов химерных генов и гибридизацию амплифицированных фрагментов на биочипе.
1.1 Выбор транслокаций для анализа на биочипе.
При выборе хромосомных перестроек для включения в анализ на биочипе учитывали данные о частоте встречаемости этих перестроек у больных лейкозом детей, а также их клиническое значение. Так при ОЛЛ были выбраны хромосомные транслокации t(12;
21)TEL/AML1, t(9;
22)p190BCR/ABL, t(1;
19)E2A/PBX1;
при ОНЛЛ t(8;
21)AML1/ETO, t(15;
17)PML/RARA и инверсия inv(16)CBFB/MYH11. Также были включены наиболее часто встречающиеся транслокации с участием гена MLL: t(4;
11) MLL/AF4, t(9;
11) MLL/AF9, t(11;
19) MLL/ENL, t(11;
19) MLL/ELL, t(6;
11) MLL/AF6, t(10;
11) MLL/AF10. Транслокации с участием гена MLL встречаются у детей до года в 70-80% случаев ОЛЛ и 50-60% случаев ОНЛЛ и являются важным фактором прогноза и выбора терапии. При хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ) патогномоничным признаком является наличие транслокации t(9;
22)p210BCR/ABL.
Поскольку места разрыва в генах при образовании транслокаций могут происходить в разных точках, одна и та же транслокация может давать начало нескольким вариантам химерных транскриптов. Наиболее ярким примером является транслокация t(9;
22)BCR/ABL, когда разные варианты транскриптов определяют разные формы заболевания (рис. 3).
Был проведен скрининг более 500 образцов РНК, выделенной из костного мозга пациентов, больных лейкозом, методом ОТ-ПЦР по протоколу, разработанному Палисгардом и др. (Pallisgaard et al, 1998) и создана коллекция контрольных образцов, несущих какую-либо из перечисленных выше транслокаций. Коллекция контрольных образцов была использована при разработке и тестировании биочипов.
Химерный ген BCR/ABL e19 a e1 e13e Ген BCR, хромосома 22 ген ABL, хромосома РНК e19-a2, белок p230 BCR/ABL РНК e14-a2, белок p210 BCR/ABL b2 а РНК e13-a2, белок p210 BCR/ABL b3 а РНК e1a2, белок p190 BCR/ABL а e Рис. 3. Схематичное изображение транслокации t(9;
22)BCR/ABL. Вариант e1a приводит к образованию химерного белка BCR/ABL тирозин-киназы p190 (м.в.190 кД), который характерен для ОЛЛ;
варианты e13a2 (b3a2) и e14a2 (b2a2) приводят к появлению белка p210, характерного для ХМЛ;
вариант e19a2 дает белковый продукт p230. Стрелками схематично показано расположение праймеров, участвующих в ПЦР, отрезками – расположение олигонуклеотидных зондов.
1.2 Выбор последовательностей праймеров для мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидных зондов. Конструирование и принцип работы ЛК-биочипа.
При подборе последовательностей праймеров и олигонуклеотидных зондов для анализа транслокаций исходили из следующих положений:
• Для каждого варианта химерного транскрипта один праймер должен располагаться внутри одного гена, участвующего в образовании транслокации, другой праймер – внутри второго гена так, чтобы продукт амплификации мог образовываться только при наличии транслокации.
• Праймеры должны обладать высокой специфичностью по отношению к данному химерному транскрипту и давать ПЦР продукт 2-го этапа длиной 150-300 п.о.
(для быстрой диффузии в гель).
Для каждой транслокации были подобраны несколько олигонуклеотидных зондов: один зонд находился внутри одного из генов и являлся общим для всех вариантов химерного транскрипта с участием этого гена, другие зонды были специфичны к последовательностям в месте слияния генов. Таким образом, с помощью набора зондов можно определить транслокацию и вариант химерного транскрипта.
Несколько другой принцип использован при подборе зондов для анализа MLL транслокаций. Как правило, в образовании транслокации участвует 5’-конец гена MLL и 3’-конец одного из так называемых генов партнеров. В большинстве случаев ген MLL в процессе транслокации претерпевает разрыв в 4 интронах - между 8 и 9 экзонами, между 9 и 10 экзонами, между 10 и 11 экзонами и между 11 и 12 экзонами (рис.4). То есть мРНК с MLL-транслокацией представляет собой участок мРНК гена MLL, обрывающийся после 8-11 экзонов, к которому примыкает участок мРНК гена партнера, продолжая транскрипционную единицу. Так как многие гены партнеры имеют также несколько участков, по которым происходят перестройки (от 2 до 4), то возможно около 50 возможных комбинаций MLL - ген-партнер. Поэтому для анализа MLL-транслокаций мы использовали зонды, расположенные в экзонах генов, участвующих в транслокациях.
BCR 1 c1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рис. 4. Схематичное изображение гена MLL. При образовании транслокации разрывы происходят в районе BCR (breakpoint region) в интронах между 8 и 12 экзонами.
Отрезками обозначены олигонуклеотидные зонды.
