Бактериальные сообщества городских почв
На правах рукописи
Лысак Людмила Вячеславовна
Бактериальные сообщества городских почв
Специальность 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва 2010
Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского
государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Звягинцев Дмитрий Григорьевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Карпачевский Лев Оскарович доктор биологических наук Ананьева Надежда Дмитриевна доктор биологических наук Васильева Лина Васильевна Ведущее учреждение: Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева
Защита состоится 2010 г. в 15 часов 30 мин. в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строение 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультете почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 2010 г.
Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по вышеуказанному адресу.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор Г.М. Зенова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Интенсивная и разносторонняя деятельность человека в пределах крупных городов приводит к существенному и часто необратимому изменению окружающей природной среды. Современные города – это особые экосистемы, которые весьма отличаются от природных зональных биогеоценозов по климатическим, физико химическим свойствам почв и атмосферы, высокому уровню загрязнения внешней среды (Почва, город, экология, 1997). В настоящее время темпы урбанизации неуклонно растут, и к концу XXI века ожидается вовлечение в этот процесс до 20% всей пригодной для жизни человека территории суши (Современные глобальные изменения природной среды, 2006).
Городская почва – сложный объект, располагающийся на стыке природных и городских систем. Именно здесь происходит наложение антропогенных процессов на естественные процессы почвообразования (Экологические функции городских почв, 2004). Это неминуемо должно сказаться на структуре и функционировании микробных сообществ городских почв. До недавнего времени почвы городских территорий в определенной степени игнорировались почвоведами, и только в последнее десятилетие интерес к этому объекту усилился, что привело к увеличению числа публикаций, посвященных этой важной проблеме (Почва, город, экология, 1997;
Экологические функции городских почв, 2004;
SUITMA-2007;
SUITMA-2009).
Почвенные микробиологи изучали, главным образом, лесные почвы и почвы, находящиеся в сельскохозяйственном использовании. Почвы же городских территорий до последнего времени изучались микробиологами преимущественно с точки зрения выявления патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов.
Только с появлением представлений о функциональной роли почв и почвенной биоты в биосфере (Добровольский и др., 2003) и пониманием роли микроорганизмов в биогеоценотических функциях почв (Звягинцев и др., 1999) интерес к микроорганизмам городских почвах усилился (Почва, город, экология, 1997;
Артамонова, 2002;
Приваленко, Безуглова, 2003;
Марфенина, 2005).
Долгое время изучение бактериального населения почв, как природных ненарушенных, так и антропогенно измененных, развивалось, в основном, в направлениях, связанных с определением численности физиологических групп бактерий и изучением распространения легко различаемых по морфолого таксономическому принципу групп бактерий. Только на рубеже XXI века на кафедре биологии почв были сформулированы подходы к изучению структурно функциональной организации микробных (в том числе бактериальных) сообществ почвы, базирующиеся на изучении таксономической структуры модельной группы организмов (для бактерий – это сапротрофный блок прокариот). Были выработаны также синэкологические критерии для характеристики этой группы (Звягинцев, Добровольская, Чернов, 1997;
Экология на рубеже XXI века, 1999;
Добровольская, 2002).
Следует отметить, что для оценки характера антропогенных воздействий на почвенные бактериальные сообщества требуется огромный статистический материал, необходимы многолетние исследования, которые проводились бы сходными методами, обеспечивая сравнимость результатов. Это возможно лишь при достаточно стабильных представлениях о таксономии бактерий. Однако в последнее десятилетие в ней произошли революционные изменения, связанные с бурным развитием молекулярно-генетических методов. «Классическая» систематика, базирующаяся в основном на фенотипических признаках, стала рассматриваться как устаревшая, что нарушило преемственность в изучении таксономической структуры микробных сообществ. Внимание микробиологов в последнее десятилетие переключается в основном на ревизию таксономической системы в свете новой методологии, разработку молекулярно-генетических методов идентификации микроорганизмов in situ (Amann et al., 1993;
Ward et al., 1995;
Chandler et al., 1997) и попытки непосредственного измерения микробного разнообразия без процедуры видовой идентификации (Dilly et. al., 2004;
Winding et. al., 2005). Молекулярно биологическим подходам сулят интересные перспективы, однако вряд ли они могут стать абсолютной альтернативой классическим методам учета микроорганизмов с помощью выделения чистых культур, что позволяет охарактеризовать их участие в процессах, протекающих в почве (Головлев, 1998;
Добровольская и др., 2001;
2009).
Увлечение новыми технологиями породило среди микробиологов скептическое отношение к традиционным методам исследования, в первую очередь методу посева. В то же время, использование молекулярно-биологических методов для изучения микробных сообществ – это не столько решение проблем микробной экологии, сколько подмена объекта исследования, при которой возникают еще большие практические и методические сложности, чем при проведении исследований методом посева (Добровольская, 2003).
Для оценки относительного обилия видов (таксонов) внутри достаточно однородных групп микроорганизмов наиболее простым и удобным остается метод посева на простые питательные среды с последующим дифференцирующим учетом колоний и характеристикой структуры сообщества с использованием синэкологических характеристик.
В последнее время такой подход был успешно использован для количественного описания сообщества почвенных грибов (Марфенина, 1999), дрожжей (Чернов и др., 1997), группы сапротрофных бактерий в ненарушенных природных биоценозах (Добровольская и др., 2002;
2009).
Как уже ранее было отмечено, характерной особенностью городских почв является их значительное загрязнение тяжелыми металлами, нефтепродуктами, ксенобиотиками и прочими загрязнителями. В свете этого особого внимания заслуживает проблема изучения механизма сохранения бактериями жизнеспособности в загрязненных почвах. При помощи электронно-микроскопических и молекулярно биологических методов исследования в природных средах были обнаружены бактерии, характеризующихся очень малыми размерами и высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды – ультрамикробактерии, или наноформы бактерий (Дмитриев и др., 2004;
Panikov, 2005). Однако, еще в прошлом веке, известные почвенные микробиологи Д.М. Новогрудский (1933) и Н.А. Красильников (1954) предполагали, что значительная часть автохтонных почвенных бактерий характеризуются очень мелкими размерами, что и определяет их высокую устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды. Это позволяет предположить, что в сильно загрязненных городских почвах может действовать именно такой механизм сохранения бактериями жизнеспособности, что требует экспериментальных исследований.
Таким образом, изучение бактериальных сообществ городских почв представляется достаточно актуальным как с точки зрения получения представлений о составе бактериальных сообществ, что позволяет охарактеризовать их участие в экологических функциях городских почв, так и с точки зрения индикации различных городских загрязнений, что имеет важное практическое значение. Изучение механизмов сохранения бактериями жизнеспособности в загрязненных городских почвах позволит расширить наши представления о возможностях сохранения прокариотами жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды и, как следствие, о выполнении почвой важной экологической функции – «банка организмов».
В соответствии со всем вышесказанным целью нашей работы было изучение структуры бактериальных сообществ городских почв в условиях различных типов загрязнения и выявление механизмов сохранения бактериями жизнеспособности в загрязненных почвах.
Задачи исследования:
1. Изучение организации бактериальных сообществ почв в ненарушенных лесных биогеоценозах Европейской части России.
2. Исследование изменений бактериальных сообществ почв и сопряженных субстратов в результате антропогенных воздействий на почвы Московского региона.
3. Изучение бактериальных сообществ окультуренных почв городских Ботанических садов и огородов на территории монастырей («Нилова пустынь», Соловецкий монастырь).
4. Оценка влияния некоторых антропогенных факторов на почвенные бактериальные сообщества (модельные опыты).
5. Изучение численности, физиологического состояния и таксономического состава наноформ бактерий в природных и антропогенно нарушенных почвах.
Научная новизна На основе количественных синэкологических критериев изучена структура бактериальных сообществ городских почв. Показано, что под влиянием антропогенных воздействий в городских почвах, загрязненных нефтью, полихлорбифенилами, цементной пылью и хозяйственно-бытовыми отходами наблюдаются разноплановые трансформации бактериальных сообществ, выражающиеся в упрощении структуры бактериальных комплексов и доминировании резистентных форм, устойчивых к разным типам загрязнений.
При загрязнении нефтью и полихлорбифенилами доминируют бактерии рода Rhodococcus, при хозяйственно-бытовом загрязнении - представители семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella), при загрязнении цементной пылью и строительным мусором – представители рода Arthrobacter.
Впервые выявлена тенденция к накоплению потенциально патогенных (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Alcaligenes) и аллергенных бактерий (роды Rhodococcus, Micrococcus) в городских загрязненных почвах, что свидетельствует о нарушении экологической функции почвы как «бактериального фильтра», и представляет опасность для человека.
Впервые показано, что в антропогенно измененных почвах, возникших в условиях длительной земледельческой практики, формируются специфические бактериальные комплексы, характеризующиеся иным профильным распределением бактерий и появлением видов, свойственных более южным регионам.
Впервые предложен метод окраски бактерий в почве люминесцентным красителем LIVE/DEAD (L7012), позволяющий охарактеризовать физиологическое состояние бактерий в природных и загрязненных почвах. Из исследованных факторов максимальное негативное действие на бактерии (повреждение клеточной мембраны) оказывает многократное замораживание и оттаивание почвы, слабее действует на клетки кратковременная обработка 1 н HCl и 1н NaOH.
