Филогенетические связи и систематика хвостатых амфибий семейства углозубов (amphibia: caudata, hynobiidae)
На правах рукописи
Поярков Николай Андреевич
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ И СИСТЕМАТИКА
ХВОСТАТЫХ АМФИБИЙ СЕМЕЙСТВА УГЛОЗУБОВ
(AMPHIBIA: CAUDATA, HYNOBIIDAE)
Специальность 03.02.04 – зоология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
МОСКВА – 2010
Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных Биологического факультета
Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Васильев Борис Дмитриевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Алёшин Владимир Вениаминович Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ доктор биологических наук Смирнов Сергей Васильевич Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН
Ведущая организация: Зоологический институт РАН
Защита диссертации состоится « 6 » декабря 2010 г. в «15» часов «30» минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.20 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, Московский государственный университет им. М.В.
Ломоносова, д. 1 стр. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.
Факс: 8(495)939-17-46;
E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
Автореферат разослан « » октября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, И.Р. Бёме доктор биологических наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Представители семейства углозубов (Hynobiidae) занимают обособленное положение среди прочих хвостатых земноводных. Углозубы обладают большим количеством примитивных черт организации и, вероятно, наиболее близки к общему предку Caudata;
среди рецентных форм они рассматриваются как прототип первых наземных позвоночных (Шмальгаузен, 1964). Вместе с Cryptobranchidae углозубов объединяют в подотряд Cryptobranchoidea, включающий наиболее примитивных рецентных представителей хвостатых амфибий. Принято считать, что монофилия Hynobiidae не вызывает сомнений, однако ряд авторов на основании морфологических (Trueb, Cloutier, 1991;
Boisvert, 2009) и молекулярных (Wiens et al., 2005) данных считает возможной парафилию группы. Палеонтологическая летопись семейства Hynobiidae крайне бедна, достоверно углозубы известны начиная с миоцена-плиоцена Казахстана и Европы (Averianov, Tjutkova, 1995;
Venczel, 1999). Однако недавние находки криптобранхоидных амфибий из юры и раннего мела северного Китая демонстрируют значительное сходство с рецентными Hynobiidae (Wang, 2000;
Zhang et al., 2006;
Chen, Gao, 2009), что предполагает длительную историю эволюции семейства Hynobiidae и делает актуальной проблему происхождения и диверсификации этой группы.
Hynobiidae обладают уникальным для амфибий кариотипом, демонстрируя большие (2n колеблется от 40 до 78) асимметричные бимодальные хромосомные наборы (Morescalchi, 1973, 1975, 1979). Изучение размера генома также показало значительный разброс между отдельными представителями семейства, хотя углозубы в этом отношении исследованы недостаточно (Olmo, 1973;
Litvinchuk et al., 2004). Весьма важно поэтому исследование эволюции карио- и цитогенетических признаков в семействе Hynobiidae.
В отличие от прочих групп Caudata, Hynobiidae встречаются почти исключительно на территории Азии. Для них характерны реликтовые разорванные ареалы, большая часть форм привязана к горным районам Восточной Азии. Группа может рассматриваться как модель для исследования исторической биогеографии Азии, а изучение филогении семейства поможет углубить понимание зоогеографии региона и влияние на эволюцию фауны кайнозойских орогенетических процессов и климатических изменений.
Сегодня в семействе Hynobiidae насчитывают около 50 видов, объединяемых в 8-10 родов, таким образом, это третье по видовому богатству семейство хвостатых (Frost, 2009). Результаты молекулярно-генетических и биохимических исследований последних десятилетий свидетельствуют о существенной недооценке разнообразия земноводных (Vieites et al., 2009).
Сложность морфологической диагностики углозубов заставляет предположить, что разнообразие Hynobiidae также недооценено, однако вопросы систематики этой группы могут быть однозначно решены только с применением молекулярных или биохимических методов (Matsui, 1987;
Matsui et al., 2000, 2001, 2002, 2004). Интенсивность таксономических исследований семейства очевидна: с 1983 года было описано 22 новых вида, 7 родов и 1 подсемейство, а ранг 4 форм был поднят до видового (Fei, Ye, 2000;
Song et al., 2001;
Kim et al., 2003;
Matsui et al., 2004;
Shen et al., 2004;
Jiang et al., 2005, Zhou et al., 2006;
Xu et al., 2007;
Lai, Lue, 2008;
Wei et al., 2009). Наконец, исследования различных видовых комплексов указывают на наличие неописанных видов (Nishikawa et al., 2001, 2003, 2005, 2007;
Fu et al., 2001;
Matsui et al., 2006;
Zeng et al., 2006;
Yoshikawa et al., 2008;
Fu, Zeng, 2008). При этом единственная ревизия всего семейства Hynobiidae была опубликована в начале ХХ века (Dunn, 1923), что делает комплексное исследование систематики и таксономии углозубых весьма актуальным.
Наиболее масштабная попытка реконструкции филогении углозубов по полным последовательностям митохондриальной ДНК представителей 8 родов Hynobiidae (Zhang et al., 2006) привела к новой схеме, которая, однако, обладала плохо разрешённой топологией, основывалась на анализе небольшого числа таксонов и противоречила ряду полученных ранее гипотез (Weisrock et al., 1999;
Larson et al., 2003). Последующие работы (Peng et al., 2010) также окончательно не разрешили филогенетические связи Hynobiidae. Данные же по ядерной филогении углозубых пока отсутствуют. Комплексному исследованию филогенетических связей, разнообразия и систематики Hynobiidae и посвящена эта работа.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состоит в комплексном изучении филогенетических связей представителей семейства Hynobiidae на различных таксономических уровнях и разработке адекватной классификации, отражающей эти связи. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Обобщить опубликованные и оригинальные данные о морфологической дифференциации Hynobiidae на родовом уровне, сопоставить их с данными по другим рецентным семействам Caudata и ряду ископаемых форм, провести филогенетический анализ по исследованным признакам.
2. Обобщить данные литературы о количестве и морфологии хромосом Hynobiidae;
получить кариотипы ряда ранее неизученных видов;
исследовать значения размера генома представителей основных филогенетических линий семейства.
3. Изучить филогенетические связи между представителями Hynobiidae по данным последовательностей мтДНК, максимально охватив разнообразие семейства.
4. Изучить филогенетические связи между представителями семейства Hynobiidae по данным последовательностей белок-кодирующих генов ядерного генома, сопоставить филогенетические гипотезы, полученные по данным мтДНК- и яДНК-маркеров.
5. На основе синтеза полученных результатов и литературных данных проанализировать эволюцию таксономически важных морфологических признаков, разработать систему семейства, отражающую результаты филогенетического анализа.
6. Изучить многообразие семейства Hynobiidae с помощью мтДНК-маркеров;
исследовать внутривидовую дифференциацию надвидовых комплексов в родах Onychodactylus, Salamandrella, Hynobius, Paradactylodon;
оценить применение гена первой субъединицы цитохром с-оксидазы (COI) как маркера для ДНК-идентификации Hynobiidae.
7. Используя методы молекулярных датировок, оценить возможные времена дифференциации различных линий семейства по мтДНК- и яДНК-маркерам;
разработать палеогеографический сценарий, описывающий эволюцию Hynobiidae.
Научная новизна. Впервые на основании обширного оригинального материала, охватывающего всех известных представителей семейства (10 родов, 75 таксонов предположительно видового ранга), изучены филогенетические связи и разнообразие Hynobiidae.
Исследование проводили на различных таксономических уровнях, причем как по мтДНК, так и по яДНК-маркерам. Установлены морфологические признаки, важные для диагностики видов и родов семейства Hynobiidae. Получены новые данные по хромосомным наборам и размеру генома 18 видов из 6 родов. Исследована филогеография ряда видовых комплексов. С помощью молекулярно-генетического анализа выявлено 19 предположительно новых для науки форм околовидового ранга, а также 12 группировок родового и надродового ранга. На основании молекулярных датировок кладогенетических событий в истории семейства выдвинута новая гипотеза о возможных путях эволюции и закономерностях дифференциации Hynobiidae.
Предложена новая система Hynobiidae, снабженная списками синонимов, таксономическими очерками и оригинальным определительным ключом по всем видам семейства. Оценена практическая применимость гена COI для молекулярной идентификации Caudata.
Теоретическое и практическое значение работы. Данные диссертации по филогении и систематике Hynobiidae могут быть полезны при проведении сравнительных исследований проблем видообразования у земноводных, исторической биогеографии и зоогеографии Азии, а также использоваться в вузовских курсах общей зоологии, зоологии позвоночных и герпетологии. Диагностические таблицы применимы при определении в полевых условиях, а также в зоологических коллекциях. Использование методов молекулярной ДНК-идентификации животных необходимо для адекватной оценки биологического разнообразия и разработки соответствующих природоохранных мер. Наши данные позволяют пересмотреть природоохранный статус большинства видов Hynobiidae и могут использоваться в дальнейшем при инвентаризации и мониторинге разнообразия батрахофауны.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены в виде докладов и стендовых презентаций на 7 международных и 3 российских конференциях: Х, XI и XII Международных конференциях студентов и молодых ученых «Ломоносов-2003», «Ломоносов-2004», «Ломоносов-2005» (Москва, МГУ), II и III съездах Герпетологического общества им. А.М. Никольского при РАН (Санкт-Петербург, 2003;
Пущино-на-Оке, 2006), 12-м (Санкт-Петербург, 2003), 13-м (Бонн, ФРГ, 2005), 14-м (Порту, Португалия, 2007) и 15-м (Кушадасы-Айдын, Турция, 2009) конгрессах Европейского герпетологического общества и на Съезде герпетологов и террариумистов (Герпетологическое общество Германии) (Герсфельд, ФРГ, 2005). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных семинарах в Национальном музее естественной истории «Naturalis», Лейден, Нидерланды (2006, 2008), Свободном университете Брюсселя, Бельгия (2006), Биологическом институте г. Ченьду, КНР (2006), Зоологическом институте г. Куньмин, КНР (2006, 2007), Университете г. Хиросаки, Япония (2008), Музее зоологии позвоночных при Калифорнийском университете, Беркли, США (2008), Институте биоразнообразия Онтарио, Гвелф, Канада (2008), Тайбэйском педагогическом университете, Тайбэй, Тайвань (2009). Работа апробировалась на семинарах лаборатории герпетологии и орнитологии ЗИН РАН (2010) и кафедры зоологии позвоночных биологического факультета МГУ (2009–2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 печатные работы, в том числе 7 статей, из которых 4 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», четырех глав: «Основные проблемы происхождения и систематики углозубов (Hynobiidae)», «Материалы и методы исследования», «Филогенетические связи представителей семейства Hynobiidae» и «Систематика и пути эволюции семейства Hynobiidae», «Выводы», «Список литературы»
(включающий 1001 источник, из них 861 на иностранных языках) и семи «Приложений». Общий объем работы 650 страниц машинописного текста, из них 290 страниц сам текст работы, и 360 страниц «Приложений». Работа содержит 20 таблиц и 60 рисунков. Приложения содержат дополнительные результаты диссертации, 19 таблиц и 33 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ВВЕДЕНИЕ Во Введении обоснована актуальность темы, сформулированы основные цели и задачи настоящего исследования.
