Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика
На правах рукописи
ПЛОТНИКОВА Елена Генриховна
БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ
И ИХ ХЛОРПРОИЗВОДНЫХ: РАЗНООБРАЗИЕ, ОСОБЕННОСТИ
МЕТАБОЛИЗМА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА
03.02.03 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Пермь - 2010
Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научные консультанты:
доктор медицинских наук, чл. – корр. РАН, профессор Демаков Виталий Алексеевич доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор биологических наук Донова Марина Викторовна доктор медицинских наук Несчисляев Валерий Александрович
Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Защита состоится «» 2010 г. в _ часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс:
(342) 2446711.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан « » _ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема очистки наземных и водных экосистем, загрязненных токсичными, устойчивыми к разложению и представляющими опасность для здоровья человека химическими соединениями, занимает центральное место в ряду актуальных задач современной экологии. Среди поллютантов, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, а также тенденцией к биоаккумуляции, наиболее распространенными являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бифенил и его хлорированные производные (Hall, Grover, 1999;
ATSDR, 2000). ПАУ поступают в окружающую среду с разливами нефти, отходами коксохимических, газоперерабатывающих производств и химических предприятий, образуются при неполном сгорании топлива и бытовых отходов (Seo et al., 2009).
Полихлорированные бифенилы (ПХБ) широко применялись в течение нескольких десятилетий при производстве лакокрасочных материалов, пластификаторов, пестицидов, в электротехнической промышленности. В настоящее время производство и использование ПХБ, как особо стойких органических загрязнителей, запрещено Стокгольмской Конвенцией (http://www.unep/org).
Наряду с задачами по восстановлению экосистем, загрязненных этой группой токсикантов, остро стоит проблема детоксикации больших объемов невостребованных коммерческих смесей, созданных на основе хлорбифенилов (Васильева, Стрижакова, 2007;
Pieper, Seeger, 2008). Биоремедиация почв и других объектов окружающей среды с использованием микроорганизмов-деструкторов (хлор)ароматических соединений имеет ряд известных преимуществ по сравнению с другими методами экобиотехнологии (Sutherland et al., 1995;
Pieper, 2005;
Cao et al., 2009).
К настоящему времени обнаружены и описаны бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать нафталин, фенантрен, антрацен, другие высокомолекулярные ПАУ (Боронин и др., 1989;
Бабошин и др., 2005;
Kanaly, Harayama, 2000;
Jones et al., 2003;
Reng et al., 2008). Способность к трансформации ПХБ описана для широкого круга бактерий – протеобактерий (Acinetobacter, Alcaligenes, Cupriavidus, Pseudomonas, Sphingomonas), актинобактерий (Rhodococcus, Arthrobacter), споровых (Bacillaceae) (Bedard, Haberl, 1990;
Furukawa, Fujihara, 2008;
Pieper, Senger, 2008). Однако известны лишь единичные штаммы, исключительно представители протеобактерий (Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas и Ralstonia), которые могут полностью разлагать моно и дихлорбифенилы (Kim, Picardal, 2001;
Adebusoye et al., 2008).
Большинство известных штаммов-деструкторов трансформируют ПХБ до соответствующих хлорбензойных кислот (ХБК). Последующие этапы деградации хлорбензоатов в ПХБ-деградирующих микробных системах осуществляют обычно другие группы организмов (Unterman, 1996). Среди них значительная роль принадлежит бактериям, осуществляющим отщепление галогена на первых этапах разложения хлорбензоатов, в результате чего образуются менее токсичные соединения, доступные для использования в качестве субстрата для многих почвенных микроорганизмов (Карасевич, 1982;
Scholten et al., 1991;
Fetzner, 1998;
Field, Sierra-Alvarez, 2008).
Развитие молекулярно-генетических методов и исследования в области структурной и функциональной геномики бактерий-деструкторов способствовало пониманию молекулярных механизмов биодеградации вышеназванных соединений. Показано, что генетические детерминанты (гены/опероны) бактериальной деструкции ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК локализованы в хромосоме и высокомолекулярных плазмидах, и могут присутствовать в клетке в нескольких копиях (Boronin, 1992;
Sanseverino et al., 1993;
Reineke, 1998;
Shimizu et al., 2001;
Dennis, Zylstra, 2004;
Basta et al., 2005;
Chain et al., 2006;
Iwasaki et al., 2006).
Имеются сведения о горизонтальном переносе генов биодеградации в составе мобильных генетических элементов (плазмид, транспозонов, интегронов), в том числе между бактериями различных филогенетических групп (Fulthorpe, Campbell, 1992;
Herrick et al., 1997;
Nishi et al., 2000;
Gartemann, Eichenlaub, 2001;
Habe, Omori, 2003;
Reng et al., 2008). Установлена важная роль диоксигеназ на начальных этапах аэробной деструкции ПАУ и бифенила/ПХБ (McKay et al., 1997;
Gibson, Parales, 2000;
Seeger et al., 2001;
Jakoncic et al., 2007;
Schuler et al., 2009). Ферменты этой группы способны осуществлять трансформацию многих полиароматических соединений, что определяет их важную роль в развитии различных биотехнологий (Harayama, 1997;
Boyd et al., 2001;
Bamforth, Singleton, 2005;
Shindo et al., 2007;
Cao et al., 2009).
Функциональные особенности бактерий-деструкторов в комплексе с данными по структурной и функциональной геномике находятся в фокусе внимания современной микробной экологии, а также активно развивающейся системной биологии. Концепции системной биологии и синергия экологических подходов и технологий геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики являются, с точки зрения современной науки, наиболее перспективным подходом к пониманию механизмов адаптации и (микро)эволюции индивидуальных микроорганизмов и микробных сообществ к условиям изменяющейся природной среды, особенно в условиях многофакторного негативного воздействия (Trigo et al., 2009). Изучение микроорганизмов, обитающих в определенных эколого-географических условиях и подверженных одновременному воздействию различных антропогенных факторов (в т.ч. высокий уровень токсичных поллютантов и повышенная минерализация среды), вызывает особый интерес. Актуальность таких исследований, наряду с теоретическими аспектами, обусловлена также и практическими задачами экобиотехнологии. Основной среди них является разработка новых стратегий биоремедиации, в том числе в связи с неэффективностью технологий, созданных на основе не адаптированных к соответствующим условиям микроорганизмов.
Имеющиеся сведения о микроорганизмах, способных к деструкции полиароматических углеводородов в условиях высокой солености, немногочисленны и касаются, в основном, грамотрицательных или «морских»
бактерий родов Pseudomonas, Сycloclasticus, Vibrio, Lutibacterium, Neptunomonas (Garsia-Valdes et al, 1988;
Dyksterhouse et al., 1995;
Geiselbrecht et al., 1998;
Hedlud et al., 1999, 2001;
Chung, King, 2001;
Kasai et al., 2002;
Garca et al., 2005;
Abed et al., 2006), а также спорообразующих бактерий (Paenibacillus) (Daane et al., 2002).
Крайне слабо изучены механизмы адаптации бактерий к таким условиям существования (Roberts, 2005;
Oren, 2008), а также взаимодействия внутри микробных сообществ: регуляция их состава, метаболической активности и устойчивости к высокому содержанию солей. До начала наших работ практически отсутствовали сведения о разнообразии и функциональных особенностях грамположительных бактерий - резидентов наземных экосистем, в которых ведущими факторами формирования микробиоценозов являются соленость среды и токсичный поллютант. Все вышесказанное определяет актуальность и перспективность фундаментальных и прикладных исследований в этом направлении.
Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование таксономического, генетического, функционального разнообразия аэробных бактерий-деструкторов ПАУ и ПХБ, а также создание и изучение бактериальных штаммов и ассоциаций с заданным биодеградативным потенциалом.
Основные задачи
исследования:
1. Выделение бактерий-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила/ПХБ, ХБК из почв/грунтов, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств.
2. Изучение генотипических и фенотипических характеристик изолятов и определение их таксономического положения с использованием принципов полифазной таксономии.
3. Характеристика экологических особенностей и биодеградативного потенциала выделенных бактерий.
4. Изучение разнообразия ключевых генов деструкции нафталина, бифенила/ПХБ и ХБК у бактерий.
5. Конструирование метаболических путей деструкции хлорированных соединений на уровне бактериальной клетки и ассоциации бактерий.
6. Выделение и изучение галотолерантных нафталинметаболизирующих консорциумов бактерий.
Научная новизна. Получены новые сведения о разнообразии микробных сообществ, обитающих в условиях повышенной солености, высокого уровня загрязнения среды токсичными поллютантами. Выделено и изучено более штаммов-деструкторов ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК - представителей классов Proteobacteria (роды Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), Actinobacteria (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces) и семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibacillus).
Выявлены бактерии, разлагающие токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40С), рН среды (от 5 до 9) и при повышенной солености среды (до 90 г/л NaCl). Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 – орто-моно(ди)ХБ;
Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) – (орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ. Впервые выделены в культуру и охарактеризованы галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена), относящиеся к родам Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов валидно описаны новый род Salinicola, включающий вид S. socius, а также новые виды рода Brevibacterium – В. permense, B. antiquum и В. aurantiacum;
выявлены новые виды «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov. и ряд других видов.
Обнаружены и изучены ключевые гены начального этапа разложения бифенила/ПХБ у бактерий-деструкторов родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus. Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis КЗТ1, контролирующие гидролитическое дегалогенирование 4ХБК. Путем клонирования fcb-генов в клетки P. putida впервые сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК, более эффективный в отношении утилизации субстрата в сравнении с природными штаммами. В результате селекции на высоких концентрациях 4ХБК рекомбинантного штамма P. putida КЗ-6R (pPC3) получены супердеструкторы 4ХБК. Впервые у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы fcb-гены, кодирующие компоненты 4ХБК-дегалогеназы.
