Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий: свойства, разнообразие, диагностика

На правах рукописи

МУЛЮКИН Андрей Львович

ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ:

СВОЙСТВА, РАЗНООБРАЗИЕ, ДИАГНОСТИКА

Специальность: 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

МОСКВА – 2010

Работа выполнена в лаборатории классификации и хранения уникальных

микроорганизмов Учреждения Российской Академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова доктор биологических наук О.И. Баулина доктор биологических наук Н.Д. Новикова

Ведущая организация:

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН)

Защита диссертации состоится 01 ноября 2010 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Учреждении Российской Академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии наук Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Автореферат диссертации разослан « » сентября 2010 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу:

117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Ученому секретарю диссертационного совета к.б.н.

Т.В. Хижняк или по факсу: (499) 135 65 30.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и состояние вопроса. При изменении условий окру жающей среды - исчерпании питательных веществ, источников энергии и про странственных возможностей, происходит или снижение скорости роста микроор ганизмов, или стратегия роста заменяется стратегией переживания и перехода в состояние покоя. Начало исследований покоящегося состояния у микроорганиз мов положили работы Ф. Кона и Р. Коха, описавших в 1876 г. эндоспоры бацилл.

Наибольшую интенсивность и разносторонность изучение форм и механизмов покоя приобрело в середине ХХ века в рамках отдельного направления микро биологии. В настоящее время интерес к явлению покоя обусловлен явлением персистенции возбудителя туберкулеза [Wayne, 1994;

Zhang, 2004] и других забо леваний [Watson et al., 1998;

Бухарин и соавт. 2005], а также существованием вы антибиотикоустойчивых клеток-персисторов [Keren et al. 2004, Lewis, 2007] и, на конец, обнаружением древних микроорганизмов [Cano, Borucky, 1995;

Vreeland et al. 2000], в том числе, в глубокомерзлых породах [Звягинцев и соавт., 1985]. Од нако у большинства видов неспорообразующих бактерий покоящиеся формы не известны, что определило актуальность диссертационной работы.

Множество публикаций посвящено жизнеспособному некультивируемому (ЖНК) состоянию бактерий, в котором клетки, сохраняя потенциальную жизне способность, утрачивают способность образовывать колонии на плотных средах [Xu et al., 1982;

Colwell et al., 1985;

Oliver et al., 1993;

Mukamolova et al., 1995;

Oliver, 2005;

Sachidanandham, Yew-Hoong Gin, 2009]. Несмотря на дискуссии по поводу адекватности этого термина состоянию неделения и сохранения клетками жизнеспособности [Bloomfield et al. 1998;

Головлев, 1998;

Barer, Harwood, 1999], не вызывает сомнений существование самого явления и важность его исследова ний особенно в связи с мониторингом патогенных и условно-патогенных бакте рий в природных местах обитания. ЖНК-состояние рассматривают и как форму покоя [Kaprelyants et al., 1993;

Rahman et al., 1996], и как стадию на пути к отми ранию популяции [Joux et al., 1997;

McDougald et al., 1998]. Некоторые авторы считают, что пребыванием клеток в таком состоянии нельзя объяснить длитель ное выживание бактерий в неростовых условиях [Bogosian et al., 1996].

Облигатное свойство всех бактерий формировать в циклах развития их культур покоящиеся «микроцисты», предназначенные для выживания вида, по стулировалось Биссетом [Bisset, 1952]. Экспериментальные доказательства спра ведливости этой гипотезы – образование клеток цистоподобного типа, были по лучены позже для узкого круга микроорганизмов [Дуда и соавт., 1982;

Sadasivan, Neyra, 1987;

Бабусенко и соавт., 1991;

Garduo et al., 2002;

Berleman, Bauer, 2004].

При описании новых таксонов ряда неспорообразующих прокариот отмечалось образование клеток, схожих по строению с цистами [Горленко и соавт., 1976;

Жи лина, Заварзин, 1979;

Heulin et al., 2003;

Zhang et al., 2003;

Zhilina et al., 2004;

Ah med et al., 2007]. При этом в работах таксономической направленности не иссле довали их свойства как форм, предназначенных для длительного переживания ви да. Отсутствие информации о покоящихся формах неспорообразующих бактерий обусловлено, во многом, отсутствием сведений об условиях, оптимальных для их образования в лабораторных культурах. При этом без достаточного количества покоящихся клеток невозможно исследование их свойств. Следует отметить, что трактовка термина «покой» для неспорообразующих бактериям широка и охваты вает: (1) клетки культур стационарной фазы [Vuli, Kolter, 2001];

(2) некультиви руемые формы [Roszak, Colwell, 1987;

Kaprelyants et al., 1993];

(3) неактивные клетки в биопленках [Costerton et al., 1999;

Xu et al., 1998];

(4) антибиотико устойчивые персисторы [Shah et al., 2006];

(5) вышеупомянутые клетки цистопо добного типа. Это не тождественные состояния пролиферативного и метаболиче ского покоя. Основанием для отнесения клеток к покоящимся формам прокариот является доказательство: 1) длительного сохранения их способности к репродук ции;

2) резко сниженной или экспериментально не выявляемой метаболической активности;

3) повышенной устойчивости к повреждающим воздействиям;

4) от личий в ультраструктурной организации от вегетативных (делящихся и стацио нарных) клеток;

5) их образования в циклах развития культур – в соответствии с определением, принятым в литературе по спорам [Sudo, Dworkin, 1973;

Cross, Atwell, 1975;

Калакуцкий, Агре, 1977].

Другой важной проблемой при изучении способов выживания микроорга низмов в природе в неростовых условиях является выяснение закономерностей и регуляции образования покоящихся форм. К настоящему времени накоплен об ширный материал о сигнальных метаболитах и регуляторных системах, контро лирующих многие процессы в циклах развития микробных популяций, такие как длительность лаг-фазы, споро- и антибиотикообразование, реактивацию некуль тивируемых клеток микрококков и др. [Хохлов, 1988;

Fuqua et al., 1994;

Олескин и соавт., 2000;

Lazazzera, 2000;

DeLisa, Bentley, 2002;

Mukamolova et al., 1998;

2006].

Описаны плотностные ауторегуляторы – ацилированные гомосеринлактоны (ГСЛ) у ряда грамотрицательных бактерий, которые в зависимости от клеточной плотности популяции контролируют индукцию ряда синтезов в стационарной фа зе [Fuqua et al., 1994;

Greenberg et al., 1996;

Taga, Bassler, 2005]. Участие этих фак торов в регуляции состояния покоя неизвестно. Регуляторы другого типа - факто ры d1, представленные у ряда бактерий алкилоксибензолами (АОБ), имеют функ ции аутоиндукторов анабиоза [Эль-Регистан и соавт., 1979;

1980;

Светличный и соавт., 1986;

Осипов и соавт., 1985;

Батраков и соавт., 1993;

Лойко и соавт., 2002].

Безусловную важность представляет дальнейшее развитие исследований регуля ции образования покоящихся форм у широкого круга микроорганизмов, осущест вляющейся с участием коммуникативных факторов из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, а также изучение их видо(не)специфичности и функциональ ной роли в переходе клеток в состояние покоя и выходе из него.

Таким образом, изучение способов и форм покоя у неспорообразующих бактерий представляет фундаментальный и практический интерес для микробной экологии, медицины, биотехнологии.

Цель работы – изучить способы выживания неспорообразующих бактерий в не ростовых условиях: морфотипы покоя, условия и регуляцию образования и харак теристики покоящихся клеток.

В настоящей работе были поставлены следующие задачи:

(1) выявить условия, способствующие образованию цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий в циклах развития их культур;

(2) охарактеризовать ЦПК как формы покоя по показателям: длительности сохра нения пролиферативного потенциала;

отсутствия метаболической активности;

устойчивости к повреждающим воздействиям;

особенностям ультраструктур ной организации;

(3) охарактеризовать внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие по коящихся форм по морфологическим типам, способности ревертировать к рос ту, степени глубины покоя, устойчивости к повреждающим воздействиям, фе нотипической диссоциации при прорастании;

(4) изучить роль внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов в контроле перехода бактерий в состояние покоя и его поддержании;

(5) разработать подходы к диагностике покоящихся форм бактерий в лаборатор ных культурах и природных образцах.

Научная новизна и значимость работы Для широкого круга неспорообразующих грамположительных и грамотрица тельных бактерий доказано, что при их росте в различных условиях цикл развития культур завершается образованием цистоподобных клеток (ЦПК), обладающих всеми признаками покоящихся форм прокариот. Для массового образования ЦПК в лабораторных культурах разработаны воспроизводимые условия, имитирующие природные. Эти условия принципиально применимы для получения покоящихся форм бактерий других таксонов с учетом специфики их ростовых потребностей.

Впервые показано внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие по коящихся форм бактерий. Внутривидовое разнообразие проявляется как поли морфизм покоящихся клеток и зависит от условий их образования. Внутрипопу ляционное разнообразие покоящихся клеток определенного морфотипа выражает ся в их разнокачественности по устойчивости к повреждающим воздействиям, от клику на условия прорастания и потребности в специальных процедурах реакти вации. Показаны различия в способности покоящихся клеток разных типов к фе нотипической диссоциации. Расширены представления о функциях плотностных ауторегуляторов в процессах образования покоящихся форм. Продемонстрирова но видонеспецифичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных ал килоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК;

2) не образующих колонии клеток и 3) нежизнеспособных микромумий. Показана принципиально сходная и видонеспецифичная функция алкилоксибензолов и неацилированного гомосеринлактона в ограничении роста численности клеток популяции и смене стадий развития бактериальных культур.

Для повышения эффективности экологического мониторинга разработаны диагностические критерии для обнаружения ЦПК в природных образцах in situ, в том числе глубокомерзлых осадках. Критерии основаны на учете особенностей ультраструктурной организации покоящихся форм и соотношения в них ряда био генных элементов (Ca/K, P/S). Для покоящихся форм, не образующих колонии на обычных средах, применены разные методы учета и приемы выявления жизне способных клеток за счет варьирования состава сред для снятия эффекта суб страт-ускоренной смерти и защиты от окислительного стресса. Показана возмож ность повышения чувствительности ПЦР при использовании покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) как источников матриц ДНК.