Впервые для выделения из почвы и характеристики физиологического состояния наноформ бактерий предложен комплексный метод фильтрации, центрифугирования и окраски красителем LIVE/DEAD (L7012). Впервые определена численность, охарактеризовано физиологическое состояние и таксономический состав наноформ бактерий на уровне филотипов в природных почвах и городских почвах, загрязненных нефтью и тяжелыми металлами.
Показано, что численность и доля наноформ бактерий в городских загрязненных почвах выше, чем в природных незагрязненных почвах. Установлено, что среди клеток более крупного размера доля клеток с ненарушенной мембраной ниже ( - 70%), чем среди наноформ бактерий (95-98%), что свидетельствует о высокой жизнеспособности наноформ. Высказывается предположение о способности бактерий к переходу в состояние наноформ как возможном механизме сохранения жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды.
Практическая значимость работы Разработаны подходы для оценки реакции почвенных бактериальных сообществ на антропогенные воздействия, что позволило охарактеризовать бактериальные сообщества городских почв. Выявлены резистентные к некоторым антропогенным воздействиям таксономические группы бактерий, которые могут быть использованы в целях индикации загрязнения почвы нефтью и полихлорбифенилами – некоторые виды рода Rhodococcus, комплексного хозяйственно-бытового загрязнения – представители семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella).
Выявлены группы потенциально патогенных (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella) и аллергенных бактерий (род Rhodococcus,Micrococcus), наиболее часто встречающиеся в загрязненных почвах городских экосистем.
Установлены местообитания (верхний горизонт почвы, опад), где эти бактерии накапливаются.
Разработан метод определения показателей численности и физиологического состояния бактерий в природных и антропогенно нарушенных почвах при помощи двухкомпонентного люминесцентного красителя LIVE/DEAD (L7012), позволяющий оценить состояние клеточной мембраны бактерий после антропогенных воздействий.
Для выделения из почвы и характеристики физиологического состояния наноформ бактерий предложен комплексный метод фильтрации, центрифугирования и окраски люминесцентным красителем LIVE/DEAD (L7012) с последующим просмотром под люминесцентным и электронным микроскопом.
Предложены качественные и количественные показатели для оценки экологического состояния бактериальных сообществ городских почв, вошедшие в систему показателей оценки экологического состояния городских почв и стоимостной оценки земель («Методические рекомендации по оценке экологического состояния городских почв», 2001).
Результаты проведенных исследований включены в учебные пособия «Методы выделения и идентификации почвенных бактерий» (1989), «Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий» (2003) и использованы в лекционных курсах по почвенной бактериологии, экологии почвенных бактерий, биохимии почвенных микроорганизмов, экологической биохимии, читаемых на факультете Почвоведения МГУ.
Проведение исследований было поддержано грантами РФФИ (проекты 96-04-49264, 99-04-48973, 00-15-97886, 00-04-48029, 03-04-48620, 08-04-90201), Грантами Президента РФ для поддержки Ведущих научных школ (НШ 1518.2003.4, НШ-8797.2006.4, НШ-2227.2008.4), ФЦНТП «Биологическое разнообразие», «Биотехнология в охране окружающей среды», «Наноструктуры почв и их роль в функционировании биокосных систем» (ГК 02.740.11.0283).
Основные защищаемые положения диссертации 1. Под действием антропогенных факторов происходят значительные изменения в бактериальных сообществах почв, проявляющиеся в изменении показателей общей численности и физиологического состояния бактерий, таксономической структуры бактериальных комплексов, появлении бактериальных таксонов, не свойственных природным ненарушенным почвам.
2. Почвы, сформированные в условиях длительной земледельческой практики (ботанические сады, монастырские огороды) характеризуются высокой численностью и иным профильным распределением бактерий по сравнению с фоновыми почвами. Структура сапротрофного бактериального комплекса проявляет черты сходства с бактериальными комплексами более южных регионов.
3. В сильно загрязненных городских почвах по сравнению с фоновыми почвами существенно изменены микробные сообщества. Они характеризующиеся снижением доли физиологически активных клеток бактерий и отличаются от сообществ ненарушенных зональных почв соотношением таксонов и спектром потенциальных доминантов. При загрязнении нефтью и полихлорбифенилами потенциальными доминантами становятся родококки (род Rhodococcus), комплексном хозяйственно-бытовом загрязнении – энтеробактерии (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella), при загрязнении цементной пылью – род Arthrobacter.
4. В городских сильно загрязненных почвах прослеживается тенденция накопления опасных для человека бактерий – потенциально патогенных (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Alcaligenes) и аллергенных (род Rhodococcus, Micrococcus).
5. Численность наноформ бактерий и их доля в городских почвах, загрязненных нефтью и тяжелыми металлами выше, чем в природных ненарушенных почвах, что свидетельствует о способности бактерий к переходу в состояние наноформ, как возможном механизме сохранения жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены на VI (Рига,1980), VII (Алма-Ата,1985) съездах Всесоюзного микробиологического общества, VI (Тбилиси,1981) съезде Всесоюзного общества почвоведов, II (Санкт Петербург,1996), III (Суздаль,2000) и IV (Новосибирск,2004), V (Ростов-на-Дону, 2008) съездах Докучаевского общества почвоведов, Всесоюзном симпозиуме «Микроорганизмы как компонент биогеоценоза» (Алма-Ата, 1982), III Всесоюзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Москва, 1986), III Всесоюзном симпозиуме «Биодинамика почв» (Таллинн,1988), III (Москва, 1994) и IV (Санкт-Петербург,1998) Международном аэрозольном симпозиуме, Всесоюзной конференции «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду» (Москва,1994), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт Петербург, 1998), Международном симпозиуме «Функции почв в биосферно геосферных системах» (Москва,2001), Всероссийской конференции «Перспективы развития почвенной биологии» (Москва, 2001), Международной конференции «Биогеография почв» (Сыктывкар, 2002), Всероссийской конференции «Биосферные функции почвенного покрова» (Пущино, 2005), II Международной научно практической конференции «Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно преобразованных экосистем (Иркутск, 2006), Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва,2006), II Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2007), International conference “Structure and function of soil organisms communities” (Ceske Budejovice,1990), Biogeomon Workshop of integrated monitoring in small catchments (Prague,1993), International Symposium of Actinomycetes (Moscow,1994), International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Prague,1994), на заседании кафедры биологии почв (2010).
Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом многолетних (1975-2010 гг.) исследований автора. Автор принимал личное участие на всех этапах исследования, ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Автор принимал личное участие в сборе образцов, получении значительной части лабораторного материала, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке основного числа научных публикаций, многократно выступал с научными докладами. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 99 работ, в том числе 6 глав в монографях, 3 научных и учебных методических пособий, 45 работ в изданиях, соответствующих списку ВАК, 14 статей в научных журналах и сборниках.
Опубликовано 31 тезисов докладов на Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, изложена на 350 страницах компьютерного текста, включает список литературы из 400 наименований, в том числе 250 на иностранных языках, рисунков, 20 таблиц и приложения.
Благодарности. Автор благодарен своим учителям, коллегам и друзьям: Т.Г.
Добровольской, Г.М. Зеновой, П.А. Кожевину, А.В. Куракову, Е.В. Лапыгиной, О.Е.
Марфениной, Л.М. Полянской, Т.В. Прокофьевой, В.С. Соиной, М.Н. Строгановой, М.М. Умарову, И.С. Урусевской, И.Ю. Чернову за поддержку идей, консультации, дискуссии, помощь при выполнении отдельных разделов экспериментальной работы, а также аспирантам и студентам, принимавшим участие в проведении экспериментов:
Н.Н. Сидоренко, Н.А. Семионовой, А.В. Раппопорту, М.А. Постниковой, М.И. Волде, И.А. Коновой, Т.Ф. Вустиной, Е.А. Бакулиной, Е.С. Ударовой, Н.Н. Студеникиной, А.С. Мясоедову, С.А. Ваниной, М.Ю. Гудиме, Е.М. Киселевой. Отдельная благодарность всем сотрудникам кафедры биологии почв за теплую обстановку и доброжелательность. Автор выражает глубокую признательность и благодарность проф. Д.Г. Звягинцеву за постоянное внимание, активную поддержку, критические замечания и советы, оказавшие решающее влияние на формирование научного мировоззрения автора.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Сформулированы общие представления о структурной и функциональной организации микробных сообществ наземных экосистем, современных методах оценки бактериального разнообразия бактериальных сообществ почв.
Охарактеризовано влияние основных экологических факторов, влияющих на разнообразие микробных сообществ городских почв. Проанализированы известные механизмы сохранения жизнеспособности бактериальных клеток при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды.
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили образцы почв, отобранные в лесных природных экосистемах России, городских экосистемах Московского региона и некоторых агроэкосистемах.
Исследовались городские загрязненные почвы на территории мегаполиса (г.
Москва), среднего промышленного центра (г. Серпухов) и малого города (наукоград Пущино-на-Оке), а также окультуренные почвы на территории Ботанических садов мегаполиса (г. Москва) и древних монастырей («Нилова пустынь», «Соловецкий монастырь»). Работы проводились с 1975 по 2009 гг. Характер антропогенных воздействий, тип почв и районы исследования подробно представлены в тексте диссертации. Отбор проб из контрольных и антропогенно преобразованных почв проводили преимущественно в конце весны (май), летом (июль) и начале осени (сентябрь-октябрь) в виде индивидуальных образцов (3-5 в каждом варианте) верхнего горизонта почв. В некоторых сериях пробы анализировали в течение всего вегетационного сезона в течение нескольких лет. В ряде экспериментов проводили анализ подстилок, листьев растений, проб приземных слоев воздуха и снега. Общее число проанализированных образцов около 1000.