Клонированы и изучены новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов. ohb–Гены фланкированы IS1396-подобными последовательностями, содержащими предполагаемые гены транспозазы А (tnpA) и ДНК топоизомеразы I/III (top).
Впервые выделены и исследованы ассоциации бактерий, способные к росту и утилизации нафталина в условиях высокой солености среды (до 8 - 9 % NaCl).
Показано, что в состав ассоциаций входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. Экспериментально подтверждено присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме SMB3 между деструкторами нафталина и бактериями-спутниками. Впервые получены данные о положительном влиянии экзогенных осмопротекторных соединений, продуцируемых галофильными/галотолерантными бактериями исследуемых микробных ассоциаций, на разложение ПАУ штаммами деструкторами в условиях повышенной солености среды. Для представителей рода Rhodococcus (деструкторов нафталина из консорциума SMB3) впервые описана комбинация осмопротекторов: глутамат, эктоин и гидроксиэктоин.
На основе выделенных и детально охарактеризованных штаммов деструкторов ПХБ и ХБК предложены и экспериментально обоснованы новые подходы к созданию бактериальных ассоциаций, способных эффективно осуществлять утилизацию различных конгенеров ПХБ (как индивидуальных, так и в составе коммерческих смесей).
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о способности аэробных бактерий разлагать ароматические соединения при повышенной солености среды расширяют представления о системах биодеградации ПАУ и могут быть использованы для создания новых эффективных биотехнологий восстановления окружающей среды. Выделенные и детально охарактеризованные уникальные штаммы-деструкторы ПХБ, в частности, Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) (Патент РФ №2262531), могут применяться для восстановления почв и водоемов, загрязненных ПХБ, а также в технологиях детоксикации промышленных смесей, содержащих хлорбифенилы. Полученные путем селекции галотолерантные нафталинметаболизирующие консорциумы являются перспективными для биоремедиации загрязненных ПАУ почв и водоемов в условиях засоления. Данные по механизмам функционирования консорциумов могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем. Результаты изучения D-плазмид галотолерантных бактерий-деструкторов найдут применение при конструировании рекомбинантных штаммов для создания биотехнологий ремедиации антропогенных экосистем.
Конструирование рекомбинантного пути полной деградации 4ХБК в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды, содержащие fcb- и ohb-гены, были использованы в совместных исследованиях в Центре микробной экологии Мичиганского университета (г. Лансинг, США). На основе fcb- и ohb-генов был создан ряд генноинженерных штаммов, осуществляющих полную утилизацию орто- и пара-хлорбифенилов. Полученные рекомбинантные штаммы-деструкторы хлорированных бензойных кислот и бифенилов могут быть использованы при создании инновационных технологий защиты окружающей среды от токсичных галогенароматических соединений.
Новые данные о разнообразии бактерий и генетическом потенциале микробного сообщества района солеразработок (г. Березники, Пермский край) являются основой для разработки критериев мониторинга этого уникального микробиоценоза. Результатом изучения таксономического разнообразия явились усовершенствованные системы классификации и идентификации бактерий ряда групп - важными для микробиологической практики и в связи с вопросами интеллектуальной собственности.
Создана обширная рабочая коллекция бактерий-деструкторов (галоген)арома тических соединений и галотолерантных/галофильных бактерий, доступных для фундаментальных и научно-прикладных исследований специалистами разного профиля. Большинство штаммов включены в фонд Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, ИБФМ, г. Пущино) и Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь).
Дубликаты типовых штаммов описанных новых видов депонированы в ВКМ и Биологических ресурсных центрах мира (в Германии, Бельгии, Франции, Японии), а также включены в международную поисковую систему Straininfo (http://www.straininfo.net). Сведения о последовательностях генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, nar, bph) штаммов-деструкторов включены в GenBank (Национальный центр биологической информации, США;
http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и сопряженные базы данных (EMBL, DDBJ, EzTaxon) других стран.
Материалы диссертации используются в лекционных курсах Биологического факультета (на Кафедрах микробиологии и иммунологии;
ботаники и генетики растений) Пермского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas преобладают среди культивируемых аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов ПАУ из микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Бактерии содержат разнообразные генетические детерминанты (D-плазмиды, гены/опероны), контролирующие ключевые этапы разложения нафталина и фенантрена.
2. Полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов (феномен ранее не известный для грамположительных бактерий) осуществляют штаммы Microbacterium sp. В51 [(орто-моно(ди)ХБ] и Rhodococcus ruber Р25 [(орто)пара моноХБ и 2,4’диХБ]. Другие активные штаммы бактерий характеризуются разной окислительной способностью по отношению к орто- и пара-хлорированным бифенилам. Бактерии-деструкторы моно(ди)хлорбифенилов, относящиеся к родам Arthrobacter, Rhodococcus, Janibacter и Pseudomonas, содержат структурно различающиеся гены, контролирующие начальный этап разложения бифенила/ПХБ.
3. Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis KЗТ1, контролирующие реакцию гидролитического дегалогенирования 4ХБК. В клетках P. putida с использованием fcb-генов сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК и получены супердеструкторы, характеризующиеся высокой стабильностью признака утилизации этого соединения. Клонированы и охарактеризованы новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов.
4. В условиях повышенной солености среды (до 8-9% NaCl) эффективная деструкция и утилизация в качестве источника углерода нафталина может осуществляться консорциумами бактерий, включающими галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinоmycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина.
В галотолерантных нафталинметаболизирующих ассоциациях микроорганизмов присутствуют протокооперативные взаимоотношения.
5. В составе микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей присутствуют галофильные и галотолерантные бактерии новых таксонов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 119 печатных работ, включая 24 экспериментальные статьи в реферируемых зарубежных, центральных и региональных журналах, 1 обзор, 2 патента, 1 учебное пособие (в соавторстве), 18 статей в сборниках научных статей, 73 тезисов докладов и сообщений на российских и международных конференциях и симпозиумах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на _ страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, отражающих результаты исследований, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего _ литературных источников, из них на русском и на английском языках.
В Приложении приведены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, nar, bph) исследуемых штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank.
Связь работы с крупными научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН, тема «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологии» (№ гос. рег. 0120.0406511), а также в рамках Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные основы воспроизводства и оптимизации генофондов растений, животных и человека»;
Программы интеграционных фундаментальных исследований Президиума УрО РАН, выполняемых в содружестве с учеными СО РАН;
проектов РФФИ №00-04-49056-а, №02-04-49043-а, РФФИ-Урал №02-04-96404_а, №04-04-96042_а, №07-04-96078_а, №07-04-97625-р_офи.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на международных симпозиумах и конференциях:
III Международном симпозиуме «Pseudomonas» (Триест, 1991), Конференции Американского общества микробиологов «Анаэробное дегалогенирование»
(Атенс, 1992), Съездах Американского общества микробиологов (1993;
1994;
1996), X Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002), I Конгрессе Европейского микробиологического общества (Любляна, 2003), Международных конференциях «Загрязнение окружающей среды» (Москва, 1998;
Волгоград-Пермь, 2001;
Пермь, 2008), IV и V Международных семинарах-презентациях инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» и «Биотехнология-2001» (Пущино, 2000;
2001), Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса» (Пермь, 2001), Международном Байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), Международной конференции «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), II и III Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005;
2008), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды»
(Саратов, 2005), IV и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007), Международных научных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Кишинев, 2009) и других.
Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, заведующему лабораторией химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, чл.-корр. РАН В.А. Демакову - за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении работы;
научному консультанту, заведующей отделом ВКМ Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, д.б.н. Л.Н. Евтушенко - за консультативную помощь при выполнении таксономических исследований. Автор признателен коллегам лаборатории, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях - к.б.н. О.В. Ястребовой, к.б.н. Д.О. Егоровой, к.б.н. Л.Н.
Ананьиной, к.б.н. Е.С. Шумковой, к.б.н. А.В. Назарову, а также другим сотрудникам ИЭГМ УрО РАН, способствовавшим успешному выполнению работы. Особую благодарность автор выражает Т.В. Цой и О.В. Мальцевой;
сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. И.А. Кошелевой, д.б.н. Л.А. Головлевой, д.б.н. И.П. Соляниковой и другим сотрудникам института за искреннюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микроорганизмы и плазмиды. Исследуемые бактериальные штаммы были изолированы из образцов почв, грунтов и донных отложений, отобранных с трех локальных территорий, загрязненных отходами предприятий химической промышленности, территории завода конденсаторов г. Серпухова Московской области;
территории предприятия ОАО «Галоген» г. Перми;
производственных площадок соледобывающего производства ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край). При изучении генетических систем раннего дегалогенирования ХБК использовали штаммы Arthrobacter globiformis КЗТ1, P. putida КЗ6 (Зайцев, Карасевич, 1981, 1984, 1985), P. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993), а также P. putida mt-2 (Bagdasarian et al., 1981) и Pseudomonas sp. B13 (Dorn et al., 1974). Для проведения генетических исследований (определение размера D-плазмид, конъюгационные эксперименты) штаммы P. putida BS394 (cys-, nah-, sal-), P. putida PpG7 (Dunn, Gunsalus, 1973) и pRK2013, NPL-1, NAH7, pASN1, pDK8 были получены из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН.
При клонировании и изучении функциональных генов использовали рекомбинантные штаммы E. coli: JM109 (Yanish-Perron et al., 1985), DH5 F' («Bethesda Research Laboratories», США), 925 (F+ minA minB thr leu thi) (Stoker et al., 1984) и векторные плазмиды pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985), BlueScript («Stratagene», США), pSP329 (Schmidhauser, Helinski, 1985), pRK415(Keen et al., 1988). Для сравнительного изучения использовали типовые культуры из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино), Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь) и из зарубежных коллекций.
