Распределение тяжелых металлов в растениях и их действие на рост (
На правах рукописи
СЕРЕГИН
Илья Владимирович
Распределение тяжелых металлов в растениях и их
действие на рост
(03.00.12 – физиология и биохимия растений)
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
.
Москва – 2009
Работа выполнена в лаборатории физиологии корня Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г.
Москва
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Иванов Виктор Борисович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Гамалей Юрий Владимирович доктор биологических наук, профессор Кошкин Евгений Иванович доктор биологических наук Носов Александр Владимирович
Ведущая организация: Московский Государственный Университет им.
М.В.Ломоносова, биологический факультет
Защита диссертации состоится октября 2009 г. в 11 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.
Факс: (495) 977-80-18, электронная почта: [email protected];
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.
Автореферат разослан « » сентября 2009 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук М.И.Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из важнейших задач экологической физиологии рас тений является изучение ответной реакции растений на ионы тяжелых металлов, ко торые при повышенных концентрациях оказывают токсическое действие на самые разнообразные физиологические процессы. Данная проблема имеет не только оче видное практическое значение, которое связано со все возрастающим загрязнением окружающей среды тяжелыми металлами, но также имеет и важное фундаментальное значение, которое связано с исследованием механизмов адаптации и устойчивости растений к тяжелым металлам. Среди них Cd и Pb – наиболее распространенные ток сиканты, тогда как Ni и Zn относят также и к микроэлементам.
По ряду причин растения не могут не поглощать большинство тяжелых металлов и в отличие от животных, способны накапливать их в больших количествах. Именно поэтому проблема компартментации тяжелых металлов в растении является опреде ляющей при изучении их токсического действия и механизмов устойчивости.
Способность растений накапливать тяжелые металлы реализуется на разных уров нях организации: клеточном, тканевом и органном, что связано прежде всего со спо собностью растений накапливать металлы в клеточных оболочках и вакуолях клеток разных тканей и органов, а также с существованием барьерных тканей, ограничи вающих передвижение ряда тяжелых металлов. Накопление тяжелых металлов в ме таболически-малоактивных компартментах клеток и в органах, которых растение мо жет впоследствии лишиться, а также связывание металлов с хелаторами и их выделе ние в корневую слизь могут являться механизмами детоксикации тяжелых металлов, в результате чего тяжелые металлы исключаются из активного метаболизма. Благода ря эффективным механизмам детоксикации металлов растения продолжают расти при повышенном их содержании в среде.
Существует большое количество данных, касающихся токсического действия тя желых металлов и их распределения по органам растений, меньше известно об их внутриклеточном распределении. Данные о распределении металлов на тканевом уровне практически полностью отсутствовали к началу наших исследований, хотя именно изучение их распределения по тканям растений является важным фактором для понимания механизмов их токсического действия и морфо-физиологических ме ханизмов детоксикации. Решение этой задачи тесно связано с необходимостью разра ботки методов анализа распределения тяжелых металлов по тканям и клеткам расте ний, которые ранее практически не были разработаны. На этом основании в данной диссертации была поставлена задача разработать такие методы и с их помощью про анализировать связь между распределением, токсичностью и особенностями ростин гибирующего действия металлов.
Многие виды растений способны накапливать тяжелые металлы, причем их содер жание в органах растений может в десятки и даже сотни раз превышать их содержание в окружающей среде. По способности к аккумуляции тяжелых металлов выделяют две контрастные группы растений: исключатели, у которых тяжелые металлы накап ливаются, главным образом, в корневой системе, и аккумуляторы, у которых они на капливаются в больших количествах в надземных органах [Baker, 1981]. В литературе, однако, практически отсутствуют сведения о том, какими морфо-анатомическими и физиологическими особенностями обусловлена способность одних видов растений накапливать тяжелые металлы в корнях, а у других видов – в надземных органах.
Выяснение роли тканей в передвижении и накоплении металлов у исключателей и гипераккумуляторов необходимо, с одной стороны, для понимания механизма гипе раккумуляции, что представляет интерес в целях изучения применения гипераккуму ляторов для рекультивации почвы и очистки окружающей среды от тяжелых металлов – фиторемедиации, которая в последнее время активно разрабатывается. С другой сто роны, это важно для выяснения структурных и физиологических особенностей исклю чателей, определяющих ограниченное поступление металлов в надземные органы, что представляет несомненный интерес для сельскохозяйственной практики.
Поступая в клетки, тяжелые металлы реагируют с функциональными группами белков и других соединений, что может являться одним из механизмов детоксикации, (металлотионеины и фитохелатины), но вместе с тем приводит к многочисленным на рушениям метаболизма и лежит в основе высокой токсичности тяжелых металлов.
Прочность связывания ионов тяжелых металлов с функциональными группами био полимеров может различаться, что может быть одной из причин различной токсично сти тяжелых металлов. Поэтому в наших исследованиях были выбраны широко рас пространенные тяжелые металлы, во-первых, обладающие различным сродством к функциональным группам биополимеров, а во-вторых, накапливающиеся в разных компартментах клетки. Так, Cd, Pb, Zn связываются главным образом с SН-группами и накапливаются в апопласте, а Ni связывается с N-содержащими лигандами и накап ливается преимущественно в протопласте.
Токсическое действие металлов четко видно по ингибированию роста, что широко ис пользуется для тестирования их присутствия в окружающей среде [Wilkins, 1978;
Wang, 1987;
Breckle, 1991;
Нagemeyer, Breckle 1996]. Действие тяжелых металлов на рост на прямую зависит от особенностей их тканевого и внутриклеточного распределения в растущем участке корня, а также от эффективности механизмов детоксикации, кото рые по-разному могут реализоваться в различных тканях исключателей и аккумулято ров. Поэтому решение проблемы специфичности и избирательности токсического действия металлов на рост, а также выяснение клеточных механизмов действия тяже лых металлов на отдельные ростовые процессы требует понимания особенностей их передвижения и распределения по органам и тканям в связи со свойствами их ионов.
Изучение функциональных особенностей тканей корня и побега в передвижении и накоплении тяжелых металлов у исключателей и гипераккумуляторов, а также выяс нение механизма ростингибирующего действия различных тяжелых металлов необхо димы для разработки фундаментальных основ адаптации растений к тяжелым метал лам и решения ряда практических задач.
Перечисленные выше проблемы определили актуальность данного исследования.
Цель исследования состояла в выяснении роли разных тканей корня и побега ис ключателей и гипераккумуляторов в передвижении и накоплении тяжелых металлов в связи с особенностями их ростингибирующего действия.
Задачи исследования:
1. Выяснить роль разных тканей корня и побега в передвижении и накоплении метал лов у исключателей и гипераккумуляторов 2. Выявить возможные причины избирательного накопления металлов в подземных органах исключателей и надземных органах гипераккумуляторов 3. Охарактеризовать на клеточном уровне механизмы ростингибирующего действия Pb, Ni и Sr в связи со специфичностью и избирательностью их действия.
Научная новизна работы. Предложены новые методы гистохимического опреде ления Cd, Pb, Sr и Zn, а метод для выявления Ni существенно модифицирован, что по зволило повысить его чувствительность. Установлены основные закономерности рас пределения металлов у исключателей и гипераккумуляторов. Впервые выяснен вклад разных тканей корня и побега в передвижении и накоплении металлов. Впервые пока заны отсутствие физиологических барьеров в меристеме корня для ионов тяжелых ме таллов, передвигающихся по симпласту и апопласту;
роль первичной коры как изби рательного аккумулятора таких «апопластических» ионов тяжелых металлов, как Cd и Pb;
отсутствие универсальных тканевых и клеточных барьеров для передвижения тя желых металлов;
функция перицикла как ткани-аккумулятора и «кольцевого коллек тора» в передвижении Ni у исключателей. Выяснена неоднозначность влияния Са на распределение и токсическое действие тяжелых металлов у разных видов. Показана возможная причина «защитного» действия Са – конкуренция за общие места связыва ния при поглощении и транспорте. Впервые показана роль гистидина в передвижении и накоплении Ni у исключателей и гипераккумуляторов. Установлено, что феномен гипераккумуляции определяется не только отсутствием тканей-аккумуляторов и барь ерных тканей в корне у гипераккумуляторов, но и ограниченным поступлением Ni в вакуоли клеток корня и повышенной скоростью поступления Ni в сосуды ксилемы в корнях гипераккумуляторов, в чем важную роль играет повышенный внутриклеточ ный уровень гистидина. Проведен сравнительный анализ ростингибирующего дейст вия тяжелых металлов. Экспериментально обоснована специфика механизма действия Pb, Ni и Sr на рост наряду с общей неспецифичностью и неизбирательностью токсиче ского действия металлов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Роль тканей растений в передвижении и накоплении тяжелых металлов не одина кова не только для разных металлов, но и у растений исключателей и гиперакку муляторов.
2. В корнях гипераккумуляторов отсутствуют барьерные ткани и ткани аккумуляторы, в результате чего их корневая система, в отличие от исключателей, не ограничивает поступление металлов в побег.
3. Гипераккумуляторы Ni, в отличие от исключателей, характеризуются ограничен ным накоплением Ni в клетках корня и повышенной скоростью поступления Ni в сосуды ксилемы, в чем важную роль у Thlaspi caerulescens играет внутриклеточ ный уровень гистидина.
4. Специфика действия отдельных тяжелых металлов на различные ростовые про цессы обусловлена как различиями физико-химических свойств их ионов, так и различным характером их передвижения и распределения по тканям и органам растений.
Научная и практическая значимость исследований. Проведенные исследования имеют, прежде всего, фундаментальный характер, поскольку позволяют понять основ ные принципы и закономерности передвижения и распределения тяжелых металлов по разным тканям в связи с различной ролью последних как у разных видов растений, так и для разных тяжелых металлов. Результаты исследования дают новые представления о специфических и неспецифических чертах ростингибирующего действия тяжелых металлов. Установленные связи между особенностями распределения тяжелых метал лов и клеточным механизмом их токсического действия на рост являются важным звеном в понимании устойчивости растений к тяжелым металлам и реакции растений на их избыток. Вместе с тем представленные результаты могут иметь и практическое значение ввиду возрастающего загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами.
