Биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода saccharomyces
На правах рукописи
МАРТЫНЕНКО НИКОЛАЙ НИКОЛАЕВИЧ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ
ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES
03.00.23. – «Биотехнология»
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
доктора биологических наук
Москва, 2009 г.
1
Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Московского Государственного Университета Пищевых Производств (ГОУ ВПО МГУПП МОН РФ), в отделе «Биотехнология ферментных препаратов в пищевой промышленности» Всероссийского научно-исследовательского института пищевой биотехнологии (ГНУ ВНИИПБТ) РАСХН.
Научный консультант: Доктор технических наук, профессор Римарева Любовь Вячеславовна
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Чернов Иван Юрьевич Доктор биологических наук, профессор Албулов Алексей Иванович Доктор технических наук, профессор Кривова Анна Юрьевна
Ведущая организация: ОАО Государственный научно исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентст ва по управлению Федеральным имущест вом (ФГУП ГОСНИИ Синтезбелок)
Защита диссертации состоится «15» мая 2009 г. в _часов на заседании Диссертационного совета Д.006.069.01 ГНУ Всероссийского научно исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН (ВНИИТИБП РАСХН) по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский р-н, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИТИБП.
Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим присылать по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский р-н, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината. ВНИИТИБП, ученому секретарю Совета.
Афтореферат разослан «_»_2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук Фролов Ю.Д.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В условиях современного технически развитого общества, характеризующегося неблагоприятной экологической обстановкой, потребителей всё больше интересует, как питание может отразиться на их здоровье. Анализ информации о состоянии окружающей среды свидетельствует о том, что её загрязнение стало актуальной и очень сложной проблемой.
Несовершенство технологических процессов, отрицательное воздействие на окружающую среду привело к нерациональному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природной среды и повышению себестоимости выпускаемой продукции в перерабатывающих отраслях АПК.
Разработка новых ресурсосберегающих технологий при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объём производимой продукции при сохранении её высокого качества является актуальным решением современных задач всех отраслей пищевой промышленности, включая и винодельческое производство.
Повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции может быть обеспечено совершенствованием технологии использования дрожжей-сахаромицетов, играющих важнейшую роль в обеспечении ключевых биотехнологических процессов. В связи с этим огромный практический интерес представляет возможность создания новых активных препаративных форм сухих и иммобилизованных дрожжей, используемых уже за рубежом в ряде технологий. Эти формы дрожжей отличаются от традиционной дрожжевой разводки легкостью и удобством использования, максимальным проявлением всех положительных качеств, новыми ценными свойствами.
Промышленная технология получения таких новых форм дрожжей в России ещё не разработана, поэтому исследования, проводимые в этом направлении, важны, актуальны и представляют несомненный интерес для усовершенствования отечественных биотехнологий, например, в винодельческом и спиртовом производствах.
Создание активных сухих дрожжей (АСД), использование которых дает возможность в любой момент времени получать необходимое количество активно бродящих дрожжей является особенно актуальным, так как значительно облегчит работу заводов, как в сезон, так и в период их запуска. С другой стороны, использование сухих дрожжей ускорит процесс брожения, увеличит выход продукта и улучшит его качество.
В плодово-ягодном виноделии за рубежом практически отсутствуют технологии АСД, а рекомендуемые для этой цели универсальные препараты не пригодны. В России за последние 20-30 лет вообще не проводились работы по выделению и изучению рас дрожжей для производства плодовых вин.
Создание и организация производства высокоэффективных препаратов сухих дрожжей на основе отбора лучших отечественных рас дрожжей по их важнейшим физиологическим и биохимическим признакам, приспособленных к местным условиям и формирующим привычный вкус и аромат готового вина, является важной, актуальной и своевременной проблемой, выходом из создавшегося положения.
Помимо препаратов АСД немаловажное значение имеет и использование иммобилизованных дрожжей (ИД). Сейчас их применение пока ограничено, но создание и использование ИД позволяет решать серьёзные и уникальные задачи, такие, как ликвидация процесса ремюажа в шампанском производстве, интенсификация брожения за счёт создания сверхвысоких концентраций дрожжей в сусле или виноматериале, биологическое кислотопонижение вин, устранение недобродов, значительное улучшение органолептических показателей готовых вин.
Эффективных решений по использованию ИД в виноделии пока нет, хотя и встречаются некоторые данные по этому вопросу в зарубежной и отечественной литературе, поэтому актуальным является поиск такого носителя для иммобилизации, который был прочным, обладал хорошими массообменными характеристиками, был бы инертен для вина и исключал бы выход дрожжей в вино в период брожения.
Использование АСД и ИД, безусловно, даёт возможность получения большого экономического эффекта для многих производств, основанных на биотехнологии дрожжей рода Sacharomyces. Научное обоснование биотехнологических процессов получения ИД и АСД позволит не только повысить эффективность бродильных производств, но и внести весомый научный вклад в развитие биотехнологической промышленности.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке теоретических и экспериментальных основ создания высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода Saccharomyces.
В задачи исследования входило:
- на основе селекционных работ осуществление скрининга активных рас винных дрожжей по их бродильной активности, ароматическим и другим технологически важным физиолого-биохимическим особенностям;
- изучение основных культуральных, морфологических, физиолого биохимических, биохимических и технологических свойств отобранных штаммов;
- улучшение морфолого-физиологических, молекулярно-биологических, биохимических и технологических свойств селекционированных рас дрожжей;
- отбор рас дрожжей, наиболее устойчивых к сохранению бродильной активности, на основе которых возможно создание наиболее эффективных препаратов АСД и ИД для производства спирта, шампанских вин, белых и красных виноградных вин, сортовых плодовых вин повышенного качества, устранения недобродов;
- создание биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД;
- разработка способов подавления выхода иммобилизованных клеток дрожжей во время брожения из матрицы носителя для повышения эффективности их действия;
- разработка научных основ и технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;
- разработка эффективных способов реактивации и подготовки к брожению препаратов АСД и ИД;
- проведение промышленных испытаний созданных препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей;
Рассматриваемые проблемы решались в соответствии с программой «Биотехнология» УНЦ РХТУ им. Менделеева «Влияние экологических факторов на качество пищевых продуктов и пищевых добавок на основе микробного синтеза и разработка более совершенных стандартов контроля качества этих продуктов»;
с Межведомственной инновационной программой «Биотехнология для медицины и агропромышленного комплекса»;
программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники»;
проекта «Новые эффективные биотехнологические процессы микробного синтеза ферментов, антибиотиков, белково-жировых кормовых компонентов и других биологически активных соединений» предложенного ВНИИ Биотехнологии;
программы Министерства образования РФ «Университеты России»;
Федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России».
Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе разработаны биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Sacharomyces, при этом теоретически обосновано и экспериментально установлено и доказано:
- на основе многоступенчатой селекции и новых экспериментальных данных по результатам сравнительных исследований выделенных штаммов дрожжей S.
cerevisiae показана перспективность 13 рас дрожжей, из которых 5 физиологически активных рас обладают высокой биосинтетической способностью по отношению к этанолу и наиболее важным метаболитам, характериным для плодово-ягодного виноделия;
- с использованием современных методов анализа изучены морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические особенности важнейших отечественных селекционированных рас винных и спиртовых дрожжей, установлена их принадлежность к одному биологическому виду S.
cerevisiae, различающихся между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как вариабельные;
- впервые обнаружено 5 межвидовых гибридов дрожжей S.cerevisiae S. bayanus var.uvarum, построено генеалогическое древо штаммов изученных дрожжей;
- получены новые экспериментальные данные и подобраны условия сепарации и обезвоживания дрожжей на сушилке кипящего слоя, позволяющие сохранить до 90% живых клеток, подобрана оптимальная композиция стабилизаторов для обезвоживания дрожжей;
- на основе установленных закономерностей впервые научно обоснована и разработана биотехнология подготовки сухих дрожжей к брожению, позволяющая сократить лаг-фазу развития дрожжевых клеток, интенсифицировать процесс брожения при одновременном улучшении качества продукта;
- исследованы культуральные и технологические свойства сухих винных и спиртовых дрожжей, определены их физиолого-биохимические параметры, используя различные методы оценки качества и хранения препаратов АСД;
- разработаны методы подготовки и хранения биокатализаторов к брожению для ИД;
- иследованы способы иммобилизации дрожжей, свойства и характеристики возможных носителей, свойства иммобилизованных дрожжей;
- впервые разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования явились основой для создания биотехнологии новых высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода Saccharomyces, усовершенствования отечественной технологии винодельческого и спиртового производства. Использование сухих и иммобилизованных дрожжей позволяет ускорить процесс брожения, увеличить выход и улучшить качество готового продукта. Наряду с получением ценных продуктов, автором решены следующие ключевые вопросы:
- селекционированы и запатентованы две новые высокоэффективные расы дрожжей-сахаромицетов для производства спирта и направлены на патентование рас для производства плодовых вин;
- разработана и запатентована в новая высокопроизводительная и экономичная технология винных и спиртовых АСД, обеспечивающая получение продукции высокого качества;
- составлены ТИ и ТУ технологии винных и спиртовых дрожжей;
- разработана технология применения винных и спиртовых АСД, позволяющая значительно повысить эффективность данных препаратов;
- представленная технология успешно апробирована на Московском дрожжевом заводе, наработаны опытные партии перспективных рас дрожжей;
- подобраны условия реактивации АСД, позволяющие сохранить лаг-фазу развития сухих дрожжей, увеличить процент реактивируемых клеток на 10-15 % даже в неблагоприятных условиях, сократить время подготовки к брожению для шампанских АСД до 2-3 часов;
- определены факторы ингибирования АСД во время их хранения, а также реактивации и брожения, и изучен механизм их действия;
- подобраны наиболее перспективные флуорохромные красители для экспресс контроля качества АСД с помощью люминисцентной микроскопии, сопряженной с компьютерным анализом изображений;
- разработана и запатентована технология ИД для виноделия на основе криогеля ПВС;
- проведены заводские испытания препаратов АСД и ИД и получены положительные результаты при использовании на винзаводах: ООО «Крона»
(Нижегородская обл.), ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край), ОАО «Миллеровский винзавод» (Ростовская обл.), ОАО «Корнет» (г. Москва), ОАО «Игристые Вина» (г. Санкт-Петербург), ООО «Ливадия» (г. Ялта, Украина) и спиртзаводе ОАО «Золотой Алтай» (г. Бийск, Алтайский край);
- проведены заводские испытания препаратов ИД при получении шампанских вин бутылочным способом на ОАО «Корнет» (г. Москва).
