Механизмы регуляции оксидом азота электрической и сократительной функции гладких мышц
На правах рукописи
КОВАЛЕВ ИГОРЬ ВИКТОРОВИЧ
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ОКСИДОМ АЗОТА
ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ И СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ
ГЛАДКИХ МЫШЦ
03.00.13. - физиология
03.00.02.- биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
ТОМСК - 2002
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Важная роль оксида азота (NO) в обеспечении межклеточной и внутриклеточной сигнализации получила много экспериментальных подтверждений, a R Furchgott, L. Ignarro, and F. Murad, открывшие сигнальные функ ции оксида азота, были удостоены Нобелевской премии.
Впервые оксид азота в качестве регулятора физиологических процессов стал рассматриваться после исследований природы релаксирующего фактора (ЭРФ), син тезируемого эндотелиоцитами сосудов [Ignarro L.,e,a., 1987;
Furchgott R., Vamioutte P.,1989;
Luscher T.,1989;
Moncada S., 1992]. Хотя природа и механизмы действия ЭРФ остаются до конца не выясненными, большинством исследователей он идентифици руется с оксидом азота, продуктом NO-синтаз (NOS) (Капилевич Л.В. с соав.,1995 2001;
Furchgott R., Vanhoutte P.,1989;
Ignarro L.,e,a., 1987,1999].
К настоящему времени показана экспрессия генов ЖЬсинтаз не только в эндо телии сосудов и эпителии воздухоносных путей, но и в различных мышечных и не мышечных структурах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [Huher А., е.а., 1998;
Selemidis S., е.а., 1998] и матки [Barber A., 1999]. Оказалось, что оксид азота,способ ствует нормальному процессу имплантации яйцеклетки [Gouge R., e,a., 1998], а его концентрация Б тканях миометрия достигает максимального значения непосредст';
венно перед родами [Genoveva D-R. М., е,а., 1999].
В последние годы было показано, что оксид азота является нейро трансмиттером в некоторых центральных и периферических синапсах [Browne S, е.а.,1999;
Dawson V.;
Dawson T.,1998;
Goyal R., He X.,1998;
fto Y. 1998;
Taylor В.].
Нитроксидэргическая иннервация присутствует в органах ЖКТ и в репродуктивной системе, где ее стимуляция угнетает спонтанную активность гладкомышечных клеток (ГМК) тонкого кишечника, матки и фаллопиевых труб [Поленов М.А.,1998;
Ekerhovd Е., е.а., 1998,1999;
Denninger J., Marietta M.I999;
Shibata С., e,a,, 1998]. Эти данные по зволяют рассматривать оксид азота в качестве первичного посредника, обеспечиваю щего не только локальную, но и дистантную регуляцию гладкомышечных органов.
Большой прогресс в изучении МО-зависимых реакций был достигнут, в связи с открытием способности некоторых нитросоединений воспроизводить эффекты ок сида азота [Реутов В.П., Орлов С.Н.,1993;
Ignarro L.,e,a., 1987,1999]. Феноменология влияния оксида азота и нитросоединений-доноров NO на сократительную функцию гладких мышц достаточно хорошо известна. Во всех исследованных типах мышц до норы NO вызывали уменьшение механического напряжения, угнетали, если таковая имелась, спонтанную активность и снижали величину сократительных ответов на действие биологически активных веществ [Капилевич Л.В. с соавт., 1995-2001;
Кова лев И.В. с соавт., 1997-2001;
Поленов М.А.,1998;
Furchgott R., Vanhoutte P.,1989;
Luscher Т., 1989;
Moncada S., 1992].
Гораздо менее полно исследовано действие нитросоединений на электрические свойства ГМК, и практически отсутствуют сведения о влиянии NO на сопряжение возбуждения-сокращения в гладких мышцах. Имеются данные о действии этих пре паратов на потенциал-зависимую, кальций-активируемую и АТФ-чувствительную компоненты калиевой проводимости мембраны [ White R.,e.a.,1993;
Lovren F., Triggle С.,1998], но вклад каждой из них в изменения электрогенеза ГМК до сих пор не ясен.
Малоизученными остаются и мруанизми-вдияния оксида азота на эффектив ность оперирования основных внутр! клеточн^^гйаяЪных систем гладких мышц.:
кальмодулин-зависимой и С-киназно!: ветвей кальциевой и цАМ -опосредованной f^-"" **""*-'Р1 *J '*""',*| систем передачи сигналов.
От классических первичных посредников, регулирующих функции гладких мышц, оксид азота отличается тем, что индуцирует МО-зависимые внутриклеточные процессы без взаимодействия с рецепторами плазматической и внутриклеточных мембран, а посредством активации цитозольного фермента - растворимой фракции гуанилатциклазы (ГЦ) [Реутов В.П., Орлов С.Н.,1993;
Северина И.С.,1995;
Palmer R., 1988;
Drewett J., Garbers D.,1994]. Повышение внутриклеточной концентрации цГМФ и активация соответствующих протеинкиназ (ПК-G) [Lincoln Т., е.а., 2001;
Vaandrager А., 1996], играют основную роль в реализации эффектов NO. Однако, значительная неоднородность эффектов цГМФ, их видо- и тканеспецифичность [Lincoln T.,e.
а.,2001], как и открытие все большого количества новых изоформ ПК G [Tamura К, Itoh H., 1996] значительно усложняет изучение цГМФ-зависимых процессов.
Выступая в качестве вторичного посредника, цГМФ снижает уровень цито зольного Са2* в ГМК [Lincoln Т.,е.а., 1994,2001;
Vaandrager A.B., 1996], угнетая его вход через потенциал-зависимые и рецептор-управляемые каналы [Collins P. е.а., 1988;
Sperelakis N.,Xiong Z.e.a., 1994], а также стимулируя его удаление наружу [Сергеев П.В. с соавт., 1993;
] и депонирование в саркоплазматический ретикулум [O'Donnel М., 1994]. Вместе с тем, имеются данные о том, что цГМФ не влияет на проводи мость мембраны ГМК для ионов кальция [Байдан Л.В. с соавт., 1987].
Нет единого мнения о способах, механизмах и роли взаимодействия цГМФ и цАМФ в ГМК. Известна их общая способность к угнетению кальциевой [Liu H., Xiong Z., Sperelakis N.,1997] и активации калиевой проводимости мембраны ГМК [Kurokawa Y., е.а, 1998]. Суперпозиция эффектов этих циклических нуклеотидов обу словливается как различным сродством к фосфодиэстеразам (ФДЭ), так и способно стью к конкурентной активации или ингибированию этих ферментов [Медведева М.В.,1995;
Jiang H.,e.a.,1993;
Corbin J., е.а.,2000]. Многообразие модулирующих воз действий цГМФ на Са2+- и цАМФ-опосредованные реакции, наличие общих мишеней для соответствующих протеинкиназ, вызывает сомнения в способности цГМФ само стоятельно выполнять функции вторичного посредника в ГМК [Rasmussen Н.,1982] Оксиду азота, кроме сигнальных, присущи цитопротекторные и цитотоксиче ские функции [Малышев И.Ю., Малышева Е.В.,1998;
Реутов В.П. с соавт., 1998;
Brune В., 1997;
Bundy R.,1999;
Taylor В., 1997]. К настоящему времени накоплено большое количество данных об участии NO в развитии патологических процессов и, в частно сти, бронхиальной астмы и гипертонической болезни [Ignarro L.,e,a.,1999;
Vanhoutte P., 1998]. Сочетание деструктивных и защитных эффектов NO, позволяют считать эту молекулу одной из центральных фигур в поддержании жизнеобеспечения клеток, ос нованном на существовании баланса между физиологическими и патофизиологиче скими процессами. Поэтому выяснение механизмов, используемых биологическими системами с участием NO в физиологических процессах и патофизиологических ре акциях, как и факторов, определяющих границы сигнальных и повреждающих функ ций этой молекулы, является актуальной задачей современной биологии и медицины.
Резюмируя изложенное, можно заключить, что несмотря на значительные ус пехи, достигнутые в исследовании механизмов регуляции оксидом азота функций гладких мышц, многие вопросы не нашли удовлетворительного решения. Существен ная, а в ряде случаев и ключевая роль NO в обеспечении физиологических функций и патофизиологических реакций клеток, выдвигает это направление в качестве насущ ной проблемы современной биологии и медицины. Все это определяет настоятельную необходимость изучения основных закономерностей и особенностей реализации сиг нальной функции оксида азота в различных типах ГМК.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ:
Изучить роль оксида азота в механизмах оперирования внутриклеточных сиг нальных систем гладких мышц.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние нитросоединений-доноров оксида азота на электрические свой ства и сократительную активность гладкомышечных клеток аорты крысы.
2. Исследовать действие оксида азота на электрическую и сократительную актив ность гладкомышечных клеток мочеточника и taenia coli морской свинки.
3. Исследовать роль растворимой фракции гуанилатциклазы гладкомышечных кле ток в механизмах действия оксида азота на электрогенез и сокращения гладких мышц.
4. Изучить участие NO-зависимых процессов в механизмах оперирования кальцие вой сигнальной системы в гладких мышцах., 5. Изучить NO-зависимую компоненту регуляции протеинкиназой С электрических и сократительных свойств гладких мышц.
6. Исследовать влияние оксида азота на оперирование цАМФ-опосредованной сиг нальной системы гладкомышечных клеток.
7. Изучить роль Na+,K*,2CI" - котранспорта в NO-зависимых процессах регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Расслабление и реполяризация мембраны гладкомышечных клеток аорты крысы, мочеточника и taenia coH при действии донора оксида азота нитропруссида натрия и нитроглицерина обусловлены активацией растворимой фракцией гуанилатцик лазы 2. Влияние оксида азота опосредуется потенциал-зависимыми и потенциал нечувствительными механизмами, относительный вклад которых определяет на правленность изменений сократительных реакций гладкомышечных клеток.
3. Релаксирующие и реполяризующие мембрану ГМК эффекты оксида азота разви ваются за счет модуляции ионной проводимости мембраны. Потенциал независимый контроль гладкомышечного тонуса осуществляется через изменение эффективности оперирования С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы и Са2+-насоса саркоплазматического ретикулума.
4. Направленность действия циклических нуклеотидов на электрическую и сократи тельную активность ГМК мочеточника зависит от изменений внутриклеточного соотношения цГМФ/цАМФ, индуцированных оксидом азота.
5. Влияние оксида азота на сокращения гладкомышечных клеток мочеточника мор + + ской свинки осуществляется с участием Na,K,2Cl" - котранспортера.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
Впервые установлена относительная роль электро- и фармако-механического сопряжения в механизмах действия оксида азота. Показано, что активация биологиче ски активными веществами рецепторов, стимулирующих метаболизм мембранных фосфоинозитидов, усиливала релаксирующий эффект доноров оксида азота.