Полученные данные о неоднозначности «защитного» эффекта Ca необходимо учиты вать в сельскохозяйственной практике, так как известкование почв – один из наиболее распространенных приемов, направленный на уменьшение поглощения и токсическо го действия тяжелых металлов. Понимание причин ограниченного поступления тяже лых металлов в надземные органы у растений исключателей и неограниченного – у гипераккумуляторов может быть использовано для разработки методов уменьшения содержания тяжелых металлов в сельскохозяйственной продукции, с одной стороны, и увеличении содержания металлов в надземных органах растений, используемых в тех нологии фиторемедиации. Кроме того, определение тяжелых металлов с помощью простых гистохимических методов имеет важное значение для экологического мони торинга. Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекци онные курсы по физиологии растений и экологии.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 1997), на Международном симпозиуме «Структура и функция корня» (Словакия, 1998), на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), на Меж дународном симпозиуме Plants under Environmental Stress (Москва, 2001);
на Между народной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001);
на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на I Молодежной конференции ИФР РАН (Москва, 2003), на V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на VIII Международ ной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004), на Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений Cевера» (Петрозаводск, 2004), на III научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екате ринбург, 2004), на Международной конференции «Физиологические и молекулярно генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на IV Междуна родной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности расте ний» (Минск, 2005), на Международной конференции «Биология стволовых клеток:
фундаментальные аспекты» (Москва, 2005), на I (IX) Международной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на Международной конференции «Физиология растений – фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на Дону, 2006), на семинарах лаборатории экологии и физиологии растений Свободного университета (Амстердам, Голландия, 2005, 2006, 2007, 2008), на секции экологии Дома ученых (Москва, 2007), на Костычевских чтениях (Санкт-Петербург, 2007), на Международном семинаре Phytoremediation and Мonitoring of Сontaminated soil (Санкт-Петербург, 2007), на VI Съезде Общества физиологов растений России (Сык тывкар, 2007), на Международной конференции «Физико-химические основы струк турно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, в том числе 23 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена в лаборатории физиологии корня Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений РАН. Из ис следований, проведенных в соавторстве с коллегами, в диссертационную работу включены и вынесены на защиту только те результаты, в получении которых автору принадлежит существенная или определяющая роль. Автор выражает глубокую бла годарность Е.И. Быстровой, А.Д. Кожевниковой, а также Н.В. Алексеевой-Поповой, А.И. Беляевой, М.Н. Катаевой, Л.К. Шпигун, R. Vooijs и доктору H. Schat (Свободный университет, Амстердам, Голландия) за оказанную помощь в проведении ряда иссле дований. Особо благодарен научному консультанту В.Б. Иванову за конструктивные советы и постоянное содействие в работе, а также всем коллегам, принимавшим уча стие в обсуждении полученных результатов.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 333 страницах и состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов. Список литературы включает 625 источника, из них 555 иностранных авторов. Работа содержит 26 таблиц и 99 рисунков. 11 таблиц и 88 рисунков включены в приложение (том 2).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Действие тяжелых металлов и Sr на рост и ветвление корня.
К тяжелым металлам относят большую группу металлов, обладающих как общи ми, так и специфическими особенностями их токсического действия на организмы. В литературе тяжелые металлы часто рассматривают как единую группу токсикантов.
Однако отдельные металлы четко различаются по физико-химическим свойствам их ионов и токсичности. Механизмы токсического действия тяжелых металлов могут быть различны. Наряду с общими механизмами токсического действия металлов, от дельные металлы в некоторых случаях могут избирательно ингибировать процессы, более специфично связанные с ростом (например, серебро ингибирует синтез этилена [Nichols et al., 1985]). Чтобы полнее охарактеризовать действие тяжелых металлов, в данной работе мы выбрали ряд металлов, заметно отличающихся по своим свойствам, и проанализировали корреляции между свойствами их ионов, распределением метал лов по тканям и клеткам и их биологическим действием.
На токсичность металлов влияют другие ионы, присутствующие в среде, наиболее важную роль среди которых играют ионы Ca. Известно, что действие Ca связано с его физиологическими функциями в клетке как вторичного мессенджера. Однако возмож но, что Са конкурирует с тяжелыми металлами как двувалентный катион. В этом слу чае такое же действие будет проявлять и Sr, который является аналогом Ca, но не вы полняет свойственных последнему физиологических функций.
В данной работе мы попытались охарактеризовать степень специфичности и изби рательности действия отдельных металлов, сравнивая между собой ряд разных метал лов, отличающихся по физико-химическим свойствам. Кроме того, было изучено, в какой мере защитный эффект Ca может быть обусловлен его физиологической ролью путем сравнения действия Сa и его близкого аналога – Sr. В качестве объекта были взяты проростки кукурузы, которые в течение многих лет использовались в нашей ла боратории как объект для скрининга биологической активности разных соединений.
Действие Сd, Pb, Ni и Sr на рост и ветвление корня. Проростки кукурузы (Zea mays L.) выращивали в течение 7 суток на растворах Cd(NO3)2 (1, 10 мкМ), Pb(NO3) (10, 100 мкМ), Ni(NO3)2 (1, 10, 15, 20, 35, 50 мкМ) или Sr(NO3)2 (3 мМ, 35 мкМ) в ве гетационной камере (27/25°C день/ночь;
интенсивность освещения 3000 лк, 16ч сут-1;
относительная влажность 70%;
постоянная аэрация раствора). При инкубации расте ний на растворах 10 мкМ Cd(NO3)2, 100 мкМ Pb(NO3)2 и 50 мкМ Ni(NO3)2 (LC) наблю дали почти полную гибель корней уже на вторые сутки. Боковые корни не возникали.
Приблизительно 50%-ное ингибирование роста первичного корня за 24-48 ч инкуба ции наблюдалось при концентрациях 1 мкМ Cd(NO3)2, 10 мкМ Pb(NO3)2, 15 мкМ Ni(NO3)2, и 3 мМ Sr(NO3)2 (LC50) (рис. 1а). На растворе Хогланда соответствующие концентрации составляли 38 мкМ Cd(NO3)2, 10 мкМ Pb(NO3)2, 75 мкМ Ni(NO3)2. Ин гибирование развития боковых корней наблюдалось только в присутствии Ni(NO3)2.
Сравнение токсичности разных металлов. Для сравнительной оценки токсиче ского действия тяжелых металлов и Sr проростки кукурузы выращивали в чашках Пет ри на растворах AgNO3, Cd(NO3)2, Pb(NO3)2, ZnSO4, CuSO4, Tl2(SO4)3, CoCl2, Ni(NO3)2, Sr(NO3)2 и HgCl2 (0.001 - 3 г/л) (рН 6.0). Токсическое действие солей металлов оце нивали по ингибированию прироста каждого корня за 1-ые, 2-ые и 3-ьи сутки после начала инкубации, изменению длины зоны боковых корней, а также по времени раз вития боковых корней, которое рассчитывали по методу В.Б. Иванова (1998).
При одинаковой концентрации ионов в растворе (например, при 10-4 М) их токсич ность уменьшалась в следующем порядке: Tl3+ Cu2+ Ag+ Hg2+ Cd2+ Ni2+ Zn2+ Pb2+ Co2+ Sr2+, что в целом совпадало с рядом токсичности, если в качестве кри терия принимали 50%-ное ингибирование роста корня (рис. 1б, в). Металлы по их дей ствию на рост корня кукурузы можно условно разделить на три группы: сильноток сичные (Сu, Tl, Ag), среднетоксичные (Cd, Ni, Hg) и слаботоксичные (Pb, Co, Zn и Sr).
Все изученные соли металлов, за исключением Ni, не влияли на время развития бо ковых корней (табл. 1), что согласуется с результатами более ранних исследований, которые показали, что ветвление корней очень устойчиво к действию разнообразных токсикантов [Ivanov, 1994]. При неизменном времени развития самих боковых корней, длина зоны боковых корней становилась короче, чем в контроле, за счет ингибирова ния роста первичного корня. В результате образуется более компактная корневая сис тема, что является общим проявлением токсического действия тяжелых металлов [Breckle, 1991, 1996;
Arduini et al., 1994;
Hagemeyer, Breckle, 1996].
Токсическое действие Ni на рост и ветвление корня у исключателей и аккумулято ров различается. Для сравнения были выбраны исключатели (Zea mays, Thlaspi perfo liatum, T. arvense) и 5 экотипов гипераккумулятора T. caerulescens (St. Felix, Prayon, Lellingen, LaCalamine, Monte Prinzera), которые выращивали на растворе Хогланда в присутствии Ni(NO3)2 в концентрациях 10–30 мкМ для T. perfoliatum и T.arvense, 30– 80 мкМ для Z. mays и 25–400 мкМ для T. caerulescens. Снижение накопления биомассы корней и побегов у T. caerulescens наблюдали при 300 мкМ Ni(NO3)2, а у T. perfoliatum – при 20 мкМ (рис. 2). Боковые корни развивались у T. caerulescens даже при 400 мкМ, в то время как у Z. mays ингибирование развития боковых корней наблюдалось уже при 60 мкМ Ni(NO3)2 в растворе. Причина таких различий кроется в различной роли тканей корня в накоплении тяжелых металлов у исключателей и гипераккумуляторов.