Разработанные в результате исследований технологии винных и спиртовых АСД и ИД способствуют созданию высокоэффективной технологии шампанских, белых и красных виноградных вин, плодовых вин и технологии спирта.
Результаты исследований по селекции при отборе наиболее продуктивных рас дрожжей, обладающих более ценными свойствами, и изучению ключевых физиолого-биохимических, технологических и молекулярно-биологических особенностей важнейших рас дрожжей рода Saccharomyces, будут востребованы при использовании последних в отечественной винодельческой и спиртовой промышленностях.
Разработанные в результате исследования технологии новых высокоэффективных препаратов сухих и иммобилизованных дрожжей позволят значительно упростить технологию дрожжей на заводах, облегчая и ускоряя работу заводов, как в сезон, так и в период запуска, интенсифицировать процесс брожения, увеличат выход продукта и улучшат его качество.
Теоретические и прикладные положения работы нашли конкретное воплощение при формировании курса лекций и проведении практических занятий в Московском Государственном Университете пищевых производств, изложены в методических указаниях для студентов высших учебных заведений по специальности «Биотехнология» и «Технология виноделия», в монографии «Современные препаративные формы дрожжей для виноделия», курсовых и дипломных проектах и работах, а также на многих предприятиях винодельческого и спиртового производства.
Значимость работы подтверждена проведением заводских испытаний новых препаратов АСД и ИД на вин- и спиртзаводах России и Украины, дипломами 1-ой степени по номинации «Биопрепараты и биологически активные добавки» на выставке-конкурсе Министерства образования РФ, Министерства промышленности, науки и технологий РФ, МГУПП, Золотой медалью агропромышленной выставки «Золотая осень-2008».
Основные положения, выносимые на защиту:
- теоретические положения систематики, генетических особенностей и идентификации дрожжей рода Saccharomyces, критерии отбора важнейших винных и спиртовых дрожжей для получения препаратов АСД и ИД;
- селекционированные расы винных и спиртовых дрожжей, их морфолого физиологические, молекулярно-биологические, биохимические и технологические особенности;
- теоретическое и экспериментальное обоснование биотехнологии препаративных форм винных и спиртовых АСД и ИД;
- способ подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения;
- технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;
- эффективные способы реактивации и подготовки к брожению АСД и ИД;
- промышленные испытания новых препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей и на Украине.
Личный вклад автора. Автором на основе анализа научно-технической и патентной литературы теоретически обосновано направление исследований, сформулированы цель и задачи, разработана методология проведения исследований.
Автор лично планировал, организовывал проведение всех испытаний и внедрений, а также обобщал полученные результаты.
Под его руководством и при непосредственном участии определены критерии отбора важнейших винных и спиртовых дрожжей-сахаромицетов, получения препаратов АСД и ИД для винодельческого и спиртового производств;
исследованы и определены расы дрожжей для создания новых наиболее эффективных препаратов АСД и ИД для шампанских вин, белых и красных виноградных вин, производства спирта и сортовых плодовых вин;
установлены морфолого-физиологические, молекулярно-биологические, биохимические и технологические особенности селекционированных дрожжей.
Автором теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД;
под его непосредственным руководством и участии разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей во время брожения;
технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве, а также эффективные способы реактивации и подготовки к брожению АСД и ИД.
С участием автора и специалистов заводов проведены промышленные испытания новых препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей и на Украине.
Личное участие автора подтверждается научно-технической и патентной документацией, актами промышленных испытаний.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных научно-технических конференциях и симпозиумах: «Пища. Экология. Человек» (МГУПП, май, 1999);
«Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (МГУПП, декабрь, 1999;
декабрь 2000);
«Biocatalysis-2000:
Fundamentals and applications» (Moscow, MSU, 10-15 June, 2000);
«Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых ресурсов» (Москва, РХТУ, сентябрь, 2000);
«Bioencapsulation in Biomedical, Biotechnological and Industrial Applications» (Warsaw, 11-13 May, 2001);
«Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии» (Ялта, 21-25 мая 2001 г.);
«Научно-технический прогресс в спиртовой и ликеро-водочной отрасли промышленности» (Москва, 19-20 апреля 2001 г);
«Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях» (Тверь, г);
«Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2002 г.);
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г);
«Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации» (Москва, 2003);
«Прогрессивные технологии и современное оборудование - важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликеро-водочной промышленности» (Москва, 23- апреля 2003 г);
«Экологической науке - творчество молодых» (Гомель, 2003);
«Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 14-18 марта, 2005);
«9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых» (Пущино, 18-22 апреля, 2005);
XXII International Conference on Yeast Genetic and Molecular Biology (Bratislava, 7-12 August 2005);
«10-й Международной Пущинской школе конференции молодых ученых» (Пущино, 18-22 апреля, 2006);
XXV International Specialized Symposium on Yeasts ISSY-25 (Helsinki, 2006);
International Congress on Bioprocessing in Food Production (18-21 June 2006, Patras, Greece, 2006), международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века.
Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск. 2008.
По материалам выполненных исследований опубликовано 66 работ, общим объёмом 54 печатных листов, в том числе 38 – в центральных изданиях, получено патентов РФ, опубликована 1 монография.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 485 страницах, включающих 138 таблиц, 134 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 435 источников, и приложения.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дано обоснование актуальности проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.
Глава 1.Обзор литературы.
В литературном обзоре представлены сведения об основных изменениях систематики дрожжей рода Saccharomyces, приведена современная классификация рода Saccharomyces, которая основана на новой концепции генетического рода дрожжей. Рассматриваются основные данные зарубежных и отечественных авторов, касающиеся молекулярно-биологических методов идентификации дрожжеей, представлены примеры и предложения по идентификации дрожжей рода Saccharomyces, используемых в плодово-ягодном виноделии. Освещены вопросы, касающиеся производственных рас дрожжей для получения различных плодово-ягодных вин, показаны технологические особенности каждой расы.
Проведен анализ и обобщены данные о применении активных сухих и иммобилизованных дрожжей в виноделии, сделан обзор существующих методов культивирования, сушки и иммобилизации дрожжей. Обоснован вывод о необходимости поиска новых рас дрожжей для сбраживания плодово-ягодных вин, разработки новых технологий плодово-ягодного виноделия и производства спирта при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объёмы производимой продукции при сохранении её высокого качества, основываясь на использовании абсолютно сухих и иммобилизованных препаративных форм дрожжей. Анализ литературных данных позволил сформулировать цель и задачи данного исследования.
Экспериментальная часть.
Общая схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.
Глава 2. Материалы и методы исследований.
2.1. Объекты исследования.
Объектами исследования были более 80 важнейших винных и спиртовых рас дрожжей рода Saccharomyces наиболее часто используемые в различных отраслях бродильных производств (виноградном и плодово-ягодном виноделии:
шампанском, спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении), полученные из коллекций: Центральной коллекции Минсельхоза России («Чистые культуры дрожжей, применяемые при производстве пива, безалкогольных напитков и вина);
коллекции микроорганизмов Института винограда и вина «Магарач» г. Ялта, Украина;
кафедры «Биотехнология» МГУПП;
коллекции микроорганизмов ВНИИ пищевой биотехнологии.
Для ПЦР-анализа в качестве контролей использовали моноспоровые культуры S.cerevisiae CBS 1171, S.bayanus CBS 380, S.pastorianus CBS 1538, S.uvarum BRM Y-1146, S.paradoxis CBS 432 (CBS-Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, the Netherlands).
2.2. Методы исследования.
В работе использовались основные общепринятые методы исследований и селекции, принятые в системе микробиологической промышленности.
Выделение ДНК из клеток дрожжей осуществляли с использованием лизисного буфера [Naumov et al., 1997]. Выделение хромосомной ДНК проводили по методике, описанной Д.Шварц и К.Кантор [Schwarz D.H. еt al., 1984] с использованием ферментного препарата Novozym 234 (Novozymes, Дания).
Амплификацию5.8S – ITS, IGS2 фрагментов рДНК, генов МЕТ2 и АСТ1, митохондриального гена СОХ2, а также ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)5 и множественную ПЦР осуществляли на ДНК-амплификаторе «Терцик»
(«ДНК-технология», Россия) в режимах, описанных в литературе [Наумов Г.И. и др., 2003;
Nguen H.V. et al.;
Naumova E.S., 2003;
Наумова Е.С., 2006].
Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле при 60-65В в 0,5хТВЕ в течение 2 часов.
Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ-анализ) 5.8 S ITS и IGS2 районов рДНК осуществляли с помощью эндонуклеаз HpaII, HaeIII и AluI, BanI, соответственно (“Fermentas” Литва). Рестриктазный анализ амплифицированных генов MEL проводили с помощью эндонуклеаз Hinc II и Hind III (“Fermentas”, Литва). ПДРФ-анализ фрагмента гена МЕТ2 проводили с помощью эндонуклеаз EcoRI и PstI (“Fermentas”, Литва), митохондриального гена СОХ2 – с помощью эндонуклеазы PstI (“Fermentas”, Литва).
Разделение фрагментов рестрикции осуществляли в 1,6%-ном агарозном геле при 60 В в 0,5х ТВЕ в течение 3 ч.
Для разделения хромосомной ДНК использовали аппарат CHEF- DRTM III (“Bio-Rad”, США). Образцы помещали в щели 1%-ного агарозного геля. Пульс электрофорез проводили при 200В в течение 24 часов: 15 часов при времени переключения полей 60 с и 9 часов при времени переключения полей 90 с (охлаждение до 140С).
Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили Саузерн-блотом [Маниатис Т.И. и др., 1984]. В качестве зонда использовали HindIII-фрагмент гена ARG4 длиной 3000п.н., изолированный из плазмиды pINAI.
Метку вводили нерадиоактивным методом по инструкции фирмы “Roche Applied Science” (Германия) с использованием дигоксигенина DIG-II-dUTP [Naumov G.I. et al.,1991]. Гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов также проводили по инструкции этой же фирмы.
Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Vilber Lourmat» (Франция).
Филогенетические родственные связи изучаемых дрожжей-сахарамицетов устанавливали путем сравнения профилей ПЦР-продуктов, амплифицированных с микросателлитным праймером (GTG)5. Дендрограмму строили с помощью компъютерного пакета TREECON, используя Neighbor-Joining метод [Van de Peer Y.et al.,1994].
При изучении гибридов амплифицированные фрагменты гена MET элюировали из геля с помощью набора “GeneClean Kit”согласно протоколу фирмы изготовителя (“Bio-101 Inc.” США). Нуклеотидные последовательности фрагмента гена MET2 размером в 330 п.н. определяли по двум цепям с помощью прямого секвенирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI 373A (“Applied BioSystem, Англия). На основании сравнительного анализа полученных и уже известных нуклеотидных последовательностей участка гена MET2 строили филогенетическое древо с помощью компъютерного пакета TREECON, используя алгоритм Neighbor-Joining с поправкой Jukes и Cantor.
Культивирование дрожжей проводили на установке ФК-20, а также дрожжерастильных аппаратах объемом 360;
1200 и 6300 литров, снабженных системой аэрации и мешалкой. Расход питательных веществ при культивировании дрожжей рассчитывали методами, принятым в дрожжевом производстве (Новаковская, 1990;
Фараджева, 2002). Сушку дрожжей проводили на сушилке с кипящим слоем марки «Aeromatic» (Германия).
При выполнении аналитических исследований применялись общепринятые физико-химические, микробиологические и биохимические методы анализа, описанные в специальной научно-технической и отраслевой литературе.
Все исследования по световой микроскопии проводили на микроскопе Axioskop 40 FL Zeiss, увеличение объектива 100. Система документирования:
цифровая камера AxioCam MRc, программа AxioVision 3.1. Фиксированные и нефиксированные клетки окрашивались различными красителями для выявления запасных веществ и органелл. Все методы окраски были адаптированы к изучаемому объекту.
Флуоресцентную микроскопию осуществляли на микроскопе МЛ-2 (ЛОМО, Россия), оснащенном цифровой фотокамерой DSC-S85 (“Sony”, Япония).
Источником света служила ртутная лампа ДРШ-250. Учет количества живых клеток проводили при помощи микроскопа Axioscop 40 FL Zeiss (блок светофильтров №02, G 365 нм, FT 395 нм, LP 420 нм, объектив 40) и цифровой камеры AxioCam MRc, подключенной к компьютеру.
Электронную микроскопию осуществляли на микроскопе “Jeol” (JEM-100B).
Подготовка образцов для электронной микроскопии - фиксация в растворе KMnO и контрастирование по Рейнольдсу. После резки на ультратоме поводили двойное окрашивание ультратонких срезов на металлических сеточках по Рейнольдсу (1 час в 4% уранилацетате, затем промывка в 3 сменах бидистиллированной воды, окрашивание 30 минут в лимоннокислом свинце в присутствии кристаллов NaOH и снова промывка в 3 сменах бидистиллированной воды).
Основные показатели соков и полученных виноматериалов определяли методами, принятыми на предприятиях винодельческой промышленности [Государственный контроль качества винодельческой промышленности, 2003].
Анализ основных ароматических компонентов осуществляли методами газовой хроматографии - масс – спектрометрии (ГХ-МС), газовой хроматографии пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД), а также газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Исследование сахаров, кислот и фенольных веществ осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы Agilent Technologies (модель 1100), детектор спектрофотометрический на УФ-область. Количественное определение аминокислот в сусле и виноматериалах проводили по известным методикам [Бурьян, 1997;
Меледина, 2002] на автоматическом анализаторе KLa-3B фирмы «Hitachi» (Япония).
Получение биокатализатора на основе дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС (марка 16/1, «Аcros», Бельгия), осуществляли двумя методами: 1) согласно методике, разработанной в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН, используя криогрануляционную колонну, заполненную гидрофобной жидкостью;
2) суспензию клеток в растворе ПВС распределяли по различным формам, используя дозатор, и замораживали при –20оС в воздушной среде, выдерживали в замороженном состоянии 1418 ч, а затем размораживали при +2 +8оС.
Жизнеспособность и метаболическую активность иммобилизованных клеток контролировали, определяя концентрацию внутриклеточного АТФ люциферин люциферазным методом, используя реагент фирмы «Люмтек» (Россия) и люминометр Microluminometr 3560 New Horizons Diagnostics Co (США).
Микрофотографии гранул криогеля ПВС, получали, используя сканирующий электронный микроскоп Jeol JSM-S300LV (Япония) и световой микроскоп Intel Play QX3 (США).
Полученные экспериментальные данные обрабатывались с применением методов математической статистики [Грачев Ю.П., 2005].
Рис. Общая схема проведения экспериментальных исследований представленной работы Разработка биотехнологии отечественных сухих активных и иммобилизованных препаратов винных и спиртовых дрожжей для плодово-ягодного и спиртового производств Биотехнология Изучение физиолого-биохимических и Биотехнология получения Селекция новых рас. дрожжей сахаромицетов технологических особенностей винных рас. АСД винных и спиртовых иммобилизованных дрожжей дрожжей препаратов винных и спиртовых дрожжей Селекция дрожжей Селекция новых Дрожжи для Дрожжи для Культивирование дрожжей Получение Создание для плодово- рас. дрожжей для получения красных получения белых на среде с мелассой в иммобилизованног высокоэффектив ягодного спиртового виноградных вин виноградных вин качестве основного сырья о биокатализатора ного виноделия производства на основе блокатализатора дрожжевых клеток на основе Дрожжи для Дрожжи для иммобилизованн получения плодово-ягодного ых клеток Для Анализ шампанских вин виноделия дрожжей кислото Видовая идентификация дрожжей, понижения винных и спиртовых выделенных с Отработка Подбор дрожжей сахаромицетов поверхности Для условий питательной ягод Применение устране культивирования среды биокатализа ния тора при недобро получении дов Получение АСД Культивирование Культивиро- Культивиро - белых спиртовых и дрожжей с непрерывной вание вание столовых использование в подачей азотистого и приточным периодическ вин спиртовом производстве фосфорного питания способом им способом Применение при получении красных столовых вин Использование АСД Применение Сушка дрожжей в Сушка дрожжей в при производстве биокатализатора производственных лабораторных виноградных, в процессе Бутылоч условиях условиях плодовых и шампанизации ным шампанских вин способом Резервуарным способом Периодический способ Непрерывный способ шампанизации шампанизации Результаты их обсуждение Глава 3. Селекция новых рас дрожжей-сахаромицетов.
Селекция дрожжей для плодово-ягодного виноделия проводилась путем ступенчатого скрининга дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae, выделенных при исследовании дрожжевой микрофлоры плодов и ягод Западной Беларуси. Всего было изучено 481 штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Исследования бродильной активности, накопления спирта, органолептических показателей готового виноматериала, позволило установить 13 штаммов дрожжей, представляющих значительный интерес для использования в плодово-ягодном виноделии. Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Штаммы исследуемых дрожжей, рекомендуемых для использования в плодово-ягодном виноделии № Название штамма Субстрат выделения Место выделения 1. ВВ-1 виноград Волковысский р-н, Беларусь 2. ВВ-2 виноград Волковысский р-н, Беларусь 3. ГВ-1 виноград Гродненский р-н, Беларусь 4. ГВ-4 виноград Гродненский р-н, Беларусь 5. ГСЧ-1 черная смородина Гродненский р-н, Беларусь 6. ГСЧ-5 черная смородина Гродненский р-н, Беларусь 7. ГСЧ-8 черная смородина Гродненский р-н, Беларусь 8. ГСЧ-11 черная смородина Гродненский р-н, Беларусь 9. ДЧК-1 черника Дятловский р-н, Беларусь 10. ВЧР-3 черноплодная рябина Волковысский р-н, Беларусь 11. ГМ-8 малина лесная Гродненский р-н, Беларусь 12. ГМ-15 малина лесная Гродненский р-н, Беларусь 13. ГМ-17 малина лесная Гродненский р-н, Беларусь При дальнейшем изучении биохимических свойств полученных 13-ти штаммов дрожжей при сбраживании яблочного и других соков были выделены пять винных штаммов, представляющих особенный интерес:
- штамм ГВ-4, рекомендуемый для сбраживания яблочного сусла, отличающийся высокой скоростью брожения и накоплением этанола, глицерина, эфиров, и обеспечивающий наиболее высокую дегустационную оценку полученным виноматериалам. Этот штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3098 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132274);
- штамм ГСЧ-1, рекомендуемый для получения яблочных и черносмородиновых виноматериалов с пониженным синтезом высших спиртов и ацетальдегида, и отличающийся высокой бродильной активностью. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3100 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132274);
- штамм ГМ-8, рекомендуемый для получения яблочных и малиновых виноматериалов с повышенным содержанием спирта и наименьшим содержанием нежелательных летучих компонентов. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3097 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132274);
- штамм ДЧК-1, рекомендуемый для получения черничных виноматериалов с высокими органолептическими показателями. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3096 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132274);
- штамм ВЧР-3, рекомендуемый для получения черноплодно-рябиновых виноматериалов с высокими органолептическими показателями, отличающийся высокой скоростью брожения. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3099 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132273).