Постулируется, что внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие по коящихся форм бактерий обеспечивает длительное, не сопоставимое со временем генерации клеток, выживание вида в природе при неблагоприятных для роста ус ловиях и его расселение при наступлении ситуаций, предусматривающих воз можность реверсии к росту.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть исполь зованы для: 1) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов;

2) разработки способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов;

3) повышения эф фективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга ок ружающей среды за счет учета покоящихся и не прорастающих на плотных сре дах клеток. Цистоподобные покоящиеся клетки сапротрофных аналогов патоген ных бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки дейст вия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов (АОБ) испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде 2 заявок на патенты РФ.

Личный вклад соискателя состоял в планировании и проведении исследований, разработке новых экспериментальных подходов, анализе полученных результатов и их оформлении для опубликования. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора состоял в непосредственном участии в определенных или всех эта пах исследования – от постановки задач и проведения экспериментов до обсужде ния полученных данных и подготовки их к опубликованию.

Апробация работы. Устные и стендовые сообщения на конференциях: Frontiers of Life (Блуа, Франция, 2000);

GeoExtreme Workshop (Тремити, Италия, 2001);

Bacterial Paleontology/Astrobiology (Москва, 2002);

Second European Workshop on Exo/Astrobiology (Грац, Австрия, 2002);

European Geophysical Society (Ницца, Франция, 2003);

1st и 2nd FEMS Congress European microbiologists (Любляна, Сло вения, 2003;

Мадрид, Испания, 2006);

35th Scientific Assembly COSPAR (Париж, 2004);

Российско-французском семинаре «Восток 2005» (Репино);

Open Science Conference SCAR-IASC-IPY (СПБ, 2008);

«Фундаментальные и прикладные ас пекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), «Физиология мик роорганизмов в природных и экспериментальных системах» (МГУ 2006;

2009).

Публикации: 74 работы: 37 экспериментальных статей, 2 обзора (38 в списке журналов ВАК), 3 главы в монографиях, 5 работ в материалах научных мероприя тий, 2 заявки на патент, 26 тезисов докладов.

Место проведения работы. Работа проводилась с 1994 по 2009 гг. в лаб. класси фикации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им.

С.Н. Виноградского РАН по плановым темам (№ гос/рег. 01200213054;

01200213058;

01200601980) при поддержке РФФИ (гранты 99-04-49144, 01-04 48771, 02-04-49150, 03-04-48403, 04-04-49710, 05-04-49520, 06-08-01469, 07-04 01011;

07-04-12121офи). Ряд исследований проведен в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Университете им. М.Лютера (Халле-Виттенберг, Германия), ФГУП Гос НИИОХТ, МИРЭА, КазНЦ РАН и Латвийском университете (Рига).

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность проф. Г.И. Эль Регистан и чл.-корр. РАН В.Ф. Гальченко за постоянное внимание и поддержку.

Искреннюю признательность за многолетнюю совместную работу выражаю со трудникам ИНМИ РАН: А.Н. Козловой, Ю.А. Николаеву, Н.Г. Лойко, Е.В. Дем киной, С.Н. Филипповой, Е.В. Менько, В.В. Сорокину, И.А. Цаплиной, Т.И. Бо гдановой. За плодотворное и длительное сотрудничество выражаю особую при знательность к.б.н. Н.Е. Сузиной и проф., В.И. Дуде (ИБФМ РАН), к.б.н. В.Н. Да нилевичу (ИБХ РАН). Автор благодарен проф. Л.И. Воробьевой, В.С. Соиной и Е.А. Воробьевой (МГУ), проф. А.С. Капрельянц (ИНБИ РАН), д.б.н. Л.П. Анто нюк (ИФБРМ РАН), Н.Б. Стражевской и проф. Р.И. Жданову (НИИ общей пато логии и патофизиологии), проф. В.П. Тычинскому (МИРЭА), Ю.В. Гоголеву (КазНЦ РАН), Н.А. Тилькуновой и Д.Ю. Залепугину (ГосНИИОХТ), Ю.Н. Тро фимовой (Латвийский университет) за совместные исследования. Выражаю при знательность д.г.-м.н. Д.А. Гиличинскому (ИБиФХПП РАН) за образцы вечно мерзлых пород. Благодарю всех соавторов публикаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 349 страницах текста и включает 86 рисунков и 51 таблицу;

состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы (100 рус ских и 628 иностранных наименований).

Основные защищаемые положения:

1. Широкому кругу неспорообразующих бактерий свойственен переход в состоя ние эндогенного покоя, являющегося необходимой стадией в циклах развития их культур. Его формой являются цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК), обладающие всеми признаками покоящихся форм прокариот.

2. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм проявляется как образование ЦПК разных типов при развитии микробной популяции (культуры) в различ ных условиях ее роста и является важным эволюционно приобретенным свой ством для длительного выживания вида.

3. Популяции покоящихся форм гетерогенны по показателям их устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия роста, потребности в проце дурах реактивации и популяционному спектру в новом цикле развития.

4. Покоящиеся формы бактерий можно выявлять по их диагностическим крите риям прямыми микроскопическими методами, более полно учитывать культу ральными методами и использовать в ПЦР.

5. Процессы приобретения, развития и поддержания состояния покоя контроли руются внеклеточными видонеспецифичными низкомолекулярными ауторегу ляторами, представленными у ряда бактерий моно- и диалкилоксибензолами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований Объекты исследований. Штаммы бактерий из коллекций ВКМ, NCIMB, каф. микробиологии биологического ф-та МГУ и ИБФРМ РАН: 1) спорообра зующие Bacillus cereus штамм В-504 (ВКМ), B. subtilis В-720 (ВКМ), B licheniformis (промышленный штамм 103), Sulfobacillus thermosulfidooxidans B 1269 (ВКМ), Alicyclobacillus tolerans В-2304 (ВКМ);

2) грамположительные не спорообразующие: Arthrobacter globiformis B-1112 (ВКМ), Lactobacillus plantarum (промышленный штамм), Micrococcus luteus NCIMB 13267, Mycobacterium smeg matis mc2 155, Mycobacterium рhlei К-4140, Staphylococcus aureus 209-Р, Rhodococ cus rhodochrous К-3285;

3) грамотрицательные неспорообразующие Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245, Erwinia carotovora (подвид atroseptica SCRI1043), Es cherichia coli М-17, Pseudomonas aurantiaca В-1558 (ВКМ), P.fluorescens NCIMB 9046 и цистообразующие Azotobacter vinelandii В-1617 (ВКМ);

4) экстремально галофильная архея Natrinema pallidum К-1;

5) дрожжи Saccharomyces cerevisiae 380 (ВКМ). Состав питательных сред и условия культивирования бактерий для получения цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) рассмотрены в главе 2.

Природные объекты представлены: 1) грунтами и почвами (возрастом до 2 млн.

лет) зон вечной мерзлоты Восточной Сибири;

2) мерзлым грунтом (170 тыс. лет) Антарктического р-на Сухих Долин, любезно предоставленными д.г-м.н. Д.А. Ги личинским (ИБФХПП РАН, Пущино);

3) пылевым наносом внутреннего помеще ния. Химическими аналогами факторов d1 бактерий были алкилоксибензолы С7 АОБ и С12-АОБ (Sigma);

факторов d2 – олеиновая кислота;

кворум-сенсорных факторов - гомосеринлактон (Sigma).

Микробиологические методы. Жизнеспособность клеток определяли по: 1) чис ленности колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) при посевах клеточных суспен зий на агаризованные среды;

2) числу микроколоний (мКОЕ/мл), образующихся в полужидких средах;

3) наиболее вероятному числу клеток (НВЧК/мл), способных к росту в жидких средах и определяемых методом предельных разведений (МПР). Приемы реактивации покоящихся клеток включали: 1) двукратную от мывку клеток от инкубационной среды в дистиллированной воде или растворе 0.1 М KH2PO4 (pH 7.4);

2) инкубацию клеток с лизоцимом (1 и 10 мкг/мл;

280С;

45 мин);

3) инкубацию клеток с внеклеточным реактивирующим фактором (РФ) Luteococcus casei [Воробьева и соавт., 2003];

4) внесение в плотные среды пиру вата натрия (0.1% в/об) [Mizunoe et al., 1999;

Bogosian et al., 2000];

5) использова ние полноценных по составу, но разбавленных (в 2-5 раз) сред, а также полужид кого агара (0.25% в/об). Устойчивость клеток к повреждающим воздействиям (теплового шока, окислителей, осмотического стресса, -облучения, токсикантов, лизоцима, антибиотиков) определяли по сохранению жизнеспособности или из менениям ростовых характеристик. Индекс диссоциации популяций определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. Для выделения диссоциантов и изучения их признаков использовали метод много кратных пассажей [Кузнецов, 1972].

Микроскопические наблюдения проводили с помощью микроскопов Zetopan (Австрия), МБИ-15 У42 (Россия), Axioplan (Carl Zeiss, Германия) и Eclipse E4000 (Nicon, Japan). В качестве флюорохромов использовали: ДНК связывающие красители - Live/Dead Baclight kit® L-13152 (Molecular Probes);

ио дистый пропидий (3 мкМ);

маркер на дыхательную активность - тетразолиевый краситель СТС (1 - 3 мкМ);

маркер на липидные включения - Nile red (4 мкг/мл).

Для электронно-микроскопических исследований клетки фиксировали, обезво живали и заливали смесью эпоксидных смол. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция) и просматривали на микроскопе JEM-100B (Япо ния). Динамическую фазовую микроскопию проводили с использованием коге рентного фазового микроскопа Эйрискан с регистрацией h - максимальной фа зовой толщины (ФТ) клетки, и d – ее диаметра [Tychinsky et al., 1997;

Weiss et al., 1999]. Рентгеновский микроанализ элементного состава клеток осуществляли с помощью микроскопа JEM-100CXII (JEOL, Япония) со сканирующей приставкой EM-ASID4D, рентгеновским микроанализатором LINK-860 и детектором E (Link-System, Англия). Рентгеновские спектры получали для 30 объектов при 3- измерениях в каждом и преобразовывали с помощью программы ZAF/PB-LINK Systems в массивы данных по величинам площади пика элемента и соотношения площади пика к фону. Для атомно-силовой микроскопии использовали микро скоп Asylum Research (MFP-3D-Bio, Канада) и зонды Olympus (18-21 nN/nm, 358 360 КГц) в полуконтактном режиме [http://ntmdt.com]. Цитометрические иссле дования с регистрацией распределения клеток по интенсивности флюоресценции и светорассеянию (размеру) проводили на приборе FACS Calibur system (Becton Dickinson) с обработкой данных программой WinMDI 2.8.