Механизм общетоксического действия тяжелых металлов. Механизмы токсич ности тяжелых металлов разнообразны [Ernst, 1992, 1999;
Серегин, Иванов, 2001;
Се регин, Кожевникова, 2006]. Ранее были предприняты попытки проанализировать кор реляции между токсичностью отдельных металлов и их физико-химическими свойст вами. Особенно четкая зависимость между токсичностью тяжелых металлов и прочно стью их связи с SH-группами была установлена при изучении их влияния на фермен Прирост корня, % от контроля 0-24 ч 100 24-48 ч Н2О Ni Pb Cd Sr Рис. 1. Влияние тяжелых металлов на прирост первичного корня кукурузы (а, б) и корреляция между концентрацией, вызываю щей 50%-ное ингибирование роста корня, и сродством тяжелых металлов к SH группам, выраженное через константу (K1), представ ляющую собой отрицатель ный логарифм растворимос ти соответствующих сульфи дов (в).
(а) – 15 мкМ Ni(NO3)2, 3 мМ Sr(NO3)2, 1 мкМ Сd(NO3)2 и 10 мкМ Pb(NO3)2.
Таблица 1. Влияние солей различных тяжелых металлов в разных концентрациях на длину зоны боковых корней и время их развития у проростков кукурузы.
Длина зоны боковых корней, мм Время развития боковых корней, ч Cоль контроль 0.01 г/л 0.1 г/л контроль 0.01 г/л 0.1 г/л 77 ± 8 (10) 62 ± 8 (6) 33 ± 9 (4) 51 ± 3 (10) 50 ± 1 (6) 54 ± 5 (4) CuSO 65 ± 5 (4) 42 ± 1 (3) 55 ± 3 (4) 55 ± 3 (3) AgNO3 — — 71 ± 8 (8) 56 ± 9 (4) 24 ± 3 (4) 50 ± 2 (8) 52 ± 4 (4) 53 ±3 (4) Cd(NO3) 70 ± 7 (5) 58 ± 2 (4) 34 ± 3 (4) 48 ± 2 (5) 48 ± 5 (4) 50 ± 2 (4) HgCl 74 ± 5 (6) 70 ± 9 (4) 35 ± 4 (5) 49 ± 2 (6) 53 ± 2 (4) 66 ± 2 (5) CoCl 75 ± 7 (8) 71 ± 5 (4) 66 ± 5 (4) 48 ± 2 (8) 47 ± 1 (4) 43 ± 1 (4) ZnSO 67 ± 4 (4) 66 ± 8 (4) 60 ± 4 (4) 53 ± 1 (4) 53 ± 1 (4) 53 ± 1 (4) Pb(NO3) 52 ± 6 (3) 56 ± 1 (3) 15 ± 1 (3) 55 ± 3 (3) 54 ± 3 (3) 72 (3) Ni(NO3) 52 ± 6 (3) 48 ± 2 (3) 52 ± 4 (3) 55 ± 3 (3) 55 ± 4 (3) 53 ± 3 (3) Sr(NO3) Примечание. Приведены средние арифметические и их стандартные ошибки. В скобках показано число независимых экспериментов. Длину зоны боковых корней измеряли на третьи сутки после начала инкубации. Прочерк означает отсутствие измерения.
0,08 0, Thlaspi caerulescens T. perfoliatum корни экотип Felix 0, черешки 0,06 листьев Сухая масса, г Сухая масса, г 0, листовые пластинки 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Контроль 10 20 Контроль 100 150 200 300 Концентрация Ni(NO3)2, мкМ Концентрация Ni(NO3)2, мкМ Рис. 2. Влияние различных концентраций Ni(NO3)2 на сухую массу корней, черешков ли стьев и листовых пластинок Thlaspi caerulescens (экотип Felix) и Thlaspi perfoliatum после 7 недель инкубации.
Прирост корня, мм Рис. 3. Влияние Ca(NO3)2 (3 мМ) на рост корня кукурузы (а) и лю Са Pb Рb+Са Н2О пина (б) в присутствии Ni(NO3) (35 мкМ), Sr(NO3)2 (3 мМ) (а) и Pb(NO3)2 (10 мкМ) (а, б). Влияние Cа(NO3)2 на ростинги бирующее действие Ni и Pb у проростков амаранта (в).
ты in vitro у разных водных беспозвоночных и рыб [Левина, 1972]. Для растений такие данные нами получены впервые.
Для анализа зависимости токсического действия тяжелых металлов на рост от фи зико-химических параметров были вычислены коэффициенты корреляции между наи более значимыми величинами, определяющими свойства атомов и ионов металлов, и молярными концентрациями, вызывающими 50%-ное ингибирование роста корня (LС50). Существенная положительная корреляция (r = 0.82) была выявлена только ме жду сродством металла к SH-группам и молярными концентрациями, при которых рост тормозится на 50% (рис. 1в). Корреляций с другими изученными параметрами мы не обнаружили.
В ряде работ сравнивали влияние на рост корней одного вида растения разных тя желых металлов [Neiboer et al., 1980;
Wong, Bradshaw, 1982;
Karataglis, 1987], не со поставляя их токсичность и физико-химические свойства. Обработка этих данных вы явила четкую корреляцию между сродством металлов к SH-группам и степенью инги бирования роста корней. При нашем анализе данных Wong и Bradshaw (1982) для Lolium perrene и Karataglis (1987) для Triticum aestivum была обнаружена высокая кор реляция между молярными концентрациями, вызывающими 50%-ное ингибирование роста корня, и электроотрицательностью (r = 0.9), что свидетельствует о связи между токсичностью металлов и их способностью образовывать прочные ковалентные связи.
Однако для корней проростков кукурузы высокой корреляции между этими парамет рами не выявлено.
Токсичность тяжелых металлов не определяется только их взаимодействием с SH группами белков, а зависит также от реакций с другими функциональными группами, от подвижности ионов и других их свойств. Поэтому относительная токсичность от дельных металлов для разных видов растений или других организмов различается.
Выявленная корреляция между степенью ингибирования роста и сродством метал лов к SH-группам, необходимым для функционирования большого числа ферментов, позволяет предположить общий для разных металлов механизм неспецифической и неизбирательной токсичности, на который могут накладываться отдельные частные реакции. Поэтому тяжелые металлы можно рассматривать как неспецифически дейст вующие вещества. Их действие обусловлено общими причинами, среди которых важ ную роль играет взаимодействие с SH-группами белков. Не исключено, что в случае Ni может происходить также инактивация ферментов, в активные центры которых входит гистидин, так как сродство Ni к N-содержащим лигандам выше, чем к S-содержащим, что определяет особенности его токсического действия.
Общие закономерности влияния тяжелых металлов на рост корней. Несмотря на существенные различия в токсичности (рис. 1б), все изученные соли тяжелых ме таллов имеют общие особенности токсического действия на рост корней: 1) диапазон концентраций, при которых рост ингибируется, невелик, 2) степень ингибирования роста, за исключением Ni, мало изменяется со временем, 3) ветвление корня не инги бируется, за исключением Ni, несмотря на сильное ингибирование роста первичного корня (рис. 1, табл. 1). Согласно ранее полученным данным, эти признаки характерны для самых разных соединений: неспецифически действующих неэлектролитов;
ряда антибиотиков, не обладающих избирательным действием на рост или деление клеток;
солей калия, натрия и других соединений [Ivanov, 1994]. Все эти вещества тормозят рост только при концентрациях, близких к летальным, что в значительной степени обусловлено неспецифическим общим нарушением структуры и метаболизма клеток.
Влияние Са на ростингибирующее действие тяжелых металлов. Несмотря на активное изучение физиологической роли макроэлементов, и в особенности Са как вторичного мессенджера в самых разнообразных сигнальных системах, его влияние на проявление токсического действия тяжелых металлов оставалось малоизученным. Для изучения влияния Ca была проведена серия экспериментов, в которой проростки ку курузы инкубировали на растворах Ni(NO3)2 (15, 20, 25, 35 мкМ), Sr(NO3)2 (3 мМ, мкМ), Сd(NO3)2 (1 мкМ) или Pb(NO3)2 (10 мкМ);
люпина Lupinus rubrum – на растворе Pb(NO3)2 (10 мкМ) и амаранта Amaranthus caudatus – на растворах Pb(NO3)2 (50, 100, 200, 700 мкМ), или Ni(NO3)2 (10, 50, 100, 500 мкМ) в присутствии Ca(NO3)2 (3 мМ для кукурузы и люпина и 100 мкМ для амаранта). Действующие концентрации Ca и тяже лых металлов были подобраны в предварительных экспериментах.
Результаты настоящей работы ясно показывают, что действие Ca неоднозначно. В отличие от кукурузы и люпина (рис. 1а, 3а, б), токсическое действие Ni и Pb на рост корня амаранта увеличивалось в присутствии Са (рис. 3в), что согласуется с увеличе нием их содержания в растущем участке корня. Сходные результаты были получены при изучении поглощения Cd корнями березы [Greger, Jensen, 1995] и Ni гипераккумуля тором Berkheya coddii [Boyd, Martens, 1998].
II. Роль различных тканей растений в передвижении и накоплении тяжелых металлов и Sr.
Тяжелые металлы и Sr поступают в растение главным образом через корневую сис тему. С целью изучения роли отдельных тканей растений в передвижении и распреде лении тяжелых металлов, были разработаны гистохимические методы определения Сd, Pb, Sr и Zn, а также модифицирован метод определения Ni, что позволило значи тельно повысить его чувствительность. Используемые реагенты (дитизон для опреде ления Cd и Pb, диметилглиоксим для определения Ni, родизонат натрия для определе ния Sr, цинкон и Zinpyr-1 для определения Zn) обладают высокой чувствительностью к изучаемым металлам и способны проникать в неповрежденные клетки. Изучение распределения металлов проводилось с помощью современных методов световой микроскопии, что позволило проанализировать распределение металлов по тканям корня и побега исключателей и гипераккумуляторов, в результате чего были выявлены основные закономерности распределения и передвижения Сd, Pb (рис. 4), Sr (рис. 5), Ni (рис. 6) и Zn (рис. 7). Анализ проводили непосредственно после приготовления сре зов корня или побега в условиях, при которых возможность перераспределения метал лов ограничена, о чем свидетельствуют результаты специально проведенных серий экспериментов, более подробно описанных в диссертации. Результаты гистохимиче ского анализа были подтверждены данными количественного определения металлов в различных участках корня и в побегах методами анодной инверсионной вольтамперо метрии [Шпигун, Копытова, 1997] (рис. 4е) или атомно-абсорбционной спектрофото метрии (рис. 5о, 6и, 7).