Среди спиртовых рас дрожжей были выделены дрожжи расы 985Т и 987- обладающие повышенной устойчивостью к повышенным температурам и обладающие осмофильными свойствами (данные представлены в таблице 2).
- штамм 985-Т, энергично сбраживающий концентрированное зерновое сусло (СВ-22-26%) при температуре 38-39°С. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3137 и запатентован (Патент РФ №2331667);
- штамм 987-0, энергично сбраживающий высококонцентрированное зерновое сусло (СВ-32%) при температуре 30-32°С. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером Y-3136 и запатентован (Патент РФ №2331666).
При сравнении полученных штаммов с наиболее широко используемыми культурами спиртовых дрожжей было показано, что наилучшим вариантом для условия интенсивного спиртового производства является штамм 985-Т, обладающими как термотолерантными, так и осмофильными свойствами и сбраживающими сусло с накоплением наибольшего количества спирта и минимального количества побочных метаболитов за короткое время. Штамм 985-Т является наилучшей исходной культурой для создания препаратов сухих спиртовых дрожжей.
Таблица 2.
Характеристика бродильной активности и синтеза побочных метаболитов различных спиртовых рас дрожжей.
Раса Время брожения Содержание дрожжей побочных 24 часа 48 часов 56 часов метаболитов РВ,г / спирт, РВг / спирт, РВ спирт, в готовой 100 мл % об. 100 мл % об. г/100 % об.
бражке, мл мг/дм 985-Т 6,10 7,5 1.80 10,0 0,35 10,6 987-0 6,50 7,3 1.80 10,0 0,70 10,3 Y-717 6,90 7,0 4,60 8,3 1,40 10,0 Y-1986 6,60 7,2 2,00 9,8 1,0 10,2 К-81 10,15 5,0 5,50 7,8 1,90 9,8 ХП-Т 8,35 6,1 4,00 8,5 1.90 9,8 Г-660 8,70 5,9 4,55 8,3 2,30 9,5 985 6,65 7,2 2,30 9,6 1,50 10,0 ВПУ-408 8,20 6,2 3,85 8,6 1,80 9,9 Глава 4. Видовая идентификация важнейших отечественных винных и спиртовых рас дрожжей Saccharomyces.
Следующим этапом работы было проведение видовой идентификации важнейших отечественных винных и спиртовых рас дрожжей Saccharomyces., так как за последние годы систематика дрожжей рода Saccharomyces подверглась многократным пересмотрам и изменениям. Используя современные физиолого биохимические и молекулярно-биологические методы, проведена идентификация 62 важнейших селекционированных нами рас дрожжей, используемых в спиртовой и винодельческой промышлености до вида согласно последнему определителю дрожжей [Kurtzman, 1998] Проведено физиологическое тестирование рас дрожжей, в результате изучения морфологических признаков стандартными методами установлено, что большинство исследуемых дрожжей относятся к роду Saccharomyces и по определению [Vaughan-Martini A. et.al., 1998] к биологическому виду S. cerevisiae, способные сбраживать сахарозу и раффинозу;
не сбраживать лактозу, трегалозу;
ассимилируть глюкозу, сахарозу, мальтозу трегалозу, раффинозу, этанол;
не ассимилируть рибозу, лизин, манит, этиламин;
расти при 35 0С;
не расти на среде с 0,1% содержанием антибиотика на среде, не содержащей витаминов Одновременно были выявлены отклонения от стандартного описания для вида S cerevisiae, штаммы ВВ-1, ГСЧ-5, ГСЧ-8, ДЧК-1, Феодосия 1-19, 47-К, 985-Т проявили способность к слабому сбраживанию трегалозы, свойственную дрожжам вида S. barnettii;
штамм Харьковская-39 ассимилирует рибозу, что характерно для видов S. castellii и S. dairenensis;
штамм 985-Т усваивает рибозу и лизин;
штамм У-717 слабо ассимилирует рибозу и лизин;
штамм ВВ-2 ассимилирует этиламин и слабо ассимилирует лизин, что характерно для представителей вида S. kluyveri;
штамм «Я » вырос на среде, содержащей 0,1% антибиотика (циклогексимида), что характерно для штаммов вида S. exiguous;
все штаммы, выделенные в Беларуси, дали слабый рост на лизине, характерный для S. kluyveri, S.unisporus, S.spenserorum и отдельных штаммов S. transvaalensis. Довольно вариабельным признаком оказалось сбраживание галактозы - все расы дрожжей разделились по нему на две большие группы.
Ассимиляционные тесты, которые были расширены до 38 источников углерода, так называемый «пестрый ряд», показали, что все исследуемые штаммы ассимилируют глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, раффинозу, галактозу (кроме рас Корнет и Яблочная Анис-6, давшие на ней слабый рост) и этанол. Все штаммы не ассимилируют сорбозу, рамнозу, ксилозу, L- и D-арабинозу, мелибиозу, лактозу, целлобиозу, арбутин, салицин, инулин, глюкозамин, эритрит, рибит, маннит, дульцит, инозит, 5-кетоглюконат, лимонную кислоту. Однако некоторые штаммы S. cerevisiae отличаются от стандартного описания. К ним относятся:
- ВВ-2, отличающийся способностью расти на среде с этиламином, характерной для вида S. kluyveri. Но не сбраживают мальтозу и мелибиозу и ассимилируют маннит.
Сидровая-101,Шампанская 11/12,ГМ-15,ГМ-17, -Вишня-18, Штейнберг-92, Кокур-3, 47-К растущие на глицерине, что характерно для вида S.
bayanus, но все без исключения исследуемые штаммы не растут на безвитаминной среде;
-штамм Я, который вырос на среде с 0,1 % антибиотика, что свойственно S.
exiguous. Однако, эти дрожжи, в отличие от штамма Я, сбраживают трегалозу, не сбраживают мальтозу, и не растут при 37°С;
-штаммы 985-Т и Y-717 ассимилируют рибозу и лизин. Ни один из видов рода Saccharomyces не проявляет этих двух физиологических свойств одновременно.
Ассимиляция рибозы характерна для дрожжей S. castellii и S.dairenensis, но они не сбраживают сахарозу, мальтозу и раффинозу, а рост на среде с лизином одновременно со способностью сбраживать сахарозу и раффинозу характерен для вида S. kluyveri. Но дрожжи этого вида, в не сбраживают мальтозу, что характерно для 62 исследуемых штаммов.
Таким образом, по результатам бродильных и ассимиляционных тестов все исследуемые штаммы относятся к биологическому виду S. cerevisiae. Отличия между отдельными штаммами по способности сбраживать отдельные сахара, попадают в разряд вариабельных признаков. Остальные расхождения между отдельными штаммами находятся в пределах, допустимых для ассимиляционного спектра, определяющего вид.
Далее определяли максимальные температуры роста каждого штамма на твердой питательной среде с содержанием СВ 7%. Диапазон температур 28-53°С.
Первый просмотр проводился через 3 дня после высева культур, второй - еще через 3-4 дня Максимальной температурой роста дрожжевых штаммов считается промежуточная между самой высокой, при которой рост не проявляется в течение 7 дней и предыдущей более низкой температурой. Было выявлено 4 группы дрожжей:
1. При температуре 35-37°С - Корнет;
Харьковская-39, Шампанская 11/12, Груша-7, Груша-10, Крыжовниковая-48, Брусничная-7, Яблочная-17, Земляничная Виктория-14, Малиновая Ленинградская, Малиновая-10, Черносмородиновая-5, Рислинг.
2. При температуре 44-46°С - ГСЧ-8, ГСЧ-11,ГМ-8,ГМ-15,ДЧК-1,ВЧР-3, Вишня-18, Яблочная -7,Сидровая-101, Феодосия 1-19, Кокур-3,47-К,Я,Яблочная Анис-6, К-17, Минская-120, Шампань ПЯ-16, Москва-30, Слива-23, Крыжовниковая-27, Черносмородиновая-7, Смородиновая-22, Вишня-6, Вишня-33, Земляничная-4, Слива-21, Земляничная-9, Холодостойкая-21, Киевская, Бордо-20, Ленинградская, Магарач-125, Магарач 17-35, Ашхабадская-3, Каберне-5, Берегово-1, Ркацители-6.
3. При 46-49°С - ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГМ-17, Штейнберг-92.
4. При температуре 49-53°С - 985-Т, У-717.
Полученные данные учитывались при выборе штаммов дрожжей для культивирования и обезвоживания с целью получении препаратов АСВД.