Биохимические методы. Для выделения и очистки ауторегуляторных факто ров d1 использовали методы экстракции, колоночной и тонкослойной хромато графии;

биологическую активность фракций оценивали в биотестах [Эль-Регистан и соавт., 1981]. Алкилоксибензолы (АОБ) в составе фактора d1 количественно оп ределяли с реактивом FBB (Sigma) [Tlusсik et al., 1981]. Структуру АОБ определя ли методом ГХ/МС (квадрупольный хроматомасс-спектрометр FISONS TRIO 1000) при использовании библиотеки масс-спектров NIST 2.0. Надмолекулярные комплексы ДНК (НК ДНК) выделяли из клеток бактерий мягким фенольным [Стручков, 1962] и детергент-фенольным [Stonington et al., 1971;

Sueoka, Hammers, 1974] методами. Эластовязкость растворов НК ДНК определяли по методу [Стручков, Стражевская, 1986]. Содержание ДНК определяли спектрофотометри чески [Спирин, 1958]. Клеточные липиды выделяли методом [Bligh, Dyer, 1959], содержание фосфора в составе фосфолипидов определяли микрометодом Бартле та [Кейтс, 1975]. Неполярные липиды микобактерий экстрагировали по методи кам [Parish, Stoker, 1998]. Фракции ДНК-связанных липидов выделяли из НК ДНК двустадийно с включением стадии обработки ДНКазой I [Стручков, Стражевская, 1993]. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) анализировали методом ГХ/МС. Активности ферментов определяли стандартными спектрофотометриче скими методами (Specord UV VIS, Германия). Эндогенное дыхание клеток опре деляли полярографически [Шольц, Островский, 1975]. О метаболической актив ности клеток судили по интенсивности включения радиоактивно-меченых пред шественников нуклеиновых кислот и белков - [3H]- урацила и [3H] L-аспарагина.

В блоке молекулярно-генетических исследований применены усовершенствован ные методы получения ДНК-матриц из вегетативных клеток и покоящихся форм.

Биомассу кипятили в буфере D с солями-хаотропами (4 М гуанидинийтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, рН 7.0, 0.1 М -меркаптоэтанол, 0.5% саркозил) (односта дийная обработка) и после отмывки инкубировали с протеиназой К (100 мкг/мл) час при 37 С (двустадийная обработка) [Данилевич, Гришин, 2002;

Данилевич и соавт., 2007]. В ПЦР использовали универсальные праймеры 27f и 1522r на ген 16S рРНК и подобранные ген-специфичные праймеры: bc-clsAB-f и bc-clsAB-r (B.cereus);

Saur-dnaA-f и Saur-dnaA-r (S.aureus);

Msmeg-sigF-f и Msmeg-sigF-r, Msmeg-gyrA-f и Msmeg-gyrA-r (M.smegmatis).

Статистический анализ проводили методами расчета среднеквадратичного отклонения внутри группы данных, t-теста Стьюдента и вычисления корреляции двух групп данных;

критерий вероятности Р0,05 принимали достаточным для достоверной разницы между ними. Минимальная повторность измерений в экспе риментах 3-кратная, максимальная - 11-кратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ Глава 1. Свойства цистоподобных покоящихся форм Объекты исследования представлены родами гетеротрофных мезофильных грамположительных и грамотрицательных неспорообразующих бактерий (рр. Mi crococcus, Arthrobacter, Rhodococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Azospirillum и др.), важных для биотехнологии, клинических исследований и экологии. Другими объектами были бациллы Bacillus cereus и B. subtilis, развивающиеся в условиях, когда спорообразующий фенотип не проявлялся. Для выявления и характеристи ки покоящихся форм неспорообразующих бактерий были разработаны специаль ные условия, рассмотренные в отдельной главе, которые обеспечивали массовое образование цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) в циклах развития мик робных культур. ЦПК были свойственны: 1) отличия в морфологии и ультра структурной организации от вегетативных клеток;

2) длительное сохранение спо собности к репродукции;

3) резко сниженная или экспериментально не выявляе мая метаболическая активность;

4) повышенная устойчивость к повреждающим воздействиям;

5) образование в циклах развития культур, что рассматривается ниже. Совокупность этих характеристик необходима для отнесения ЦПК к по коящимся формам прокариот.

1.1. Особенности морфологии и ультраструктурной организации. В пост стационарных культурах бактерий, выращенных в периодическом режиме при соответствующих модификациях условий культивирования, часть клеток автоли зировалась, а оставшиеся интактными характеризовались повышенной степенью светопреломления (рефрактерностью) по сравнению с вегетативными клетками (рис. 1). Степень рефрактерности была высокой у покоящихся клеток микрокок ков, азоспирилл, родококков и др., аналогично спорам и цистам некоторых бакте рий. Особенностями ультраструктурной организации исследуемых покоящихся форм, отличающими их от предшествующих вегетативных клеток, были: 1) ус ложнение и утолщение клеточных оболочек;

2) неоднородность текстуры цито плазмы;

3) появление электронопрозрачных включений полиалканатов (у ряда бактерий);

4) конденсация и компактизация нуклеоида;

5) отсутствие признаков деления (рис. 2).

г а б в ж е д з и м л к Рис. 1. Вид клеток в фазово-контрастном микроскопе: (а) вегетативные клетки (ВК) и (б) ЦПК M. luteus;

(в) ВК и (г) ЦПК P. аurantiaca;

(д) ВК и (е) ЦПК M. phlei;

(ж) ВК и (з) ЦПК M. smegmatis. Вид ЦПК: (и) B. cereus;

(к) B. subtilis;

(л) A. brasilense;

(м) A. globiformis.

Масштабные метки: (г, к) 2 мкм, остальные - 10 мкм Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий контрастно отличаются по своему строению и способу образования от эндоспор, которые формируются внутри клетки - спорангия и обладают специфическими структурами: многослой ными белковыми покровами, наружной и внутренней споровыми мембранами, располагающимся между ними кортексом, зачаточной клеточной стенкой и серд цевиной – споровым протопластом [Fitz-James, Young, 1969;

Дуда, 1982;

Driks, Setlow, 2000]. В структурном отношении исследуемые покоящиеся формы отлич ны от экзоспор стрептомицетов [Калакуцкий, Агре, 1977;

Chater, 1984;

Flrdh, Buttner, 2009], миксоспор миксобактерий [Dworkin, Gibson, 1964], акинет циано бактерий [Nichols, Carr, 1978]. Выявленные формы покоя у неспорообразующих грамположительных бактерий Arthrobacter globiformis, Rhodococcus rhodochrous, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium phlei и др. с утолщенными и дифферен цированными клеточными стенками (рис. 2) сходны в этом отношении с цистами, обнаруженными только у некоторых грамотрицательных бактерий [Wyss et al., 1961;

Sadoff, 1975;

Berleman, Bauer, 2004].

д в е а б г и к з ж м л н Рис. 2. Ультратонкие срезы: (а) вегетативных клеток (ВК) и (б) ЦПК B.cereus;

(в) ВК и (г) ЦПК типа цист A.brasilense;

(д) ВК и (е) ЦПК M. smegmatis;

(ж) ВК и (з) ЦПК L.plantarum;

(и) ВК и (к) ЦПК E. coli. ЦПК: (л) M. phlei;

(м) R.rhodochrous;

(н) A.globiformis. Длина масштабной метки: (в, г) – 300 нм;

(ж, з) – 500 нм;

остальных – 1 мкм.

Однако, применение термина «цисты» для обозначения покоящихся клеток у объ ектов исследования спорно по следующим соображениям. Так, типичные цисты Azotobacter vinelandii обладают многослойной оболочкой, состоящей из внутрен них покровов (интины), клеточной стенки грамотрицательного типа и внешних покровов (экзины), а также обширными электронопрозрачными включениями по лиоксибутирата внутри цитоплазмы. У покоящихся форм грамположительных бактерий слои, подобные интине и экзине, отсутствуют (рис. 2). Наличие вклю чений, характерных для «липидных» и «незрелых» цист ряда фотосинтезирующих и метанотрофных бактерий [Whittenbury et al., 1970;

Горленко и соавт., 1976;

Гальченко, 2001], не является облигатным у исследуемых покоящихся форм.

Структурные трансформации при переходе вегетативных клеток у неспоро образующих бактерий в состояние покоя носят комплексный характер (рис. 2), что свидетельствует о реализации программ цитодифференцировки. Для A. vine landii известны лишь некоторые гены, участвующие в определенных стадиях цис тообразования ampDE, rpoS, algU, algR, eex, phbBAC, в том числе, в формирова нии многослойных оболочек [Moreno et al., 1998;

Nez et al., 1999;

2000;

Segura et al., 2003;

Gimmestad et al., 2006;

Sandercock, Page, 2008]. Однако экстраполировать генетические механизмы, задействованные в образовании цист азотобактера, на процессы цитодифференцировки у широкого круга грамположительных и гра мотрицательных бактерий пока не представляется возможным.

Поэтому, как по особенностям ультратонкого строения, так и способу обра зования, формы покоя исследуемых бактерий предложено вынести в отдельную категорию с обозначением их как цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК).

С привлечением других прямых микроскопических методов также выявле ны особенности строения ЦПК. Они отличались от вегетативных клеток бугри стым рельефом клеточной поверхности и наличием участков с высокой плотно стью вещества, составляющего наружные клеточные покровы (данные атомно силовой микроскопии АСМ). Сохранение барьерной функции клеточных мем бран ЦПК выявлено в реакции клеток на прокрашивание красителем Live/Dead.

Однако характер флюоресценции у части ЦПК неспорообразующих бактерий M.luteus, A.globiformis, A.brasilense, P. aurantiaca после прокрашивания был пере ходным (желто-зеленое и желтое свечение или его отсутствие) и отличался от живых (ярко-зеленых) и мертвых (красных) клеток в культурах стационарной фа зы. Наличие у ЦПК специфического характера флюоресценции или их непрони цаемость для компонентов красителя, по-видимому, обусловлены особенностями структурной организации цитоплазматической мембраны, утолщением клеточных оболочек и появлением капсульного слоя. Особенности структурной организации ЦПК бактерий, существенные для выживания, суммированы в таблице 1.