Подобные данные, особенно для Сd и Sr, полностью отсутствовали в литературе, так как гистохимические методы их определения ранее не были разработаны. Однако существует ряд работ, касающихся распределения Ni в надземных органах растений гипераккумуляторов [Severne, 1974;
Heath et al., 1997;
Psaras, Manetas, 2001;
Bidwell et al., 2004] и распределения Pb по тканям подземных органов ряда видов [Glater, Her nandez, 1972;
Wierzbicka, 1987;
Tung, Temple, 1996;
Gzyl et al., 1997]. Полученные эти ми авторами результаты согласуются с данными гистохимического анализа, что также позволяет заключить, что разработанные методы выявляют истинное распределение изучаемых металлов. Следует отметить, что при изучении окрашенных срезов, по ин тенсивности окрашивания мы можем полуколичественно оценивать и сравнивать со держание металла в разных участках среза на единицу площади, в то время как срав нение содержания металла в клетках разных тканей возможно лишь при сходном раз мере клеток на срезах. На основании полученных данных подробно проанализирована роль отдельных тканей корня и побега в распределении металлов на примере как од нодольных (Zea mays), так и двудольных (Lupinus rubrum, Thlaspi perfoliatum, Thlaspi caerulescens, Amaranthus caudatus) растений, относящихся, кроме того, к разным стра тегиям: исключателям и гипераккумуляторам. Оценено также влияние Са на накопле ние и распределение металлов.
Корневой чехлик. Клетки корневого чехлика и ризодермы участвуют в образова нии слизи, покрывающей апикальный участок корня [Данилова, 1974]. Способность слизи связывать тяжелые металлы зависит от сродства ионов металлов к функциональным группам биополимеров слизи. Чем прочнее ионы металлов связываются со слизью, тем медленнее они поступают в корень. Наиболее высоким сродством к этим группам облада ют ионы Pb [Mench et al., 1987], которые прочно связывается со слизью. Sr связывается с материалом слизи значительно слабее, что обусловливает его высокую мобильность и бы строе поступление в корень. Для Ni также существенно связывание с материалом слизи.
Однако его сродство к уроновым кислотам слизи ниже, чем у Pb, так как Ni образует связи преимущественно с N-лигандами [Левина, 1972]. Таким образом, слизь может играть роль своеобразного аккумулятора для тех ионов металлов (Pb), физико-химические свойства ко торых определяют их высокое сродство к функциональным группам углеводов.
Поступая в клетки корневого чехлика кукурузы, тяжелые металлы и Sr распреде ляются в них достаточно равномерно (рис. 5м). Ni накапливался преимущественно в Рис. 4. (а) – отсутствие Pb в контрольных корнях. Распреде ление Pb в проростках кукурузы (б-д), люпина (ж, з), ама ранта (и, к) после 24 ч (б, г, д);
48 ч (в, з);
7 суток (ж, и, к) ин кубации на растворах 10 мкМ (б, в, д, ж, з), 0.1 мМ (г, и, к) Pb(NO3)2 в отсутствие Са (б-д, ж, з, и), в присутствии Са (к).
Показано распределение металлов в апикальном (в, и, к), среднем и базальном участках корня (б, г, д, ж, з) при LC (б, в, г, д, ж-к) и LC (г). (е) – содержание Pb в корнях проро стков кукурузы после 1-2 сут выращивания в присутствии 0.01 и 0.1 мМ Pb(NO3)2 (вегетационные сосуды) и 1 и 10 мМ Pb(NO3)2 (чашки Петри). (д) – плазмолиз 0.7М сахарозой (1ч) ВК – внутренняя кора;
К – кора;
КП – ксилемная паренхима;
Кс - ксилема;
Мк – метакси лема;
НК – наружная кора, П – перицикл;
Р – ризодерма;
С – сердцевина;
Ф – флоэма;
Э – эндодерма. Для Сd на проростках кукурузы получены аналогичные результаты.
Рис. 5. Распределение Sr (а-н, п) в корнях (а-в, е-и, л-н) и по бегах (г, д, к) проростков кукурузы и в эпидерме листовой пластинки Thlaspi caerulescens (экотип Lellingen) (п) после ч (а, б);
48 ч (в-д, з, и, м, н);
7 суток (е, ж, к, л) или 42 суток (п) инкубации на растворах 3 мМ (а-о) или 300 мкМ (п) Sr(NO3)2 в отсутствие Са (а-ж, м) или в присутствии Са (з л, н). (о) – содержание Sr в корнях и побегах кукурузы.
КЧ – корневой чехлик;
ПП – проводящий пучок;
ПЦ – покоящийся центр;
Эп – эпидерма.
Остальные обозначения как на рис. 4.
Рис. 6. Распределение Ni в растениях кукурузы (а-e) и Thlaspi caerulescens экотипов Felix (ж) и Prayon (з) по сле 48 ч (а, б, д);
4 суток (в);
7 суток (г, е) или 7 недель (ж, з) инкубации на растворах Ni(NO3)2 (35 мкМ (а-в, е), 75 мкМ (в, д), 300 мкМ (ж, з) в отсутствие Са (а), в присутствии Са (б-з). (г) – апикальный участок корня, (з) – нижняя эпидерма листа. (и) – содержание Ni в проростках кукурузы (75 мкМ Ni(NO3)2).
(к, л) – корреляции между содержанием Ni и Ca в растениях T. caerulescens и T. perfoliatum.
М – межклетник;
ЗКл, ОКл, ПКл – замыкающие, основные, побочные клетки.
Рис. 7. Распределение Zn в корнях (а-в, з), мезофилле (е), нижней (г) и верхней (д) эпидерме листовой пластинки Thlaspi caerulescens (экотип Lellingen) (а-д) и Thlaspi perfoliatum (з) после 7 недель инкубации на растворах Zn(NO3)2 (2 мкМ (а, б), 70 мкМ (з), 200 мкМ (в), 800 мкМ (е), 1000 мкМ (г, д). (ж) – содержание Zn в растениях T. caerulescens. Закономерности распре деления Zn по тканям при всех изученных концентрациях сохраняются неизменными. КВ корневой волосок, М – мезофилл, Тр – трихобласт. Остальные обозначения как на рис. 4, 6.
симпласте (мы будем называть такие металлы «симпластическими»), а остальные изу ченные металлы – преимущественно в апопласте (будем называть такие металлы «апо пластическими»). Так как поверхностные клетки чехлика и клетки колумеллы разли чаются по ультраструктуре и выполняемой функции [Данилова, 1974], можно заклю чить, что различия в строении различных клеток чехлика не обуславливают каких либо особенностей распределения этих металлов. Равномерное распределение метал лов по клеткам корневого чехлика может определяться функциональной однородно стью апопласта, в результате чего Cd, Pb и Sr беспрепятственно поступают в клетки всех слоев чехлика. Ni также проникает в клетки колумеллы, что дает основания пола гать, что транспорт Ni по протопластам клеток чехлика ничем не ограничен.
Распределение металлов по клеткам чехлика может изменяться в зависимости от присутствия Са. Так, в присутствии Cа (3 мМ), Pb и Sr были обнаружены только в по верхностных клетках чехлика (рис. 5н), а содержание Ni во всех клетках чехлика было ниже, чем в отсутствие Са, что может быть связано с конкуренцией за общие места связывания при транспорте и поступлении ионов в корень. Наиболее выражено явле ние конкуренции наблюдается в случае Pb, Sr, так как Са также транспортируется преимущественно по клеточным оболочкам [White, Broadley, 2003].
Разные клетки корневого чехлика кукурузы почти в равной степени накапливают Ni, в то время как клетки чехлика гипераккумулятора Thlaspi caerulescens существенно отличаются по этой способности: содержание Ni в клетках колумеллы намного пре вышало его содержание в периферическом слое клеток и клетках, примыкающих к инициалям. Следовательно, клетки корневого чехлика у разных видов растений разли чаются по способности накапливать Ni. Пока еще неясно, насколько эти различия обу словлены различиями между исключателями и гипераккумуляторами.
Апикальная меристема корня и зона растяжения. Меристема и зона растяжения характеризуются наличием не полностью дифференцированных тканей.
В меристеме корня находится небольшая группа клеток, названная «покоящимся центром». Содержание Cd и Pb в клетках покоящегося центра проростков кукурузы было ниже, чем в окружающих клетках меристемы, в то время как содержание Sr в клетках покоящегося центра и окружающих его клетках заметно не отличалось (рис.
5м). До конца неясно, какие особенности строения апопласта клеток покоящегося центра определяют ограниченное поступление в них Cd и Pb. Так как транспорт этих металлов происходит преимущественно по апопласту, предполагается, что структура клеточных оболочек и плазмалеммы этих клеток отличаются от структуры оболочек и плазмалеммы окружающих клеток меристемы, что и снижает поступление этих металлов в покоящийся центр [Wierzbicka, 1987]. Однако эти особенности клеточных оболочек клеток покоящегося центра практически не ограничивают поступление Sr, что, по крайней мере отчасти, может определяться более высоким по сравнению со Sr сродством Cd и Pb к материалу оболочек.
Не исключено, что апопласт клеток покоящегося центра проницаем для ионов Sr, как он, вероятно, проницаем и для Са [Peterson, Cholewa, 1998], аналогом которого является Sr.