ГЛАВА I. ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ПРОИСХОЖДЕНИЯ И СИСТЕМАТИКИ УГЛОЗУБОВ (HYNOBIIDAE) В главе приводится краткий обзор наиболее актуальных проблем филогенетики и систематики Hynobiidae. Полный обзор литературы по истории таксономических и филогенетических исследований семейства приводится в Приложении 1.
I.1. Наиболее актуальные проблемы систематики Hynobiidae на надродовом уровне – уровне семейства. В разделе рассматриваются основные проблемы таксономической структуры семейства Hynobiidae, родовой систематики и филогенетических связей между основными группами углозубых.
I.2. Наиболее актуальные проблемы систематики Hynobiidae на видовом и подвидовом уровнях. В разделе рассмотрены основные проблемы видовой и внутривидовой систематики углозубых и обозначены наименее изученные в таксономическом отношении роды и видовые комплексы.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II.1. Материалы исследования. Исследование проводили с 2003 по 2009 год.
Экспедиционную работу и сбор материала осуществляли на территории России, Казахстана, Ирана, Китая, Тайваня и Японии. Помимо этого были обработаны материалы герпетологических коллекций 16 зоологических музеев и университетов. Всего в ходе исследований морфологии изучено 2523 особи, в том числе количество туловищных позвонков у 650 особей. Было кариотипировано 35 особей 13 видов, а размер генома определен для 102 особей 19 видов. В молекулярном анализе помимо собственных сборов использовали материал, любезно предоставленный коллегами, и из музейных коллекций. В общей сложности в анализе участвовало 1367 особей из 316 локалитетов, относимых к 75 филетическим линиям, представляющим все признаваемые сегодня виды Hynobiidae за исключением H. turkestanicus.
II.2. Методы исследования. Кладистический анализ морфологических признаков проводили с целью (а) уточнения филогенетических связей между современными родами Hynobiidae и (b) уточнения положения Hynobiidae относительно остальных рецентных семейств и ряда вымерших групп хвостатых амфибий. Для решения последней задачи за основу была взята таксон-признаковая матрица из 281 морфологическиого признака (Wiens et al., 2005), которая была дополнена состояниями признаков для 13 таксонов Hynobiidae, представляющих все роды семейства. В матрицу был включен 151 анатомический и кариологический признак (Dunn, 1923;
Duellman, Trueb, 1986;
Zhao et al., 1988;
Adler, Zhao, 1990;
Trueb, Cloutier, 1991;
Fei et al., 2006;
Sessions, 2008 и др.), а также 57 оригинальных признаков внешней морфологии и 43 признака, описывающих особенности размножения и развития углозубых. Последний массив данных использовали для выявления филогенетических связей между родами Hynobiidae. В общей сложности в анализе участвовало 532 признака. При описании признаков внешней морфологии были отобраны 26 наиболее информативных признаков (из них 10 метрических признаков тела, 13 метрических признаков головы и 3 меристических признака), широко применяемых в систематике и видовой диагностике хвостатых амфибий (Good, Wake, 1992;
Wilson, Larson, 1999;
Nishikawa et al., 2007). Подсчет числа костальных бороздок проводили по Y. Misawa (1989), а туловищных позвонков с помощью рентгенограмм (540 экземпляров) или при вскрытии ( экземпляров, по: Litvinchuk, Borkin, 2003). Также описывали 23 качественных признака окраски, их состояния кодировали (по: Tominaga et al., 2005, с изменениями).
Сбор и хранение материалов для молекулярного и цитогенетического анализа проводили по стандартным методикам. Размер генома (количество ядерной ДНК в диплоидном ядре) измеряли при помощи проточной цитофотометрии на базе лаборатории цитогенетики человека и животных ИХБФМ СО РАН и KIZ CAS, данные обрабатывали по стандартным методикам (Виноградов и др., 1990;
Murphy et al., 1997;
Litvinchuk et al., 2004). В качестве реперного стандарта использовали периферические клетки крови одних и тех же особей Pleurodeles waltl, Triturus karelinii (Salamandridae) и Rana temporaria (Ranidae). Анализ числа и морфологии хромосом проводили в сотрудничестве с лабораторией проф. М. Куро-о на базе Университета Хиросаки, Япония, по стандартным методикам (Kezer, Sessions, 1979, с изменениями).
Молекулярно-генетический анализ осуществляли на базе нескольких лабораторий, в том числе кабинета молекулярных методов каф. зоологии позвоночных биологического ф-та МГУ, кабинета молекулярной диагностики ИПЭЭ РАН, лаборатории Музея зоологии позвоночных Калифорнийского университета (MVZ, UC, Berkeley) и Канадского центра ДНК Штрихкодирования (CCDB, BIO, Guelph). Выделение ДНК проводили четырьмя различными методиками (Sambrok et al., 1989;
Bruford et al. 1992;
Ivanova et al., 2006), затем концентрацию ДНК выравнивали до 100 ng/L на спектрофотометре NanoDrop.
При разработке праймеров, филогенетическом анализе полученных последовательностей мтДНК, а также в качестве внешних групп использовали ранее опубликованные полные последовательности мтДНК хвостатых амфибий: 23 мтДНК-генома для Hynobiidae (Zhang et al., 2006;
Peng et al., 2010), а также 16 мтДНК-геномов представителей других семейств Caudata. При филогенетических реконструкциях на уровне семейства в качестве мтДНК-маркеров применяли только белок-кодирующие гены H-цепи, исключая некодирующие участки и гены тРНК и рРНК (общая длина 16750 п.о., окончательное выравнивание 10937 п.о.). При филогеографических реконструкциях и исследованиях на уровне родовой филогении исследовали фрагменты гена цитохрома b (cyt b;
818-1152 п.о.), 12S рРНК, (12S rRNA;
267-1138 п.о.), 16S рРНК (16S rRNA;
538-1085 п.о.), первой субъединицы цитохром с-оксидазы (COI;
655 п.о.), первой и второй субъединиц гена NADH-дегидрогеназы (ND1, ND2;
1467 п.о.). Для амплификации фрагментов мтДНК всего использовали комбинации из 53 праймеров, из которых 5 оригинальные. В качестве яДНК-маркеров исследовали высококонсервативные однокопийные ядерные белок кодирующие гены: первая субъединица гена активации рекомбинации (RAG1;
1460 п.о.), ген нейротропного фактора мозга (BDNF;
715 п.о.) и ген проопиомеланокортина (POMC;
540 п.о.).
Для их амплификации применяли комбинации из 16 праймеров, из которых 8 оригинальные.
ПЦР, визуализацию и очистку ампликонов и определение первичных нуклеотидных последовательностей (секвенирование) проводили по стандартным методикам (Hillis et al., 1996).
В общей сложности для реконструкции филогении семейства Hynobiidae автором было получено 413 последовательностей, и 256 были заимствованы из генбанка NCBI, из которых уникальных. Для исследований филогении внутриродового уровня было получено последовательности, и 616 последовательностей было получено из генбанка или предоставлено коллегами. Ранее ядерная филогения углозубых не изучалась, поэтому все полученные последовательностей являются оригинальными.
II.3. Анализ исследованных признаков. Кладистический анализ морфологических данных проводили с использованием программ PAUP v.4.0b10;
MrBayes v.3.0b3 и WinClada v.1.0.
Филогенетический анализ осуществляли по всему массиву признаков и таксонов для выявления положения углозубов среди прочих Caudata, а также отдельно по признакам, применяемым в систематике Hynobiidae. В первом случае в качестве внешней группы использовали Karaurus sharovi (Karauridae), а во втором сестринское углозубам семейство Cryptobranchidae.
Большинство сравниваемых признаков были бинарными, кроме 99, которые ордировались. Для минимизации влияния педоморфных изменений на филогенетические гипотезы было выделено 72 потенциально педоморфных признака;
анализ проводили как с включением их в анализ, так и без них. Для формирования адекватной полярности исследуемых признаков, исходя из известных филогенетических связей между рецентными группами хвостатых амфибий (Larson et al., 2003;
Wiens et al., 2005;
Zhang, Wake, 2009), на результирующие филогенетические гипотезы накладывали топологические ограничения. Реконструкция кладограмм выполнена методом максимальной экономии (MP) и байесовским методом (UBA). Статистическую обработку морфометрических данных проводили в программах Microsoft Excel и StatSoft Statistica v.6.0. Для минимизации фактора размера животного абсолютные значения признаков нормировали к длине туловища. С помощью стандартных параметрических тестов оценивали сопряженность признаков, выраженность полового диморфизма и достоверность различий по морфометрическим признакам. Скоррелированные признаки исключали из дальнейшего анализа.