Методы. Для выделения и роста бактерий-деструкторов были использованы жидкие и агаризованные минеральная среда К1 (Зайцев, Карасевич, 1981) и минеральная среда Раймонда (Розанова, Назина, 1982). В качестве полноценных сред использовали среду LB (Маниатис и др., 1984), а также модифицированную среду Раймонда при добавлении 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта в качестве ростовых субстратов. Чистые культуры бактерий хранили в глицерине при -80°С и в лиофильно высушенном состоянии. Для получения биомассы с целью измерения активностей и очистки ферментов проводили культивирование бактерий в среде К1 методом периодического культивирования, используя нафталин, фенантрен, салицилат, 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии. Определение количества биомассы проводили спектрофотометрически при =540 нм. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний бактерий на чашках с полноценной агаризованной средой.
Кинетические характеристики растущей периодической культуры определяли согласно рекомендациям (Перт, 1978).
Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий изучали по стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983). Состав аминокислот и сахаров в препаратах клеточных стенок (Schleifer, Kandler, 1972) определяли хроматографически (Suzuki et al., 1993). Определение состава жирных кислот целых клеток и хинонов определяли с использованием методов ГЖХ и масс-спектрометрии (Zhilina et al., 1997;
Suzuki et al., 1993).
Выделение тотальной ДНК проводили методом, описанным (Current protocols in molecular biology, 1995). Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре ее тепловой денатурации (Owen, Lapage, 1976). Выявление клонов и предварительную группировку штаммов бактерий осуществляли методами ДНК типирования (REP-ПЦР, BOX-ПЦР и ARDRA) как описано ранее (Versalovic et al. 1994;
Scortichini et al., 2002). Амплификацию 16S рРНК генов проводили по описанным методам с использованием универсальных бактериальных праймеров (Weisburg et al., 1991). Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и функциональных генов проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBACE 1000 в соответствии с рекомендациями производителя («JSC GE Healthcare», США). Для филогенетического анализа использовали последовательности 16S рРНК генов, депонированные в GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org).
Последовательности 16S рРНК генов выравнивали с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических древ производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, DeWachter, 1994).
Плазмидную ДНК выделяли стандартными (Marco et. al., 1982;
Бабыкин и др., 1984) и оригинальными методами. Электрофорез в агарозном геле, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, щелочной фосфатазой, нуклеазой Bal31, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, лигазой фага Т4 проводили в соответствии с рекомендациями (Маниатис и др., 1984). Коньюгационный перенос плазмидной ДНК осуществляли, используя модифицированный метод (Dunn, Gunsalus, 1973). Элиминация бактериальных плазмид проводилась согласно стандартной методике (Rheinwald et al., 1973). Трансформацию плазмидных ДНК в клетки E. coli и P. putida осуществляли по общепринятой методике (Dagert, Ehrlich, 1979), а также методом электропорации на приборе E. coli Gene Pulser («Bio-Rad Laboratories», США). Клонотеки генов A. globiformis КЗТ1 и P. aeruginosa 142 конструировали при использовании плазмидных векторов pUC19, BlueScript, pSP329 в клетках E. сoli JM109 и E. сoli DH5 F'. Для обнаружения рекомбинантных клонов, содержащих fcb- и ohb-гены, использовали оригинальные подходы с применением методик (Резников и др., 1970;
Parke, 1992).
Реакцию ник-трансляции, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли по (Rigby et al., 1977;
Southern, 1975).
Получение мини-клеток E.coli и включение 35S-метионина проводили в соответствии с рекомендациями (Stoker et al.,1984). Электрофорез белков проводили по (Laemmli, 1970), используя 12.5% полиакриламидный гель.
Структуру ассоциации бактерий SMB3 исследовали методом ДГГЭ фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с применением эубактериальных праймеров 27F и 518R (Tiirola et al., 2002). Электрофорез был выполнен на DcodeTM Universal Mutation System («Bio-Rad Laboratories», США) согласно протоколу (Muyzer et al., 1993) Для амплификации fcb-генов использовали праймеры, сконструированные на основе гомологичных последовательностей fcb-генов штамма A. globiformis КЗТ (Rodrigues et al., 2001). При изучении bph-генов штаммов деструкторов бифенила/ПХБ применяли вырожденные праймеры, подобранные к участкам генов, кодирующих -субъединицы известных ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Witzig et al., 2006).
Продукты бактериального разложения ПАУ и 4ХБК определяли методами ТСХ и ВЭЖХ. Анализ метаболитов деструкции ПХБ проводили спектрофотометрически при длине волны 390 - 450 нм и методом ВЭЖХ (Maltseva et al., 1999). Динамику дегалогенирования ПХБ и ХБК контролировали по содержанию ионов хлора в культуральной жидкости, освобожденной от клеток (Резников и др., 1970).
Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически.
Удельные активности нафталин и фенантрен диоксигеназ определяли согласно (Dua, Meera, 1981), салицилат и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаз - (Кiyohara, Nagao, 1978), катехол 2,3- и 1,2-диоксигеназ - (Feist, Hegeman, 1969 и Ornston, 1966), гентизат диоксигеназы - (Crawford et al., 1975). Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение 1 мкМ субстрата или образование 1 мкМ продукта в минуту. Относительную активность рассчитывали, принимая за 100% активность с незамещенным субстратом.
Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Брэдфорда (Schlomann et al., 1990).
Выделение осмопротекторов проводили из галофильных и галотолерантных бактерий, выращенных в минеральной среде Раймонда с разной соленостью и глюкозой в качестве субстрата. Спектры ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY («Bruker», Германия) (Хмеленина и др., 2000).
Повторность экспериментов, как минимум, трехкратная. При статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал, достоверность результата. Для обработки результатов использовали статистический модуль Exсel 5.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов Методом накопительного культивирования из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений было выделено 240 штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена. Данные анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических особенностей изолятов позволили установить их принадлежность родам Arthrobacter, Brevibacterium, Dietzia, Kocuria, Rhodococcus, Streptomyces, Janibacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. Ниже приводятся характеристики 3-х групп бактерий-деструкторов ПАУ: актинобактерий порядка Actinomyсetales (роды Arthrobacter и Rhodococcus);
спорообразующих бактерии родов Bacillus и Pаenibacillus;
протеобактерий рода Pseudomonas. Ряд этих бактерий входит в состав нафталинметаболизирующих комплексов (см. раздел 4.1.).
1.1. Бактерии-деструкторы рода Arthrobacter Результаты генотипирования восьми штаммов рода Arthrobacter, выделенных из почв района солеразработок, показали, что штаммы B901, B904, B составляют одну геномогруппу. Штаммы SF27, DF14, SN17, SMB145 и SMB отличаются как от данной группы, так и между собой по BOX-ДНК профилям.
Пять штаммов (B905, SMB11, SMB145, SF27 и DF14) были наиболее близки по нуклеотидным последовательностям 16S рРНК генов с типовым штаммом вида A. сrystallopoietes (уровень сходства 99.7%), а SN17 - с типовым штаммом вида A. arilaitensis (уровень сходства 99.8%). На рисунке 1 представлена дендрограмма, отображающая положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter.
Большинство исследуемых артробактерий являются галоалкалотолерантными организмами: растут при щелочных значениях рН (до 9.0), а также в присутствии до 110 г/л NaCl на полноценных средах и до 60 г/л соли на минеральной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии. Штаммы SMB145 и В905 растут на нафталине в присутствии до 90 г/л NaCl, а штамм SF27 - на фенантрене при содержании до 60 г/л соли.
0. SN A. arilaitensis CIP 108037 T (AJ609628) A. nicotianae DSM 20123T (NR_026190) A. mysorens DSM 12798T (AJ617482) A. uratoxydans DSM 20647T (X83410) A. ardleyensis An25T (AJ551163) A.bergeri CIP 108036 T (AJ609630) A. creatinolyticus gifu12498T(D88211) A. protophormiae DSM 20168T (X80745) A. psychrophenolicus DSM 15454T(AJ616763) A. kerguelensis KGN15T (AJ606062) A. sulfureus DSM 20167T (X83409) A. gangotriensis Lz1YT (AJ606061) A. rhombi F98.3HR69T (Y15885) A. globiformis M23411T(ARGSSRNA) A. ramosus DSM 20546T (X80742) A. pascens DSM 20545T (X80740) A. psychrolactophilus B7T (AF134179) A. stackebrandtii CCM 2783T (AJ640198) A. russicus GTC 863T (AB071950) A.sulfonivorans DSM 14002T (AF235091) A. roseus CMS90T (AJ278870) A. chlorophenolicus A6T (AF102267) T 100 A. scleromae YH-2001 (AF330692) 62 A. polychromogenes DSM 20136T (X80741) A. oxydans DSM 20119T (X83408) A. woluwensis 1551T (X93353) A. methylotrophus DSM 14008T (AF235090) 100 SMB A. crystallopoietes DSM 20117T (X80738) 56 DF SF 56 B SMB A. agilis DSM 20550T (X80748) A. tecti LMG22282T(AJ639829) A. parietis LMG 22281T (AJ639830) A. tumbae LMG 19501T(AJ315069) A. luteolus DSM 13067T (AJ243422) A. koreensis CA15-8T (AY116496) A. citreus DSM 20133T (X80737) A. gandavensis R5812T (AJ316140) 100 A. nicotinae DSM 20123T (X80739) 91 A. histidinolovorans DSM 20115T (X83406) A. ureafaciens DSM 20126T (X80744) A. ilicis DSM 20138T (X83407) 79 A. nitroguajacolicus CCM 4924T (AJ512504) A. aurescens DSM 20116T (X83405) A. monumenti LMG 19502 T (AJ315070) A. pigmenti LMG 22284T (AJ639827) A. castelli LMG 22283 T (AJ639826) A. nasiphocae M597/99/10T (AJ292364) A.atrocyaneus DSM 20127T (X80746) A. cumminsii 445T (X93354) A. albus DSM 13068T (AJ243421) Mycobacterium tuberculosis H37/Rv (X52917) Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода “neighbor-joining”, отображающее положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).
