Экология грибов рода trichoderma (pers: fr.) бассейна реки енисей, их биологические свойства и практическое использование
На правах рукописи
САДЫКОВА Вера Сергеевна
ЭКОЛОГИЯ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA (PERS: Fr.) БАССЕЙНА
РЕКИ ЕНИСЕЙ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И
ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Специальности:
03.02.12 – Микология
03.01.06. – Биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета (г. Красноярск) и кафедре микологии и альгологии Московского государственного университета им.
М.В. Ломоносова Научные консультанты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова А.Н. Лихачев доктор биологических наук, зав. кафедрой микологии и альгологии МГУ имени М.В.
Ломоносова А.В. Кураков
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, зав.
кафедрой биохимии ФГБОУ «Казанский государственный университет» имени В.И.
Ленина Ф.К.Алимова доктор биологических наук, руководитель секции коллекции культур ГНЦА М.В. Бибикова доктор биологический наук, профессор кафедры биотехнологии РХТУ имени Д.Г. Менделеева Н.Б. Градова ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный
Ведущая организация:
аграрный университет»
Защита состоится 2012 г в аудитории М-1 в ч. мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, ГСП – 2, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет Факс – (095) 939–3970.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М. В. Гусаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Изучение биологии, филогении, распространения, а также ряд аспектов, связанных с механизмами биоконтроля, биосинтеза ферментов и антибиотиков микромицетами рода Trichoderma, благодаря их широкому применению в практике, к настоящему времени изучен достаточно подробно (Сейкетов,1972;
Александрова, 2000;
Алимова, 2005;
Samuels, 1996;
2006). Однако, несмотря на множество исследований, потенциал грибов рода Trichoderma не только не исчерпан, но и не до конца раскрыт. К настоящему времени практически отсутствуют данные, связанные с исследованием их аллелохимического воздействия на микробиоту, простейших, беспозвоночные и растения. Установлено, что виды этого рода синтезируют более 200 биологически активных веществ (Rejno, 2008) и могут успешно применяться в медицине и сельском хозяйстве. Недостаточная изученность биохимического состава видов рода Trichoderma не дает возможности безопасного использования их биомассы в кормопроизводстве и других отраслях народного хозяйства и медицины.
Описание видов, распространенных на территории России, касается лишь европейской ее части, сведения о видовом составе Trichoderma на территории азиатской части России, в частности, в Сибири, малочисленны. Изучению видов на территории бассейна реки Енисей, протяженность которого составляет более 3 тыс.
километров, посвящено небольшое число работ (Якименко, 1996;
Прудникова, 2000;
Громовых, 2002). Эти исследования носят направленный характер поиска штаммов продуцентов биопрепаратов защиты растений. На территории бассейна реки Енисей, охватывающей три климатических пояса: арктический, субарктический и умеренный, в которых расположены восемь природных лесорастительных зон, полномасштабные исследования видов рода Trichoderma и оценки их экологической значимости не проводились. Не исследована молекулярно-генетическая диагностика видов рода Trichoderma, распространенных на территории бассейна реки Енисей.
Целенаправленный поиск видов, обладающих регуляторной активностью по отношению к организмам из разных таксонов, как и выявление среди них продуцентов для биотехнологических производств невозможен без четкого представления об их распространении в экосистемах и проявления функциональных свойств в этих условиях. Созданные коллекции, на основе новых активных штаммов, могут быть потенциалом для отбора штаммов грибов рода Trichoderma и использования их в различных сферах биотехнологии, сельского хозяйства и растениеводства.
Цель работы – исследование разнообразия и гетерогенности видов рода Trichoderma в наземных экосистемах бассейна реки Енисей и оценка возможности их использования в биотехнологии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- характеристика видового состава и распространения грибов рода Trichoderma в различных компонентах наземных экосистем бассейна р. Енисей;
- создание коллекции культур микромицетов рода Trichoderma рода Trichoderma (по культурально - изучение гетерогенности видов морфологическим свойствам, температуре, аэрации, потреблению субстратов, антибиотической активности, чувствительности к тяжелым металлам) - исследование вегетативной совместимости моноспоровых штаммов рода Trichoderma;
Исследование возможности использования штаммов рода Trichoderma в биотехнологии:
- поиск штаммов рода Trichoderma с высокой антагонистической активностью к фитопатогенным грибам для создания биопрепарата для защиты растений;
- скрининг штаммов, стимулирующих рост хвойных и злаковых растений и идентификация соединений, ответственных за этот эффект;
- изучение биодеструкции растительных субстратов отобранными штаммами при твердофазном культивировании для биотехнологии получения биофунгицидов и усовершенствования технологии вермикомпостирования;
- оценка активности штаммов рода Trichoderma к патогенным и условно патогенным бактериям для создания препаратов, ускоряющих элиминацию этих организмов из почв и органических остатков (компостах) - испытание полученных опытных образцов биофунгицидов и вермикомпостов против возбудителей болезней хвойных и злаковых растений на естественных и искусственных инфекционных фонах.
Скрининг штаммов по биохимического составу (содержание белка, аминокислотного и липидного состава) мицелия штаммов рода Trichoderma для использования как компонента селенсодержащих кормовых добавок.
Изучение противоопухолевой активности штаммов рода Trichoderma для отбора продуцентов противоопухолевых препаратов.
Научная новизна. В результате масштабных инвентаризационных исследований ненарушенных лесных почв и агроценозов бассейна реки Енисей составлен список видов Trichoderma, среди которых T. citrinoviride, T. hamatum и T.
atroviride отмечены впервые. Показано, что возникающие внутривидовые группировки у видов рода Trichoderma выполняют роль краевых популяций, осуществляющих освоение новых субстратов и эколого-трофических ниш. Установлена высокая пластичность аэробного и анаэробного метаболизма, что обеспечивает специализацию к субстратам и поддержание численности видов рода Trichoderma в различных лесорастительных зонах бассейна реки Енисей. Показано, что неполная изоляция группировок снижает возможность образования гетерокарионов, что в конечном итоге, приводит к морфологическим, культуральным и биохимическим различиям клонов.
В области фундаментальной биотехнологии исследование дает исходный материал для инвентаризации рода Trichoderma и теоретического обоснования методов направленного поиска и скрининга промышленно важных штаммов микроорганизмов.
Показано, что популяции грибов рода Trichoderma являются природным резервуаром для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений. Стабильность культурально-морфологических признаков является критерием отбора штаммов-продуцентов для получения целевых продуктов в биотехнологии.
Впервые установлена ростстимулирующая активность у выделенных штаммов рода Trichoderma в отношении растений и каллусов злаковых и хвойных, связанная со способностью синтезировать вещества ауксиновой природы (индолилуксусную кислоту);
отобраны перспективные штаммы для получения биопрепаратов, рекомендованные для стимулирования роста и защиты растений от корневых гнилей, вызываемых фитопатогенами из родов Alternaria, Bipolaris и Fusarium.
В результате исследований биологической активности метаболитов и экстрактов из спор и мицелия штаммов рода Trichoderma в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и линий опухолевых клеток изучен механизм токсического действия и даны рекомендации для использования активных штаммов как продуцентов биологически активных противоопухолевых соединений.
Исследован биохимический состав биомассы и культуральной жидкости штаммов T. asperellum, T. harzianum, T. koningii и T. viride. Изучено влияние селена на накопление биомассы штаммов рода Trichoderma при поверхностном и глубинном культивировании и показана возможность их использования для получения кормовых добавок.
Основные защищаемые положения:
1. Лесные подстилки, верхние горизонты почв и корневые системы древесных растений – ведущие факторы в формировании видового состава и численного пула грибов Trichoderma. Представители этого рода предпочитают растительный опад, богатый лигноцеллюлозной органикой, их численность падает в более глубоких горизонтах почв, а также в ризосфере растений, особенно древесных.
2. Абиотические факторы (температура, аэрация, влажность) и субстратная специфичность определяют доминирование определенных видов и популяций рода Trichoderma.
3. Качественная популяционная структура видов характеризуется значительной физиологической пластичностью и представляет собой мозаику клонов, с различными типами совместимости, скорости роста, спороношения, антибиотической активности и конкурентоспособности. В большинстве случаев виды представлены агрегатами гетерогенных популяций с разным проявлением частот культурально-морфологических типов.
Популяции грибов рода Trichoderma являются природным резервуаром 4.
для поиска штаммов-продуцентов биологически активных соединений, эффективных для контроля широкой группы организмов: фитопатогенных грибов, условно патогенных и патогенных бактерий, опухолевых клеток, а также оказывающих влияние на рост высших растений.
Практическая значимость работы. Создана коллекция штаммов рода Trichoderma, проведен скрининг штаммов, имеющих потенциальную ценность для производства биопрепаратов стимулирования роста и защиты растений: T. asperellum «Mg-6» (ВКПМ F-878 и T. harzianum «M99/5» (ВКПМ F-888);
вермикомпостов: T.
asperellum «Mg-97» (ВКПМ F-675);
кормовых добавок:T. asperellum штамм «TH-5» и противоопухолевых соединений: T. asperellum Т-310 (ВКМ F4340D), T. harzianum ТV4-1 (ВКМ F4341D) и T. harzianum М99/51 (ВКПМ F- 1027).