В незначительной степени ограничивается поступление в покоящийся центр веществ по симпласту. Содержание Ni в покоящемся центре кукурузы было лишь несколько ниже, чем в окружающих тканях меристемы. Можно полагать, что это связано с меньшим, по сравне нию с окружающими клетками, количеством плазмодесм между клетками покоящегося центра и клетками окружающих тканей [Clowes, Juniper, 1964].
Таким образом, в зонах деления и растяжения отсутствуют физиологические барьеры для радиального передвижения как «апопластических», так и «симпластических» ионов металлов.
Распределение металлов в меристеме зависит от присутствия Са, однако его влия ние неоднозначно для разных видов растений. Накопление металлов в апексе кукуру зы в присутствии Ca уменьшается (рис. 5о, з). Sr обнаруживается только в поверхно стных слоях клеток, тогда как Ni поступает вглубь меристемы. Меньшая конкуренция между Ni и Са по сравнению со Sr и Са может определяться преимущественным транспортом Са [White, 1998;
White, Broadley, 2003] и Sr по апопласту, в то время как Ni транспортируется в апикальном участке корня главным образом по симпласту. Рас пределение Ni в присутствии Са становится еще более неравномерным по сравнению с его распределением в отсутствие Са. Более интенсивно окрашивается слой клеток, примыкающий к калиптрогену, периблема и проводящие ткани. В клетках незрелой метаксилемы Ni накапливался в протопластах и, особенно, – на границе с ядерной обо лочкой. Важно, что ядра в присутствии Ca практически не окрашивались (рис. 6в). Все это может быть причиной снижения токсического действия тяжелых металлов и Sr на рост корня в присутствии Ca (рис. 1а, 3а).
В апикальном участке корня амаранта в присутствии Ca накапливалось существен но больше Pb, чем в его отсутствие (рис. 4и, к), что сопровождалось усилением рос тингибирующего действия (рис. 3в). Одним из возможных объяснений такого измене ния в распределении и накоплении Pb является предположение о том, что Pb, накапли вающийся в клеточных оболочках может поступать туда из симпласта посредством «контейнерных перевозок» с участием пузырьков Гольджи. Этот процесс является Са зависимым, а следовательно, в присутствии Са содержание Pb увеличивается [Antosiewicz, 2005]. Несмотря на то, что эта гипотеза нуждается в дальнейшем под тверждении, становится очевидным, что для одного и того же металла пути его посту пления в корень могут различаться у разных видов растений.
Молекулярный механизм защитного действия Ca изучен еще недостаточно. Пока зано участие в поступлении тяжелых металлов Са(II)-транспортера пшеницы LCT [Clemens et al., 1998] и других переносчиков [Rogers et al., 2000;
Kochian, 2000], а также Са каналов [Perfus-Barbeoch et al., 2002;
Ehlken, Kirchner, 2002] и фитосидеро форов [Kochian, 2000]. Возможно, катион-связывающие участки транспортеров и ка налов имеют более высокое сродство к ионам Са, чем к ионам тяжелых металлов. По этому существует пороговая концентрация (3мМ), при превышении которой ионы Са конкурируют за общие места связывания, в том числе и на переносчиках, в результате чего поступление тяжелых металлов снижается (рис. 8). В присутствии Ca меньшее накопление тяжелых металлов в корне происходит за счет физико-химических про цессов, основанных на конкуренции за поглощение между ионами Ca и ионами тяже лых металлов. При замене Ca на Sr, ионы которого имеют сходные с Са физико химические свойства, но который не играет функциональной роли, свойственной Са [Костюк, 1986], накопление Ni и его ростингибирующее действие уменьшалось в той же степени, что и в присутствии Са (рис. 8). Накопление Sr в тканях в присутствии Ni также уменьшалось.
Рис. 8. Прирост корня кукурузы (в % от соответствующего контроля) на растворе 35 мкМ Ni(NO3)2 в присутствии Ca(NO3)2 (а) и влияние Sr на ростингибирующее действие Ni (б).
Представляют интерес данные, касающиеся изменения соотношения между Са и Ni в надземных органах ярутки при увеличении концентрации Ni в растворе. Уста новлена отрицательная корреляция между содержанием этих двух элементов, которая прослеживалась только для двух экотипов T. caerulescens (St.Felix и Prayon), тогда как для экотипа Lellingen её не наблюдалось, а у T. perfoliatum она прослеживалась только для черешков листьев (рис. 6к, л). Последнее явление пока трудно объяснить. Умень шение содержания Ca при увеличении концентрации Ni в растворе, вероятно, можно рассматривать не только как результат конкуренции за общие места связывания при поглощении и транспорте, но и как один из механизмов токсического действия Ni.
Можно предположить, что несмотря на различия в распределении, поступление Ni, Sr и Ca в корень опосредовано сходными механизмами, например, через Са каналы. Од нако должны существовать и другие пути поступления металлов, так как Са каналы большую часть времени остаются закрытыми, в результате чего поддерживается низ кая концентрация Са в цитоплазме [White, 2000;
White, Broadley, 2003].
Таким образом, ткани апикального участка корня исключателей, где отсутствуют физиологические барьеры для радиального передвижения металлов, можно рассмат ривать в качестве тканей-накопителей, где металлы накапливаются только в отсутст вие ионов конкурентов.
Рассмотрев особенности распределения и передвижения изучаемых металлов в растущем участке корня, остановимся более подробно на распределении и передвиже нии металлов в зоне корневых волосков и зоне дифференцированных тканей.
Ризодерма. При выращивании проростков кукурузы на растворах солей тяжелых металлов, они выявлялись в клетках ризодермы (рис. 6г), причем их содержание, как и в других тканях, увеличивалось со временем.
Ризодерма всех изученных нами видов состоит из удлиненных, расположенных в один слой клеток (рис. 4а). Клетки ризодермы (трихобласты) способны к образованию корневых волосков. Вопрос о их роли в поглощении металлов остается мало изучен ным. С одной стороны, при выращивании проростков кукурузы на растворах тяжелых металлов в чашках Петри, все изученные металлы были обнаружены в хорошо разви тых корневых волосках. С другой стороны, в водной культуре, когда новые корневые волоски у кукурузы развиваются очень слабо, металлы также беспрепятственно по ступали в ткани корня, из чего можно заключить, что само по себе наличие корневых волосков не определяет поступление металлов в корень.
Не исключено, что роль ризодермы в поглощении и накоплении различных тяже лых металлов неодинакова. Так, например, Сd, Pb и Sr обнаруживались главным обра зом в апопласте клеток ризодермы, в то время как Ni накапливался преимущественно в протопластах (рис. 6г). Накопление Zn в атрихобластах и трихобластах обоих видов ярутки существенно различалось: Zn накапливался главным образом в трихобластах и растущих корневых волосках (рис. 7), чего не наблюдалось для других металлов..
Первичная кора. Значительную часть площади поперечного сечения корня зани мают клетки коры (рис. 6г). Кора значительно увеличивает диаметр и площадь по верхности корня, что может играть важную роль в накоплении тяжелых металлов. Од нако распределение разных металлов, в том числе и в клетках коры, существенно раз личается. Вклад клеток коры в накопление металлов, транспорт которых происходит по апопласту или по симпласту, будет неодинаков. Для ионов, передвигающихся по апопласту (Сd, Pb, Sr), наиболее важную роль будет играть «емкость апопласта» кле ток коры, которая включает межклетники, клеточные оболочки и периплазматическое пространство. Для металлов, накапливающихся преимущественно в протопласте (Ni) важна «общая емкость протопласта» клеток коры. Вероятно, чем выше эти показатели для данного вида растений, тем больше металла может накапливаться в соответст вующем компартменте. Важно, что основной объем зрелых клеток коры занимает цен тральная вакуоль, а слой цитоплазмы местами не превышает толщины клеточных обо лочек [Данилова, Стамболцян, 1975]. Основываясь на этих общих предположениях, сравним вклад апопласта и протопласта в связывании ионов.
Емкость апопласта зависит от объема межклетников и катионобменной способно сти клеточных оболочек, что в свою очередь зависит как от их состава, так и от срод ства ионов металлов к материалу оболочек.
При выращивании растений в присутствии Сd и Pb, их высокое содержание было выяв лено в клеточных оболочках кукурузы (рис. 4б, г), люпина (рис. 4ж, з), амаранта (рис. 4к).
Однако прочность связи различных ионов металлов с компонентами клеточной оболочки неодинакова. Она коррелирует с величиной констант стабильности (log K) комплексов ме таллов с карбоксильными группами углеводов. Для Pb, например, log K равен 6.4, а для Сd – 4.9 [Рудакова и др., 1988]. Сродство других тяжелых металлов к полигалактуроновой ки слоте уменьшается в ряду: Pb Cr Cu Ca Zn [Ernst et al., 1992]. Как результат, Pb свя зывается с материалом клеточных оболочек сильнее, чем Cd, Zn и Sr, а следовательно и скорость его передвижения по апопласту наименьшая. Среди изученных ионов Sr наиболее мобилен. Сравнение констант стабильности ясно показывает, что тяжелые металлы могут успешно конкурировать с Са за места связывания в «замковых зонах» пектинов.
Клеточные оболочки, связывая большое количество металлов, могут ограничивать их поступление в цитоплазму. Связывание металлов в клеточных оболочках, главным образом, клеток коры, можно рассматривать как один из морфофизиологических ме ханизмов детоксикации, направленный на изоляцию металла в метаболически малоак тивном компартменте клетки. Многослойную кору растений-исключателей можно рассматривать в качестве ткани-аккумулятора для ионов металлов, обладающих высо ким сродством к материалу оболочек и пониженной способностью поступать внутрь клетки (Pb и в меньшей степени – Cd). Кора является тканью-аккумулятором только в том случае, когда экзодерма не выполняет барьерной роли, а эндодерма, напротив, выполняет роль барьера, ограничивающего поступление тяжелых металлов в цен тральный цилиндр. Если же барьерной роли эндодерма не выполняет и поток ионов в более глубокие ткани корня не ограничен, то и в коре металл будет выявляться, но не накапливаться, как это наблюдается в случае Sr (рис. 5а) и Zn (рис. 7).