Впервые показано, что реализация эффектов оксида азота опосредована потен циал-зависимыми и потенциал-нечувствительными внутриклеточными механизмами, относительный вклад которых обуславливает направленность изменений электроге неза и сокращений ГМК.
Потенциал-зависимые эффекты донаторов оксида азота связаны с угнетением кальциевой и/или натриевой проводимостей и модуляцией кальций-зависимой и АТФ-чувствительной компонент калиевой проводимости мембраны ГМК. Потенциа ло-нечувствительные эффекты доноров оксида азота связаны с угнетением С киназной ветви кальциевой регуляции электрической и сократительной активности ГМК.
Впервые обнаружено, что в отличие от нитропруссида натрия, релаксирующие эффекты нитроглицерина обусловлены угнетением кальциевой проводимости мем браны ГМК цГМФ-независимым способом.
Впервые показана ключевая роль изменений внутриклеточного отношения цГМФ/цАМФ, индуцированных оксидом азота, в определении направленности сокра тительных реакций в гладкомышечных клетках мочеточника Впервые установлено, что стимулирующее влияние оксида азота на сократи тельную активность ГМК мочеточника осуществляется с участием Na+,K+,2Cl~ котранспортера.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных представлений о механизмах внутриклеточной регуляции общего и локального тону са гладкомышечных органов и сосудов. Показано, что механизмы взаимодействия ок сида азота с основными внутриклеточными сигнальными системами зависят от осо бенностей их оперирования в процессах регуляции функций гладких мышц.
Отмечена особая роль С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы глад ких мышц в определении направленности и потенцировании релаксирующих эффек тов донаторов оксида азота. Получены новые сведения о том, что увеличение внут риклеточного отношения цГМФ/цАМФ может определять направленность эффектов оксида азота в ГМК.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии дополнительных механиз мов действия нитросоединений и препаратов, изменяющих внутриклеточный уровень цГМФ и цАМФ, на сократительную активность гладкомышечных клеток. Это должно способствовать более тщательному отбору препаратов для фармакологической кор рекции в случае дисфункций гладкомышечных органов с учетом их способности не только к релаксируюшим, но и к контрактильным эффектам.
Основные положения работы используются в курсах лекций, читаемых на ка федре биофизики и функциональной диагностики и кафедре нормальной физиологии Сибирского Государственного Медицинского Университета, на кафедре физиологии человека и животных Томского государственного университета. Методические прие мы и полученные данные используются в научных исследованиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики и нормальной физиологии Си бирского государственного медицинского университета. Областями применения по лученных данных являются физиология, биофизика, фармакология.
Апробация работы. Основные результаты диссертации обсуждены на между народных конгрессах «United European Gastroenterology Week» (Oslo, 1994) и «Intern.Conggress of patophisiology»(Kyoto, 1994);
«The 19 scientific Meeting of the International Society of Hypertension, and 12* European Meeting on Hypertension (June - 27, 2002. Prague, Czech Republic)»;
на VII-IX национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 1997-1999);
на международных конференциях «Нейрогу моральные механизмы регуляции органов пищеварительной системы" (Томск, 1997) и «Актуальные вопросы кардиологии»(г.Томск, 2000);
на II международном симпозиу ме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воро неж, 1998);
на XVII и XVIII съездах Всероссийского физиологического общества им.
И.П. Павлова (Ростов-на-Дону, 1998;
Казань, 2001);
на межрегиональных научных конференциях «Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции»
(Томск, 1997);
Сибири и Дальнего Востока, посвящ. 150-летию со дня рожд. акад.
Павлова И.П.(Томск,ТГУ,1999);
Проблемы нейрогуморальной регуляции физиологи ческих функций висцеральных систем, посвященной 100-летию со дня рожд проф.
Д.Я. Криницина (Омск, ИВМ и ОмГАУ, 2000), на IV Съезде физиологов Сибири с международным участием (Новосибирск, 2002).
Основные результаты диссертации опубликованы в 44 печатных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста. Состоит из введения, трех глав описания собственных иссле дований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована рисунками и 1 таблицей. Список литературы содержит 467 источников, включая отечественных и 372 иностранных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили изолированные препараты гладких мышц аорты белых беспородных крыс-самцов, мочеточника и taenia coli морской свинки.
После удаления эндотелия из средней части аорты приготовлялись полоски шириной 0,6-0,7 мм, длиной -10-12мм. Из очищенных от соединительной ткани моче точников приготовлялись сегменты, а из taenia coli — полоски длиной 10-12 мм.
Для одновременной регистрации электрической и сократительной актив ности глад ком ышечных клеток использовалась методика двойного сахарозного моста [Артеменко Д.П. с соавт.,1982]. Отведение электрических потенциалов (изменений мембранного потенциала покоя спонтанных и вызванных электрическим стимулом потенциалов действия) проводили с помощью неполяризующихся электродов. Меха ническое напряжение (МН) и сокращения гладкомышечных полосок регистрировали механотроном 6МХ2Б в условиях, близких к изометрическим.
Отводимые сигналы после усиления подавались на АЦП (32 канала, разряд ность -12 бит, отношение сигнал/шум - 70 дб, частота дискретизации -2кГц) и обраба тывались с помощью IBM PC.
В качестве контрольных (100%) служили значения амплитуды анэлектротони ческого потенциала (АЭП), параметров потенциала действия (ПД) (амплитуда пико вой компоненты, величина и длительность плато) и амплитуды сокращения ГМК в растворе Кребса в ответ на электрический стимул, или изменения мембранного по тенциала покоя (МП) и МН, полученные в растворе Кребса, содержащем 40 мМ хло рида калия.
Результаты исследований обрабатывались методом вариационной стати стики. Для оценки достоверности различий парных выборок использовались крите рии t- Стьюдента и Колмогорова-Смирнова.
Используемые растворы:
Раствор сахарозы в концентрации 0,3 М на основе деионизированной воды с удельным сопротивлением 15 МОм\см.
Раствор Кребса следующего состава (в мМ): NaCl - 120,4;
КС1 - 5,9;
СаСЬ - 2,5;
№НгРО4 - 1,2;
NaHCO3 или трис(оксиметил)-аминометана- 15,5;
MgCl2 -1,2;
глюкозы - 11,5. Значения рН растворов поддерживались в пределах 7,35 - 7,40;
при температу ре 37±0,1° С.
Модифицированные растворы Кребса:
1. Гиперкалиевые растворы с концентрацией КС1 40, 60 и 120 мМ.
2.Безнатриевые растворы с эквимолярным замещением NaCl на холинхлорид.
g 3.Бескальциевые растворы с добавлением 0,1 и 1 мМ этиленгликоль-бис-( аминоэтиловый эфир)-НЙ№,№,-тетрауксусной кислоты (ЭГТА).
Тестирующие растворы готовились на основе Кребса и его модификаций с до бавлением соответствующих реактивов.
Используемые реактивы: фенилэфрин (Мезатон), гистамин, кофеин (Кофеин бензоат натрия, все-Россия), верапамил, (финоптин, Орион, Финляндия), изадрин, глибенкламид;
метиленовый синий, нитропруссид натрия, буметанид, З-изобутил-1 метилксантин (ШМХ), кальфостин С (Calphostin С), тапсигаргин (Thapsigargin, все-, Sigma);
тетраэтиламмония хлорид (ТЭА) и форболовый эфир (phorbol miristoyl-13 acetyl, ФМА -Serva);
нитроглицерин (Nitroject, SUN, Индия), дибутирил-цАМФ и ди бутирил- цГМФ (Boehringer Mannheim GmbH, Германия), винпоцетин (Гедеон Рих тер), пропранолол (Inderal, ICI).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние нитросоединений на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток.
1.1. Исходное механическое напряжение (МШ и мембранный потенциал (МП) ГМК аорты, мочеточника при добавлении в перфузионный раствор нитропруссида натрия (НП) и нироглицерина (НГ) в концентрациях 0,1- 1000 мкМ не изменялись.
Присутствие этих нитросоединений не влияло на вольт-амперные характеристики мембраны ГМК аорты и мочеточника. Эти данные свидетельствуют о том, что ис пользуемые нитросоединения не изменяют потенциал-зависимую калиевую проводи мость мембраны гладкомышечных клеток.
1.2. В ГМК, помещенных в гиперкалиевый раствор (40 мМ). развивалась депо ляризация мембраны, и росло механическое напряжение. Полученные при этом изме нения МП и МН были приняты в качестве контрольных значений (100%).
При добавлении нитросоединений в концентрациях 0,1-ЮООмкМ предсокра щенные хлоридом калия препараты аорты крысы, мочеточника и taenia coli морской свинки расслаблялись. Это расслабление сопровождалось реполяризацией мембраны ГМК (Рис.1).
Рис.1. Влияние нитропруссида натрия (НП) на мышечное напряжение (А,В) и мембранный потенциал (Б,Г) гладкомышечных клеток аорты крысы (А и Б) и taenia coli морской свинки (В и Г), предсокращенных гиперкалиевым (КС1 40) раствором.
Стрелками обозначено начало и конец действия тестирующих веществ.
Прерывистой линией отмечены исходные электрические и сократительные ответы ГМК в отсутствии НП. Справа калибровочный сигнал и отметка времени.
Нитропруссид натрия (НП) в концентрации 1мкМ на 5-8 мин вызывал досто верное снижение МН и реполяризацию мембраны ГМК аорты до величин 86±1% и 84±2% (п=8;
р0,05) от контрольных значений в 40 мМ растворе хлорида калия. Уве личение концентрации НП приводило к усилению реполяризующего и релаксирую щего действия, и при 1мМ значения МП и МН ГМК аорты крысы составляли 15±3% и 14±1% (п=8;
р0,05) от контрольных. Концентрация нитропруссида натрия, вызы вающая полумаксимальный расслабляющий эффект (БС5о) ГМК аорты, равна 10 мкМ.
Сходное действие НП оказывал на ГМК taenia coli и мочеточника морской свинки, но величина расслабления этих гладких мышц при тех же концентрациях НП была достоверно ниже, чем аорты (Рис.2,В»Г).
Рис.2. Влияние нитропруссида натрия и нитроглицерина на механическое напря жение (А,В) и мембранный потенциал (Б,Г) ГМК аорты (А,Б) и taenia coli (В,Г).
Пунктирной линией показано действие нитропруссида натрия, сплошной нитроглицерина.
