Морфологические корреляты функциональной пластичности маутнеровских нейронов
На правах рукописи
Тирас Надежда Романовна
Морфологические корреляты функциональной пластичности
маутнеровских нейронов
03.00.13 - Физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Пущино
2007
Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Архипов Владимир Иванович член - корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Отеллин Владимир Александрович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Косицын Николай Степанович
Ведущая организация Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино
Защита состоится 19 декабря 2007 г. в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д002.093.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан _ 2007 г
Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат физико-математических наук Н.Ф. Ланина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования По существующим представлениям адаптация и память, важнейшие функции мозга, обеспечиваются модификациями межнейронных связей. Эти модификации сопровождаются структурными изменениями в синапсах, что является предметом изучения функциональной нейроморфологии (Бабминдра и др., 1990). Чрезвычайная гетерогенность и численность клеточного состава мозга затрудняет получение данных о роли отдельных клеток в функционировании ансамблей нейронов и побуждает искать объекты, организованные морфологически просто;
с такими же механизмами адаптации как в нервной системе высших животных;
с функцией, проявляемой в поведении и доступной четкому определению на клеточном уровне. Таким уникальным объектом являются маутнеровские нейроны (МН) низших позвоночных, наиболее изученные парные нервные клетки головного мозга (Stefanelli, 1951;
Сахаров, 1961;
Diamond, Huxley, 1971;
Мошков, 1985;
Zottoli, Faber, 2000). Преимущества МН связаны с их свойствами: большим размером;
разделением зрительного и статоакустического входов на вентральном и латеральном дендритах;
наличием электрического и химического типов межклеточной коммуникации. Эти нейроны предоставляют исключительную возможность исследовать морфологические изменения при различных сенсорных и фармакологических воздействиях, структурные признаки модификации функции под влиянием повторной сенсорной или электрической стимуляции, рассматриваемых как следы памяти. Считается, что памятный след может проявляться как «количественное изменение» (рост числа отростков, синапсов) или как «качественное изменение» в уже существующих нейронах и синапсах (Виноградова, 2000;
Thompson, 2000).
Ультраструктурные механизмы адаптации и памяти принято объяснять через центральное понятие - свойство пластичности или долговременной изменчивости нейронов (Конорски, 1970), необходимое для выживания организма. Существенно, что пластичность МН проявляется в адаптации, естественной формы памяти, и в условиях длительной потенциации, модельной ее формы (Мошков и др., 2003). Оба феномена реализуются на синаптическом уровне. Согласно предложенной гипотезе (Мошков, 1985), адаптация МН к длительной стимуляции достигается через сокращение площади проводящей части - активной зоны - в химических синапсах, величина которой регулируется десмосомоподобными контактами при изменении состояния примебранного цитоскелетного белка актина. Проблема цитоскелетной регуляции эффективности синаптической передачи изучена недостаточно и нуждается в дополнительной разработке, а сама гипотеза – в проверке. Актуальность таких исследований несомненна. Они приближают объяснение высших функций мозга активностью нервных клеток, делают реальной морфологическую диагностику функционального состояния нейронов и синапсов, помогают в поиске путей коррекции возникших изменений и патологий.
Еще одна проблема функциональной нейроморфологии, где использование МН перспективно – исследование морфологических признаков латерализации мозга, проявляемой в поведении животного. Зеркальная симметрия в расположении двух клеток и функциональные свойства дают возможность изучать их роль не только в инициации реакции избегания (Zottoli, 1977;
Nissanov et al., 1990;
Eaton et al., 2001;
Korn, Faber, 2005), но и в осуществлении спонтанных поворотов тела рыбки (ориентировочной реакции) и в латерализации свободного поведения. Ранее о существовании моторной асимметрии у рыбок вообще не предполагали.
Цель и основные задачи исследования Целью работы было определение вызванных сенсорной стимуляцией и фармакологическим воздействием морфологических изменений, которые можно рассматривать как структурные элементы механизмов регулирования интегративной деятельности маутнеровских нейронов, проявляемой в поведении золотой рыбки. Особое внимание уделяли участию цитоскелетного актина в регуляции эффективности химической синаптической передачи и в интеграции различных синаптических влияний. Центральным вопросом было выяснение роли маутнеровских нейронов в осуществлении специфической формы спонтанного поведения рыбки.
Основные задачи
:
1. Исследовать структурные характеристики функциональных состояний маутнеровских нейронов (МН) при деафферентации и естественной стимуляции вестибулярного аппарата, а также аппликации на МН колхицина и блокаторов химических синапсов, в том числе фаллоидина.
2. Изучить структуру специализированных контактов в синапсах адаптированных МН при воздействии цитохалазина D и этанола, деполимеризующих актин.
3. Разработать методологию исследования различных функциональных состояний одних и тех же МН по поведению золотой рыбки, по амплитуде электрического ответа in vitro, по их ультраструктуре.
4. Определить адекватность прямого и непрямого методов оценки функциональной активности МН in vivo и in vitro.
5. Разработать и реализовать подход к выявлению в ядах членистоногих биологически активных веществ, обладающих цитоскелетным действием.
6. Провести морфофункциональные исследования МН при действии идентифицированного полимеризующего актин пептида из яда скорпиона.
7. Исследовать моторную асимметрию золотой рыбки и морфологическую асимметрию МН. Определить изменчивость асимметрии под влиянием различных экспериментальных воздействий.
Научная новизна исследования 1. Впервые разработан и применен комплексный подход к исследованию функционального состояния МН на организменном, клеточном и субклеточном уровне. Данный подход включает количественное описание поведения одних и тех же рыбок в норме, после естественной стимуляции вестибулярного аппарата или аппликации биологически активных веществ, затем выделение срезов мозга, содержащих МН, и определение их электрической активности микроэлектродной техникой, и в заключение изучение ультраструктуры любой части МН.
2. Впервые определено, что в основе адаптации МН, вызванной повторной естественной стимуляцией (тренировкой), лежит длительная депрессия химических синапсов, модельная форма синаптической пластичности. Ее структурным механизмом является уменьшение площади активных зон и реципрокное увеличение десмосомоподобных контактов, построенных из актина. Установлено, что стабильностью полимерной формы актина определяется функциональная и структурная устойчивость адаптированного состояния МН.
3. Охарактеризованы интактное, адаптированное и утомленное функциональные состояния МН с использованием косвенной (по поведению рыбок) и прямой (по электрической активности) регистрации.
Соответствие полученных результатов позволяет, не прибегая к вживлению микроэлектродов, описывать гистологические и ультраструктурные изменения как корреляты определенных электрофизиологических характеристик МН.
4. Установлено, что золотые рыбки и их МН служат адекватным объектом для идентификации в составе яда паукообразных физиологически активных веществ, специфически взаимодействующих с актином.
5. Впервые у мальков золотой рыбки выявлены асимметрия моторного поведения и структурная асимметрия МН. Корреляция между ними указывает на МН как возможный центр поворотов рыбки.
Научно-практическое значение Комплексными исследованиями показано, что, используя МН костистых рыб можно проводить изучение веществ с точки зрения их нейротропной, нейротоксической и цитотоксической активности, а также выявлять их активность по отношению к актиновому цитоскелету. Разработана методика скрининга биологически активных веществ, в основе которой проведение исследований на МН in vivo и на выделенном актине in vitro. Применение методики позволило идентифицировать в яде скорпиона однородный нетоксичный пептид, полимеризующий актин, и пептиды, деполимеризующие актин, пригодные для изучения роли актинового цитоскелета в различных физиологических проявлениях клеток и тканей.
Разработанный нами подход к морфофункциональному исследованию МН с помощью аппликаций физиологически активных веществ может быть полезным в поиске новых препаратов как потенциальных лекарственных средств для неврологических целей.
В целом, полученные результаты можно использовать в исследовании других нейронов, нервных центров и целостного мозга. Они представляются полезными для диагностики функциональных и патологических состояний, выявления нарушений когнитивных процессов мозга и для выработки путей их профилактики или коррекции.
Апробация работы Материалы исследования были представлены: на Международном симпозиуме «Signal molecules and mechanism of animal behavior» (Пущино, 1989);
на III Симпозиуме «The cytoskeleton» (Weimar, Германия, 1990);
на «Soviet-Indian Symposium on Neurotransplantation and Developmental Neurobiology» (Пущино, 1991);
на Международном рабочем совещании “Intracellular communication” (Пущино, 1994);
на Конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция» (Пущино, 2000);
на Конференции «Научные исследования в Наукоградах Московской области» (Пущино, 2001);
на II и III Съездах биофизиков России (Москва, 1999;
Воронеж, 2004);
на Международном междисциплинарном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии интегративная медицина» (Хургада, Египет, 2004);
на Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001;
Москва, 2004;
2007;
Екатеринбург, 2005);
на семинарах, проведенных на научно исследовательской станции «Петница» (г. Вальево, Сербия и Черногория, 2005);
на Международных симпозиумах «Biological motility: New Trends in Research» (Пущино, 1994, 2001, 2004);
на научной конференции «Нейрохимия:
фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005);
на Съезде Физиологов Стран СНГ (Дагомыс, Сочи, 2005);
на Международных конференциях «Проблемы нейрокибернетики» (Ростов-на-Дону, 2002, 2005);
на Конференции по нейронаукам «Нейронауки: теоретичнi та клiничнi аспекти»
(Донецк, Украина, 2005);
на Международных конференциях по функциональной нейроморфологии («Колосовские чтения» – 1992, 1997, 2002, 2006, Санкт Петербург).