1.2. Длительность сохранения колониеобразующей способности показана для пост-стационарных культур или суспензий B. subtilis, A. globiformis, M. luteus, M. phlei, R. rhodochrous, P. fluorescens, P. aurantiaca, A. brasilense и др. (табл. 2), в которых доля ЦПК составляла 45-80% от общего числа интактных клеток (по данным микроскопических просмотров). Аргументация корректности вывода о том, что ЦПК образуют колонии, рассмотрена ниже.

Таблица 1. Структурные особенности ЦПК и их значение для выживания Характеристики Связь с покоящимся состоянием ЦПК Наличие Дополнительный защитный слой;

матрикс для сорбции ор капсульных слоев ганоминеральных частиц, повышающих защиту клетки in situ;

коммуникативная структура для передачи сигналов к развитию и поддержанию покоя и выходу из него.

Утолщенная и Обеспечение устойчивости к термообработке, действию ли слоистая клеточная тических ферментов и другим повреждающим физическим, стенка химическим и биологическим факторам.

Измененное Обратимая инактивация мембраносвязанных ферментов (в состояние т.ч., электрон-транспортной цепи);

изменение проницаемо клеточных мембран сти мембран для моновалентных ионов и обезвоживание клетки.

Измененная струк- Уменьшение числа рибосом или их агрегация, что обеспе тура цитоплазмы чивает обратимую инактивацию метаболизма Компактизация Обратимое прекращение репликации и транскрипции;

нуклеоида обеспечение устойчивости генетического материала к по вреждающим воздействиям;

Наличие Резервный материал, утилизируемый при прорастании.

включений Таблица 2. Сохранение способности ЦПК к образованию колоний Срок ин- Численность КОЕ/мл Вид Модификации сред кубации, (% КОЕ в культурах стационарной фазы) мес 1.5 ·107 (11) 10-кратный лимит N M. luteus 3.6 ·108 (48) A. globiformis 5 лимит С и 4 лимит N 3.7 ·105 (1) M. smegmatis 5 лимит N 1.8 ·107 (35) M. phlei 5 лимит Р 3.6 ·107 (65) R. rhodochrous 5 лимит N 3.0 ·107 (20) P. aurantiaca 2 лимит N 7 · 106 (7) P. fluorescens 2 лимит N Способность к образованию колоний на плотных средах явилась важным крите рием для разграничения покоящихся и жизнеспособных некультивируемых кле ток бактерий. Отметим, что учет численности КОЕ на богатых плотных средах обуславливает недооценку численности способных к пролиферации клеток, воз растающую по мере хранения культур ЦПК. Например, численность ЦПК микро кокков, артробактерий и псевдомонад, образовавшихся в условиях длительного голодания (4 – 6 мес), практически не изменялась. Об этом судили по доле ин тактных рефрактерных клеток, морфологически отличных от вегетативных и ав толизированных клеток и легко диагностируемых при просмотрах в светооптиче ском микроскопе, а также при анализе ультратонкого строения (данные электрон ной микроскопии). При этом колониеобразующая способность снижалась. Для более полного выявления числа жизнеспособных, но не дающих колонии клеток была рекомендована комбинация разных методов учета численности (МПР, мКОЕ) при варьировании состава сред для прорастания. Так, при низком титре КОЕ (1%, табл. 2) в 5-мес суспензиях микобактерий M. smegmatis, содержащих ЦПК, численность клеток, способных к реверсии роста в жидкой среде, оказалась на 2 порядка выше. Таким образом, продемонстрировано свойство покоящихся популяций сохранять пролиферативный потенциал в течение времени, не сопос тавимого по длительности со временем генерации клеток.

1.3. Об экспериментально не выявляемом уровне метаболизма у ЦПК не спорообразующих бактерий свидетельствовало отсутствие дыхательной активно сти (рис. 3а, линия 1). Доказательства ингибирования дыхательных процессов у ЦПК аэробных бактерий M. smegmatis, M. luteus, S. aureus получены также в мик роскопических тестах с тетразолиевым красителем СТС: ЦПК не давали ярко красного свечения, характерного для метаболически активных клеток. Об инги бировании биосинтетических активностей (у ЦПК M. smegmatis) также судили по отсутствию включения в клетки меченых предшественников нуклеиновых кислот - [3H] урацила, и белков – [3H] L-аспарагина. После перенесения отмытых ЦПК в свежую среду восстанавливались дыхательные процессы и включение меченых предшественников биополимеров. Полученные данные свидетельствуют об обра тимом торможении метаболической активности у покоящихся клеток.

Методом рентгеновского микроанализа были выявлены различия в содер жании ряда биогенных элементов и их соотношениях в вегетативных и покоя щихся клетках B.cereus и M. luteus. Клетки бацилл экспоненциальной фазы роста отличались от клеток стационарной фазы более высоким содержанием Ca и более низким K. Однако различия между делящимися и стационарными клетками ока зались гораздо менее выраженными, чем их отличия от покоящихся форм (спор и ЦПК). Их отличительным признаком было низкое, по сравнению с вегетативными клетками, соотношение P/S и высокое - Са/K (табл. 3), что, по-видимому, отража ет изменения их ионного гомеостаза, снижение пула АТФ и деградацию РНК при переходе клеток в покоящееся состояние. Наличие сниженного, но выявляемого уровня калия у покоящихся форм свидетельствует о сохранении у них барьерной и изменении транспортной функции цитоплазматических мембран.

1.4. С состоянием пролиферативного и метаболического покоя сопряжена повышенная устойчивость ЦПК к действию повреждающих факторов, прежде всего, их терморезистентность. Так, у ЦПК M. luteus, прогретых при 80 С, мин, численность КОЕ снизилась на 2 порядка, тогда как в контрольных вариан тах (вегетативные клетки) – на 8 и более порядков (рис. 3 в, г).

0, Потребление O2, нмоль O ОП суспензии (540 нм), ед.

0, 0, -20 0, 0 200 400 600 0 5 10 Время, сек.

Время, мин.

а б до термо- до термо 12 обработки обработки после термо- после термо 10 обработки обработки 8 lg КОЕ lg КОЕ 6 4 2 0 вегетативные клетки ЦПК г в Рис. 3. Свойства ЦПК: (а) Дыхательная активность (1) длительно инкубируемых ЦПК и (2) вегетативных клеток. Типовой график для M. luteus A. globiformis, P. aurantiaca, A. brasilense.

(б) Действие лизоцима на M. luteus: (1) ЦПК;

(2) вегетативные клетки;

(3) отмытые ЦПК. (в, г) Терморезистентность (80 С, 10 мин) вегетативных клеток и ЦПК M. luteus.

Таблица 3. Данные рентгеновского микроанализа клеток бактерий Вариант Соотношения площадей пиков (П/П) Ca/K P/S Bacillus cereus Вегетативные клетки 0.29± 0.01 3.06± 0. Эндоспоры 22.78± 2.78 1.90± 0. ЦПК 1.36± 0.41 1.30± 0. Micrococcus luteus Вегетативные клетки 0.48± 0.03 3.49± 0. ЦПК 1.39± 0.04 2.85± 0. Повышенная устойчивость к прогреванию была показана для ЦПК всех иссле дуемых бактерий. При образовании в относительно однотипных условиях ЦПК грамположительных бактерий были более терморезистентными, чем ЦПК грамот рицательных бактерий (табл. 4). Среди исследуемых покоящихся форм грамположи тельных бактерий более устойчивыми к термообработке оказались ЦПК бацилл, об разующиеся в условиях катаболитной репрессии как альтернатива эндоспорам, а также ЦПК ряда немицелиальных актинобактерий (родов Arthrobacter, Micrococcus, Mycobacterium). Высокая устойчивость к прогреванию при 70 С (10 мин) и гипоос мотическому шоку (~ 100% выживших) характерна также для ЦПК экстремально галофильной археи Natrinema pallidum.

Таблица 4. Сравнительная характеристика термоустойчивости ЦПК бактерий Температура Возраст Доля вы Вид бактерий ЦПК, мес живших кле- (С) и время (условия образования ЦПК) прогрева (мин) ток*, % ЦПК грамположительных бактерий B. subtilis (среда с 12% глюкозы) 6 50 80 ;

B. cereus (среда с 6% глюкозы) 1.5 30 80 ;

A.globiformis (лимит C и N) 4 37 80 ;

S.aureus (ФР с 100 мМ СaCl2) 4 44 60 ;

M.smegmatis (среда СР-1, лимит N) 5 20 60 ;

L. plantarum (сгущение в 30 раз) 4 10 60 ;

R.rhodochrous (среда СР-1, лимит N) 9 10 60 ;

M.phlei (среда СР-1, лимит P) 9 2 60 ;

ЦПК грамотрицательных бактерий 4 1.2 60 ;

A.brasilense Sp7(5 лимит N) 6 1 60 ;

P. aurantiaca (2 лимит N) E.coli (сгущение в 20 раз) 1 0.07 55 ;

* от числа жизнеспособных клеток (титр КОЕ) до термообработки. Доля вегетативных клеток, устойчивых к прогреванию в тех же условиях, была на 3-7 порядков ниже.

По сравнению с эндоспорами бацилл, ЦПК обладали существенно меньшей тер моустойчивостью, чем эндоспоры бацилл, которые выдерживают прогревание при 90 – 100 С [Briggs, 1966]. При этом ЦПК грамположительных бактерий, а также азоспирилл и псевдомонад оказались более устойчивы к термообработке, чем цисты Azotobacter vinelandii [Layne, Johnson, 1964], фотосинтезирующих бак терий Rhodospirillum centenum [Berleman, Bauer, 2004], бделловибрионов [Tudor, Conti, 1977], азоспирилл [Sadasivan, Neyra, 1985]. Повышенная терморезистент ность покоящихся форм бактерий – объектов исследования, послужила дополни тельным основанием для обособления их в категории ЦПК.

Сохранение жизнеспособности и приобретение термоустойчивости образо вавшимися ЦПК зависели от условий их последующей инкубации (хранения).