По оси абсцисс - концентрация нитросоединений в микромолях, По оси ординат - величина механическо напряжения и мембранного потенциала в % от контрольных исходных в гиперкалиевом (40 мМ) растворе.
Звездочкой обозначены лостовепно отличные значения Гп=8:о0.05Х ЕС5о НП для ГМК taenia coli равна 0,1 мМ, а для мочеточника -1 мМ.
Таким образом, чувствительность гладких мышц к оксиду азота убывала в ря ду: аорта, taenia coli, мочеточник.
Нитроглицерин (НП в ГМК аорты начиная в концентрации 1мкМ, уже на 2- мин. снижал уровень МП до 91 ±5% и МН до 87±5% (п=8, р0,05) от контрольных значений в 40 мМ растворе хлорида калия. Увеличение концентрации НГ вело к дальнейшему снижению уровня мембранного потенциала и механического напряже ния. При концентрации НГ в гиперкалиевом растворе, равной 100 мкМ, уровень МП и МН ГМК аорты крысы приближались к исходным значениям в нормальном растворе Кребса (Рис.2). ECso НГ для ГМК аорты равна 5мкМ.
Таким образом, НГ действовал более быстро и уже в микромолярных концен трациях полностью расслаблял и реполяризовал ГМК аорты.
Отличия в действии нитроглицерина на мембранный потенциал и механиче ское напряжение ГМК вероятнее всего обусловлены его структурой, предполагаю щей более высокую липофильность и, следовательно, мембранотропность, и особен ностями метаболизма, который связан с образованием нитрозотиолов - активаторов ГЦ [Григорьев Н.Б.,с соавт.,1991;
Северина И.С.,1995;
Upchurch G., е.а.,1996;
Abderrahmane A.,e.a.,1998].
При повторном или однократном длительном действии НГ в ГМК аорты раз вивалась толерантность [Сумароков А.Б. 1989;
Hasegawa К., е.а.,1999], что затрудняло его использование в качестве тестирующего агента.
1.3 Действие нитросоединений на спонтанные и вызванные электрическим стимулом потенциалы действия (ПД) и сокращения ГМК изучалось на гладком ышеч ных препаратах taenia coli и мочеточника морской свинки В концентрациях ЮмкМ и выше НП и НГ угнетали спонтанную и вызванную электрическую и сократительную активность ГМК taenia coli (Рис.З,А,Б).
Рис.3. Влияние нитропруссида натрия и нитроглицерина на сокра тительную и электрическую активность ГМК taenia coli (А и Б) и мочеточ ника (В и Г) морской свинки.
А и Г- действие 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП);
Б и В - действие 100 мкМ нитроглицерина (+НГ).
а - сократительная активность;
б - потенциалы действия.
Справа - калибровочный сигнал и отметка времени Величина анэлектротонических потенциалов при этом не изменялась. Посколь ку ПД ГМК taenia coli имеют кальциевую природу [Bulbring E.,Tomita Т., 1970], и со противление мембраны при действии нитросоединений не изменялось, такие эффек ты, вероятнее всего, обусловлены отрицательным влиянием нитросоединений на по тенциал-зависимую кальциевую проводимость мембраны ГМК.
Вызванные электрическим стимулом потенциалы действия и сокращения гладкомышечных клеток мочеточника также угнетались нитроглицерином в диапазо не концентраций 10-500 мкМ (Рис.З,В).
В концентрации 10 мкМ НГ на 3-5 мин.: уменьшал амплитуду сокращений до 73±9%, а длительность плато до 91 ±6% от исходных в нормальном растворе Кребса.
Этот угнетающий эффект был обратим и зависел от концентрации нитроглицерина в растворе. В присутствии 500 мкМ НГ амплитуда сокращений ГМК снижалась отно сительно исходных до 39±9%, а длительность плато ПД до 80±11% (п=8,р0,05).
Иначе проявлялся эффект нитропруссида натрия (Рис.З,Г). В концентрациях 0,01-50 мкМ НП не изменял электрическую и сократительную активность ГМК моче точника, но в концентрации 100 мкМ НП увеличивал амплитуду сокращений до!30±7% (п=11;
р0.01) от исходных значений в нормальном растворе Кребса. Дли тельность плато ПД при этом практически не изменялась.
2.Изучение роли гуанилатциклазы в механизмах действия нитропруссида натрия и нитроглицерина на электрические и сократительные свойства ГМК.
Реполяризующее и релаксирующее действие нитросоединений на ГМК может быть связано с их способностью высвобождать оксид азота или образовывать нитро зотиолы, которые активируют растворимую фракцию гуанилатциклазы (ГЦ). Следо вательно, вторичным посредником этого сигнального каскада, вероятнее всего, явля ется циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) [Реутов В.П., Орлов С.Н.,1993;
Севе рина И.С.,1995-1998].
Для изучения роли гуанилатциклазы в реализации эффектов НП, который ос вобождает NO, использовался ингибитор ГЦ метиленовый синий [Реутов В.П., Орлов С.Н. 1993;
Северина И.С., 1995;
Drewett J., Garbers D.,1994;
Wang Y.,e.a.,1995].
Метиленовый синий (1-10мкМ)не влиял на исходный уровень МП и МН ГМК аорты крысы, но полностью устранял релаксирующее и реполяризующее действие НП на предсокращенный 40мМ хлорида калия гладкомышечный препарат (Рис.4).
Рис.4. Влияние метйленового синего на эффекты нитропрусснда натрия на механическое напря жение (А, Б) и мембранный потен циал (В, Г) ГМК аорты крысы в гнперкалиевом (КС) 40) растворе Кребса.
А и В - контрольные расслаб ление и реполяризация мембраны ГМК при действии нитропруссида натрия в концентрации 10- мкМ;
Б и Г- то же, что А и В, но в присутствии 1мкМ метйленового синего.
Остальные обозначения как на Рис.1. Ослабление эффекта нитропруссида натрия после предобработки ингибитором ГЦ метиленовым синим, было характерно и для ГМК мочеточника и taenia coli, предсокращенных гиперкалиевым (40мМ) раствором.
При действии 10 мкМ метйленового синего вызванные электрическим стиму лом ПД и сокращения ГМК мочеточника морской свинки не изменялись, но устраня лось усиление нитропруссидом натрия вызванных сокращений ГМК мочеточника (Рис.5,А,Б).
Нитроглицерин, в отличие от нитропруссида натрия, продолжал угнетать ПД и сокращения ГМК мочеточника и в присутствии ингибитора ГЦ. После предобработ ки метиленовым синим, добавление 100 мкМ НГ приводило к снижению амплитуды сокращения и длительности плато ПД до величин 58±4% и 78±5% (п=8, р0,05), что соответствовало эффекту НГ в отсутствии метиленового синего (с. 10). Более того, эффект НГ оставался обратимым и на фоне действия ингибитора ГЦ (Рис.5,Г).
Рис. 5. Влияние нитропруссида натрия и нитроглицерина на сокращения и потенциалы действия ГМК мочеточника в присутствии метиленового синего.
А - действие 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП) в нормальном растворе Кребса.
Б - то же, что и А в присутствии 10 мкМ метиленового синего (+Мет.синий).
В -действие 100 мкМ нитроглицерина (+НГ);
Г -то же, что и В в присутствии 10 мкМ метиленового синего (+МС).
Остальные обозначения как на рис.3.
Полученные данные указывают на то, что основной мишенью для нитропрус сида натрия в исследуемых ГМК является растворимая фракция ГЦ, поскольку его эффекты полностью устранялись метиленовым синим.
Влияние нитроглицерина на ПД и сокращения ГМК мочеточника осуществля ется и цГМФ- независимым способом.
3. Исследование влияния оксида азота на кальциевую систему регуляции электрической и сократительной активности ГМК.
Главенствующая роль кальциевой сигнальной системы в цикле сокращение расслабление гладких мышц в настоящее время не вызывает сомнения [Шуба М.Ф.с соав. 1984-1988;
Kuriyma H. е.а.,1998]. Источниками ионов кальция, необходимых для активации и поддержания сокращения, являются внеклеточное пространство и внут риклеточные депо. Были проведены исследования влияния NO на эффективность оперирования этого пути передачи сигнала в ГМК.
3.1. Для активации потенциал-зависимого входа ионов капьция через деполяри зованную мембрану проводилось предсокращение ГМК аорты крысы растворами с концентрацией КС1 40 мМ, 60 мМ и 120 мМ. В этих условия происходило увеличение МП до 138±8% и МН до 140±11% (60 мМ КС1) и 191±3 % и 149±3% соответственно в растворе, содержащем 120 мМ КС1 (п=8;
р0,05). Значения МП и МН в растворе с мМ КС1 приняты за 100%. Реполяризующее и релаксирующее влияние нитропруссида натрия на ГМК оставалось на одном уровне, но исчезало при 120 ММ КС1 (Рис.6;
1-3).
Рис.6. Влияние нитропруссида натрия на механическое напряжение (А) и мембранный потенциал (Б) ГМК аор ты, пред сокращенные различными реагентами:
1-40 мМ хлорида калия;
2 — 60 мМ хлорида калия;
3-120 мМ хлорида калия;
4 - 1 мкМ фенилэфрина;
5-120 мМ хлорида калия и 1 мкМ фенилэфрина.
Заштрихованные столбцы -то же, что и светлые при действии 10 мкМ НП.
За 100% взяты значения механиче ского напряжения'и мембранного потен циала в гиперкалиевом (40 мМ) растворе Звездочкой обозначены достовер но отличные значения (п=8;
р0,05).
3.2. Для более детального изучения потенциал-зависимых механизмов действия NO использовались блокаторы кальциевых каналов и модифицирующие содержание внеклеточного кальция и натрия растворы.
3.2.1.Блокатор потенциал-зависимых кальциевых каналов верапамил в концен трации ЮмкМ расслаблял и реполяризовал мембрану ГМК аорты крысы, предсокра щенных гиперкалиевым раствором (40 мМ), до величин 53±2% и 68±1% (п=6;
р0,05) соответственно. Добавление на фоне верапамила 10 мкМ НП приводило к полному расслаблению и дополнительной реполяризации мембраны ГМК до 52±3% (п=6;
р0,05) относительно контрольных значений в гиперкалиевом растворе.
Верапамил на фоне действия НП вызывал полное расслабление гладкомышеч ных полосок аорты и снижение МП с 65±1% до 50±1% (п=6;
р0,05) от контрольных значений в 40 мМ растворе хлорида калия. Следовательно, ограничение входящего потока ионов кальция верапамилом ослабляло реполяризующие и усиливало релакси рующие эффекты нитропруссида натрия.