Материалы опубликованы в печати в виде тезисов.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 228 страницах, включает 37 рисунков, 15 таблиц. Список литературы содержит 325 ссылок.
ОБЪЕКТЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Работа проведена на мальках золотой рыбки (Carassius auratus L.) пород шубункин и вакин (вес около 2г, длина 2.5-3см, возраст 3-4мес) и их маутнеровских нейронах (МН). В некоторых экспериментах использовали 10-ти дневных мальков рыбки-зебры (Brachydanio rerio) и головастиков шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) на стадиях 21, 47, 50 и 52 по Ньюкупу и Фаберу (Хоперская, 1974), уделяя главное внимание МН.
Воздействия на вестибулярный аппарат. Использовали физиологическую модель утомления и адаптации к нему. Утомление МН (частичное или полное до их дисфункции) вызывали естественной длительной стимуляцией рецепторов октаво-латеральной и зрительной систем, вращая рыбок в течение 2час вокруг ростро-каудальной и дорзо-вентральной осей тела в специальной установке. Адаптацию, т.е. резистентность МН к утомлению, индуцировали в этой же установке с помощью ежедневной дозированной стимуляции в тренировочном режиме. Использовали 15сут и 30сут режимы адаптации с постепенно возрастающей продолжительностью воздействия.
Уровень адаптации оценивали через 4сут по завершении тренинга, подвергая рыб длительной стимуляции, рассматриваемой как тест-стимуляция (Тирас и др., 1995).
Исследование роли вестибулярного аппарата в созревании структуры и функции МН проводили в трех аспектах. Для изучения влияния на МН дисфункции вестибулярного аппарата использовали развитие мальков рыб в условиях микрогравитации. Икру рыбки-зебры со стадии 5 сомитов инкубировали в невесомости на борту космической станции Салют 5. Через 10сут полета мальки были зафиксированы и на транспортном корабле Союз- доставлены на Землю. Контролем служила другая часть икры, развивавшаяся в условиях наземной лаборатории. Эта часть работы проведена совместно с Л.Р.
Пальмбахом (Институт общей генетики, РАН). Для изучения влияния на развитие МН гиперфункции вестибулярного аппарата головастиков шпорцевой лягушки выращивали в центрифуге в условиях силы тяжести в 2.9g до стадии метаморфоза. Опыты проводились совместно с сотрудницей нашей лаборатории Л.Н. Савельевой и сотрудницей Института медико-биологических проблем РАН О.И. Голубевой. Для исследования влияния на МН вестибулярной денервации у зародыша шпорцевой лягушки на 21 стадии развития удаляли справа задний мозговой пузырь. Контрольных и подопытных головастиков выращивали и изучали на 50-52 стадиях. Эту часть работы выполняли на кафедре эмбриологии МГУ совместно с Е.Н. Калистратовой.
Функциональную активность МН в хронических экспериментах определяли косвенно по количеству поворотов, совершаемых золотой рыбкой в кольцевой камере (Мошков и др., 1982). Прямое определение активности МН проводили в электрофизиологических экспериментах (совместно с П.И.
Пахотиным, Институт биофизики клетки РАН) по разработанной нами методике морфофункциональных исследований МН во фрагменте продолговатого мозга in vitro (Moshkov et al., 1996, 1998). В инкубированном срезе регистрировали экстраклеточную активность одного из МН на ортодромные стимулы (прямоугольные импульсы 50-500мкА, 0,2мс). Для утомления МН использовали 2час раздражение VIII нерва пачками из десяти прямоугольных импульсов 500мкА с частотой 20Гц и чередованием пачек 0,5Гц. Восстановление ответов проверяли в течение 2час по завершении стимуляции, раздражая МН одиночными ортодромными стимулами.
Фармакологические воздействия. Исследование влияния этанола на выработку адаптации рыбок проводили по схеме 30сут тренинга. После каждой тренировки рыб содержали в 2% растворе этанола до потери основных рефлексов (Faber, Klee, 1976).
Аппликации препаратов на МН проводили под оптическим контролем на тающем льду после анестезии рыбок в воде с температурой 6о-7оС по разработанному нами методу (Тирас, Мошков, 1978). Эффективные дозы препаратов и время проявления их эффекта определяли в предварительных экспериментах. Объем вводимой жидкости составлял 5мкл. Контрольным группам апплицировали, как правило, среду разведения препаратов – физраствор или дистиллированную воду. Использовали следующие дозы веществ на 1г массы тела золотой рыбки: колхицин 10-45мкг, апамин 25мкг, бикукуллин 1-12.5мМ, бензилпенициллин натрия 1-25мкМ, цитотоксин II из яда среднеазиатской кобры 2.5мкг;
фаллоидин 10-20мкг, цитохалазин D 12.5 мкг с добавлением 0.1% DMSO, каиновая кислота 2.5мкг.
Яды членистоногих, их фракции и состав исследовали совместно с В.Н.
Пашковым и С.А. Козловым (Институт биоорганической химии РАН) с помощью соответствующих методик (Laemmli, 1970;
Коваленко и др.,1981;
Kozlov et al., 2000). Аппликации ядов осуществляли в следующих дозах (мкг/г): черного скорпиона (Orthochirus scrobiculosus) - 0.03;
тарантула южнорусского (Licosa singoriensis) - 6;
степного паука (Segestria florentina) - 0.7;
домашнего паука (Tegenaria domestica) - 7.5;
сколопендры кольчатой (Scolopendra singulata) – 6.
Аппликации фракций яда скорпиона проводили в дозах (мкг/г): 5-ая – 0.002;
6 ая, 8-ая, 9-ая по 0.006;
пептид 7а – 0.2 и 0.3.
Взаимодействие пептидов яда скорпиона и актина in vitro. Эту часть работы выполняли совместно с сотрудником нашего института С.Н.
Удальцовым. Актин в глобулярной (Г-) форме выделяли из скелетных мышц кролика по стандартному методу (Spudich, Watt, 1971). Полимеризацию актина пептидами яда проводили в условиях инкубирования Г-актина с фракцией 6, затем - с каждой из ее девяти субфракций (в присутствии 20мМ KCl). После обнаружения активности в одной из субфракций и ее разделения на компонентов, каждый инкубировали с актином в эквимолярных соотношениях (1М) в присутствии 10мМ KCl. В качестве контроля в тех же условиях Г-актин полимеризовали фаллоидином или 100мМ KCl. Исследование взаимодействия актина и фракции 9 яда и ее 4-х компонентов проводили в двух сериях экспериментов. В одной серии изучали их свойство деполимеризовать филаментозный (Ф-) актин. В контроле инкубировали Ф-актин с цитохалазином D или с пептидами из неактивной фракции 8 (как плацебо). В другой серии изучали способность компонентов этой фракции предотвращать полимеризацию Г-актина, вызванную добавлением в среду 100мМ KCl.
Инкубационные пробы изучали в электронном микроскопе методом негативного контрастирования (Galkin et al., 2001).
Асимметрию моторного поведения определяли, анализируя движение рыбок в прямолинейном узком канале (Михайлова и др., 2005;
2006).
Коэффициент моторной асимметрии вычисляли как отношение числа поворотов вправо или влево к суммарному числу поворотов. Для направленного изменения моторной асимметрии применяли следующие воздействия. 1). Длительное вращение рыбок по часовой стрелке или против нее вокруг ростро-каудальной оси тела. При этом предварительно было установлено, что преимущественно стимулируется нейрон, расположенный контралатерально относительно предпочитаемой стороны поворота.
Применяли также дозированный ежедневный тренинг, вызывающий адаптацию МН к такой стимуляции. 2). Билатеральное вращение в двух плоскостях и индукцию адаптации к нему. 3). Ипсилатеральную и контралатеральную (относительно стороны поворота) деафферентацию вестибулярного и зрительного входов - разрушение рецепторной выстилки вестибулярного аппарата и энуклеацию глаза.
Трехмерная реконструкция МН выполнена по серийным гистологическим фронтальным срезам продолговатого мозга толщиной 3мкм с блоков ткани, фиксированной и обработанной для электронной микроскопии. Срезы фотографировали при увеличении 120х цифровым аппаратом, установленным на световой микроскоп Nu-2E (Carl Zeiss). На изображениях обводили контуры частей МН. Выравнивание срезов, трехмерные изображения и количественные данные объемов частей МН получали с помощью соответствующих компьютерных программ. Автор благодарен за их предоставление В.И. Попову (Институт биофизики клетки РАН). Морфологическую асимметрию МН выражали в виде коэффициента структурной асимметрии, который вычисляли как отношение объема контралатерального нейрона (суммы объема сомы, объемов латерального и вентрального дендритов до мест бифуркации и объема начального сегмента аксона) к сумме объемов обоих нейронов. Для определения взаимосвязи моторной асимметрии золотой рыбки и структурной асимметрии ее МН вычисляли коэффициент корреляции между коэффициентами моторной и структурной асимметрии.
Электронная микроскопия. Продолговатый мозг фиксировали в формальдегид-глутаральдегидном фиксаторе на какодилатном буфере с диметилсульфоксидом (Picard, 1976), затем в 2% растворе четырехокиси осмия в том же буфере, обезвоживали в спиртах и ацетоне, заливали в эпон и резали фронтально на серийные срезы толщиной 10мкм (рис. 1,а). Обнаружение МН проводили без дополнительной окраски срезов. Каждый интересующий нас срез переклеивали на другой блок и резали ультратонко на ультрамикротоме LKB-3 (рис. 1,б): центральные срезы МН, содержащие ядро и ядрышко, - для изучения ультраструктуры афферентных химических синапсов (рис. 2,а), а срезы дистальной части латерального дендрита - для изучения смешанных синапсов (рис. 2,б). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца (Гайер, 1974) и фотографировали при увеличении 14000 18000х в электронных микроскопах JEM-100B и TESLA BS-500.
