Биотехнологические способы получения нуклеозид -5’-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора

На правах рукописи

СКОБЛОВ

Юрий Самойлович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ

НУКЛЕОЗИД -5’-ТРИФОСФАТОВ, МЕЧЕННЫХ

РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТОПАМИ ФОСФОРА

03.00.23 – Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Москва - 2009

Работа выполнена на предприятии «Радиопрепарат» Института ядерной физики АН УзССР (г. Ташкент), в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (г.

Москва), в Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (г. Москва).

Официальные оппоненты:

академик РАН, профессор Свердлов Евгений Давыдович член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «7» апреля 2010 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «» _ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, д.ф-м.н., с.н.с. В.А. Олейников -1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в биологических исследованиях начиналось в 50-х годах ХХ века с применения Р-ортофосфата для введения радиоактивного фосфора в нуклеиновые кислоты. Исследования взаимосвязи падения инфекционности бактериофагов и радиоактивного распада фосфора-32, включившегося в состав вирусной нуклеиновой кислоты, дали мощный импульс к возникновению и развитию молекулярной биологии.

Одновременно расширились сферы применения и номенклатура соединений, меченных фосфором-32, а позднее и фосфором-33. На первое место среди используемых соединений, меченных фосфором-32, вышли предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот – нуклеозид-5’-трифосфаты. Развитие с середины 1970-х годов методов секвенирования ДНК значительно изменило объем и характер исследований, проводимых в области молекулярной генетики, молекулярной биологии и биотехнологии. Потребление нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, в первую очередь аденозин-5’- [-32P] трифосфата, 2’-дезоксиаденозин-5’- [-32P] трифосфата и 2’ дезоксицитидин-5’- [-32P] трифосфата, в мире в 80-х годах достигло очень большой величины – до 10 Ки ежемесячно. Разработка флуоресцентных автоматических секвенаторов и внедрение их в рутинную повседневную практику существенно снизило потребление меченых фосфором нуклеотидов, однако, в целом, разнообразные исследования с использованием радиоактивных изотопов фосфора, остаются в методическом арсенале ученых.

Главным преимуществом использования соединений, меченных фосфором-32, в различных биологических исследованиях является высокая чувствительность методов.

Теоретически чувствительность таких методов определяется молярной (удельной) активностью используемых соединений и может достигать достоверного обнаружения и измерения 10-15 моль в исследуемом образце. Высокая чувствительность в сочетании с высокой специфичностью и простотой реализации делают использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, по-прежнему, важнейшим и распространенным инструментом исследователей.

Технологии получения нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, имеют свои специфические проблемы и ограничения.

1. Высокая молярная активность вынуждает проводить синтезы с количеством радиоактивного изотопа 10-8 – 10-9 моля, что соответствует активности 10-100 мКи.

-2 2. Реакции, используемые для синтеза меченых соединений, не должны приводить к неконтролируемому изотопному разбавлению нерадиоактивным фосфором-31, и местоположение радиоактивного атома должно быть строго зафиксировано.

3. Фосфор-32 и фосфор-33 являются реакторными изотопами, т.е. нарабатываются в результате облучения соответствующих мишеней в нейтронном потоке ядерного реактора, и при получении этих изотопов с максимально высокой молярной активностью, в ходе первичной переработки облученного радиоактивного сырья, получается ортофосфорная кислота, меченная фосфором-32 или фосфором-33 соответственно. Следовательно, схемы получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, основываются на использовании в качестве исходного радиоактивного соединения (радиоактивного сырья) 32(33) Р-ортофосфорной кислоты.

4. При высокой объемной активности (1-10 Ки/мл) в реакционной смеси быстро накапливаются неидентифицированные продукты, индуцированные ионизирующим излучением, поэтому время проведения всех стадий процесса, включая анализ выхода промежуточных продуктов, необходимо минимизировать.

5. Количество синтезируемых веществ слишком мало, чтобы использовать классические методы органического синтеза (перегонка, кристаллизация, осаждение и т.д.) и существенно ограничивает возможности использования физико-химических методов анализа: ЯМР-спектрометрию, масс-спектрометрию, УФ и ИК-спектроскопию.

6. Высокая активность на рабочем месте требует определенных мер по соблюдению техники радиационной безопасности и вынуждает проводить технологический процесс в соответствующих защитных боксах.

Среди методов синтеза нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, можно выделить химические, химико-ферментативные и ферментативные методы. Высокая скорость вместе с высокой специфичностью и технологичностью делают ферменты незаменимым инструментов для проведения сложных радиохимических синтезов. Основным ограничением ферментативных и химико-ферментативных методов синтеза является доступность высокоочищенных ферментов и недостаточно полная информация об их субстратной специфичности и стабильности в условиях радиохимического синтеза. Поэтому прикладные разработки технологических ферментативных схем синтеза меченых нуклеотидов сопряжены с работой по получению очищенных ферментов и фундаментальными энзимологическими исследованиями.