Полученные данные свидетельствуют о том, что действие NO на ГМК, по видимому, обусловлено не только угнетающим влиянием на входящий по потенциал зависимым кальциевым каналам поток ионов Са2*, но и значительным участием по тенциал-нечувствительных механизмов расслабления гладких мышц, проявляющихся на фоне действия блокатора потенциал-зависимых кальциевых каналов верапамила.
3.2.2.В следующей серии экспериментов ГМК аорты помешали в бескальцие вые растворы Кребса. содержащий 0.1 и 1 мМ ЭГТА. В этих растворах исходное МН снижалось до 50±3% и развивалась деполяризация мембраны ГМК до 31 ±5% от кон трольных значений в 40мМ растворе хлорида калия (п=6;
р0,0).
В бескальциевом растворе влияние хлорида калия на МП и МН ослабевало бо лее чем вдвое. Значения МП и МН составляли величины 45±2% и 40±2% 5).
(п=6;
р0,05) относительно действия гиперкалиевого раствора в контрольных экспе риментах. Механическое напряжение ГМК при этом достигало значений, близких к исходным, в нормальном растворе Кребса. Следует отметить, что сокращения ГМК при действии хлорида калия имели транзиторный характер (Рис.7).
Рис. 7. Влияние ниг ропруссида натрия и ко феина на мембранный по тенциал (А) и механические напряжение (Б) в бескаль циевом ЭГТА - содержащем растворе.
Стрелками обозначе но добавление удаление со тветствующих тестирующих веществ в раствор Кребса и его безкальциевую модифи кацию.
Остальные обозначе ния как на рис. Развитие МН гладкой мышцы при действии хлорида калия в бескальциевых растворах указывает на сохранность в этих условиях внутриклеточного пула ионов кальция, достаточного для инициации сокращения. Добавление на этом фоне НП в концентрации 10 мкМ, полностью устраняло сократительные ответы ГМ на КС1, не влияя на уровень МП ГМК аорты крысы.
Использование бескальциевых ЭГТА-содержащих растворов позволяет сни жать вне- и, опосредованно, внутриклеточную концентрацию ионов кальция, о чем свидетельствует падение МН гладкомышечных полосок аорты крысы. Деполяризация мембраны ГМК, при этом, могла быть связана с увеличением проницаемости мем браны для ионов натрия и уменьшением внутриклеточной концентрации ионов каль ция. Последнее ведет к уменьшению или полному устранению значимой для под держания потенциала покоя сосудистых ГМК кальций-зависимой калиевой проводи мости мембраны ГМК [Шуба М.Ф., Кочемасова Н.Г, 1988;
Kuriyama Н.,е.а.,1998].
Полученные данные указывают на то, что реполяризация мембраны ГМК при дейст вии НП в гиперкалиевом растворе Кребса, вероятно, связана с изменениями калиевой проводимости мембраны Вместе с тем, отсутствие реполяризующего эффекта НП в бескальциевом ЭГТА -содержащем гиперкалиевом растворе может быть отчасти связано и с тем, что в данных экспериментальных условиях резко уменьшается сопротивление мембраны, поэтому даже существенные сдвиги в величине калиевых токов, если они имели ме сто, не могли привести к заметным изменениям МП.
Известно, что генерация ПД ГМК мочеточника обусловлена изменениями про водимости мембраны к ионам кальция, натрия и калия. [Кочемасова Н.Г.,Шуба М.Ф.,1982].
3.2.3.Для выделения кальциевой компоненты ПД наружные ионы натрия заме шались холинхлоридом, и в этих условиях ПД приобретали пиковый характер, обу словленный входом ионов кальция по потенциал-зависимым каналам.
Нитропруссид натрия (100 мкМ) уменьшал амплитуду кальциевых ПД и вели чину сокращений ГМК до 85±11% и 78±12%(п=8;
р0,05) соответственно, относи тельно контрольных в безнатриевом растворе (Рис.8), Такие изменения ПД и, как следствие, сокращений, могли быть связаны с прямым угнетением оксидом азота по тенциал-зависимой кальциевой и/или с повышением калиевой проводимости мем браны ГМК. Для выяснения этого вопроса использовали блокатор калиевых каналов тетраэтиламмоний [Кочемасова Н.Г.,1982].
Добавление 5 мМ ТЭА в безнатриевый раствор (Рис.В.В) приводило к появле нию плато ПД и усилению сокращений. В таких условиях НП не влиял на ПД и со кращения ГМК мочеточника.
Рис.8 Влияние ннтропруссида натрия на сокращения и потенциал действия ГМК мочеточника морской свинки в безнатриевых растворах.
А - динамика ПД и сокращений в безнатриевом растворе.
Б - действие 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП) в раствре Кребса и на фоне безнатриевого раствора (-Na) В -действие 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП) в безнатриевом раство ре на фоне 5 мМ тетраэтиламмония (+ТЭА).
Остальные обозначения как на оис.З Эти данные указывают на то, что изменения ПД, вызванные добавлением НП в безнатриевый раствор, обусловлены в первую очередь нарушениями калиевой прово димости мембраны ГМК.
ЗАИзучение роли изменений калиевой проводимости мембраны в механизмах действия оксида азота на электрогенез и сокращения ГМК.
В проведенных исследованиях использовались блокаторы калиевых каналов тетраэтиламмоний [Imaizumi Y. е.а,, 1981] и глибенкламид [Mioshi H.e.a., 1994;
Kubo М.,е.а.,1994].
3.4.1.В ГМК аорты, предсокращенных гиперкалиевым (40 мМ) раствором, до бавление 5 мМ ТЭА вызывало дополнительную деполяризацию мембраны и рост механического напряжения до величин 182±11% и 190±8% (п=8;
р0,05) соответст венно от контрольных (КС1 40мМ) значений.
Действие нитропруссида натрия (10 мкМ, ECso) на фоне ТЭА существенно ос лабевало. Значения МП и МН ГМК составили 88±4% и 79±5% (п-8;
р0,05), от кон трольных значений в гиперкалиевом (40 мМ) ТЭА-содержащем растворе.
Действие более высоких концентраций нитропруссида натрия (1мМ) на фоне ТЭА также существенно ослабевало. Снижение МП и МН ГМК составило лишь 59±7% и 38±5%, против их значений 15±3% и 14±1% (п-8;
р0,05) для этой концен трации НП в отсутствии ТЭА.
Добавление 10 мМ тетраэтиламмония в раствор Кребса вызывало деполяриза цию мембраны ГМК аорты и повышение МН до 171±7% и 185±9% (п=8;
р0,05) со ответственно. Влияние нитропруссида натрия на ГМК в концентрациях 10-1000 мкМ в присутствии 10 мМ ТЭА ослабевало еще в большей степени, чем при действии мМ. МП и МН ГМК при добавлении 10 мкМ НП (ЕС50) на фоне 10 мМ ТЭА состав ляли 90±5% и 87±5% (п=8;
р0,05) соответственно, от контрольных значений.
Таким образом, присутствие ТЭА в растворах существенно снижало эффектив ность реполяризующего и расслабляющего действия НП.
Известно, что в указанных концентрациях ТЭА уменьшает потенциал зависимую и кальций-активируемую калиевые проводимости мембраны ГМК [Benham С., Bolton Т., 1986]. Как указывалось выше (стр.8), нитропруссид натрия не изменял вольт-амперную характеристику мембраны ГМК аорты, а значит, он не ока зывал влияния на потенциал-зависимую калиевую проводимость мембраны ГМК аор ты. Следовательно, резкое ослабление тетраэтиламмонием реполяризующих эффек тов НП связано с блокированием Са2+-активируемых калиевых каналов мембраны ГМК аорты.
Полученные данные указывают на то, что уменьшение МП при действии НП обусловлено повышением Са2+-активируемой калиевой проводимости мембраны.
В ГМК мочеточника добавление тетраэтиламмония (5 мМ) в раствор Кребса вызывало увеличение длительности плато ПД на 116±23%, и амплитуды сокращений ГМК мочеточника на 57±18% (п=17;
р0.01) относительно исходных значений в нор мальном растворе Кребса, НП в концентрации 100 мкМ дополнительно увеличивал амплитуду, длитель ность плато ПД и силу сокращений ГМК еще на 11 ±6%, 21 ±9% и 27±6% (п=17;
р0.01) соответственно, относительно контрольных в присутствии ТЭА.
Нитроглицерин (100 мкМ) в присутствии 5 мМ тетраэтиламмония сохранял свое угнетающее влияние на ПД и сокращение ГМК мочеточника (Рис.9).
Рис.9. Влияние тетраэтиламмония на эффекты нитропруссида натрия и нитроглицерина на сокращения и потенциалы действия ГМК мочеточника мор ской свинки.
А - добавление 5 мМ тетраэтиламмония (+ТЭА) и на его фоне 100 мкМ нитропруссида натрия (+НГ);
Б - то же, что А, но при добавлении 100 мкМ нитроглицерина.
Остальные обозначения как на пис 3.
Длительность плато ПД и величина сокращения уменьшились до 71 ±11% и 74±14% (п=8;
р0.05) соответственно от контрольных в присутствии ТЭА.
Таким образом, действие НП на электрическую и сократительную активность ГМК мочеточника обусловлено снижением натриевой и кальциевой проводимости мембраны ГМК.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в ГМК мочеточника в услови ях блокирования калиевых каналов тетраэтиламмонием оксид азота вызывал эффек ты, противоположные тем, которые характерны для ГМК аорты.
Это дает основания полагать, что в ГМК сосудов и мочеточника оксид азота модулирует эффективность оперирования различных внутриклеточных сигнальных систем, либо один путь передачи сигнала, эффекты активации или ингибирования ко торой различны в ГМК мочеточника и аорты. Наиболее реальным кандидатом на эту роль является С-киназная ветвь кальциевой сигнальной системы [Баскаков М.Б., с со авт.,1987-1988].
В следующей серии экспериментов изучалась роль АТФ-чувствительной ком поненты калиевой проводимости мембраны ГМК в механизмах действия оксида азо та на ГМК аорты и мочеточника.
3.4.2.Блокатор АТФ-чувствительных калиевых каналов глибенкламид в кон центрации 100 мкМ вызывал деполяризацию мембраны ГМК аорты и рост механиче ского напряжения до 54±4% и 55±3,5% {п=6;
р0,05) соответственно от контрольных значений в гиперкалиевом растворе.
Добавление 10 мкМ НП уменьшало вызванное глибенкламидом МН до 65± 5% и снижало МП до 78± 7% (п=6;
р0,05) от контрольных значений в присутствии гли бенкл амида.