Схема биочипа для анализа 13 хромосомных перестроек представлена на рис. 5.
t(9;
22) t(9;
22) t(8;
21) t(8;
21) ABL ABL BCR/ABL BCR/ABL AML1/ETO AML1/ETO b3a2 b3a t(9;
22) t(9;
22) t(8;
21) t(8;
21) inv16 inv16 t(1;
19) t(1;
19) BCR/ABL BCR/ABL ETO ETO CBFB/MYH CBFB/MYH E2A/PBX1 E2A/PBX b2a2 b2a t(15;
17) t(15;
17) t(9;
22) t(9;
22) inv16 inv16 t(1;
19) t(1;
19) PML/RARA PML/RARA BCR/ABL BCR/ABL CBFB/MYH CBFB/MYH PBX1 PBX Bcr3 Bcr3 e1a2 e1a t(15;
17) t(15;
17) t(12;
21) t(12;
21) inv16 inv16 t(9;
22) t(9;
22) PML/RARA PML/RARA TEL/AML1 TEL/AML CBFB/MYH CBFB/MYH ABL ABL Bcr1 Bcr1 J2 J t(12;
21) t(12;
21) t(15;
17) t(15;
17) inv16 inv16 AF 10_3 AF 10_ TEL/AML1 TEL/AML RARA RARA CBFB CBFB exon exon J1 J AF 6 AF 6 ENL ENL t(12;
21) t(12;
21) AF 10_2 AF 10_ exon exon exon exon TEL TEL exon exon AF 4_2 AF 4_2 ELL 2 ELL 2 AF 9_2 AF 9_2 AF 10_2 AF 10_ exon 4 exon 4 exon 2 exon 2 exon exon exon exon AF 4_1 AF 4_1 ELL 1 ELL 1 AF 9_1 AF 9_1 AF 10_1 AF 10_ exon 5 exon 5 exon 3 exon 3 exon exon exon exon MLL MLL MLL MLL MLL MLL MLL exon MLL exon exon 8 exon 8 exon 9 exon 9 exon 10 exon 10 11 М М Рис. 5. Схема расположения олигонуклеотидных зондов на ЛК-Биочипе. Каждая ячейка продублирована. М – ячейка, маркированная флуоресцентным красителем.
1.3 Разработка процедуры анализа транслокаций.
Метод выявления транслокаций при помощи олигонуклеотидных биочипов включает следующие этапы: выделение РНК из лейкоцитов костного мозга или периферической крови;
обратную транскрипцию с праймерами длиной 12- нуклеотидных оснований, специфичных к генам, вовлеченным в транслокации;
двухэтапную мультиплексную ПЦР;
введение флуоресцентной метки в виде Cy5-dUTP на втором этапе ПЦР;
гибридизацию на олигонуклеотидном биочипе и анализ изображения.
Примеры гибридизационных картин представлены на рис. 6. В верхнем ряду биочипа расположены зонды, комплементарные участкам гена ABL, экспрессирующегося во всех клетках. Ген ABL служит положительным контролем выделения РНК и прохождения обратной транскрипции.
А Б В Рис. 6. Примеры гибридизационных картин: А - образец, не содержащий транслокаций, светятся только ячейки с зондами к гену ABL;
Б - образец с транслокацией t(8;
21)AML/ETO;
В - образец с транслокацией t(6;
11)MLL/AF6.
Методом последовательных разведений определена аналитическая чувствительность метода, она составила 1 клетку, несущую транслокацию, на нормальных клеток. При тестировании ЛК-биочипа на контрольных образцах точность метода составила не менее 95%.
1.4 Скрининг клинических образцов и определение частоты встречаемости отдельных транслокаций у больных лейкозом детей.
Образцы костного мозга или периферической крови были получены от пациентов в возрасте от 0 до 18 лет, проходивших лечение в онкогематологических отделениях Российской детской клинической больницы (РДКБ) Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (Москва), Морозовской городской детской клинической больницы (Москва), Московского областного онкологического диспансера (Балашиха) и других городских и областных больниц в период с 2000 по 2008 год. Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов. Всего в исследование было включено детей, жителей различных регионов России (рис. 7).
ОЛЛ ОНЛЛ t(4;
11) t(1;
19) t(6;
11) t(11;
19)ELL (2.4%) t(9;
11) (2%) (1,2%) 2.4% t(9;
22)p190 11q23 (10.5%) t(10;
11) (4.6%) (1.2%) (1,2%) Inv (16) t(12;
21) (4%) 12.8% t(15;
17) (8%) t(8;
21) Транслокации не (9.5%) обнаружены (75.6%) Транслокации не обнаружены (63.6%) 900 пациентов с ОЛЛ (24.4%) 300 пациентов с ОНЛЛ (36.4%) Рис. 7. Частоты встречаемости транслокаций при ОЛЛ и ОНЛЛ у детей.
Как видно из диаграммы на рис.7 при ОЛЛ анализируемые хромосомные перестройки встречаются у 24,4 % пациентов. При ОНЛЛ – у 36,4%. Наиболее частой транслокацией при ОЛЛ является t(12;
21)TEL/AML (12,8%). При ОНЛЛ наиболее частыми являются транслокации t(8;
21)AML/ETO (9,5%), t(15;
17)PML/RARA (8,0%) и t(9;
11)MLL/AF9 (10,5%). Все случаи обнаружения химерного транскрипта с использованием биочипов были независимо подтверждены методом ОТ-ПЦР с индивидуальными праймерами. Полученные нами данные по частоте встречаемости транслокаций у детей, больных лейкозом, в РФ близки к литературным данным по другим странам.
Было исследовано клиническое значение транслокаций при ОЛЛ. Результаты терапии в группе пациентов с наличием t(12;
21)TEL/AML1 оказались значительно выше, чем в группе детей без транслокаций (бессобытийная выживаемость 91,3% у пациентов с t(12;
21) против 82% у пациентов без транслокаций). В то время, как у детей с t(4;
11)MLL/AF4 или t(9;
22)BCR/ABL эффективность терапии оказалась достоверно ниже, чем в группе сравнения, бессобытийная выживаемость составила 57% против 83%.
Полученные нами результаты полностью подтверждают данные других исследователей и свидетельствуют о крайне неблагоприятном прогнозе этих транслокаций при ОЛЛ (Исаева и др., 2004).
Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике. В настоящее время тест-система ЛК-Биочип используется для анализа клинических образцов из РДКБ (Москва) и региональных гематологических центров РФ.