Цель и задачи исследования. Цель исследования: создание технологий серийного производства нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, для -3 обеспечения исследований в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Разработка эффективных методов синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в масштабе 100 мКи по радиоактивному сырью.

2. Разработка методов очистки целевых соединений.

3. Разработка методов промежуточного технологического контроля и контроля качества конечного продукта.

4. Создание ферментативной технологической базы, необходимой для реализации технологии получения нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

5. Внедрение разработанных методов в серийное производство.

6. Создание эффективного радиопротектора, обеспечивающего увеличение срока годности синтезированных меченых соединений.

Научная новизна и практическая значимость исследования Проведенное исследование позволило создать технологию получения нуклеозид 5’-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, основанную на использовании ферментов. Были разработаны ферментативные способы синтеза целевых соединений, их очистки с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также разработан и внедрен эффективный радиопротектор, замедляющий радиолитическое разрушение конечного продукта. Разработаны методы контроля качества нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, при их серийном производстве.

Внедрение полученных научных, технологических, конструкторских и организационных решений позволило создать эффективное серийное производство, а также в 1989 г. осуществить продажу части этой технологии на Кубу для организации там собственного производства [-32P]АТР, [-32P]dАТР и [-32P]АТР.

Серийное производство нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, по разработанной ферментативной технологии в разные годы было реализовано на различных предприятиях: 1) предприятие «Радиопрепарат» Института ядерной физики АН УзССР, 2) Государственный научный центр – Физико-энергетический институт, 3) Государственное унитарное предприятие – Институт реакторных материалов.

Личный вклад автора заключается в формулировании и постановке целей и задач исследования, обосновании путей их решения и непосредственном выполнении -4 экспериментов, анализе, обобщении и оформлении полученных результатов, организации опытно-промышленного и серийного производства на основании разработанных технологических процессов.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 1) III-Международный симпозиум по органическим соединениям, меченным радиоактивными изотопами. 1988, Марианске Лазне, 2) Всемирный съезде по ядерной медицине и биологии. 1998, Берлин, 3) II Всесоюзное совещание по проблеме «Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами» 1988, Звенигород, Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 5 глав экспериментальной части и выводов, списка литературы (104 наименований) и приложений. Основной текст диссертации изложен на страницах, включая 24 рисунка и 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез нуклеозид-5’-[-32(33)P] трифосфатов.

Нуклеозид-5’-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора в гамма положении, широко используются в фундаментальных и прикладных биохимических исследованиях, связанных с ферментативным фосфорилированием, в качестве донора фосфатной группы. Поскольку основным донором фосфатных групп в клетках является аденозин-5’- трифосфат, наиболее востребованным среди нуклеозид-5’-[-32(33)P] – трифосфатов является аденозин-5’-[-32(33)P] трифосфат ([-32(33)P]АТР). Более того, [ 32(33) P]АТР является промежуточным продуктом при ферментативном синтезе нуклеозид 5’-[-32(33)P] трифосфатов, поэтому синтез [-32(33)P]АТР является ключевым.

1.1 Синтез [-32P]АТР реакцией «обмена».

В основе технологии получения [-32P]АТР реакцией «обмена» лежит работа Глина и Чаппела [I.M.Glynn, J.B.Chappell Biochem.J. 1964, 90, 147], в которой было предложено синтезировать [-32P]АТР из АТФ по следующей схеме (схема 1):

1) рррА + 3-рGlyOH ppA + 1,3-pGlyOp фосфоглицераткиназа pi ) + NAD+ 2) 1,3-pGlyOp + NADH 3-pGla + pi ( глицеральдегидфосфатдегидрогеназа схема 1.

-5 На первой стадии фосфоглицераткиназа (PGK) фосфорилирует 3-фосфоглицерат (3-pGlyOH) с помощью АТP (рррА), превращая их в 1,3-дифосфоглицерат (1,3-pGlyOp) и АDP (ppA) соответственно. На второй стадии глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (GAPD) дефосфорилирует 1,3-дифосфоглицерат с одновременным восстановлением до глицеральдегид 3-фосфата (3-pGla). Именно на этой стадии, благодаря обратимости этой реакции, радиоактивный неорганический ортофосфат (32pi), добавленный в реакционную смесь, включается в состав органического соединения - 1,3-дифосфоглицерата – с образованием радиоактивного 1,3-[1-32P]дифосфоглицерата. Радиоактивный [-32P]АТР синтезируется за счет обратимости реакции, которую катализирует PGK. Молярная активность [-32P]АТР, синтезированного этим способом, рассчитывается по формуле 1:

Амол = Аоб. х % выхода, где (м +м ) АТР *pi Амол - молярная активность, Ки/ммоль Аоб - общая активность в реакции, Ки % выхода – выход реакции (доля радиоактивного фосфата, конверсировавшего в АТР), % (м +м ) – суммарное количество ммолей АТР и неорганического (радиоактивного) АТР *pi фосфата - *pi Формула 1.