Емкость апопласта определяется не только связыванием металла материалом кле точных оболочек, но и их поступлением в периплазматическое пространство и накоп лением на поверхности протопласта. Действительно, Pb, Sr (рис. 4д, 5ж) и Cd были найдены не только в самих клеточных оболочках, но и на поверхности протопласта, что четко демонстрирует характер распределения металлов в плазмолизированных клетках. Более сложная ситуация прослеживается в случае Ni. В плазмолизированных клетках он был обнаружен как внутри протопласта, так и в периплазматическом простран стве. Хотя Ni выявлялся в межклетниках, в самих клеточных оболочках его содержание было низким (рис. 6д), что, вероятно, определяется его низким сродством к их материалу.
Таким образом, наряду с клеточными оболочками, играющими роль аккумулятора тя желых металлов, плазмалемма играет роль важнейшего внутриклеточного барьера, ограни чивающего проникновение Cd, Pb и Sr в цитоплазму. Возможность симпластного транс порта для ионов Cd, Pb и Sr ограничена, хотя и не исключена полностью. Накапливаясь на поверхности протопласта, тяжелые металлы вызывают разнообразные нарушения в строе нии и функционировании плазматической мембраны [Meharg, 1993;
Ouariti et al., 1997], в результате чего их поступление в клетки может увеличиваться пассивно. Все эти измене ния, наряду с инактивацией мембранных ферментов, могут привести к нарушению ионного гомеостаза в клетке.
Накопление Cd и Pb в клетках коры обуславливает токсическое действие на них тяжелых металлов. Однако накопление металлов в клетках коры приводило их к гибе ли только при концентрациях, полностью ингибирующих рост корня, что было пока зано при использовании красителя проционового яркоголубого RS, проникающего только в мертвые клетки (рис. 9а). Накопление Cd в клетках наружной коры может быть также одной из причин утолщения клеточных оболочек этих клеток, которое оценивали по их автофлуоресценции и которое наиболее четко наблюдалось на рас стоянии 3-4 см от кончика корня (рис. 9б). Подобные модификации оболочек могут иметь важное значение, ограничивая поступление металлов по апопласту.
Рис. 9. (а) – отмирание клеток ризодермы и наружной коры апикального участка корня после инкубации проростков кукурузы на растворе Pb(NO3)2 (0.1 мМ) в течение 24 ч, (б) – утолщение клеточных оболочек коры корня на расстоянии 3-4 см от кончика после инку бации в течение 5 суток в присутствии 38 мкМ Сd(NO3)2 (автофлуоресценция). Обозначе ния как на рис 4. ЦЦ – центральный цилиндр.
Гистохимический анализ распределения Ni при разных условиях эксперимента по казал, что в клетках коры корня кукурузы, за исключением внутренней коры, содер жание Ni на единицу площади клетки невелико. Накопления значительного количест ва металла в вакуоли также, по-видимому, не происходит (рис. 6д). Таким образом, для «апопластических» ионов кора является важнейшей тканью-аккумулятором, в то время как для «симпластических» ионов тяжелых металлов ее роль сводится только к передвижению металлов по радиусу корня и накоплению во внутренней коре.
Клеточные оболочки наружного слоя коры (экзодермы) в базальном участке корня кукурузы утолщаются, в результате чего экзодерма часто рассматривается в качестве апопластического барьера [Hose et al., 2001]. Металлы, передвигающиеся по апопласту (Сd, Pb), аккумулируются во всех слоях клеток коры (рис. 4б), хотя в базальном участ ке корня их содержание в более внутренних от экзодермы слоях клеток ниже. Как по казали исследования с локальным воздействием высоких концентраций Cd и Pb на ог раниченный участок корня, вертикальное передвижение этих металлов по клеткам ко ры ограничено. Отсюда можно полагать, что часть металлов проходит через модифи цированные клеточные оболочки экзодермы. Ni накапливался в протопластах клеток экзодермы в базальном участке корня, в то время как содержание металла в подлежа щем слое коры было существенно ниже. Sr, в отличие от Cd, Pb и Ni, свободно посту пал через клетки экзодермы в прилежащие ткани (рис. 5). Все эти данные свидетельст вуют о том, что барьерная функция экзодермы, так же как и в случае эндодермы, не универсальна. Именно эффективность тканевых барьеров (экзо- и эндодермы) наряду с другими факторами, рассмотренными выше, определяет функционирование всей ко ры или только наружного ее слоя в качестве ткани-аккумулятора.
У всех изученных экотипов гипераккумулятора T. caerulescens и у исключателя T.
arvense кора представлена только двумя слоями клеток. Ni не накапливается в клетках коры корня T. caerulescens вплоть до концентрации соли Ni в растворе 400 мкМ (рис.
6ж), что в 20 раз больше концентрации, при которой Ni накапливался в коре корня T.
arvense и в 5 раз больше концентрации, при которой наблюдалось высокое содержание Ni во всех тканях корня кукурузы. Принимая во внимание, что большинство гиперак кумуляторов представляют собой растения с маленькой биомассой и низкой скоро стью роста, можно предположить, что аккумулирующая способность корневой систе мы у таких видов понижена, но взамен этого они обладают более эффективными ме ханизмами транспорта металлов в надземные органы.
Одно из возможных объяснений данного явления заключается в том, что растения T. caerulescens неспособны эффективно транспортировать Ni в вакуоли клеток корня, в то время как у T. arvense он закачивается в вакуоль. Эта точка зрения согласуется с результатами Lasat с соавт., которые показали, что вакуолярная фракция Zn у T.
caerulescens была меньше, чем у T. arvense [Lasat et al., 1998]. Немаловажную роль в этом могут играть низкомолекулярные хелаторы, такие как гистидин, на чем мы более подробно остановимся ниже.
Таким образом, первичная кора корня исключателей является основной аккумули рующей тканью для ряда тяжелых металлов, способность клеток которой накапливать металлы зависит как от сродства ионов к функциональным группам пектинов оболоч ки, так и от эффективности функционирования экзодермального и эндодермального барьеров.
Эндодерма. Хорошо известно, что эндодерма является важнейшим функциональ ным барьером, ограничивающим поступление Pb в центральный цилиндр корня у це лого ряда видов [Wierzbicka, 1987;
Ksiazek, Wozny, 1990;
Tung, Temple, 1996]. Аналогич ные данные были нами получены на корнях однодольных (кукуруза) и двудольных (люпин) растений. Pb был обнаружен главным образом в ризодерме и коре (рис. 4б, в, з). Эндодерма у 3-4 дневных проростков вышеупомянутых видов в среднем участке корня находилась на разных стадиях развития. В то время, как у кукурузы выявлялись только пояски Каспари, у люпина утолщение распространялось и на внутренние тан гентальные клеточные оболочки. Следовательно, для ограничения транспорта Pb дос таточно формирования поясков Каспари и необязательно развития субериновой пла стинки и U-образных утолщений. Так как пояски Каспари присутствуют фактически у всех сосудистых растений [Peterson, Cholewa, 1998], можно полагать, что барьерная роль эндодермы для ионов Pb и аналогичных веществ, транспорт которых происходит по апопласту, универсальна для всех видов растений.
Барьерная роль эндодермы определяется не только суберинизацией клеточных оболочек, но и малой проницаемостью плазмалеммы, плотно прилегающей к оболочке в области пояска [Данилова, 1974]. В результате передвижение ионов по периплазма тическому пространству становится невозможным, а клетка получает возможность контролировать поступление ионов в симпласт, а следовательно, и в центральный ци линдр. Поэтому существует определенный концентрационный порог токсичных ионов в апопласте (скорее всего – в периплазматическом пространстве), при превышении ко торого нарушается структура и функционирование плазмалеммы, увеличивается ее проницаемость, а следовательно, ионы металлов беспрепятственно проходят в ткани стелы. Действительно, при летальных концентрациях Pb в растворе, он был обнаружен во всех тканях корня уже после первых суток инкубации (рис. 4г). Важно, что при данной концентрации, как показали исследования с использованием проционовых красителей, клетки эндодермы оставались живыми (рис. 9а). Следовательно, некон тролируемое поступление Pb в центральный цилиндр было обусловлено только нару шением проницаемости мембраны эндодермы, а не являлось следствием отмирания ее клеток.
Важно выяснить, насколько универсальна барьерная роль эндодермы для разных ионов. Транспортируясь по апопласту клеток коры, Sr, в отличие от Cd и Pb, уже через сутки после начала инкубации был обнаружен во всех тканях корня (рис. 5а, б). Про никновение металлов через эндодерму не может быть результатом изменения свойств гидрофобного слоя поясков Каспари или особенностей упаковки и состава углеводов клеточных оболочек в корнях. При передвижении через эндодерму ионы должны пройти через цитоплазму этих клеток. Содержание Sr в эндодерме было достаточно высоким, причем интенсивное окрашивание, свидетельствующее о его присутствии, было обнаружено в протопластах клеток (рис. 5а). Исходя из этого, можно предполо жить, что его транспорт через эндодерму осуществляется по симпласту.
Поступление Ni в протопласты клеток определяет иное, по сравнению с Cd и Pb, распределение по тканям корня. Уже на вторые сутки инкубации Ni был выявлен во всех тканях корня, включая центральный цилиндр (рис. 6а). Однако эти данные еще не свидетельствуют о том, что эндодерма проницаема для ионов Ni. Ni, так же как Cd и Pb, мог поступать в центральный цилиндр через апикальный участок корня, где поя ски Каспари еще не развиты. Для выяснения этого вопроса проростки кукурузы инку бировали на растворах с нетоксичной концентрацией Ni(NO3)2 (1 мкМ). В этих опытах кончик корня отрезали, а поверхность среза замазывали ланолином или вазелином, ко торые предотвращали поступление Ni в корень через поверхность среза. Размер отре занного участка корня составлял 1 см, что незначительно превышало в совокупности длину зоны деления и растяжения у проростков кукурузы. Отсутствие Ni под ланоли новым чехлом свидетельствовало как об ограниченном поступлении металла из выше лежащего участка корня, так и об отсутствии существенного проникновения Ni через ланолин или вазелин. Однако в базальном участке корня Ni был обнаружен не только в ризодерме и коре, но и в тканях центрального цилиндра, и особенно в эндодерме.