Молекулярно-биологическое исследование штаммов дрожжей проводилось путем изучения амплифированных 5.8S-ITS и IGS2 фрагментов рДНК исследуемых дрожжей показало, что размеры их одинаковы у всех изученных и тестерных штаммов и составляют соответственно примерно 850 и 1300 п.н., что подтверждает их принадлежность к роду Saccharomyces.
Проведён ПДРФ-анализ амплифицированных 5.8S-ITS фрагментов рДНК всех исследуемых штаммов дрожжей, с использованием эндонуклеаз HpaII и НаеIII показано, что все они имеют идентичные профили с двумя фрагментами размером примерно 730 и 120 п.н., т.е. среди них отсутствуют дрожжи видов S. paradoxus, S.mikatae, S. cariocanus. По сходству НаеIII рестриктазных профилей все изученные дрожжи разделились на 2 группы. В первую группу вошло подавляющее большинство изученных штаммов, и ее представители характеризуются наличием четырех НаеIII- фрагментов размером примерно 320, 230, 170 и 130 п.н. (рис.2, дорожки 3 и 10-18).
Рис. 2. Рестриктазный анализ амплифицированных 5.8S-ГТS-фрагментов рДНК штаммов Saccharomyces с помощью эндонуклеазы НаеIII.Дорожки: 1- S.
pastorianus CBS 1538;
2 - S. bayanus var.
bayanus CBS 380;
3-S. cerevisiae CBS 1171;
4 - S. bayanus var. uvarum BKM Y-1146;
S.
cerevisiae x S. bayanus var. uvarum: -ГСЧ-5, 6 - ГСЧ-8, 17 - ГСЧ-11, 8 - Л-80-4, 9 - Шампанская-11/12;
S. cerevisiae: 10 Корнет, 11 - Штейнберг-92, 12 Харьковская-39, 13-301, 14-261, 15- 125, 16-ГВ-1, 17-ГВ-4, - ГСЧ-1. М - маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA Ladder" ("Fermentas", Литва) Рис. Аналогичную картину имеет НаеШ рестриктазный профиль типового штамма S. cerevisiae CBS 1171. Во вторую группу вошли пять штаммов - ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская-11/12, Л-80-4, обладающие уникальными НаеШ-профилями 5.8S-ITS участка рДНК (рис.2, дорожки 5-9 соответственно). Штаммы этой группы имеют сложные паттерны, в которых объединены три фрагмента, характерные для S. bayanus (около 490, 230 и 130 п.н.) и четыре фрагмента, характерные для S.
cerevisiae (около 320, 230, 170 и 130 п.н.).
Аналогично разделяются исследуемые штаммы дрожжей по результатам ПДРФ анализа амплифицированных IGS2 фрагментов рДНК, проведенного с использованием эндонуклеаз АluI и ВаnI. Рестриктазные профили некоторых штаммов представлены на рис.3.
Таким образом, проведенный нами ПДРФ-анализ показал, что большинство изученных штаммов относятся к виду S. cerevisiae и только пять штаммов (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская-11/12, Л-80-4), представляют собой гибриды S.cerevisiaeS. bayanus var. uvarum Проведённый кариотипический анализ подтвердил, что большинство штаммов относятся к виду S. cerevisiae. Хромосомные ДНК этих штаммов были разделены на 11-14 полос. Согласно интенсивности свечения окрашенных полос некоторые из них содержат более одной хромосомы. Некоторые спиртовые (985-Т, У-717), а также изученные пивные и пекарские штаммы дрожжей обладают сложным кариотипом, насчитывающим более 16 хромосомных полос. Для этих штаммов характерно наличие четырех хромосомных полос размером штаммы ГСЧ-5, ГСЧ-8 и ГСЧ-11 по кариотипам не отличались от штамма ГСЧ-1, также изолированного с ягод черной смородины и отнесенного нами по рестриктазным профилям к S. cerevisiae (рис. ЗА, дорожки 5-8).
Штамм Шампанская-11/12 по своему кариотипу существенно отличается от большинства штаммов и стандарта YNN 295: у него имеется хромосомная полоса размером около 1300 п.н., характерная для дрожжей S. bayanus и S. pastorianus (рис. ЗА, дорожки 2-4), по своему кариотипу этот штамм напоминает гибридные дрожжи S. pastorianus. Два других сбраживающих мелибиозу штамма ВВ-2 и Харьковская-39 имеют кариотипы, типичные для вида S. cerevisiae.
Гибридизация по Саузерну выявила только по одной гибридизацинной полосе у всех изученных штаммов (рис. ЗВ), за исключением штамма Шампанская 11/12, у которой маркер характерен для дрожжей S.bayanus и S.pastorianus, тогда, как у остальных штаммов, включая четыре гибрида (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Л-80-4) в положении, характерном для S. cerevisiae (рис. ЗВ, дорожки 1, 5-12) Рис. 3. Рестриктазный анализ амплифицированных IGS2-фрагментов рДНК штаммов Saccharomyces с помощью эндонуклеаз Alul. (А) и Banl (В).
Дорожки: 1- S. pastorianus CBS 1538;
2-S. bayanus var. bayanus CBS 380;
3 - S.
cerevisiae CBS 1171;
4 - S. bayanus var.
uvarum BKM Y-1146;
S. cerevisiae x S.
bayanus var. uvarum: 5 -ГСЧ-5, 6 - ГСЧ-8, - ГСЧ-11, 8 - Л-80-4, 9 - Шампанская-11/12;
S. cerevisiae: 10 - Корнет, 11 Штейнберг-92, 12 - Харьковская-39, 13-301, 14-261, 1 5 - 125, 16-ГВ-1, 17-ГВ-4, 18 ГСЧ-1. М - маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA Ladder" ("Fermentas", Литва).
Рис. Множественная ПЦР с двумя парами праймеров, специфичных для S.
cerevisiae и S. bayanus, также подтвердила видовую принадлежность исследуемых дрожжей. У 50 исследованных нами штаммов винных дрожжей амплифицировался только один фрагмент размером около 1700 п.н., характерный для дрожжей S.
cerevisiae (рис. 4, дорожки 2-10). Для штаммов Шампанская-11/12, ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Л-80-4, характерно два фрагмента размером около 1700 пл. и 330 п.н.,что соответствetn, видfv S. cerevisiae и S. bayanus (рис. 6, дорожки 11-17), что подтверждает их гибридную природу.
Внутривидовой полиморфизм дрожжей S. cerevisiae изучали с помощью полимеразной цепной реакции с микросателлитным праймером (GTG)5.
Большинство анализируемых штаммов S. cerevisiae имеют ПЦР-профили с мажорными фрагментами размером около 750, 670, 450 и 350 п.н На основании сходства паттернов с праймером (GTG)5 была построена дендрограмма, представленная на рис. 5. Изученные штаммы сформировали отдельный кластер относительно тест-штамма S. bayanus var. uvarum ВКМ Y-l 146, изолированного с ягод винограда. Внутри этого кластера выделяются несколько групп, объединяющих штаммы с более сходными ПЦР-профилями. Наиболее многочисленную группу, составили штаммы, выделенные из соков и с поверхности ягод плодово-ягодных растений. Внутри этой группы можно выделить три подгруппы, одна из которых представлена в основном штаммами, выделенными из малинового и грушевого соков. Вторую подгруппу сформировали штаммы, изолированные из земляничного сока, а также из соков ягод кустарниковых растений (смородина и крыжовник). Третья подгруппа включает плодово-ягодные штаммы, выделенные в различных районах Белоруссии. Часть шампанских и винных дрожжей сгруппированы на дендрограмме вместе.
Рис.4. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК дрожжей Saccharomyces (А) и Саузерн-гибридизация с зондом ARG4 (В).
Дорожки: 1- S. cerevisiae YNN (хромосомный стандарт);
2- S. bayanus var.
uvarum BKM Y-l 146;
3 - S. pastorianus CBS 1538;
S. cerevisiae x S bayanus var. uvarum:
4 - Шампанская-11/12, 5 - ГСЧ-5, 6 - ГСЧ-8, 7 - ГСЧ-11, 9 - Л-80-4;
S. cerevisiae: -ГСЧ1,10 - 301, 11 - 985-Т, 12 - У-717.
У717.
Состав геномов обнаруженных нами гибридных штаммов S. cerevisiae S.
bayanus var. uvarum - ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Л-80-4 и Шампанская-11/12С был подробно изучен с помощью Саузерн-гибридизации, ПДРФ-анализа и секвенирования ядерного гена МЕТ2 и ПДРФ-анализа митохондриального гена СОХ2. На рис. 6 и 7 указаны результаты ПДРФ-анализа соответственно ядерного гена МЕТ2 и митохондриального гена СОХ2. Полученные данные свидетельствуют о том, что гибриды ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11 и Л-80-4 содержат более полный геном дрожжей S. cerevisiae, включая митохондриальную ДНК, и частичный геном S. bayanus var. uvarum. В то время как гибрид S. cerevisiae х S.
bayanus var. uvarum (штамм Шампанская 11/12), наоборот, содержит более полный геном S. bayanus var. uvarum и частичный геном S. cerevisiae.
Таким образом, подавляющее большинство винных и спиртовых штаммов дрожжей России, Украины и Беларуси принадлежат к биологическому виду S.
cerevisiae. Дрожжи вида S. bayanus var. uvarum среди исследованных отечественных штаммов дрожжей нами не обнаружены, однако установлено, что среди них, особенно в Беларуси, могут встречаться гибриды S. cerevisiae х S.
bayanus var. uvarum, впервые выделенные нами из естественной среды Рис.5 Дендрограмма родства штаммов Saccharomyces, основанная на матрице различий по ПЦР-профилям с микросателлитным праймером (GTG)s. В качестве внешней группы использован штамм S.
bayanus var. uvarum BKM Y-l 146. Данные обработаны по программе Neighbor-Joining из компьютерного пакета TREECON.