Морфометрический анализ. Измерения специализированных контактов синапсов, проведенные на экране фотоувеличителя Микрофот (Carl Zeiss) или на мониторе компьютера, обрабатывали с помощью специальной программы морфометрического анализа изображений, позволяющей оценивать линейные размеры и площади исследуемых объектов (разработка сотрудника нашего института А.А. Деева). Достоверность отличий определяли по t-критерию Стьюдента. При исследовании асимметрии использовали тест ANOVA и корреляционный анализ.
А С АЧ С а б Рис. 1. Фронтальные срезы МН золотой рыбки;
а – гистологический срез (об - х20, ок - х10), б – ультратонкий срез (х3000). С – сома;
А – аксон;
АЧ – аксонная чаша.
ДПК ДПК ЩК ДПК АЗ б а Рис. 2. Специализированные контакты в афферентных синапсах МН: а – в синапсе химического типа - активная зона (АЗ) и десмосомоподобный контакт (ДПК);
б – в синапсе смешанного типа - десмосомоподобный и щелевой контакт (ЩК). Для морфометрического анализа измеряли протяженности всех контактов. У десмосомоподобных контактов (даны при большем увеличении) определяли площадь электронноплотного вещества. Масштабный отрезок 1мкм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфологические характеристики МН при изменении их функции специфическим воздействием на синапсы и цитоскелет Изменение сенсорного притока от вестибулярного аппарата Длительная вестибулярная стимуляция вызывает состояние утомления МН (рис. 3). Оно характеризуется неподвижностью рыбок и уменьшением в 4- раз (в разных опытах) количества совершаемых ими поворотов.
Ультраструктурные последствия утомления МН носят деструктивный характер, они достаточно полно изучены традиционными методами электронной микроскопии (Мошков, 1985) и здесь рассматриваться не будут. Учитывая наш особый интерес к афферентным синапсам и цитоскелету МН, отметим следующее. При утомлении синаптические окончания сильно опустошаются (рис. 4), изменения в активных зонах и десмосомоподобных контактах, производных цитоскелета, отсутствуют, а характерные для интактного состояния актиновые волокна в цитоплазме, выявляемые декорацией филаментного актина субфрагментом 1 миозина, исчезают (Павлик и др., 1997а). В ядре волокна сохраняются, но переориентируются в соответствии с его удлинением после стимуляции. Описанные изменения цитоскелета МН соответствуют значительному снижению в них содержания актина (Янюшина и др.,1992) и могут быть связаны с действием избыточного афферентного притока при истощающей активации возбуждающих синапсов.
в % к исходному значению число везикул в синапсе Контроль Адаптация 80 Стимуляция Колхицин Фаллоидин Апамин 0 1 2 4 6 10 час И ДС К Кх Рис. 4. Число везикул в синапсах Рис. 3. Изменение двигательной активности МН: И - интактные, К - контроль, золотых рыбок после адаптации, длительной ДС - длительная стимуляция, Кх стимуляции и специфических фармакологических аппликация колхицина.
воздействий на МН.
Менее разработаны вопросы повышения устойчивости к утомлению МН и недостаточно исследованы ее структурные механизмы. Об этом ниже.
При морфологической целостности вестибулярного аппарата, но в условиях его длительной дисфункции (в невесомости) отмечается задержка выклева личинок из икры, связанная с запаздыванием функционального созревания МН:
известно, что выклев требует унилатерального изгиба хвоста, который инициируется активацией МН. Морфология МН рыбок, развившихся на орбите и на Земле, оказалась в основном схожей. Однако в цитоплазме МН подопытных рыбок встречаются преимущественно нейрофиламенты и отсутствуют микротрубочки, типичные для МН неполовозрелых рыб наземной группы.
Эти данные показали участие цитоскелета в изменении функциональной активности МН.
В опытах по денервации в отсутствие СПЦ отолитов и полукружных каналов развившиеся личинки мало плавают, в основном находятся на дне сосуда, что ЭПР является проявлением дисфункции МН. В цитоплазме МН появляются протяженные субповерхностные цистерны (рис. 5), ретикулум набухает, цитоскелет Рис. 5. Субповерхностные цистерны выявляется плохо. Развитие головастиков (СПЦ) в МН головастика шпорцевой шпорцевой лягушки в условиях лягушки после удаления заднего повышенной силы тяжести в основном мозгового пузыря. ЭПР – протекает нормально, но опережает эндоплазматический ретикулум.
развитие контрольных животных в среднем Масштаб 1мкм.
на две стадии. Головастики подопытных групп на всех исследованных стадиях развития проявляют устойчивость к длительной стимуляции. Созревание МН характеризуется усложнением структуры ретикулума и его производных, субповерхностных цистерн, и уплотнением сети нейрофиламентов. В синапсах обнаружено уменьшение доли синаптического контакта, занятой активными зонами. При сочетании действия гравитации и вестибулярной стимуляции размер активных зон вновь становится близким к контрольному значению. Эти факты, по-видимому, указывают на включение структурного адаптивного механизма и вовлечение в него активных зон.
Данные свидетельствуют о том, что воздействия на вестибулярный аппарат влияют на поведение животного и на структуру МН. О корреляции между состоянием МН и способностью рыбок совершать спонтанные повороты свидетельствуют опыты по денервации МН и специфической блокаде афферентных синапсов.
Специфические фармакологические влияния на афферентный синаптический аппарат МН Эффект аппликации на МН колхицина (его действие аналогично денервации), как и эффект длительной стимуляции заключается в подавлении функции химических синапсов (рис. 3). О том же свидетельствует уменьшение популяции везикул в аксонных окончаниях (рис. 4), которое, в отличие от действия стимуляции, не сопровождается изменениями ядра и органоидов цитоплазмы. Угнетение функции МН вызывает также цитотоксин II яда кобры, индуцирующий массированный выброс медиаторов. При этом изменение функции МН сопровождается сильным опустошением синаптических бутонов.
Помимо такого эффекта на синапсы наблюдается значительное просветление цитоплазматического матрикса из-за деструкции цитоскелета (Moshkov et al.,1990).
Блокада процессов торможения веществами - антагонистами ГАМК, бикукуллином, пенициллином, а также апамином, полипептидом, выделенным из яда пчелы, вызывает судорожное безостановочное движение рыбок (рис. 3).
В цитоплазме МН наблюдается вакуолярная дистрофия и увеличение числа субповерхностных цистерн в постсинаптических отделах аксосоматических синапсов определенного типа, имеющих только одну специализацию в области прилегания бутона - активную зону (рис. 6). В таких синапсах отсутствуют десмосомоподобные контакты и цитоскелет.
Под другими синапсами, которые содержат активные зоны и десмосомоподобные контакты, субповерхностные цистерны встречаются редко, а цитоскелет в виде микротрубочек, нейро- и микрофиламентов развит хорошо. Появление субповерхностных АЗ СПЦ цистерн только под синапсами без цитоскелета и без десмосомоподобных контактов привело нас к предположению, что Рис. 6. Химический синапс после подобные синапсы являются тормозными, а действия апамина. СПЦ синапсы, которые имеют эти структуры и не субповерхностная цистерна АЗ – активная зона. Масштаб 1мкм.
затрагиваются действием блокаторов торможения – возбуждающими.
Применение нами техники объемной реконструкции афферентных синапсов по серии ультратонких срезов подтвердило обоснованность такой классификации синапсов МН (Мошков, Тирас, 1987;
Тирас, Мошков, 1987).
Иммуноцитохимическое исследование тормозных синапсов МН также показывает, что они не содержат десмосомоподобных контактов (Triller, Korn, 1991).
Определение типа синапса по специализированным контактам, структура которых не зависит от способа фиксации, оказалось адекватным также для возбуждающих булавовидных окончаний смешанного типа на латеральном дендрите МН, содержащих десмосомоподобные контакты, и для синапсов ЦНС высших животных. Например, аксо-дендритные возбуждающие синапсы в нижнем молекулярном слое мозжечка морской свинки и крысы отличаются от тормозных аксосоматических синапсов на клетках Пуркинье десмосомоподобными контактами рядом с активными зонами в своем прилегании (Тирас и др., 1988). В нашей дальнейшей работе исследовали главным образом возбуждающие синапсы, соответствующие этому критерию.
Воздействие препаратами, влияющими на актиновый цитоскелет Цитоскелет интактных МН состоит из трех элементов, представленных в различных пропорциях в зависимости от отделов нейрона: микротрубочки встречаются крайне редко и, как правило, в области аксонного холмика, нейрофиламенты видны повсеместно, но превалируют в дендритах.
Микрофиламенты локализуются в цитоплазме соматической части клетки и в областях прилегания возбуждающих синапсов к цитоплазматической мембране МН в зоне десмосомоподобного контакта (Павлик и др., 2003).
Иммунофлуоресцентным методом показано, что ядро и цитоплазма содержат актин (Tiras et al., 1992). Декорация актина субфрагментом 1 миозина выявила локализацию полимерного актина в виде пучков волокон и кристаллоподобных образований в ядре и в виде отдельно лежащих одиночных нитей в цитоплазме МН (Павлик и др., 1997а).
Эффект цитохалазина D, деполимеризующего актин, заключается в снижении функциональной активности МН (Рис. 12). Падение активности сопровождается просветлением матрикса МН, уменьшением осмиофильности десмосомоподобных контактов, потерей ими части волокнистого материала, просветлением их щели без существенного изменения их протяженности.