У бактерий выявлены разнообразные пути метаболизма ПАУ. Штаммы B901, B904, B905, SMB11 и SMB145 осуществляют катаболизм нафталина с образованием салицилата и катехола как ключевых интермедиатов. Анализ деструктивных особенностей другой группы штаммов (штаммов SF27, DF14 и SN17) указывает на наличие у них двух путей разложения салицилата - через катехол и гентизат (Yen, Serdar, 1988;
Grund et al., 1992). Штаммы SF27 и DF эффективно растут на фенантрене и возможных продуктах его метаболизма – 1-гидрокси-2-нафтоате и орто-фталате. Три других штамма B901, B904 и SMB способны к слабому росту на фенантрене и не растут на орто-фталате.
На основании анализа метаболитов и изучения ферментативных активностей можно предположить, что утилизация фенантрена штаммами SF27 и DF14 идет по орто-фталатному пути, как описано для нескольких деструкторов рода Arthrobacter (Бабошин и др., 2005;
Seo et al., 2006), а штаммы SMB11, B901 и B осуществляют деструкцию фенантрена с образованием 1-гидрокси-2-нафтоата, 1,2-дигидрокси-нафталина и салицилата при участии ферментов пути утилизации нафталина (Iwabuchi, Harayama, 1998). Штаммы SN17, В905, B901 и B обладают широкой субстратной специфичностью и способны к деструкции не только нафталина, фенантрена, но и бифенила, фенола, алифатических углеводородов.
Результаты исследований на наличие экстрахромосомальной ДНК показали, что штамм SN17 содержит плазмиду размером ~85 т.п.н., в штаммах DF14, SF27, B901, B904 и B905 зарегистрированы плазмиды размером ~120 т.п.н. (рис. 2). При обработке клеток штамма SF27 митомицином С были получены элиминанты, которые не росли на нафталине, фенантрене и 1-гидрокси-2-нафтоате, но сохраняли способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1-гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма SF27, кодируются плазмидными генами. Факт локализации генов, ответственных за разложение ароматических соединений, в плазмидах описан для многих бактерий (Hayatsu et al., 1999;
Eaton, 2001;
Sandu et al., 2005;
Jerke et al., 2008).
Рис. 2. Электрофореграммы плазмидных ДНК: (А) 1 – рВ905;
2 – pКЗТ1 (110 т.п.н.);
3 – –pB904;
4 – pB901. (Б) 1 – рSF27;
2 – рDF14;
3 – рSN17;
4 – NAH (83 т.п.н.).
1 2 3 4 1 2 3 А В 1.2. Бактерии-деструкторы рода Rhodococcus Исследовано тринадцать бактерий-деструкторов рода Rhodococcus, двенадцать из которых выделены из района солеразработок. По результатам типирования выявлено шесть геномогрупп, и у десяти штаммов определены нуклеотидные последовательности 16S рРНК генов. Анализ фрагментов генов 16S рРНК размером около 560 п.н. этих бактерий с аналогичными последовательностями типовых штаммов рода Rhodococcus показал 100% сходство со штаммами R. wratislaviensis 13082 T (штаммы G10, B13, В14), R. ruber DSM 43338T (штаммы DB11, SN31), R. erythropolis ATCC 4277T (штамм I25).
Штаммы SMB37, B2-1 и B1-4, по всей вероятности, относятся к новому виду, наиболее близкому к R. pyridinivorans (уровень сходства 97.3%), а штамм SMB скорее всего представляет новый вид, близкий к R. marinonascens (уровень сходства 98.9%).
Все родококки, выделенные из накопительных культур при повышенной солености среды (30-60 г/л NaCl), способны расти при содержании хлорида натрия до 90-120 г/л в полноценной среде и до 60-90 г/л - в минеральной среде с нафталином. Штаммы SMB37, SMB38, B2-1, B13, B14 и B1-4 растут в пределах рН 6.0-9.0, штаммы G10, I17, I17а - при рН 7.0-9.0, штаммы I25, I31 - при рН 7.0-8.0, штамм SN31 – при рН 6.0-7.0 и штамм DB11 – при рН 6.0-8.0.
Бактерии росли на нафталине, бифениле, салицилате, гентизате и протокатехате в качестве источника углерода, большинство из них способны расти на бензоле, толуоле, феноле, бензоате и дизельном топливе. Штаммы SMB37, B2-1, B13, B14 и B1-4 осуществляли разложение хлорароматических соединений (ХБК и 2,4-Д). Рост штаммов на салицилате и гентизате дает основание предполагать, что разложение нафталина изученными штаммами осуществляется по гентизиновому пути, описанному для ряда представителей этого рода (Grund et al., 1992;
Di Gennaro et al., 2001;
Kulakov et al., 2005).
У двух изученных штаммов были обнаружены плазмиды разного размера (рис. 4): у SN31 – одна плазмида (~100 т.п.н), а у G10 - две плазмиды (~85 т.п.н. и 70 т.п.н.). В то же время, необнаружение плазмид у других изученных штаммов родококков не дает основания считать, что экстрахромосомальная ДНК у них отсутствует, так у представителей этого рода плазмиды часто имеют значительно большую молекулярную массу и для их выявления необходимо использование специальных методов выделения и детекции (Shimizu et al., 2001).
1.3. Спорообразующие бактерии родов Bacillus и Paenibacillus Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов семи спорообразующих штаммов из района солеразработок показал, что штаммы I12b, I23 и I27 являются представителями разных 16S рРНК-групп рода Bacillus (Ash et al., 1991) (рис. 3). Штаммы I23 и I27 входят в кластер «B. pumilus»
(уровни сходства 100% и 99.3%, соответственно, с B. pumilus DSM27T). Штамм I12b наиболее близок к B. hwajinpoensis SW-72T (уровень сходства 98.8%).
Полученные данные не позволяют однозначно отнести ни один из вышеперечисленных штаммов к какому-либо известному виду;
два из них (I12b и I27), по всей вероятности, представляют собой новые виды. Анализ генов 16S рРНК штаммов I10b и SN501 выявил принадлежность штаммов к роду Paenibacillus (рис. 3), виды которого ранее входили в одну из филогенетических групп Bacillus (Ash et al., 1993). Штамм I10b наиболее близок к P. amylolyticus NBRC 15957T (уровень сходства 16S рРНК генов 99.8%), а штамм SN501 - c P. naphthalenovorans PR-N1T (уровень сходства 99%).
Бактерии являются галоалкалотолерантными организмами, способны к росту в щелочных условиях (до pH 9.0) и при содержании 90-110 г/л NaCl в среде культивирования. Утилизируют дизельное топливо, ряд индивидуальных ароматических и алифатических углеводородов. Paenibacillus sp. SN501 обладает широкой субстратной специфичностью: растет на нафталине, фенантрене, салицилате, орто-фталате, а также феноле и октане. Так как штаммы-деструкторы SN501 и I10b не растут на гентизате и 2-метилсалицилате, и не образуют полуальдегид оксимуконовой кислоты (продукт мета-расщепления катехола), можно предположить, что деструкция салицилата данными штаммами осуществляется с образованием катехола и расщеплением последнего по орто пути (Mutzel et al., 1996;
Alquati et al., 2005). Paenibacillus sp. SN501 растет в минеральной среде с нафталином как единственном источнике углерода и энергии при концентрации соли в среде культивирования до 50 г/л.
0. B. amyloliquefaciens ATCC 23350T (X60605) B. subtilis subsp. subtilis DSM 10T (AJ276351) B. subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049T (AF074970) 81 B. vallismortis DSM 11031T (AB021198) B. mojavensis IFO 15718T (AB021191) T 86 B. aerius 24K (AJ831843) 91 B. sonorensis NRRL B-23154T (EU138473) B. licheniformis DSM 13T (X68416) 98 B. atrophaeus JCM 9070T (AB021181) I 88 I B. pumilus DSM 27T (AY456263) B. safensis FO-036bT (AF234854) B. altitudinis 41KF2bT (AJ831842) B. aerophilus 28KT (AJ831844) B. stratosphericus 41KF2aT (AJ831841) B. taeanensis BH030017T (AY603978) B. decolorationis LMG 19507T (AJ315075) 99 T 100 B. idriensis SMC 4352-2 (AY904033) T B. indicus Sd/3 (AJ583158) B. cibi JG-30T (AY550276) B. algicola KMM 3737T (AY228462) 84 I12b 100 B. hwajinpoensis SW-72T (AF541966) 100 P. xylanilyticus XIL14T (AY427832) P. pabuli JCM 9074T (AB073191) P. illinoisensis JCM 9907T (AB073192) P. barcinonensis BP-23T (AJ716019) P. soli DCY03 T (DQ309072) 100 P. elgii SD17 T (AY090110) P. ehimensis KCTC 3748 T (AY116665) 100 SN 93 P. naphthalenovorans PR-N1 T (AF353681) P. validus DSM 3037 T (D78320) P. alkaliterrae KSL-134 T (AY960748) 99 I10b P. amylolyticus NBRC 15957T (AB363743) 100 P. macquariensis DSM 2T (AB073193) P. antarcticus LMG 22078T (AJ605292) Alicyclobacillus acidocaldarius NBRC 15652T (AB271754) Рис. 3. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода “neighbor joining”, отображающее положение исследуемых штаммов в системе родов Bacillus и Paenibacillus. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap-анализа” 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 80%).