Максимально высокая численность колониеобразующих ЦПК азоспирилл A. bra silense (1.2·108 кл/мл) наблюдалась при их хранении в нативной среде роста при – 20 С, при этом доля терморезистентных клеток была низкой (0.01%). При инку бации ЦПК азоспирилл в нативной среде роста при комнатной температуре (в ус ловиях для созревания) выявлено снижение числа КОЕ (1·107 кл/мл) одновремен но с увеличением количества и доли (27%) терморезистентных клеток, что объяс няется возрастанием степени глубины покоя. При хранении ЦПК A. brasilense в условиях, препятствующих их созреванию (в физрастворе или в замороженном состоянии), доля термоустойчивых клеток была низкой. Обратная корреляция между долей термоустойчивых клеток и численностью клеток, способных к обра зованию колоний, отмечена также для 5 – 6-месячных суспензий ЦПК B. subtilis (50-69%;

2·104 КОЕ/мл) и M. smegmatis (20%;

3.7·105 КОЕ/мл).

Другим важным свойством ЦПК неспорообразующих бактерий является их устойчивость к действию гидролитических ферментов. Резистентность ЦПК M.

luteus к разрушению лизоцимом (1 мкг/мл) была обратима и терялась после 3 кратной отмывки ЦПК слабощелочным раствором (рис. 3 б). При этом вегетатив ные клетки не выдерживали обработки лизоцимом (0-5 КОЕ/мл). Высокая устой чивость ЦПК неспорообразующих бактерий к повреждающим воздействиям оп ределяет их значение в реализации стратегии выживания микробных популяций в неблагоприятных условиях.

1.5. Доказательства образования ЦПК как этапа в цикле развития бактери альных культур приведены в Главе 2.

Таким образом, обобщенные в настоящей главе данные позволяют сформу лировать важный вывод о наличии у широкого круга неспорообразующих бакте рий конститутивной формы покоя – цистоподобных покоящихся клеток.

Совокупность морфологических и физиологических исследований ЦПК в сравнении с предшествующими вегетативными клетками доказывает не только существование покоящихся форм у исследуемых бактерий, но и обосновывает корректность заключения, что именно ЦПК в длительно инкубируемых культурах образуют колонии. Приведение такого аргумента важно, если рассматривать воз можность поддержания численности клеточной популяции в старых культурах за счет роста (криптического) небольшой ее части [Zambrano et al., 1993;

Scmeulders et al., 1999]. Поэтому проанализируем данные, полученные для культур ЦПК мик рококков и псевдомонад, для оценки максимального вклада вегетативных клеток в образование колоний. Привлечем показатели: 1) численности всех клеток (пря мой счет) и живых (Live/Dead);

2) доли (из 1000 объектов в фазово-контрастном микроскопе) рефрактерных клеток как покоящихся форм, условно считая нереф рактерные вегетативными клетками;

3) доли вегетативных клеток и ЦПК, диффе ренцируемых по результатам анализа ультратонких срезов 100 клеток;

4) числен ности КОЕ при посеве культур;

5) доли клеток, устойчивых к повреждающим воздействиям (табл. 5).

Таблица 5. Оценка вклада вегетативных клеток и ЦПК в образование колоний N клеток/мл Доля (%) и численность**(кл/мл) Титр Вклад в КОЕ:

КОЕ/ «вегетатив всех живых* «вегетативных» интактных клеток (ВК) неделящихся ных» клеток ЦПК мл Культуры с ЦПК M.luteus (10 лимит N, 6 мес) Светооптическая микроскопия не определяется 35%***;

0.9·107 65%;

1.7· 8 7 Анализ ультратонких срезов 2.6·10 2.6·10 1.7· 5 0.99%***;

2.6·10 60%;

1.6·10 1.5% 98.5% 0 ВК из 100 60 ЦПК из Обработка лизоцимом (1 мкг/мл)**** 9· 0.000001%;

1-5 все ЦПК 0.0002% 99.9998% Культуры с ЦПК P.aurantiaca (2 лимит N, 6 мес) Светооптическая микроскопия не определяется 55%***;

7.7·107 45%;

6.3· 8 8 Анализ ультратонких срезов 2.5·10 1.4·10 3· 6 0.99%***;

1.4·10 27%;

3.8·10 4.6 95.4% 0 ВК из 100 27 ЦПК из Термообработка (60 С, 5 мин)**** 3· 0.000001%;

1-5 Н.о. 0.002% 99.998% *тест с Live/Dead;

** N (живых) показатель доли;

***максимальное допущение;

****на осно вании данных для культур вегетативных клеток;

величины отклонений не приводятся.

Если по результатам просмотров в светооптическом микроскопе удалось распо знать 45 – 65% клеток как покоящихся, то из-за возможной неоднозначности ста туса остальных (вегетативные, поврежденные, автолизированные клетки?) вклад в образование колоний ЦПК и вегетативных форм неясен. Эта неоднозначность, вполне допустимая для малоизученных микроорганизмов или трудно диагности руемых по морфологии клеток, снимается за счет более тщательного дифферен цирования клеток в популяции. Так, электронно-микроскопический анализ срезов 100 клеток (и более) в культурах ЦПК не выявил вегетативных форм, распозна ваемых по особенностям ультратонкого строения, на основании чего наибольшая вероятность их встречаемости составляет 0.99 %. С учетом этого максимальный вклад «вегетативных клеток» в образование колоний не превышает 5%.

Их вклад нивелируется до нулевых значений за счет дополнительного или альтернативного анализа данных по устойчивости тех же культур к повреждаю щим воздействиям (табл. 5). При обработке покоящихся популяций микрококков лизоцимом (1 мкг/мл) и псевдомонад – прогреванием (60 С, 5 мин), когда чис ленность КОЕ снизилась на 50% и 2 порядка, соответственно, вегетативные клет ки не могли выдержать такие воздействия. Это обосновывается данными о прак тически полной гибели клеток культур стационарной фазы или активно растущих в тех же условиях обработки. Таким образом, использование повреждающих воз действий, щадящих для ЦПК и при этом полностью летальных для вегетативных клеток, также целесообразно для аргументации образования колоний за счет про растания только ЦПК. Аналогичным образом доказан вклад ЦПК остальных ис следуемых бактерий в образование колоний или пул жизнеспособных клеток, про растающих из покоящихся популяций и выявляемый МПР.

Наконец, на модели микобактерий M. smegmatis были отработаны подходы к получению однородных фракций ЦПК, основанные на центрифугировании 5 мес культур (СР1 с лимитом N) в ступенчатом (1.8 М и 2.1 М) или линейном (0 2.1 М) градиенте сахарозы. Микроскопическими наблюдениями выявлено, что нижняя фракция была на 95 – 100% (в зависимости от типа градиента) обогащена покоящимися клетками и практически не содержала палочковидных форм. Жиз неспособность ЦПК гомогенной фракции, по данным посевов на NB-среду, соста вила 2.6·105 КОЕ/мл и 6·107 НВЧК /мл. Эта фракция отличалась от общей суспен зии большей долей ЦПК, устойчивых к прогреванию при 70 С (13%).

Для доказательства наличия и характеристики у форм покоя, представлен ных ЦПК, необходима разработка специальных условий для их образования в культурах у неспорообразующих бактерий в количествах, достаточных для иссле дований микроскопическими и физиологическими методами. Условия и законо мерности перехода клеток в состояние покоя рассматриваются ниже.

Глава 2. Условия образования покоящихся форм неспорообразующих бактерий 2.1. Трофическая регуляция образования ЦПК в пост-стационарной стадии развития бактериальных культур основана на создании стресса голодания за счет лимитирования среды роста источником N или изменением баланса CN, а также недостатком О2 или Р. Эти ситуации стандартны для природных систем. В усло виях исчерпания лимитируемого субстрата бактериальные культуры росли с меньшими удельной скоростью роста и выходом биомассы (5 – 10 раз), чем в ба зовых безлимитных средах. При этом стратегия роста сменялась стратегией вы живания за счет перехода клеток большей части популяции в покоящееся состоя ние. Так, численность жизнеспособных клеток в 2-мес культурах M. luteus, рас тущих в богатых средах, была существенно ниже (0.06% от числа КОЕ в стацио нарной культуре), по сравнению с их численностью в культурах, развивавшихся в модифицированных средах: 75% при лимите N;

10.8% при лимите Р;

9.2% при сниженной аэрации. При этом доля ЦПК от общего числа клеток, выявляемая по результатам микроскопических просмотров, была на 2-3 порядка выше в пост стационарных культурах микрококков, выращенных при лимитах N или P, по сравнению с вариантами развития в богатых средах. Аналогичное влияние моди фикаций условий культивирования на повышение эффективности образования жизнеспособных ЦПК установлено для артробактерий, родококков, псевдомонад, азоспирилл и других бактерий – объектов исследования.

Условия роста культур, наиболее пригодные для длительного сохранения ЦПК колониеобразующей способности, приведены в таблице 2.

Также установлено, что тип лимитации среды определяет динамику титра КОЕ при инкубации культур образо вавшихся покоящихся форм. Так, соз дание в среде лимита С и N способст вовало полной утрате у ЦПК M. luteus число КОЕ, lgN свойства образовывать колонии к 6 - 4 мес, в отличие от вариантов развития при остальных модификациях условий культивирования (рис. 4). У ЦПК P.

aurantiaca, образовавшихся при 5 кратном лимите источника N, титр - 0 3 6 9 КОЕ снижался до единичных значений к 2.5 мес, в отличие от условий менее время инкубации, мес жесткой азотной лимитации. Утрата Рис. 4. Численность жизнеспособных клеток в колониеобразующей способности ЦПК культурах M. luteus: (1) среда с лимитом N, могла быть связана с возрастанием (2) лимит Р, (3) лимит С + N.

глубины их покоя.

Таким образом, для M. luteus, P. aurantiaca и других бактерий выявлены условия образования покоящихся клеток, для которых метод учета по КОЕ неэффективен или недостаточен и необходимы другие подходы к доказательству их жизнеспо собности. Этому посвящены отдельные исследования (Глава 4).