Резюме. Разработан метод выявления и идентификации хромосомных аберраций при лейкозах. Мишенью для анализа является мРНК в лейкемических клетках. После выделения РНК и постановки обратной транскрипции, проводят двухэтапную ПЦР и гибридизацию на олигонуклеотидном биочипе. На основе этого подхода создана и сертифицирована для применения в клинике диагностистическая тест-система ЛК Биочип. Метод апробирован на клинических образцах 1200 пациентов. Хромосомные транслокации обнаружены у 24,4% пациентов с ОЛЛ, 36,4% пациентов с ОНЛЛ. В настоящее время этот подход используется для определения транслокаций при лейкозах в гематологических отделениях РДКБ и других детских больниц. Точность метода составила не менее 95%.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Т-КЛЕТОЧНОЙ КЛОНАЛЬНОСТИ МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ НА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОМ БИОЧИПЕ.
Т-клеточные лимфомы встречаются в 15-20 % случаев всех лимфоидных опухолей. Диагностика Т-клеточных опухолей традиционно основывалась на сочетании клинических данных, гистологического анализа и иммунофенотипирования. Однако, во многих случаях для постановки точного диагноза необходимо определение Т-клеточной клональности молекулярными методами. В основе этих методов лежит анализ перестроенных локусов Т-клеточных рецепторов в популяции Т-лимфоцитов (рис. 8).
V-J перестройка Сплайсинг, мРНК транскрипция Белок Трансляция Рис. 8. Схема перестройки локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора в результате сайт-специфической рекомбинации при созревании Т-лимфоцитов.
Т-клеточная клональность традиционно оценивается с помощью двух методов – Саузерн-блот гибридизации и полимеразной цепной реакции с последующим анализом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (PCR-SSCP).
Обнаружение моноклональности методом Саузерн-блот гибридизации не нашло широкого применения в клинической практике, так как данный метод требует больших временных затрат, большого количества ДНК, и обычно включает в себя использование радиоизотопов. Метод PCR-SSCP является более простым, дешевым и быстрым, не требует работы с радиоактивными веществами. Однако данный анализ требует проведения электрофореза высокого разрешения, что является достаточно трудоемким.
Также может быть использован метод ПЦР в реальном времени (Yang, 2005), но этот подход не получил широкого распространения. Нами предложен новый метод на основе мультиплексной ПЦР и гибридизации на олигонуклеотидном биочипе для анализа перестроенных фрагментов локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора (TCR). В данном случае с помощью биочипа можно анализировать все возможные комбинации V и J-генов, возникающие в ходе перестройки.
В работе использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови, а также измельченной свежей или замороженной ткани лимфатических узлов. Процедура анализа включала выделение ДНК, двухэтапную мультиплексную ПЦР, введение метки на втором этапе ПЦР с помощью флуоресцентно меченого праймера, гибридизацию на биочипе. На обоих этапах ПЦР проводили по циклов так, чтобы реакция не выходила на плато. Это позволило проводить анализ соотношения различных вариантов перестроенных генов в популяции Т-лимфоцитов, что необходимо для отличия поликлональности от моноклональности.
А TCR- гены Б TCR- гены Рис. 9. Определение Т-клеточной клональности на биочипе. А - поликлональный образец, Б - образец больного Т-клеточной лимфомой, несущий биаллельную перестройку V8-J1/2 и V11-J1/2.
При анализе изображения использован следующий алгоритм. Из массива нормированных сигналов флуоресценции {Jm} исключали N сигналов с максимальными значениями, где N выбиралось равным максимальному числу перфектных дуплексов при наличии моноклональной перестройки TCR в изучаемом образце. Оставшиеся (после удаления выбросов) сигналы Jm использовали для вычисления значений среднего фонового сигнала J, его дисперсии и порогового значения для сигналов ПЗ = J + 4. Далее считали, что сигналы Jm, значения которых превышают порог ПЗ, соответствуют перфектным дуплексам. По найденным таким образом числу и положениям перфектных дуплексов определяли наличие и конкретный тип перестройки TCR. В качестве референс-метода использовали метод PCR-SSCP.
Биочип содержит олигонуклеотидные зонды на все V и J-сегменты, участвующие в перестройках -цепи Т-клеточного рецептора (рис.9). Метод выявляет только перестроенные -цепи;
в не перестроенной -цепи V и J-сегменты удалены друг от друга на значительное расстояние, что делает амплификацию невозможной. В поликлональной популяции Т-лимфоцитов различные комбинации V-J встречаются с приблизительно равной частотой, соответственно амплифицированные фрагменты, представляющие различные комбинации, нарабатываются с одинаковой эффективностью. В результате флуоресцентные сигналы в ячейках биочипа, содержащих зонды на разные V- и J сегменты, имеют приблизительно одинаковую интенсивность (рис. 9, А). Все они не превышают выбранного порогового значения, равного J + 4.
При преобладании в образце клеток, несущих в результате перестройки определенную V-J комбинацию, с первых циклов ПЦР начинают нарабатываться однотипные фрагменты ДНК. Таким образом, амплифицированный продукт преимущественно представлен данной комбинацией V-J сегментов, далее этот продукт специфично гибридизуется с соответствующими зондами на биочипе (рис.9, Б). Это приводит к появлению сигналов, превышающих выбранное пороговое значение интенсивности флуоресценции. В данном случае можно говорить о преобладании в образце клона Т-лимфоцитов, содержащих биаллельную перестройку: V8-J1/2 в одной хромосоме и V11-J1/2 в другой хромосоме.
Метод был апробирован на 49 образцах больных лимфомой и 47 образцах здоровых доноров. Результаты анализа на биочипе полностью совпали с результатами, полученными PCR-SSCP методом, таким образом, точность метода с использованием биочипов относительно PCR-SSCP метода составила 100%. Аналитическая чувствительность метода определена при последовательных разведениях ДНК опухолевого клона (клеточная линия Jurkat) в ДНК поликлонального образца.