Показана возможность использования штаммов T. asperellum «Mg-6» и T.
harzianum «M99/5» для переработки отходов предприятий деревообрабатывающей и гидролизной промышленности. Подобран рациональный растительный субстрат для твердофазного культивирования продуцентов. Разработана в лабораторных условиях технология получения биопрепарата Триходермин-М. Наработана опытная партия биопрепаратов с титром 3.5·109 КОЕ/г антагонистически активных штаммов и проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на 1 –м конгрессе микологов России.- Москва, 2002;
XIV Congress of European Mycologists, Ялта, 2003;
XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России» Новосибирск-Барнаул, 2003;
75 th Anniversary Meeting Canadian Phytopathology Society, Ottawa, 13-16 June, 2004;
9 th Internetional Workshop on Trichoderma and Gliocladium, April 6-8, Vienna, Austria,2006;
2-й рос. конф. «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», 2006;
Internetional Symposium “EU Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme”, June 5-9, 2006, St.-Petersburg;
IX Всероссийском популяционныйом семинаре «Особь и популяция - Стратегия жизни», 2-7 октября, 2006, Уфа;
Международной школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна 28 ноября - 1 декабря, Пущино, 2006;
4 Съезда Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова 5 7 декабря, Пущино, 2006;
International symposium “Best practice in disease, pest and weed management”, 10-12 May, Berlin, 2007;
Международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений». – Новосибирск, 2008;
5 съезде биотехнологов России. – Москва, 2008;
VII Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии», Пермь, 7-13 сентября 2009;
Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», проходившей в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 15 17 марта, Москва, 2010;
Всероссийская конференция «Биологически активные вещества», посвященная 90-летию М.С. Егорова, 29-30 ноября, Москва, 2011.
Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: РФФИ-офи – №06-04-08040-офи «Создание высокопродуктивных, устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»;
РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ «Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса»;
РФФИ "Енисей" – № «Биологический контроль биотехнологии сокультивирования хвойных в культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma и Streptomyces»;
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 печатных работ, в том числе 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения исследований.
Структура и объем работы. Диссертационная работа стоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации … страниц (основной текст … страниц, приложение … страницы). Диссертация содержит … рисунков и … таблиц. Список литературы включает в себя … источников, из них … на иностранных языках.
Основная работа по получению материала, Личный вклад автора.
обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. В выделении отдельных изолятов Trichoderma и фитопатогенов, а также полевых испытаниях принимали участие д.б.н., проф. Громовых Т.И., к.б.н., доц. Прудникова С.В., к.б.н., доц. Литовка Ю.А., к.б.н. Заика Н.А., к.б.н. Сенашова В.С. В организации полевых исследований на базе КрасНИИСХ принимали участие д.б.н. Зобова Н.В., на базе Института Леса им. В.Н. Сукачева д.б.н. Третьякова И.Н., ГУ «Мининский лесхоз» Гребинник Г.В.
Молекулярно-генетические исследования изолятов Trichoderma проводились при активной помощи заведущего лаборатории микологии г. Оттава Дж. Биссетта, сотрудника Института химической инженерии в Вене, д.б.н. Дружининой И.А, изолятов фитопатогенных грибов при активной помощи заведущего лаборатории фитопатологии Дж. Лазаровича г. Лондона (Канада), токсикологическую оценку экстрактов спор и мицелия проводили по методу разработанной в МГУПБ под руководством к.б.н. Е.Г. Черемных, оценку полученной пищевой добавки проводили на установке «Искусственный желудок».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показаны научная новизна и практическая ценность результатов работы.
1 Обзор исследований грибов рода Trichoderma: систематика, распространение и биология видов, практическое использование Целенаправленный поиск видов грибов, обладающих регуляторной активностью в отношении организмов из разных таксонов как в природной среде, так при их интродукции в агросистемы, а также выявление среди них продуцентов, способных синтезировать те или иные биологически активные вещества, не возможен без четкого представления об их распространении в экосистемах, особенностей эколого-трофических ниш и проявления функциональных свойств в этих условиях. В равной мере это относится и к представителям рода Trichoderma, которые, входя гетеротрофный блок микроорганизмов, влияют на почвообразовательные процессы, улучшая структуру почвы, участвуя в образовании гумуса за счет биоконверсии и минерализации растительных остатков и регуляции комплекса микробиоты почв, ограничивая развитие фитопатогенных видов.
Доминирование грибов Trichoderma в микробоценозах связано с реализацией в экосистемах различных типов гетеротрофного и биотрофного взаимодействий с микробиотой и макробиотой (путем паразитизма и даже оппортунистического эндофитизма, и способностью разрушать органический материал и сохранять супрессивность почв).
С момента первого описания этого рода в 1794 г по 1969 г было дано морфологическое описание 8 агрегатов рода Trichoderma, за последующие 20 лет (к 1991 г) число описанных видов возросло до 27. В эру молекулярно-генетического анализа наблюдается критический пересмотр старой систематики Trichoderma, основанной на морфологических критериях. В результате количество видов Trichoderma к 2002 г возросло до 46. Мультигенный филогенетический анализ позволили выявить 88 видов Trichoderma к 2005 г. С помощью компьютерной программы Barcode к началу 2006 г. определено 110 видов. Предполагается, что в ближайшие годы количество видов Trichoderma может достигнуть 130 и более.
В настоящее время исследования рода Trichoderma идут параллельно по трем направлениям: (а) биоразнообразие и распространение в различных регионах биосферы, (б) скрининг видов, перспективных для биотехнологии из новых выделенных и описанных изолятов Trichoderma и (в) разработка методологии быстрой и правильной идентификации и построения филогенетического древа рода Trichodema /Hypocrea.
2 Объекты и методы исследований Объекты исследований. В работе использовали созданную коллекцию видов грибов рода Trichoderma, состоящую из 611 штаммов, выделенных из почв различных лесорастительных зон на территории бассейна реки Енисей, плодовых тел, образцов растительного материала и семян растений. Штаммы поддерживаются в коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова и Центре биотехнологии и микологии СибГТУ.
Оценку антагонистической активности штаммов рода Trichoderma проводили с использованием тест-культур фитопатогенов злаков: Alternaria sp., B. bicolor, B. еllisii, В. nodulosa, B. zeae, F. chlamydosporum, F. heterosporum, F. sambucinum, F. solani и F.
sporotrichioides из коллекции Центра биотехнологии и микологии СибГТУ.
В качестве тест-объектов для определения ростстимулирующей активности были использованы семена и каллусы: лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), пшеницы линии «КС-1554», пшеницы яровой линии «КС-1607», ячменя сорта «Красноярский 80». Эксплантами для индукции каллуса злаковых служили незрелые зародыши семян ячменя и пшеницы, для хвойных растений использовали незрелые зиготические зародыши элитных деревьев-доноров.
Анализ противоопухолевой активности проводили на линиях клеток: асуитной карциновы Эрлиха, НаСаТ – кератиноциты человека;
HEK 293Т-клетки эмбриональной почки человека и K562- линия клеток хронической миелоидной лейкемии. Анализ антибактериальной активности проводили на условно-патогенных бактериях из коллекции КрасГМА (23 штамма) и резистентных госпитальных стафилококках (11 штаммов), выделенных из больных людей из коллекции Института Проблем Севера СО РАН. Биотестирование на токсичность проводили на двух тест объектах простейших: Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis.
Методы исследования Образцы почвы отобраны в соответствии с правилами отбора проб для микробиологического анализа (Методы..., 1991). Выделение изолятов грибов рода Trichoderma из образцов почв, ризосферы, ризопланы корней и филлопланы, растительных остатков, плодовых тел макромицетов проводили в 1997 – 2008 гг. на территории бассейна реки Енисей по методу Д.Г. Звягинцева (Звягинцев, 1990).
Идентификацию штаммов рода Trichoderma проводили по культурально морфологическим (Александрова с соавт., 2001;
Chaverri et al., 2003;
Samuels, 2003) и генетическим признакам (Druzhinina et al., 2005). Морфологическую идентификацию проводили по следующим признакам: строение репродуктивных органов, очертание спор, размеры мицелия (методом сканирующей электронной микроскопии). Для подтверждения видовой принадлежности проводили генетическую идентификацию под руководством к.б.н., Тухбатовой Р.Э., за что автор выражает ей благодарность.
Исследовались участки ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и ген tef1. Результаты секвенирования фрагмента гена tef1 обрабатывали при помощи пакета программ Lasergene 5.03 (DNASTAR, Inc., США). Для анализа секвенсных хроматограмм использовали программу SeqMan и дальнейшим выравниванием последовательностей и экспорта их в формате GCG с использованием программы MegAlign.
Молекулярную идентификацию нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы TrichoMark – TrichoBLAST.
Моноспоровые культуры грибов получали методом разведения конидиальной суспензии на жидких питательных средах с добавлением глицерина (Лихачев, 1994).
О стабильности моноспоровых и исходных штаммов судили по их разделению на культурально-морфологические типы (КМТ) и появлению секторов при росте на чашках Петри. Цвет колоний определяли по шкале А.С. Бондарцева (1953).
Вегетативную совместимость моноспоровых клонов изучали парным сращиванием колоний на чашках Петри на среде Чапека, с последующим микроскопированием пограничной зоны между колониями. Характер проявления реакций при визуальной оценке и микроскопировании сравнивали с описаниями, приведенными у Ю.Т.
Дьякова и А.В. Долговой (1995).