Таким образом, блокатор АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламид в большей степени ослаблял реполяризующий мембрану эффект НП, чем его релакси рующее действие. Это свидетельствуют о том, что изменения МП при действии НП могут быть обусловлены активацией АТФ-чувствительной компоненты калиевой проводимости мембраны ГМК аорты.
3.5.Влияние оксида азота на внутриклеточные депо ионов кальция гладких мышц исследовалось с помощью активатора его высвобождения кофеина [Григорьев М., с соав.,1995;
Ganitkevich V., Isenberg G.,1992] и ингибитора Са2+-АТФ-азы сарко плазматического ретикулума (СПР) тапсигаргина [Murthy K.,e.a.51998-2000].
3.5.1.Кофеин в концентрации 0.6 мМ в бескальциевых растворах вызывал при рост МН до 113±5%, без изменений МП ГМК.
Предобработка ГМК НП не изменяла величину кофеин-индуцированного со кращения (Рис.7).
Полученные данные свидетельствуют о том, что НП не оказывает влияние на процессы высвобождения Са2+ из кофеин-чувствительных внутриклеточных депо ГМК аорты.
3.5.2.Влияние тапсигаргина на изменения электрогенеза и сокращений ГМК изучалось на препаратах мочеточника.
Тапсигаргин в концентрации 1 мкМ вызывал увеличение длительности плато ПД и усиление сокращений ГМК мочеточника, на 83±11% и 38±8% (п=8;
р0,05) со ответственно, относительно исходных в нормальном растворе Кребса В присутствии тапсигаргина активирующее действие нитропруссида натрия на сокращения ГМК мочеточника снижалось. Если в отсутствии тапсигаргина амплиту да сокращений при действии НП возрастала до!30±7% (п=11;
р0.01) относительно исходных значений в растворе Кребса, то на фоне действия ингибитора Са2+-АТФ азы СПР амплитуда сокращения достоверно снижалось до 87±6% (п=6;
р0.05) отно сительно контрольных значений (в присутствии 1 мкМ тапсигаргина) (Рис.10).
2+ Известно, что внутриклеточные депо Са не играют столь значимой для со кращения ГМК мочеточника роли, которую выполняет его внеклеточный пул [Шуба М.Ф.,Бурый В.А.,1984]. В этой связи, повышение сократительной активности тапси гаргином могло быть связано с увеличением внутриклеточной концентрации свобод ных ионов кальция вследствие угнетения процессов их депонирования в СПР.
Важным является и тот факт, что в присутствии ингибитора Са2+-АТФ-азы СПР снижалось активирующее действие НП на сокращения ГМК мочеточника. Эти данные можно рассматривать как свидетельство того, что в активации сократительно го ответа ГМК мрчыичнщш НЦИДействии Mil участвует и Са, депонированный в т СПР, количество которог| |^р^ёгает вследст ше стимуляции нитропруссидом на трия кальциевого iacocaCnpfPHvc.JP,El Рис. 10. Влияние тапсигяргина на эффекты нитропрусида натрия на сокраще ния (а) и потенциалы действия (б) мочеточника морской свинки:
А - действие 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП) в растворе Кребса;
Б - то же, что А, но на фоне действия 1 мкМ тапсигаргина (+Taps) Справа — калибровочный сигнал и отметка времени.
З.б.Изучение влияния оксида азота на электрические и сократительные свойст ва гладких мышц, активированных биологически активными веществами (БАВ).
В соответствии с классической схемой возбуждающее действие агонистов ре цепторов на ГМК обусловлено открыванием малоселективных рецептор-управляемых ионных каналов и, последовательно, селективных кальциевых рецептор-управляемых ионных каналов, которое ведет к деполяризации мембраны, открыванию потенциал зависимых кальциевых каналов и освобождению ионов кальция из внутриклеточного депо [Шуба М.Ф,,Кочемасова Н.Г.,1988]. В последнее время в эту схему в качестве важного компонента включена протеинкиназа С (ПК-С), активация которой обуслов лена входом ионов кальция в результате воздействия миметиков на рецепторы мем браны ГМК (ai, HI, М|И др.), стимуляцией G-белков и фосфолипазы С [Lee M., Severson D., 1994;
Somlyo A.P., Somlyo A.V., 1994].
3.6.1.Для исследования влияния оксида азота на изменения МП и МН на ГМК аорты, вызванные стимуляцией о^-адренэргических рецепторов, применяли фени лэфрин (ФЭ) и норадреналин (НА) как в качестве самостоятельного предсокращаю щего фактора, так и совместно с гиперкалиевыми растворами.
Добавление 1мкМ фенилэфрина (ФЭ) в присутствии 1 мкМ блокатора Р адренэргическйх рецепторов пропранолола вызывало деполяризацию мембраны ГМК до 138±4% (п=8;
р0,05). Величина деполяризации мембраны в этих условиях соот ветствовала той, которую наблюдали в растворе с 60 мМ хлорида калия, а МН ГМК достигало значения 170±4% (п=8;
р0,05), что было больше на 30% (Рис.6;
4).
Нитропруссид натрия (ЮмкМ), добавленный на фоне ФЭ, вызывал реполяри зацию мембраны до 50±4% и снижение МН ГМК до 16±3% (п~8;
р0,05) от контроль ных значений. Увеличение концентрации НП до 100 мкМ приводило к полному рас слаблению гладкомышечного препарата и снижению величины МП до 45±3% (п=8;
р0,05).
При добавлении 40мМ хлорида калия на фоне действия 1мкМ ФЭ регистриро валась дополнительная деполяризация мембраны, которая суммарно составила 168±3% (п=8;
р0,05). Увеличения МН ГМ при этом не происходило. НП (ЮмкМ) в этих условиях вызывал снижение МП и уменьшение МН ГМК до 50±3% и 45±5% соответственно (п=8;
р0,05) относительно контрольных значений в гиперкалиевом (40 мМ) растворе.
Как следует из приведенных данных, изменения МП при действии НП в при сутствии ФЭ и КС1 не отличались от тех, которые наблюдали при добавлении НП в раствор, содержащий только ФЭ или КС1, но релаксирующий эффект НП при этом варианте предсокращения (ФЭ+КС1) был достоверно меньше, чем в присутствии только фенилэфрина. Следовательно, при одинаковых реполяризующих эффектах НП проявлял более сильное релаксирующее действие на фенилэфрин-индуцированное, чем на индуцированное деполяризацией мембраны сокращение гладких мышц аорты.
3.6.2.В следующей серии экспериментов ГМК аорты предсокращались норад реналином (НАЛ мкМ) в присутствии 1 мкМ пропранолола.
Нитросоединения (НГ и НП) вызывали зависимое от концентрации расслабле ние таких препаратов. При действии 10 мкМ нитропруссида натрия МН ГМК аорты снижалось до значений 10±4% (п=8;
р0,05) от контрольных (Рис.11).
Следует отметить, что в этом случае НП более эффективно расслаблял ГМК, чем НГ. В гиперкалиевых растворах соотношение расслабляющего действия НП и НГ было обратным. Совместное применение НП (I мкМ) и НГ (1мкМ) вызывало полное расслабление гладких мышц аорты, предсокращенных норадреналином.
Сравнения эффектов донора оксида азота при использовании различных адре номиметиков показало, что при одних и тех же концентрациях фенилэфрина и норад реналина (1 мкМ) добавление в раствор 10 мкМ НП вызывало снижение МН ГМК аорты до сходных значений: 16±3% (п=8;
р0,05) - для ФЭ и 10±4% (п=8;
р0,05) - НА.
Рис. 11. Влияние нитрогли церина и нитропруссида натрия на механическое напряжение ГМК аорты, предсокращенных норадреналином.
По оси абсцисс- логарифм концентрации нитросоединения в моль/л;
По оси ординат- за 100% взяты значения механического напря жения при добавлении 1 мкМ но радреналина в присутствии мкМ пропранолола.
Кривые:
1 - действие нитроглицерина, 2 - нитропруссида натрия.
Остальные обозначения как на рис.2.
Полученные данные позволяют считать, что при действии агадреномиметиков сокращение ГМК обеспечивается процессами, которые проявляют большую чувстви тельность к оксиду азота. Усиление расслабляющего действия нитросоединений на ГМК, предсокращенные БАВ, может быть обусловлено влиянием последних на по следовательные этапы запуска и поддержания сокращения гладких мышц возбуж дающими агонистами: на рецептор-управляемые ионные каналы, потенциал зависимый вход ионов кальция в ГМК и (или) на активируемые при этом процессы, независимые от изменения МП.
З.б.З.Исследование влияния НП на рецептор-управляемый вход ионов кальция в ГМК аорты в условиях инактивационного выключения быстрого потенциал зависимого входа ионов кальция.
Для изучения рецептор-управляемого входа ионов кальция фенилэфрин добав лялся на фоне действия раствора, содержащего 120 мМ хлорида калия (с. 12). Ранее считалось, что прирост МН в ответ на действие ФЭ в этих условиях обеспечивается исключительно открыванием рецептор-управляемых кальциевых каналов [Ходоров Б.И.,1975]. В последние десятилетия убедительно показано, что кроме этого аг адре номиметики включают сигнальный путь, опосредованный активацией метаболизма мембранных фосфоинозитидов, который и обеспечивает генерацию мышцей поддер живаемого сокращения [Berridge М.,1984;
Park S., Rasmussen H.,1985;
Lee M, Severson D., 1994;
Somlyo A.P., Somlyo A.V., 1994].
ФЭ (1мкМ) на фоне 120 мМ КС1 вызывал повышение механического напряже ния до 201 ±6% (п=8;
р0,05) от контрольных значений при неизменном МП. В этих условиях НП в концентрациях 10 - 1000 мкМ не влиял на величину МП и МН ГМК аорты (Рис.6,5).
Полученные данные указывают на то, что расслабляющие эффекты NO на гладкие мышцы, предсокрашенные ФЭ, не связаны с угнетением рецептор управляемого входа ионов кальция в ГМК аорты крысы.
В условиях перегрузки цитозоля ионами кальция оксид азота не влияет и на сигнальный каскад, связанный с гидролизом мембранных фосфоинозитидов.
3.6.4.Влияние NO на электрическую и сократительную активность ГМК моче точника на фоне БАВ изучалось в ПРИСУТСТВИИ гистамина и Фенилэфрина. (Рис.12).
Рис.12 Влияние 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП) на сокращения и по тенциалы действия ГМК мочеточника морской свинки в присутствии биологически активных веществ:
А- действие на фоне 10 мкМ мезатона (+Мезат.), Б- действие на фоне 10 мкМ гистамина (+Гистам.).