1.4. Бактерии-деструкторы рода Pseudomonas Грамотрицательные бактерии-деструкторы (штаммы SN11, SN21, SN101, DN13, G51) были выделены при культивировании на минеральной среде К1 с нафталином в качестве источника углерода, без добавления NaCl. У штаммов G51, DN13 и SN11 определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК размером около 600 п.н., анализ которых подтвердил принадлежность штаммов к роду Pseudomonas. Наибольшее сходство сравниваемых нуклеотидных последовательностей с таковыми типовых штаммов рода Pseudomonas: для штамма G51 - с P. putida (98%), для штамма DN13 - с P. plecoglossicida (98%) и для штамма SN11 - с P. oryzihabitans (99%).
Все штаммы росли на нафталине и салицилате - промежуточном продукте разложения нафталина, и были способны к росту на 5метилсалицилате - что предполагает наличие у них ферментов орто- и мета-пути расщепления катехола (Timmis, Lehrbach, 1985;
Yen, Serdar, 1998). Следует также отметить, что после продолжительного культивирования на фенантрене, изученные псевдомонады приобретали способность к росту на этом субстрате, а также на 1-гидрокси-2-нафтоате (промежуточном продукте биодеградации фенантрена).
Возможность модификации генетических систем биодеградации нафталина при длительном инкубировании на фенантрене была показана для штамма P. putida BS3703, который приобретал способность к конститутивному синтезу ферментов "верхнего пути" окисления ПАУ и к росту на фенантрене и 1-гидрокси-2нафтоате (Балашова и др., 1997).
У Pseudomonas sp. SN11 были определены активности ферментов деградации нафталина и фенантрена. В связи с тем, что ферменты катаболизма нафталина у большинства бактерий индуцируются салицилатом (Barnsley, 1975), измерение активности ключевых ферментов биодеградации проводили как в отсутствие, так и в присутствии салицилата. Полученные данные подтверждают факт утилизации нафталина по пути диоксигеназного расщепления ароматического кольца с образованием салицилата и последующим его расщеплением через катехол. Индукция салицилатом фенантрен диоксигеназной активности и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы свидетельствует о возможности утилизации фенантрена штаммом Pseudomonas sp. SN11 с участием ферментов биодеградации нафталина (Балашова и др., 1997). Низкая активность гентизат 1,2-диоксигеназы при индукции салицилатом свидетельствует о возможности окисления данным штаммом салицилата до гентизиновой кислоты, как описано на примере штамма Pseudomonas sp. U2 (Fuenmayor et al., 1998). Установлено, что салицилат является индуктором ферментов пути деградации нафталина: нафталин диоксигеназы, салицилат гидроксилазы и катехол 1,2-диоксигеназы, а также индуктором фенантрен диоксигеназной активности и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы, необходимых для утилизации фенантрена с участием ферментов деградации нафталина. Фермент мета-пути расщепления катехола – катехол 2,3-диоксигеназа имеет высокую конститутивную активность и не индуцируется салицилатом.
Все исследованные штаммы рода Pseudomonas содержат плазмиды размером ~85 т.п.н. (рис. 4). Для доказательства плазмидной локализации генов, участвующих в разложении ПАУ, проведены эксперименты по элиминации плазмид из штамма SN11 и конъюгационному переносу. Так, перенос плазмиды рSN11 в реципиентный штамм P. putida BS394 (cys- nah- sal-) приводил к образованию трансконъюгантов с фенотипом Cys Nah+ Sal+ Phn+. Полученные результаты свидетельствуют, что плазмида рSN11 является конъюгативной и содержит гены разложения нафталина и салицилата;
деградация фенантрена штаммом SN11 также контролируется плазмидой. Аналогичные эксперименты по конъюгационному переносу плазмид были проведены с использованием штаммов SN101 и G51. Как и в случае плазмиды pSN11, плазмиды из этих штаммов являются конъюгативными и содержат гены деградации нафталина.
Рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoRI показал, что плазмиды из штаммов SN11 и G51 имеют одинаковый набор рестрикционных фрагментов, что позволяет предположить идентичность данных плазмид.
Рис. 4. Электрофореграмма плазмидных ДНК штаммов деструкторов ПАУ: (А) 1 – NAH (83 т.п.н.);
2 – рDN13;
3 – рSN11;
4 – рSN21;
5 – рSN101;
6 – рG51;
7 – рSN31.
1 2 3 4 5 6 1.5. Галотолерантные свойства бактерий-деструкторов ПАУ Бактерии-деструкторы ПАУ, выделенные из района солеразработок, способны как к росту на средах, не содержащих хлорид натрия, так и на средах с повышенным содержанием соли. Большинство штаммов росли на полноценных средах при концентрации NaCl выше 90 г/л. Кроме того, все исследованные бактерии, кроме Paenibacillus sp. SN501 (растет в присутствии 50 г/л NaCl), способны к росту на агаризованной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии, при 60 г/л NaCl. Ряд штаммов росли в присутствии более высоких концентраций соли (см. раздел 4.1.). Полученные результаты позволяют отнести бактерии к умеренно галотолерантным микроорганизмам (Кашнер, 1981).
Следующим этапом изучения являлось установление некоторых механизмов галотолерантности у исследуемых бактерий. Полученные нами трансконъюгантные штаммы (см. раздел 1.4.), содержащие плазмиду из галотолерантного штамма Pseudomonas sp. SN11, были проверены на способность к росту на средах с повышенным содержанием соли (табл. 2).
Таблица 2. Рост рекомбинантных бактерий при повышенном содержании NaCl Полноценная среда Среда Раймонда с Штаммы Раймонда, нафталином, содержание NaCl (г/л) содержание NaCl (г/л) 40 60 90 25 40 Pseudomonas sp. SN11* ++ ++ ++ ++ ++ + P.putida BS394** + P.putida BS394-(SN11-81) ++ + ++ + P.putida BS394-(SN11-82) ++ + ++ + Примечание. «++» - рост;
«+» - слабый рост;
«» - нет роста. донорный штамм;
реципиентный штамм.
Было установлено, что реципиентный штамм P. putida BS394 способен к слабому росту на среде, содержащей 40 г/л NaCl, но не растет при 60 г/л NaCl, тогда как у трансконъюгантных штаммов был отмечен хороший рост при содержании 60 г/л соли на полноценной среде и при 40 г/л на среде с нафталином в качестве субстрата. В то же время, природный галотолерантный штамм SN11 более устойчив к повышению концентрации NaCl, чем рекомбинантные бактерии (табл. 2). Таким образом, можно предположить, что в плазмидах исследуемых бактерий-деструкторов присутствуют не только гены, участвующие в деградации ПАУ, но и генетические элементы, детерминирующие способность бактерий к росту при повышенной солености среды.
Кроме того, у галотолерантных штаммов Arthrobacter sp. SMВ11 и SMB145, выращенных при повышенной солености среды (50-100 г/л NaCl), были обнаружены низкомолекулярные эндо-метаболиты: эктоин, глутамат, бетаин и трегалоза. Известно, что такие соединения относят к осмопротекторам и они обнаружены у многих галофильных и галотолерантных бактерий. Накопление в клетках организмов осмопротекторов является одним из основных механизмов адаптации микроорганизмов к высокой осмолярности среды (Ventosa et al., 1998;
Grant, 2004;
Lentzen, Schwarz, 2006). Также нами было показано, что штаммы рода Rhodococcus, выращенные в минеральной среде в присутствии 50 и 80 г/л NaCl с глюкозой в качестве субстрата, накапливали эктоин, гидроксиэктоин и глутамат (табл. 3). Такое сочетание осмолитов в клетках родококков обнаружено впервые.
Таблица 3. Содержание осмопротекторов у деструкторов рода Rhodococcus Содержание осмопротекторов Концентрация (% от сухого веса биомассы) Штамм NaCl, (г/л)* Эктоин Глутамат Гидроксиэктоин SMB37 50 0.6 0.4 0. SMB37 80 0.3 – 0. SMB38 50 0.6 1.4 1. SMB38 80 1.2 0.6 2. Примечание. * вес/объем в среде культивирования, «–» – вещество не обнаружено.
1.6. Бактериальные гены, контролирующие начальные этапы деструкции нафталина Первым этапом аэробной деградации нафталина у бактерий является гидроксилирование субстрата до соответствующего cis-дигидродиола, реакция осуществляется мультикомпонентными ферментными системами – диоксигеназами (Larkin, 1999;
Gibson, Parales, 2000). Нафталин диоксигеназы (НДО), кодируемые генами nah (штаммы рода Pseudomonas) и nar (штаммы рода Rhodococcus), существенно различаются между собой структурно, сохраняя при этом основные каталитические свойства (Kulakov, 2000). Разнообразие генов, кодирующих - и -субъединицы НДО, в исследуемых штаммах изучали путем амплификации участка генов nah и nar с последующим гидролизом полученных ампликонов эндонуклеазами рестрикции MseI и HaeIII. ПЦР-анализ с использованием праймеров, разработанных Ferrero с соавторами (Ferrero et al., 2002), показал наличие гена nahAc, кодирующего -субъединицу НДО, в исследуемых бактериях рода Pseudomonas. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка nahAc-гена штаммов SN11, DN13, G51 выявил высокую гомологию (99.6-100%) с таковыми референтных штаммов P. putida NCIB9816, NCIB9816-4 и BS202. На рисунке 6 представлена дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену nahAc, исследуемых и известных штаммов-деструкторов.
Для исследования генов, кодирующих НДО, грамположительных бактерий, нами были сконструированы праймеры, при создании которых были использованы известные нуклеотидные последовательности nar-генов, кодирующих - и -субъединицы НДО, деструкторов нафталина рода Rhodococcus. С ДНК-матриц родококков были получены ампликоны ожидаемой длины (1936 п. н.) (рис. 7).