Изучение способности к анаэробному росту проводили в анаэростатах (“BioMerieux Co”, Франция), в которых инкубировали культуры в течение 7–10 сут в анаэробных условиях при 25°С. Анаэробиоз создавали с помощью газовых анаэробных пакетов “GENbox anaer”, который контролировали индикаторами на основе резазурина (“Oxoid Limited”, Англия). Активность спиртового брожения определяли у штаммов, проявивших способность к росту в условиях анаэробиоза на жидкой минеральной среде. Содержание спирта определяли в культуральной жидкости методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе модели Chrom 3700 с пламенно-ионизационным детектором, колонка SOVPOL (1,5 м) и Parapac Q (0,5 м), газ носитель - аргон, температура колонки 160 С и 130 С, испарителя 240 С, детектора 250 С.
Интенсивность утилизации органических соединений определяли методом Biolog Phenotype MicroArray (PM) system (Tanzer et al., 2003;
Druzhinina, 2006;
Кожевин и др.,2008).
Оптимум роста при различных температурах определяли путем культивирования на сусло-агаре. Температурный режим культивирования задавали в пределах 4-х градаций: 15-20, 20-25, 25-30 и 30-35 С.
Оценку влияния тяжелых металлов на рост штаммов Trichoderma проводили на твердых и жидких средах, содержащих различные концентрации от 0,01 до 10 ммоль меди, цинка, кадмия, свинца. Оценку остаточного содержания ТМ в растворах проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе Agilent 7500 Series ICP-MS.
Антагонистические свойства штаммов рода Trichoderma, в отношении фитопатогенных микромицетов, оценивали по показателям гиперпаразитической и антибиотической активности. Изучение антибиотической активности проводили методом лунок и перпендикулярных штрихов (Егоров, 2005).
Антибактериальную активность компонентов, выделенных из культуральной жидкости, и экстрактов мицелия штаммов оценивали методом лунок (Егоров, 2005) на условно-патогенных бактериях из коллекции КрасГМА и резистентных госпитальных стафилококках, выделенных из больных людей из коллекции Института Проблем Севера СО РАН.
Противоопухолевую активность компонентов, выделенных из культуральной жидкости, и экстрактов спор штаммов изучали in vitro на 4-х линиях опухолевых клеток. Фильтраты культуральной жидкости и экстракты из спор штаммов рода Trichoderma тестировали на линиях опухолевых клеток, предоставленных лабораторией клеточных взаимодействий ИБХ РАН. Для выявления у исследуемых образцов противоопухолевой активности проводили анализ цитостатичности in vitro с помощью МТТ теста и оценку проапоптотической активности. Анализ фракционного состава активных компонентов культуральной жидкости проводили с помощью жидкостного хроматографа "Shimadzu" (Япония) на колонке с обращенной фазой Perkin Elmer C18 (250х4,6 мм, 5мкм) в градиенте ацетонитрила 0-100% в 0,1% трифторуксусной кислоте при скорости потока 1,5 мл/мин. и длине волны 214 нм.
Оценку токсичности исследуемых штаммов в отношении простейших проводили по методу Е.Г. Черемных(2005), состоящего из трех последовательных этапов. На первом этапе оценивали выживаемость тест-объектов инфузорий Paramecium caudatum в водных и ацетоновых экстрактах мицелия и спор и культуральных фильтратах. На втором этапе проводили оценку токсичности на тест объектах Tetrahymena pyriformis. На третьем этапе исследований подбирали нетоксичную концентрацию и увеличивали время экспозиции объекта с использованием обеих популяций простейших.
Ростстимулирующее действие метаболитов штаммов рода Trichoderma изучали по показателям энергии прорастания и всхожести семян с использованием метода влажных камер (ГОСТ 13056.5-76). Оценку стимуляции роста каллусов злаков и хвойных растений проводили путем их культивирования с добавлением метаболитов грибов при постоянном освещении и температуре 20-24С, длительность каждого пассажа составляла 40 суток. Пролиферацию каллусных культур проводили на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 1% и 3% концентрации фильтратов культуральной жидкости штаммов Trichoderma в питательную среду.
Содержание индолилуксусной кислоты в культуральной жидкости штаммов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе KNAUER на колонке Zorbax с диаметром 4,6 мм, длиной 250 мм, заполненной обращенным фазовым сорбентом SB-C18 зернением 5 µkм. В качестве элюента использовали раствор ацетонитрила с 2 % уксусной кислотой в соотношении (1:4). Детектирование осуществляли при 280 нм. ИУК определяется в диапазоне от 0 до 5 мг/л (r=0,9998), со стандартным отклонением пика 3,5 % (n=6).
Изучение биохимического состава биомассы и метаболитов грибов рода Trichoderma проводили по классическим методам. Общее количество белка определяли по методу Кьельдаля (Емельянова, 1976);
аминокислотный состав - на автоматическом аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия), общее содержание триптофана изучали спектрофотометрическим методом, разработанным в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, содержание липидов с их последующим разделением на нейтральные, глико - и фосфолипиды – по методу Блайя и Дайера (Кейтс, 1975).
Концентрацию селена в мицелии грибов рода Trichoderma измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии (атомно-абсорбционный спектрометр «Квант ZЭТА»). Процедуру минерализации проб в аналитических автоклавах проводили в соответствии с МУК 4.1.985-00. Токсикологическую оценку мицелия проводили на установке «Искусственный желудок», разработанной в МГУПБ.
Твердофазное культивирование грибов рода Trichoderma проводили на растительных субстратах: коре пихты исходной и после различных химических обработок, коре лиственницы;
гидролизном лигнине, вегетативной части топинамбура исходного и после водной экстракции. Определение химического состава сырья после биодеструкции проводили по общепринятым в химии растительного сырья методикам (Химия древесины, 1994).
Полевые испытания биопрепаратов на основе активных штаммов проводили на посевах Pinus sibirica в Мининском лесном питомнике, расположенном на территории Мининского опытного лесного хозяйства (5610c.ш., 9242в.д).
Эффективность действия препарата в агроценозе проводили на пшенице линии «КС 1554» и ячмене сорта «Красноярский-80» оценивали после сбора урожая по следующим параметрам: масса 1000 зерен, высота растений, продуктивная кустистость, количество зерен в колосе, количество растений к уборке, урожайность.
Для оценки влияния внесения биопрепаратов на микробиоту почв использовали методы, разработанные Д.Г. Звягинцевым (1991) и Й. Сэги (1983).
Эксперимент проводили в трех-пяти повторностях. Статистическую обработку результатов экспериментов и оценку достоверности различий проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95% с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007 и Statistica 8.0.
3 Распространение видов Trichoderma на территории бассейна реки Енисей 3.1 Распространение и видовой рода Trichoderma В настоящей работе исследовали почвы всех лесорастительных зон территории бассейна реки Енисей, имеющие аграрную значимость для сельскохозяйственных нужд и лесовосстановления. Исследование подстилки и целинных и окультуренных почв ризосферы хвойных в трех климатических поясах (арктическом, субарктическом и умеренном) позволило выделить 587 штаммов как материала для дальнейших исследований и оценки биоразнообразия и значимости видов рода Trichoderma. В конечном итоге было проведено исследование 374 образцов восьми типов целинных и окультуренных почв.
Для установления экологических мест обитания видов рода Trichoderma особое внимание было уделено исследованию 53 партий семян хвойных (урожая 1999-2009 гг.), собранных на территории Красноярского края и республик Хакасия и Тыва, и 64 партий семян злаков (урожая 2000-2009 гг.), выращенных в исследуемых агроценозах. Обследованию подлежали также плодовые тела макромицетов, собранные на территории Красноярского края и Республики Тыва и имеющие визуально поражения микромицетами. В период с 1997 по 2010 гг. нами было выделено 620 изолятов Trichoderma, которые и послужили основным материалом для исследования биологических свойств и оценки видового разнообразия.
Как показали наши исследования, представители рода Trichoderma встречаются в почвах всех исследуемых климатических зонах, включая самые северные широты до 65 0 с.ш.. Самая высокая встречаемость изолятов Trichoderma отмечена в целинных и почвах и почвах лесных питомников. Антропогенные ландшафты агроценозов злаков характеризовались снижением частоты встречаемости и видового разнообразия Trichoderma. Из комплекса исследованных антропогенных ландшафтов исключение составляли почвы Маганского и Мининского лесных питомников. Этот факт, вероятно, связан с интродукцией в течение ряда лет популяции биоконтрольных штаммов Trichoderma в составе биофунгицидов для борьбы с грибными заболеваниями сеянцев хвойных.
При идентификации изолятов с помощью культурально-морфологических и молекулярно-генетических методов в почвах 3-х климатических зон идентифицировано 8 видов. Среди видов, ранее не обнаруженных на исследуемой территории оказались: T. citrinoviride Bissett, T. hamatum (Bon) Boner и T. atroviride Koning. (таблица 1). Исследование частоты встречаемости видов Trichoderma установлено, что наиболее распространенным и часто встречающимся оказался вид T.
asperellum - 235 выделенных изолятов, что составило 37,9 % от общего числа выделенных. Представители этого вида были выделены практически из всех образцов, при этом большинство выделенных изолятов этого вида являются почвенными.