Остальные обозначения как на рис. Добавление в раствор Кребса 10 мкМ мезатона (фенилэфрина) на 3-5 мин, при вело к увеличению длительности плато ПД и амплитуды сокращения ГМК мочеточ ника на 51±19% и 88±28% (п=16;
р0.01) соответственно, относительно исходных значений в растворе Кребса. На фоне ФЭ НП (100 мкМ) вызывал снижение амплиту ды сокращения ГМК до исходных значений в отсутствии БАВ (Рис.12,А).
Подобный эффект был получен и при использовании 10 мкМ гистамина. Его применение вело к увеличению длительности плато ПД и амплитуды сокращений ГМК на 61±25% и 104±23% (п=11;
р0.01) соответственно выше исходных. При дей ствии НП (100 мкМ) электрическая и сократительная активность ГМК снижалась до значений, близких к исходным, регистрируемым в отсутствии БАВ (Рис.12,Б).
Эти данные подтверждают, что в ГМК мочеточника, так же как и в аорте, оксид азота более эффективно действует на изменения электрогенеза и сокращения ГМК, индуцированные БАВ, чем на исходную активность или на изменения вызванные де поляризацией мембраны хлоридом калия. Таким образом, дополнительная деполяри зация мембраны ГМК и, следовательно, повышение входящего потока Са2+, ослабля ло реализацию эффектов NO, тогда как активация рецепторов, сопряженных с мета болизмом фосфоинсзитидов усиливало эти процессы.
Известно, что в последнем случае происходит активация обеих ветвей кальцие вой сигнальной системы:
-кальмодулин-зависимой и С-киназной [Park S., Rasmussen Н.,1985;
Somlyo A.P., Somlyo A.V., 1994]. Более выраженное влияние НП на индуци рованное БАВ сокращение, чем на вызванное хлоридом калия, свидетельствует о том, что угнетение С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы, играет существен ную роль в механизмах NO-зависимого расслабления. Это предположение согласует ся с данными о том, что цГМФ угнетает метаболизм мембранных фосфоинозитидов [Реутов В.П.,Орлов С.Н.,1993;
Murthy K.,e.a.,2000].
3.6.5.Исследование роли изменений калиевой проводимости мембраны ГМК в механизмах действия оксида азота на активированные БАВ гладкие мышцы.
В первой серии экспериментов изучался вклад изменений калиевой проводи мости мембраны ГМК в реализацию действия НП на фенилэфрин-индуцированную активацию гладкой мышцы аорты.
На фоне действия 10 мМ ТЭА. добавление 1мкМ ФЭ вызывало прирост МП до 214±8% и МН до 226+7% от контрольных значений в гиперкалиевом (40 мМ) раство ре. Добавление НП в концентрации 10 мкМ приводило к снижению МП и МН этих величин до 179±5% и 184±7% (п=7;
р0,05) соответственно (Рис.13,3).
Добавление 10 мМ ТЭА в присутствии ФЭ ПмкМ) вызывало прирост МП и МН до величин 160±5% и 172±7% (п=7;
р0,05). Нитропруссид натрия (10 мкМ) на этом фоне вызывал снижение МП и МН до 130±5% и 139±6% соответственно (п=7;
р0,05) от контрольных значений в гиперкалиевом (40 мМ) растворе (Рис. 13,4).
Рис.13. Влияние нитропрус сида натрия на механическое напряжение (А) и мембран ный потенциал (Б) ГМК аор ты, предсокращеннымн раз личными факторами:
1-40 мМ хлорида калия;
2 - ЮмМ тетраэтиламмония;
3 - ЮмМ тетраэтиламмония и 1 мкМ фенилэфрина;
4 - 1 мкМ фенилэфрина и ЮмМ тетраэтиламмония.
Остальные обозначения как на рис. Поскольку присутствие в растворе 10 мМ ТЭА в большой степени ослабляло реполяризующее и расслабляющее действие оксида азота на предсокращенные хло ридом калия гладкомышечные полоски, то такие особенности реагирования гладких мышц аорты могут быть обусловлены различиями в природе контрактур, вызванных хлоридом калия и ФЭ. Гиперкалиевая контрактура обеспечивается притоком кальция извне по неинактивирующимся кальциевым каналам плазмалеммы. Поддерживаемое сокращение при действии ФЭ обеспечивается оперированием С-киназной ветви каль циевой сигнальной системы. В первом случае реполяризация и снижение МН может быть достигнуты за счет угнетения кальциевой или (и) активации калиевой проводи мостей мембраны ГМК. Во втором - действие соединений, оказывающих реполяри зующее и расслабляющее действие, должно быть направлено на протеинкиназу С или на процессы, индуцируемые активацией этого фермента.
По-видимому, резкое ослабление такого действия НП в гиперкалиевом ТЭА содержащем растворе может служить свидетельством вовлечения калиевой проводи мости мембраны в механизмы действия оксида азота на контрактуру гладких мышц аорты, вызванную деполяризацией мембраны. Если сокращение этих ГМК вызвано стимуляцией рецепторов, которые активируют метаболизм мембранных фосфоино зитидов, сохранение обычного влияния НП на МП и МН указывает на то, что НП реа лизует свое действие через С-киназный путь передачи внутриклеточного сигнала.
В ГМК мочеточника оксид азота вызывает реакции противоположные тем, ко торые развиваются в ГМК аорты.
Как показано в работах М.Б.Баскакова с соав. (1987-1988), в ГМК мочеточника и taenia coli С-киназная система регуляции электрической и сократительной активно сти использует эффекторные механизмы отличные от тех, которые оперируют в сосу дистых ГМК. Включение этого пути передачи внутриклеточных сигналов ведет к уг нетению электрической и сократительной активности за счет увеличения калиевой проводимости мембраны вследствие стимуляции натрий-протонного обмена.
4. Исследование механизмов действия оксида на процессы регуляции про теинкиназой С электрических и сократительных свойств гладких мышц.
Хорошо известно, что стимуляция арадрено- и Нггистаминэргических рецеп торов мембраны ведет к активации С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы [Rassmussen НД982;
Berridge M., 1984;
Lee M., Severson D., 1994].
Для выяснения роли С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы в меха низмах действия оксида азота на электрогенез и сокращения ГМК аорты и мочеточ ника использовался активатор ПК-С, форболмиристатацетат (ФМА) и ее ингибитор кальфостин С [Fan J., Byron K.,2001;
Coats P., e.a.,2001] 4.1.ФМА. в концентрации 0.5 мкМ к 25мин. необратимо снижал амплитуду, длительность плато ПД и силу сокращений ГМК мочеточника до величин 89±7%, 77±9% и 69*11% (п=6;
р0,05) соответственно, относительно исходных в растворе Кребса(Ри14,Б).
При увеличении концентрации ФМА до 1 мкМ угнетающий эффект нарастал до величин 80±7%, 70±7% и 45±9% (п=6;
р0,05) соответственно (Рис.14,Б).
ТЭА (5мМ) снижал влияние ФМА на ПД и сокращения ГМК мочеточника.
После предобработки ГМК форболовым эфиром НП вместо стимуляции со кращений вызывал их угнетение.
4.2.Кальфостин С в концентрации 0.1 мкМ на 5-7 мин. действия вызывал усиле ние сокращений ГМК мочеточника до 110±9% (п=6;
р0,05) относительно исходных значений. Добавление на фоне кальфостина С НП (100 мкМ) не приводило к харак терной для мочеточника активации сокращения при действии оксида азота (Рис.14,В).
Для диффсренцировки эффектов оксида азота, опосредованных изменениями ионной проводимости мембраны ГМК и обусловлены модуляцией С-киназного пути передачи сигнала, были проведены эксперименты с БАВ.
4.3.БАВ на фоне действия кальфостина С (0.1 мкМ) продолжали оказывать ак тивирующее действие на ПД и сокращения ГМК мочеточника (Рис.14,ГД).
Гистамин (10 мкМ) на фоне кальфостина С увеличивал длительность плато ПД и амплитуду сокращений на 43±7% и 63±11% соответственно (Рис.14,Г). Подобный эффект был характерен и для мезатона (Рис.14Д), добавление которого после каль фостина С, вызывало увеличение длительность плато и амплитуды сокращений ГМК мочеточника дополнительно на 42±8 % и 85±15 % (п=6;
р0,05).
Нитропруссид натрия на фоне кальфостина С и БАВ не оказывал никакого влияния на ПД и сокращения ГМК мочеточника. Следовательно, угнетение С киназной ветви кальциевой регуляции кальфостином С ослабляло эффекты донатора оксида азота - нитропруссида натрия на ГМК мочеточника (Рис.14,ГД).
Рис. 14. Влияние активности протеинкиназы С и нитропруссида натрия на сокращения (а) и потенциалы действия (б) ГМК мочеточника морской свинки:
А-действие 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП) и 5 мМ теграэтиламмония (+ТЭА);
Б - тоже, что А, но на фоне 1 мкМ активатора ПК-С форболового эфира (+ФМА);
В - тоже, что А, но на фоне 0,1 мкМ ингибитора ПК-С кальфостина (+Calphostin);
Г - тоже, что В, но на фоне действия 10 мкМ гистамина;
Д - тоже, что В, но на фоне действия 10 мкМ мезатона.
Остальные обозначения как на рис. Полученные данные свидетельствуют о том, что сигнальная система, опосредо ванная метаболизмом фосфоинозитидов и активацией ПК-С, является одним из клю чевых звеньев в реализации потенциал-независимого влияния оксида азота на сокра тительную активность ГМК мочеточника. Такое заключение согласуется с имеющи мися литературными данными, в которых авторы сообщают об угнетении цикличе ским гуанозинмонофосфатом фосфолипазы С [Реутов В.П., Орлов С.Н.,1993;
Murthy К.,е.а.,1998,1999], одного из ключевых ферментов фосфоинозитидного обмена [Lee М., Severson D., 1994]. Показано также снижение митогенной активности ПК-С при действии НП на изолированные ГМК простаты [Guh J., е.а.,1998].
5. Изучение влияния NO на изменения электрической и сократительной активности, вызванные стимуляцией цАМФ -зависимой сигнальной системы.
5.1.Для активации аденилатциклазы использовался В-адреномиметик изадрин".
В концентрациях 1-10 мкМ он не вызывал значительных изменений ПД и со кращений ГМК мочеточника. Действие 100 мкм НП на фоне изадрина практически не отличалось от контроля без изадрина.
Эффекты на уровне вторичных мессенджеров (цАМФ и цГМФ) можно вос произвести не только, активируя их синтез, но и угнетая ферменты, обеспечивающие их деградацию.