Таким образом, эндодерма проницаема для ионов Ni, хотя в интактных корнях нельзя исключить их поступление через апикальный участок корня. Cтепень прони цаемости эндодермы для ионов Ni невысока. В тканях центрального цилиндра и даже в перицикле содержание Ni было ниже, чем в эндодерме (рис. 6а, е). Об этом можно судить, так как клетки эндодермы, перицикла и ксилемной паренхимы имеют соизме римый размер на поперечном срезе. Можно предположить, что накопление большого количества Ni в эндодерме определяется как наличием в этих клетках крупной вакуо ли [Grymaszewska, Golinowski, 1987], так и присутствием большого количества белка, о чем свидетельствует интенсивное окрашивание клеток эндодермы проционовым си ним RS. В этом проявляются свойства эндодермы как ткани-аккумулятора Ni при по тере ее барьерных свойств.
Следовательно, барьерная роль эндодермы для Сd и Pb характерна для растений исключателей из разных классов цветковых растений и в этом отношении, по видимому, универсальна. В то же время барьерная роль эндодермы не универсальна для разных металлов (Ni, Sr) и зависит от способа передвижения металлов по тканям корня, что в свою очередь может определяться как физиологическими особенностями растений, так и физико-химическими свойствами ионов металлов.
Распределение Ni в клетках эндодермы исключателей и аккумуляторов различает ся. У кукурузы эндодерма играет роль аккумулятора Ni, в то время как у T.
caerulescens содержание Ni в клетках эндодермы было часто ниже предела определе ния гистохимического метода даже при концентрации Ni(NO3)2 в растворе в 5 раз большей (рис. 6ж). Маловероятно, что Ni поглощается и поступает в проводящие тка ни только в апикальном участке корня, где всегда наблюдается наиболее интенсивное окрашивание тканей. Надо полагать, что наряду с незначительной аккумулирующей способностью клеток коры корня T. caerulescens, эндодерма проницаема для Ni и не участвует в его накоплении. В отличие от T. caerulescens, клетки корня T. perfoliatum и T. arvense накапливали определяемые количества Ni в клетках коры и эндодермы при концентрации Ni(NO3)2 в растворе в 20 раз меньше. Понятно, что токсическое дейст вие Ni на клетки корня исключателей будет больше, чем у гипераккумуляторов. От сутствие барьерной роли эндодермы у ярутки показано также для Sr и Zn (рис. 7).
Итак, в отличие от Сd и Pb, Ni способен поступать в центральный цилиндр через эндодермальный барьер, и эта способность проявляется в большей степени у расте ний-гипераккумуляторов. Такие особенности передвижения и распределения Ni могут являться одной из причин наличия в природе намного большего числа растений гипер аккумуляторов Ni по сравнению с аккумуляторами Cd и Pb [Salt, Ensley, 2000].
Перицикл и паренхима стелы. Роль клеток перицикла в передвижении ионов, в том числе и тяжелых металлов, мало изучена. Металлы, которые не проникают через эндодермальный барьер (Сd и Pb), практически не поступают в клетки перицикла (рис.
4з). Однако ионы, которые проходят через эндодерму по симпласту, выявляются в пе рицикле. Среди изученных металлов локализация Ni и Sr в перицикле существенно различалась: Ni накапливался в протопластах клеток перицикла проростков кукурузы (рис. 6а, г, е), в то время как Sr выявлялся преимущественно в клеточных оболочках (рис. 5в, и). Полученные данные свидетельствуют о том, что Sr, пройдя через эндо дерму по симпласту, вновь транспортируется через плазмалемму и выходит в апо пласт. Можно предположить, что Sr, так же как и Са, поступает в симпласт эндодер мальных клеток через Са каналы и транспортируется через мембрану посредством Са2+-АТФазы или Са2+/Н+ антипортера в клетках стелы на границе с эндодермой [White, 1998].
Содержание Ni в клетках перицикла, хотя и меньше, чем в эндодерме, но зачастую гораздо больше, чем в клетках ксилемной паренхимы (рис. 6а, г, е), в то время как преимущественного накопления Sr в клетках перицикла кукурузы по сравнению с дру гими тканями центрального цилиндра не наблюдалось (рис. 5в, е, и). При сходных размерах этих клеток на поперечном срезе, мы можем сравнивать содержание метал лов на единицу площади клеток по интенсивности их окрашивания. Уменьшение ин тенсивности окрашивания клеток ксилемной паренхимы по сравнению с перициклом свидетельствует о том, что поступление Ni из клеток перицикла в другие ткани цен трального цилиндра ограничено. Причина ограниченного поступления Ni в ткани сте лы может заключаться в том, что транспорт Ni в центральном цилиндре происходит по симпласту, а большая часть плазмодесм в перицикле расположена в наружных тан гентальных и радиальных оболочках клеток перицикла. Только около 10% плазмодесм у 7-дневных проростков злаков находилось на внутренних тангентальных оболочках [Vakhmistrov, 1981;
Вахмистров, 1991]. Ясно, что у таких исключателей как кукуруза, перицикл играет роль «кольцевого коллектора», накапливающего Ni, возможно еще и благодаря высокому содержанию белка, являясь, таким образом, одновременно и тка нью-аккумулятором. Впервые коллекторная роль перицикла для ионов калия была по казана Д.Б. Вахмистровым [Вахмистров, 1991]. При мощном поступлении Ni из кле ток коры, клетки эндодермы и перицикла структурно имеют значительно меньший «выход», аккумулируя тем самым Ni в протопласте. Конечно, подобное явление было бы невозможным, если бы ионы Ni были способны, подобно Sr, проходить через плаз малемму клеток стелы и транспортироваться по апопласту.
В отличие от Ni, содержание Sr в клеточных оболочках клеток перицикла и цен трального цилиндра уже после двух суток инкубации было приблизительно одинако во. Роль перицикла как «коллектора» ионов свойственна, по-видимому, только для ио нов, передвигающихся по симпласту.
Важно установить, играет ли перицикл роль коллектора у гипераккумуляторов.
При изученных концентрациях Ni, его накопления в перицикле Thlaspi caerulescens не происходило. Следовательно, в корнях гипераккумуляторов отсутствуют не только барьеры для передвижения Ni, но и, что возможно более важно, – отсутствуют ткани аккумуляторы и ткани-«коллекторы» и, как следствие, корневая система не играет барьерной функции, свойственной исключателям. Причины этих различий могут скрываться как в структурных, так и в физиологических особенностях клеток этих тканей.
Клетки перицикла, расположенные против сосудов ксилемы, наряду с признаками дифференцированных тканей, несут черты ультраструктуры, характерные для мери стем, что играет важную роль в заложении и развитии боковых корней. Развитие боко вых корней устойчиво к действию большинства тяжелых металлов (табл. 1). Однако причины этой устойчивости различаются. С одной стороны, металлы могут не посту пать в перицикл (Сd и Pb) и поэтому не влиять на ветвление корня. С другой стороны, металлы могут проходить через эндодерму, но накапливаться в клетках перицикла в метаболически-малоактивном компартменте – клеточных оболочках. Это свойственно Sr, что наряду с его слабой токсичностью, обуславливает нормальное заложение боко вых корней. Уникальным в этом отношении является Ni, для которого перицикл явля ется аккумулятором и «коллектором». Накапливаясь в протопласте и обладая высокой цитотоксичностью, Ni ингибирует ветвление корня, что наблюдалось также у проро стков риса даже при более низких, чем в наших экспериментах, концентрациях Ni в растворе [Samantaray et al., 1997].
Ингибирующее действие Ni на образование боковых корней не наблюдалось у T.
caerulescens, что связано с низким содержанием Ni в клетках перицикла даже при кон центрации соли Ni в растворе в 10 раз большей, чем для кукурузы. Перицикл гиперак кумуляторов не играет роли аккумулятора и «коллектора» Ni и не препятствует его поступлению в ксилему.
Итак, устойчивость образования боковых корней у исключателей в присутствии тяжелых металлов определяется либо ограниченным их поступлением в клетки пери цикла (Cd или Pb), либо накоплением металла в клеточных оболочках (Sr). Различия в ответе на Ni у исключателей и гипераккумуляторов определяются, по-видимому, раз личиями в накоплении Ni в перицикле как результат отсутствия аккумулирующей и коллекторной функции перицикла у гипераккумуляторов.
Паренхимные клетки стелы включают в себя ксилемную паренхиму и паренхиму сердцевины, клетки которых отличаются по своей структуре. Клетки ксилемной па ренхимы в корнях кукурузы имеют утолщенные клеточные оболочки, что также отли чает их от паренхимы первичной коры [McCully, Canny, 1988]. Поступая через эндо дермальный барьер, уже через сутки после начала инкубации Sr выявлялся в апопла сте клеток всех тканей стелы (рис. 5б), что, казалось бы, находится в противоречии с данными о структурных особенностях клеточных оболочек этих клеток. Однако дан ное противоречие легко объяснить, если принять во внимание, что прочность связыва ния Sr с материалом клеточных оболочек невысока. Кроме того, значительная часть металла находится на поверхности клеточных оболочек или в периплазматическом пространстве (рис. 5ж). В совокупности это может определять высокую мобильность Sr, в результате чего модификация клеточных оболочек паренхимы стелы не ограни чивает его передвижение в более глубокие ткани корня, в том числе в клетки сердце вины (рис. 5б, в, е, и).