Таблица 1 - Список видов и количество изолятов грибов рода Trichoderma, выделенных на территории бассейна реки Енисей Вид Количество изолятов % от общего Число изолятов числа Trichoderma sect. Trichoderma T. asperellum Samuels, Lieckfelt et 37,9 Nirenberg Группа T. viride Pers, Fr. 10,5 T. hamatum (Bon) Boner 3,8 Группа T. koningi Oudemans et 4,2 Koning Trichoderma sect. Pachybasium T. harzianum Rifai 26,1 Trichoderma sect. Longibrachiatum T. citrinoviride Bissett 8,5 T. longibrachiatum Rifai 5,2 T. atroviride 3,7 Общее число выделенных изолятов На втором месте по распространенности был вид T. harzianum, доля изолятов которого составила 26,1 % от общего числа. Изоляты этого вида также преимущественно выделялись из целинных и антропогенных почв, подстилки, но не были обнаружены на семенах злаковых и хвойных растений, листьях и шишках. Доля T. viride составялет 10,5 % всех исследуемых изолятов, причем, большинство выделялись из подстилки, лесного опада, образцов гниющей древесины и ризосферы корней. Следует отметить, что этот вид не встречался в антропогенных почвах и агроценозах. Часть изолятов этого вида были выделены из плодовых тел.
Виды из секции Longibrachiatum находятся на четвертом месте по распространенности и численной характеристике, доля T. citrinoviride составила 8, %, а T. longibrachiatum – 5,2 % от общего количества. Изоляты этих видов также выделены из богатых органикой субстратов: подстилки, верхних горизонтов целинных почв и плодовых тел. Далее по распространенности следуют группа видов T. koningii (4,2 %), изоляты которой были обнаружены в верхних горизонтах целинных почв, гниющей древесине, а также хвои, шишек и корневой системы живых деревьев. Самыми малочисленными по количеству и распространению были изоляты видов T. hamatum (3,8 %) и T. atroviride (3,7 %), предпочитающие более глубокие почвенные горизонты.
Можно проследить некоторые закономерности по распределению некоторых видов в разных климатических зонах. Так, вид T. asperellum имеет широкий диапазон распространения и присутствует как в почвах северных, так и южных областей, однако редко выделяется в южных районах, в леечных биоценозах Тывы и Хакасии.
Вид T. atroviride встречался в основном в холодных климатических условиях Эвенкии, а в более южных областях встречаемость этого вида снижается. Виды T.
hamatum, T. citrinoviride, T. harzianum имеют широкий диапазон распространения, однако их находки немногочисленны в северных почвах, а со снижением широты их численность увеличивается.
Анализ исследуемых почв показал, что наибольшее разнообразие видов обнаружено в целинных почвах и наименьшее в антропогенных ландшафтах.
Уменьшение видового разнообразия в антропогенных ландшафтах и агроценозах отмечено ранее и для других микромицетов (Марфенина, 2004). Среди типичных видов агроценозов нами обнаружено только пять: T. asperellum, T. harzianum, T.
hamatum, T. koningi и T. viride. В почвах агроценозов и лесопитомников не были найдены виды T. atroviride, T. longibrachiatum и T. citrinoviride.
Таблица 2 – Встречаемость видов рода Trichoderma в почвах лесорастительных зон бассейна реки Енисей № Пространстве Временная Чис Значимость вида Вид п/п нная частота, частота, (%) ло (%) изол ятов Зона тундры T. asperellum 1. 3.9 3 случайный 9. Зона лесотундры T. asperellum 1. 4.1 6.8 2 случайный T. atroviride 2. 5.0 17.0 9 случайный Северная тайга T. asperellum 1. 11.4 19.0 12 случайный T. atroviride 2. 7.9 17.2 4 случайный T. longibrachiatum 3. 10.4 12.9 2 случайный Средняя тайга T. asperellum 1. 59.1 62.9 51 типичный доминирующий T. atroviride 2. 3.4 7.0 2 случайный T. longibrachiatum 3. 7.6 15.0 3 случайный T. koningii 4. 33.5 38.7 13 типичный редкий Южная тайга T. asperellum 1. 65.8 82.6 типичный доминирующий T. atroviride 2 2.7 6.4 случайный T.citrinoviride 3 33.2 42.0 типичный частый T. hamatum 4 3.4 7.5 случайный T. harzianum 5 62.6 77.7 типичный доминирующий T. koningii 6 4.7 10.4 случайный T. longibrachiatum 7 3.5 9.7 случайный T. viride 8 32.8 38.9 типичный частый Травяные леса с островами лесостепи T. asperellum 1. 58.5 64.0 типичный доминирующий T. atroviride 2 6.0 12.5 случайный T. citrinoviride 3 23.4 47.8 типичный редкий T. hamatum 4 7.2 12.0 случайный T. harzianum 5 56.4 68.6 типичный доминирующий T. koningii 6 6.5 11.4 случайный T. longibrachiatum 7 18.6 31.4 типичный редкий T. viride 8 45.1 55.7 типичный частый Островные лесостепи T. asperellum 1. 67.0 75.0 типичный доминирующий T. atroviride 2 4.7 8.0 случайный T. citrinoviride 3 35,7 52,0 26 типичный частый T. hamatum 4. 5.0 17.0 случайный T. harzianum 5. 33.6 49.1 28 типичный частый T. koningii 6. 18.7 31.2 11 типичный редкий T. longibrachiatum 7 16.2 30.3 11 типичный редкий T. viride 8 30.4 37.6 22 типичный частый Влажная подтайга и горно-черневая темнохвойная тайга T. asperellum 1. 35.0 55.1 типичный частый T.citrinoviride 2 3.8 22.2 случайный T. hamatum 3 8.7 16.3 случайный T. harzianum 4 23.6 46.7 типичный редкий T. koningii 5 5.5 13.0 случайный T. longibrachiatum 6 4.6 11.5 случайный T. viride 7 33.2 42.0 типичный частый 3.2 Влияние абиотических факторов на рост и развитие грибов рода Trichoderma Структура популяции грибов, в зависимости от характеристики биологических свойств входящих в них клонов, включая их генетическую и адаптивную изменчивости, под воздействием факторов среды определяется широтой нормы реакции, сохранению жизнеспособностью и доминирования в данных условиях. На популяцию видов действует комплекс экологических и биотических факторов, который формирует клоны, с определенными физиолого-биохимическими свойствами, способностью адаптации к определенным условиям обитания.
Представители видов рода Trichoderma не очень требовательны к условиям окружающей среды, однако они имеют оптимальные границы условий температуры и влажности для своего развития и нормальной жизнедеятельности (Thodore & Panda, 1995). Влажность, температурный, световой режим, доступность органических и минеральных питательных веществ могут ускорять или замедлить процессы роста Trichoderma, а также определять переход от стадии покоя к вегетативному росту и формированию репродуктивных структур (Лугаускас, 1988;
Kubota, 1995).
Влияние температуры на рост и развитие штаммов Trichoderma.
Доминирование и динамика развития определенных видов грибов Тrichoderma в различных экосистемах подвержены сезонным колебаниям и во многом определяются влиянием температуры. Как показали наши исследования, для сибирских изолятов восьми исследуемых видов температурный диапазон, при котором штаммы способны расти и осуществлять спороношение, находится в пределах от 10 до 35 0С. Большинство штаммов являются типичными мезофиллами, оптимум температуры для развития представителей разных видов колеблется от до 25 0С. Для некоторых штаммов вида T. hamatum отмечен лучший рост при температуре 10 0С (средний диаметр колоний штаммов до 40 мм). При повышении температуры свыше 25 0С ингибируется рост изолятов вида T.koningii, а низкие температуры ингибируют рост штаммов вида T. citrinoviride. Согласно нашим исследованиям, психрофильные штаммы, способные расти при температуре 5 – 10 0С обнаружены среди представителей видов T. asperellum, T.viride и T. atroviride, в основном это были штаммы, выделенные из почв северных территорий Красноярского края и Эвенкии. Таким образом, установлено, что виды рода Тrichoderma, типичные для холодных географических районов, имеют более низкий температурный оптимум для роста, чем виды теплых климатических районов.
Максимальный показатель величины диаметра, являющийся результатом более высокой скорости роста при температуре 10 0С, характерен для штаммов вида T.
atroviride, которые были выделены из тундровых почв Эвенкии, где среднегодовые температуры воздуха не превышают 0 – 5 0С.
Для штаммов видов T. asperellum и T.viride также характерна тенденция преобладания изолятов, выделенных из умеренных и относительно холодных районов и растущих при низких значениях температуры. В то время как утверждать такую закономерность для других видов этого рода неправомочно. Среди изученных изолятов вида T. citrinoviride психрофильных штаммов обнаружено не было, все исследуемые представители этого вида способны расти при температуре только выше 150С. Изоляты видов T. longibrachiatum и T.citrinoviride являются типичными мезофиллами с оптимумом роста 25 0С. Однако среди исследованных представителей этих видов, а также вида T. hamatum встречались также термотолерантные изоляты, способные расти при температуре выше 350С. Внутривидовая вариабельность по способности роста и развития наиболее отчетливо проявляется при высоких и низких значениях температуры – 30 - 35 0С и 10 0С.
Влияние кислорода на рост штаммов Trichoderma разных видов.
Большую часть выделенных видов Trichoderma традиционно относят к облигатным аэробам. Вместе с тем, в природе эти грибы часто встречаются в местообитаниях с ограниченной обеспеченностью кислородом, что может способствовать преобладанию определенной популяции или видов в условиях с пониженным содержанием кислорода, как в затопляемых почвах, так и в растительных остатках. Для поддержания жизнедеятельности в таких условиях микромицеты, по-видимому, переходят к брожению. Имеются единичные сообщения о росте в анаэробных условиях и сбраживанию органических субстратов для отдельных представителей рода Trichoderma (Лаврентьев и др., 2008;
Кураков и др., 2011). Исследования по влиянию такого важного экологического фактора, как доступный кислород, на развитие микромицетов рода Trichoderma может способствовать пониманию преобладания определенной популяции или видов в условиях с пониженным содержанием кислорода, как в затопляемых почвах, так и в растительных остатках.