Выявление соответствующей перестройки и определение образца как моноклонального оказалось возможным при концентрации опухолевых клеток 5-10%. Ранее показано, что чувствительность PCR-SSCP метода составляет 88%, а специфичность – 92% (Сидорова, 2004). В целом, по литературным данным частота выявления Т-клеточной клональности при доказанных опухолях составляет в зависимости от метода 66-96% (Cozzio and French, 2008).
Также нами определены частоты, с которыми различные V и J гены вступают в клональные перестройки TCR- локуса. Наиболее часто в перестройки вовлечены V гены семейства 1, а именно, V1-8 (62%), реже всего в перестройках участвует V11 (3, %). Из J генов наиболее часто в перестройки вовлекаются гены J1 и J2 (наш метод их не различает), частота случаев составляет 81,6% от всех случаев перестроек с участием J генов. Этот факт находит отражение при анализе поликлональных образцов, в большинстве случаев сигнал от J1/2 зонда заметно превышает сигналы от Jp1, Jp и Jp зондов (рис.9, А) Резюме. Разработан метод определения Т-клеточной клональности по анализу перестроек V и J генов локуса Т-клеточного рецептора с помощью ТКЛ-биочипа. В поликлональной популяции Т-лимфоцитов различные комбинации V-J встречаются с приблизительно равной частотой. При преобладании в образце клеток, несущих в результате перестройки определенную V-J комбинацию, с первых циклов ПЦР начинают нарабатываться однотипные фрагменты ДНК, что и выявляется в результате гибридизации на биочипе. Метод позволяет осуществлять дифференциальную диагностику реактивной и опухолевой Т-клеточной пролиферации при наличии 5-10% опухолевых клеток в образце. Чувствительность и специфичность метода составляют около 90%.
3. АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ BRCA1, BRCA2 И CHEK2, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ФОРМОЙ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РАКА ЯИЧНИКОВ.
Наследственные мутации генов BRCA1 и BRCA2 обусловливают от 56 до 80% риска развития рака молочной железы (РМЖ) на протяжении всей жизни (в возрасте до 70 лет), а также от 10 до 30 % риска развития рака яичников (РЯ). На данный момент описано свыше 1400 различных наследственных мутаций гена BRCA1 и 1200 мутаций в гене BRCA2. Для каждой популяции имеется свой спектр и частота мутаций BRCA1/ генов (Breast Cancer Information Core – BIC date base online. http://www.nhgri.nih.gov).
Существуют мутации, свойственные только определенным этническим группам. В частности, в популяции евреев Ашкенази найдены две преобладающие мутации в гене BRCA1 - 185delAG и 5382insC, и мутация 6174delT в гене BRCA2, встречающиеся с суммарной частотой примерно 2,6% в общей популяции (Roa et al., 1996). Основываясь на данных о спектре мутаций BRCA1/2 и СHEK2 генов в популяциях сопредельных и этнически близких стран (Латвии, Литвы, Польши, Белоруссии), а также исследований, проведенных в России, были выбраны семь наиболее частых мутаций в данных генах (185delAG, 300TG, 4153delA, и 5382insC в гене BRCA1, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, 1100delC в гене СНЕК2) и полиморфизм 4158AG в гене BRCA1 для дальнейшего их анализа на биочипе. Известно, что эти мутации (за исключением полиморфизма 4158AG) приводят к частичной или полной потере активности белковых продуктов данных генов, участвующих, прежде всего, в процессах репарации ДНК.
Потеря белками их функций приводит к нарушениям внутриклеточных процессов и, как следствие, к возникновению опухоли.
3.1. Разработка РМЖ-биочипа для анализа мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 и процедуры генотипирования.
Для каждой нуклеотидной позиции, в которой может произойти одна из выбранных нами мутаций, подобрана пара дискиминирующих олигонуклеотидных зондов: один зонд представляет собой участок последовательности дикого типа длиной от 15 до 20 н.о., другой – соответствующую мутантную последовательность. Ячейки на биочипе дублированы для повышения надежности процедуры анализа изображения. В двух верхних рядах биочипа размещены зонды, соответствующие последовательностям дикого типа, в двух нижних – мутантным последовательностям. Анализируемый нуклеотид (несколько нуклеотидов) расположен в центральной части олигонуклеотидного зонда. Примеры последовательностей олигонуклеотидных зондов для определения мутации 5382insC приведены в таблице 1.
AGA GAA TCC CAG GAC AGA A WT 5382insC GAG AAT CCC CAG GAC AGA MUT Табл.1. Пара олигонуклеотидных зондов для определения мутации 5382insC.
Анализ на биочипе включал следующие этапы: выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови или клеток буккального эпителия, содержащихся в образцах слюны;
проведение двухэтапной ПЦР;
введение флуоресцентной метки в продукт ПЦР второго этапа с помощью флуоресцентно меченого праймера;
гибридизация меченого продукта ПЦР на биочипе;
анализ изображения. Схема биочипа и гибридизационные картины представлены на рис. А 1 2 3 4 5 6 7 185AG 300T 4153A 4158A 5382 695A 6174T 1100C 185AG 300T 4153A 4158A 5382 695A 6174T 1100C 185delAG 300G 4153delA 4158G 5382insC 695insT 6174delT 1100delC 185delAG 300G 153delA 4158G 5382insC 695insT 6174delT 1100delC Б Интенсивность флуоресценции, отн.
"дикий" тип 1, 1,20 мутация 1, 1 2 3 4 5 678 1, 0, 0, 0, 0, 0, ед.
0, 0, 0, 0, 0, G T lA lT lC G sC AG ns A de de de in 0T el 5i 5d В Интенсивность флуоресценции, отн.
"дикий" тип 1, 1,20 мутация 1, 1 23 4 5 6 7 8 1, 0, 0, 0, 0, 0, ед.