Показатели общей численности бактерий определяли прямым микроскопическим методом при помощи люминесцентной микроскопии с использованием следующих красителей: акридина оранжевого, флуоресцеин диацетата (ФДА) и красителя LIVE/DEAD (L7012).
Учет численности бактериальных клеток проводили с использованием люминесцентного микроскопа “Axioskop 2+ ” (объектив х100, масляная иммерсия).
Детальное изложение методик представлено в тексте диссертационной работы.
Определение численности и физиологического состояния бактерий в почве проводили при помощи двухкомпонентного люминесцентного красителя LIVE/DEAD L7012 (BacLight Bacterial Viability Kits), который позволяет различать клетки с неповрежденной мембраной («живые» - светятся зеленым) и поврежденной мембраной («мертвые» - светятся красным). Подробная методика приведена в тексте диссертации. Расчет количества бактериальных клеток производился по общепринятой формуле, подсчитывали также долю клеток с неповрежденной клеточной мембраной.
Характеристику таксономического состава и структуры сапротрофного бактериального комплекса проводили на основании критериев, разработанных на кафедре биологии почв (Добровольская, 2002), используемых при проведении сравнительных почвенно-экологических исследований. Посев почвенных образцов проводили на глюкозо-пептонно-дрожжевую среду (ГПД), которая позволяет выделить до 50 родов сапротрофных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий (Добровольская и др., 2003). Идентификацию выделенных культур бактерий до рода проводили на основании изучения микроморфологических, культуральных, физиоло-биохимических и некоторых хемотаксономических (для коринеформ) признаков, руководствуясь общепринятыми определителями: «Bergey’s manual of systematic bacteriology», «The Prokaryotes» и ключом для идентификации почвенных бактерий (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991), а также оригинальными работами (Смирнов, Киприанова, 1990;
Нестеренко и др., 1988).
В модельных опытах изучали также влияние на бактерии в почве и лабораторную смесь бактерий 1н HCI и 1н NaOH. Навеску почвы массой 1 г помещали в 100 мл раствора и выдерживали в течение суток в холодильнике при 10°С. В качестве контроля использовали навеску почвы, помещенную стерильную водопроводную воду.
Лабораторную смесь бактерий получали путем смыва стерильной водопроводной водой колоний, выраставших на чашках Петри после посева почвенной суспензии на (ГПД). Время экспозиции бактериальных смесей с 1н NaOH и 1н HCl - 1 сутки.
Выделения наноформ бактерий из почвы проводили по следующей методике:
1 г почвы помещали в 100 мл стерильной водопроводной воды и обрабатывали ультразвуком (УЗДН-1, 22кГц, 0,44А, 2 мин). Суспензию центрифугировали при 1000 об./мин 10 мин. Для выделения наноформ надосадочную жидкость пропускали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. (“Sarstedt”, “Millipore”). В фильтрате определяли численность и физиологическое состояние клеток бактерий при помощи красителя LIVE/DEAD (L7012).
Разнообразие и численность отдельных филогенетических групп прокариотов в некоторых почвах оценивали также при помощи метода FISH (fluorescence in situ hibridisation). Детальное описание метода приведено в тексте работы.
Наноформы бактерий изучали при помощи просвечивающей (ПЭМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Детальное описание методик приведено в тексте работы.
Достоверность и обоснованность результатов подтверждены проведенной статистической обработкой экспериментальных данных с применением компьютерных программ Statgraphs и Statistica.
Глава 3. ВЕРТИКАЛЬНО-ЯРУСНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ В НЕНАРУШЕННЫХ ПРИРОДНЫХ ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ В результате исследований, проведенных нами на территории заповедников лесной зоны России, были сформулированы основные закономерности распределения численности и таксономического разнообразия бактерий сапротрофного блока в ненарушенных лесных экосистемах (1,5,9,19,24,31,33,39).
В лесных экосистемах при Табл. 1. Распределение прокариот по ярусам лесных биогеоценозов переходе от надземного яруса (численность, млн. КОЕ/г) (филлоплана растений) к наземному Ярус Горизонт Бактерии (подстилка) наблюдается резкое Надземный 0.1 – 2. увеличение численности бактерий (филлоплана) сапротрофного блока (табл. 1), оно Наземный 01 (L) 50 – (подстилка) 02+03 (F+H) 1 – может измеряться 2-3 порядками, здесь же наблюдаются и наибольшие A1 0.5 – 1. Почвенный A2 0.1 – 0. сезонные колебания численности бактерий. Самые высокие показатели соответствуют влажным и часто холодным периодам (весна, осень, зима) и приходятся большей частью на верхний слой подстилки (рис. 1). При переходе к почвенному ярусу наблюдается снижение плотности популяций бактерий, причем численность может падать на 1-2 порядка.
Распределение бактерий в N пределах почвенного профиля имеет общий характер, состоящий в снижении плотности популяций по мере перехода от верхнего к нижним горизонтам.
Так, в подстилке численность бактерий максимальна, в горизонте А1 ниже на 1- Рис. 1. Сезонная динамика численности бактерий порядка, и еще на порядок ниже (N, КОЕ/г) по методу посева в подстилке ельника волосисто-осокового (Чашниково, Моск. обл.): 1 – в минеральных горизонтах 01 (L), 2 – 02+03 (F+H) (16,19,24,33).
В надземном ярусе лесов бактерии обнаруживаются на поверхности листьев и трав, коре и шишках, цветках и плодах, почках и семенах (табл. 2). Большинство обитателей филлопланы использует прижизненные выделения растений и относится к классу протеобактерий, они же доминируют в подстилке, особенно в верхнем ее слое L, куда попадают с опадом. Набор таксонов, входящих в класс протеобактерий, в верхнем слое подстилки тот же, что и в филлоплане. В нижних слоях подстилки (F+H) появляются спорообразующие бактерии, цитофаги и миксобактерии, увеличивается доля целлюломонад. Все они принадлежат к функциональной группе гидролитиков, а по Табл. 2. Доминирующие роды бактерий в разных ярусах лесного биогеоценоза.
Функционально Горизонт, субстрат Род трофическая группа Кора ели, хвоя Pseudomonas Эккрисотрофы, копиотрофы Листья деревьев Flavobacterium, Micrococcus, и кустарников Rhodococcus Травы, злаки, осоки Erwinia, Methylobacterium, Clavibacter Curtobacterium О1 (L) Cellulomonas, Cytophaga, пор. Myxoсоссales, Подстилочные сапротрофы Bacillus O2+O (F+H) Streptomyces, Rhodococcus, Cellulomonas, Гидролитики пор. Myxoсоссales Педобионты-сапртрофы A1 Streptomyces Гидролитики Bacillus, Nocardia, Rhodococcus Группа почкующихся и стебельковых Олиготрофы олиготрофных бактерий типу экологической стратегии являются L- и К- стратегами. Хотя основную функцию деструкции растительных остатков в лесных биогеоценозах выполняют грибы, однако нахождение бактерий в значительных количествах там, где идет активная переработка растительного опада, позволяет говорить об активном участии бактерий в этом процессе. Здесь обитают копиотрофы, гидролитики и олиготрофы, представленные разными родами бактерий (1,4,33,25,31) (рис. 2).
При переходе от наземного к почвенному ярусу уменьшается не только численность бактерий, но и их таксономическое разнообразие. В сапротрофном комплексе присутствуют, главным образом, стрептомицеты, родококки, бациллы, появляются нокардии и каулобактер. Типичными представителями почвенного яруса являются такие олиготрофы, как Pedomicrobium, Metallogenium, Seliberia, Gallionella (Аристовская,1980) и простекобактерии (Васильева, 1990). К этой же экологической группировке относятся и представители коринеподобных бактерий – роды Arthrobacter и Rhodococcus. Однако представители рода Arthrobacter – типичного обитателя большинства дерново-подзолистых почв – не обнаруживаются в кислых подзолистых почвах (11,12,60,74,75,76). Своеобразной особенностью типичных педобионтов – представителей родов Arthrobacter и Rhodococcus является ярко выраженная способность к синтезу внеклеточных кислых полисахаридов (17,21,22).
Влажность почвы в значительной степени Рис. 2. Распределение доминирующих родов бактерий (%) определяет сезонные по ярусам лесного биогеоценоза. Ярусы, горизонты: 1 изменения в таксономическом растения, 2 – L, 3 – F+H, 4 – Al, 5 – A2, 6 – B;
роды: а – Pseudomonas;
б – Flavobacterium;
в – Erwinia;
г – составе бактериальных Methylobacterium;
д – Actinobacteria;
е – пор.
комплексов, расположенных в Myxococcales;
ж – Cytophaga;
з – Bacillus.
Сумма всех представленных родов в каждом из ярусов пределах одной природно- составляет 100%.
климатической зоны. На примере почв Окского биосферного заповедника показано, что в периоды длительного переувлажнения в почве доминируют типичные представители водной фазы почвы (гидробионты), представленные спириллами и другими формами подвижных грамотрицательных бактерий (31). При иссушении почв доминантами становятся бактерии актиномицетной линии (15). Из высушенной в лаборатории дерново-подзолистой почвы удалось выделить и описать новые виды малоизученного рода коринеподобных бактерий – Agromyces (20,59,80).