.
Рис. 5.
Рис.6. Идентификация дрожжей S.
cerevisiae, S. bayanus и их межвидовых гибридов с помощью множественной (multiplex) ПЦР. Дорожки: S. bayanus var. uvarum: 1 - ВКМ Y-l 146;
S.
cerevisiae: 2 - BKM Y-502;
3 - ГСЧ-1;
4 BB-1;
5 - Яблочная-17;
6 Крыжовниковая-27;
7 - Слива-23;
8 Киевская;
9 - Магарач 125;
-Холодостойкая 21;
S. cerevisiae S.
bayanus var. uvarum: 11 Шампанская-11/12;
12 - ГСЧ-5;
13 использован штамм S. bayanus var.
uvarum BKM Y-l 146. Данные Рис. 6.
обработаны по программе Neighbor Joining из компьютерного пакета TREECON.
Рис. 7 Рестриктазный анализ гена МЕТ2 штаммов Saccharomyces с использованием эндонуклеаз ЕсоШ (А) и Pstl (Б).
Дорожки: S. cerevisiae: 1 - ВКМ Y-502;
- ГСЧ 1;
11 - Сидровая 101, 12 - К 17;
-Крыжовниковая-27;
14 - Вишневая-6;
Брусничная-7;
S. bayanus var. uvarum: 2 ВКМ Y-l 146;
S. bayanus var. bayanus: 3 CBS 380;
S. pastorianus: 4 - CBS 1538;
S.
cerevisiae S bayanus var. uvarum: 5 ГСЧ-5;
6 - ГСЧ-8;
7 - ГСЧ-11;
8 - Л-80-4;
- Шампанская-11/12. M - маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA Ladder" ("Fermentas").
Рис. 7.
Рис. 8. Рестриктазный анализ амплифицированного фрагмента митохондриального гена СОX2 дрожжей Saccharomyces с использованием эндонуклеазы Pstl.
Дорожки: 1 - S. cerevisiae BKM Y-502;
2-5. bayanus var. uvarum BKM Y-l 146;
3 - S. bayanus var. bayanus CBS 380;
4 S. pastorianus CBS 1538;
S. cerevisiae x S.
bayanus var. uvarum: 5 - ГСЧ-5;
6 -ГСЧ-8;
- ГСЧ-11;
8 - Л-80-4;
9 Шампанская-11/12. M - маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA Рис. 8.
Ladder" ("Fermentas", Литва).
Глава 4. Исследование физиолого-биохимических особенностей винных штаммов дрожжей рода Saccharomyces.
Исследования проводились с 10 штаммами дрожжей, отобранными нами из нескольких десятков штаммов в результате предварительных испытаний по следующим показателям: бродильной активности, синтезу ароматических веществ, влиянию на качественный и количественный состав органических кислот, фенольных соединений.
Дрожжи для получения красных виноградных вин.
Бродильная активность. Исследована динамика потребления глюкозы и фруктозы и накопление спирта выбранными расами дрожжей, что позволило отобрать штаммы Бордо-20 и Берегово-1 (т), накапливающие наибольшее количество спирта. Установлено также, что среди исследованных дрожжей нет штаммов-фруктофилов – все они быстрее сбраживают глюкозу, а фруктоза остается основным компонентом несброженных сахаров.
Синтез ароматических веществ. Значительное внимание уделено исследованию закономерностей синтеза ароматических веществ штаммами дрожжей. Установлены штаммы 47-К и Берегово-1 (т), у которых не наблюдается резкого увеличения содержания высших спиртов в конце брожения, что, по видимому, обусловлено большей устойчивостью их клеток к автолизу. Накопление многоатомных спиртов исследованными штаммами происходило постепенно в ходе всего брожения, достигая максимума на 12-15 сутки, что несколько отличается от имеющихся в литературе данных (Ribero-Gayon, 2000). При этом наибольшим накоплением глицерина отличаются штаммы 47-К и Каберне-5.
Накопление ацетальдегида, а также этилацетата и других сложных эфиров подчиняется закономерностям, описанным в литературе (Скурихин, 1988).
Наилучшим эфирообразованием отличаются штаммы Феодосия 1-19(т), Каберне-5, а также Ашхабадская-3 и Бордо-20, а наименьшим накоплением ацетальдегида Ашхабадская-3 и 47-К. Отмечена также отрицательная корреляция между накоплением С6-С10 жирных кислот и бродильной активностью изученных дрожжей.
Влияние на качественный и количественный состав органических кислот.
Что касается органических кислот, то наибольший практический интерес представляет яблочная кислота, повышенное содержание которой является одной из проблем отечественного виноделия. В результате проведенных исследований отобран штамм Берегово-1, который способен усваивать до 17% яблочной кислоты, и может использоваться для частичного кислотопонижения сусла во время его сбраживания. Установлено, что в наибольшей степени содержание яблочной кислоты снижается в самом конце брожения.
Винная кислота дрожжами используется очень мало – максимально установленное снижение – 7-9% при использовании штамма Феодосия 1-19 (т).
Содержание лимонной кислоты резко снижается в самом начале брожения, достигая минимума на 10-13 сутки, после чего начинает понемногу возрастать.
Отобраны штаммы Феодосия 1-19 (т), Ашхабадская-3 и Берегово-1 (т) способствующие максимальному снижению лимонной кислоты в вине.
Содержание янтарной кислоты быстро возрастает с начала брожения, достигая максимума на 10-13 сутки, однако в самом конце брожения ее содержание резко снижается. Содержание пировиноградной кислоты возрастает с самого начала брожения, достигая максимума на 7-8 сутки, после чего оно постепенно снижается.
Молочная и уксусная кислоты активно накапливались с начала брожения, однако содержание их было в норме во всех вариантах.
Влияние дрожжей на состав фенольных соединений представляет особый интерес, так как в литературе практически отсутствуют данные по этому вопросу.
Установлено, что в начале процесса брожения доминируют процессы экстракции фенольных веществ (в основном мономерных форм и антоцианов).
Особенно это выражено при использовании штаммов Бордо-20, 47-К и Ашхабадская-3, что, по-видимому, обусловлено более высокой активностью в указанных штаммах экстрацеллюлярных ферментов. К концу брожения, наряду с отмиранием клеток дрожжей и осветлением виноматериала, которые сопровождаются снижением концентрации полифенольных соединений и антоцианов в среднем на 30%, резко возрастает интенсивность процесса трансформации полифенольных соединений, о чем свидетельствует возрастание содержания проантоцианидинов. Установлено, что повышенные дозировки SO способствуют не только ускорению перехода полифенольных соединений во время мацерации, но и сохранению их на стадии осветления виноматериала.
Изучено поведение отдельных групп фенольных веществ во время брожения.
Катехины в процессе брожения слабо подвергаются трансформации, их концентрация, увеличивается во время мацерации и снижается на стадии осветления. В большей степени подвержен трансформациям эпикатехин, в то время как катехин и эпикатехингаллат только накапливаются. Антоциановые пигменты подвергаются изменениям, почти не изменяя своего пропорционального соотношения. Нами идентифицированы два новых антоциановых пигмента образующиеся в процессе брожения – это продукты конденсации мальвидин-3 гликозида с пировиноградной кислотой (витисин А) и с п-кумаровой кислотой (витисин В). Содержание кафтаровой и коутаровой кислот непрерывно и плавно снижается во время брожения, а галловой - наоборот возрастает, очевидно, за счет кислотного гидролиза эпикатехингаллата входящего в структуру полимерных процианидинов. Концентрация кверцетина также возрастает к концу процесса брожения, что связано с улучшением его растворимости при повышении содержания спирта в виноматериале. Вещества группы стильбенов, в частности ресвератрол и его гликозид пицеид, обнаружены не были.
Таким образом, исходя из полученных данных, для получения высококачественных красных вин рекомендовано использовать штаммы Бордо- и Каберне-5, а для сбраживания высококислотных красных сусел – Берегово-1.
Дрожжи для получения белых виноградных вин.
Бродильная активность. Отобраны штаммы Кокур-3, Ленинградская и Магарач-17-35, накапливающие наибольшее количество спирта. Исследование динамики сбраживания сахаров показало, что, хотя фруктоза более активно потребляется в самом начале брожения, она все же остается основным компонентом несброженных сахаров в вине.
Синтез ароматических веществ. Установлено, что синтез ароматических веществ изученными дрожжами в целом подчиняется закономерностям, описанным в литературе. При этом наиболее благоприятными ароматическими свойствами характеризуются дрожжи Кокур-3, отличающиеся максимальным синтезом сложных эфиров, и 47-К, накапливавшие наименьшее количество высших спиртов и ацетальдегида. В отличие от красных вин, отрицательной корреляции между накоплением С6-С10 жирных кислот и бродильной активностью не обнаружено. Так, дрожжи Кокур-3, накапливавшие наибольшее их количество, обладали высокой активностью брожения.
Влияние на качественный и количественный состав органических кислот. При изучении закономерностей превращения органических кислот в ходе брожения было установлено, что содержание яблочной кислоты возрастает в первые 4 суток, а затем плавно снижается. В наибольшей степени снижение яблочной кислоты наблюдается при сбраживании дрожжами Ленинградская, что может быть использовано для кислотопонижения сусла.