0, 0, 0, 0, 0, T lT lA lC G nsC ins G G T 3de de 0de lA 8A 82i de 9 5 1 00 5 5 5 3 41 41 53 18 Рис. 10. А - схема РМЖ-биочипа для анализа мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK (ячейки серого цвета соответствуют последовательностям дикого типа;
ячейки белого цвета - мутантным последовательностям). Примеры гибридизационных картин (слева), полученных для образца ДНК, не содержащего исследуемых мутаций (Б), и несущего мутацию 5382insC в гене BRCA1 (В), а также диаграммы значений нормированных интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа (справа).
Для определения точности метода с помощью РМЖ-биочипа было протестировано 37 контрольных образцов ДНК с известным генотипом, предоставленных Биомедицинским центром Латвийского университета (Рига).
Результаты гибридизации на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами (SSCP и прямое секвенирование). Контрольных образцов с мутациями в гене BRCA2 не было в наличии, однако при тестировании пациентов эти варианты мутаций были обнаружены с помощью анализа на РМЖ–биочипе.
Полученные нами данные были подтверждены секвенированием. Таким образом, точность метода при тестировании контрольных образцов составила 100%.
Аналитическая чувствительность была определена методом последовательных разведений. Показано, что минимальное количество ДНК, необходимое для однозначной идентификации мутаций, составляет около 500 пкг, что соответствует 100-150 геном эквивалентам.
3.2 Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 в группах больных.
Пациенты с онкологическими заболеваниями (с диагнозом РМЖ, РЯ, ПМЗН) для исследования на наличие мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 были отобраны в период с 2004 по 2006 гг. в Российском онкологическом научном центре РАМН им. Н.Н.
Блохина (Москва). Диагноз устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов. Выборка была смешанной по возрасту и семейной истории заболевания.
Частота мутации (%) РМЖ (n=385) 20 РЯ (n=68) ПМЗН (n=33) 185delAG 300TG 4153delA 4158AG 5382insC 695insT 6174delT 1100delC BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA2 BRCA2 CHEK 0,3 0,3 0,6 1,3 3,4 0,3 0,3 1. РМЖ 1,5 0 0 0 10,3 0 0 РЯ 3 9,1 3 0 18,2 0 0 6, ПМЗН Рис. 11. Частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН (с поражениями МЖ и яичников).
В соответствии в диагнозом и клиническими особенностями пациенты были разделены на три группы. В первую группу входили женщины с диагнозом РМЖ (n=385, диапазон возраста от 23 до 85 лет, средний возраст – 53 года), во вторую - женщины с диагнозом РЯ (n=68, диапазон возраста от 31 до 76 лет, средний возраст – 55 лет). Третья группа состояла из женщин с диагнозом ПМЗН с поражением МЖ и яичников (n=33, диапазон возраста от 27 до 79 лет, средний возраст – 50 лет). Все пациенты были жителями европейской части России.
Из 385 пациентов с диагнозом РМЖ у 17 пациентов (4,4%) были обнаружены мутации в гене BRCA1, у пяти пациентов (1,3%) – полиморфизм 4158AG, у двух пациентов (0,5%) – мутации в гене BRCA2 и у пяти пациентов (1,3%) был обнаружен вариант 1100delC в гене CHEK2. Из 68 больных РЯ у восьми (11,8%) были обнаружены мутации в гене BRCA1;
исследуемых мутаций в гене BRCA2 и варианта 1100delC в гене CHEK2 обнаружено не было. В группе пациентов с диагнозом ПМЗН у 11 пациентов (33,3%) были обнаружены мутации в гене BRCA1, и у двух пациентов (6,1%) была обнаружена мутация 1100delC в гене CHEK2;
исследуемых мутаций в гене BRCA найдено не было. Частоты каждой конкретной мутации в трех группах пациентов показаны на рис. 11.
Наибольшая частота четырех исследуемых мутаций в гене BRCA1 (185delAG, 300TG, 4153delA, и 5382insC) найдена у больных ПМЗН с поражением МЖ и яичников. Из 11 пациентов–носителей мутаций в гене BRCA1 у восьми (72,7%) был сочетанный РМЖ и РЯ. Это позволяет сделать вывод о том, что одновременное поражение МЖ и яичников может служить маркером наличия у пациента мутаций в гене BRCA1 и, следовательно, наследственной формы злокачественных новообразований.
Россия n=385* Россия (Sokolenko et al., 2007) n=857** n= n=2012 Польша (Gorski et al., 2005) n= Ашкенази (Warner et al., 1999) n= n= n=500 Венгрия (van der Looij et al., 2000) n= n=800 Германия (Backe et al., 1999) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 (%) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4, Рис.12. Частота мутации 5382insC в гене BRCA1 у больных РМЖ и здоровых лиц в различных странах. Обозначения: (*) – настоящее исследование, (**) – выборка больных с билатеральным РМЖ, серый цвет – выборка больных РМЖ, черный цвет – популяционная выборка, n – число пациентов в выборке).
Полиморфизм 4158AG в гене BRCA1 был обнаружен при изучении больных с диагнозом РМЖ и РЯ в Латвии (Tichomirova et al., 2005). В нашем исследовании этот полиморфизм был обнаружен только в выборке пациентов с диагнозом РМЖ у пяти человек (1,3%). У всех этих пациентов отсутствовала семейная история заболевания РМЖ. Таким образом, данных в пользу ассоциации полиморфизма 4158AG с наследственными формами РМЖ и РЯ получено не было, хотя для окончательного ответа требуется широкомасштабное исследование популяции здоровых доноров.