Температура определяет лишь интенсивность и скорость биологических процессов. На примере коринеподобных бактерий родов Arthrobacter и Rhodococcus показано, что многие представители этих родов способны к росту при низких температурах за счет механизма увеличения скорости синтеза РНК (и ферментных белков соответственно) при низких (100-120) температурах роста. У штаммов артробактерий и родококков, выделенных их южных почв, максимальная для роста температуры составляла 40-450, что на 5-100 выше, чем у штаммов, выделенных из тундровых почв – 30-350 (10, 11, 13,14,57,58,71,72,73).
Характеристика бактериального разнообразия на видовом уровне осложнена трудностями, связанными с видовой идентификации бактерий, упрощается лишь у тех групп бактерий, где первоначальное деление на группы возможно на основании сочетаний простых признаков (цвет и морфология колоний, некоторые особенности цикла развития бактерии). На видовом уровне охарактеризовано сообщество коринеподобных бактерий ненарушенной дерново-подзолистой почвы (табл. 3).
Максимальное разнообразие бактерий этой группы обнаружено в лесной подстилке, где происходит интенсивное разложение растительного материала. К этому ярусу приурочены представители 4 родов коринеподобных бактерий: Rhodococcus, Cellulomonas, Promicromonospora, Micrococcus. В горизонте А1 обнаруживаются три вида артробактерий, один вид родококков и представители родов Cellulomonas и Agromyces. В горизонтах А2 и В коринеподобные бактерии представлены двумя видами рода Arthrobacter.
Табл. 3. Распределение некоторых видов коринеподобных бактерий по профилю ненарушенной дерново-подзолистой почвы Горизонт Виды 01 (L) Rhodococcus luteus, R. erythropolis, R. longus, Cellulomonas sp., Promicromonospora citrea, Micrococcus roseus R. erythropolis, R. longus, Cellulomonas sp., 02+03 (F+H) Promicromonospora citrea A1 R. erythropolis, Arthrobacter globiformis, A. pascens, A. aurescens, Cellulomonas sp., Agromyces sp.
A2 Arthrobacter globiformis, A. pascens B1 Arthrobacter globiformis Разнообразие таксономических, экологических и трофических группировок бактерий в основных ярусах лесного биогеоценоза обеспечивает осуществление ими самых разнообразных функций и делает лесной биогеоценоз неисчерпаемым «банком» бактерий, которые могут быть использованы в целях биотехнологии (23.27,43,59,60,74,82).
Итак, по вертикальной структуре лесного биогеоценоза меняется как таксономическая структура бактериального комплекса, так и принадлежность к определенным трофическим группировкам и типам экологических стратегий. Смена таксономического состава бактерий происходит путем последовательного замещения одних таксономических группировок другими с сохранением некоторых таксонов, характерных для вышележащих горизонтов. Смена трофических группировок бактерий по вертикали отражает сукцессионные изменения при разложении растительных остатков.
Глава 4. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СООБЩЕСТВА ПОЧВ БОТАНИЧЕСКИХ САДОВ И ОГОРОДОВ ДРЕВНИХ МОНАСТЫРЕЙ Особое положение среди антропогенно преобразованных почв занимают почвы ботанических садов, находящиеся на городских территориях, а также почвы огородов древних монастырей. Спецификой их является то, что на протяжении многих лет они подвергаются специальному уходу, направленному на повышение плодородия почв, и в меньшей степени, чем прочие городские почвы, испытывают загрязнение нефтепродуктами и тяжелыми металлами. Известна также история проводимых агротехнических мероприятий: внесение удобрений, перемещение горизонтов, насыпка на поверхность исходной почвы плодородных слоев. Значительный интерес поэтому представляет изучение бактериальных сообществ таких почв и сравнение их с фоновыми ненарушенными почвами той же природной зоны.
Исследования проводились на территории Ботанического сада МГУ (Ленинские горы), филиала Ботанического сада МГУ «Аптекарский огород»
(проспект Мира), Ботанического сада РАН (Останкино), Ботанического сада Соловецкого монастыря, огородов монастыря «Нилова пустынь». По современной классификации исследованные почвы отнесены к агростратоземам, рекреаземам и культуроземам (Классификация почв России, 1997, 2000;
Строганова и др.,1997, Урусевская и др., 2001).
Особый интерес к окультуренным почвам на территории монастырей («Нилова пустынь», Соловецкий монастырь), вызывается также тем, что на этих северных территориях удается получать высокие урожаи культурных растений и выращивать растения, не растущие обычно в таком суровом климате.
Изучение бактериальных сообществ основных генетических горизонтов агростратозема на территории Соловецкого монастыря показало, что общая численность бактерий мало изменялась по профилю и колебалась от 4 до 6 млрд. в 1 г почвы в исследованных горизонтах (рис. 3). Максимальные показатели численности бактерий были зафиксированы в горизонте Р1 агростратозема – 6x клеток в 1 г почвы. Численность бактерий в образцах контрольной почвы (альфегумусового подзола) была примерно такой же, однако при этом наблюдалось довольно резкое уменьшение численности вниз по профилю. В целом для исследованных почв было характерно иное изменение общей численности бактерий, чем в фоновой почве, что проявлялось в менее резком убывании численности бактерий по профилю и более высоком содержании их в нижних горизонтах по сравнению с целинными аналогами (37,42,46,90,91).
2 4 6 8N Близкие закономерности были Рис. 3. Численность бактерий (N, млрд. /г) получены и при изучении распределения в исследованных почвах по горизонтам (данные прямой микроскопии) численности сапротрофных бактерий, выраставших на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде (рис. 4). Численность бактерий уменьшалась вниз по профилю окультуренных почв не столь резко, как в фоновых почвах, что связано с высоким содержанием в преобразованных горизонтах гумуса и менее кислой реакцией среды.
Бактериальные комплексы исследованных горизонтов окультуренных почв отличались от фоновых почв большим родовым разнообразием коринеподобных бактерий и высоким относительным lg N обилием рода Arthrobacter (табл.4).
2 4 6 8 Это сближает их с хорошо удобренными дерново-подзолистыми почвами и черноземами (42,37,18).
Из древне-окультуренных почв Соловецкого монастыря постоянно и lg N в значительных количествах 2 4 6 выделялись представители разных Рис. 4. Численность сапротрофных бактерий (N, КОЕ/г) в исследованных видов рода Arthrobacter, в том числе почвах Arthrobacter atrocyaneus, ранее часто выделявшийся нами из окультуренной дерново луговой почвы и чернозема, но никогда не выделявшийся из природных ненарушенных почв таежно-лесной зоны (18).
Табл. 4. Структура сапротрофного бактериального комплекса Al-Fe-гумусового подзола и агростратозема Почва Гори- Доминанты Субдоминанты Группа среднего зонт обилия Al-Fe- О Proteobacteria Bacillus Myxococcus гумусовый Streptomyces Подзол E Bacillus Proteobacteria Myxococcus Bh Bacillus Myxococcus Aquaspirillum BC Bacillus Aquaspirillum Myxococcus Агростратозем P1 Arthrobacter Bacillus, Cytophaga Myxococcus P2 Arthrobacter Bacillus Cytophaga, Myxococcus P3 Arthrobacter Bacillus Cytophaga, Myxococcus Исследование бактериальных сообществ методом МСТ, также свидетельствуют о значительных отличиях окультуренных почв от природных зональных почв, той же природной зоны (рис. 5) (42,66,92).
Изучение бактериальных комплексов основных генетических горизонтов культурозема и рекреазема не территории Филиала Рис. 5. Дендрограмма сходства (квадрат Евклидова Ботанического сада МГУ «Аптекарский огород»
расстояния по методу Уорда) позволило выявить их отличия от ненарушенных бактериальных комплексов горизонтов альфегумусового дерново-подзолистых почв той же природной подзола и агростратозема (данные метода посева) зоны. Культурозем и рекреазем характеризовались высокими показателями общей численности бактерий по исследованному профилю почв, незначительном уменьшении численности бактерий вниз по профилю и высоким содержанием бактерий в нижних горизонтах (рис. 6,7).
При этом показатели общей численности бактерий в погребенных гумусовых горизонтах близки к показателям, регистрируемым в верхних гумусовых горизонтах (38,65,99).
Рекреазем Рекреазем N, млн. КОЕ/г N, млрд./г Культурозем Культурозем N, млн. КОЕ/г N, млрд./г Рис. 6. Общая численность бактерий (N, Рис. 7. Численность сапротрофных млрд./г) в рекреаземе и культуроземе бактерий (N, млн. КОЕ/г) в рекреаземе и (данные прямой микроскопии). культуроземе Численность сапротрофных бактерий, выраставших на ГПД, тесно коррелировала с содержанием гумуса в исследованных горизонтах. Своеобразной особенностью исследованных рекреаземов и культуроземов является высокое родовое разнообразие бактерий по всему исследованному профилю. Отмечено повышенное содержание коринеподобных бактерий, в первую очередь родококков, устойчивых к различным типам загрязнения, а также проникновение их в нижние горизонты профиля. Изученные почвы характеризовались высокой долей артробактерий и актиномицетов, тяготеющих к нейтральным и щелочным значениям рН почвы (табл.5). Отмечено значительное развитие миксобактерий по всему профилю по сравнению с ранее исследованными урбаноземами, расположенными на территории Москвы, что связано, видимо, с хорошим состоянием растительности ботанического сада и свидетельствует об интенсивном протекании процесса разложения целлюлозы в почве. Специфической особенностью исследованных почв ботанических садов является частое обнаружение вида Bacillus megaterium и рода Azotobacter, представленного двумя видами – Azotobacter chroococcum (обычный для хорошо окультуренных дерново-подзолистых почв) и Azotobacter nigricans (выделяющийся, как правило, из более южных почв). Значительную долю в бактериальном комплексе составляли представители семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Erwinia, Serratia, Proteus).