0.2 0. Pseudomonas sp. SN Pseudomonas sp. DN Pseudomonas putida NCIB9816 (M23914) Pseudomonas putida C18 (M60405) Pseudomonas putida NCIB9816-4 (AF491307) Pseudomonas putida BS202 (AF010471) 100 Pseudomonas sp. G Pseudomonas putida G7 (AB237655) Pseudomonas putida OUS82 (AB004059) Pseudomonas aeruginosa PaK1 (D84146) Pseudomonas stutzeri AN10 (AF039533) Ralstonia sp. U2 (AF036940) Рис. 6. Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену nahAc.
Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации генов narAaAb штаммов-деструкторов рода Rhodococcus: 1 – G10, 2 – P25*, 3 – DB11, 4 – SMB38, 5 – SMB37, 6 – B2-1, 7 – B1-4, 8 – B13, 9 – B14, 10 - отрицательный контроль, 11 – маркер -HindIII («Силекс», Россия). *Описание штамма 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rhodococcus ruber P25 см. в разделе 2.2.
В то же время, применение сконструированных праймеров с препаратами ДНК деструкторов нафталина родов Arthrobacter и Bacillus не дало положительных результатов, что свидетельствует о высокой специфичности сконструированных олигонуклеотидов, а также о различии генетических систем деструкции нафталина у разных таксонов грамположительных бактерий.
Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонов штаммов В13, В2-1, DB11, SMB38, выделенных из засоленных почв, показал принадлежность исследуемых фрагментов ДНК к семейству nar-генов, и выявил высокую гомологию (98.5-100%) с таковыми известных штаммов-деструкторов полиароматических соединений рода Rhodococcus. На дендрограммах четко прослеживается закономерность выделения взятых в анализ фрагментов narAa генов и narAb-генов в два кластера (рис. 8). Степень сходства нуклеотидных последовательностей была выше 98% для narAa- и narAb-генов внутри каждого кластера и не превышала 92% для narAa-генов и 90% для narAb-генов между кластерами. На основании проведенного анализа можно предположить наличие двух ветвей эволюции narАаAb-генов у бактерий рода Rhodococcus. Показано, что nar-гены этих штаммов входят в разные группы одного подкластера (рис. 8) с гомологией нуклеотидных последовательностей внутри группы 100%, а между ними - 99%.
А Б Рис. 8. Дендрограммы, отображающие сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам narAa (А) и narAb (Б).
Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем деструкции нафталина бактерий рода Rhodococcus, выделенных из района разработок Верхнекамского месторождения солей.
2. Бактерии-деструкторы бифенила/полихлорированных бифенилов 2.1. Характеристика бактерий-деструкторов Методом накопительного культивирования на бифениле из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений выделено штаммов-деструкторов бифенила, из них около 50 бактериальных культур изучено более детально. На основании филогенетического анализа и фенотипических характеристик штаммы отнесены к родам: Arthrobacter, Alcaligenes, Cellulomonas, Comamonas, Flavimonas, Flavobacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Janibacter, Xanthomonas.
Большинство изолированных бактерий росли в диапазоне температур 8-40С и рН среды 6-9. У ряда бактерий-деструкторов выявлена способность к росту на полноценной и минеральной (с бифенилом в качестве субстрата) средах в присутствии повышенного содержания NaCl. Так, штаммы Alcaligenes sp. Р39, Pseudomonas sp. B2 и Pseudomonas sp. B106, R. ruber Р25 активно росли на бифениле при содержании 60 г/л соли в среде культивирования и в полноценной среде при 100-120 г/л NaCl.
Более половины изученных деструкторов бифенила способны к росту на нафталине, толуоле, бензоле и феноле, пять штаммов могут осуществлять деструкцию фенантрена. Среди исследованных штаммов выявлены бактерии, которые осуществляли деструкцию хлорированных соединений (2ХБК, 4ХБК, 2,4-Д). Особо следует отметить штаммы R. ruber Р25, Microbacterium sp. B51, Pseudomonas spр. G1, G12 и B106, которые обладают наиболее широкой субстратной специфичностью по отношению к моно(поли)ароматическим соединениям и их хлорпроизводным.
Все исследованные штаммы осуществляли разложение монохлорированного бифенила: при инкубации клеток бактерий с 4моноХБ (500 M) наблюдалось накопление 4ХБК (от 75 M до 230 M, в зависимости от штамма, за 1 час). Для изучения особенностей разложения орто- и пара-ХБ изолированными бактериями в качестве модельного соединения нами выбран 2,4’диХБ, хлорированный по обоим бифенильным кольцам. Все бактерии проявляли активность по отношению к 2,4’диХБ, однако эффективность и характер окислительных способностей штаммов различался. На основании анализа продуктов биодеструкции 2,4’диХБ выделены три группы штаммов, обладающие различными путями деградации данного соединения (табл. 4). У большинства штаммов (группы I и II) при деструкции 2,4'диХБ происходило накопление продукта мета-расщепления дихлорбифенила - 3,8-Cl ГОФДК (max=397 нм), что указывает на 2,3-диоксигенирование пара-хлорированного кольца 2,4'диХБ (Seeger et al., 1995;
Seah et al., 2000). Кроме того, все исследованные штаммы группы II накапливали разные количества 4ХБК, что в свою очередь говорит о более глубокой трансформации 2,4'диХБ по пути предпочтительного 2,3-диоксигенирования орто-хлорированного кольца. У штамма Р25 наблюдалось существенное уменьшение количества продуктов разложения 2,4'диХБ (3,8-Cl ГОФДК и ХБК), что указывает на эффективную утилизацию не только 2,4'диХБ, но и 4ХБК.
Таблица 4. Разложение 2,4’дихлорбифенила бактериями-деструкторами ГОФДК, ОП (397) ХБК Штамм Концентрация,%* Положе 3 часа 24 часа ние хлора 3 часа 24 часа I группа (осуществляют окисление пара-хлорированного кольца) 1.36 0. Alcaligenes sp. P39 0 - 0 Flavimonas sp. S214 3.1 ± 0.11 3.05 ± 0.04 - 0 1.12 0. Flavobacterium sp. P38 0 - 0 Pseudomonas sp. B106 3.5 ± 0.03 2.44 ± 0.02 - 0 Pseudomonas sp. G1 3.7 ± 0.08 3.48 ± 0.03 - 0 Pseudomonas sp. G11 3.1 ± 0.09 2.91 ± 0.07 - 0 Pseudomonas sp. G13 3.2 ± 0.01 3.78 ± 0.05 - 0 Pseudomonas sp. P24 4.2 ± 0.3 4.48 ± 0.03 - 0 Pseudomonas sp. S1 0 1.6 ± 0.08 - 0 Pseudomonas sp. S2 0 2.3 ± 0.04 - 0 Pseudomonas sp. S9 0 0.6 ± 0.04 - 0 Pseudomonas sp. S13 0 0.7 ± 0.06 - 0 Pseudomonas sp. S15 0 1.1 ± 0.04 - 0 Pseudomonas sp. S210 1.1 ± 0.04 1.72 ± 0.07 - 0 Pseudomonas sp. S212 3.0 ± 0.06 2.94 ± 0.02 - 0 Rhodococcus sp. P1 0 0.5 ± 0.04 - 0 Rhodococcus sp. P19 0 0.1 ± 0.03 2 0 3. Janibacter sp. P9 3.6 ± 0.02 2.7 ± 0.01 - 0 Xanthomonas sp P8 1.7 ± 0.04 4.1 ± 0.08 - 0 II группа (осуществляют окисление орто- и пара-хлорированных колец) Arthrobacter sp. P29 2.1 ± 0.07 1.79 ± 0.02 4 28.4 46. Arthrobacter sp. B107 1.8 ± 0.03 2.01 ± 0.03 4 30.3 43. Cellulomonas sp. P27 0.8 ± 0.04 0.84 ± 0.03 4 67.0 97. Cellulomonas sp. P28 0.6 ± 0.07 0.64 ± 0.03 4 70.0 66. Flavobacterium sp. G14 3.3 ± 0.09 3.40 ± 0.04 4 0 7. Microbacterium sp. P26 1.1 ± 0.05 4 38.7 68. 3.240. Pseudomonas sp. B2 4.0 ± 0.06 3.96 ± 0.02 4 5.4 10. Pseudomonas sp. B7 2.7 ± 0.03 1.60 ± 0.01 4 9.3 14. Pseudomonas sp. B8 1.6 ± 0.06 1.69 ± 0.02 4 48.0 64. Pseudomonas sp. P22 0.7 ± 0.05 0.87 ± 0.05 4 72.0 74. Pseudomonas sp. P23 0.3 ± 0.08 0.36 ± 0.01 4 70.6 84. Rhodococcus sp. G10 2.9 ± 0.01 2.69 ± 0.05 4 10.0 13. Rhodococcus sp. P2kr 3.1 ± 0.05 3.8 ± 0.04 4 2.0 12. Rhodococcus sp. P12 0 0 4 0 6. 2 3.6 3. Rhodococcus sp. P13 0.2 ± 0.09 0.4 ± 0.04 4 1.4 2. 2 3.0 4. Rhodococcus sp. P20 0.2 ± 0.07 0.5 ± 0.04 4 0 2. 2 3.0 4. Rhodococcus sp. P25** 1.2 ± 0.02 0.52 ± 0.07 4 67.0 29. Rhodococcus sp. SN31 0.8 ± 0.04 1.22 ± 0.04 4 3.7 9. III группа (осуществляют окисление орто-хлорированного кольца) Comamonas sp. S211 0 0 4 16.4 18. Microbacterium sp. B51 0 0 4 88.0 92. Pseudomonas sp. G12 0 0 4 84.0 85. Rhodococcus sp. DB11 0 0 4 9.5 33. Примечание: * - % от теоретически возможного, ** - к 5 часам инкубации штамма Р25 с 2,4’диХБ было отмечено: ГОФДК – ОП397=1.1, 4ХБК – 73.8%.