Для оценки влияния кислорода нами была изучена возможность роста в анаэробных условиях штаммов Trichoderma, принадлежащих к 8 видам, выделенным из разных эколого-трофических ниш. Как показали наши исследования, грибы рода Trichoderma способны расти в анаэробных условиях с образованием субстратного и воздушного мицелия. Однако в таких условиях не было отмечено формирование репродуктивных органов и спороношения (таблица 3). М.В. Горленко показано, что снижение аэрации и недостаток освещенности тормозит как образование фиалид, так и сам процесс конидиогенеза, а также влияет на содержание липидов в покоящихся структурах (Горленко, 1982).
Следует отметить, что штаммы, способные к росту в анаэробных условиях, выявлены среди представителей всех исследуемых видов. Однако для штаммов вида T. longibrachiatum характерна большая чувствительность к недостатку кислорода, чем для штаммов других видов. Только два из 20 изученных штаммов этого вида способны были к слабому росту мицелия при отсутствии кислорода. При росте в анаэробных условиях они формировали нетипичный, более тонкий паутинистый воздушный мицелий.
У всех исследуемых штаммов обнаружена приуроченность места их обитания к способности роста в отсутствии кислорода. Так, штаммы, выделенные из плодовых тел макромицетов, пищеварительного тракта дождевого червя, гидроморфных почв и верховых болот, характеризовались активным ростом в анаэробных условиях.
Активный рост был отмечен также для штаммов, выделенных из погребенных почв античного города Фанагории, взятых для сравнения в наших исследованиях. В то же время штаммы, изолированные из семян хвойных растений, в этих условиях не росли (таблица 3). Итак, способность роста в анаэробных условиях определяется не систематической принадлежностью гриба, а существенно варьирует среди штаммов одного вида.
Таблица 3 - Рост в анаэробных условиях штаммов рода Trichoderma Вид Число штаммов Прове Радиальная скорость роста, мм/ч рено 0.01 – 0.05 0.05 – 0.10 0. T. asperellum 55 10 8 T. harzianum 32 10 2 T. viride 35 8 4 T. hamatum 24 2 2 T.koningii 26 5 4 T. longibrachiatum 20 2 - T. citrinoviride 25 3 3 T. atroviride 10 1 3 У штаммов, которые хорошо росли в условиях анаэробиоза, была в дальнейшем исследована активность спиртового брожения. Как показали исследования, все протестированные штаммы на среде с глюкозой способны к спиртовому брожению, что позволяет их отнести к группе факультативных анаэробов. Анализ количества этанола при сбраживании глюкозы показал, что с относительно высокой и умеренной активностью спиртового брожения встречаются штаммы видов – T. harzianum, T.
asperellum, T. citrinoviride и T. koningii. В большинстве случаев эффективность сбраживания глюкозы составляла у штаммов этих групп грибов 25-50 %. Умеренная активность спиртового брожения (накопление 0,2-0,6 % этанола к 4-7 суткам) обнаружена у большинства штаммов T. asperellum, эффективность сбраживания глюкозы у них составляла порядка 15-20 % на среде с 3 % глюкозы. Низкая бродильная активность у штаммов T. hamatum, T. viride, T. atroviride. Среди представителей T. citrinoviride и T. koningii обнаружены как активные штаммы, накапливающие около 1 % этанола и более, так и очень слабо сбраживающие глюкозу. Вместе с тем, среди изолятов, обладающих широким спектром гидролитических ферментов, видов T. harzianum, T. asperellum и T. koningii обнаружены штаммы с бродильной активностью, сопоставимой с таковой у мукоровых грибов-сахаролитиков. Максимальный уровень накопления этанола на более богатых по содержанию сахаров средах составил 3 – 5%, что сравнимо с продукцией этанола диких штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae КБП-3781 и Hanseniaspora sp. 1R (Кураков, Лаврентьев, 2008).
Влияние ионов тяжелых металлов на рост штаммов рода Trichoderma.
Исследовано влияние пяти металлов: цинк, свинец, медь, никель, кадмий на рост и продуктивность 42 штаммов Trichoderma на среде Чарека с добавлением соли металла в концентрациях 1 ммоль/л, 5 ммоль/л, 10 ммоль/л. Проведенные исследования показали избирательность действия различных металлов на рост штаммов на агаризованной среде при добавлении различных их концентраций.
Добавление исследуемых металлов в концентрации 1 ммоль/л полностью ингибировало спороношение всех штаммов и формирование репродуктивных органов грибов (конидиеносцев и фиалид) на воздушном мицелии.
Наиболее токсичной из металлов оказалась медь;
рост колоний всех штаммов T.
asperellum и T. citrinoviride полностью прекращался при концентрации в среде 5 и мМоль/л, а в концентрации 1 ммоль/л рост у разных штаммов этих видов снижался на 65 % и более в сравнении с контролем. Штаммы видов T. longibrachiatum, T. atroviride и T. hamatum не росли на среде с добавлением меди. Самым устойчивыми к высоким концентрациям меди оказались штаммы вида T. harzianum, способные расти при содержании меди в среде 5 ммоль/л. Диаметр колоний всех исследуемых штаммов на третьи сутки составлял от (5,3±0,9) до (15,8±2,7) мм, что в 5,6 раза меньше, чем в контроле. На втором месте по токсичности в отношении исследуемых штаммов всех видов был никель. При добавлении никеля в количестве 10 ммоль/л рост всех штаммов полностью ингибировался. В концентрации 1 ммоль/л скорость роста штаммов снижалась от 20 до 45 % у штаммов видов T. asperellum, T. atroviride, T.
viride, T. koningii и на 45-55 % у штаммов вида T. hamatum. По результатам оценки влияния металлов на рост штаммов гриба рода Trichoderma на агаризованных средах были отобраны штаммы для дальнейшего исследования продуктивности их при жидкофазном глубинном культивировании, с различным содержанием солей металлов.
Особенности спектра утилизации органических веществ изолятов вида Trichoderma Исследование широты спектра потребления органических веществ разными видами и штаммами Trichoderma может способствовать пониманию преобладания тех или иных популяций и видов в разных эколого-трофических зонах, а также обеспечить выделение конкурентноспособных изолятов из определенных экониш.
Анализ спектра утилизации 23 субстратов методом мультисубстратного тестирования показал внутри и межвидовые различия по физиологическим профилям потребления субстратов. Результаты дискриминантного анализа (рисунок 1) выявили межвидовые различия по степени усваиваемости соединений. Наибольшая специфика в утилизации отмечена для штаммов видов T. hamatum и T. longibrachiatum, которые характеризуются более узким спектром в сравнении с остальными видами и ограниченной способностью усваивать спирты и аминокислоты.
Root 1 vs. Root Root - - -3 Harzianum Viride - Koningii Citrinoviride - Longibrachiatum -6 Atroviride -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Hamatum Root Root 1 vs. Root Root - - - - Asperellum - Harzianum -6 Koningii Citrinoviride - Longibrachiatum -8 Atroviride -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 Hamatum Root Рисунок 1. Дискриминантный анализ спектров потребления 23 субстратов грибами 5 видов рода Trichoderma (эллипсы ограничивают область с вероятностью p=0.95) На основе данных потребления субстратов методом кластеризации, штаммы разделяются на две группы вне зависимости от их видовой принадлежности. В первую группу преимущественно вошли штаммы, выделенные из почв, во второй кластер вошли штаммы, изолированные из плодовых тел макромицетов, образцов растительных остатков и семян хвойных и злаковых растений. Для штаммов, вошедших во второй кластер, характерно более интенсивное потребление сахаров, что, вероятно, может быть связано с их обитанием в условиях более богатых углеводными соединениями, чем почва. Таким образом, при исследовании выборки штаммов обнаружены как межвидовые различия в способности к утилизации определенных субстратов, так и различия, связанные с природным местом обитания изолята.
3.3 Гетерогенность популяции изолятов вида Trichoderma Отражение широкой пластичности грибов проявляется и в нестабильности признаков, свойственной представителям разных систематических групп грибов.
Один из самых широко используемых критериев для выявления внутривидовой дифференциации микромицетов является сравнительный анализ культурально морфологических признаков при их росте в условиях in vivo и in vitro. На их основе у ряда фитопатогенных грибов удалось установить наличие культурально морфологических типов (КМТ), коррелирующих с проявлением патогенности, токсинообразования. Это четко прослеживается у ржавчинных грибов, возбудителя ложной мучнистой росы хмеля, “томатной” и “картофельной” рас фитофторы и у многих других фитопатогенных грибов. Для сапротрофов и, в частности, для рода Trichoderma такие исследования практически не проводились.
Нами были исследованы 124 гетерогенных изолята, выделенные из разных эколого-трофических ниш, и принадлежащие к восьми видам рода Trichoderma. Для каждого из диких штаммов было выделено по 15 моноспоровых изолятов, отличающихся стабильными культурально-морфологическими признаками. В зависимости от видовой принадлежности было установлено от двух до четырех стабильных культурально-морфологических типа (КМТ), причем большинство штаммов (65%) принадлежало ко второму культурально-морфологическому типу.