Для выявления дифференциации между популяциями использовали канонический детерминантный анализ (CDA) и многогрупповой анализ главных компонент (MGPCA).
Для обработки молекулярных данных применяли 18 различных пакетов программ. После первичного анализа и выравнивания последовательностей (Chromas 1.45;
BioEdit 7.0.5.2;
Clustal X 1.8 и др.) проводили анализ положения стоп-кодонов и делеций. Последовательности яДНК также анализировали на возможность наличия гетерозигот, однако из 157000 исследованных было выявлено лишь 19 сайтов, потенциально гетерозиготных по двум основаниям.
Дополнительно проводили оценку различий нуклеотидного состава как мтДНК, так и яДНК маркеров;
несмотря на достоверные различия, они не оказывают решающего влияния на филогению. Производили оценку насыщения фрагментов мтДНК и яДНК (DAMBE v.4.2.13). В мтДНК трансверсии по третьей кодон-позиции вносят наибольший вклад в снижение уровня филогенетического разрешения (Mueller et al., 2004), что учитывали при реконструкции филогении на уровне семейства и при выборе оптимальной модели эволюции. По маркерам яДНК существенных следов насыщения не выявлено ни по одной из кодон-позиций.
Статистический анализ согласованности филогенетического сигнала между мтДНК и яДНК не позволил провести совместный анализ данных мтДНК и яДНК. Выбор адекватной модели эволюции ДНК, расчет генетических дистанций и построение филогении проводили независимо для прямых нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей ДНК в программах Modeltest v.3.06;
MrModeltest v.2.2;
PAUP v.4.0b10;
MEGA 4.1 и Treefinder. МтДНК геном был разбит на 42 партиции, для каждой из которых выбор оптимальной модели проводили независимо. Для нуклеотидных последовательностей мтДНК применяли модели GTR+Г4 и GTR2+Г4. Для аминокислотных последовательностей мтДНК использовали модель mtREV+Г4.
Последовательности 3 ядерных генов были разбиты на партиции по кодон-позициям и генам, для каждой из них были рассчитаны оптимальные модели и параметры, в конечном итоге в анализе участвовали 8 партиций. Топологию дендрограмм вычисляли тремя алгоритмами:
дистанционным методом (ближайшего соседа, NJ), кладистическими методами (максимальной экономии, MP;
максимального правдоподобия, ML) и с помощью байесовского анализа (байесовский анализ по партициям, PBA). Устойчивость узлов дендрограмм оценивали по значениям бутстрэп-поддержек (BS) и апостериорных вероятностей (PP). Проводили оценку стабильности скоростей эволюции мтДНК и ядерных генов и относительных скоростей в различных линиях Caudata (с помощью BRRT, в программе Cadence v.1.08). Для оценки предположительного времени кладогенетических событий в эволюции Hynobiidae применяли анализ «молекулярных часов». Мы использовали 2 калибровки максимального возраста кладогенетических событий (дивергенция Batrachia и дивергенция Urodela;
по Marjanovi, Laurin, 2007) и 7 калибровок минимального возраста по находкам ископаемых форм земноводных (из которых 3 относятся к дифференциации Cryptobranchoidea, 3 охватывают дифференциацию Salamandroidea, а 1 отражает дивергенцию между Anura и Caudata). Время дивергенции оценивали по множественному байесовскому алгоритму калибровки в пакете программ MULTIDIVTIME v.03, с использованием свободных молекулярных часов (relaxed clock).
Биогеографический анализ проводили в программе Lagrange 1.0, предоставляющей оценки максимального правдоподобия для альтернативных биогеографических сценариев. По данным работ по палеогеографии Азии (конец мезозоя кайнозой) были сконструированы схемы, описывающие изменения географии Азиатского континента с середины мела до голоцена;
на их основе разработан оригинальный сценарий эволюции Hynobiidae. Филогеографический анализ, расчет демографических и популяционно-генетических параметров и построение медианных сетей гаплотипов проводили в пакетах программ Arlequin v.3.1 и Network 4.111.
ГЛАВА III. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА HYNOBIIDAE III.1. Филогенетические связи представителей семейства Hynobiidae по данным кладистического анализа морфологических признаков. Из 532 исследованных признаков признака не были изменчивы, а 130 – оказались филогенетически неинформативны, из оставшихся признаков 282 оказались изменчивы среди Cryptobranchoidea. При филогенетических реконструкциях получены деревья длиной от 614 до 1902 шагов. Исключение из анализа педоморфных признаков приводило к падению уровня поддержки большинства узлов кладограммы, но не к топологическим изменениям. Результаты филогенетического анализа монофилию подотряда Cryptobranchoidea не подтверждают. Положение большинства включенных в анализ ископаемых форм неопределенно, кроме рода Chunerpeton, являющегося сестринской группой к Cryptobranchidae, и Liaoxitriton, который достаточно надежно группируется с Hynobiidae. Семейство Hynobiidae монофилетично (BS=51%), причем наиболее базальное положение занимают роды Onychodactylus и Liaoxitriton (рис. 1). Все остальные роды составляют монофилетическую группу (BS=72%), в которой сперва отделяется клада, объединяющая западноазиатские роды Ranodon и Paradactylodon (BS=72%), а затем клада, объединяющая Batrachuperus и Liua (BS=97%). Последнее объединение, вероятно, связано с тем, что эти роды являются наиболее водными и более подвержены педоморфным изменениям, чем прочие группы Hynobiidae. Филогенетическое положение Pseudohynobius, Salamandrella и Pachyhynobius неразрешено, а представители рода Hynobius образуют монофилетическую группу (BS=90%), которая подразделяется на две клады «прудовых» (подроды Satobius, Hynobius s.
str.) и «ручьевых» углозубов (Pseudosalamandra, Pachypalaminus, Hynobius Тайваня).
III.2. Филогенетические связи представителей семейства Hynobiidae по данным последовательностей митохондриальной ДНК. Средние генетические дистанции между родами углозубых варьируют от 0.140 (p-дистанция) между родами Batrachuperus и Liua до 0. между родами Protohynobius и Onychodactylus. Дистанции между Onychodactylus и другими родами углозубых (Hynobiidae s. str.) достигают скорее уровня дистанций между семействами хвостатых амфибий, чем родового уровня, даже превышают дистанции между родственными семействами хвостатых амфибий (например, Ambystomatidae и Dicamptodontidae, 0.219). Была выявлена глубокая внутриродовая дифференциация в родах Liua, Pseudohynobius и Paradactylodon. Максимальные внутриродовые различия наблюдались при сравнении двух видов Paradactylodon P. gorganensis и P. mustersi (они достигают 0.145 и превышают минимальную Рис. 1. Филогенетические связи между рецентными представителями Hynobiidae по данным анализа морфологических признаков;
даны значения BS-поддержек.
межродовую дистанцию (0.140 между Batrachuperus и Liua)). При проведении межвидовых сравнений в пределах рода p дистанции колеблются от 0.01 (при сравнении между близкими формами рода Hynobius: H.
guabangshanensis и H. chinensis, H. tenuis и H.
hidamontanus и др.) до 0.12 – 0.13 (ряд видов Onychodactylus, Paradactylodon и Pseudohynobius).
Филогенетические схемы, полученные при анализе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей мтДНК, обладали несколько различной топологией;
противоречия между ними касались тех узлов филогенетического дерева, которые были слабо поддержаны статистически. Максимальным уровнем филогенетического разрешения и топологической стабильностью обладает схема, построенная по данным анализа аминокислотных последовательностей по модели mtREV+Г4. Этой схеме мы и отдаем предпочтение при интерпретации филогенетических гипотез по данным мтДНК (рис. 2). Она предполагает филогенетическую обособленность Onychodactylus и монофилию группы Hynobiidae s. str. В ее пределах базальное положение занимает Pachyhynobius, а остальные роды распадаются на две монофилетические клады: западноазиатских (Ranodon и Paradactylodon) и восточноазиатских (все остальные роды) углозубых. Последняя группа также состоит из двух клад: рода Hynobius и объединения западнокитайских (Liua, Batrachuperus, Protohynobius и Pseudohynobius) и сибирских (Salamandrella) углозубов. Анализ обширного массива данных мтДНК показал несоответствие современной таксономии Hynobiidae выявленным филогенетическим группировкам. Хотя все роды семейства оказались монофилетическими, традиционная таксономическая структура рода Hynobius самого большого рода семейства явно противоречит его филогенетической структуре. Результаты нашего филогенетического анализа отличаются от опубликованных ранее (Larson et al., 2003;
Zhang et al., 2006;
Peng et al., 2010). Отличия касаются тех узлов, которые были слабо или недостоверно поддержаны в предыдущих исследованиях. Причинами топологических противоречий могут быть, в том числе, объем анализируемых данных, а также молекулярные маркеры и алгоритмы филогенетического анализа. Данные анализа мтДНК не позволяют абсолютно разрешить филогенетические связи между группами Pachyhynobius, Ranodon Paradactylodon и остальными родами Hynobiidae s.
str. Возможно, дифференциация предка Hynobiidae s. str. на эти три линии произошла в короткий эволюционный промежуток времени, и мтДНК-геном принципиально неспособен однозначно разрешить отношения между ними;
для этого необходимо привлечение данных яДНК.