Наиболее часто встречающейся мутацией в гене BRCA1 во всех трех группах пациентов была мутация 5382insC (в группах пациентов с РМЖ, РЯ и ПМЗН ее доля от всех остальных изучаемых нами мутаций в гене BRCA1 составила 56, 87 и 55%, соответственно). На рис. 12 показаны частоты данной мутации в России и в других странах у больных РМЖ (смешанные по возрасту и семейной истории заболевания выборки) в сравнении с общими популяционными выборками. Показательно, что в России данная мутация встречается чаще, чем в других популяциях, при этом ее частота в общей популяции жителей России, по–видимому, крайне низка. В частности, в недавно проведенном исследовании (Sokolenko et al., 2006) ее частота была равна нулю, в отличие от значений частот в других популяциях (от 0,15 до 0,35%). Исходя из того, что мутация 5382insC в гене BRCA1 является мажорной во всех трех группах пациентов, она в первую очередь должна быть включена в список мутаций для генетического тестирования. Следует отметить, что наиболее широкий спектр мутаций выявлен у пациентов с РМЖ. Так, все мутации, представленные на биочипе, хотя бы по одному разу были обнаружены у пациентов с РМЖ. Более узкий спектр мутаций при РЯ может отражать специфику заболевания, но также быть связанным с меньшим размером выборки.
Отдельно следует сказать о мутации 1100delC в гене CHEK2. Ген CHEK относится к низко пенетрантным генам (у носителей данной мутации риск возникновения РМЖ в два раза выше) (Meijers-Heijboer et al., 2002). В нашем исследовании эта мутация была обнаружена у пяти пациентов (1б,3%) с диагнозом РМЖ. В другом исследовании российских ученых ее частота в смешанной выборке пациентов с диагнозом РМЖ примерно в 2 раза превышала найденную нами (2,1%) (Chekmareva et al., 2006). В группе больных РЯ эта мутация нами не обнаружен.
3.3 Клиническое значение мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2.
Проведено сравнение среднего возраста начала заболевания у пациентов– носителей мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2, и пациентов, у которых исследуемые мутации не были обнаружены (табл.2). Статистически значимые расхождения в среднем возрасте для пациентов без мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 и пациентов–носителей мутаций были найдены для больных РМЖ и ПМЗН (р= 0,0006 и 0,0003, соответственно).
У большинства больных РМЖ и ПМЗН носителей мутаций в гене BRCA заболевание возникло в возрасте до 40 лет включительно (53% и 64% соответственно).
Это согласуется с данными других исследований, где показано, что ранний возраст манифестации заболевания является характерным признаком его наследственной формы (Nomizu et al., 1997).
Средний возраст, лет Пациенты РМЖ РЯ ПМЗН Носители мутаций 44,9±13,2 48,3±10,0 41,6±4, Без мутаций 53,7±11,8 56,1±10,9 55,1±12, p 0, 0,0006 0, Табл. 2. Сравнение среднего возраста пациентов–носителей мутаций и пациентов, у которых исследуемые мутации обнаружены не были.
Среди 38 пациентов–носителей мутаций в генах BRCA1/2 семейный анамнез был доступен только у 28 человек. Из них у 26 (93%) носителей мутаций в гене BRCA1/2 был выявлен онкологически отягощенный семейный анамнез (один или более родственников первой степени родства имеет РМЖ и/или РЯ или другую локализацию опухоли в анамнезе). У двух пациентов (7%) семейная история заболевания отсутствовала. Это можно объяснить неполной пенетрантностью мутаций в гене BRCA1, наличие которых обусловливает от 60 до 80% риска возникновения РМЖ до 70 лет (Ford et al., 1994). В случае мутации 1100delC в гене CHEK2 только одна пациентка (14%) из семи носителей была из семьи с отягощенным анамнезом (у матери пациентки был выявлен РМЖ), у остальных шести (86%) – онкологически отягощенный анамнез выявлен не был. Это соответствует ранее полученным данным о низкой пенетрантности мутации 1100delC в гене CHEK2 по отношению к развитию РМЖ.
Пример родословной онкологически отягощенной семьи, где у пробанда с помощью анализа на РМЖ-биочипе была выявлена мутация 5382insC в гене BRCA1, показан на рис. 13.
Рак простаты Рак почки +64 РЯ (58) +58 +55 РЯ РМЖ РЯ 53 39 + Опухоль мозга + wt +28 +32 +22 + 5382insC Рис. 13. Родословная пациентки В.
Таким образом, доля наследственных форм РМЖ и РЯ в общей структуре заболевания у российских пациентов составляет более 6%, что делает обоснованным проведение генетического тестирования среди пациентов для выявления наследственных форм этих онкологических заболеваний. При этом особое внимание следует уделять пациентам с ПМЗН, имеющих сочетанный РМЖ и РЯ, поскольку по нашим данным у этих больных наблюдалась самая высокая частота мутаций в гене BRCA1. Также генетическое тестирование показано пациентам с манифестацией заболевания в раннем возрасте (до 40 лет) и наличием семейной истории заболевания.
Обнаружение мутаций, ассоциированных с наследственной формой РМЖ или РЯ, у пациента имеет значение для выбора стратегии лечения, так как при этих формах высока вероятность возникновения билатерального рака. Обнаружение мутации в доклинической стадии позволяет принимать профилактические меры, предупреждающие развитие заболевания (профилактическая мастэктомия и овариэктомия, прием тамоксифена), или меры, направленные на раннюю диагностику.
Резюме. Разработан РМЖ-биочип для определения 8 мутаций, определяющих наследственную форму РМЖ и РЯ, наиболее распространенных в странах Восточной Европы. С помощью РМЖ-биочипа протестировано 385 образцов ДНК пациентов с диагнозом РМЖ, 68 образцов пациентов с диагнозом РЯ и 33 образца пациентов, имеющих ПМЗН с поражением МЖ и/или яичников. Мутации в генах BRCA1/ обнаружены у 6,3% пациентов с РМЖ, 10% пациентов с РЯ и 39,4% пациентов с ПМЗН с поражением МЖ и/или яичников. Наиболее частой мутацией во всех группах является мутация 5382insC в гене BRCA1.
4. РАЗРАБОТКА БИОЧИПОВ ДЛЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ.