Процентное соотношение между остальными типами распределялось следующим образом: клоны, относящиеся к первому КМТ составили 4,7 % для T. harzianum и 14,2 % для T.asperellum. Клоны третьего и четвертого типа составляли 13,3 и 16,3 % для T. harzianum и 22,6 и 21,8 % для T.asperellum соответственно (таблица 4).
Таблица 4 – Культурально-морфологические типы колоний изолятов видов рода Trichoderma Вид Количест Количест Соотношение культурально-морфологических во гетеро во типов (%) споровых моноспор I II III IV изолятов овых клонов T. asperellum 15 150 14,2 41,4 22,6 21, T. hamatum 15 150 7,2 67,4 10,6 14, T. harzianum 15 150 4,7 65,7 13,3 16, T. 15 150 5,8 55,8 38,4 citrinoviride T.longibrachiat 15 150 11,5 55,2 33,3 um T.viride 15 150 - 64,9 - 35, T.atroviride 10 100 - 42,3 - 57, T. koningii 15 150 - 61,8 - 38, Примечание: «-» - вид не представлен Для моноспоровых культур видов T. citrinoviride и T. longibrachiatum установлено три КМТ: первый, второй и третий. Гетероспоровые популяции этих видов в большей степени также были представлены вторым КМТ. Сравнительный анализ гетероспоровых популяций видов секции Rufa и видов T.viride, T.atroviride и T.
koningii, позволил выделить только два культурально-морфологических типа: второй и четвертый.
Эколого-географические особенности регионов также влияют на проявление частот культурально-морфологических типов в популяциях грибов (Дьяков, 1998). В ряде случаев удается установить корреляцию групп КМТ с образованием антибиотиков и токсинов. Установлено, что клоны второго культурально морфологического типа вида T. asperellum характеризовались высокой антибиотической активностью к фитопатогенным грибам, в сравнении с изолятами других КМТ (Садыкова, 2003;
Махова, 2003).
3.4 Вегетативная совместимость моноспоровых штаммов Trichoderma Популяции грибов представляют собой мозаику клонов, одним из изолирующих механизмов которых является различные реакции проявления вегетативной совместимости. Клоны, имеющие общие гены вегетативной совместимости, способны к генетическим обменам и образуют вегетативно совместимые группы, эволюционирующие при бесполой фазе развития независимо друг от друга, что обеспечивает их внутривидовую и внутрипоуляционную дивергенцию.
Сравнение общих частот реакций совместимости и несовместимости у выделенных изолятов и их моноспоровых штаммов всех видов показало, что для разных видов Trichoderma характерны различные пропорции реакций совместимости и несовместимости. Для видов, представляющих собой полифилетические группы, характерен сдвиг в сторону реакций несовместимости: для T. koningii (40,4 %), T.
viride (54,9 %) и T. harzianum (45,8 %). Вегетативная несовместимость наиболее четко проявляется у контрастных по культуральным признакам штаммов. При парном сращивании исходных изолятов различного происхождения выявлен широкий спектр проявления реакции вегетативной несовместимости с преобладанием «бордюра» и «ограничения роста». Причем только для этих трех видов характерна реакция «барраж» при сращивании штаммов, выделенных из разных мест обитания. При сращивании гетероспоровых изолятов этих видов с моноспоровыми клонами преобладает реакция несовместимости типа бордюр – у 68 % изолятов, барраж отмечается у 3 % изолятов. Среди типов реакций вегетативной совместимости преобладают валик и проникновение.
Сравнение общих частот реакций совместимости и несовместимости для видов T. asperellum, T. atroviride, T. hamatum указывает на наличие тенденции относительного сдвига в сторону реакций смешанного типа и вегетативной совместимости, что отражает однородность состава этих видов в сравнении с популяциями T. koningii, T. viride и T. harzianum. Для видов T. longibrachiatum и T.
citrinoviride характерно преобладание смешанных реакций и реакции типа валик.
Следует отметить, что совместимость моноспоровых клонов одного происхождения (выделенных из одного географического региона) зависит от его принадлежности к культурально-морфологическому типу. Так, например, клоны второго КМТ с другими типами давали реакции бордюра или ограничения роста колонии, а при сращивании между собой наблюдали реакции вегетативной совместимости. Для клонов других культурально-морфологических типов такая корреляция выражена более слабо, однако отмечено, что при сращивании клонов третьего и второго типа с четвертым всегда наблюдали реакции «бордюр» или «ограничение роста» последних. Отсутствие анастомозов между субстратными гифами и ограничение роста колоний, по-видимому, можно объяснить продуцированием биологически активных веществ в питательную среду.
Для штаммов, проявляющих данные типы реакций, характерно проявление высокой антибиотической активности в отношении взятых тест объектов. Различия по антибиотической активности в природных условиях являются одним из признаков, обеспечивающих вегетативную совместимость грибов, совместимые клоны образуют локальные популяции или субпопуляции (Дьяков, Долгова, 1995).
Эти данные указывают на значительную гетерогенность изолятов по изучаемому признаку. Гетерогенная несовместимость прекращает образование гетерокарионов между адаптированными и, вероятнее всего, генетически разными штаммами. По мере снижения вариабельности гриба, за счет выявления моноспоровых культур происходит относительный сдвиг реакций в сторону смешанного типа.
Вероятно, адаптация к разным эконишам предопределяет соотношения ядерного состава гетерокарионов, что поддерживается стабилизирующим отбором.
Возникающие внутривидовые группировки у рода Trichoderma, вероятно, как и в случае обособления клонов у фитопатогенных грибов, выполняют роль краевых популяций, осуществляющих освоение новых субстратов и эколого-трофических ниш.
При этом даже неполная изоляция снижает возможность образования гетерокарионов и повышает специализацию к субстрату, что в конечном итоге приводит к морфологическим, культуральным и биохимическим различиям клонов.
Глава 4 Биологическая активность грибов рода Trichoderma На основании анализа стабильности культурально-морфологических признаков и антибиотической активности для исследования биологической активности было отобрано 42 моноспоровых штамма 8 видов рода Trichoderma, выделенных из разных эколого-трофических ниш и относящихся к второму культурально морфологическому типу.
Антагонистическая активность штаммов Trichoderma в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium, Bipolaris и Alternaria Одним из главных ограничений для использования препаратов на основе грибов антагонистов рода Trichoderma для защиты растений является зависимость их эффективности от типа почвы, гидротермичеких факторов, состава микробиоты, сортовых особенностей культур, а также экологической ниши, где будет функционировать продуцент. В этом случае целесообразно использование местных штаммов грибов рода Trichoderma, как наиболее приспособленных к конкретным почвенно-климатическим условиям в отношении доминирующих в Сибири видов возбудителей болезней растений из родов Fusarium, Bipolaris и Alternaria.
Оценка гиперпаразитической активности показала как гетерогенность штаммов в пределах одного вида, так и межвидовые различия по степени активности изолятов Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов. Все виды Bipolaris и Alternaria чувствительны к микромицетам рода Trichoderma, тогда как виды рода Fusarium оказались более устойчивыми к антагонистам.
Гиперпаразитическая активность в отношении штаммов фитопатогенов достоверно различалась у всех штаммов T. asperellum. Максимальную активность в отношении изолятов Bipolaris и Alternaria проявили штаммы «Mg-6» и «30»;
другие штаммы этого вида «TH-5», «TH-7», «TH-11» и «119» проявляли минимальную активность в отношении тех же фитопатогенов. Самыми активными штаммами в отношении всех изолятов Fusarium оказались штаммы T. asperellum «119», «Mg-6» и «Mg-97» и T. citrinoviride «TH-4».
Максимальную антибиотическую активность в отношении Alternaria и Bipolaris проявили штаммы T. koningii «ТСЛ-06» и «ТСГ», T. asperellum «31» и «119», в отношении Fusarium – T. asperellum «Mg-6» и T. koningii «ТСЛ-06». Штаммы T.
asperellum «Mg-97», «TH-5», «TH-7», «TH-11», T. citrinoviride «МК» и «TH-4», T.
harzianum «M99/5» антибиотического действия в отношении всех фитопатогенов Alternaria, Bipolaris и Fusarium не показали.
Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Bipolaris и Alternaria методами кластерного анализа показал, что по набору вышеуказанных признаков все штаммы, вне зависимости от видового происхождения, разделяются на два кластера (рисунок 2А).
T. harzianum «Унив»
T. viride «Lg-2»
T. harzianum «М99/5»
T. asperellum «Mg-97»
T. citrinoviride «MK»
T. asperellum «K-12»
T. viride «Lg-1»
T. asperellum «Mg-6»
T. asperellum «30»
2. T. koningii «ТСГ»
T. viride «O-97» 2.1 T. asperellum «119»
T. asperellum «31»
T. koningii «ТСЛ-06»
А Уровни сходства (Эвклидово расстояние) T. harzianum «Унив»
T. citrinoviride «ТН-4»
T. asperellum «31»
T. koningii «ТСГ»
T. citrinoviride «MK»
T. asperellum «Mg-97»
T. asperellum «119»
T. viride «O-97»
T. asperellum «30»
T. viride «Lg-1»
T. viride «Lg-2»
T. asperellum «K-12» T. harzianum «М99/5»
T. koningii «ТСЛ-06»
T. asperellum «Mg-6»
Б Уровни сходства (Эвклидово расстояние) Рисунок 2 – Кластерный анализ антагонистической активности в отношении фитопатогенов родов Bipolaris и Alternaria (А);
рода Fusarium (Б) К первому кластеру был отнесен штамм T. koningii «ТСЛ-06», который проявил высокую гиперпаразитическую и максимальную антибиотическую активность в отношении всех видов Bipolaris и Alternaria. Второй кластер разделился на два подкластера: в первый подкластер объединились три штамма: T. asperellum «31» и «119» и T. viride «О-97», характеризующиеся средней гиперпаразитической, но высокой антибиотической активностью в отношении большинства штаммов видов Bipolaris и Alternaria. Во второй подкластер объединены все остальные штаммы рода Trichoderma.
Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Fusarium позволил условно разделить штаммы-антагонисты на три кластера (рисунок 2Б). В первый кластер вошли два штамма T. asperellum «Mg-6» и T. koningii «ТСЛ 06», характеризующиеся высокой гиперпаразитической и антибиотической активностью по сравнению с другими штаммами. Второй кластер объединил четыре штамма T. harzianum «M99/5», T. asperellum «К-12», T. viride «Lg-2» и «Lg-1», в третий кластер вошли все остальные штаммы, которые проявляли выборочную активность в отношении некоторых видов Fusarium.
Полученные данные свидетельствуют о том, что штаммы состоят из клонов с разной антибиотической активностью, что обуславливает необходимость селекции активных штаммов по отношению к набору штаммов-возбудителей болезней растений.
Противоопухолевая активность штаммов рода Trichoderma Первые упоминания о противоопухолевых свойствах этих грибов были сделаны А.М. Безбородовым, выделившим зарагозовую кислоту, которая является сильным ингибитором фермента ФТП-азы, и может выступить в качестве потенциальных противораковых лекарств (А.М. Безбородов,1969). Впоследствии рядом авторов были установлены и другие группы активных веществ, таких как триходермамиды – модифицированные дипептиды, выделенные из морского штамма T. virens.
Виридиофунгины были изолированы из T. viride и содержали как структурный элемент лимонную кислоту. Известны их формы A–C, A1–4, B2 и Z2, которые оказывают цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Триходеноны и циклопептановые производные, изолированные из культуры T. harzianum, паразитирующей на Halichondria okadai, обладают цитотоксическим эффектом на линии опухолевых клеток. В этой связи виды Trichoderma могут представлять особый интерес, так как являются потенциальным дешевым биологическим ресурсом для получения препаратов-иммуномодулятов и новых противоопухолевых антибиотиков.
В результате первичной оценки цитопатической активности в отношении клеток асцитной карциномы Эрлиха было отобрано 10 активных штаммов, шесть из которых принадлежат к виду T. asperellum (MG-97,ТН-5,TН-7, TH–11, MG-6, 30 и 31), штамм М–99/51 – вид T. harzianum;
(Tv4-1 и Tv4-2) – вид T. citrinoviride;
Lg–1 – вид T. viride и ТСЛ-06-вид T. koningii.
Штаммы, проявившие цитостатический эффект в отношении карциномы Эрлиха затем оценивали на трех линиях клеток: НаСаТ- кератиноциты человека;
HEK 293Т клетки эмбриональной почки человека и K562- линия клеток хронической миелоидной лейкемии. Первичный скриниг проводили на наличие цитотоксической активности метаболитов и споровых экстрактов штаммов гриба рода Trichoderma на различных линиях опухолевых клеток in vitrо. У штаммов, проявивших цитотоксической активности метаболитов грибов рода Trichoderma, исследовали их проапоптотическую активность и действие на клеточный цикл опухолевых клеток.
Клетки культивировали 72ч с различными концентрациями культуральных жидкостей. Результаты эксперимента представлены в виде зависимости индекса ингибирования, от концентрации исследуемых препаратов. В том случае, если ИИ0, то наблюдается подавление роста или лизис клеток за счет действия препарата. При ИИ0 наблюдается стимуляция роста клеток. Высокую цитотоксическую активность была отмечена у трех штаммов: TV4-1, M99/51 и 310 в отношении всех линий опухолевых клеток. Культуральная жидкость TV4-1обладала невысоким индексом ингибирования в отношении всех трех линий опухолевых клеток, а Тсл-06(Г) оказала незначительный подавляющий эффект на клетки К562 и JurKaT. Выраженной цитотоксической активностью обладает только культуральные жидкости TV4-1, M99/51 и 30, что подтвердилось на трех клеточных линиях HEK 293T, JurKaT и К (рисунок 3).
100 80 и н д е к с и н г и б и р о в а н и я,% инд ек с инг иб иров ан ия,% 80 TV4-1(10)C и н д е к с и н г и б и р о в а н и я,% 60 TV4-1(10)C 60 M99/5(10)C M99/5(10)C 60 TV4-1(10)C 50 TV4-1(5)Г 40 TV4-1(5)Г M99/5(10)C Тсл-06(5)Г 40 Тсл-06(5)Г TV4-1(5)Г 30(10)Г 30(10)Г Тсл-06(5)Г 20 30(10)Г 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 - - концентрация,% кончентрация,% концентрация,% Рисунок 3 – Зависимость индекса ингибирования от концентрации культуральных жидкостей штаммов Trichoderma на линии клеток HEK 293T (а), на линии клеток К562 (б), на линии клеток JurKaT(в) при инкубации 72ч Особый интерес представляют исследования противоопухолевой активности экстрактов спор грибов рода Trichoderma. Для чего проводили анализ цитотоксической активности экстрактов из спор гриба Trchoderma, полученных методом холодной и горячей экстракции на линии клеток HaCaT при инкубировании 72ч, который показал, что небольшой активностью в отношении опухолевых клеток обладают экстракты спор штаммов М99/51 и Lg-1.
В результате проведенных экспериментов по анализу цитотоксичности и апоптоза установили, что значительную активность в отношении трех клеточных линий HEK 293T, JurKaT и К562 среди 10 исследованных проявляют штаммы Tv4-1, М99/51 и 30. При этом одним из механизмов действия этих препаратов является индукция апоптоза поздней стадии, что подтвердилось на четырех линиях клеток:
К562, THP-1 и 8866-05 и А431. Полученные результаты показывают, что одним из механизмов действия культуральных фильтратов Trichoderma на опухолевые клетки может являться индукция апоптоза поздней стадии (20ч).
Проведенные анализы противоопухолевой активности 10 штаммов Trichoderma показали, что метаболиты культуральных фильтратов трех штаммов М99/51, TV4-1 и 310 обладают высокой цитотоксической активностью и универсальностью действия, что подтвердилось на линиях опухолевых клеток HEK 293T, JurKaT и К562.
Метаболиты культуральных фильтратов активных штаммов TV4-1, M99/51 и вызывают индукцию апоптоза поздней стадии, но не оказывают влияния на жизненный цикл опухолевых клеток. На наш взгляд, более целесообразно выделять соединения из культуральных фильтратов, а не из экстрактов спор грибов рода Trichoderma. По результатам проведенных исследований, представленных в данной работе, были депонированы во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов штаммы T. asperellum Т-310 (ВКМ F4340D и T.harzianum Rifai ТV4-1 (ВКМ F4341D) как продуценты противоопухолевых соединений. Штамм T.harzianum М99/ депонирован во Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ F- 1027).
Оценка токсичности штаммов рода Trichoderma в отношении простейших Для того чтобы рекомендовать тот или иной штамм в качестве продуцента биопрепарата или для биосинтеза активных антимикробных или противоопухолевых веществ, а также дальнейшего регламентирования биотехнологического штамма, обязательна оценка его токсичности. Биотестирование, проведенное на двух тест объектах: Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis показало, что штаммы имеют различную токсичность в отношении простейших. Так, самую высокую токсичность показали споровые экстракты и мицелиальные жидкости штаммов 30, 310, ТН-7, ТН-11. Пробы штаммов Тсл-06, М-99/5 и М-99/51 оказались мало токсичными. Для штаммов Mg-6 и Тv-4-2 малотоксичными оказались экстракты мицелиалия, а культуральная жидкость и споровые экстракты нетоксичны. Среднюю токсичность также показали экстракты мицелия штаммов 30, 310, горячий споровый экстракт Тv -4-1 и культуральные фильтраты и экстракты спор и мицелия штамма Lg – 1 (таблица 6). При увеличении разведения токсичность всех экстрактов снижалась, и в разведении 1:8 все пробы кроме экстрактов спор и мицелия штамма ТН-7 были нетоксичны. Следует отметить, что экстракты особо токсичных штаммов, таких как ТН-7 и ТН-11 лизировали клетки инфузорий в течение 10-15 минут после внесения. В то время как экстракты Тсл-06 и М-99/5 не оказывали никакого воздействия на их жизнеспособность.
У штаммов Trichoderma asperellum самыми токсичными оказались экстракты спор штаммов ТН-7 и ТН-11. Штамм ТН-7 является самым токсичным из всех исследуемых штаммов. Его культуральный фильтрат и экстракты спор не теряют полностью свою токсичность даже при разведении 1:8, в то время как экстракты мицелия нетоксичны уже при разведении 1:2. Экстракты мицелия и спор штаммов ТН-5 и Мg-6 были малотоксичны, а экстракты спор – нетоксичны для инфузорий даже без разведения. Для штаммов 30 и 310 характерна умеренная токсичность.
Эстракты мицелия показали сравнительно низкую токсичность относительно споровых экстрактов. Так, у штамма 30, споровый экстракт которого без разведения приводил к 100%-й гибели популяции Paramecium caudatum, экстракт мицелия показал в 2 раза меньшую токсичность. Для штаммов ТН-7 и ТН-11, споровые экстракты которых лизировали клетки, экстракты мицелия приводили к гибели всего 30-50 % и 70-80 % популяции соответственно.