2.2. Вторая группа приемов, направленных на эффективное образование ЦПК, основана на создании стресса исчерпания пространства за счет повышения клеточной плотности культур (суспензий), что предусматривало плотностную компоненту регуляции смены стратегии роста стратегией выживания. Один из этих приемов включал модификацию среды роста введением в нее избыточных количеств глюкозы (6% для B. cereus;

12% для B. subtilis), что обеспечивало вы сокий выход биомассы к началу стационарной фазы (109 - 1010 кл/мл) и репресси ровало образование эндоспор. В этих условиях спорообразующий фенотип у ба цилл не проявлялся, и цикл развития культур завершался образованием ЦПК, аналогично неспорообразующим бактериям. Численность жизнеспособных ЦПК в 1.5-мес культурах B.cereus и B. subtilis при репрессии спорообразования состав ляла порядка 60% от числа жизнеспособных клеток в стационарных культурах.

Другой вариант стресса исчерпания пространственных возможностей при развитии культуры предусматривал индукцию автолиза части клеток в суспензи ях с искусственно создаваемой высокой клеточной плотностью. Эффективность образования ЦПК в автолизирующихся суспензиях исследовали при варьирова нии клеточной плотности и состава инкубационных сред (наличие Са2+, рН), при спонтанном автолизе или индуцированном внесением олеиновой кислоты. Ре зультаты типичного опыта на модели E.coli приведены в таблице 6. В автолизи рующихся сгущенных суспензиях бактерий численность КОЕ составляла 2- 37%, тогда как в контрольных вариантах (пост-стационарных культурах того же воз раста) количество жизнеспособных ЦПК было низким – 0.01 – 0.2%.

Таблица 6. Число жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) E.coli в автолизирующихся клеточных суспензиях, хранившихся 1 мес при 28оС Численность КОЕ (% от КОЕ в стационарной Среда фазе) в суспензиях разной степени сгущения в:

10 раз 20 раз 30 раз (3.5±0.5)108 (0.3) (3±0.3)108 (0.1) (4.0±0.3)108 (0.1) среда роста с 20 мМ CaCl (1.5±0.3)109 (1) (2±0.4)109 (1) (2.5±0.3)109 (0.7) 0.1 М KH2PO4 буфер с 20 мМ CaCl2, рН (1.9±0.4)1010(15) (2.1±0.5)1010 (10) (1.9±0.4)1010 (5) 0.1 М KH2PO4 буфер с 20 мМ CaCl2, рН (2.3±0.5)1010(18) (4±1.0)1010 (18) (3.4±0.7)1010 (10) 0.1 М KH2PO4 буфер с 20 мМ CaCl2, рН Оптимальными условиями образования жизнеспособных ЦПК в автолизирую щихся суспензиях (до 4 мес. хранения) были:

• E.coli – 20-кратное сгущение в 0.1 М KH2PO4 фосфатном буфере с 20 мМ CaCl2, рН 8;

титр жизнеспособных ЦПК 18%;

• M. luteus – 10-кратное сгущение в 0.1 М KH2PO4 буфере с 20 мМ СаСl2, рН 7.25;

титр ЦПК 37%;

• L. plantarum – 30-кратное сгущение в растворе 0.09% Na2SiO3·9H2O, рН 6.3;

титр жизнеспособных ЦПК 2%.

Таким образом, автолиз части популяции в пост-стационарных бактериаль ных культурах может рассматриваться как не только фаза отмирания, но и стадия развития, сопряженная с образованием покоящихся форм.

2.3 Третья группа приемов, разработанных для массового образования ЦПК, имитировала ситуации развития стресса голодания у бактерий в присутствии при родных субстратов или биокосных компонентов, что наблюдается при резком из менении окружающих условий или смене хозяина для симбиотрофных бактерий.

Так, оптимальной для образования ЦПК псевдомонад была инкубация клеток ста ционарных культур в почвенной вытяжке или развитие популяции на поверхности почвенного агара (1.5 – 2 мес). Эффективным оказалось перенесение с последую щей инкубацией (до 4 мес) стационарных клеток псевдомонад, артробактерий, стафилококков и эрвиний в: 1) раствор водорастворимой окиси кремния 0.09% Na2SiO3 · 9H2O;

2) физраствор (ФР) с 10 - 300 мМ СaCl2;

3) безуглеродную мине ральную среду. Результаты опытов на модели S. aureus приведены в таблице 7.

Таблица 7. Общее число и численность жизнеспособных клеток S. aureus в различных инкубационных средах через 4 мес инкубации Вариант инкуба- Общая численность (N, кл/мл), титр КОЕ и доля жизнеспособных клеток (% от титров КОЕ или НВЧК в стационарной фазе) ции N, кл/мл КОЕ/мл % от КОЕ стацио- % от НВЧК ста нарных культур ционарных культур (4.0±1.3)·10 9 (1.2±0.1)·10 ФР с 10 мМ CaCl2 1.2 13. (9.0±1.9)·10 9 1.0±0.1)·10 ФР с 100 мМ CaCl2 1 9. (4.7±1.5)·10 9 (4.7±0.7)·10 ФР с 300 мМ CaCl2 0.08 1. (6.0± 1.5)·108 (3.0± 0.4)· среда роста 0.01 0. 2.4. Четвертая группа приемов, разработанная для получения ЦПК, основы валась на повышении в культурах начала стационарной фазы роста концентраци онного уровня микробных аутоиндукторов анабиоза за счет внесения их химиче ского аналога - C12-АОБ. Титр жизнеспособных ЦПК, полученных этим способом, составлял, например: 91% для M.luteus (3 10-4 М C12-АОБ, 1 мес);

38–45% для P.

aurantiaca и P. fluorescens (10-4 М – 2.510-4 М C12-АОБ, 1.3 мес);

12% для E. caro tovora (110-4 М C12-АОБ, 1.5 мес). Закономерности биологического действия АОБ подробно рассмотрены в Главе 5.

Обобщенный и формализованный статистический анализ с ранжированием числа успешных из предпринятых экспериментов показал наличие достоверной коррелятивной связи (rS 0.933–0.946) между эффективностью образования ЦПК и применением вышеописанных модификаций условий культивирования и сред.

Разработаны воспроизводимые (80 – 100%) подходы к интенсификации образова ния ЦПК у широкого круга неспорообразующих бактерий. Приемы могут быть использованы для изучения форм покоя у других микроорганизмов с учетом спе цифики их роста и развития.

Образование ЦПК неспорообразующими бактериями рассматривается как экстремальная форма ответа микробной культуры на такие стрессовые условия (голодания и исчерпания пространства), когда ее дальнейший рост невозможен.

При постоянном притоке субстрата и удалении части клеточной популяции пол ный цикл развития (рост-покой-рост), вероятнее всего, нарушен в силу того, что трофические и плотностные условия, способствующие переходу клеток в состоя ние покоя, не создаются.

Важно отметить, что образование ЦПК у M. luteus, P.aurantiaca, A. globi formis обеспечивалось применением всех разработанных приемов. Таким образом, каковы бы ни были условия роста бактериальных культур, циклы их развития все гда завершаются образованием покоящихся форм, хотя и с разными свойствами.

Выявлению их разнообразия посвящен следующий раздел исследований.

Глава 3. Разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий 3.1. Внутривидовое разнообразие. В разных условиях роста бактериальные культуры одного и того же штамма завершают цикл развития образованием по коящихся форм. Образующиеся в разных условиях покоящиеся клетки отличают ся: морфологически и ультраструктурной организацией;

устойчивостью к повре ждающим воздействиям;

быстротой отклика на условия, способствующие их ре активации и росту;

изменением популяционного спектра в новом цикле развития.

3.1.1. Внутривидовое разнообразие ЦПК псевдомонад P.aurantiaca и P.

fluorescens, проявляющееся при развитии культур в разных условиях, выражалось в формировании нескольких типов покоящихся клеток, которые структурно раз личались толщиной и слоистостью клеточных оболочек, отсутствием или наличи ем капсульного слоя и внутрицитоплазматических включений (рис. 5 а - в). Фор мы, сходные по тонкому строению с типичными бактериальными цистами, были выявлены в популяциях псевдомонад, развивающихся на почвенном агаре (рис.

5в). ЦПК разных морфотипов различались степенью сохранения пролиферативно го потенциала и термоустойчивостью. Для образования ЦПК псевдомонад, дли тельно сохраняющих колониеобразующую способность, оптимальными были: (1) двукратное уменьшение в среде роста содержания N;

2) инкубация в среде с оки сью кремния или почвенной вытяжке;

3) развитие на почвенном агаре. Устойчи выми к термообработке (60 С, 5 мин) оказались ЦПК, образующиеся в 6-мес культурах при лимите азота (1% выживших клеток, тест по КОЕ) или голодной среде с окисью кремния (0.1%). ЦПК, полученные при развитии на почвенном агаре, были устойчивы к высушиванию, но не к термообработке (рис. 6 а).

3.1.2. Разнообразие покоящихся форм продемонстрировано для микобакте рий M. smegmatis (рис. 5, г-е). При развитии их культур в среде СР1 с лимитом N образовывались дифференцированные ЦПК с выраженной рефрактерностью, утолщенными клеточными оболочками и спороподобной головкой (рис. 1з, 5г).

При развитии культур M. smegmatis в среде Сатона при сниженном рН отмечено массовое образование кокковидных форм без цитоплазматических включений (рис. 5 д). В культурах, инкубированных в среде Сатона с лимитом P, выявлены «слабодифференцированные» покоящиеся клетки с включениями (рис. 5е). Диф ференцированные формы со сложной ультраструктурной организацией обладали свойствами углубленного покоя, о чем судили судя по их высокой терморези стентности и необходимости создания специальных условий для их реверсии к вегетативному росту. Так, глубокопокоящиеся (5 мес) ЦПК микобактерий I а в б I ИС КС Н В НС КС г В ИС КС д е II з ж и III ВС КС ВС КС КС К ИС КС К л м к ЦПМ ВС КС Рис. 5. Структурное разнообразие форм покоя неспорообразующих бактерий:

(I) внутривидовое: P. aurantiaca: (а-в) (а) 2 лимит N, 6 мес инкубации;

(б) + C12-АОБ (2.5·10-4 М), 1.3 мес.;

(в) развитие на почвенном агаре, 1 мес. Метка 500 нм;

M. smegmatis: (г) дифференциро ванные ЦПК (среда СР1, лимит N, 5 мес);

(д) кокковидные формы (среда Сатона, рН 6.2, 4 мес);

(е) слабодифференцированные клетки (среда Сатона, лимит Р, 5 мес);

(II) межштаммовое: A. brasi lense: (ж,з) ЦПК штамма Sp7 (стартовый лимитом N, 4 мес.) (и) циста штамма Sp245 (физраствор мес.);

(III) внутипопуляционное: M. luteus: ЦПК (к) I, (л) II и (м) III структурных типов (10 ли мит N, 9 мес). Метки (г-м): 300 нм.