4.1 Анализ полиморфизма гена TPMT, приводящего к недостаточности фермента тиопурин-S-метил-трансферазы.
Известно, что в среднем у 1 из 300 человек имеется выраженная недостаточность ферментной активности тиопурин-S-метилтрансферазы (TPMT), что приводит к тяжелой миелосупрессии при применении стандартных доз при лечении тиопуринами. Около 10% населения имеют промежуточную активность TPMT, при которой также возможно развитие токсического эффекта. Примерно 90% популяции имеют высокую активность TPMT (Krynetskiy et al., 1996).
В настоящее время описан аллель дикого типа TPMT*1, определяющий нормальную ферментную активность, и более 20 различных аллелей, которые кодируют фермент с пониженным уровнем активности белка (TPMT*1A, TPMT*2–*23) (Evans et al., 2004;
Schaeffeler et al., 2006). Самыми распространенными из аллелей, приводящих к дефициту ферментной активности, являются TPMT*2 (полиморфизм G238C), TPMT*3А (полиморфизмы G460A и A719G) и TPMT*3С (полиморфизм A719G), которые встречаются от 85 до 95% случаев от всех аллелей такого рода в мировых популяциях.
На основании литературных данных выбраны шесть наиболее распространенных в популяциях мира однонуклеотидных полиморфных точек в гене TPMT (G238C, G292T, G460A, G644A, T681G, A719G) и разработан биочип для их анализа. Таким образом, с помощью биочипа мы можем детектировать восемь различных полиморфных аллелей, включающих как самые распространенные (TPMT*2, *3А,*3С), так и редкие аллели, встречающиеся в единичных случаях в отдельных популяциях (*3В, *3D, *5, *7, *8), а также определять предковый аллель или аллель дикого типа (TPMT*1).
На рис. 14 приведены схема расположения олигонуклеотидных проб на ТПМТ биочипе (А) и примеры гибридизационных картин для образцов с различными генотипами (Б и В). Биочип был протестирован на 60 контрольных образцах ДНК с известным генотипом. Результаты гибридизации на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами (ПДРФ-анализ или прямое секвенирование).
Таким образом, точность метода диагностики вышеназванных полиморфных точек в гене TPMT с помощью биочипа составила 100%.
Было проведено широкомасштабное исследование частот генотипов и аллелей гена TPMT у жителей европейской части России, включая восточных славян и жителей Северного Кавказа (91% и 9% общей выборки, соответственно). В результате из обследуемых индивидов 52 (5,9 %) были гетерозиготны по локусу гена TPMT, из них у 43 (4,9 %) обнаружен генотип *1/*3А, у 7 (0,8%) – генотип *1/*3С и у 2 (0,2%) человек – генотип *1/*2. Остальные 828 (94,1 %) индивидов имели генотип TPMT*1/*1 («дикий тип»). Следует отметить, что генотип *1/*3А в нашем исследовании был обнаружен только у представителей славянской группы, в то время, как генотип *1/*3С, в большинстве случаев принадлежал жителям Северного Кавказа. Пациенты гомозиготные по TPMT*2, *3А,*3С аллелям, а также носители *3B, *3D, *7 и *8 аллелей в нашем исследовании обнаружены не были.
1 2 3 4 5 А G238 G292 G460 G644 T681 A G238 G292 G460 G644 T681 A 238C 292T 460A 644A 681G 719G 238C 292T 460A 644A 681G 719G Интенсивность флуоресценции, отн.
"дикий" тип 1, 1,20 мутация 1, 1, Б 0, 1234 5 6 0, 0, ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, G238C G292T G460A G644A T681G A719G В Интенсивность флуоресценции, отн.
"дикий" тип 1, 1,20 мутация 1 234 5 6 1, 1, 0, 0, 0, ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, G238C G292T G460A G644A T681G A719G Рис. 14. Схема расположения олигонуклеотидных проб на ТПМТ–биочипе (А). В двух верхних рядах иммобилизованы олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям дикого типа, в двух нижних – олигонуклеотиды, соответствующие измененным последовательностям. Представлены гибридизационные картины, полученные при анализе образцов с различным генотипом (слева): Б – генотип дикого типа TPMT*1/*1;
В – генотип TPMT*1/*3А;
и соответствующие диаграммы значений относительных интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа (справа).
При анализе литературных данных по частотам аллелей гена ТПМТ в популяциях США, Европы, Африки, Китая, Юго–Восточной Азии, оказалось, что популяция жителей европейской части России наиболее близка к популяциям Европы и белого населения Америки (рис. 15).
Россия Польша Словения Германия Частота аллеля,% белое население Америки 6 Афро-Американцы Юго-Восточная Азия Кения Китай ТПМТ*3А ТПМТ*3С ТПМТ* Рис. 15. Частоты наиболее распространенных аллелей гена TPMT в популяциях мира и в России.
Для выявления клинического значения полиморфизма гена TPMT врачами гематологами было проведено сравнение переносимой дозы 6–МП и его гематологической токсичности у 59 больных ОЛЛ, 8 из которых были гетерозиготами по полиморфным аллелям гена TPMT, приводящим к недостаточности фермента, а остальные пациенты имели генотип дикого типа (Чупова Н.В. и др., 2005).Оказалось, что пациентам, носителям аллелей TPMT*3A, TPMT*3С и TPMT*2 приходилось снижать дозу вследствие плохой переносимости 6–МП (264 мг/м2 по сравнению с 312 мг/м2;
p=0,04). Также у гетерозиготных пациентов в 2 раза чаще отменяли терапию 6-МП по сравнению с пациентами с генотипом дикого типа (20% по сравнению с 11%;
p=0,01) вследствие развития острой гематологической токсичности, что нарушало сроки проведения лечения.
Таким образом, диагностика полиморфных вариантов гена TPMT, приводящих к недостаточности фермента, позволяет осуществлять индивидуальный подход к лечению пациентов путем уменьшения дозы лекарственного препарата с целью снижения токсичности.