III.3. Филогенетические связи представителей семейства Hynobiidae по данным последовательностей ядерной ДНК. Как и ожидалось, исследованные маркеры яДНК оказались значительно более консервативными, чем в случае мтДНК. При сравнении нуклеотидных последовательностей гена RAG1 представителей разных семейств отряда Caudata генетические дистанции варьируют от 0.06–0.13, при сравнении Hynobiidae с другими семействами минимальная дистанция наблюдалась между Andrias (Cryptobranchidae) и Onychodactylus (0.073).
Сравнения в пределах Hynobiidae выявили минимальные генетические дистанции между родами Liua и Batrachuperus (0.011) и родами Liua и Pseudohynobius (0.011), а максимальная обнаруживается между родами Onychodactylus и Pachyhynobius (0.065) (что превышает минимальную дистанцию между семействами: p = 0.060). Это подтверждает значительную эволюционную обособленность рода Onychodactylus и свидетельствует о глубокой дифференциации углозубых. Максимальные дистанции при внутриродовых сравнениях выявлены в родах Paradactylodon и Hynobius. При внутривидовых сравнениях, как правило, наблюдалось значительное генетическое единообразие, исключения составили криптические формы из комплекса O. fischeri (p-дистанции варьируют от 0.00 до 0.003).
Рис. 2. Общие схемы филогенетических связей представителей Hynobiidae по данным анализа мтДНК (А) и яДНК (В). Звездочкой (*) обозначены узлы с максимальной статистической поддержкой (BS97%, PP0.97);
кружком обозначены узлы с умеренной поддержкой (показаны значения BS/PP). Приведены хромосомные числа (2n);
в скобках показаны гипотетические предковые числа хромосом и их вероятные изменения по данным реконструкции на основе байесовского анализа. Сокращения: B. Batrachuperus;
P. Paradactylodon;
L. Liua;
H. Hynobius.
Полученная на основе анализа последовательностей трёх ядерных генов RAG1, BDNF и POMC филогенетическая гипотеза достаточно стабильна и в большинстве узлов хорошо разрешена;
топология схем, полученных разными алгоритмами (MP, UML и PBA), оказалась идентичной (рис. 2). Филогенетические гипотезы, основанные на анализе мтДНК и яДНК, отличаются, эти различия устойчивы и касаются нескольких достоверно поддержанных узлов. И мтДНК-, и яДНК-схемы согласуются в определении филогенетического положения рода Onychodactylus и рассматривают его как наиболее обособленную группу. Основные топологические отличия заключаются в том, что, согласно данным яДНК, наиболее базальное положение в группе Hynobiidae s. str. занимает клада западноазиатских углозубых (Ranodon и Paradactylodon), а не род Pachyhynobius, как это вытекает из анализа мтДНК. При этом следующим после клады Ranodon Paradactylodon от общего ствола Hynobiidae s. str. отделяется род Salamandrella, и лишь потом - род Pachyhynobius, который является группой, сестринской к кладе, объединяющей западнокитайских углозубов и род Hynobius. Поддержка такой топологии не абсолютная, но в целом достоверная. Ранее род Salamandrella сближался с Hynobius (Fei, Ye, 1984;
Zhao, Hu, 1984;
1988) или западнокитайскими углозубыми (Zhang et al., 2006;
Peng et al., 2010). Последнее различие в топологии яДНК- и мтДНК-дендрограмм касается положения клады, объединяющей тайваньских представителей рода Hynobius. Согласно результатам анализа яДНК, эта группа рассматривается как наиболее базальная линия рода Hynobius (BS=82%;
PP= 0.99). При этом, согласно анализу мтДНК, наиболее базальное положение занимает H. (Satobius) retardatus с Хоккайдо. Таким образом, мы столкнулись с существенными противоречиями между результатами филогенетического анализа яДНК и мтДНК. Определенными основаниями предпочесть одну филогенетическую схему другой мы не располагаем. Несмотря на большое сходство между полученными топологиями, 3 узла в них разрешены альтернативным образом.
Причины подобного рода топологических противоречий не ясны. По-видимому, они касаются преимущественно давних кладогенетических событий (старше 50 млн. лет), когда разрешающая способность обоих маркеров падает ввиду различных причин. Вероятно, эти кладогенетические события произошли в относительно короткие с эволюционной точки зрения промежутки времени. Такие различия между основанными на мтДНК и яДНК гипотезами встречаются в ряде работ по филогенетике амфибий (Zhang, Wake, 2009;
Vieites et al., 2009).
III.4. Общая филогенетическая структура семейства Hynobiidae. Полученные на основе анализа мтДНК- и яДНК-маркеров филогенетические схемы позволяют лучше понять эволюционные связи представителей семейства Hynobiidae. Несмотря на некоторые топологические противоречия между ними, в целом они хорошо согласуются друг с другом (рис.
2). Монофилия семейства Hynobiidae ранее оспаривалась в ряде работ по эволюционной морфологии (Trueb, 1993;
Trueb, Cloutier, 1991;
Boisvert, 2009). Однако как мтДНК-, так и яДНК маркеры свидетельствуют в пользу монофилии семейства. Наиболее обособленным является род Onychodactylus, представляющий собой, по-видимому, давно отделившуюся и высокоспециализированную линию углозубых, дифференциация которой соответствует уровню подсемейства – семейства хвостатых амфибий;
таксономическое разнообразие этого рода также значительно недооценено (см. раздел III.6). Группа настоящих углозубых (Hynobiidae s. str.) объединяет все роды Hynobiidae, кроме Onychodactylus, и достоверно монофилетична.
Положение монотипического рода Pachyhynobius разрешено неоднозначно он рассматривается как наиболее базальная линия группы Hynobiidae s. str. по данным мтДНК или как сестринская группа по отношению к кладе, объединяющей западнокитайских углозубов и род Hynobius по данным яДНК. Pachyhynobius характеризуется значительной морфологической обособленностью от остальных Hynobiidae s. str., в его пределах выявлены две мтДНК-линии, дифференциация которых, по-видимому, не достигает видового уровня. Группа западноазиатских углозубых объединяет два рода углозубых из Среднего Востока и Средней Азии: Paradactylodon и Ranodon. Положение этой группы разрешено неоднозначно, по данным яДНК она рассматривается как наиболее базальная линия в кладе Hynobiidae s. str. Род Paradactylodon достоверно монофилетичен, P. mustersi из Афганистана значительно отличается от иранских видов, как по данным мтДНК и яДНК, так и по особенностям внешней морфологии, различия приближаются к уровню родовых. Иранские виды P. gorganensis и P. persicus генетически крайне близки (p=0.033). Дифференциация в пределах монотипического рода Ranodon также очень мала (p0.015). Группа восточноазиатских углозубых объединяет самый крупный род семейства Hynobius, четыре рода западнокитайских углозубых (Batrachuperus, Liua, Pseudohynobius и Protohynobius) и, по-видимому, род Salamandrella. Положение последнего рода достаточно нестабильно, по данным яДНК он рассматривается как наиболее базальная линия среди восточноазиатских углозубых. Группа западнокитайских углозубых объединяет четыре рода углозубых из восточной части Тибетского плато. Согласно анализу аминокислотных последовательностей мтДНК, группа представлена двумя монофилетическими кладами, первая объединяет роды Pseudohynobius и Protohynobius, а вторая постоянноводные роды Batrachuperus и Liua. Поддержка объединения Batrachuperus и Liua по данным анализа яДНК недостоверна. В составе рода Batrachuperus выявлено около 4–5 криптических видов.
Морфологическая и генетическая дифференциация рода Liua значительна и, вероятно, достигает уровня подродовых;
в составе L. shihi и L. tsinpaensis также обнаружены мтДНК-линии неясного статуса. Род Hynobius самый большой в семействе и насчитывает сегодня более 33 видов.
Монофилия Hynobius подтверждается данными анализа как мтДНК-, так и яДНК-маркеров. В составе Hynobius наиболее обособленное положение занимают монотипическая группа Satobius и группа тайваньских углозубов, которые имеет смысл рассматривать как подроды. Остальные виды группируются в подрод Pachypalaminus, объединяющий комплексы H. boulengeri и H.
kimurae, и подрод Hynobius s. str., объединяющий прочие видовые комплексы. Современная система рода недооценивает действительное разнообразие: молекулярный анализ выявил наличие, по крайней мере, еще 8 криптических форм.
III.5. Кариологическая изменчивость углозубов (Hynobiidae): число хромосом и размер генома. Обобщение данных по числу и морфологии хромосом Hynobiidae важно для понимания эволюции кариотипа этой группы и филогенетических связей между ее представителями. Максимальное количество хромосом наблюдается у наиболее базальной группы семейства рода Onychodactylus (2n=78), чей геном также отличается максимальным набором микрохромосом (38);
гаплоидный набор хромосом Onychodactylus (n=39) является самым большим из известных для земноводных. Крупные кариотипы отмечены у родов Ranodon, Liua и Batrachuperus pinchonii (2n=66). При этом у других форм наблюдается уменьшение числа хромосом, преимущественно за счет исчезновения микрохромосом: Pachyhynobius (2n=64), Paradactylodon (2n=62), Salamandrella (2n=62). В пределах рода Batrachuperus наблюдается хромосомная изменчивость, и вид B. tibetanus имеет 2n=62, а остальные формы, вероятно, 2n=66.
Надрод Hynobius и комплекс Pseudohynobius Protohynobius имеют значительно меньшее, чем другие углозубые, число хромосом. Pseudohynobius и Protohynobius обладают сходными кариотипами и 2n=52. Надрод Hynobius отличается уникальным хромосомным полиморфизмом.