Число жизнеспособных клеток, Порядок снижения числа КОЕ lgN 40к 45 50 55 60 65 70 75 к 1 1(а) 2 3 4 б а Вариант Температура, С Рис. 6. Термоустойчивость ЦПК по показателям порядков снижения титра КОЕ: (а) ЦПК Р. aurantiaca после термообработки при 60С (5 мин) в зависимости от варианта их образова ния: (1) – в среде с 2 лимитом N, 1.5 мес, (1а) то же, 6 мес.;

(2) внесение С12-АОБ (1·10-4 М);

1.3 мес., (3) с Na2SiO3, 1.3 мес;

(4) в почвенной вытяжке;

(5) на почвенном агаре;

(к) - вегета тивные клетки. (б) ЦПК M. smegmatis (в среде СР1, лимит N, 2 мес) после прогревания при 50 – 80 °С (10 мин): 1 – титр КОЕ, 2 – титр мКОЕ.

реактивировались в жидкой среде, что определялось по высокому титр НВЧК (6·107 кл/мл) в тестах по МПР. При этом не выявлено потребности в специальных условиях для реактивации кокковидных и слабодифференцированных клеток. По показателям терморезистентности три типа покоящихся форм M. smegmatis одно го возраста (4 - 5 мес) были ранжированы в ряду: дифференцированные ЦПК (20% выживших после прогревания при 60 С, 10 мин, тест по КОЕ) слабодиф ференцированные клетки (0.3%) кокковидные формы (0%). Выраженный поли морфизм свойственен также ЦПК M. luteus. Так, у шестимесячных ЦПК микро кокков, полученных при дисбалансе CN или сниженной аэрации, клеточные стенки были значительно толще и имели обширный капсульный слой по сравне нию с ЦПК того же возраста, образовавшимися в условиях лимита источника P.

3.1.3. Проявлением внутривидового разнообразия является полиморфизм покоя у B.cereus и B. subtilis (эндоспоры и ЦПК), когда цикл развития бацилл в условиях репрессии спорообразования завершался образованием цистоподобных клеток, обладающих всеми характеристиками покоящихся форм прокариот.

3.2. Межштаммовый уровень разнообразия покоящихся форм выявлен для неэндофитного (Sp7) и эндофитного (Sp245) штаммов диазотрофных бактерий A.

brasilense, представляющих хорошую пару сравнения. При развитии штамма Sp в синтетической среде с 5-кратно сниженным стартовым N формировались ЦПК двух структурных типов (рис. 5 ж, з). Формированию ЦПК у штамма Sp245 спо собствовало создание в среде роста дефицита P. В более жестких условиях голо дания – при переносе клеток стационарных культур (среда с лимитом N) в физра створ, у него наблюдалось образование структурно дифференцированных покоя щихся клеток (рис. 5 и), сходных с цистами азотобактера. Большей термоустой чивостью (50, 55, 60°С;

10 мин) обладали ЦПК неэндофитного штамма Sp7, что коррелирует с усложнением их структурной организации и наличием внеклеточ ного матрикса (рис. 5 ж, з). Таким образом, полученные данные демонстрируют зависимость формирования покоящихся клеток определенных морфотипов сим биотрофными бактериями от характера их взаимодействий с растительным парт нером (неэндофитного или эндофитного).

3.3. Важным уровнем разнообразия является гетерогенность по степени проявления свойств покоя внутри популяции ЦПК одного типа, образующихся в данных конкретных условиях. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПК прояв лялось в длительно инкубируемых популяциях M. luteus (среда с лимитом N, 2- мес) в наличии различных типов ЦПК, имеющих толстые оболочки с одним (I тип), двумя (II тип) и более (III тип) слоями различной электронной плотности (рис. 5 к, л, м). По мере созревания увеличивалась доля толстостенных ЦПК II и III типов (до 70 – 80% к 6-9 мес.) и параллельно возрастала их устойчивость к ли зоциму (1 мкг/мл;

снижение титра КОЕ на 40-50%), что подтверждает вывод о развитии общей резистентности ЦПК с увеличением физиологического возраста.

Гетерогенность популяций ЦПК M. smegmatis (среда СР1, лимит N, 2 мес) была документирована результатами проточно-цитометрического анализа их кле точных суспензий (рис. 7). При их прокрашивании красителем Nile Red была выявлена субпопуляция ЦПК (45 ± 17% от общего числа клеток) с силь ной флюоресценцией, отражающей повышенное содержание триацилг лицеридов в составе внутриклеточ ных электронопрозрачных включе ний. Обогащенность ЦПК этими ли пидами (в 1.5 раза) по сравнению со стационарными клетками была под тверждена результатами ТСХ выде Рис. 7. Распределение покоящихся форм M. smeg- ленных фракций неполярных липи matis по интенсивности флюоресценции (ось Y) дов. Особо отметим, что индивиду после прокрашивания Nile Red и светорассеянию клеток как функции диаметра вращения и размера альная фракция ЦПК M. smegmatis, клеток (ось X). В заштрихованном треугольнике полученная при центрифугировании фракция ЦПК с сильной флюоресценцией.

клеточных суспензий в градиенте сахарозы и оказавшаяся гомогенной по морфологии, была гетерогенной как по характеристикам термоустойчивости, так и способности клеток ревертировать к росту на питательном агаре или в жидкой среде. Обнаружено нарушение способ ности у ЦПК микобактерий, прогретых при 65С (10 мин), к образованию макро колоний, притом, что их жизнеспособность сохранялась, и они образовывали микроколонии (мКОЕ) на плотной среде (рис. 6 б). Аналогичная тенденция про слеживалась для ЦПК S. aureus: резкое снижение титра КОЕ при обработке кле ток при 55 – 60С (но не выше) при сохранении колониеобразующей способности при температурах 65 – 75С. По-видимому, термообработка при «критической»

температуре не была достаточной для активации части популяции ЦПК, для про растания которой в виде макроколоний (КОЕ) требовалась бльшая доза теплово го воздействия.

Отметим, что прогревание при 70 – 80 С используется для активации эн доспор бацилл. Гетерогенность популяции покоящихся форм по отклику на тер мообработку и «нестандартность» реакции при 65 оС была выявлена в исследова ниях эндоспор B. licheniformis неинвазивным методом динамической фазовой микроскопии (ДФМ). Метод дает возможность: (1) регистрации максимальной (h) фазовой толщины (ФТ) микробных клеток как маркера их физиологического состояния: для покоящихся спор h 80 нм, инициированных спор h 40 нм, убитых нагреванием спор h 20 нм;

(2) анализа, как единичной споры, так и по пуляции (100 спор). При нагревании спор в неблагоприятных для прорастания ус ловиях (в физрастворе) выявлены немонотонность изменения максимальной h с ростом температуры (18-75 оС) и ее возрастание при 65 оС. Высокое значение h (100 нм) единичной споры (и большинства спор в популяции) было постоянным в интервале 20-35оС, снижалось до 45 нм в диапазоне 38-40оС;

затем возрастало до величины, характерной для покоящихся спор, при 65оС (критической температуре для прорастания прогретых ЦПК M. smegmatis) и снижалось при дальнейшем на гревании. При этом у преобладающего количества спор снижение h было обра тимым, что соответствует состоянию обратимой тепловой активации эндоспор в неростовых условиях. У большинства (95%) инициированных спор (15 мин после добавления питательного субстрата) величина h составляла 40 нм, однако у ми норной части она была повышенной, что отражает гетерогенность популяции по скорости прорастания спор и отклику на условия роста.

3.4. Фенотипическая вариабельность как еще одно проявление разнообразия покоящихся форм бактерий выражалась в существенном изменении диссоциатив ного спектра популяции, выросшей при посеве ЦПК на плотную среду. Качест венные и количественные изменения в диссоциативных спектрах, полученных в первом пассаже при рассеве ЦПК, зависели от условий их образования и сроков хранения. У Р. aurantiaca диссоциация проявлялась как переход исходного фено типа, дающего S-колонии, в R-тип или более пигментированный P-тип и была наиболее выражена при рассеве ЦПК, полученных на среде с двукратным лими том N, а также под воздействием C12-АОБ. Частота переходов SR (до 70%) и SР (до 80%) зависела от концентрации C12-АОБ и сроков хранения суспензий ЦПК. Выщепление диссоциантов R-типа (до 45%) наблюдалось при рассеве ЦПК, полученных в условиях лимитации N и хранившихся не менее 4 мес. У P.

fluorescens проявление диссоциативных переходов SR зависело не только от условий получения ЦПК, но и от состава плотных питательных сред, используе мых для их посева. Диссоцианты псевдомонад различались по скорости роста, ус тойчивости к антибиотикам и стрессам (повышенной солености и окислительно му), продуктивности по внеклеточным протеазам и чувствительности к действию аналогов микробных ауторегуляторов – С12-АОБ (табл. 8). Таким образом, страте гия переживания псевдомонадами неростовых условий обеспечена не только об разованием ЦПК различных морфотипов, но и внутрипопуляционной фенотипи ческой вариабельностью, проявляющейся при их прорастании.

Таблица 8. Свойства некоторых диссоциантов Тип Тип Характеристики Характеристики колоний колоний P. aurantiaca P. fluorescens Скорость роста, max: 0.04 ч-1 Скорость роста, max: 0.41 ч- Устойчивость (LD50) к: Устойчивость (LD50) к:

стрептомицину: 180 мкг/мл Н2О2: 1800 мкМ тетрациклину: 40 мкг/мл NaCl: 380 мМ R R Внеклеточные протеазы: 5.3 мЕ/мл С12 – АОБ: 54 мкМ Скорость роста, max : 0.02 ч-1 Скорость роста, max: 0.64 ч- Устойчивость (LD50) к: Устойчивость (LD50) к:

стрептомицину: 235 мкг/мл Н2О2: 600 мкМ тетрациклину: 25 мкг/мл NaCl: 185 мМ S (Д) S (Д) Внеклеточные протеазы: 15 мЕ/мл С12 – АОБ: 370 мкМ A. brasilense Sp7 A. brasilense Sp Тип подвижности Тип подвижности + — Swa--Gri Swa Gri (роение) (отсутствие под вижности) Sm Pg Тип подвижности Тип подвижности + + Swa+Gri Swa Gri (роение и миграция в (роение) виде микроколоний) S (Д) S (Д) Д – доминантный вариант. Величины отклонений ±5% не приводятся.