4.1 Создание биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации.
Гены, определяющие реакцию организма на канцерогены и экотоксины, кодируют белки, обеспечивающие биотрансформацию (дезактивацию и детоксикацию) ксенобиотиков. Их относят к так называемым генам "внешней среды" (environmental genes) или генам «метаболизма», которые характеризуются значительным популяционным полиморфизмом.
Совместное функционирование ферментов системы биотрансформации обеспечивает обезвреживание десятков тысяч ксенобиотиков всех химических классов и разных групп, включая канцерогены, мутагены, тератогены, пестициды, промышленные и сельскохозяйственные яды, пищевые добавки, красители, растворители, лекарственные препараты. Изменение активности ферментов биотрансформации и несбалансированность работы ферментов отдельных стадий этого процесса может приводить к повышенной восприимчивости организма к вредным воздействиям и, как следствие, к увеличению риска развития различных многофакторных заболеваний, в том числе онкологических.
При создании биочипа нами были выбраны гены CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, кодирущие ферменты 1-ой стадии процесса биотрансформации цитохромы;
гены GSTT1 и GSTM1, кодирующие глютатионтрансферазы (GST), и гены NQO1, NAT2, TPMT, продукты которых участвуют во 2-ой стадии;
а также гены MTHFR и MTRR, продукты которых участвуют в метаболизме фолатов. Роль полиморфизма в гене TPMT была рассмотрена выше.
A CYP1A1 GSTM GSTT CYP2D С4887А и A4889G T6235C делеция делеция CCATT ACATT 6235T 1934G 2637A + + CCATT ACATT 6235T 1934G 2637A + + CCGTT ACGTT 6235C 1934A 2637delA - CCGTT ACGTT 6235C 1934A 2637delA - NQO1 CYP2C MTHFR MTRR CYP2C 677C 1298A 66A 609C 430C 1075A 681G 677C 1298A 66A 609C 430C 1075A 681G 677T 1298C 66G 609T 430T 1075C 681A 677T 1298C 66G 609T 430T 1075C 681A NAT 341T 481C 590G 857G 341T 481C 590G 857G 341C 481T 590A 857A 341C 481T 590A 857A Б Рис. 16. Схема биочипа (А) и пример гибридизации, полученной на ПФ биочипе (Б). Стрелками указаны полиморфные варианты, наличие которых приводит к изменению каталитической активности ферментов. *Для генов GSTT1 (делеция) и GSTM1 (делеция) на схеме в двух верхних строках приведены «+», что соответствует олигонуклеотидам без делеции;
в качестве внутреннего контроля использованы зонды, содержащие искусственную замену одного нуклеотида в центральной части.
Биочип позволяет анализировать 16 однонуклеотидных замен и 2 делеции в десяти различных генах: CYP1A1 (4887СА, 4889AG, 6235TC), CYP2D6 (1934GA, 2637delA), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTHFR (677CT, 1298AC), MTRR (66AG), NQO1 (609CT), CYP2C9 (430СT, 1075CT), CYP2C19 (681GA) и NAT (341TC, 481СТ, 590GA, 857GA). На рис. 16 приведена схема биочипа и пример гибридизационной картины. Для определения точности диагностического метода с использованием биочипа использовали контрольные образцы с известным генотипом.
Чувствительность и специфичность метода составляют не менее 98%.
На основе разработанного биочипа создана диагностическая тест-система ПФ биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации. Тест-система зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике. С использованием тест-системы ПФ-биочип нами были проведены исследования по определению частот различных аллелей генов системы биотрансформации в группах здоровых доноров и больных онкогематологическими заболеваниями.
4.2 Анализ полиморфизма генов системы биотрансформации у здоровых доноров, жителей европейской части России.
Для анализа полиморфизма генов системы биотрансформации в российской популяции использовали две выборки. Выборка (1) включала 177 здоровых доноров, образцы крови были любезно предоставлены к.м.н. Никитиным Е.А. ( Гематологический научный центр РАМН) и д.б.н. Иващенко Т.Э. (НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.
Отта РАМН, Санкт-Петербург). Средний возраст составил 51 год (диапазон возраста от 20 до 102 лет;
50.8% мужчины).
Выборка (2) включала 490 здоровых доноров. Кровь и/или слюна была собрана у студентов Московского Государственного Открытого Университета (МГОУ), сотрудников Института молекулярной биологии им. В. А..Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и сотрудников Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (ИОГен РАН).
Средний возраст здоровых доноров составил 20 лет (диапазон возраста от 18 до 34 лет;
50.2% мужчины). Обе выборки представлены жителями европейской части России, преимущественно восточными славянами. Результаты генотипирования в обеих выборках представлены на рис. 17 в сравнении с усредненными данными по европейским популяциям. Как видно, выявленные в двух контрольных выборках частоты генотипов изученных генов системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQO1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 достоверно не различаются между собой, также они близки к опубликованным частотам, полученным в европейских популяциях (Krajinovic et al., 1999;
Labuda et al., 1999;
Roddam et al., 2000;
Garte et al., 2001;
Wiemels et al., 2001;
Майорова и др., 2002;
Yuille et al., 2002;
Gaikovich et al., 2003;
Gemmati et al., 2004;
Kracht et al., 2004;
Gast et al., 2007). Это позволяет сопоставлять данные, полученные для популяции европейской части России, с данными по другим европейским популяциям.
4.3 Анализ полиморфизма генов системы биотрансформации у больных лейкозами и лимфомами.
С использованием тест-системы ПФ-Биочип выполнены три исследования по анализу ассоциаций различных аллелей генов системы биотрансформации с риском развития следующих заболеваний: 1) Т-клеточной лимфомы и В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза у взрослых;
2) острых лейкозов у детей, 3) рецидива острых лейкозов у детей.