Аппликация фаллоидина, который необратимо полимеризует и стабилизирует актин без нарушения его свойств (Виланд, Фаульштих, 1978), приводит к необратимому угнетению функции МН (рис. 3), напоминающему действие длительной стимуляции и колхицина. В цитоплазме МН после декорирования актина появляются пучки длинных волокон (Павлик и др., 1997,б), стресс-волокна, имеющие прямолинейную или более сложную форму и состоящие из спирализованного и гомогенного участков. В химических возбуждающих синаптических окончаниях (рис. 7) уменьшается длина сечения активных зон, места секреции медиатора, и увеличивается длина десмосомоподобных контактов (Moshkov et al., 1980).
Данные косвенно показали, что актин входит в состав десмосомоподобных контактов. Затем этот факт был прямо подтвержден с помощью выявления актина меткой фаллоидин - коллоидное золото (Павлик и др., 2003).
Увеличение длины десмосомоподобных контактов, по-видимому, отражает возрастание содержания Ф-актина в примембранных областях.
Токсичность фаллоидина, необратимость действия и медленное К Фал проникновение в нейроны затрудняют его использование как инструмента для длина, нм изучения роли актина в нейроне. Тем не К Фал менее, удалось определить направление поиска путей защиты нейронов от утомления фармакологическими способами. Так, при совместном действии фаллоидина и стимуляции структура МН практически не АЗ ДПК повреждается, что мы связываем со Рис. 7. Размер активных зон (АЗ) и десмосомоподобных контактов стабилизацией актинового цитоскелета (ДПК) в контроле (К) и под фаллоидином и престройкой действием фаллоидина (Фал).
специализированных контактов.
Уменьшение размера активных зон вследствие аппликации фаллоидина на МН (рис. 3) снижает афферентный приток. Только этим, по-видимому, и можно объяснить необратимое угнетение способности рыбок совершать повороты. Фактически этот препарат блокирует проведение сигнала в химических возбуждающих синапсах МН.
Данные этой части работы показывают, что все примененные воздействия на афферентный синаптический аппарат и цитоскелет МН изменяют поведение рыбок и ультраструктуру их МН. При утомлении в значительной степени повреждаются практически все клеточные компоненты. Утомление МН предотвращается фаллоидином. Учитывая, что денервация МН колхицином и длительная стимуляция сопровождаются уменьшением числа поворотов рыбок и уменьшением числа везикул в синапсах, и что функциональная депривация, вызывая угнетение поведения, коррелирует со специфическими изменениями ультраструктуры, можно предположить, что МН вовлекаются в инициацию спонтанно осуществляемых поворотов рыбок.
Количественная оценка этого поведения была использована нами как косвенный тест функционального состояния МН.
Структурная характеристика пластичности МН Одним из способов повышения структурно-функциональной устойчивости МН к утомлению являются повторные сенсорные воздействия в виде специализированного тренинга, формирующие адаптированное состояние (Мошков, 1985). Ранее было определено, что в основе адаптации лежат реципрокные длительные изменения протяженности специализированных контактов в химических синапсах: уменьшение длины активных зон и увеличение длины десмосомоподобных контактов. Предполагалось, что десмосомоподобные контакты могут быть структурами, которые регулируют размеры активных зон в возбуждающих синапсах. Они всегда располагаются вблизи (по краям) активных зон (Тирас, Мошков, 1987;
Uchida et al., 1996) и, как ранее нами показано (Moshkov et al., 1980;
Тирас и др., 1988), изменяются реципрокно с активными зонами при экспериментальных воздействиях, в частности, под действием фаллоидина. Наличие в десмосомоподобных контактах Ф-актина в виде примембранных осмиофильных уплотнений подсказало подход к исследованию роли этих контактов в функционировании синапсов путем избирательного влияния на актин с оценкой формирования и устойчивости адаптации.
Влияние цитохалазина D на адаптированное состояние Цитохалазин D снижает функциональную активность не только интактных, но и адаптированных МН (рис. 12,16) и повреждает их ультраструктуру.
Изменения заключаются в локальном уменьшении осмиофильности волокнистого материала десмосомоподобных контактов со стороны цитоплазмы и в просветлении А длина структур, нм их щели. При этом протяженность десмосомоподобных контактов А А+Цх снижается почти в 1.5 раза (рис. 8), а 200 А+Цх отношение протяженности к длине аксосоматического контакта сокращается почти в 2.5 раза, приближаясь к величине, характерной для МН неадаптированных рыбок. ДПК АЗ Размер активных зон принимает прежнее контрольное значение. Эти Рис. 8. Размеры активных зон (АЗ) и данные хорошо согласуются с десмосомоподобных контактов (ДПК) адаптированных МН (А) и после предложенной нами гипотезой о аппликации на них цитохалазина D цитоскелетном регулировании размера (А+Цх).
активных зон с помощью десмосомоподобных контактов.
Влияние этанола на формирование адаптированного состояния Эффект этанола, который согласно биохимическим данным влияет на превращения актина в клетке (Моженок и др., 1992), заключается в угнетении функции МН, а его действие в сочетании с каждой тренировкой понижает способность рыбок к адаптации (рис. 9). Такие рыбки лучше переносят тест стимуляцию, чем нетренированные рыбки, но гораздо хуже, чем адаптированные.
число поворотов длина ДПК, нм 0 И Эт А А+Эт И Эт А+Эт А Рис. 9. Двигательная активность рыбок до Рис.10. Размеры десмосомоподобных (столбик слева) и после (столбик справа) тест- контактов (ДПК) химических синапсов стимуляции. Интактный контроль (И), этанол МН интактных и подопытных рыбок.
(Эт), адаптация (А), эффект тренировок и Обозначения те же, что и на рис. 9.
этанола (А+Эт).
При действии этанола и при сочетании действия этанола и тренировок морфометрический анализ выявил увеличение длины профиля прилегания синапса к соме МН. Размер десмосомоподобных контактов, свойственный адаптации, при сочетании воздействий не достигается, по-видимому, из-за того, что этанол сам по себе уменьшает длину этих контактов (рис. 10).
Протяженность профилей активных зон во всех экспериментальных группах мало отличается от контрольных значений. В цитоплазме МН подопытных рыбок пропадают стресс-волокна, формируются инвагинации плазматической мембраны с субповерхностными цистернами в пространство между аксонными окончаниями (рис. 11) и в сами окончания. Факт подавления этанолом увеличения десмосомоподобных контактов, вызванного тренировками и факт дезадаптации рыбок также вписываются в гипотезу о роли цитоскелетного актина в функционировании МН.
Вместе с тем, цитоскелетные процессы, лежащие в основе адаптации, настолько стабильны, что этанол не может их полностью прервать. Заключение о том, что этанол влияет на десмосомоподобные контакты из-за непосредственного взаимодействия с актином, подтверждают ЦВ также модельные эксперименты: он ЦВ уменьшает протяженность актиновых нитей и препятствует полимеризации Г-актина под действием высоких концентраций хлорида Рис. 11. Ежесуточное действие калия.
этанола и тренировок.
Полученные нами данные имеют ЦВ – цитоплазматический вырост.
фундаментальное значение для понимания Масштаб 1мкм.
принципов функционирования синапсов, и позволяют также взглянуть с новой стороны на проблему возникновения алкогольной интоксикации и проблему алкоголизма в целом.
Влияние каиновой кислоты на адаптированное состояние О большой прочности цитологических механизмов, лежащих в основе адаптации, свидетельствуют результаты действия на МН токсичного структурного аналога возбуждающего медиатора глутамата - каиновой кислоты.
Ее аппликация на МН интактных рыбок вызывает чередование периодов гиперактивности и неподвижности. Этому состоянию соответствует значительное уменьшение размеров нейронов, сопровождающееся уплотнением их матрикса, деструкцией цитоскелета, который представлен сетью коротких тонких густо расположенных фибрилл, при этом микротрубочки, нейрофиламенты и микрофиламенты не идентифицируются. В синаптических бутонах деградируют везикулы: становятся мелкими, склеиваются, опушаются.
Просвет между пресинаптическим и постсинаптическим участком мембран сужается, несинаптические участки плазматических мембран соседних бутонов претерпевают липоидное перерождение. Таким образом, генерализованное возбуждение, вызванное этим нейротоксином, которое сильно утомляет МН, имеет четкую структурную основу в виде сильной деструкции клетки.
Влияние каиновой кислоты на МН адаптированных рыбок менее драматично. В целом наблюдается существенно меньшее сжатие нейронов.
Цитоплазматический матрикс остается светлым, отчетливо видны нейро- и микрофиламенты, расстояние между ними увеличивается. Отсутствуют липоидные перерождения плазматических мембран синаптических окончаний.
Это доказывает, что стабилизация цитоскелетных актиновых элементов под действием тренировочной стимуляции является одним из механизмов защиты МН от последующего нейротоксического действия каиновой кислоты.
Разработка комплексного подхода к исследованию функционального состояния МН по поведению рыбки, электрофизиологической активности и ультраструктуре Решение вопроса о роли МН в естественном поведении рыб связано с доказательством того, что МН действительно активируются при спонтанном повороте тела. Можно вживлять в район локализации МН микроэлектроды и дистантно наблюдать за активностью, проявляемой в различных экспериментах. Этот вариант возможен в случае работы на крупных рыбах и только при электрической стимуляции МН (Korn, Faber, 2005), и не применим при исследовании мальков золотых рыбок размером 3-5 см, используемых в нашей работе. Мы разработали другой способ. Сначала изучается поведение рыбки до и после прямого воздействия на МН. При этом функциональное состояние нейронов оценивается по числу совершенных ею поворотов, т.е. по «МН-специфичному» поведению. Далее у тех же рыбок исследуются электрофизиологические характеристики МН техникой экстраклеточной регистрации электрической активности. Причем, активность МН изучается in vitro по разработанной нами методике переживающих срезов, адекватной для изучения морфологических (гистологических и ультраструктурных) коррелятов функциональных состояний, индуцированных тем или иным воздействием (Мошков и др., 1996;
1998;
Moshkov et al., 1998;
Тирас и др., 2002;
2003).