5.2.В следующих экспериментах использовались ингибиторы фосфодиэстераз 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) и винпоцетин [Медведева М.В. 1995;
Jiang Н.,е.а.,1993;
Kiss В;
Karpati E. 1996].
5.2.1.IBMX в концентрации 10 мкМ уменьшал продолжительность плато по тенциала действия (ПД) до 68 ± 11% (п=6;
р0,05) и амплитуду сокращений ГМК до 56 ±8 % и от исходных значений в нормальном растворе Кребса (Рис.15,А).
Рис. 15. Влияние нитропруссида натрия и ингибиторов фосфодиэстера зы на сокращения и потенциалы действия ГМК мочеточника морской свинки А-действие ЮмкМ З-изобутил-1- метилксантина (+IBMX);
Б-то же, что А, но на фоне действия 5 мМ тетраэтиламмония (ТЭА);
B-TQ же, что А, но на фоне действия 1 мкМ винпоцетина (+ВП).
Г-действие 1 мкМ винпоцетина (+ВП) на фоне 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП);
Д-то же, что Г, но на фоне действия 10 мкМ метиленового синего (+ Мет.син.);
Е - то же, что А, но на фоне действия 10 мкМ гистамина (+Гис.).
Остальные обозначения как на рис.3.
В присутствии тетраэтиламмония (ТЭА, 5 мМ) угнетающее влияние IBMX на ПД и сокращения ГМК мочеточника достоверно снижалось. Длительность плато ПД составляла 85±10%, а амплитуда сокращений 89±8% (п=6;
р0,05) от контрольных значений действия ТЭА (Рис.15,Б).
Полученные данные указывают на то, что эффекты IBMX обусловлены повы шением калиевой проводимости мембраны ГМК.
5.2.2.Винпоцетин (ВЩ в концентрации 1 мкМ оказывал противоположный IBMX эффект: происходило увеличение амплитуды сокращений ГМК на 33±7%, а длительность плато ПД при этом уменьшалась на 22±9,% (п=6;
р0,05) относительно контрольных значений в растворе Кребса (Рис.15,В) ШМХ (ЮмкМ) на фоне винпоцетина снижал длительность плато и амплитуду сокращений ГМК до 68±8% и 56±8%, (п=6;
р0,05) соответственно, что свидетельст вуют о различии внутриклеточных мишеней, используемых этими соединениями.
5.2.3.Действие винпоцетина (1 мкМ) изучалось в присутствии 100 мкМ НП и мкМ метиленового синего.
На фоне усиления сокращения ГМК мочеточника 100 мкМ НП на 30±7 % (п=11;
р0.01) добавление 1 мкМ ВП вызывало дополнительное увеличение амплиту ды сокращения еще на 18±8 % (п=6;
р0.05). В присутствии метиленового синего ак тивирующее действие НП и ВП на ГМК мочеточника устранялось (Рис.15,ГД).
При обратной последовательности применения тестирующих агентов НП после действия винпоцетина (33±7%) дополнительно повышал амплитуду сокращения ГМК мочеточника еще на 16±5% (п=6;
р0,05). Проведение предобработки метиленовым синим эти активирующие сокращения ГМК мочеточника эффекты ВП и НП значи тельно подавляло.
Эти данные дают основания полагать, что стимулирующее влияние ВП, также как и НП, на сокращения ГМК мочеточника обусловлено увеличением внутрикле точной концентрации цГМФ. В случае действия НП, это достигается активацией рас творимой фракции ГЦ (стр.П), а при действии ВП - ингибированием процесса гидро лиза цГМФ. Если это действительно так, то на фоне БАВ эффекты ингибитора ФДЭ на электрические и сократительные свойства ГМК мочеточника, должны напоминать действие НП (стр.20).
5.2.4. На фоне 10 мкМ фенилэфрина и. особенно, гистамина активация сокра щения ГМК винпоцетином сменялось на противоположное: происходило угнетение сокращений и укорочение плато ПД. (Рис.15,Е).
Таким образом, применение БАВ приводило к исчезновению активирующего сокращения ГМК мочеточника действия винпоцетина, как и в случае с нитропрусси дом натрия (стр.20, рис. 12). Можно предположить, что эффекты обоих препаратов связаны с повышением уровня цГМФ в цитоплазме ГМК и развитием угнетающего влияния на С-киназную систему кальциевой регуляции, запускаемую БАВ.
Обращение эффектов винпоцетина и НП в присутствии БАВ может быть обу словлено тем, что, как указывалось выше (стр.П), оксид азота, используя в качестве вторичного посредника цГМФ, уменьшает натриевую и кальциевую проводимости мембраны и снижает эффективность оперирования С-киназной ветви кальциевой сиг нальной системы ГМК. Суперпозиция этих противоположных по результату влияний на ПД и сокращения определяет функциональный конечный ответ ГМК мочеточника.
В интактных ГМК доминируют эффекты ослабления угнетающего влияния ПК С на ПД и сокращения. В условиях активации гистамином натриевой проводимо сти и снижения кальциевой проводимости фенилэфрином преобладают эффекты, свя занные с действием NO на ионную проводимость мембраны.
Нельзя исключить и другого варианта развития событий. Известно, что при ак тивации метаболизма мембранных фосфоинозитидов происходит резкое увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ [Berridge М., 1984;
Lee M., Severson D., 1994].
Винпоцетин, ингибируя преимущественно ФДЭ 1-го типа, использующие в качестве субстрата цГМФ [Солнцева Е.И., Буканова Ю.В.,1998;
Kiss В;
Karpati E., 1996], обес печивает еще больший прирост содержания этого ЦН в клетке. Поскольку сродство наиболее активной ФДЭ к цГМФ примерно на порядок выше, чем к цАМФ [Barnes Р., 1995], фермент «переключается» на гидролиз циклического гуанозинмонофосфата.
Следствием этого может быть накопление в клетках цАМФ, который, как известно, угнетает ПД и сокращения ГМК мочеточника [Баскаков М.Б.,1988].
Влияние IBMX на ПД и сокращение, вероятнее всего, опосредовано повыше нием внутриклеточной концентрации цАМФ [Jiang H.,e.a.,1993]. Этот циклический нуклеотид, угнетает электрическую и сократительную активность ГМК за счет по вышения калиевой проводимости мембраны [Kurokawa Y., e.a,1998;
Okogbule Wonodi А.,е.а.,1998] и, потому, присутствие ТЭА снижает его эффекты (РисЛ5,Б).
5.3.Дальнейший анализ действия циклических нуклеотидов на электрические и сократительные свойства ГМК проводился с использованием проникающих анало гов цАМФ и цГМФ (РисЛбУ Добавление дибутирил-цАМФ ПО мкМ) вызывало, подобно IBMX, угнетение сокращения ГМК, тогда как дибутирил-иГМФ (100 мкМ и 500 мкМ). также как НП и ВП, активировал сокращения ГМК мочеточника Следует отметить, что эффекты дибутирил—цАМФ, но не —цГМФ изменяли свою миогенную направленность при 10-ти кратном увеличении концентрации. При менение 100 мкМ дибутирил - цАМФ усиливало сокращение ГМК мочеточника при снижении длительности платно ПД (Рис.16, А и Б).
Рис.16. Влияние про никающих аналогов цикли ческих нуклеотидов на со кращения (а) и потенциалы действия (б) ГМК мочеточ ника морской свинки.
А- действие 10 мкМ ди бутирил-цАМФ Б- действие 100 мкМ дибу тирил-цАМФ В- действие 100 мкМ дибутирил-цГМФ Остальные обозначения как на рис.3.
Таким образом, полученные данные позволяют говорить о возможности неза висимого и разнонаправленного действия цГМФ- и цАМФ на сопряжение возбужде ния-сокращения в гладкомышечных клетках мочеточника при определенных концен трационных соотношениях этих циклических нуклеотидов в клетке. Суперпозиция эффектов ЦН в значительной степени определяет направленность изменений электро генеза и сокращений ГМК. При этом цАМФ снижает длительность плато потенциала действия и угнетает сокращение за счет активации калиевой проводимости мембра ны, а цГМФ усиливает сокращения гладкомышечных клеток, снижая при этом еще и натриевую проницаемость мембраны.
Активация сокращений ГМК мочеточника циклическим гуанозинмонофосфа том может быть связана с увеличением вклада ретикулярного кальция в генерацию сокращения изучаемой гладкой мышцы, а также с ингибированием ПК С.
б.Влияние оксида азота на №,К,2С1-котранспорт в ГМК мочеточника В последние годы активно обсуждается роль и место Ка^К^ДСГ-котранспорта в сократительных реакциях гладких мышц на действие физических факторов (осмо тическое давление), химических и биологически активных веществ. Показано, что в + ГМК аорты выключение Na*,K,2Cl~- котранспорта существенно изменяло эффек тивность действия нитросоединений [Akar F., е.а. 1999,2001].
+ + Влияние модуляции Na,K,2CF- котранспорта на сопряжение возбуждения сокращения в гладкомышечных клетках, а также действие оксида азота на эти про цессы не изучалось.
+ + Для выключения Ка,К,2СГ"-котранспота использовался буметанид [Orlov, S., е.а. 1996;
Akar F., е.а. 1999,2001] 6.1.Добавление буметанида в концентрации 10 мкМ в раствор Кребса на 8- мин. приводило к гиперполяризации мембраны и снижению силы сокращений до 83±12% (п=9;
р0.05) относительно исходных значений в растворе Кребса. Парамет ры ПД при этом практически не изменялись.
В более высоких концентрациях (50-100 мкМ) буметанид не изменял электри ческую и сократительную активность ГМК мочеточника (Рис.17).
Рис. 17. Влияние биологически активных веществ и буметанида на со кращения (а) и потенциалы действия (б) ГМК мочеточника морской свинки:
А - 12-15 мин. после добавления 10 мкМ и 100 мкМ буметанида (+Бум.);
Б - то же, что А, но после добавления 5 мМ тетраэтиламмония (+ТЭА);
В - то же, что А, но после добавления 10 мкМ мезатона (+Мез.)_ Г - то же, что А, но после добавления 10 мкМ гистамина (+Гис.);
Д- то же, что А, но после добавления 100 мкМ нитропруссида натрия (+НП);
Е - то же, что А, но в безнатриевом растворе (-Na).
Остальные обозначения как на рис.3.
6.2.Исследования механизмов гиперполяризационного действия буметанида на мембрану ГМК мочеточника проводили с использованием блокатора калиевых кана лов (ТЭА) и безнатриевых растворов.
Предобработка буметанидом (10 мкМ) вызывала снижение активирующего электрическую и сократительную активность ГМК эффекта 5 мМ ТЭА (Рис17,Б).