Штаммы III группы - Rhodococcus sp. DB11 и Comamonas sp. S211 в присутствии 2,4'диХБ аккумулировали около 33 и 18.6% 4ХБК, соответственно, а штаммы Pseudomonas sp. G12 и Microbacterium sp. B51 - около 90% этого продукта, накопления продуктов мета-расщепления 2,4'диХБ не было зафиксировано (табл. 4). Таким образом, можно предположить, что эти штаммы атакуют только орто-хлорированное кольцо молекулы 2,4'диХБ.
2.2. Биодеградативные особенности штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В Штамм R. ruber Р25 (=ИЭГМ 896) является активным деструктором орто-, пара-замещенных хлорированных бифенилов. При деструкции 2моноХБ в среде наблюдалось накопление 8-Cl ГОФДК (max=395 нм) и 2ХБК, а при деструкции 4моноХБ – 10-Cl ГОФДК (max=434 нм) и 4ХБК. В процессе деградации 4моноХБ к 24 часам было отмечено снижение содержания 4ХБК в среде с 66% до 41%. При культивировании штамма Р25 с 2,2’диХБ не была обнаружена ГОФДК, но в среде аккумулировались свободные ионы хлора и 2ХБК (около 14% от теоретически возможного, за 24 часа). При разложении 4,4’диХБ было отмечено накопление в среде 3,10-диCl ГОФДК (max=434 нм) и увеличение концентрации 4ХБК в течение первых 24 часов до 68% с последующим снижением в 5.5 раза. Установлено, что при деструкции 2,4’диХБ штамм R. ruber Р25 предпочтительнее окислял орто хлорированное кольцо молекулы хлорбифенила (табл. 4), при деструкции 2,4,2’триХБ – ди(орто-пара)-хлорированное кольцо, а при разложении 2,4,4’триХБ – моно(пара)-хлорированное кольцо. Изучена способность штамма R. ruber Р использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 2-, 4моноХБ и 2,4’диХБ (рис. 9). Кроме того, штамм эффективно утилизировал образующиеся в процессе разложения 2ХБК и 4ХБК (рис. 10).
К О Е /м л ХБК, Cl- КОЕ/мл (мг/л) 1,E+ 1,E + 0 9 3 2 750 9 1,E+ 1,E + 0 7 1 1,E+ 250 1,E + 0 0 1,E+ 0 3 6 9 сутки 1,E + 0 0 5 10 15 су тк и Рис. 10. Рост R. ruber Р25 на бензойной кислоте (1) и ее Рис. 9. Рост R. ruber Р25 на хлорпроизводных: КОЕ при росте на бифениле (1) и его хлорированных 2ХБК (2), 4ХБК (3), производных: 2 - 2-моноХБ, 3 - 4 2,4ХБК (4);
Cl при росте на 2ХБК (5), моноХБ, 4 - 2,4'диХБ.
4ХБК (6), 2,4ХБК (7);
концентрация ХБК при росте на 2ХБК (8) и 4ХБК (9).
R. ruber Р25 содержит три плазмиды, размером ~110 т.п.н. (рР25-1), ~90 т.п.н. (рР25-2) и ~80 т.п.н. (рР25-3) (рис. 11А). Для доказательства плазмидной локализации генов, ответственных за разложение бифенила, нафталина и ХБК, проведены эксперименты по элиминации плазмид. При скрининге клонов, утративших способность к росту на одном или нескольких субстратах, обнаружено отсутствие одной или нескольких плазмид (рис. 11Б). Клоны с фенотипом бифнаф2ХБК4ХБК характеризовались отсутствием плазмид, у клонов с фенотипом бифнаф+2ХБК4ХБК было зафиксировано наличие плазмиды рР25- (~80 т.п.н.), а у клонов, утративших способность к росту только на ХБК, отсутствовала плазмида рР25-1 (~110 т.п.н.). Таким образом, нами сделано предположение о плазмидной локализации генетических детерминантов, контролирующих деградацию бифенила, нафталина и ХБК у штамма R. ruber Р25.
Рис. 11А. Электрофореграмма плазмидных ДНК: 1 – рР25-(1-3);
2 - -HindIII («Силекс», Россия);
3 – pКЗТ1 (110 т.п.н.);
4 - NAH7 (83 т.п.н.).
Рис. 11Б. Скрининг клонов R. ruber Р25 с различным фенотипом на наличие плазмидной ДНК:
+ + 1 - биф наф ХБК (рР25-2, рР25-3);
2 - бифнаф+ХБК (рР25-3);
3 – бифнафХБК (элиминант);
4 – -HindIII 1 2 3 4 1 23 4 («Силекс», Россия);
5 - NAH7 (83 т.п.н.).
А Б Результаты изучения деструкции моно(ди)хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51 приведены в таблицах 4 и 5.
Таблица 5. Деструкция хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В Хлорбензойная кислота ГОФДК Время Концент Концент Поло- Концентрация ПХБ рация ПХБ инкубации рация max жение ОП мг/л %* Cl- (мг/л) (мг/л) (час) (нм) хлора 2ХБ 94.25 0 н.о. 2 - - 395 5 56.600.02 72.3 24 11.820.01 15.1 0. 4ХБ 94.25 0 н.о. 4 - - 434 5 31.110.08 39.7 0. 24 28.310.05 36.0 0. 2,2’ХБ 22.3 0 - 2 - - - 5 14.130.03 90.3 3.80. 24 1.650.02 10.6 6.30. 4,4’ХБ 22.3 0 - 4 - - 432 5 - 3.590.01 23.0 0.360. 24 - 12.690.06 81.1 0.950. Примечание: «н.о.» – не определяли, « - »- не обнаружено, * - % от теоретически возможного.
Штамм Microbacterium sp. В51 осуществлял практически 100% деструкцию диХБ (2,2’-, 2,4’- и 4,4’диХБ). Аккумуляция в среде 2ХБК и 4ХБК при деструкции 2,2’- и 2,4’диХБ, соответственно, свидетельствовала о предпочтительной атаке штаммом орто-хлорированного кольца этих соединений (табл. 4, 5).
Microbacterium sp. В51 утилизировал 2ХБК, продукт разложения 2моноХБ и 2,2’диХБ, и трансформировал 4,4’диХБ через стадию образования 3,10-диCl ГОФДК до 4ХБК (табл. 5). Полученные данные позволяют предположить, что штамм В51 способен окислять орто- и пара-хлорированные кольца молекул ПХБ. Таким образом, Microbacterium sp. В51 по своим деградативным свойствам близок к известному штамму-деструктору ПХБ Burkholderia sp. LB400 (Seeger et al., 1995, 1999;
Seah et al., 2000), но, в отличие от штамма LB400, способен деградировать 4,4’диХБ и осуществлять полную утилизацию 2моноХБ и 2,2’диХБ.
Было также установлено, что штамм В51 способен активно разлагать 2моноХБ в условиях модельной почвенной системы. Анализ динамики изменения концентрации 2моноХБ показал, что основное снижение количества субстрата (до 98%) происходило в течение первых 24 часов инкубирования. Увеличение количества жизнеспособных клеток штамма в течение эксперимента на три порядка по сравнению с контролем свидетельствовало об использовании 2моноХБ в качестве ростового субстрата.
2.3. Разнообразие генов, кодирующих -субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, исследуемых бактерий деструкторов Проведен скрининг 24 штаммов-деструкторов бифенила, на наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей, кодирующих -субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000).
Амплифицируемые участки ДНК соответствуют правой части генов -субъединиц терминальных оксигеназ, включающей каталитический центр (Zielinski et al., 2002).
С ДНК четырнадцати штаммов был получен ПЦР-продукт ожидаемого размера, около 500 п.н. В то же время с ДНК ряда деструкторов бифенила/ПХБ, в том числе активных штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51, отсутствовала специфичная амплификация. Несмотря на сформировавшуюся в процессе эволюции специализацию ферментов по отношению к конкретным субстратам, наблюдается перекрывание спектров окисляемых соединений даже для диоксигеназ, относящихся к разным подсемействам (Barriault, Sylvestre, 1999;
Raschke et al., 2001). С другой стороны, известны бактерии родов Sphingomonas, Bacillus, Rhodococcus, осуществляющие деструкцию бифенила с помощью бифенил 2,3-диоксигеназ, существенно отличающихся от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ и сходных с фенантрен и нафталин диоксигеназами бактерий-деструкторов ПАУ (Romine et al., 1999;
Mukerjee-Dhar et al., 2005;
Taguchi et al., 2007;
Yang et al., 2007). Полученные данные свидетельствуют об отличии ключевых ферментов деструкции бифенила исследованных нами активных бактерий от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.
По результатам гидролиза ампликонов эндонуклеазами рестрикции HhaI и HaeIII бактерии рода Pseudomonas были выделены в отдельную группу, бактерии порядка Actinomycetales можно подразделить на три группы (рис. 12). К первой группе относятся Rhodococcus sp. P1, P12, P13, P20, утилизирующие бифенил/ХБ, нафталин, бензол, толуол. Штамм Rhodococcus sp. G10 (вторая группа) осуществляет трансформацию бифенила/ХБ и растет на бензоле и толуоле.
В третью группу вошли штаммы Arthrobacter sp. Р24а, Cellulomonas sp. Р28, Janibacter sp. P27a и P9, способные к слабому росту на бифениле.
147 п.н. 600 п.н.
242 п.н.
500 п.н.
110 п.н. 190 п.н.
400 п.н.
300 п.н.
200 п.н.
(А) 100 п.н.
67 п.н.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Грамотрицательные бактерии I II III 600 п.н.
500 п.н.
190 п.н.
400 п.н.
147 п.н.
110 п.н. 300 п.н.
200 п.н.
100 п.н.
67 п.н.