Косвенное и прямое определение функционального состояния МН Косвенное определение активности МН интактных рыбок по поведению показало, что в результате длительной стимуляции она снижается почти в 6 раз (рис. 12,а). Поведение адаптированных рыбок после такой же стимуляции практически не меняется.
1 2 И число поворотов 3 Ф Цх А И А Ф6 Цх а б Рис. 12. Косвенное и прямое определение функционального состояния МН;
а – по двигательной активности рыбок, б – по электрическим ответам инкубируемых нейронов этих же рыбок. Столбик слева – двигательная активность до тест стимуляции, столбик справа – после нее. 1, 2, 3 – ответы МН до электрической стимуляции, сразу после ее прекращения, через 1час, соответственно. И – интактные рыбки (нейроны), А – адаптированные;
Ф6, Цх – после аппликации на МН фракции яда скорпиона и цитохалазина, соответственно.
Определение активности МН микроэлектродной техникой (рис. 12,б) показывает, что амплитуда вызванного экстраклеточного ответа интактных или адаптированных нейронов в условиях инкубирования составляет около 4 мВ, как и их активность in vivo (Furshpan, Furukava, 1962). После электрической ортодромной стимуляции интактных МН амплитуда ответов тоже снижается в 6 7 раз и лишь частично восстанавливается в течение последующего часа. Таким образом, электрическая стимуляция и естественная стимуляция вызывают одинаковое утомление МН. Оценка состояния МН по поведению рыбки на фоне аппликации цитохалазина до и после естественной стимуляции (рис. 12,а) и на основании прямой регистрации ответов после аппликации цитохалазина и электрической стимуляции (рис. 12,б) свидетельствует о том, что активность нейронов снижается примерно на 40% и полностью не восстанавливается в течение 1час. Ответы МН адаптированных рыбок после такой же стимуляции практически не меняются, как и после воздействия на МН фаллоидина, которое изучалось в нашей лаборатории (Дзебан и др., 2003;
Павлик и др., 2003).
Видно, что и поведенческий тест и оценка электрической активности показывают резистентность нейронов к утомлению.
Изменения функциональной активности МН коррелируют с качественными и количественными изменениями ультраструктуры (рис. 13). При инкубировании интактных МН она значительно повреждается. Обнаружены такие же изменения, какие наблюдаются при утомлении МН in vivo. Синаптические окончания сильно опустошаются и вакуолизируются. Вместе с тем десмосомоподобные контакты, активные зоны и щелевые контакты сохраняются хорошо. Электрическая стимуляция МН интактных рыб в процессе инкубации вызывает не только сильные повреждения органоидов цитоплазмы МН, но и совершенно разрушает десмосомоподобные контакты афферентных синапсов. В то же время электрическая стимуляция незначительно влияет на ультраструктуру МН адаптированных рыб. Синаптические окончания имеют интактный вид, нормальное наполнение везикулами, характерный цитоскелет и, что существенно, хорошую сохранность специализированных контактов, в том числе десмосомоподобных структур.
Рис. 13. Размеры контактов химических синапсов МН в разных опытах. В каждой паре длина структуры, нм столбиков величина активной зоны - слева, десмосомоподобной структуры 300 - справа. И – интактный контроль, ДС - длительная стимуляция, А – адаптация, А+ДС – сочетание тренировок и длительной стимуляции, 100 Фр.6 – аппликация фракции яда скорпиона, А+Цх – сочетание адаптации и аппликации цитохалазина D.
И ДС А А+ДС Фр.6 А+Цх Результаты показывают, что в исследованных случаях предполагаемая функция МН, которую оценивали с использованием косвенной методики регистрации, в количественном отношении соответствует оценке функции МН, полученной прямой методикой регистрации активности, и эти состояния МН имеют одинаковые ультраструктурные корреляты. Данные также свидетельствуют о высокой стабильности процессов, лежащих в основе адаптации и согласуются с представлением о том, что существенную роль в них играет актиновый цитоскелет.
Использование маутнеровских нейронов для поиска новых препаратов цитоскелетного действия Проявление функциональной активности МН в определенной форме поведения, присущая им пластичность в виде адаптации к утомлению, наличие в синаптических окончаниях десмосомоподобных контактов, диагностического маркера изменения актина и, одновременно, структурного регулятора проводимости синапсов, создает предпосылку для использования рыбок и МН в качестве уникального тест-объекта для скрининга веществ, влияющих на актиновый цитоскелет. Мы раньше других исследователей разработали подход к поэтапному комплексному исследованию их в этом качестве (Parng et al., 2002;
Hill at al, 2005). Он основан на стратегии прямого воздействия на актин десмосомоподобных контактов с оценкой структурно-функционального состояния МН (Мошков и др., 1979;
Тирас и др., 1998;
1999а, б;
Tiras et al., 1999). Для более яркого проявления эффекта используется сочетание аппликации препарата и естественной стимуляции, а для прямого доказательства цитоскелетного действия - оценка реакции с выделенным актином in vitro электронномикроскопическим методом негативного контрастирования.
Действие ядов членистоногих на функциональную активность МН Аппликации цельных ядов, как правило, дифференцированно снижают двигательную активность рыбок, и, соответственно, угнетают функцию МН (Тирас и др., 1999). Сравнение эффектов показывает, что нейротоксичность у яда тарантула отсутствует (его эффект идентичен изотоническому раствору), у яда паука степного и сколопендры проявляется в слабой, а у яда паука домашнего – в средней степени. Яд скорпиона проявляет нейротоксичность высокой степени, поэтому он выбран нами как наиболее перспективный для дальнейшего поиска (Тирас и др., 1999). Уже на этом уровне мальки золотых рыбок и их МН проявляют себя как адекватный объект для данного вида исследований и более удобный, чем классический – лабораторные мыши (Dehesa-Davila et al., 1996;
Parng et al., 2002), поскольку позволяют значительно сократить расход тестируемого препарата.
Действие яда скорпиона на морфофункциональные свойства МН Эффект яда проявляется сильнее при сочетании с длительной стимуляцией (рис. 14). Двигательная активность подопытных рыбок подавляется в меньшей степени, чем контрольных, и восстанавливается быстрее, хотя яд сам по себе угнетает функцию МН. Защитный эффект яда проявляется и на ультраструктурном уровне. Стимуляция подопытных рыбок не вызывает повреждений афферентных синапсов и цитоплазмы МН, которые наблюдаются после стимуляции интактных и контрольных рыбок. Через 1сут после стимуляции повреждения МН интактных и контрольных рыбок сохраняются, в то время как ультраструктура МН подопытных рыбок практически нормализуется.
Так как цельный яд состоит из множества компонентов, клеточную мишень его действия установить сложно. По ряду структурных признаков можно предположить, что их две. Одна из них - субповерхностные цистерны.
Пролиферация этих структур, увеличивающих кальций-аккумулирующую емкость клетки, вероятно, связана с блокадой натриевых каналов синаптических мембран, первичной мишени яда скорпиона (Martin, Couraud, 1995). Другой вероятной число поворотов мишенью яда является актиновый цитоскелет. После воздействия яда увеличивается число десмосомоподобных контактов, важного звена стабилизации структуры МН, выглядят они более осмиофильными, чем такие же структуры интактных и контрольных 1 2 МН.
Приведенные выше данные Рис. 14. Двигательная активность рыбок под позволили предположить, что в действием яда и тест-стимуляции. 1 - до стимуляции;
2 - сразу после;
3 – спустя составе яда скорпиона содержатся сутки. Левый, средний, правый столбик – компоненты, взаимодействующие с интактные, контрольные и опытные рыбки, нейрональным актином. Это соответственно.
предположение проверили, разделяя яд на фракции, субфракции и вещества, на каждом этапе тестируя их свойства взаимодействовать с актином десмосомоподобных контактов МН и с выделенным актином.
Влияние фракций яда на морфо-функциональные свойства МН Исследовали фракции 5, 6, 8, 9 (рис. 15). Остальные признаны неинтересными. Фракцию 5 составили низкомолекулярные пептиды и соли, фракцию 6 - пептиды молекулярной массой до 6 кДа, фракции 8 и 9 полипептиды от 12 до 45 кДа.
Исследуемые фракции воспроизвели отдельные свойства цельного яда. Так, 5-я проявила очень сильную токсичность, на порядок выше, чем у цельного яда, 6 я была в два раза менее токсична, а 8-я и 9-я оказались не токсичными.
Длительная стимуляция рыбок после аппликации фракций 5 и 8 угнетает двигательную активность Рис. 15. Профиль элюции яда черного скорпиона более чем в 5 раз. Она не восстанавливается даже через сутки (рис. 16,а). В то же время фракция 6 повышает резистентность МН, что свидетельствует о ее протекторном действии, сравнимом с влиянием тренировок и фаллоидина (Тирас и др., 1984;
Мошков, 1985). Аппликация фракции 9 на МН значительно угнетает их функцию, а в сочетании со стимуляцией активность МН еще более снижается, напоминая действие цитохалазина D (рис. 16,б).