Еще один уровень различий диссоциантов связан со способностью к форми рованию покоящихся форм разных типов. Эти различия иллюстрируются образо ванием эндоспор или ЦПК диссоциантами S- и Mr- (муарового) типов B. subtilis и M –микоидного, W – белого и Tr- прозрачного вариантов B. cereus. Катаболитная репрессия спорообразования и формирование ЦПК происходили при развитии в средах с 4-8% глюкозы у всех диссоциантов, кроме Mr-типа B. subtilis и W-типа B.cereus. Образование ЦПК W-вариантом происходило только при повышении концентрации глюкозы в среде до 12% и не наблюдалось у Mr-типа, который в этих условиях образовывал споры.

Повышенная фенотипическая диссоциация выявлена при прорастании ЦПК симбиотрофных бактерий A. brasilense шт. Sp7 и шт. Sp245 и была более выраже на у неэндофита (шт. Sp7). Основными колониально-морфологическими вариан тами шт. Sp7 были: доминантный S-тип;

сильно пигментированный Pg-тип;

R тип;

Sm-тип, образующий мелкие колонии;

Sg-тип с сегментированными коло ниями. Частота появления фенотипических вариантов зависела не только от усло вий и сроков хранения ЦПК штамма Sp7, но и их предобработки перед посевом (прогрев при 55 и 60 С, 10 мин). Максимальная частота переходов SРg (до 74%) отмечена при прорастании ЦПК, хранившихся в нативной среде роста при – 20 С 4 мес, а SSm (до 100%) – при рассеве ЦПК после термообработки. Для симбиотрофных бактерий важным признаком является тип их роста и подвижно сти в полужидком агаре, имитирующем прикорневой полисахаридный матрикс.

Для S- варианта был характерен смешанный тип подвижности;

для Pg- и Sg - ва риантов – роение;

для Sm-варианта – отсутствие подвижности (табл. 8). Спектр диссоциантов эндофитного штамма Sp245 был менее разнообразным, чем штамма Sp7, и представлен S-, Sm- и M- вариантами с разной подвижностью клеток. Раз личия между неэндофитным и эндофитным штаммами азоспирилл в фенотипиче ской диссоциации могут отражать особенности адаптации к меняющимся услови ям и характер взаимоотношений этих бактерий с растениями.

Расширение диссоциативного спектра при прорастании ЦПК показано для E.

carotovora, B. subtilis, M. smegmatis, S. aureus. При рассеве разных типов покоя щихся клеток микобактерий и стафилококков на средах с канамицином или тет рациклином выявлена диссоциация с появлением антибиотикоустойчивых фено типов, что важно для понимания роли покоя в появлении клонов, резистентных к действию антимикробных препаратов. Таким образом, повышенная фенотипиче ская вариабельность, реализующаяся при прорастании ЦПК, отражает пластич ность бактериального генома и обеспечивает бльшие возможности дальнейшего развития популяции в новых условиях окружения.

Полученные результаты позволяют заключить, что внутривидовое и внутри популяционное разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий важный механизм, повышающий адаптационный потенциал бактерий для дли тельного выживания вида.

Глава 4. Диагностика и более полное выявление покоящихся форм бактерий Разработка критериев для мониторинга покоящихся форм микроорганизмов составляет важную задачу при изучении структуры и функционирования микроб ных сообществ и природных систем. Вклад в ее решение вносят результаты, по казавшие возможность выявления покоящихся форм прямыми методами и более полного учета численности жизнеспособных клеток в покоящихся популяциях культуральными методами.

4.1. Прямые методы. Результаты электронно-микроскопических исследова ний выявили аналогию ультраструктурной организации клеток непосредственно в образцах длительно мерзлых пород (без применения процедуры подращивания) (рис. 8) и ЦПК, полученных в лабораторных условиях (рис. 2 и 5), в т.ч., для изо лятов из мерзлоты. «Портретная» диагностика микробных клеток предлагается в качестве подхода к оценке их возможного физиологического состояния in situ.

а б в д г е Рис. 8. Тонкие срезы бактерий in situ в мерзлых образцах возрастом (а, б) 30-40 тыс. лет, (в) тыс. лет, (г) 2 млн. лет;

ЦПК: (д) штамма Micrococcus sp. 4-1 из образца мерзлого отложения, полученных на среде с лимитом P и хранившихся 3 года при 20 С;

(е) A.globiformis (среда с лимитом N). Метки: (а-в, г) 0.2;

(д, е) 0.1 мкм.

Другой подход к выявлению микроорганизмов в объектах окружающей среды и прогнозирования физиологического статуса обнаруживаемых клеток основан на использовании дифференциальных характеристик их элементного состава. Мето дом рентгеновского микроанализа были исследованы бактериоморфные частицы в образцах Антарктических мерзлых осадков (170 тыс лет) и пылевого наноса (рис. 9). Разработанный алгоритм диагностики включал анализ содержания P, S, Ca и K и соотношений Ca/K и P/S в частицах в сопоставлении с аналогичными характеристиками, полученными для микробных клеток различного физиологи ческого состояния (табл. 3) и другими авторами [Никитин и соавт., 1998]. Отсут ствие пиков P и S в рентгеновских спектрах позволяло характеризовать частицы как неживые (рис. 9 в, г). Среди объектов, предположительно отнесенных к клет кам, покоящиеся формы предложено выявлять по повышенному содержанию Ca, соотношениям Ca/K 1.0 и P/S (0.5 – 3.0).

б а ч ч г ч ч в Рис. 9. Вид в сканирующем микроскопе и рентгеновские спектры: (а, б) бактериоморфных час тиц, по-видимому, клеток, и (в, г) абиогенных частиц в (а, в) мерзлоте и (б, г) пылевом наносе.

Таким образом, разработаны диагностические критерии для дифференциро ванного выявления покоящихся форм непосредственно в природных объектах.

Совокупность приведенных результатов прямых микроскопических исследований позволяет заключить, что выживание неспорообразующих бактерий в таких эко системах, как древние (до 2 млн лет) вечномерзлые породы, обеспечивается за счет покоящихся форм типа ЦПК.

4.2. Для повышения результативности учета потенциально жизнеспособных клеток в популяциях ЦПК M. luteus, A. globiformis, P. aurantiaca, E. carotovora, для которых метод учета по КОЕ неэффективен, а доля живых клеток (тест с Live/Dead) была высокой (10-44%), были использованы следующие приемы для реверсии ростовых процессов. Так, прединкубация суспензий ЦПК M. luteus в бу ферном растворе 0.1 М К2НРО4 (рН 7.4) обеспечивала увеличение численности живых клеток, что свидетельствовало о восстановлении барьерной функции мем бран. Однако при этом не наблюдалось существенного повышения числа КОЕ при рассеве ЦПК на LB-агаре. Варьирование состава сред для посева с добавкой пи рувата Na и разбавление сред способствовало образованию макроколоний лишь небольшой частью популяции ЦПК M. luteus (50-80 КОЕ/мл). Однако в тех же ус ловиях численность клеток, способных к микроколониальному росту (мКОЕ), бы ла на 4 порядка выше, чем титр КОЕ. Наиболее успешными оказались учет чис ленности мКОЕ в полужидком агаре и использование МПР, когда наблюдалась практически полная реверсия ЦПК микрококков к росту (табл. 9).

Таблица 9. Повышение эффективности (в N раз) выявления жизнеспособных клеток за счет применения разных методов учета и модификаций сред Число живых Титр КОЕ/мл Учет Среда Титр жизнеспособ- N клеток,кл/мл по: для посева ных клеток не образующие колоний ЦПК М.luteus (лимит С+N, 6 мес.) разбавленный в (1.8 ±0.2)·105 мКОЕ/мл раз LB-агар 2.6·10 0.2 мКОЕ полужидкий LB (2.3 ± 0.5)·107 кл/мл агар МПР не образующие колоний ЦПК A.globiformis (дефицит N, 4 мес.) разбавленный в (3.3±0.7)·106 КОЕ/мл раза LB-агар 3.2·10 3–5 КОЕ не образующие колоний ЦПК P. aurantiaca (5-кратный лимит N, 2 мес.) 6.5·107 1.1 (0.3–3.3)·103 кл/мл МПР LB-бульон 1–2 не образующие колоний E.carotovora (С12-АОБ, 4·10-4 M, 6 мес.) 107 отмывка в безугле КОЕ родной среде, LB-агар 107 - 108 КОЕ/мл 2·109 1 – фракция ЦПК M.smegmatis (среда СР1, лимит N, 5 мес.) (2.6± 0.2)·105 МПР NB-среда 7·107 6·107 кл/мл ЦПК S. aureus (инкубация в ФР с 100 мМ CaCl2, 4 мес.) (1.0± 0.1)·108 МПР 7·109 3.0·109 кл/мл LB-бульон Примеры повышения эффективности учета жизнеспособных клеток в популяциях покоящихся форм других бактерий приведены в таблице 9.

Таким образом, показана возможность выявления ЦПК, потенциально спо собных к росту, но не образующих колонии. Также обнаружена большая по чис ленности субпопуляция покоящихся клеток, способных в первом пассаже только к микроколониальному росту, а при пересевах восстанавливающая способность к образованию макроколоний.

4.3. Повышение чувствительности ПЦР при использовании покоящихся форм бактерий. Для возможности использования покоящихся форм как источника ДНК матриц в ПЦР были применены ранее разработанные: (1) одностадийная обработ ка солями-хаотропами для пермеабилизации их клеточных оболочек и (2) двуста дийная обработка с дополнительной инкубацией с протеиназой К для деградации белковых оболочек и депротеинизации клетки [Данилевич, Гришин, 2002;