(Б) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Грамотрицательные I II III бактерии Рис. 12. Электрофореграммы рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ампликонов эндонуклеазами HhaI (A) и HaeIII (Б):
Rhodococcus sp. (штаммы: 3 – P1, 4 – P12, 5 – P13, 6 – P20, 7 – G10), Janibacter sp.
(штаммы: 8 – P9, 9 – P27a), 12 – Arthrobacter sp. P24a, 13 – Cellulomonas sp. P28, Pseudomonas sp. (штаммы: 14 – S9, 15 – S13, 16 – S210, 17 – S211, 18 – S212);
2, 19 – Rhodococcus sp. P20 (ампликон, не обработанный эндонуклеазой);
1, 10, 20 – маркер 100–1000 п.н. («Силекс», Россия);
11 – маркер pUC19 ДНК/ MspI («Силекс», Россия).
Анализируемые участки генов бактерий рода Rhodococcus существенно отличались от гомологичных генов бактерий рода Pseudomonas (рис. 13). Участки ДНК штаммов Rhodococcus sp. P1, P12 и P13 были на 98-99% сходны с генами, кодирующими -субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназ, известного деструктора ПХБ Rhodococcus sp. RHA1 и разлагающего бифенил R. opacus BIE-20.
Амплифицированный фрагмент ДНК Rhodococcus sp. G10 на 98% сходен с геном -субъединицы гидроксилирующей диоксигеназы деструктора толуола Arthrobacter sp. 3YC3. У бактерий родов Janibacter и Arthrobacter обнаружены уникальные нуклеотидные последовательности, отличающиеся от генов, кодирующих большие субъединицы известных гидроксилирующих диоксигеназ как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (рис. 13).
Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем, контролирующих ключевые процессы деструкции ароматических углеводородов, бактерий-деструкторов бифенила из техногеннозагрязненных почв Прикамья.
Pseudomonas sp. B2A (AJ544518) Pseudomonas sp. S13 (FJ752168) Pseudomonas sp. S210 (FJ752169) Pseudomonas sp. S9 (FJ752172) Pseudomonas sp. S212 (FJ752170) Pseudomonas sp. B4 (U95054) Подсемейство Б/Т ДО Burkholderia xenovorans LB400 (M86384) Ralstonia eutropha H850 (AJ544525) Pseudomonas sp. Cam-1 (AY027651) P. pseudoalcaligenes KF707 (M83673) Rhodococcus sp. M5 (U27591) II Rhodococcus sp. G Arthrobacter sp. 3YC3 (DQ336942) Rhodococcus sp. RHA1 (D32142) Rhodococcus opacus BIE-20 (AJ544524) I Rhodococcus sp. P12 (FJ765412) Rhodococcus sp. P13 (FJ752171) Rhodococcus sp. P1 (FJ752167) Janibacter sp. P27a III Arthrobacter sp. P24a Janibacter sp. P Рис. 13. Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных исследуемым участкам генов -cубъединиц подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.
3. Природные и генетически-модифицированные бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот Более 20 бактерий-деструкторов хлорбензойных кислот (2-, 3-, 4- и 2,4ХБК) были выделены из почв и грунтов, загрязненных отходами производства галогенсодержащих соединений (г. Пермь). Подробно нами были исследованы шесть штаммов-деструкторов 4ХБК, которые на основании филогенетических и фенотипических особенностей были идентифицированы как Arthrobacter sp. H4, H5, Micrococcus sp. G120, G126, Pseudomonas sp. G107, H2.
3.1. Генетические системы, контролирующие дехлорирование 4ХБК, бактерий рода Arthrobacter Данные ДНК-типирования двух исследованных артробактерий, штаммов H и H5, показали их идентичность. Наибольший уровень сходства (99%) ген 16S pРНК штамма Н4 имеет с типовым штаммом A. globiformis M23411T. Штаммы Arthrobacter sp. H4 и Н5 эффективно растут на 4ХБК, используя данное соединение в качестве единственного источника углерода и энергии, способны к росту на высоких концентрациях хлорбензоата - до 3 г/л. Параметры роста артробактерий сопоставимы с таковыми хорошо изученного штамма-деструктора 4ХБК A. globiformis КЗТ1 (Зайцев, Карасевич, 1981). Анализ метаболитов при культивировании штаммов H4 и Н5 на 4ХБК показал наличие в среде инкубирования интермедиатов – ПГБК, ПКК и ионов хлора. На основании полученных результатов и анализа литературных данных было сделано предположение, что штаммы H4, Н5, как и штамм КЗТ1, осуществляет дегалогенирование 4ХБК до расщепления ароматического кольца (Зайцев, Карасевич, 1981). Описан механизм первичной атаки на молекулу 4ХБК гидролитическое дегалогенирование (Elsner et al., 1991). Эту реакцию катализирует трехкомпонентная 4ХБК-дегалогеназа, включающая 4-хлорбензоат-KoA-лигазу (FcbA), 4-хлорбензоил-KoA-дегалогеназу (FcbB) и 4-гидроксибензоат:КоА тиоэстеразу (FcbC).
Ранее нами было показано, что у штамма A. globiformis КЗТ1 реакция дегалогенирования 4ХБК контролируется генами, расположенными в плазмиде (рКЗТ1) размером ~110 т.п.н. Гены, ответственные за дальнейший метаболизм пара-гидроксибензойной кислоты, находятся в хромосоме (Zaitzev et al., 1991). У Arthrobacter sp. H4 и Н5, выделенных из техногенных почв (г. Пермь), плазмидные ДНК не были обнаружены. Можно предположить, что генетические детерминанты, контролирующие весь путь разложения 4ХБК, у этих штаммов располагаются в хромосоме.
Клонирование и изучение fcb-генов A. globiformis КЗТ1. В клетках E. coli JM109 на мультикопийном векторе pUC19 была сконструирована клонотека Sau3A-фрагментов тотальной ДНК (обогащенной плазмидной ДНК) штамма Арr-клонов A. globiformis КЗТ1. При анализе E.coli JM109 обнаружен рекомбинантный штамм, содержащий плазмиду pCA311, которая придавала клеткам E. coli способность к дехлорированию 4ХБК. Анализ с использованием метода ТСХ показал, что ПГБК является единственным продуктом конверсии 4ХБК клетками E. coli. Таким образом, в составе pCA311 были клонированы fcb-гены, кодирующие 4-хлорбензоат-4-гидроксилазу (дегалогеназу). На основе рестрикционного анализа плазмиды pCA311 и ее делеционных производных, а также анализа полипептидов, синтезированных в мини-клетках E. coli на матрицах полученных рекомбинантных плазмид была построена физическая карта клонированного фрагмента ДНК (7612 т.п.н.), определена последовательность расположения генов, кодирующих полипептиды с Mr=57, 31 и 17 кДа. Показано, что все 3 гена fcbA1(А), fcbA2(В), fcbA3(С) требуются для сохранения 4ХБК+ фенотипа. В дальнейшем, данные о наличии трех структурных генов, определяющих дегалогеназную активность, были подтверждены и дополнены, когда была определена и проанализирована нуклеотидная последовательность ДНК, клонированная в составе плазмиды pCA311 (номер в GenBank AF304300).
Основываясь на результатах анализа нуклеотидных последовательностей и литературных данных (Babbitt et al.,1992;
Schmitz et al.,1992), было сделано заключение, что проклонированные нами гены fcb объединены в структурный оперон с тремя открытыми трансляционными рамками, кодирующими полипептиды в следующем порядке: 4ХБК-КоА-лигаза, 4ХБК-КоА-дегалогеназа и 4ХБК-КоА-тиоэстераза.
3.2. fcb-Гены бактерий-деструкторов 4ХБК из техногеннозагрязненных почв (г. Пермь) На основе нуклеотидных последовательностей fcb-генов штаммов A. globiformis КЗТ1 (GenBank AF304300) и Arthrobacter sp. SU (GenBank M93187) были разработаны праймеры, при использовании которых возможна амплификация участков ДНК, содержащих гены fcbA и fcbB (Rodrigues et al., 2001). Методом ПЦР нами были исследованы выделенные бактерии-деструкторы 4ХБК на наличие в геноме fcb-генов. С ДНК штаммов Arthrobacter sp. H4, H5, Micrococcus sp. G120 были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера – 589 п.н. (fcbA) и 598 п.н. (fcbB) (рис. 14А). Полученные результаты позволяют сделать предположение о наличии у этих штаммов генов, контролирующих дегалогенирование 4ХБК. fcb-Гены были также обнаружены у штамма R. ruber Р25 (рис. 14Б), деструктора ХБ/4ХБК (см. раздел 2.2.).
600 п.н. 600 п.н.
500 п.н 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 23 4 А Б Рис. 14. Электрофореграммы продуктов амплификации fcb-генов штаммов деструкторов 4ХБК: (А) Arthrobacter sp. H4 (2 – fcbA, 6 – fcbB), Micrococcus sp. G (3 – fcbA, 7 – fcbB), Micrococcus sp. G120 (4 – fcbA, 8 – fcbB), Arthrobacter sp. Н5 (5 – fcbA, 9 – fcbB), 1, 10 – маркер IX («Sigma», Германия), 11 – отрицательный контроль;
(Б) A.
globiformis КЗТ1 (1 – fcbA, 4 – fcbB), R. ruber Р25 (2 – fcbA, 5 – fcbB), 3 - маркер 1000 п.н.
(«Силекс», Россия).
Анализ нуклеотидных последовательностей генов fcbA и fcbB штамма Arthrobacter sp. H4 показал 100% сходство с гомологичными последовательностями большинства бактерий рода Arthrobacter. Уровень сходства участка гена fcbA штамма R. ruber P25 с генами, кодирующими 4-хлоробензоат-КоА-лигазу, бактерий A. globiformis КЗТ1, A. ramosus FG1, Arthrobacter sp. SU, Arthrobacter sp. TM1 составил 98-99%;