Исследование экстраклеточной электрической активности МН после аппликации фракции 6 показывает, что амплитуда вызванных ответов составляет около 4 мВ, как в контроле и как при адаптации. После стимуляции она не уменьшается (рис. 12).
в % к исходному уровню в % к исходному уровню 100 80 60 40 20 0 И 5 6 8 9 Цх А 9 Цх1 Цх а б Рис 16. Двигательная активность неадаптированных (а) и адаптированных (б) золотых рыбок под действием препаратов и тест-стимуляции (светлые и темные столбики, соответственно).
И – интактный контроль;
А – адаптация;
5, 6, 8, 9, Цх – аппликация соответствующих фракций яда и цитохалазина;
Цх1 и Цх2 – 5 и 12 час после аппликации. Отличия значений до и после тест-стимуляции достоверны (за исключением адаптированных рыбок и рыбок, подвергнутых действию фракции 6).
Таким образом, фракции 6 и 9 оказывают на МН противоположные эффекты. Фракция 6 повышает устойчивость МН к утомлению. Фракция существенно снижает резистентность МН к утомлению, приобретенную в результате тренировок, т. е. разрушает адаптацию МН. Основываясь на сходстве физиологических эффектов фракции 6 и фаллоидина, а также фракции 9 и цитохалазина D, мы предположили, что фракция 6 может содержать компоненты, полимеризующие актин или стабилизирующие филаментный актин, а фракции 9 - полипептиды со свойствами цитохалазина D. Это предположение проверили ультраструктурными методами.
Ультраструктурная идентификация клеточной мишени фракций яда скорпиона После аппликации на МН фракции 6 в цитоплазме обнаруживаются стресс волокна в виде пучков нитей. Морфометрический анализ выявляет увеличение количества десмосомоподобных контактов: двухкратное возрастание их протяженности и площади электронно-плотного примембранного материала (рис. 17а,б). Одновременно эта фракция уменьшает на 22% и на 17%, соответственно, длину и количество активных зон. Идентичные изменения специализированных контактов наблюдаются при адаптации МН (рис. 17,г).
Более чем на четверть уменьшается также количество активных зон.
Существенно, что аналогичная гипертрофия и четкая выраженность этих контактов в химических синапсах выявляется также после аппликации на МН фракции 6 и последующей изоляции мозга и многочасовой инкубации его срезов in vitro.
Аппликация фракции 9 неравномерно ослабляет осмиофильность электронноплотного материала десмосомоподобных контактов (рис. 17,в).
После длительной стимуляции адаптированных нейронов, подвергнутых действию фракции 9, деформация этих структур проявляется наиболее сильно, только 23% из них сохраняют интактный вид, у 43% осмиофильность волокнистого материала в цитоплазме МН уменьшается, в них появляются пустоты, 4% десмосомоподобных структур вообще теряют волокнистый материал. Наконец, в 30% случаев осмиофильный материал присутствует только с одной стороны контакта (как правило, в синаптическом бутоне), ширина щели становится неравномерной, а мембраны - извитыми (рис. 17,е).
а б в д е г Рис. 17. Изменение электронноплотного вещества пресинаптической и постсинаптической частей десмосомоподобных контактов химических синапсов МН;
а – интактный контроль, б фракция 6, в - фракция 9, г – адаптация, д - адаптация + тест-стимуляция, е - адаптация + фракции 9 + тест-стимуляция.
Величина активных зон возвращается к интактному значению. Похожее влияние на ультраструктуру МН адаптированных и неадаптированных рыб оказывает цитохалазин D. Кроме специфических изменений десмосомоподобных контактов наблюдается удвоение периметра субповерхностных цистерн, увеличение почти в 1.5 раза их количества, что, возможно, свидетельствует о присутствии в обеих фракциях компонентов, вызывающих канальные (рецепторные) эффекты. Это заключение сделано на основании ранее полученных морфофункциональных исследований МН после аппликации апамина (Мошков и др., 1979) и имеющихся данных о слабом свойстве некоторых компонентов яда блокировать калиевые каналы (Волкова и др., 1984).
Следовательно, рассматриваемые фракции яда не только по-разному влияют на функциональное состояние МН, но и противоположным образом действуют на цитоскелет и на структуру десмосомоподобных контактов.
Фракция 6 влияет на них так же, как адаптация и фаллоидин и, по-видимому, содержит компонент, полимеризующий актин. Фракция 9 влияет так же, как длительная стимуляция, этанол и цитохалазин, и, по-видимому, содержит компонент, деполимеризующий актин. Существенно то, что, затрагивая структуру десмосомоподобных контактов, все воздействия сопровождаются реципрокными изменениями размеров активных зон синапсов.
Предположение о специфическом влиянии фракций именно на актиновые структуры проверили в экспериментах по прямому взаимодействию компонентов яда скорпиона и выделенного актина in vitro.
Влияние компонентов фракции 6 на Г-актин Хроматографически чистый мышечный Г-актин в среде с низкой ионной силой сохраняет нативную структуру и не образует нитей в течение 3 час. На пленке-подложке он представлен отдельными электронносветлыми глобулами на темном фоне, создаваемом красителем (рис. 18,а).
в а б г д ж е з Рис. 18. Изменение состояния актина: а – глобулярный актин;
б, в, г, д, е - полимеризация актина фракцией 6, субфракцией 7-11, компонентом 7а яда скорпиона, фаллоидином, 100 мМ KCl, соответственно;
ж - препятствие полимеризации актина цитохалазином D;
з – разрушение филаментов актина субфракцией 9а. Масштаб 0.1мкм.
При тех же условиях инкубирования Г-актина с фракцией 6 в среде уже через 1,5 час образуются нити и пучки нитей (рис. 18,б).
Для выяснения, какие конкретно полипептиды вызывают эти эффекты, были изучены девять ее субфракций. Оказалось, что нити и пучки нитей актина образуются только при инкубировании Г-актина и субфракции 7-10 (рис. 18,в).
После ее дальнейшего разделения на 14 компонентов, обнаружено, что появление нитей актина вызывают три из них - 7а, 7g, и 7n (рис. 18,г). Однако образования пучков актина под влиянием этих компонентов уже не происходит.
Похожие нити актина формируются при инкубировании Г-актина с фаллоидином или с 100 мМ KCl (рис. 18д,е). Установлено, что компонент 7а представляет собой однородный пептид с массой 4209 Да. Компоненты 7g, и 7n являются смесями пептидов, их далее не исследовали.
Влияние компонентов фракции 9 на полимеризацию Г-актина и на Ф актин Фракция 9 была разделена на шесть субфракций. Полимеризация Г-актина в растворе 100 мМ KCl в присутствии фракции или ее двух субфракций из шести - 9d и 9e - нарушается. Нити актина либо вообще не образуются, либо они деформированные и короткие. Подобный эффект оказывает цитохалазин D при инкубировании с актином (рис. 18,ж). Другие четыре субфракции активности не проявляют. Инкубирование фракции 9 и ее шести субфракций с Ф-актином показывает, что как фракция 9, так и субфракции 9а, 9d, 9f фрагментируют существующие нити актина (рис. 18,з).
Таким образом, мы установили, что в состав яда скорпиона входят полипептиды, взаимодействующие с актином: полимеризующие Г-актин с образованием нитей и пучков нитей, препятствующие полимеризации Г-актина и деполимеризующие Ф-актин. Дальнейшее испытание пептида 7а показало, что он является удачным фармакологическим инструментом для изучения роли актина в пластичности МН.
Влияние пептида 7а на морфофункциональные свойства МН Длительная стимуляция интактных и контрольных рыбок приводит к угнетению активности МН более чем в 4 раза. В то же время аппликация пептида значительно усиливает резистентность к утомлению (рис. 19).
Она проявляется и в ультраструктуре МН, которая после длительной стимуляции остается число поворотов практически не поврежденной. Синаптические бутоны возбуждающих типов сохраняют цитоскелет, хорошо идентифицируются десмосомоподобные контакты.
Морфометрическим анализом установлено, что как адаптация, И П А так и аппликация пептида увеличивают на 20% длину Рис. 19. Двигательная активность интактных сечений пре- и постсинаптических (И) рыбок, после адаптации (А), аппликации пептида 7а (П). Столбик слева – значения до частей десмосомоподобных тест-стимуляции, столбик справа - после нее.
контактов в химических синапсах (рис. 20). Площадь 400 химические смешанные примембранного электронно- синапсы синапсы плотного компонента этого вида длина ДПК, нм контактов возрастает более чем в раза по сравнению с интактным контролем. Увеличение размера этих структур сопровождается реципрокным уменьшением размеров активных зон синапсов почти на 20%. Следовательно, пептид индуцирует в химических ИПА ИПА синапсах адаптированное Рис. 20. Изменение десмосомоподобных состояние, т.е. состояние контактов (ДПК) афферентных синапсов МН депрессии синаптической золотых рыбок. Обозначения такие же, как на передачи. В смешанных синапсах рис. 19.
десмосомоподобные контакты также меняются под действием препарата: возрастает площадь пре- и постсинаптических уплотнений. При этом размеры щелевых контактов и активных зон остаются прежними.
Обнаружено существенное структурное изменение десмосомоподобных контактов смешанных синапсов. В их щели под действием пептида 7а на 30% возрастает число мостиков (Тирас и др., 2007). Такая структурная перестройка свидетельствует о потенцированном состоянии таких синапсов, усилении электротонической передачи, показанном в модельных экспериментах (Дзебан и др., 2003), при адаптации (Мошков и др., 2003) и после аппликации дофамина (Безгина и др., 2006).
Об усилении резистентности МН к утомлению вследствие аппликации пептида 7а свидетельствует образование в цитоплазме стресс-волокон (рис. 21).