Винная кислота потребляется в белых винах значительно больше, чем в красных. При этом максимально способствуют ее сохранению штаммы Феодосия 1-19 и Холодостойкая-21. При их использовании концентрация винной кислоты в вине на 0,6-0,8 г/л выше, чем при использовании других штаммов. Лимонную кислоту максимально потребляют Феодосия 1-19,Холодостойкая-21 и Ркацители-6.
Янтарная кислота непрерывно накапливается в течение всего процесса брожения, наименьшим накоплением характеризуется дрожжи Ркацетели-6, Магарач 17-35 и Кокур-3, наибольшим 47-К. Содержание молочной и уксусной кислоты было в норме во всех вариантах.
Влияние на качественный и количественный состав фенольных веществ. Характер изменений концентрации полифенольных веществ в процессе сбраживания сусла сходен для всех использованных дрожжей. При этом прослеживается резкий прирост концентрации фенолов на третьи сутки и плавное снижение ее весь последующий период. Резкое повышение концентрации полифенольных соединений обусловлено их высвобождением из твердых частиц под действием экстрацеллюлярных ферментов дрожжей. В наибольшей степени это выражено для штаммов Магарач 17-35, Ленинградская, Кокур-3 и Массандра-3.
Снижение концентрации фенолов свидетельствует о приросте биомассы и меньшим влиянием процессов окисления на формирование полифенольных соединений вина. Наименее окисленные виноматериалы были получены с использованием дрожжей Ркацетели-6, Рислинг Анапский и 47-К.
Состав комплекса полифенолов белого вина, исследованный нами методами ВЭЖХ, представлен на таблице 3.
Таблица 3.
Содержание полифенольных соединений в виноматериалах Рислинг полученных с использованием различных рас дрожжей.
Эпикатехин-галлат п-Кумаровая Эпикатехин Кафтаровая Кутаровая Кофейная Галловая Катехин Тирозол В В В В 47-К 1 29 49 8,5 12 12 29 3 4,8 33 3 8 0, Кокур-3 0,3 25 43 5 11 12 31 3 4 33 4 8 0, Ленинградская 0,3 25 53 5,6 11 14 41 2,9 4,2 31 3,5 7,9 0, Магарач-125 0,3 19 49 8 12 12 30 2,9 4,3 34 3,6 8,4 0, Магарач-17-35 0,3 25 45 7,7 10 12 30 2,9 4,5 34 3,9 8,4 0, Массандра-3 0,5 20 49 9,5 16 12 37 2,9 5 32 3,4 8,1 0, Рислинг Анапский 0,3 18 50 4,8 11 12 28 2,9 4,5 32 3,3 8,1 0, Ркацители-6 0,3 18 50 5,6 11 13 32 3,2 4,5 32 3,4 7,9 0, Феодосия-1-19 0,1 23 47 11 20 10 31 2,1 4,3 34 2,7 6,3 0, Холодостойкая-21 0,1 17 38 9,3 18 10 31 2,4 4,5 33 2,7 6,3 0, Показано, что в сусло на первых этапах брожения переходят из твердых частичек в основном только процианидины, далее в процессе брожения концентрация большинства полифенольных соединений снижается. Наиболее подверженными окислительным и конденсационным процессам являются катехин и процианидины. Эпикатехин и эпикатехингаллат менее подвержены трансформации в процессе брожения. Производные оксикоричных кислот в процессе брожения мало подвержены трансформации. Незначительно возрастает концентрация кофейной кислоты образующейся при гидролизе кафтаровой кислоты, концентрация которой несколько снижается на ранних этапах брожения.
Концентрация тирозола в процессе брожения возрастает, что объясняется выделением этого компонента в процессе автолиза отмирающих клеток дрожжей.
Сопоставляя результаты анализов комплекса полифенольных соединений белых виноматериалов можно выделить штаммы Ленинградская и Ркацители-6, с наименьшей окислительной активностью, обеспечивающие получение виноматериалов с более высоким содержанием легко окисляемых полифенольных соединений, в то время как дрожжи Холодостойкая-21 и Кокур-3 в наибольшей степени трансформируют полифенольные соединения в процессе брожения.
На основании полученных данных и результатов дегустации виноматериалов рекомендуется использовать для получения высококачественных белых вин штаммы 47-К и Кокур-3. Штамм Ленинградская рекомендуется для переработки высококислотных белых сусел.
Дрожжи для получения игристых вин.
Исследования проводились с 11 штаммами дрожжей, предназначенных для получения шампанских вин. Изучение их бродильной активности позволило отобрать штаммы Харьковская-39, Корнет и Шампанская-39, наиболее активно проводящие шампанизацию вина и накопившие максимальное количество спирта.
Изучение ароматических свойств данных штаммов и органолептической оценки шампанских вин показало, что наилучшими являются дрожжи Харьковская-39, обеспечивающие накопление наименьшего количества высших спиртов, и наибольшего количества высших спиртов, и наибольшего – глицерина, а также обеспечивающего получение шампанского с максимальной дегустационной оценкой, что позволяет рекомендовать эти дрожжи как наиболее перспективные для создания препаративных форм.
Дрожжи для получения плодовых вин Развитие плодово-ягодного виноделия в России на основе отечественных рас дрожжей является очень важной и актуальной проблемой, так как многие вопросы плодово-ягодного виноделия до сих пор не изученны.
В работе использовали яблочные, грушевые, вишневые, черничные, голубичные, черноплоднорябиновые, черносмородиновые, красносмородиновые, брусничные, клюквенные, малиновые и клубничные виноматериалы и 50 рас дрожжей селекционированных в России, Украине, Беларуси для получения плодовых вин.
Для получения высокачественных плодово-ягодных виноматериалов отбирались культуры дрожжей максимально полно сбраживающие сахара сусла (сахарозу, глюкозу и фруктозу), накапливающие наибольшее количество спирта, полиолов, фенилэтанола, сложных эфиров, терпеновых и других веществ, определяющих сортовой аромат вин, и наименьшее количество ацетальдегида, метанола, высших спиртов, жирных кислот и производных фурфурола - все эти соединения определяют вкус и аромат вина. Значительное внимание также уделялось способности дрожжей максимально полно сохранять наиболее полезные для здоровья человека компоненты плодовых вин - аскорбиновую и эллаговую кислоты, а также флавонолы. Исследовался также количественный и качественный состав аминокислот и изменение их содержания в процессе брожения.
На основе комплексного исследования ключевых биохимических и технологических свойств важнейших рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия установлено, что лучшими являются следующие штаммы дрожжей: для получения яблочных виноматериалов – ГВ-4 и Сидровая – 101;
грушевых – ГВ-4 и груша – 10;
вишневых – Вишня-6 и Вишня-18;
черноплодно-рябиновых – Вишня-18 и Москва-30;
черничных – Вишня-18 и ДЧК-1;
голубичных – Вишня- и Москва-30;
красносмородиновых – Москва-30;
малиновых – Москва-30 и ГСЧ-1;
клюквенных-ГВ-4;
брусничных – Брусничная 7 и ГВ-4;
клубничных – Вишня-18 и Земляничная-9.
Глава 5. Технология препаратов винных и спиртовых АСД на основе мелассы, как основного сырья для культивирования дрожжей.
Эта часть работы посвящена разработке технологии получения препаратов винных и спиртовых АСД на основе определенных ранее лучших рас дрожжей и использования их в виноделии (АСВД) и спиртовом производстве (АССД).
При создании отечественных АСВД и АССД при культивировании дрожжей была использована меласса, в качестве основного субстрата. Меласса является довольно необычным субстратом для культивирования этих дрожжей. Поэтому необходимо было скорректировать такие параметры культивирования, как концентрация питательных веществ, температура и рН среды.
На первом этапе исследований определяли возможность роста винных и спиртовых дрожжей на концентрированных мелассных субстратах, так как эти дрожжи менее осмофильно стойкие. Культивирование винных и спиртовых дрожжей на мелассных средах концентрацией СВ от 2% до 17% показало, что в данных условиях они хорошо накапливают биомассу. Установлено, что наиболее экономически выгодным для винных дрожжей является использование мелассных сред с до СВ 14%, а для спиртовых дрожжей 985-Т-среды с СВ до 17%.
На следующем этапе исследований были определены наиболее оптимальные для культивирования винных и спиртовых дрожжей значения температуры и рH.
Показано, что температурный оптимум роста винных дрожжей находится от 27 до 330С;
шампанских - при 27 0С, и спиртовых – при 350С. Учитывая необходимость применения повышенных температур при получении сухих дрожжей, для стимуляции синтеза трегалозы, можно рекомендовать выращивание шампанских дрожжей в диапазоне температур 27-300С;
винных – 30-330С;
спиртовых - 33-350С.
При температуре 350С растут все дрожжи, что особенно важно при получении АСД шампанских рас – Харьковская 39.
Культивирование при рН 3,0 позволяет снизить риск инфицирования всего технологического процесса, но при этом снижается накопление биомассы, поэтому оптимальным рН среды культивирования для получения винных и спиртовых АСД признан диапазон рН 3,8-4,2.
На практике для получения дрожжей реально используется 2 способа культивирования: периодический и приточный. Первоначально нами было отдано предпочтение периодическому способу, так как он позволяет вести процесс в асептических условиях.
Получение АСД при культивировании периодическим способом.
Разработку технологии препаратов АСД для винодельческого и спиртового производства начали с шампанских дрожжей раса Харьковская-39, поскольку, с одной стороны, к этим дрожжам предъявляются более высокие требования, такие, как чистота брожения и вкус готового вина, а, с другой стороны, они являются значительно менее термостойкими и осмофильноустойчивыми, чем расы дрожжей для других отраслей виноделия и спиртовые дрожжи.