Чтобы проверить, для всех ли ионов металлов апопласт ксилемной паренхимы также проницаем, как для ионов Sr, было изучено распределение Cd и Pb в разрезан ных вдоль корнях. У таких корней ветвление корня не ингибировалось в присутствии Cd и Pb, хотя эндодерма уже и не выполняла барьерной функции. Этот факт заставля ет предположить, что проницаемость апопласта коры и центрального цилиндра для ионов Cd и Pb различна. При гистохимическом исследовании распределения Cd и Pb в разрезанных вдоль корнях было обнаружено, что Cd и Pb проникали только через 2- слоя клеток от поверхности разреза, тогда как по коре они доходили до эндодермы.
Принимая во внимание, что Cd и Pb могут поступать в стелу и проводящие ткани че рез апекс корня, где отсутствуют физиологические барьеры для передвижения ионов, клетки ксилемной паренхимы можно рассматривать в качестве избирательного, не универсального для разных ионов, барьера, ограничивающего их передвижение по апопласту центрального цилиндра. Данное предположение подтверждается накопле нием Cd и Pb только в паренхиме, окружающей сосуды метаксилемы, что для Pb под тверждается другими работами [Tung, Temple, 1996;
Pielichowska, Wierzbicka, 2004].
При различиях в транспорте разных ионов по апопласту стелы, транспорт по сим пласту ничем не ограничен. Ni, проходя через эндодермальный барьер поступал во все ткани стелы. Его содержание в протопластах клеток стелы было ниже, чем в эндодер ме и перицикле (рис. 6а), что определяется аккумулирующей ролью последних.
Проводящие ткани. Ведущая роль в дальнем транспорте ионов по ксилеме отво дится сосудам метаксилемы [McCully, 1995]. Основным принципом в организации тканей стелы корня является пространственное разделение флоэмы и ксилемы при не посредственном контакте каждой из этих тканей с перициклом. Cd и Pb в незначи тельных количествах выявлялись в проводящих тканях корня и побега, особенно при отсутствии ионов-конкурентов в среде, что еще раз свидетельствует о существовании в апикальном участке корня «обходного» пути поступления этих металлов в стелу. Sr уже через двое суток накапливался во всех тканях побега (рис. 5г, д), что свидетельст вует об отсутствии барьеров на пути его передвижения. Содержание Ni в надземных органах проростков кукурузы было незначительным. Одной из причин подобного ог раниченного поступления Ni в побеги исключателей может являться его накопление в областях перфораций между члениками сосудов метаксилемы (рис. 6б).
Вопрос о возможности транспорта металлов по флоэме до настоящего времени ос тается до конца не решенным. Как Sr, так и Ni были обнаружены во флоэмных эле ментах (рис. 5в, и, 6а). Возможность транспорта Ni по флоэме была показана ранее [Zeller, Feller, 1998], однако Sr такой способностью, по-видимому, не обладает [Koranda, Robinson, 1978;
Zeller, Feller, 2000] или эта способность ограничена.
Таким образом, у растений-исключателей низкое содержание металлов в надзем ных органах определяется барьерной функцией корневой системы. Для Cd и Pb эта функция определяется барьерной ролью эндодермы, в то время как для металлов, про ходящих через эндодермальный барьер (Ni), могут функционировать иные морфофи зиологические барьеры на уровне корня, например накопление в местах перфораций.
Все перечисленные барьеры, однако, не универсальны для всех металлов. В отличие от исключателей, у гипераккумуляторов функциональные барьеры на уровне корня и побега отсутствуют.
Ткани надземных органов растений. В побегах исключателей Сd, Pb и Ni были обнаружены в проводящих тканях, в эпидерме, а также, в случае Ni, в клетках эндо дермы мезокотиля кукурузы. Особенностью распределения Sr в надземных органах является его накопление во всех тканях побега (рис. 5г, д, к). В побеге кукурузы для Sr характерен апопластный транспорт, для которого в побеге не существует функцио нальных барьеров.
Иные закономерности распределения металлов можно проследить у гипераккуму ляторов, что четко проявляется в случае Ni и Zn. В то время как у исключателей тка нями-аккумуляторами являются отдельные ткани корня, то у гипераккумуляторов сходную роль играет эпидерма стебля и листа, в клетках которой наблюдается накоп ление Ni (рис. 6з) и Zn (рис. 7г, д). Повышенное содержание Ni в эпидерме листа было отмечено и у других гипераккумуляторов [Bidwell et al., 2004;
Broadhurst et al., 2004].
Роль отдельных клеток эпидермы в накоплении Ni различна и литературные дан ные в этом отношении крайне противоречивы. При сравнении распределения Ni у раз ных экотипов T. caerulescens было показано, что Ni накапливается преимущественно в крупных клетках эпидермы стебля, черешка листа и водозапасающих клетках эпидер мы листовой пластинки (рис. 6з), причем клетки нижней и верхней эпидермы листа различаются по способности накапливать Ni: в нижней эпидерме эти клетки аккуму лируют больше металла, чем те же клетки верхней эпидермы.
Само по себе существование подобных «емкостных» клеток в покровной ткани не определяет способность гипераккумуляторов накапливать Ni в надземных органах, так как подобные клетки, хотя и меньших размеров, имеются у T. arvense и T. perfoliatum.
Их существование является необходимой предпосылкой, определяющей способность к гипераккумуляции, которая проявляется только при отсутствии барьерной функции корневой системы и неограниченном поступлении металла в побег.
Можно ожидать, что если бы накопление Ni в эпидерме определялось бы только явлением транспирации, то наибольшее содержание Ni было бы обнаружено в клетках устьичного аппарата, что наблюдалось у T. caerulescens в случае Sr (рис. 5п). Вероят но, у гипераккумуляторов существует механизм, посредством которого Ni закачивает ся в «емкостные» клетки, хотя о его металлоспецифичности судить пока рано. Накоп ление в водозапасающих клетках эпидермы листовой пластинки было показано также для Cd [Cossio et al., 2005] и Zn, хотя содержание Zn в замыкающих клетках устьиц на единицу площади клетки было выше, чем в водозапасающих (рис. 7).
Анализируя полученные данные можно заключить, что все изученные металлы, за исключением Sr и Zn, не способны в какой-либо значительной степени проходить че рез плазмалемму клеток обкладки пучка и поступать в мезофилл. Именно эта особен ность обуславливает поступление Cd, Pb и Ni в клетки эпидермы листа. Накопление Ni в эпидермальных клетках гипераккумуляторов может иметь приспособительное зна чение.
Рассмотрев роль тканей корня и побега в передвижении и накоплении изучаемых металлов, остановимся более подробно на участии фитохелатинов и гистидина в де токсикации и транспорте тяжелых металлов.
Роль фитохелатинов в передвижении и детоксикации Cd и Pb. Несмотря на преимущественное накопление Cd и Pb в апопласте, незначительное их количество было обнаружено в протопластах клеток корня кукурузы (рис. 4, 10д), куда они посту пают разными путями. Из цитоплазмы большая часть металлов поступает в вакуоль посредством Ме2+/Н+ антипорта, существование которого дискуссионно [Salt et al., 1993;
Chardonnens et al., 1999;
Clemens, Simm, 2003] или энергозависимого транспорта с участием фитохелатинов [обзоры, Cobbett, 2000;
Серегин, 2001;
Clemens et al., 2002]. В вакуоли тяжелые металлы образуют трудно растворимые комплексы с органическими кислотами [Krotz et al., 1989;
Mazen, Maghraby, 1997/98], что является одним из механиз мов их детоксикации.
Фитохелатины представляют собой небольшие, богатые цистеином пептиды, способ ные связывать ионы тяжелых металлов через SH-группы, и играют наибольшую роль в детоксикации Cd [Rauser, 1999;
Cobbett, 2000;
Серегин, 2001;
Clemens et al., 2002], тогда как в детоксикации Ni участия не принимают [Schat et al., 2002]. Однако синтез фито хелатинов у проростков кукурузы впервые нами наблюдался и в присутствии Pb, хотя и в меньшей степени по сравнению с Cd (рис. 10г), что может определяться не только более ограниченным, по сравнению с Cd, поступлением Pb в цитоплазму, но и мень шей способностью последнего активировать фитохелатинсинтазу [Grill et al., 1989;
Chen et al., 1997]. Методом высокоэффективной хроматографии были обнаружены не только фитохелатины с C-терминальным глицином (PC2–PC5), но и гидроксиметил фитохелатины c C-терминальным серином (serPC2–serPC5) с наибольшим содержани ем изоформ с 2–3 -Glu-Cys остатками (рис. 10г). Содержание фитохелатинов в ба зальном участке корней кукурузы было в несколько раз выше, чем в апикальном, что противоречит ранее полученным данным [Tukendorf, Rauser, 1990], но согласуется с дан ными по содержанию металлов, которые были получены с помощью атомно-абсорбцион Рис. 10. Содержание GSH (а), Cd (б), serGSH (в) и фитохелатинов (PC) (г) после 5 сут ин кубации проростков кукурузы (38 мкМ Cd(NO3)2 или 10 мкМ Pb(NO3)2). У контрольных проростков serGSH и фитохелатины не обнаружены. А – апикальный участок корня (1-й см от кончика корня);
Б – базальный участок корня (3-й см от зерновки);
П – побег (ме зокотиль, колеоптиль и первая пара листьев). (д) – накопление Pb в апопласте коры ( ).
ВК – внутренняя кора. Повторность всех экспериментов трехкратная.
ного и гистохимического методов (рис. 10).
Индукция синтеза фитохелатинов согласуется с уменьшением содержания глута тиона (GSH) как в апикальном, так и в базальном участках корня, а также с накопле нием гидроксиметилглутатиона с С-терминальным серином (serGSH) (рис. 10а, в), что свидетельствует о том, что эти соединения являются субстратами для синтеза фитохе латинов.