Подобные волокна появляются после действия фаллоидина, фракции 6 и Рис. 21. Стресс-волокна в цитоплазме при адаптации. МН под действием пептида 7а.
Данные, представленные в этой Масштаб 1мкм.
части работы, свидетельствую о том, что благодаря свойству десмосомоподобных контактов афферентных синапсов МН золотой рыбки структурно отображать состояние актинового цитоскелета и функциональную активность нейрона, в яде скорпиона идентифицированы пептиды, полимеризующие и деполимеризующие актин. Пептид 7а, действие которого идентично эффекту тренировочной стимуляции, вызывает устойчивость к утомлению, так как специфически взаимодействует с актином десмосомоподобных контактов. Использование этого пептида послужило ключом к разгадке механизмов адаптации МН, клеточного аналога памяти (Мошков, 1985).
Сравнение эффектов адаптирующей стимуляции, фаллоидина и пептида 7а показывает, что структурно-функциональные последствия воздействий одинаковы – депрессия возбуждающей химической передачи. Однако при адаптации и при аппликации пептида угнетения двигательной активности, как это наблюдается на фоне действия фаллоидина (рис. 3), не происходит. Нами установлено, что при адаптации и при аппликации пептида 7а одновременно с депрессией химических синапсов имеет место потенциация смешанных синапсов. Аппликация фаллоидина эффекта потенциации не вызывает (Павлик и др., 2003). По-видимому, снижение возбуждения в одном локусе нейрона компенсируется увеличением возбуждения в другом, что позволяет нейронам сохранять высокую активность в экстремальных условиях функционирования.
Можно утверждать, что механизмом адаптации (естественной модификации состояния МН), вызванной тренировками, является обратимая дополнительная полимеризация актина, в частности, в десмосомоподобных контактах.
Адаптация не является следствием перестройки мозга или его отделов. Для ее индукции достаточно сдвинуть баланс нейронального актина в сторону дополнительного формирования Ф-актина в командных нейронах, какими являются МН.
Исследование моторной асимметрии золотой рыбки и объемных характеристик МН Наблюдения за движением золотой рыбки в узком канале и подсчет количества поворотов, совершаемых вправо или влево за определенное время, впервые показали, что у рыбок, подобно другим животным и человеку, существует врожденная моторная асимметрия. При свободном движении часть из них предпочитает чаще повернуться направо, а другая часть - налево. В популяции пропорция таких рыбок составляет 1.5:1 и сохраняется в течение длительных наблюдений. Таким образом, моторная асимметрия является индивидуальным фенотипическим признаком этого вида животных.
Является ли моторная асимметрия следствием асимметрии тела, морфологической асимметрии целостного мозга, среднего мозга, вестибулярных ядер, ретикулярной формации продолговатого мозга или его деривата – МН, определяющих движение рыбки? Эти нейроны интегрируют входную информацию из перечисленных отделов мозга и непосредственно от вестибулярного аппарата и боковой линии и активируют соответствующие мотонейроны спинного мозга, которые в свою очередь управляют сокращением правой и левой туловищной мускулатуры. Если исходить из гипотезы об инициации МН поворотов тела рыбки не только при выполнении реакции избегания (Korn, Faber, 2005), но и в свободном движении, то должна существовать связь между латерализацией ее моторного поведения и морфологией двух зеркально расположенных МН.
Действительно, нами выявлена устойчивая корреляция между моторной асимметрией золотой рыбки и морфологической асимметрией МН: при правосторонней моторной асимметрии левый нейрон имеет больший объем, чем правый, а при левосторонней моторной асимметрии - правый нейрон крупнее левого (табл. 1). Чем больше выражена моторная асимметрия, тем больше различия объемов правого и левого нейронов. Более того, значение коэффициента моторной асимметрии индивидуальных рыбок практически совпадает со значением коэффициента структурной асимметрии их МН (коэффициент корреляции составляет 0.9-1.0). Поскольку правый и левый поворот являются, по-существу, следствием активации левого и правого маутнеровского нейрона (Foreman, Eaton, 1993), различия в размерах означают повышенную эффективность большего нейрона (контралатерального по отношению к стороне поворота) по сравнению с меньшим (ипсилатеральным) по размеру нейроном.
Остается неясным меняются или остаются такими же врожденная моторная асимметрия и асимметрия МН при экспериментальных воздействиях и под влиянием факторов окружающей среды.
Изучение моторной асимметрии рыбок и структурной асимметрии МН при изменении сенсорного притока и действии полимеризующего актин пептида 7а из яда скорпиона Известно, что ориентация рыб осуществляется преимущественно за счет сигналов от вестибулярного и зрительного аппаратов (Хайнд, 1975).
Унилатеральное вращение рыбок вокруг ростро-каудальной оси тела, преимущественно воздействующее на один нейрон из пары через вестибулярный аппарат, боковую линию, орган зрения, может служить фактором среды, влияющим на моторную асимметрию рыбки.
Действительно, контралатеральная стимуляция, соотнесенная с локализацией большего по размеру нейрона, в зависимости от продолжительности воздействия уменьшает проявление моторной асимметрии и даже приводит к ее инверсии (табл. 1). Пропорционально длительности стимуляции контралатеральный нейрон заметно уменьшается и становится меньше, чем ипсилатеральный нейрон. Характер изменения объемов МН рыбок, совершающих правый или левый поворот одинаков, что трактуется нами как следствие одинакового утомления при воздействии на ведущую половину мозга и единства принципов организации поворотов.
При индукции адаптации с помощью контралатеральной или ипсилатеральной тренировочной стимуляции исходная моторная асимметрия рыбок и структурная асимметрия их МН сохраняется. Однако тест-стимуляция показывает, что объемы адаптированных МН стабилизируются на уровне интактных значений, что свидетельствует о приобретении адаптированными нейронами резистентности.
Таблица 1. Объемы частей и суммарные объемы контралатерального (К) и ипсилатерального (И) МН (по отношению к стороне поворота) в норме и после экспериментальных воздействий.
Рыбки, Рыбки, Рыбки, совершающие поворот вправо совершающие совершающие поворот вправо поворот влево ДС Адаптация Адаптация (15) (15) (6) (6) + ДС (6) К И К И К И К И К И Сома 191±20* 109±13 194±18* 116±17 66±3 78±26 182±15* 99±41 156± 110± 17* ЛД 85±16* 60±7 76±17 66±16 44±11 49±10 64±6 62±8 64±6 52± ВД 84±12 69±18 79±24 68±20 54±7 56±14 59±8 61±10 79±8 61± Аксон 185±24 160±25 170±16 155±20 181±16 161±22 188±18 126±35 198± 176± 18 1МН 546±48* 399±42 519±48* 406±52 345±22 343±54 480±39 401±32 483± 421± 14 2МН 944±80 924±83 688±64** 880±34 890± КСА 0.58±0.02 0.56±0.03 0.48±0.03 0.57±0.02 0.55±0. КМА 0.59±0.02 0.57±0.02 0.47±0.03 0.60±0.06 0.52±. Примечание. ДС - длительная стимуляция ЛД и ВД – латеральный и вентральный дендриты;
КСА и КМА - коэффициенты структурной и моторной асимметрии;
в скобках указано количество рыбок (столько же контралатеральных или ипсилатеральных нейронов);
объемы выражены в мкм3 х103;
*- достоверно отличается от объема ипсилатерального нейрона (р0.05);
**- достоверно отличается от интактного значения (р0.05).
Таблица 2. Объемы частей МН после деафферентации их вестибулярного или зрительного входа.
Вестибулярная деафферентация Зрительная деафферентация ипсилатеральная контралатеральная ипсилатеральная контралатеральная К И К И К И К И 186±34 190±25 191±25* 101±19 129±25* 83±20 160±22 141± Сома 40±13 51±11 64±11* 38±9 103±23 81±18 90±21 52± ЛД 42±9 49±13 62±17 59±15 62±13* 35±10 20±11* 83± ВД 242±30 224±45 144±22 123±29 133±34 120±19 260±19 230± Аксон 0.50±0.04 0.59±0.03 0.57±0.03 0.51±0. КСА 0.30±0.06 0.77±0.10 0.59±0.03 0.78±0. КМА Примечание. В группах количество рыбок = 5. Обозначения те же, что и в таблице 1.
Другим экспериментальным фактором, меняющим моторную асимметрию рыбок, является унилатеральная деафферентация МН. Повреждение контралатерального вестибулярного аппарата или удаление контралатерального глаза усиливает моторную асимметрию (табл. 2). Однако морфология МН после таких операций различается. Деафферентация контралатерального вестибулярного входа не меняет размеров частей МН и соотношения их объемов. Деафферентация контралатерального зрительного входа уменьшает разницу между объемами нейронов из-за увеличения сомы ипсилатерального нейрона. При этом важно отметить, что вентральный дендрит контралатерального МН становится в четыре раза меньше вентрального дендрита ипсилатерального МН.
Повреждение ипсилатерального вестибулярного аппарата приводит к инверсии моторной асимметрии рыбок. При этом различия между объемами частей нейронов и их объемами в целом практически исчезают. После удаления ипсилатерального глаза моторная асимметрия рыбок не меняется, структурная асимметрия МН ей соответствует. Однако объем как ипсилатерального, так и контралатерального нейрона, пропорционально уменьшается. Почти в 1.5 раза уменьшается объем вентрального дендрита ипсилатерального МН.
а б Рис. 22. Реконструкция МН: а - аппликация пептида 7а;
б – аппликация и тест-стимуляция.