Была разработана технологическая схема производства сухих винных дрожжей, которая предусматривала следующие стадии:
1) Приготовление посевного материала (3 этапа):
• пересев из пробирки в колбу со 100 мл солодового сусла (СВ=10%);
• рассев содержимого колбы в 6 таких же колб. со 100 мл. солодового сусла (СВ=10–12%);
• засев инокулятора общим объемом 10 литров (рабочим – 8 литров), оснащенного системой аэрации содержимым из этих 6 колб. Среда культивирования: смесь мелассы и сусла 1:1 – СВ = 12–14%, КН 2РО4 – мг;
(NH4)2SO4 – 15 г;
MgSO4 – 48 мг;
рН довести серной кислотой до 4,2, дрожжевой автолизат – 80 мл;
пеногаситель (Лапрол 3003) – 2 мл.
Длительность каждой из этих 3 лабораторных стадий – 16–18 часов.
Культивирование ведут при температуре 27 °С.
2) После окончания культивирования содержимое инокулятора переносят в дрожжерастильный аппарат общим объемом 360 л с объемом среды 250–280 л концентрацией СВ 10%. Соли азота и фосфора вносятся из расчета содержания азота – 4,9%, фосфора – 3,4%, сульфат аммония – 0,523 кг;
диаммонийфосфат – 0,198 кг. Дополнительно вносят также источники калия – KCl – 0,16 кг, а также микроэлементы, биотин и пантотеновую кислоту. Культивирование проводят в анаэробных условиях в течение 24 часов. Полученную биомассу дрожжей – 3 кг переводят в дрожжерастильный аппарат общим объемом 1200 литров с объемом среды 950 литров с концентрацией СВ 11%. Источники азота и фосфора вносили из расчета содержания азота – 4,2%;
фосфора – 2,9%;
сульфат аммония – 2,685 кг;
диаммонийфосфат – 1,013 кг. Культивирование проводили при очень слабой аэрации 25 м3 воздуха на 1 м3 среды в час в течение 11 часов. При этом ожидается получение 21 кг биомассы дрожжей. Температуру на стадиях ЧК следовало поддерживать на уровне 27 °С.
Товарную стадию предполагалось проводить в дрожжерастильном аппарате общим объемом 6300 литров, в который добавляют мелассу из расчета концентрации СВ=11%, доводят общий объем среды до 4500 литров. При этом рассчитывали получить 120 кг дрожжей. Соли азота и фосфора вносились из расчета содержания в дрожжах азота – 2,2%, фосфора – 0,9% (оптимальные концентрации при получении сухих дрожжей) – диаммонийфосфата – 2,097 кг;
сульфата аммония – 10,676 кг. Дополнительно предполагалось вносить 3,5 кг KCl, микроэлементы, биотин и пантотеновую кислоту. Культивирование предполагалось вести 24 часа, при усиленной аэрации 1 л воздуха / 1 л среды в минуту.
В ходе проведения культивирования выяснилось, что шампанские дрожжи обладают несколько большей удельной скоростью роста, чем это предполагалось.
Так в ЧК-1 она составляла 0,147 против 0,112 расчетных, в ЧК-2 – 0,149 против 0,108 расчетных, и на товарной стадии – 0,133 против 0,108. Известно, что выход дрожжей при такой же технологии составляет около 25%, а выход шампанских дрожжей в наших опытах был в 1,5 раза меньшим, что вероятнее всего объясняется несколько иным обменом веществ у шампанских дрожжей. Далее полученную биомассу сепарировали, промывали водой, фильтровали под вакуумом, гранулировали и отправляли на сушку.
Сушка винных дрожжей.
Анализ данных литературы показал, что наиболее перспективными видами сушки являются лиофильная и сушка в кипящем слое. Однако, оборудование для лиофильной сушки очень дорогое, сложное в эксплуатации: процесс сушки на нем очень длительный и малопроизводительный, поэтому ни один дрожжевой завод не использует лиофильную сушку. В связи с этим, все исследования проводились на сушилке кипящего слоя «Аэроматик» (Германия). Были разработаны несколько режимов сушки, представленные в таблице 4. Полученные данные показывают, что шампанские дрожжи, выращенные периодическим способом, сушку переносят очень тяжело – при этом погибает 70–85% клеток. Наиболее оптимальными при этом были режимы, обозначенные в таблице под номерами 3 и 4.
Таблица Режимы высушивания шампанских дрожжей расы «Харьковская-39»
Время высушивания, Заданная Твход Твыход Влажность, Мертвые мин. температура, t°C W, % клетки, 0-7 56 20-57 26- 7-12 48 57-50 30- 12-17 42 50-43 38-38 8,62 85% 17-22 38 43-39 38- 22-27 36 38-37 37- 0-4 48 25-48 27- 4-8 46 48-46 27- 8-12 42 46-43 27- 12-15 38 43-40 28- 15-20 36 40-36 30-33 7,44 75% 20-25 33 36-32 33- 25-30 30 32-30 32- 30-37 32 30-32 31- 0-4 50 30-50 30- 4-8 46 50-47 30- 8-12 40 47-42 30-35 8,46 70% 12-20 36 42-37 35- 20-35 32 37-32 35- 0-5 50 25-51 27- 5-18 48 51-49 39- 8-12 40 49-42 39-39 7,58 70% 12-20 36 42-37 39- 20-30 32 37-34 32- 0-5 52 23-52 25- 5-8 48 52-50 28-38 8,02 80% 8-12 42 50-44 38- 12-25 36 44-37 38- Испытания полученных препаратов. Исследования, проведенные на аппарате Варбурга и представленные в таблице 5, показали, что, несмотря на довольно высокое количество мертвых клеток, полученные препараты шампанских АСД обладают значительной дыхательной и бродильной активностью.
Таблица 5.
Активости дыхания и брожения шампанских дрожжей расы Харьковская-39, высушенных в различных режимах.
Варианты Бродильная активность Дыхательная активность (мкл СО2) (мкл О2) Вариант-1 31,2 35, Вариант-2 39,6 58, Вариант-3 61,2 69, Вариант-4 70,8 89, Вариант-5 26,4 24, Препарата Seccoferm 23,8 22, Контроль Харьковская -39 90,5 107, Примечание: №№ вариантов соответствуют №№ режимов сушки Шампанизация вина в бутылках показала, что все опытные препараты сухих дрожжей даже превосходят по сбраживающей способности и сухие дрожжи Seccoferm производства Дании, и дрожжевую разводку, о чем свидетельствует более высокое содержание спирта (в среднем на 0,3–0,4%), и повышенное давление СО2 в шампанском, полученном с использованием наших препаратов.
Интересно, что количество физиологически активных клеток в опытных вариантах в конце шампанизации было несколько выше, чем в контроле – несмотря на то, что первоначальное количество живых клеток в них было намного меньше.
Общее содержание альдегидов в опытных вариантах было несколько выше, чем в контроле, что свидетельствует об их большей окисленности. Несколько снижалась в опытных вариантах титруемая кислотность, и увеличивалось содержание общей SO2. По результатам дегустации лучшим был признан опытный вариант №4, полученный с использованием дрожжей, высушенных по режиму №4. Учитывая также и то, что шампанское, полученное с этими дрожжами, имело и ряд других положительных характеристик – высокое содержание спирта, давление углекислоты, количество жизнеспособных клеток и низкое содержание альдегидов – нами рекомендуется использовать для сушки шампанских дрожжей режим №4.
Однако, несмотря на хорошие технологические показатели полученных АСД, высокий % мертвых клеток в них следует считать недопустимым. Это показывает, что культивирование винных дрожжей периодическим способом не дает возможности подготовить их к сушке и поэтому не может быть использовано для получения качественных АСВД. В связи с этим было решено культивировать винные и спиртовые дрожжи приточным способом.
Получение шампанских, винных и спиртовых АСД приточным способом культивирования.
Режим приточного культивирования (его товарная стадия) был отработан на установке ФК-20. Работу проводили с расами шампанских дрожжей Харьковская 39 и Корнет;
винных дрожжей Кокур-3 и Вишня-18;
спиртовых дрожжей 985-Т.
Поскольку какие-либо сведения по приточному культивированию винных или спиртовых дрожжей в литературе отсутствуют, то режим внесения мелассы был разработан нами эмпирически в расчете на удельную скорость роста 0,090. Было также предложено поднимать в конце культивирования рН среды с 4,2 до 5,8-6, для стимуляции синтеза трегалозы. Кроме того, был исследован температурный режим выращивания дрожжей. При этом сравнивались два режима: первый предусматривал выращивание дрожжей при оптимальной температуре и подъем температуры за 2 часа до окончания культивирования до 34–35 °С. Другой режим культивирования предусматривал более высокую температуру 32-340С для всех рас дрожжей и поднятие её до 350С в конце культивирования. Спиртовые дрожжи культивировали только при t=330С с дальнейшим подъемом до 36-380С.
Выход дрожжей Харьковская 39 и Корнет снижался при повышении температуры до 65,5% по сравнению с 72,2% при их оптимальной температуре роста, дрожжи Кокур-3 до 60% по сравнении 69,37% соответственно;
Вишня-18 до 60% по сравнению с 69,37% при оптимальных температурах культивирования.
Далее проводили сушку дрожжей по режиму 4, подобранному для сушки дрожжей, культивированных периодическим способом. Результаты свидетельствуют о том, что культивирование дрожжей приточным способом обеспечивает значительно большую выживаемость их при сушке, особенно при культивировании их при повышенных температурах, где выживаемость дрожжей при сушке была на 19,3-24,7% выше, чем при культивировании при температуре, оптимальной для роста.