Табл. 5. Структура сапротрофного бактериального комплекса культурозема Горизонт Доминанты Субдоминанты Группа среднего обилия Au Myxococcus Bacillus Streptomyces, Arthrobacter U Myxococcus Bacillus Streptomyces, Cellulomonas [A1] Bacillus Streptomyces, Flavobacterium Myxococcus [AE] Bacillus Myxococcus Streptomyces, Arthrobacter [E] Myxococcus Streptomyces, Bacillus Arthrobacter Таким образом, для богатых гумусом и элементами минерального питания почв городских ботанических садов характерен своеобразный таксономический состав и более равномерное распределение бактерий по профилю по сравнению с урбаноземами и дерново-подзолистыми почвами, проникновение коринеподобных бактерий в более глубокие горизонты, обильное развитие целлюлозоразрушающих бактерий (роды Myxococcus, Polyangium, Cytophaga).
Значительное разнообразие бактериальных комплексов нижней части профиля рекреаземов и культуроземов, расположенных на территориях ботанических садов, может рассматриваться как одна из дополнительных функций ботанических садов, осуществляющих сохранение не только растений, но и бактериального генофонда.
Глава 5. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СООБЩЕСТВА ГОРОДСКИХ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ Под влиянием антропогенной нагрузки в городах формируется особая экосистема, значительно отличающаяся от природной. Городские почвы по сравнению с зональными ненарушенными характеризуются сильным уплотнением, щелочной реакцией среды, загрязнением токсичными веществами. Все это создает особые условия для обитающих в таких почвах бактерий и требует тщательного исследования бактериальных сообществ таких почв.
Бактериальные сообщества городских загрязненных почв и сопряженных субстратов (филлосфера, опад) были изучены нами на примере почв городов Московского региона с разной численностью населения и различной антропогенной нагрузкой: мегаполис – г. Москва, средний промышленный город – г. Серпухов, малый чистый город – г. Пущино-на-Оке.
Наиболее детально были изучены бактериальные комплексы городских загрязненных почв и сопряженных с почвой субстратов (опада, филлосферы) города Серпухова. Отбор образцов проводился три раза в год по сезонам (весна, лето, осень) в течение 1995-1999гг. Полученные результаты сравнивали с показателями, ранее полученными при изучении бактериальных сообществ ненарушенного лесного биогеоценоза (3,6,32).
При изучении бактериального населения городских загрязненных почв максимальные показатели численности бактерий были выявлены в интруземе, загрязненном нефтью и мазутом (около 7 млрд. клеток в 1 г почвы), а самые низкие – в урбаноземе, загрязненном костной мукой, и контрольной серой лесной почве (табл. 6). Доля метаболически активных клеток (окраска ФДА) была максимальной в контрольной почве, где она составляла около 60 % от общего числа клеток. Ниже она была в образцах урбаноземов и интрузема (загрязнение нефтью, полихлорбифенилами, костной мукой) (32,35,36,37).
Табл. 6. Численность (млрд. /г) и доля метаболически активных клеток (%) бактерий в исследованных почвах Тип загрязнения Окраска Окраска Доля акридином флуоресцеин метаболически оранжевым диацетатом активных клеток Контроль 2.7 + 0.3 1.7 + 0.1 Нефть и мазут 7.4 + 0.7 2.1 + 0.2 Комплексное 3.8 + 0.4 1.7 + 0.1 Костная мука 2.1 + 0.4 0.8 + 0.1 Полихлорбифенилы 4.1 + 0.5 1.8 + 0.1 Цементная пыль 3.3 + 0.5 1.4 + 0.1 Показатели численности сапротрофного бактериального комплекса (учет на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде) значительно изменялись в зависимости от сезона года и типа анализируемого субстрата (почва, опад, филлоплана). При этом максимальные показатели численности бактерий во все сроки отбора образцов отмечались в опаде, где они колебались в пределах 30-600 млн. КОЕ в 1 г субстрата (рис. 8). Минимальная численность была выявлена на листьях деревьев и в травянистом ярусе – от 2 до млн. КОЕ в 1 г. Показатели численности бактерий в почве занимали промежуточное положение (рис. 9). Следует отметить, что выявленные закономерности соответствуют ранее описанному характеру распределения численности бактерий в разных ярусах лесного биогеоценоза, однако разброс Рис. 8. Пределы колебаний численности показателей численности бактерий бактерий (N, млн. КОЕ/г) в разных субстратах был более значительным (32).
города(I) и контрольного участка (II).
Максимальное родовое богатство бактерий, выявленное на использованной среде, отмечено в образцах почв.
Здесь в зависимости от срока отбора образцов и типа загрязнения выделялось до родов бактерий. Проанализированные растительные субстраты, отобранные на тех же площадках, характеризовались меньшим родовым богатством (до 15 родов).
Таксономическую структуру бактериального комплекса характеризовали при помощи критериев, разработанных на кафедре биологии почв (Добровольская и др., 2003). Спектры потенциальных доминантов (табл.7), позволили выявить ряд различий, обусловленных разными загрязнителями. Общими доминантами во всех изученных городских загрязненных почвах были бациллы, при этом в контроле Рис. 9. Пределы колебаний численности бактерий (N, млн. КОЕ/г) доминировали также артробактерии и в городских почвах на участках с стрептомицеты. В местах наибольшей разными типами загрязнения: А – нефть и мазут, Б – полихлорбифенилы, концентрации населения (центр города, В – хозяйственно-бытовое, Г– цементная пыль, Д – костная мука, К рынок) повышалась частота доминирования – контрольный участок.
представителей семейства Enterobacteriaceae.
При загрязнении почвы нефтью доминантами становились представители рода Rhodococcus, загрязнение цементной пылью приводило к повышению частоты доминирования протеобактерий (роды Pseudomonas, Spirillum, Aquaspirillum), а в почве, загрязненной костной мукой доминировали скользящие бактерии и стрептомицеты (35,86,87,89,90).
Табл. 7. Структура сапротрофного бактериального комплекса городских загрязненных почв Тип загрязнения Доминанты Субдоминанты Группа среднего обилия Контроль Arthrobacter Bacillus Myxococcus, Cytophaga Streptomyces Aquaspirillum Нефть, мазут Rhodococcus Bacillus Streptomyces, Myxococcus Комплексное Enterobacteriaceae Streptomyces Bacillus, Arthrobacter хозяйственно-бытовое Myxococcus Rhodococcus Полихлорбифенилы Rhodococcus Streptomyces Pseudomonas Bacillus Flavobacterium Цементная пыль Arthrobacter Bacillus Rhodococcus, Pseudomonas Streptomyces Azotobacter Различия на уровне субдоминантов и минорных компонентов бактериальных комплексов исследованных субстратов отражены также на дендрограммах (рис. 10).
Максимальное сходство отмечено между образцами опада, отобранными на площадках, загрязненных цементной пылью и костной мукой, минимальное – между образцами, отобранными в городе и контролем. Среди почвенных образцов максимальное сходство проявляли бактериальные комплексы урбаноземов, загрязненных цементной пылью, полихлорбифенилами и костной мукой. Минимальное сходство Рис. 10. Сходство бактериальных комплексов выявлено между бактериальными (%) почв (I) и опада (II) на участках с разными типами загрязнений: А – нефть и комплексами городских почв и мазут, Б – полихлорбифенилы, В – хозяйственно-бытовое, Г – цементная пыль, контрольной почвой.
Д – костная мука, К – контроль.
Результаты, полученные при изучении таксономической структуры бактериальных комплексов, подтвердились при изучении функционального разнообразия микробных сообществ методом мультисубстратного тестирования (МСТ). Полученные результаты свидетельствуют об изменении спектров потребляемых субстратов и снижении интенсивности их использования в городских загрязненных почвах (36,37).
Факторный анализ данных по таксономической структуре почвенных бактериальных комплексов центра города (максимальная антропогенная нагрузка) и контрольной ненарушенной почвы позволил охарактеризовать степень экологического сходства бактериальных популяций по чувствительности к антропогенным воздействиям (ось ГК 1) и потребности в наличии легкогидролизуемого субстрата (ось ГК 2) (рис. 11). Популяции с близкими экологическими нишами в рассматриваемом пространстве двух главных компонент (оси ГК1 и ГК2) располагатются рядом друг с другом, а увеличение относительного расстояния указывает на возрастание различий между ними. Бактериальные популяции, расположенные в левой части схемы принадлежат к классу протеобактерий: представители семейства Enterobacteriaceae и рода Pseudomonas – по режиму питания копиотрофы;
миксобактерии и цитофаги – активные гидролитики.
Рис. 11. Положение исследованных бактериальных популяций в пространстве двух главных компонент ГК1 и ГК2.