На фоне угнетения калиевой проводимости мембраны (ТЭА, 5мМ) добавление 1-0 мкМ буметанида приводило к снижению длительности плато ПД и сокращений ГМК мочеточника до значений 80±16% и 76±18 (п=6;
р0.05), и этот эффект усили вался при увеличении концентрации буметанида до 50-100 мкМ в растворе с ТЭА.
Так как буметанид продолжал оказывать свое угнетающее влияние на ПД и со кращения ГМК мочеточника и в безнатриевых растворах (РисПД), можно предпо ложить, что основную роль в гиперполяризации мембраны ГМК играют нарушения процесса перераспределения ионов хлора при угнетении буметанидом механизмов оперирования Na+,K+,2Cl~-KorpaHcnopra. Имеются сведения о способности буметани да играть роль антагониста хлорной проницаемости мембран в клетках эпителия, эритроцитах и ГМК культуры аорты [Gillen С., Bliss F.,1999;
Adragna N.,e.a.,2000].
В ГМК внутриклеточная концентрация ионов хлора существенно превышает ту, которая следует из расчетной в условиях пассивного распределения этих ионов через мембрану. Неравновесное распределение хлора в основном поддерживается переносом этих анионов через №+,К+,2СГ".-котранспорт. Его ингибирование буме танидом ведет к уменьшению внутриклеточной концентрации ионов хлора и как следствие к снижению входящего хлорного тока через мембрану. Эти процессы и обуславливают гиперполяризацию мембраны при действии буметанида.
б.З.Предобработка гладкомышечных препаратов буметанидом (10 мкМ) ослаб ляло активацию сокращений ГМК мочеточника нитропруссидом натрия. В этом слу чае, добавление 100 мкМ нитропруссида натрия увеличивало амплитуду сокращения до 111 ±7%, тогда как в отсутствии буметанида прирост сокращения при действии НП составлял величину 130±9% (n=ll;
p 0,05) относительно исходных в растворе Кребса, Следует отметить, что на фоне нитросоединения буметанид вызывал так же снижение и электрической активности ГМК мочеточника. Амплитуда и длительность плато ПД. составляли 78±15% и 79±16% (п=6;
р0.05) соответственно, относительно контрольных значений в присутствии 100 мкМ НП (Рис.17,Е).
Увеличение концентрации буметанида в растворе до 100 мкМ на фоне НП при водило к еще большему угнетению сократительного ответа ГМК мочеточника. Ам плитуда сокращений при этом снижалась до 56±10 % (п=6;
р0.05) относительно кон трольных эффектов НП. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что одним из эффекторов оксида является Na+,K*,2Cl~- котранспортер.
6.4.Предобработка препаратов буметанидом (10 мкМ) достоверно снижала ак тивирующий эффект 10 мкМ гистамина и мезатона на ПД и сокращения ГМК моче точника (Рис.17.В-ГУ Относительно эффектов БАВ в растворе Кребса, на фоне 10 мкМ буметанида амплитуда и длительность плато ПД ГМК мочеточника после действия мезатона дос тигали значений 82±12% и 79±16% (п=6;
р0.05);
а после гистамина 73±14% и 76±11% соответственно.
б.З.Угнетающие эффекты буметанида на фоне БАВ (10 мкМ). были значитель но сильнее выражены, чем в интактных ГМК. Так, при действии 10 мкМ буметанида на фоне гистамина, амплитуда и длительность плато ПД ГМК мочеточника снижа лись до значений 79±14% и 64±8% (п=9;
р0.01), а на фоне мезатона - до 86±13% и 76±8% (п=8;
р0.01) соответственно. Угнетение электрических и сократительных свойств ГМК мочеточника на фоне БАВ усиливалось при увеличении концентрации + ингибитора Ка*,К,2СГ-котранспорта в растворе до 50 и 100 мкМ.
Полученные данные указывают на то, что одним из компонентов влияния сти муляции cti-адрен- и Нггистаминэргических рецепторов мембраны ГМК мочеточника является модуляция хлорных токов, величина которых зависит от электрохимическо го потенциала этих анионов, создаваемого Ка*,К.+,2СГ-котранспортом. Увеличение вклада хлорных токов в электрогенез ГМК при действии БАВ и обуславливает боль шую чувствительность электрической и сократительной активности к действию ин гибитора Ка+,К+,2С1~-котранспорта - буметанида.
Полученные результаты дают основания предположить, что более сильное влияние оксида азота в присутствии БАВ (стр.10) обусловлено, по крайней мере, час тично, уменьшением деполяризующего хлорного тока вследствие ингибирования ПК-С и деактивации Ка+,К+,2С1~-котранспорта.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Многочисленные гормоны, медиаторы, простагландины и другие БАВ, а также лекарственные вещества, взаимодействуя со специфическими мембранными рецепто рами, оказывают свое регулирующее влияние на клетки через систему вторичных по средников: цАМФ, цГМФ, ионы кальция и продукты метаболизма мембранных фос фоинозитидов: диацилглицерол и инозитолтрифосфат [Баскаков М.Б. с соавт., 1988 2001;
Ткачук В.А.,1998;
1994;
Kuriyma H.,e,a.,1998].
К настоящему времени накоплено большое количество данных об участии ок сида азота в поддержании постоянного баланса физиологических и патофизиологиче ских процессов в самых различных биологических объектах [Реутов В.П, Орлов С.Н.,1993;
Марков Х.Ф.,1996;
Малышев И.Ю., Малышева Е.3.,1998;
Brune B.,1997;
Bundy R.,1999;
Taylor В., 1997]. Выяснение значимости, особенностей оперирования и функциональных проявлений этих процессов, открывает новые перспективы понима ния механизмов регуляции клеток, органов и систем.
Есть основания полагать, что важную роль в патогенезе таких патологических процессов, как бронхиальная астма, гипертоническая болезнь, дискинезии органов ЖКТ и т.д. [Капилевич Л.В. с соавт., 2001;
Поленов М.А.,1998;
Ignarro L.,e,a.,1999;
Ekerhovd Е„ е.а., 1998,1999;
Denninger J., Marietta M.I999;
Shibata C., e,a., 1998;
Vanhoutte P.,1998] играют нарушения синтеза и/или эффекторных механизмов сиг нального пути, опосредованного оксидом азота и вполне вероятно, что ключевую роль в их коррекции будут играть воздействия, направленные на восстановление нормальной продукции NO и его взаимодействий с основными внутриклеточными сигнальными системами гладкомышечных клеток.
Многочисленные исследования процессов активации и поддержания сократи тельного ответа однозначно указывают на то, что изменения уровня цитоплазматиче ского Са2+ играет главенствующую роль в цикле сокращение расслабление гладких мышц. Таким образом, проблема регуляции сокращения ГМК является, в сущности, проблемой метаболизма внутриклеточного кальция. [Баскаков М.Б. с соавт., 1988 2001;
Ткачук В.А.,1998;
Somlyo A.P., Somlyo A.V., 1994;
Kuriyma H.,e.a.,1998].
Оксид азота как физиологический регулятор метаболизма ионов кальция имеет ряд особенностей. Прежде всего, это газ, который взаимодействует не с рецепторами плазматической или внутриклеточных мембран, а непосредственно активирует фер мент - растворимую фракцию гуанилатциклазы. Об этом свидетельствуют многочис ленные литературные данные, полученные на различных сосудах [Furchgott R., Vanhoutte P., 1989;
Luscher Т., 1989;
Moncada S., 1992]. Проведенные исследования по казали, что, несмотря на ряд принципиальных различий в механизмах сопряжения возбуждения-сокращения в ГМК сосудов, ЖКТ и мочеточника, мишенью для NO в этих мышцах является растворимая фракция ГЦ.
Характерной чертой сопряжения возбуждения-сокращения в ГМК, как и в кар диомиоцитах, является использование внеклеточных ионов кальция, которые участ вуют как в процессах возбуждения (генерация ПД), так и активации сокращения. При возбуждающем действии агонистов вход Са2+ из внешней среды в ГМК осуществля ется по двум типам кальциевых каналов: рецептор-управляемым, стимулируемым БАВ, и потенциал-зависимым, открывающимся при деполяризации мембраны.
Расслабляющее действие оксида азота на ГМК аорты и угнетение сокращений taenia coli могло быть связано с уменьшением входящих токов ионов кальция. Однако проведенные исследования показали, что донор оксида азота НП не оказывал прямого влияния на потенциал-зависимые и рецептор-управляемые пути входа ионов кальция в ГМК. Ограничение потенциал-зависимого потока кальция является следствием по вышения калиевой проводимости мембраны, реполяризации и закрытия части потен циал-зависимых кальциевых каналов.
Из экспериментов с блокаторами калиевых каналов и анализа, полученных вольт-амперных характеристик мембраны изучаемых ГМК следует, что оксид азота модулирует два компонента калиевой проводимости мембраны -кальций активируемую и АТФ-чувствительную. Эти данные еще раз подтверждают точку зре ния М.Ф.Шубы (1984) о том, что в гладких мышцах изменения калиевой проводимо сти, в отличие от других электровозбудимых структур, играют доминирующую роль в реализации различных регуляторных воздействий.
Другим фактором, влияющим на потенциал-зависимый вход ионов кальция, являются хлорные токи, смещающие МП ГМК в сторону деполяризации мембраны.
Принципиальным отличием ГМК от других электровозбудимых структур является наличие высокого электрохимического потенциала для ионов хлора, направленного наружу. Неравновесное распределение ионов хлора в ГМК в основном поддерживает ся переносом этих анионов посредством Ка+,К*,2С1~-котранспорта. Так как ингиби рование буметанидом этого котранспорта в ГМК мочеточника ведет к снижению эф фектов НП, можно предположить, что влияние оксида азота обусловлено, по крайней мере, частично уменьшением хлорного тока вследствие снижения электрохимическо го потенциала для этих анионов из-за угнетения Ка^,К+,2С1~-котранспорта Известно, что внутриклеточные депо ионов кальция, в том числе саркоплазма тический ретикулум (СПР), не играют значимой роли в сокращении большинства ГМК, в сравнении с его внеклеточным пулом [Шуба М.Ф., Бурый В.А.,1984|. Как указывалось выше, в присутствии ингибитора Са^-АТФ-зы СПР тапсигаргина зна чительно ослаблялось активирующее действие НП на сокращения ГМК мочеточника.
Эти данные можно рассматривать как свидетельство того, что природа активации со кращения ГМК мочеточника частично обусловлена стимуляцией нитропруссидом натрия кальциевого насоса СПР. Повышенная предзагрузка ретикулума Са2* повыша ет значимость этой фракции в обеспечении сокращений ГМК мочеточника (стр. 17).