Так называемые «прудовые» группы видов Hynobius характеризуются меньшим количеством хромосом (подрод Hynobius, 2n=56) по сравнению с «ручьевыми» (подрод Pachypalaminus, группа «Pseudosalamandra», 2n=58). Все исследованные тайваньские виды имеют 2n=58. Крайняя для Hynobiidae степень редукции числа хромосом наблюдается у H. (Satobius) retardatus с 2n=40, что связано с редукцией большей части микрохромосом, которых остается 6 пар. Минимальные значения числа плеч хромосом (NF) наблюдаются у H. (Satobius) retardatus (NF=72), максимальные у представителей родов Onychodactylus и Hynobius (H. boulengeri, H. kimurae) (NF=102). У большинства видов углозубых значения NF варьируют в пределах 80~90. Нами были определены кариотипы 13 видов, из них для 5 видов впервые: Salamandrella tridactyla (2n=62;
NF=92), Hynobius fuca (2n=58;
NF=98), H. sp. 1 (2n=58;
NF=94), H. guabangshanensis (2n=56;
NF=92), H. maoershanensis (2n=56;
NF=92).
Изменчивость размера генома на гаплоидное ядро (С-value) у хвостатых земноводных превышает изменчивость в других группах позвоночных. Она связана прежде всего с различиями в размерах хромосом, а не в их числе, и, вероятно, является отражением не только филогенетического положения, но даже в большей степени комплексных различий в биологии развития, морфогенезе и экологии сравниваемых форм (Sessions, 1984;
Sessions, Larson, 1987;
Gregory, 2005;
Litvinchuk et al., 2004;
2007;
Sessions et al., 2008). Ранее размер генома ряда форм Hynobiidae был изучен с помощью денситометрии по Фёльгену (Мазин, 1978;
Morescalchi et al., 1979;
Графодатский, Григорьев, 1982) и проточной цитометрии (Vinogradov, 1998;
Stck, 1999;
Litvinchuk et al., 2004), однако ввиду высокой ошибки измерений первого метода эти данные несопоставимы. С помощью проточной цитометрии мы исследовали размер генома 19 видов из родов Hynobiidae, для 14 видов данные были получены впервые. Согласно нашим данным, размер генома различных представителей Hynobiidae колеблется от 45.4 до 110.11 пг.
Наименьший из отмеченных нами размеров генома наблюдался у Hynobius quelpaertensis (46.3±0.6 пг), а максимальный у Onychodactylus fischeri (109.1±0.9 пг). Различия между нашими оценками размера генома Onychodactylus fischeri, Salamandrella keyserlingii, Salamandrella tridactyla и Ranodon sibiricus, и данными предыдущих исследователей (Litvinchuk et al., 2004), незначительны. Наша оценка размера генома Paradactylodon gorganensis (48.0±0.6 пг) существенно отличается от опубликованной ранее (34.77 пг;
Stck, 1999), что, вероятно, связано с использованием различных реперных видов. Наши исследования подтверждают показанные ранее (Morescalchi et al., 1979;
Litvinchuk et al., 2004) значительные отличия рода Onychodactylus по размеру генома (106.2–110.1 пг) от остальных углозубых (размер генома варьирует в пределах 45.4–68.1 пг). Это согласуется с обособленным филогенетическим положением Onychodactylus. В группе Hynobiidae s. str. корреляции между числом хромосом, филогенетическим положением и размером генома не выявлены. В пределах рода Hynobius «прудовые» формы Hynobius s. str. и Satobius имели меньшие значения размера генома (45.4–54.2 пг), чем «ручьевые» Pachypalaminus и тайваньские виды Hynobius (60.8–67.0 пг). Сходные значения размера генома демонстрировали и другие ручьевые формы родов Batrachuperus (60.2–63.1 пг) и Pachyhynobius (60.94 пг±0.7 пг), что, возможно, связано со сходной биологией размножения и продолжительным эмбриональным развитием у ручьевых форм углозубов. С другой стороны, базальные «ручьевые» роды Ranodon и Paradactylodon имели меньшие размеры генома (R. sibiricus: 55.1–57.1 пг;
P. gorganensis: 47.3– 48.5 пг), в то время как размножающийся в стоячих водоемах род Salamandrella, напротив, имел большие размеры генома (63.8–66.9 пг);
таким образом, говорить о четких закономерностях затруднительно. В пределах группы тайваньских Hynobius выявлены достоверные относительные различия по размеру между отдельными популяциями H. arisanensis (RD=1.6%) и H. formosanus (RD=1.1%), их таксономическое значение не ясно. При этом H. sonani и H. arisanensis оказались неотличимыми по размеру генома, что согласуется с филогенетической близостью этих видов.
Рис. 3. Филогенетические связи представителей рода Onychodactylus по данным анализа фрагментов cyt b, 16S rRNA и COI (2345 п.о. мтДНК). Звездочкой (*) обозначены узлы с максимальной статистической поддержкой (BS97%, PP0.97);
кружком обозначены узлы с умеренной поддержкой (показаны значения BS/PP).
III.6. Внутри- и межвидовая дифференциация и систематика безлегочных тритонов (Onychodactylus). Филогенетический анализ показал базальное положение рода Onychodactylus в системе Hynobiidae. Сегодня признается два вида этого рода O. japonicus с Хонсю и Сикоку и O. fischeri из Кореи, провинций Ляонин и Гирин КНР и юга Приморья РФ. Недавно появились данные о глубокой молекулярной дифференциации O. japonicus (Yoshikawa et al., 2008). Мы исследовали фрагменты мтДНК генов 16S rRNA, cyt b и COI у 220 представителей Onychodactylus из 49 популяций со всего ареала рода, кроме территории КНДР, а также морфологическую дифференциацию рода по 223 взрослым экземплярам. Исследования показали неожиданно высокое генетическое разнообразие рода, в общей сложности было выявлено не менее 8 линий, p дистанция между которыми по COI превышает 0.05 (рис. 3). Для 6 линий обособленность была подтверждена секвенированием ядерных генов (0.004 p 0.007). Статистический анализ по метрическим, 3 меристическим признакам, а также 23 качественным признакам окраски позволил различить особей из Сихотэ-Алиня (РФ), пров. Гирин (КНР), южной Кореи, северной и центральной частей о-ва Хонсю (Япония). Эти данные позволяют нам рассматривать выявленные формы как потенциальные виды, таксономический статус которых нуждается в проверке. Виды рода Onychodactylus достаточно надежно различаются по числу костальных бороздок и туловищных позвонков, а также по числу сошниковых зубов, форме их рядов, по пропорциям туловища и хвоста и особенностям окраски. Начало дифференциации рода Onychodactylus по данным яДНК оценивается в 18 млн. лет (обособление O. fischeri s. str.).
Наиболее базальное положение занимает значительно обособленная (p = 0.112~0.133) форма O. fischeri s. str., населяющая, по-видимому, только южные отроги Сихотэ-Алиня на территории РФ. Все остальные виды образуют надежную монофилетическую кладу, дифференциация линий в пределах которой колеблется от 0.05 до 0.093 (p). Она делится на две субклады, первая из которых объединяет популяции Корейского полуострова, а также линию из пров. Ляонин и юга пров. Гирин (КНР). Неожиданным оказалось положение популяции г. Янгсан на юго-востоке Кореи, которая заметно отличается от других корейских и китайских популяций (0.06 p 0.075). Вторая субклада объединяет все популяции Японского архипелага, образующие монофилию, и, что также оказалось неожиданным, линию, населяющую горную часть пров. Гирин (КНР);
причем обособленность этой популяции весьма значительна (0.075 p 0.091). На территории Японии выявлено не менее 7 обособленных линий, в целом в соответствии с данными Ёсикава с соавт. (Yoshikawa et al., 2008). Для двух из этих линий недавно было показано наличие репродуктивной изоляции в зоне симпатрии (Yoshikawa et al., 2010), что подтверждает выдвинутое нами предположение о видовом статусе выявленных форм.
Выявленная структура рода Onychodactylus показывает не только несоответствие современной таксономии группы действительному разнообразию, но и свидетельствует о сложной эволюционной истории рода. Предложен палеогеографический сценарий, описывающий возможные пути эволюции рода.
III.7. Молекулярная дифференциация, систематика и филогеография надвидового комплекса сибирского углозуба (Salamandrella). Сибирский углозуб (Salamandrella keyserlingii) имеет один из наиболее обширных ареалов среди современных амфибий. Недавно было показано наличие криптического вида на Дальнем Востоке РФ, ряд авторов применяют для него название S. schrenckii (Берман, 2005;
Matsui et al., 2008;
Малярчук и др., 2009), другие обозначают его как S. tridactyla (Кузьмин, 2008;
Frost, 2010). До последнего времени распространение и таксономический статус выявленной криптической формы оставался до конца не определенным.
Мы исследовали фрагменты мтДНК генов cyt b и COI у 439 особей рода Salamandrella из, в общей сложности, 74 локалитетов, причем в анализ были включены 19 популяций из Китая, 2 из Японии и 4 из Сахалинской области, что обеспечило более полное покрытие ареала рода. Анализ мтДНК показал значительную дивергенцию между двумя криптическими формами (0.94 p 0.11), а анализ яДНК-маркеров подтвердил их видовой статус, что согласуется с результатами аллозимного анализа (Matsui et al., 2008). Время дивергенции двух видов Salamandrella по данным яДНК оценивается в 7.0 млн. лет.
Согласно результатам анализа мтДНК, S. keyserlingii был обнаружен на всей территории ареала рода в Европе и Сибири, на юг вплоть до Малого Хингана на территории пров.
Хэйлунцзян КНР, а также на островах Тихого океана, в то время как дальневосточный вид S.
tridactyla / S. schrenckii был выявлен на территории Приморья и Хабаровского края по долине р.