В правой части схемы располагаются в основном грамположительные бактерии родов Rhodococcus, Cellulomonas, Micrococcus, Streptomyces, Bacillus. Все они способны переносить длительные периоды голодания, образуя споры или иные покоящиеся формы, существуя длительное время за счет эндогенного метаболизма или используя труднодоступные для других бактерий субстраты. Поэтому вполне закономерно их экологическое сходство по пониженной конкурентоспособности в опаде, основу которого составляет легко доступное органическое вещество.
Вполне объяснимо расположение в верхней части схемы бактерий (высокие значения фактора урбанизации) семейства Enterobacteriaceae и родов Rhodococcus, Arthrobacter, Micrococcus и Streptomyces. Представители семейства Enterobacteriaceae тесно связаны с человеком и теплокровными животными и обильны в местах их концентрации (населенные пункты, в нашем случае они доминируют в центре города), родококки приурочены к загрязнению нефтью, нефтепродуктами и другими ксенобиотиками (полихлорбифенилы), артробактер и стрептомицеты положительно реагируют на подщелачивание почв, характерное для городских почв.
Проведенные исследования свидетельствуют о том, что в условиях города в бактериальных комплексах сопряженных с почвой субстратов (опад, филлоплана, приземный слой воздуха) возрастает значимость представителей семейства Enterobacteriaceae, родов Rhodococcus, Arthrobacter и Micrococcus (63,78,79,88,91).
Под действием различных городских загрязнителей происходила перестройка структуры сообществ на видовом уровне внутри родов Rhodococcus и Bacillus (табл. 8) (34).
Табл. 8. Видовой спектр родококков в городских загрязненных почвах Контроль Комплексное Дихлорфенилы Нефть, мазут Цементная (140 ПДК) (20 ПДК) пыль (50 ПДК) R. luteus R. luteus R. luteus R. maris R. luteus R. erythropolis R.erythropolis R. erythropolis R. ruber R. erythropolis R. rhodochrous R. luteus R. ruber R. maris R. rubropertinctus R. rubropertinctus R. erythropolis R. ruber Максимальное видовое богатство родококков было приурочено к загрязнению нефтью и полихлорбифенилами (5-6 видов родококков). При загрязнении нефтью на первое место по обилию выходили R. ruber, R. maris, что согласуется с данными о способности к использованию углеводородов нефти (28,40,77) и полихлорбифенилов (Нестеренко и др., 1985). В контрольных образцах выделялись, в основном, представители видов R. erythropolis и R. luteus. Также в городских загрязненных почвах снижалась доля Bacillus cereus и увеличивалась доля B. megaterium, что связано с подщелачиванием почвы вследствие поступления цементной пыли.
Особого внимания заслуживает изменение структуры бактериального комплекса в почвах, загрязненных нефтью и полихлорбифенилами в пользу увеличения доли родококков, что имеет индикационное значение (44,45).
Накопление в городских загрязненных почвах потенциально патогенных (семейство Enterobacteriaceae), а также аллергенных бактерий (роды Rhodococcus и Micrococcus), свидетельствует о нарушении экологической функции почвы как «бактериального фильтра» и может представлять определенную опасность для человека.
Глава 6. ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ НЕКОТОРЫХ АНТРОПОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ (МОДЕЛЬНЫЕ ОПЫТЫ) Характеристика физиологического состояния бактериальных клеток в почве, реакция на разнообразные негативные воздействия среды требует применения новых методов в почвенной микробиологии. В настоящее время для характеристики изменения состояния бактериальных клеток в чистых культурах хорошо себя зарекомендовал флуоресцентный краситель LIVE/DEAD L7012 (LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit L7012) (Terzieva et al., 1996;
Auty et al., 2001). Краситель состоит из двух компонентов – изотиоцианатфлуоресцеина, который окрашивает клетки бактерий с неповрежденной мембраной в зеленый цвет и пропидиум йодида, проникающего через поврежденную мембрану и окрашивающего клетку в красный цвет. Соотношение зеленых и красных клеток позволяет сделать вывод о соотношении клеток с поврежденной и неповрежденной мембраной, т.е о физиологическом состоянии бактерий в исследуемом образце почвы (рис. 12).
Разработанный нами метод окраски почвенной суспензии красителем LIVE/DEAD L7012 позволило определить численность и охарактеризовать физиологическое состояние бактериальных клеток в образцах природных ненарушенных почв и городских почв, загрязненных тяжелыми металлами и нефтепродуктами (рис.13). В свежеотобранных образцах большинства исследованных нами почв России доля клеток с неповрежденной клеточной Рис. 12. Оценка физиологического состояния бактерий в почве – окраска почвенной суспензии красителем LIVE/DEAD L7012 (изотиоцианатфлуоресцеин + пропидиум йодид).
Зеленые клетки – бактерии с неповрежденной мембраной, красные – бактерии с поврежденной мембраной.
Рис. 13. Численность бактерий (N, млрд./г) и доля клеток с неповрежденной мембраной (%) в исследованных образцах почв (окраска LIVE/DEAD L7012), красный цвет – клетки с поврежденной мембраной, зеленый – клетки с неповрежденной мембраной. Почвы: 1 – аллювиальная луговая, А1;
2 – дерново-подзолистая, А1;
3 – чернозем выщелоченный, А;
4 – торфяная верховая болотная, Т1;
5 – горно-луговая, Ад;
6 – дерново-карбонатная горная, Ад;
7 – бурая лесная (горная), А1;
серая лесная (горная), А1.
мембраной (интактных) составляла 60-70% (50,52). Показатели общей численности бактерий (интактные + поврежденные клетки) в целом соответствовали показателям численности, полученным при окраске почвенной суспензией акридином оранжевым, традиционно широко применяемым в почвенной микробиологии.
Длительное загрязнение почвы тяжелыми металлами и нефтепродуктами (исследовались городские почвы – урбаноземы и интрузем) не вызывало существенного снижения доли интактных клеток, она составляла 55-60%. Это свидетельствует о высокой устойчивости бактерий в почве к действию неблагоприятных факторов среды и высокой адаптационной способности значительной части бактерий.
Несколько отличались результаты, полученные в модельных опытах. Высушивание и замораживание почвенных образцов, особенно многократное, значительно уменьшало долю интактных клеток и, соответственно, увеличивало долю клеток с поврежденной мембраной (50) (рис.14). При этом даже после трехкратного замораживания-оттаивания образца около 10% клеток сохраняли Рис. 14. Общая численность бактерий (N, неповрежденную клеточную мембрану, млрд./г), доля клеток с поврежденной мембраной (красный цвет) и доля клеток с что, видимо, связано с защитным неповрежденной мембраной (%) в образце дерново-подзолистой почвы, подвергнутой действием почвы по отношению к высушиванию и замораживанию-оттаиванию.
населяющим ее организмам.
Обработка образцов дерново-подзолистой почвы 1 н HCl, 1 н NaOH, снижала долю интактных клеток до 33-37%, однако снижение было не столь значительным, как это можно было ожидать (рис. 15). Сохранение значительной части бактерий в жизнеспособном состоянии подтверждено методом посева почвенной суспензии (47,48,49,50,52). Более устойчивыми к примененным обработкам были грамположительные бактерии, особенно споровые, менее устойчивыми – грамотрицательные, за исключением родов Myxococcus, Polyangium и Sporocytophaga, которые способны образовывать покоящиеся формы – миксоспоры, микроцисты.
Рис. 15. Изменение доли клеток с неповрежденной мембраной (%) после обработки 1 н HCl (1), 1 н NaOH (2) – окраска LIVE/DEAD (L 7012)): зеленый цвет – клетки с неповрежденной мембраной, красный – клетки с поврежденной мембраной.
После примененных обработок некоторая, причем довольно значительная, часть клеток сохраняла неповрежденную мембрану. Это, вероятно, связано как с особым состоянием бактериальных клеток в почве («некультивируемое жизнеспособное состояние»), так и защитной ролью почвы по отношению к населяющим ее организмам (органоминеральные оболочки на поверхности клеток, адсорбция на поверхности и проникновение вглубь почвенных частиц и т.п.).
Следует также отметить определенные преимущества красителя LIVE/DEAD L перед акридином оранжевым, широко используемым в настоящее время в почвенной микробиологии. Акридин оранжевый, будучи катионным красителем, адсорбируется на поверхности почвенных частиц, что может завышать численность бактерий. Изотиоцианат флуоресцеина, входящий в состав L7012, является анионным красителем и имеет низкий уровень связывания с неклеточными структурами, что дает более адекватные представления о численности бактерий в почвах. Применение этого красителя позволяет не только определить численность клеток бактерий, но и дифференцировать клетки по степени повреждения клеточной мембраны, а также требует меньше времени, чем окраска акридином оранжевым. Все это позволяет нам рекомендовать применение L7012 для окраски почвенной суспензии в качестве экспресс - метода, позволяющего провести мониторинг численности и физиологического состояния бактерий, как в природных ненарушенных почвах, так и в почвах, подвергающихся разнообразным антропогенным воздействиям.
Глава 7. НАНОФОРМЫ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДНЫХ И АНТРОПОГЕННО ИЗМЕНЕННЫХ ПОЧВАХ С помощью прямых микроскопических методов наблюдения еще в прошлом веке было показано, что бактерии в почве имеют довольно мелкие размеры (Виноградский, 1952;
Звягинцев, 1987). Была высказана гипотеза, что уменьшение размера клеток является одним из механизмов сохранения жизнеспособности бактерий в неблагоприятных условиях (Новогрудский, 1933;
Красильников, 1954). В последнее десятилетие при помощи электронно микроскопических и молекулярно-биологических методов показано, что мелкие бактерии, описываемые терминами «фильтрующиеся формы», «L формы», «ультрамикробактерии, «наноформы бактерий», «нанобактерии», «наннобактерии», довольно широко распространены в природных средах (Дмитриев и др., 2004, Panikov, 2005). Высказанная ранее гипотеза позволяет предположить, что в сильно загрязненных почвах бактерии могут переходить в состояние наноформ.