Таблица 6 – Значение критерия токсичности штаммов рода Trichoderma на Paramecium caudatum Значение критерия токсичности экстрактов спор и мицелия штаммов рода Trichoderma Штаммы рода Trichoderma Холодный Горячий Холодный Горячий Культуральный экстракт экстракт экстракт экстракт фильтрат спор спор мицелия мицелия T. asperellum 30 0,99 0,99 0,55 0,55 0, T. asperellum 310 0 0 0,55 0 0, T. asperellum Мg-6 0,9 0,8 0,8 0,7 0, T.asperellum ТН-5 1 0,6 1 1 0, T. asperellum ТН-7 0 0 0 0 T. asperellum ТН-11 0 0 0 0 T. citrinoviride Тv-4-2 1 1 0,8 0,7 T. citrinoviride Тv-4-1 0 0,5 0,3 0,5 T. viride Lg-1 0,5 0,3 0,8 0,5 0, T. konigii Тсл-06 1 1 1 1 T. harzianum М-99/5 1 1 1 1 T. harzianum М-99/51 1 1 1 1 Для всех исследуемых штаммов был проведенный анализ влияния на прирост популяции Tetrahymena pyriformis, который выявил различия между штаммами в пределах одного вида. Значительный прирост популяции Tetrahymena pyriformis отмечен на всех пробах штаммов Тv -4-1, Тv -4-2, ТН-5, а также холодных экстрактах мицелия и культуральных жидкостях штаммов Mg-6, 30 и ТН-7. Наибольшую биологическую активность проявляли горячие споровые экстракты трех штаммов ТН 5 и Mg-6 T. asperellum, а также Tv4-2 T. citrinoviride. Среди холодных экстрактов самыми активными оказались экстракты T. asperellum штаммов ТН-7 и 30. Холодный экстракт штамма ТН-7 по коэффициенту прироста выше, чем горячий в 3,2 раза, а у штамма 30, почти в 2 раза. Это дает основания полагать, что эти штаммы грибов синтезируют биологически активные вещества;
в случае со штаммами 30 и ТН-7 эти вещества являются термолабильными.
Таким образом, оценка токсичности показала, что биологическая активность определяется не столько видовой принадлежностью штамма, а в большей степени его вариабельностью в пределах вида.
5 Ростстимулирующая активность штаммов рода Trichoderma Положительное влияние биологически активных компонентов, продуцируемых видами Trichoderma, на ростовые показатели растений, отмечено на многих промышленно значимых зерновых культурах и древесных видах, однако это зависит от применяемого штамма (Harman и др., 2004;
Romano, 2008). Оценка действия на рост растения может способствовать отбору продуцентов препаратов с комплексным воздействием – как стимуляторов роста и как антагонистов фитопатогенных грибов. В связи с этим, использование биопрепаратов на основе этих грибов может быть расширено, если в качестве одного из главных факторов отбора для штамма определить их способность оказывать стимулирующее действие на рост растения.
На основе кластерного анализа по антагонистической активности были отобраны 8 штаммов рода Trichoderma и проведены исследования их ростстимулирующих свойств в отношении семян злаковых и хвойных растений.
Исследования показали, что штаммы рода Trichoderma, в зависимости от видовой принадлежности, оказывают как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на энергию прорастания и всхожесть и биометрические показатели проростков семян злаков. Все изоляты вида T. asperellum в различной степени оказывают ингибирующее действие. Штаммы T. koningii «ТСЛ-06», T. koningii «ТСГ»
и T. harzianum «M99/5» проявляют достоверную стимулирующую активность по сравнению с контролем. Остальные исследуемые штаммы не оказывали достоверного действия на энергию прорастания и всхожесть семян. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о различном действии штаммов рода Trichoderma на показатели всхожести и энергии прорастания семян злаков, что необходимо учитывать при их отборе для использования в биоконтроле.
Для установления истинного ростстимулирующего эффекта используемого антагониста необходимо исключить присутствие фитопатогенов при выращивании растений. С этой целью удобно использование культуры каллусов. Для оценки действия штаммов использовали растворы метаболитов в культуральной жидкости штаммов рода Trichoderma с концентрацией 1, 3, 5 и 10 %. Результаты исследования представлены на рисунке 4. При внесении в культуру каллусов ячменя культуральной жидкости штаммов в концентрации 5 и 10 % все каллусы погибали, что свидетельствует о токсическом действии активных компонентов грибов при их высокой концентрации. При внесении культуральной жидкости 1 и 3 % отмечено нейтральное или стимулирующее действие.
Максимальный стимулирующий эффект на каллусы ячменя сорта «Красноярский-80» оказали метаболиты штамма T. harzianum «М99/5»: прирост каллуса при внесении культуральной жидкости с концентрацией 1 % был в 3,6 раза, а с концентрацией 3 % – в 3 раза выше, чем в контроле. Обработка каллусов ячменя метаболитами штамма T. koningii «ТСЛ-06» с концентрациями 1 % и 3 % так же способствовала увеличению их роста.
4, 5, 3, 4, 3,00 4, 2,50 3,50 1% концентрация метаболита 2,00 3, 2,50 3% концентрация 1, метаболита 2, 1, 1, 0, 1, 0, 0, Trichoderma TrichodermaTrichoderma контроль 0, harzianum koningii koningii «M99/5» Trichoderma Trichoderma Trichoderma контроль А «ТСГ» «ТСЛ-06»
harzianum koningii koningii «M99/5» «ТСГ» «ТСЛ-06»
Рисунок 4 – Объем каллусов ячменя «Красноярский-80» (А) и каллуса пшеницы сорт «КС-1607» (Б) при обработке метаболитами штаммов рода Trichoderma Метаболиты культуральной жидкости штамма T. koningii «ТСГ» стимулировали рост каллусов только при 3 %-й концентрации. Внесение в культуру каллусов пшеницы культуральной жидкости штаммов T. koningii «ТСЛ-06» и «ТСГ» оказывало ингибирующий эффект: прирост каллусов даже в количестве 1 и 3 % был ниже, чем в контрольном варианте, а при более высоких концентрациях каллусы погибали. При внесении метаболитов штамма T. harzianum «М99/5» в культуру каллусов в концентрации 1 и 3 % отмечено слабое стимулирующее действие, а при более высоких концентрациях каллусы погибали. По результатам проведенных исследований на семенах и каллусах злаковых растений установлено, что биологически активные компоненты отобранных разных штаммов-антагонистов могут избирательно влиять на разные виды растений, оказывая как стимулирующее, так и ингибирующее действие.
Исследования стимулирующего эффекта штаммов рода Trichoderma на хвойных видах показали, что обработка семян лиственницы сбирской и сосны обыкновенной метаболитами штамма T. asperellum «Mg-6» стимулировала как всхожесть, так и энергию прорастания в сравнении с контролем. Обработка метаболитами культуральной жидкости штамма T. harzianum «M99/5» увеличивала энергию прорастания и всхожесть семян всех исследуемых видов хвойных растений.
Достоверное стимулирующее влияние метаболитов штамма T. harzianum «M99/5» установлено при обработке каллусов всех трех испытуемых хвойных видов (рисунок 5). Наибольший стимулирующий эффект был достигнут при обработке каллусов лиственницы сибирской. Средняя масса каллуса через 40 суток культивирования, оказалась в 1.5 раза больше по сравнению с контролем. При обработке каллусов сосны сибирской объем превышал контрольный в 1.3 раза.
А Б В Рисунок 5 – Динамика роста эмбриогенного каллуса лиственницы сибирской (А), сосны сибирской (Б) и сосны обыкновенной (В) при обработке метаболитами T.
asperellum «Mg-6» и T. harzianum «M99/5».
Исследования показали, что в течение всего периода культивирования каллусов метаболиты штамма T. harzianum «M99/5» оказывали ростстимулирующее действие и на каллусы сосны обыкновенной, однако к концу культивирования прирост опытного каллуса достоверно не отличался от контрольного.
При введении в питательную среду метаболитов штамма T. asperellum «Mg-6» на определенном этапе роста была отмечена стимуляция роста каллуса лиственницы сибирской и сосны сибирской, тогда как к концу культивирования объем опытных и контрольных вариантов каллусов достоверно не различался. При обработке каллусов сосны обыкновенной штамм T. asperellum «Mg-6» достоверно снижал их прирост в 1.5 раза в сравнении с контролем. Из этого следует, что при использовании этого штамма в биоконтроле можно ожидать только эффект подавления фитопатогенных микромицетов, но не ростостимулирующее действие на сеянцы.
Вторичные метаболиты Trichoderma могут действовать подобно механизму действия ауксинов, у которых оптимальная стимуляция роста наблюдается при низких концентрациях (10-5 и 10-6 M), при ингибирующем эффекте в более высоких дозах. В то же время в результате наших исследований оказалось, что метаболиты штамма Trichoderma harzianum «M99/5» предположительно оказывают еще и непосредственный ростстимулирующий эффект, который отмечен на каллусных культурах. Полученные вышеизложенные данные свидетельствуют о непосредственном стимулирующем эффекте штаммов Trichoderma harzianum «M99/5» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06» на рост растений, в связи с чем, представляло интерес определить наличие в культуральной жидкости штаммов специфических соединений - ауксинов, которые синтезируют отобранные штаммы антагонисты.