Уссури, а также на территории пров. Гирин и Хэйлунцзян (КНР) и равнинной части Еврейской АО. Вероятной географической границей, разделяющей два вида на территории КНР, является, по-видимому, р. Сунгари (Сунхуацзян). Т.о., оба вида Salamandrella встречаются на территории Китая, а дальневосточный вид населяет также север КНДР. Находка изолированной популяции S.
tridactyla / S. schrenckii на территории Еврейской АО на правом берегу Амура, окруженной популяциями S. keyserlingii, по-видимому, отражает изменения русла рек или расселение углоузбов во время половодий, эта территория перспективна для изучения репродуктивной изоляции между двумя видами. В пределах каждого из видов Salamandrella была выявлена филогеографическая структура, дальневосточный вид по сравнению с сибирским отличается заметно большими значениями нуклеотидного и гаплотипического разнообразия. В составе S.
tridactyla / S. schrenckii было обнаружено три значительно обособленные монофилетические линии гаплотипов (BS=95~100%;
0.028 p 0.041), две из которых соответствуют группам, выделенным Малярчуком с соавт. (2009), и встречаются в верхнем и нижнем течении р. Уссури, а также, согласно нашим данным, на территории Маньчжурии. Третья наиболее обособленная линия встречается изолированно в горной части пров. Гирин КНР. В составе S. keyserlingii мтДНК гаплотипы группируются в три обособленные монофилетические клады (BS=95~100%;
0.016 p 0.031), из которых наиболее базальное положение занимает линия, встречающаяся на Хоккайдо и Кунашире. Вероятно, к этой кладе относятся и некоторые популяции Хабаровского края и Сахалина (Malyarchuk et al., 2010). Неожиданным оказалось обособление локальной линии S. keyserlingii из предгорий Малого Хингана, пров. Хэйлунцзян, КНР. Большую часть ареала вида занимает одна линия гаплотипов. Полученные данные свидетельствуют о более высоком, чем предполагалось ранее, генетическом разнообразии обоих видов Salamandrella на территории Маньчжурии, которая и рассматривается нами как предположительная область формирования группы. Демографический анализ показал значительную стабильность эволюционной истории 2х из 3х линий S. tridactyla / S. schrenckii. Сахалин, по-видимому, неоднократно колонизировался S.
keyserlingii, а обособленная популяция Хоккайдо и южных Курил отражает первую волну расселения вида. Большая часть ареала S. keyserlingii была заселена одной линией в течение последних 0.05–0.1 млн. лет (вероятно, между ледниковыми максимумами 90 и 60 тыс. лет назад) и генетически крайне однородна (Поярков, Кузьмин, 2008).
III.8. Молекулярная, морфологическая и кариологическая дифференциация и систематика углозубов рода Hynobius. Филогенетические связи между видами Hynobius самого большого рода семейства остаются ключевой проблемой систематики Hynobiidae.
Сегодня насчитывают около 33 видов Hynobius, однако таксономический статус многих форм нуждается в проверке. Мы провели филогенетический анализ 42 линий по фрагментам мтДНК (общее выравнивание до 4850 п.о.), для 23 из них были получены последовательности 3х ядерных генов (2715 п.о.). Как мтДНК-, так и яДНК-схемы однозначно подтверждают монофилию Hynobius s. lato. Основные топологические отличия между ними заключаются в положении H. (Satobius) retardatus в первом случае этот вид рассматривается как самая базальная линия рода, в то время как согласно данным яДНК, базальное положение занимает группа тайваньских Hynobius. Однако, вопреки аллозимным данным (Matsui et al., 1992), обособленность Satobius весьма значительна, что позволяет рассматривать его как отдельный подрод. Филогенетические отношения Hynobius по данным мтДНК (рис. 4) предполагают полифилию группы ручьевых углозубов (ранее входивших в состав рода Pseudosalamandra).
Несмотря на значительное сходство в морфологии и биологии этих форм, они распадаются на пять отдельных линий, одна на Тайване и четыре в Японии. Филогенетическая и морфологическая обособленность тайваньских углозубов значительна и соотвествует уровню подрода Hynobius. Японские углозубы, ранее рассматриваемые в составе рода Pachypalaminus (H.
boulengeri, H. hirosei), образуют достоверно монофилетическую кладу с комплексом H. kimurae (ранее сближавшемся с H. naevius). Эта клада образует одну из базальных линий рода Hynobius, обладает рядом черт морфологического сходства и может рассматриваться как самостоятельный подрод. Остальные виды рода формируют монофилетическую группу, которая объединяет как ручьевые, так и прудовые формы углозубов из Китая, Кореи и Японии и может рассматриваться как подрод Hynobius s. str. «Ручьевая» группа H. naevius распадается на две линии, собственно комплекс видов H. naevius, близкий японским «прудовым» углозубам, и H. stejnegeri, филогенетическое положение которого неопределенно и противоречит имеющимся аллозимным данным (Nishikawa et al., 2001, 2003, 2005, 2007, 2008). То, что большинство базальных линий рода Hynobius является ручьевыми формами, заставляет нас предположить, что это состояние было свойственно и общим предкам рода. Интересно положение H. okiensis (формы, ранее считавшейся членом комплекса H. naevius): этот ручьевой вид оказался членом группы типичных «прудовых» видов комплекса H. nebulosus, что подтверждается также хромосомным и аллозимным анализами (Seto et al., 1987;
Matsui et al., 2007) и отражает, по-видимому, вторичную адаптацию к ручьевому образу жизни. Углозубы «прудового» типа формируют три монофилетических комплекса видов. Комплекс H. nigrescens объединяет виды с севера и из центра Хонсю, а также H. abei и популяции с Хонсю, ранее относимые к H. nebulosus (вероятно, они соответствуют H. peropus). Виды из центрального и восточного Китая образуют монофилетический комплекс H. chinensis. Он близок к видовым комплексам H. leechii и H.
nebulosus, которые населяют южную Маньчжурию, Корейский полуостров и острова Корейского пролива (Цусима, Чеджудо, Дого), Кюсю, запад Сикоку (и, вероятно, запад Хонсю) и включают не менее 11 форм, морфологическая и филогенетическая близость которых позволяет рассматривать их в составе одного видового комплекса.
Рис. 4. Филогенетические связи представителей рода Hynobius по данным анализа фрагментов мтДНК (до п.о.). Звездочкой (*) обозначены узлы с максимальной статистической поддержкой (BS97%, PP0.97);
кружком обозначены узлы с умеренной поддержкой (показаны значения BS/PP). Чёрным и подчеркиванием выделены виды «ручьевого» типа углозубов, серым без подчеркивания – «прудовые» Hynobius, а пунктирной линией – Satobius.
Таким образом, род Hynobius монофилетичен, в связи с чем, в связи со значительной дифференциацией и разнообразием, имеет смысл рассматривать его как надрод. Базальная дифференциация рода началась, по-видимому, около 31–36 млн. лет назад. Наше исследование показало, что систематика рода Hynobius недостаточно разработана в отношении как филогении, так и видового разнообразия группы. Особенный интерес вызывает филогенетическое положение и межвидовая дифференциация Hynobius Тайваня, представляющих собой одну из наиболее обособленных линий рода. На Тайване, где недавно признавался 1 вид углозубов, сегодня насчитывают 5 узкоареальных алло- или парапатрически распространенных видов (Lai, Lue, 2008), а наши находки позволяют предполагать наличие еще 1-2 неописанных таксонов. Среди «прудовых» углозубов корейского полуострова комплекса H. leechii выявлено по меньшей мере самостоятельных линии, одна из которых (H. sp. 5) филогенетически значительно обособлена и является сестринской группой к объединению комплексов H. leechii из Кореи и H. nebulosus из Японии (рис. 4). Все это свидетельствует о необходимости дальнейших исследований филогении и систематики углозубов рода Hynobius.
ГЛАВА IV. СИСТЕМАТИКА И ПУТИ ЭВОЛЮЦИИ СЕМЕЙСТВА HYNOBIIDAE IV.1. Эволюция морфологических и кариологических признаков в семействе Hynobiidae. Основные диагностические признаки, важные для родовой систематики углозубых, скоррелированы с экологией рассматриваемых форм. В целом, можно выделить несколько морфо-экологических типов углозубых, представители которых связаны сходным образом жизни и биологией размножения. Ранее считалось, что примитивными формами углозубых следует считать наименее специализированных представителей, напоминающих углозубов рода Hynobius, например, H. leechii (Dunn, 1923). Однако филогенетические данные предполагают базальное положение Onychodactylus, крайне специализированной реофильной формы. Степень морфологической обособленности Onychodactylus весьма значительна, ряд признаков отличают его от всех остальных Caudata. Для этого рода характерна значительная степень эмбрионизации (Smirnov, Vassilieva, 2002). Реофильность, по-видимому, тесно связана с уменьшением размера кладки, увеличением размера икринок и продолжительности эмбрионального развития. Помимо Onychodactylus, уникальные адаптации к размножению в ручьях демонстрируют тайваньские виды Hynobius, отличающиеся значительной редукцией личиночной стадии без фазы активного питания и, в крайнем случае, откладывающие икру во влажную почву. Для форм, ведущих постоянно-водный образ жизни, характерно увеличение размеров, наличие педоморфных черт в организации скелета, тяготение к неотении и формирование ряда адаптаций, полезных при длительном развитии и жизни в условиях проточных водоемов. Ярким примером этой тенденции является морфологическое сходство неблизкородственных Paradactylodon и Batrachuperus, долгое время относимых к одному роду. Наземный образ жизни, напротив, связан, как правило, с уменьшением размера и ускорением личиночного развития. Интересно филогенетическое положение рода Salamandrella, типично наземной формы «прудового» типа, длительное время рассматривавшегося в составе рода Hynobius в связи со значительным морфологическим сходством. Согласно нашим данным, Salamandrella является одной из базальных линий Hynobiidae s. str., неродственной Hynobius. Исходя из данных филогенетического анализа, очевидно, что в ходе эволюционной истории углозубых происходили неоднократные изменения морфо-экологических типов, приведшие к параллельному приобретению сходных сочетаний признаков. Наиболее распространён тип околоводных форм, который встречается почти во всех основных филогенетических линиях семейства. По-видимому, такие малоспециализированные горные формы (наподобие Ranodon) представляют собой исходную для Hynobiidae нишу, из этого типа можно вывести как постоянноводные педоморфные формы, так и более специализированные наземные. Это предположение согласуется с тем, что к этому типу относятся наиболее базальные формы семейства.