Разработанный и использованный в работе метод фильтрации почвенной суспензии через мембранные фильтры (размер пор 0.2 мкм) с последующим центрифугированием и окраской красителем LIVE/DEAD (L7012) позволил определить численность, охарактеризовать физиологическое состояние и определить филогенетическую принадлежность наноформ почвенных бактерий (наноформ) в некоторых почвах (51,53,54).
Численность наноформ бактерий в исследованных ненарушенных и антропогенно-измененных почвах России весьма велика и составляют десятки и сотни миллионов клеток в 1 г почвы, что на 1–2 порядка ниже, чем численность бактерий более крупного размера в тех же почвах (рис. 16).
Обращает на себя внимание, что в загрязненных тяжелыми металлами и углеводородами нефти городских почвах численность и доля наноформ бактерий выше, чем в их ненарушенных аналогах (рис. 17). Доля наноформ бактерий составляла от 12 до 15% от общего числа клеток, т.е. была в два и более раз выше, чем в природных незагрязненных почвах той же природной зоны.
N, млн./г 4,8% 2,3% 100 5,7% 0,6% 1,4% 0,9% 50 1,7% 1% 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 16. Численность и доля (%) наноформ бактерий в природных почвах:
1 – аллювиальная луговая, 2 – дерново-подзолистая, 3 – выщелоченный чернозем, 4 – торфяная верховая болотная, 5 – горно-луговая, 6 – дерново-карбонатная (горная), 7 – бурая лесная (горная), 8 – серая лесная (горная).
N, млн./г 12% 14% 15% 1 2 Рис. 17. Численность и доля (%) наноформ бактерий в городских загрязненных почвах: 1 – урбанозем (придорожная полоса), 2 – урбанозем (тяжелые металлы), 3 – интрузем (углеводороды нефти).
Таксономическое разнообразие наноформ бактерий на уровне филотипов (метод FISH) в исследованных природных почвах весьма велико. Обнаружены представители основных филогенетических групп бактерий и архей, широко представленных в почвах: Archaea, Actinobacteria, Firmicutes Cytophaga, Proteobacteria (рис. 18). Обращает на себя внимание высокая доля неидентифицированных клеток, что может быть связана как с малой изученностью наноформ бактерий, так и с особым состоянием клетки, не позволяющим им связываться со специфическими молекулярными зондами-маркерами. Соотношение между отдельными таксонами как среди наноформ, так и среди более крупных клеток примерно одинаково (51,53,54). Правомочно предположить, что в почве представители некоторых, если не многих, таксонов присутствуют как в виде клеток более крупного, так и более мелкого размера. Подобное явление ранее было обнаружено у бактерий родов Kaistia, Sphyngopyxis, Pelagibacter, Verrucomicrobium, обитающих в почве (Дмитриев и др., 2008).
Рис. 18. Таксономический состав прокариот (на уровне крупных филотипов – метод FISH) бактерий в горно-луговой почве: 1 – Archaea;
2 – Firmicutes;
3 – Proteobacteria;
– неидентифицированные клоны.
Изучение физиологического состояния, проведенное при помощи красителя LIVE/DEAD (L7012), свидетельствуют о высокой жизнеспособности наноформ бактерий. Доля клеток с неповрежденной клеточной мембраной среди наноформ составляла 95-98%, а среди клеток более крупного размера не превышала 70% (53,54,67,68).
Сопоставление данных о значительной доле среди наноформ бактерий клеток с неповрежденной клеточной мембраной (более 90%), с долей неидентифицированных методом FISH клеток позволяет предположить, что наноформы бактерий представляют собой живые, но мало активные (содержащие сравнительно мало рРНК) клетки, находящиеся в особом анабиотическом состоянии.
Морфологическое разнообразие наноформ бактерий была изучено методами сканирующей (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (рис. 19).
Результаты изучения целых клеток при помощи СЭМ представлены на рис. 19 А.
Видно, что клетки имеют круглую или овальную форму, диаметр их не превышал 200 нм, что несомненно позволяет отнести исследуемые объекты к наноформам бактерий. Обращает на себя внимание, что клетки присутствуют как в виде конгломератов, состоящих из 2-5 клеток, так и в виде единичных объектов. Рядом с некоторыми клетками обнаруживаются более мелкие клетки, напоминающие почки, что свидетельствует о делении клеток и подтверждает их жизнеспособность.
Изучение морфологии клеток методом ПЭМ показало, что клетки бактерий имели диаметр от 120 до 200 нм и длину от 150 до 500 нм. (рис. 19 Б, В). Обнаружены клетки кокковидной, овальной и палочковидной формы. Кокковидные клетки формируют конгломераты, то есть делятся, что свидетельствует об их активном состоянии. Хорошо видны внешние покровы, характерные для клеток с грамположительным типом клеточной стенки. Также выявлялись клетки, толщина покрова которых невелика, а внешние контуры клеточной стенки имеют неровные края, что характерно для бактерий с грамотрицательным типом клеточной стенки. Обнаружено три типа палочковидных клеток: короткие с диаметром 150–160 нм и длиной 500 нм, длинные тонкие палочки, диаметром около нм и длиной более 600 нм и почкующиеся палочки диаметром 180 нм и длиной 500 нм.
Таким образом, впервые установлено, что численность наноформ бактерий в изученных почвах довольно велика и составляет десятки и сотни миллионов клеток в 1 г.
Характерная особенность наноформ бактерий – высокая доля клеток с неповрежденной мембраной (95 – 98%). Разнообразие наноформ бактерий как на уровне филотипов, так и морфотипов, довольно высоко, что подтверждается молекулярно-биологическими и электронно-микроскопическими методами. При этом преобладают клетки с грамотрицательным типом клеточной стенки.
Высокая доля наноформ в городских почвах, загрязненных тяжелыми металлами и углеводородами нефти, свидетельствует в пользу гипотезы о переходе бактерий в состояние наноформ как возможном механизме сохранения жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды.
А Б В Рис. 19. А – клетки наноформ бактерий в сканирующем электронном микроскопе.
Б, В – клетки наноформ бактерий, окрашенные 1% раствором молибденово-кислого аммония, в просвечивающем электронном микроскопе (кс – клеточная стенка).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В сравнительном аспекте изучены бактериальные микробные сообщества почв и некоторых сопряженных субстратов в мегаполисе (Москва), среднем промышленном городе (Серпухов), малом чистом городе (Пущино-на-Оке), Ботанических садов и огородов на территории древних монастырей (Соловецкий монастырь, «Нилова пустынь») и природных почв заповедников и заказников.
Установлено, что в мегаполисе, среднем промышленном городе, а также на территории древних монастырей, микробные комплексы характеризуются рядом отличий от природных ненарушенных почв. В природных ненарушенных почвах закономерности изменения численности и бактериального разнообразия определяются многими экологическими факторами: влажностью, содержанием органического вещества, кислотностью, содержанием солей. В антропогенно преобразованных почвах значительное влияние на бактерии оказывают антропогенные воздействия, особенно ярко это проявляется в городских сильно загрязненных почвах.
Реакция бактериального сообщества на антропогенные воздействия проявляется на разных уровнях, как на количественном, так и качественном:
1. Численность бактерий – в городских сильнозагрязненных почвах – увеличение сезонных флуктуаций численности, в почвах городских ботанических садов – иное профильное распределение численности бактерий, выражающееся в увеличении общей численности бактерий в погребенных гумусовых горизонтах 2. Физиологическое состояние бактерий – в сильно загрязненных городских почвах уменьшается доля метаболически активных клеток (окраска ФДА), увеличивается доля наноформ бактерий.
3. Структура сапротрофного бактериального комплекса – в сильно загрязненных городских почвах происходит перераспределение таксонов в пользу увеличения удельного веса бактерий, тесно связанных с человеком (семейство Enterobacteriaceae, род Micrococcus), а также бактерий, приспособившихся к определенным типам загрязнений:
пигментированные родококки – нефть, полихлорбифенилы;
артробактерии, азотобактер – подщелачивание почвы, энтеробактерии – хозяйственно-бытовое загрязнение. В почвах городских ботанических садов и огородов древних монастырей – большая представленность артробактера и стрептомицетов, тяготеющих к нейтральным и слабощелочным почвам. От городских сильнозагрязненных почв почвы ботанических садов отличаются активным развитием целлюлозоразрушающих бактерий (миксобактерии и цитофаги).
Итак, реакция почвенного бактериального комплекса на антропогенные воздействия для человека может иметь негативные и позитивные последствия.
Негативные последствия наиболее ярко видны в сильнозагрязненных городских почвах и заключаются в снижении метаболической активности клеток и накоплении опасных для человека (потенциально патогенных и аллергенных) бактерий, главным образом, энтеробактерий и родококков. Эта тенденция проявляется с разной интенсивностью в зависимости от характера антропогенного воздействия, его уровня и типа загрязнения. Наибольшее увеличение экологически опасных видов установлено в большом городе.