Контралатеральные нейроны выделены темным цветом. Масштаб 100мкм Аппликация пептида 7а оказывает эффект аналогичный эффекту тренировочной стимуляции, приводящей к адаптации МН. Тест-стимуляция показывает, что под действием пептида происходит стабилизация объемов МН.
После сочетания сумма объемов нейронов, действия пептида и стимуляции нейроны визуально не изменяются тыс.кв.мкм.
(рис. 22), о чем свидетельствуют и количественные данные (рис.
23).
В целом, результаты указывают на то, что экспериментально вызванное изменение моторной И К П А асимметрии рыбок влечет за собой изменение размеров Рис. 23. Объемы МН до (столбик слева) и после (столбик справа) тест-стимуляции. И – интактные, К – МН и коррелирует с уровнем контроль, П – аппликация пептида 7а, А – адаптация.
активности встибулярного и зрительного входов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наша почти 30-ти летняя работа по изучению цитологических основ интегративной функции МН позволила решить важные нейробиологические проблемы и привела к целостному пониманию роли этих нейронов в поведении золотой рыбки.
1. Установлено, что адаптация, естественная модификация функции МН, вызванная тренировочной стимуляцией и длительная депрессия химической передачи, модельная форма пластичности, вызванная фармакологическими воздействиями, основаны на едином механизме преобразования цитоскелетного актина.
Для обоснования этого заключения потребовалось разработать комплекс специфических методов и подходов к изучению МН. Он включает оценку функционального состояния МН по поведению рыбки;
тестирование электрической активности в переживающих фрагментах мозга;
прицельную аппликацию на МН физиологически активных веществ, специфично меняющих состояние нейрона;
выделение из яда скорпиона и идентификацию актин полимеризующего вещества с последующим его использованием как молекулярного инструмента воздействия на нейрональный актин.
В результате экспериментально доказана ранее выдвинутая гипотеза (Мошков, 1985) о том, что актин-содержащие десмосомоподобные контакты в афферентных синапсах МН являются структурами, которые регулируют размер активных зон и тем самым управляют эффективностью синаптической передачи. На участие актина, одного из главных компонентов цитоскелета МН, в адаптации указывают данные по морфофункциональной устойчивости нейронов к электрической или естественной стимуляции на фоне действия пептидов, полимеризующих актин (Тирас и др., 2002, 2003).
В основе резистентности лежит появление полимерного актина в цитоплазме в виде пучков нитей, а в химических и смешанных синапсах - в виде гипертрофии десмосомоподобных контактов. В этом смысле показательно, что тонкое воздействие на десмосомоподобные контакты пептида 7а, который высоко специфично полимеризует актин, приводит к адаптации МН (Тирас и др., 2006). Однако высокая активность МН не может быть объяснена депрессией химической передачи, которая лежит в основе адаптации. При индукции такой депрессии фаллоидином функция МН необратимо угнетается.
Оказалось, что, несмотря на снижение функциональной активности химического афферентного входа при адаптации, высокий интегральный уровень активности МН сохраняется из-за реципрокного повышения эффективности другого, электротонического входа, осуществляемого в смешанных синапсах. Их проводимость усиливается вследствие дополнительного образования в щели десмосомоподобных контактов актиновых мостиков (Тирас и др., 2006), структурного признака длительной потенциации (Дзебан и др., 2003;
Мошков и др., 2003;
Павлик и др., 2003;
Безгина и др., 2007). Оба механизма сопряжены, надёжны и эффективны, поскольку имеют единую основу - актиновый компонент цитоскелета. Мы предполагаем, что такая тонкая регулировка баланса возбудимости нейронов, компенсирующая снижение активности в одном локусе ее усилением в другом, является подлинной причиной того, что до сих пор не удается зарегистрировать существование модельных форм памяти в естественных функциональных модификациях мозга, связанных с обучением (Abbot, Nelson, 2003) 2. Доказано, что в основе функциональной асимметрии головного мозга лежат морфологические различия между зеркально расположенными нейронами правой и левой его частей. В случае изменения функциональной асимметрии наблюдаются коррелятивные структурные изменения.
Моторная асимметрия наиболее ярко проявляется в поведении животных и поэтому часто используется в качестве модели для изучения различных аспектов функциональной асимметрии мозга. При рассмотрении ее возможных анатомических признаков в качестве адекватного объекта рыбки, как правило, вообще не рассматриваются (Бианки, 1985;
Vallortigara, 2000;
Salas et al., 1998;
Фокин, 2004). По-видимому, это связано с отсутствием данных о существовании у них моторной асимметрии в исследованиях, проведенных ранее (Kleerkoper et al., 1969) и в разрозненных, статистически недостоверных и скорее описательных результатах исследований последних лет (Bisazza et al., 1998;
2001;
Nepomnyashchikh, 2006).
Исследуя в рамках этой проблемы поведение мальков золотой рыбки, мы впервые обнаружили у них стойкое индивидуально выраженное предпочтение спонтанного изменения направления движения вправо или влево при свободном движении. Более того, впервые обнаружена строгая корреляция между моторной асимметрией и асимметрией в строении правого и левого маутнеровского нейрона, причем более крупный нейрон доминирует в инициации поворота. Существование тесной корреляции между размером нейрона и определенным уровнем его активности развивает представление о морфофункциональной основе формирования и хранения памяти в нейронах при рассмотрении количественных и качественных ее аспектов (Виноградова, 2000;
Thompson, 2000).
3. Сформулировано целостное представление о роли МН в естественном поведении золотой рыбки. Мы показали, что МН играют исключительную роль в регуляции важнейшей формы моторного поведения – совершении поворотов тела, как основы ориентировочной реакции рыбки. По нашему мнению именно эта основополагающая функция позволила МН сохраниться в эволюции.
Поворот, или смена направления движения является доминантной формой поведения, при которой прекращаются другие виды моторной активности, например, поступательные движения. Поворот – это внешнее проявление активации (возбуждения) одного из МН и следствие сдвига существующего равновесия процессов торможения и возбуждения между двумя нейронами.
Разнообразие и большое число афферентных синапсов на поверхности нейрона (до ста тысяч у зрелого МН) указывает на то, что его потенциал действия представляет собой интегрирующий ответ на информацию, поступившую от всех этих нейронов, которые в свою очередь имеют собственную активность и эффективность афферентных связей.
Можно предположить, что маутнеровские нейроны играют роль двухклеточного центра поворотов и у других видов рыб и амфибий, где они присутствуют.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что десмосомоподобные контакты химических возбуждающих синапсов МН под воздействием фаллоидина, полимеризующего актин или цитохалазина D, деполимеризующего его, соответственно увеличивают или уменьшают свои размеры. Одновременно реципрокно с ними уменьшаются размеры активных зон, мест секреции медиатора. Данные свидетельствуют о том, что десмосомоподобные контакты состоят из актина, и дают основание рассматривать эти структуры как цитоскелетное звено, регулирующее синаптическую эффективность.
2. Разработан подход к исследованию активности МН по поведению золотой рыбки и по амплитуде вызванного ответа в переживающем срезе продолговатого мозга. Его применение впервые показало, что активность МН, определяемая по поведению, прямо коррелирует с уровнем электрической активности и, следовательно, может служить адекватным неинвазивным способом оценки их функционального состояния в хронических экспериментах.
3. Скрининг яда черного скорпиона, его фракций и субфракций, проводимый на организменном (поведение), клеточном (электрическая активность), ультраструктурном (синапсы и синаптические контакты) и молекулярном (взаимодействие выделенного актина с веществом) уровнях, позволил идентифицировать пептиды, полимеризующие или деполимеризующие цитоскелетный актин.
4. Определено, что ультраструктурные признаки длительной депрессии афферентных химических синапсов МН, вызванные вестибулярной тренировочной стимуляцией и индуцированные с помощью аппликации физиологически активных веществ, полимеризующих актин, идентичны.
Одинаковое проявление длительной депрессии в поведении рыбки и в электрическом ответе МН, и одинаковые ультраструктурные изменения в синапсах доказывают, что естественная модификация функции нейронов и модельная форма синаптической пластичности основаны на единых механизмах.
Впервые выявлена асимметрия моторного поведения золотых рыбок:
5.
предпочтение к поворотам влево или вправо, и установлена прямая ее корреляция с морфологической асимметрией МН в норме и после физиологических воздействий. Эти данные в комплексе с установленными изменениями ультраструктуры в различных экспериментальных ситуациях позволяют утверждать, что МН вовлечены в естественное поведение и играют роль командного двухклеточного центра поворотов тела золотой рыбки.
Список основных публикаций по теме диссертации 1. Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Поведенческое и ультраструктурное исследование влияния аппликации колхицина на маутнеровские нейроны золотой рыбки Carassius auratus. Ж. эволюц. биох. и физиол.,1978, т. 14, № 5, с. 486-491.
2. Тирас Н.Р., Мошков Д.А., Пальмбах Л.Р. Изучение структуры маутнеровских нейронов рыб, развивающихся из икры в условиях длительного космического полета. В кн.: «Успехи космической биофизики», Пущино, 1978, с. 69-77.
3. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Мирошников А.И. Изучение ультраструктуры маутнеровских нейронов рыб после воздействия апамина. ДАН СССР, 1979, т. 245, № 4, с. 1014-1016.
4. Moshkov D.A., Tiras N.R., Saxon M.E. Phalloidin changes the synaptic contact ultrastructure. Naturewissenschaften, 1980, v. 67, p. 194-195.
5. Тирас Н.Р. Ультраструктурные исследования пластичности маутнеровских нейронов с использованием биологически активных веществ. В сб.
«Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия», Пущино, 1981, с. 134-141.