Принято считать (Morescalchi, 1973, 1975;
Sessions, 2008), что для амфибий плезиоморфным состоянием кариотипа является асимметричный бимодальный кариотип с большим числом хромосом и микрохромосом, а последующие эволюционные изменения связаны с независимым постепенным сокращением числа хромосом, уменьшением числа телоцентрических хромосом и выравниванием кариотипов. Семейство Hynobiidae хорошо иллюстрирует эту закономерность. Кариотип наиболее базального рода Onychodactylus является, возможно, самым примитивным для амфибий, демонстрируя максимальное гаплоидное число хромосом (n=39), наибольшее число микрохромосом (38) и большое количество тело- и субтелоцентрических хромосом. Другие базальные линии углозубых сохраняют плезиоморфное состояние генома и хромосомные наборы с большим количеством тело- и субтелоцентрических хромосом. Согласно результатам реконструкции (Sessions, 2008), возможное число хромосом общего предка Cryptobranchidae (2n=60) и Hynobiidae (2n=40~78) определяется как 2n=66. Этот результат основан на гипотезе, что уменьшение числа хромосом в эволюции кариотипа более вероятно, чем увеличение;
но нельзя исключать и независимого уменьшения хромосомных чисел у Cryptobranchidae и Hynobiidae s. str. Реконструкция эволюции числа хромосом у Hynobiidae по данным байесовского анализа филогенетических данных предполагает следующую схему (рис.
2). Примитивные кариотипы (2n=66) характерны для представителей родов Ranodon, Liua и большинства видов Batrachuperus;
это число хромосом, вероятно, является предковым для группы Hynobiidae s. str. При этом у других базальных форм Hynobiidae s. str. наблюдается независимое уменьшение предкового числа хромосом, преимущественно за счет исчезновения микрохромосом до 2n=64 (Pachyhynobius) и 2n=62 (Paradactylodon, Salamandrella, B. tibetanus).
Для B. yenyuanensis есть неподтвержденные данные о бльшем числе хромосом (2n=68) (Yang et al., 1990). Роды Pachyhynobius и Salamandrella отличаются большим количеством телоцентрических хромосом, что соответствует плезиоморфному состоянию кариотипа.
Значительное уменьшение числа хромосом параллельно и независимо происходит у предков Pseudohynobius Protohynobius (до 2n=52) и у предков надрода Hynobius. Предок Hynobius имел, вероятно, 2n=58, а в ряде линий произошло независимое изменение числа хромосом до 2n=56 у «прудовых» углозубов и до 2n=40 у H. (Satobius) retardatus. Филогенетические данные свидетельствуют о полифилии «ручьевых» (2n=58) и парафилии «прудовых» углозубов (2n=56) (рис. 4);
т.о. хромосомные числа связаны с морфо-экологическими типами, а не с филогруппами углозубов. Вероятно, число хромосом неоднократно изменялось в ходе эволюции рода Hynobius.
Итак, мы можем предположить, что в эволюции семейства Hynobiidae неоднократно происходили множественные параллельные изменения как морфологических, так и кариологических признаков, что ставит вопрос о причинах подобного распределения гомоплазий.
Этот вопрос крайне интересен и требует дополнительных исследований.
IV.2. Особенности распространения и зоогеографии основных групп Hynobiidae.
Hynobiidae семейство амфибий, характерное для Палеарктики. Самые южные находки углозубых известны с о-ва Тайвань (22.75° с.ш.). Все находки углозубов в самой южной части их ареала привязаны к высокогорным районам (более 2000 м), которые и флористически, и фаунистически ближе к Палеарктике, однако нельзя исключать вероятность обнаружения новых форм в горных районах южной Азии. Южная граница Палеарктики в Азии является предметом интенсивных научных дискуссий (Тахтаджян, 1978;
Щербак, 1982;
Borkin, 1999;
Zhao, 1999);
ввиду взаимного проникновения фаун чёткой границы провести не удаётся. Мы рассматриваем Hynobiidae как автохтонные палеарктические элементы, свойственные западно-азиатской, центрально-азиатской, сибирской и восточноазиатской подобластям палеарктической области.
Для Hynobiidae характерен фрагментированный ареал, состоящий из ряда изолированных участков, связанных преимущественно с горными районами. Наиболее значительная дизъюнкция разделяет западноазиатские роды Paradactylodon и Ranodon и роды углозубов западного Китая (аридные районы и высокогорья Центральной Азии). Линии Paradactylodon и Ranodon также географически разобщены небольшие ареалы Ranodon sibiricus, Paradactylodon mustersi и комплекса P. persicus отстоят на примерно равное расстояние друг от друга. Другая дизъюнкция разделяет фауну Hynobiidae центрального и восточного Китая и углозубых, населяющих северо восточную Азию (аридный пояс центрального Китая). Граница между ареалами углозубых восточного и западного Китая проходит по восточным отрогам хр. Дабашань и Далоушань:
низкогорные участки на востоке населяют Hynobius и Pachyhynobius, а высокогорья на западе группа западнокитайских углозубов. Долина р. Янцзы рассматривается как южная граница Палеарктики (Zhao, Adler, 1993);
в центральном Китае роды Hynobius и Pseudohynobius встречаются к югу, а роды Batrachuperus, Liua, Protohynobius и Pachyhynobius к северу от ее русла. Род Salamandrella имеет самый обширный ареал из всех углозубых и встречается в восточно-европейской, сибирской и восточноазиатской областях Палеарктики. Род Hynobius имеет дизъюнктивный ареал и населяет горные районы центрального и восточного Китая, а также восточную Маньчжурию, Корейский полуостров и ряд островов Тихого океана.
Географически и филогенетически наиболее обособлены формы с южной и северной границ ареала рода: углозубы о-ва Тайвань и эндемичный для Хоккайдо H. (Satobius) retardatus.
Основное разнообразие форм рода Hynobius приходится на западные районы Японии (о-ва Кюсю, Сикоку и запад Хонсю). Род Onychodactylus встречается только в восточноазиатской области Палеарктики и обладает ареалом реликтового типа, привязанным к горным районам Хонсю, Сикоку, Корейского полуострова и юга Дальнего Востока РФ. Как на Японских островах, так и на континенте распространение рода Onychodactylus не является непрерывным. Существенной особенностью распространения родов Hynobiidae является то, что ареалы разных родов практически не перекрываются, а в немногих зонах контактов известны лишь единичные случаи симпатрии представителей разных родов углозубых. Единственным исключением из этой закономерности является род Onychodactylus он распространен симпатрично с видами Hynobius или Salamandrella. Из всех Hynobiidae род Onychodactylus является наиболее специализированной реофильной формой. По-видимому, эта специализация является достаточной для сосуществования его вместе с другими родами Hynobiidae.
IV.3. Основные этапы и возможные пути эволюции семейства Hynobiidae.
Этапы дифференциации семейства. Согласно данным оценки скорости накопления филогенетических линий («диверсификационный анализ» по Nee et al., 1992;
Harmon et al., 2003), гипотеза о равномерном распределении кладогенетических событий в эволюционной истории Hynobiidae не подтверждается. Анализ показал наличие двух периодов радиации в эволюционной истории углозубых продолжительностью в целом не более десятой доли общей продолжительности эволюции группы. Первый из них приходится примерно на середину эволюционной истории семейства, а второй на последнюю четверть. Мы предполагаем, что этапы радиации Hynobiidae могли быть связаны с наступлением благоприятных климатических и географических предпосылок, способствующих расселению и последующему обособлению различных линий углозубых. Определяющую роль биогеографических факторов в кладогенезе и радиации разных групп хвостатых амфибий, в том числе и углозубых, подчеркивали разные авторы (Weisrock, 2001, 2006;
Kozak et al., 2006;
Vieites et al., 2007, Zhang et al., 2006).
Молекулярные датировки. Оценки молекулярных датировок времен дивергенций, сделанные по мтДНК и ядерным генам, хорошо коррелируют друг с другом и показывают в целом сходные значения. Это свидетельствует в пользу корректности выбранных нами методов молекулярных датировок и позволяет разработать единый палеогеографический сценарий для семейства. Ядерные датировки, как правило, дают не столь древние оценки кладогенетических событий;
вероятно, оценки по яДНК несколько более точны. При оценке событий моложе 50 млн.
лет разрешающая способность мтДНК постепенно уменьшается с возрастом события (как было показано Ho et al., 2005;
Emerson, 2007), а таковая у яДНК остается примерно неизменной. При оценке филогенетических событий старше 50 млн. лет столь же четкой закономерности выявить не удается, что, вероятно, связано с общим падением точности оценок. В пределах Hynobiidae скорости эволюции исследованных ядерных генов достоверно не отличались, в то время как скорость эволюции мтДНК была достоверно ниже у Onychodactylus и Pachyhynobius.
Дивергенция между Cryptobranchidae и Hynobiidae произошла в конце юры – начале мела и оценивается в 162/138 млн. лет (здесь и далее мтДНК/яДНК датировки). Начало дифференциации Hynobiidae и обособление Onychodactylus приходится на средний мел и оценивается примерно в 114/98 млн. лет. Вероятно, обособление предков Onychodactylus от основного ствола Hynobiidae происходило примерно в то же время и могло быть связано со сходными причинами, что и дифференциация основных семейств хвостатых амфибий. По данным анализа последовательностей яДНК, дифференциация группы Hynobiidae s. str. и формирование основных филогенетических линий произошли позже и завершились быстрее, чем по данным мтДНК (примерно с 65 по 46 млн. лет по данным мтДНК и с 56 по 44 млн. лет по яДНК). Согласно результатам молекулярных датировок, кладогенез в этой группе имеет два выраженных пика. Первый этап сводится к образованию групп родового ранга. Он приходится на палеоцен-эоцен и длится 15–17 млн. лет (примерно с 56 по 39 млн. лет назад). Второй этап связан с внутриродовой дифференциацией и формированием основных групп видов. Он наблюдается у большинства линий семейства, приходится на олигоцен – миоцен и длится 10–11 млн. лет.