Позитивные последствия наблюдаются в окультуренных почвах на территории Ботанических садов и древних монастырей. Они проявляются в большей численности и значительном разнообразии бактериальных комплексов в нижних горизонтах почвенного профиля, что может рассматриваться как одна из дополнительных функций ботанических садов, которые осуществляют сохранение не только растений, но и бактериального генофонда.
Особого внимания заслуживает реакция почвенных бактерий на сильные загрязнения городских почв, заключающаяся в увеличении численности и доли наноформ бактерий. Это подтверждает на экспериментальном уровне ранее высказанную гипотезу об уменьшении размера бактериальных клеток в неблагоприятных условиях, и позволяет утверждать, что именно наноформы бактерий являются «пулом», представляющим собой жизнеспособные, находящиеся в особом анабиотическом состоянии клетки бактерий, обеспечивающие сохранение бактериального разнообразия почв.
ВЫВОДЫ 1. В природном лесном биогеоценозе общая численность бактерий максимальна в наземном ярусе, меньшие показатели регистрируются в почве и филлоплане. По профилю почвы происходит значительное уменьшение плотности бактериальных популяций. Вертикально-ярусная смена таксономического состава бактерий и трофических группировок бактерий отражает сукцессионные изменения при разложении растительных остатков.
2. В почвах, сформированных в условиях длительной земледельческой практики (городские ботанические сады, огороды на территориях монастырей), бактериальные сообщества характеризуются более равномерным распределением бактерий и активным развитием целлюлозоразрушающих бактерий по всему профилю. Таксономический состав характеризуется большей представленностью родококков, устойчивых к различным типам загрязнения, а также артробактера и стрептомицетов, тяготеющих к нейтральным и слабощелочным почвам.
3. Значительное разнообразие бактериальных комплексов нижней части профиля рекреаземов и культуроземов, расположенных на территориях ботанических садов может рассматриваться как одна из дополнительных функций ботанических садов, осуществляющих сохранение не только растений, но и бактериального генофонда.
4. В сильнозагрязненных городских почвах в сапротрофном бактериальном комплексе происходит перераспределение таксонов в пользу увеличения удельного веса бактерий, адаптированных к определенным типам загрязнений: пигментированные родококки – нефть, полихлорбифенилы, артробактерии, азотобактер – подщелачивание почвы, энтеробактерии – хозяйственно-бытовое загрязнение. Подобные изменения могут рассматриваться как индикационные.
5. В загрязненных городских почвах и сопряженных субстратах происходит накопление опасных для человека потенциально патогенных энтеробактерий и аллергенных родококков, что свидетельствует о нарушении экологической функции почвы как «бактериального фильтра» и может представлять опасность для человека.
6. С использованием красителя LIVE/DEAD (L 7012) установлено, что в природных ненарушенных почвах значительная доля (65 – 70 %) клеток имеют неповрежденную клеточную мембрану. В сильнозагрязненных городских почвах доля интактных клеток ниже (50 – 55 %), еще ниже она была в почвах, подвергавшихся в модельных опытах многократному замораживанию и оттаиванию, а также обработке 1 н HCl и 1 н NaOH.
7. Впервые определена численность и охарактеризовано физиологическое состояние наноформ бактерий в природных почвах и почвах, загрязненных нефтью и тяжелыми металлами. Установлено, что численность и доля наноформ бактерий в городских загрязненных почвах выше, чем в природных незагрязненных почвах. Показано, что среди наноформ бактерий доля клеток с ненарушенной клеточной мембраной выше (95-98%), чем среди клеток обычного размера. Высказывается предположение о способности бактерий к переходу в состояние наноформ как возможном механизме сохранения жизнеспособности в неблагоприятных условиях среды.
8. Впервые определен таксономический состав почвенных наноформ бактерий на уровне крупных филотипов. Установлено, что наноформы в торфяной и горно-луговой почве представлены археями, протеобактериями, цитофагами и актинобактериями. Значительная часть наноформ бактерий (до 50%) отнесено к неидентифицированным клонам.
9. Сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия выявила значительное морфологическое разнообразие наноформ бактерий, представленных как кокковидными, так и палочковидными формами с грамотрицательным и грамположительным типом клеточной стенки.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Монографии, методические и учебные пособия 1. Звягинцев Д.Г., ДобровольскаяТ.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Лысак Л.В. Роль микроорганизмов в биогеоценотических функциях почв. Глава в монографии «Структурно-функциональная роль почвы в биосфере». М.:Геос.1999. 278 с.С. 113 121.
2. Звягинцев Д.Г., ДобровольскаяТ.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Лысак Л.В.
Структурно-функциональная организация микробных сообществ. Глава в монографии «Экология на рубеже XXI века (наземные экосистемы)». М.: Научный мир.1999. 428 с. С. 147-180.
3. Звягинцев Д.Г., Умаров М.М., Чернов И.Ю., Марфенина О.Е., Лысак Л.В.
Микробные сообщества и их функционирование в процессах деградации и самовосстановления почв. Глава в монографии "Деградация и охрана почв". М.: Изд во МГУ. 2002. 654 с. Стр. 401-454.
4. Добровольская Т.Г., Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Лысак Л.В. Роль микроорганизмов в биоценотических функциях почв. Глава в монографии «Структурно-функциональная роль почв и почвенной биоты в биосфере». М.:
Наука.2003. 364 С. 115-125.
5. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Лысак Л.В. и др.
Структурно-функциональная организация микробных сообществ наземных экосистем. "Экология и почвы". Избранные лекции VIII-IX Всероссийских школ (1998-1999). Т.2. Пущино:ОНТИ ПНЦ РАН.1998. 252 с. С.34-83.
6. Лысак Л.В., Сидоренко Н.Н. Особенности микробных сообществ городских загрязненных почв. "Экология и почвы". Избранные лекции VIII-IX Всероссийских школ (1998-1999). Т. 3. М.: Полтекс. 2000. 312с. С.226-237.
7. Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий. М.: Изд-во МГУ. 1990. 76 с.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под. ред. Д.Г. Звягинцева. И.В.
Асеева, И.П. Бабьева, Б.А. Бызов, В.С. Гузев, Т.Г. Добровольская, Д.Г. Звягинцев, Г.М. Зенова, П.А. Кураков, Л.В. Лысак и др. М.: Изд-во МГУ. 1991.303 с. С.63-110, 131-155, 155-169.
9. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий (учебное пособие).
М.:МАКС Пресс.2003. 120 с.
Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций основных результатов докторской диссертации 10. Горова А.К., Асеева И.В., Лысак Л.В., Васильевская В.Д. Психрофильные микобактерии в тундровых почвах Таймыра // Вестник МГУ. Сер. 17. Почвоведение.
1975. №2. С. 74-81.
11. Лысак Л.В., Асеева И.В. Распространение психрофильных коринеподобных бактерий в некоторых почвах Советского Союза // Вестник МГУ. Сер.17.
Почвоведение. 1976. №6. С.84-89.
12. Лысак Л.В., Асеева И.В. Динамика психрофильных бактерий в дерново-подзолистой почве // Вестник МГУ. Сер. 17. Почвоведение. 1978. №1. С.71-76.
13. Лысак Л.В., Асеева И.В. Влияние температуры культивирования на содержание нуклеиновых кислот у психрофильных почвенных бактерий // Микробиология. 1981.
Т.50. №5. С. 818-822.
14. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г. Бактерии в почвах тундры Западного Таймыра // Почвоведение. 1982. №9. С.74-78.
15. Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Коринеподобные бактерии в бактериальных ценозах ряда почв сухих субтропиков // Почвоведение. 1986. №2. С.81-87.
16. Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г Бактерии как компонент биоты лесной подстилки // Вестник МГУ. Сер.17. Почвоведение. 1987. №2. С.54-59.
17. Виноградов Е.В., Горин С.Е., Вустина Т.Ф., Лысак Л.В. Структура внеклеточного полисахарида Rhodococcus sp., C 13-6, содержащего Д-ликсо-гексулозоновую кислоту // Биоорганическая химия. 1988. Т.14. №9. С.1214-1224.
18. Добровольская Т.Г.Черняковская Т.Ф.Ванина С.Е. Закономерности распределения эпифитных и сапротрофных бактерий по вертикальной структуре степных биогеоценозов // Почвоведение. 1990. №6. С.68-77.
19. Звягинцев Д.Г.Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Черняковская Т.Ф. Вертикальный континуум бактериальных сообществ в наземных биогеоценозах // Журнал общей биологии. 1991. Т.52. С.162-177.
20. Евтушенко Л.И., Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Черняковская Т.Ф., Згурская Е.И., Ильченко В.Я., Аданин В.М., Калакуцкий Л.В. Актиномицеты с диаминомасляной кислотой в клеточной стенке, изолированные из почвы // Микробиология. 1991.
Т.60. №5. С.920-927.
21. Лысак Л.В., Горин С.Е., Вустина Т.Ф. Экзогликаны почвенных бактерий родов Arthrobacter и Rhodococcus // Микробиология. 1992. Т.61. №4. С.622-628.
22. Лысак Л.В., Горин С.Е., Вустина Т.Ф. Образование внеклеточных полисахаридов почвенными коринеподобными бактериями // Вестник МГУ. Сер.17. Почвоведение.
1992. №2. С.62-66.
23. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Лысак Л.В., Марфенина О.Е. Роль микроорганизмов в биоценотических функциях почв // Почвоведение. 1992. №6. С.63-77.