Дивергенция между Ranodon и Paradactylodon оценивается как 50/47 млн. лет;
дальнейшая дифференциация рода Paradactylodon произошла не ранее 43/39 млн. лет. Обособление Pachyhynobius могло произойти около 65/49 млн. лет, a Salamandrella – около 51/52 млн. лет назад;
однако ввиду топологических различий эти оценки малосопоставимы. Разделение между Hynobius и общим предком западнокитайских углозубых оценивается в 53/45 млн. лет назад.
Начало дифференциации группы западнокитайских углозубов приходится на 46/42 млн. лет, а дивергенция между родами Batrachuperus и Liua оценивается в 43/40 млн. лет, обособление Protohynobius от Pseudohynobius, по-видимому, произошло около 36 млн. лет назад (по мтДНК).
Дифференциация Batrachuperus состоялась около 26/17 млн., а Liua около 24/18 млн. лет назад.
Отдельно следует рассмотреть дифференциацию рода Hynobius. Начало дифференциации этого рода приходится на конец эоцена ранний олигоцен (36/31 млн. лет), а формирование основных филогенетических линий этого самого разнообразного рода углозубых заканчивается к концу олигоцена около 24 млн. лет назад. Род Hynobius разнообразен не только благодаря большому количеству видов, но и полиморфизму внешней морфологии, организации кариотипа и экологических стратегий. Монофилия родов Paradactylodon, Liua, Pseudohynobius s. lato и Hynobius s. lato делает ненужным их разделение на отдельные роды. Однако значительно более древняя, чем у остальных углозубых, дифференциация и существенные различия между основными филогенетическими линиями этих родов позволяют нам рассматривать их в ранге надродов, а составляющие их линии в качестве подродов. Вероятно, такая схема адекватно описывает действительное таксономическое разнообразие углозубых. Большинство известных сегодня видов Hynobiidae, согласно данным нашего анализа, доплейстоценового возраста, что согласуется с оценками возраста большинства видов хвостатых амфибий (Weisrock et al., 2006;
Steinfartz et al., 2007;
Zhang et al., 2009).
История возникновения филогенетических групп Hynobiidae и их ареалов. По палеонтологическим и молекулярным данным обособление предка Cryptobranchoidea произошло на территории Азии около 160–170 млн. лет назад. Определить ископаемого общего предка Cryptobranchidae + Hynobiidae пока не удается, но весьма вероятно, что к границе юрского и мелового периодов линия, приведшая в дальнейшем к Hynobiidae, уже была сформирована.
Базальная радиация Hynobiidae в Азии на предка Onychodactylus и предка остальных родов произошла, вероятно, в начале верхнего мела. В тот же период или чуть позже (96–100 млн. лет назад) происходит базальная радиация и других крупных семейств Caudata: Plethodontidae, Ambystomatidae s. lato и Salamandridae. Этот этап базальной радиации семейств Caudata хорошо совпадает с верхнемеловым температурным оптимумом, приведшим к значительному повышению среднегодовых температур в высоких широтах. Механизм, объясняющий связь этапов глобального потепления климата и радиации хвостатых земноводных, не ясен. Хвостатые земноводные крайне чувствительны к изменениям температуры и хорошо приспособлены к низким температурам. Можно предположить, что во время значительных потеплений климата могло происходить вымирание многих групп Caudata, фрагментация ранее непрерывных ареалов и, как следствие, ускорение кладогенеза в различных группах. С другой стороны, глобальное потепление климата может приводить к изменению среднего количества осадков, появлению вакантных экологических ниш в районах высоких широт и расселению отдельных групп хвостатых (Zhang, Wake, 2009). Анализ кладогенеза в эволюции Hynobiidae показал наличие двух периодов интенсивной радиации семейства. Первый совпадает с палеоцен-эоценовым температурным оптимумом и продолжается около 15 млн. лет. Короткий период интенсивной радиации Hynobiidae s. str. в палеоцене эоцене подтверждается небольшими расстояниями между узлами дендрограмм. Ко второй половине эоцена формируются все рецентные роды семейства Hynobiidae. Второй этап радиации Hynobiidae имеет более размытые границы и приходится на внутриродовую дифференциацию и формирование основных групп видов.
Максимум узлов филогенетического дерева связан с периодом относительного потепления климата в первой половине миоцена, в это же время определяющее влияние на климат Азии начинает оказывать система летних восточноазиатских муссонов, которые привели к значительному распространению лесного покрова и мезофильной растительности по всему континенту (Sun, Wang, 2005;
Jia et al., 2003). Вероятно, эти факторы благоприятствовали расселению углозубых и их радиации, приведшей к формированию новых видовых групп.
Значительную роль в истории Hynobiidae могли играть орогенетические процессы.
Контакт Индостана с Азией, вызвавший интенсификацию орогенеза по всему южному краю континента, привел к формированию путей для проникновения углозубов в Среднюю Азию и на Средний Восток. В дальнейшем вызванная поднятием Тибетского нагорья резкая аридизация климата Центральной Азии, вероятно, привела к обособлению западноазиатской ветви семейства (Ranodon и Paradactylodon), а также разделению между предками Salamandrella и других родов восточноазиатских углозубых. Кладогенез в последней группе был, вероятно, связан с быстрым поднятием основных хребтов восточной части Тибетского нагорья в первой половине эоцена, обособившим предка высокогорных форм западного Китая (Batrachuperus, Liua, Pseudohynobius, Protohynobius) от предков Pachyhynobius и Hynobius. В позднем эоцене идет поднятие хребтов Хэхуаншань и Айлаошань, вызвавшее изменение водоразделов и формирование русла р. Янцзы.
Вероятно, это событие могло привести к обособлению предков Pseudohynobius Protohynobius и Batrachuperus Liua. Усиление альпийского орогенеза в олигоцене формирует сухопутную связь между территориями Среднего Востока и Восточной Европы, что могло способствовать проникновению на запад предков ископаемых Parahynobius, известных с миоцена.
К концу эоцена олигоцену в Восточной Азии постепенно возрастает количество осадков, климат становится более умеренным и мягким, что, вероятно, благоприятствует расселению предка Hynobius и формированию основных линий рода. Раньше других, по видимому, отделяется тайваньская группа видов на южной границе ареала рода. Олигоценовая регрессия приводит к замыканию бассейна Японского моря и формированию сухопутного моста, соединяющего Корейский п-ов, Хонсю, Хоккайдо и Сахалин;
формирование Цугарского пролива вызывает, по-видимому, обособление H. (Satobius) retardatus. Основные этапы видообразования в родах Hynobius и Onychodactylus связаны, вероятно, с орогенетическими процессами и неоднократными трансгрессиями уровня моря на территории Восточной Азии в олигоцене миоцене. Группа восточнокитайских видов подрода Hynobius s. str., скорее всего, представляет собой результат проникновения углозубов «прудового» типа на эти территории из северо восточной Азии. Изменения климата в плиоцене эоплейстоцене и плейстоценовые климатические колебания приводили к неоднократной фрагментации предковых ареалов с их последующим восстановлением в разных группах углозубых, в том числе в родах Paradactylodon, Batrachuperus, Liua, Hynobius и Salamandrella.
IV.4. Генетическое разнообразие семейства Hynobiidae и его изучение. Сегодня инвентаризация биоразнообразия с помощью методов молекулярной диагностики, или «баркодинга», является необходимым условием его адекватной оценки и разработки соотвествующих мер охраны. Молекулярная диагностика особенно актуальна для земноводных, где таксономическое разнообразие существенно недооценено (Vieites et al., 2009). В большинстве групп животных успешно применяется COI-баркодинг, основанный на анализе фрагмента гена цитохром c-оксидазы I (Hebert, Gregory, 2005;
Hebert et al., 2004), однако ряд авторов сомневались в применимости этого маркера для баркодинга амфибий (Lockridge, Mueller, 2006;
Vences et al., 2005a,b). Нами было показано, что COI вполне может применяться в систематических и филогеографических исследованиях хвостатых амфибий, в частности, представителей семейства Salamandridae (Smith et al., 2007). В настоящей работе анализируются последовательности фрагмента гена COI (~655 п.о.) 1073 экземпляров представителей Hynobiidae, более 80% которых являются оригинальными. Согласно результатам нашего исследования, указаный фрагмент корректно идентифицирует роды, виды и внутривидовые группировки представителей Hynobiidae. Обнаружено генетическое единообразие углозубов внутри популяций (р 0.001) и при сравнении особей из географически близких популяций одного вида (0.001 р 0.01). Некоторые трудности возникают при соотнесении значений генетических дистанций при внутривидовых и межвидовых сравнениях. Так, в пределах вида Onychodactylus fischeri в его современном понимании р-дистанции колеблются от 0.0 до 0.13. По нашему убеждению, это отражает прежде всего слабую разработанность системы семейства Hynobiidae;
мы придерживаемся разделения на группы видового ранга, учитывающего как генетическую структуру видовых комплексов Hynobiidae, так и их морфологическую и географическую дифференциацию. В таких группировках р-дистанции при внутригрупповых сравнениях не превышают 0.05, а их генетическая обособленность подтверждается как другими мтДНК маркерами, так и данными анализа яДНК-маркеров и, в ряде случаев, морфологии.