Количество ферментов для синтеза всегда берется в значительном избытке (в 30 100 раз по единицам ферментативной активности). Это обусловлено низкой концентрацией реагентов и необходимостью максимально сократить длительность реакций до достижения равновесия. Теоретически варьируя соотношение реагентов, в первую очередь молярное отношение АТР и *pi, можно менять молярную активность в широких пределах. Однако, как следует из формулы 1, при этом будет существенно меняться выход реакции. Так, при выходе 75% (соотношение АТР : *pi = 3 :1 ) молярная активность не может превышать 1300 Ки/моль, независимо от абсолютного количества радиоактивного фосфата, взятого в реакцию. Реально, за счет примеси «холодного» Р ортофосфата во всех компонентах реакционной смеси, молярная активность зависит от количества радиоактивного фосфата, взятого в синтез, и оказывается всегда немного ниже расчетной. Оптимальным для серийного производства оказалось соотношение АТР : *pi = 2,5 : 1, которое обеспечивает технологический выход на уровне 65-70% с гарантированной молярной активностью не ниже 1600 Ки/моль при загрузке 100 мКи меченого ортофосфата (см. рис.1, реакция 1). Эта технология легко масштабировалась в широком -6 диапазоне (вплоть до 1 Ки по радиоактивному сырью) и полностью применима как для фосфора-32, так и для фосфора-33.

pi Рис.1. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе аликвот реакционных смесей синтеза [-32P]АТР. Элюент 1 М КН2РО 1 – синтез реакцией «обмена»

2 – синтез прямой реакцией из ADP Выход реакции, определенный с помощью ATP фосфоиммиджера для реакции 1 – 68% 1 2 для реакции 2 – 95% 1.2. Синтез [-32P]АТР по прямой реакции из АDР.

Технология синтеза [-32P]АТР по прямой реакции из АDР была разработана на основе работ Джонсона и Валсеса [Walseth T.F., Johnson R.A. Biochim Biophys Acta. 1979, 562(1):11-31], которые предложили модифицировать предыдущую схему за счет дополнительного фрагмента цепи гликолиза (см. схему 2). По их методу глицеральдегид 3-фосфат (3-pGla) синтезируется из L--глицеролфосфата (3-рGly) c помощью глицеролфосфатдегидрогеназы (GPD) и триозофосфатизомеразы (TPI).

1) СН2-ОН + NAD+ глицеролфосфатдегидрогеназа СН2-ОН + NADH СН-ОН С=О СН2-О-Н2РО3 СН2-О-Н2РО 3-рGly DAP триозофосфатизомераза 2) СН2-ОН СН=О С=О СН-ОН СН2-О-Н2РО3 СН2-О-Н2РО DAP 3-pGla 3) СН=О + NAD+ + H3*PO4 O=C-O-H2*PO3 + NADH глицеральдегидфосфатдегидрогеназа СH-OH СН-ОН СН2-О-Н2РО3 СН2-О-Н2РО 3-pGla 1,3-pGlyOp -7 4) O=СН-O-H2*PO3 + ppA O=C-O-H + *PppA фосфоглицераткиназа ([-32(33)P]АТР) СH-OH СН-ОН СН2-О-Н2РО3 СН2-О-Н2РО 1,3-pGlyOp 3-рGlyOH + 5) СH3 + NADH CH3 + NAD лактатдегидрогеназа С=O СН-ОН СOOH СООН Pyr схема На первой стадии из 3-рGly с помощью GPD образуется диоксиацетонфосфат (DAP), который на второй стадии с помощью TPI изомеризуется в 3-pGla. На стадиях 3 и последовательно синтезируется [-32(33)P]АТР – на схеме 2 он обозначен *PppA – с помощью соответственно GAPD и PGK. Для увеличения выхода [-32(33)P]АТР NAD+, расходующийся на стадиях 1 и 3, регенерируется лактатдегидрогеназой (LDH) на стадии 5. Несмотря на кажущуюся сложность, метод очень прост в реализации. Отдельно готовится смесь ферментов из сульфат-аммонийных суспензий индивидуальных ферментов, отдельно готовится реакционная смесь, содержащая необходимые компоненты. Затем все прибавляется к раствору радиоактивного фосфата. Синтез завершается через 10-15 мин. инкубации с выходом 95-98% и полностью применим как для фосфора-32, так и для фосфора-33. Специфичность PGK позволяет синтезировать по этой технологии практически все природные нуклеозид-5’-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора в гамма положении.

Однако масштабирование этой технологии имеет серьезные ограничения. Несмотря на значительный избыток ферментов, выход [-32P]АТР сильно зависит от загрузки радиоактивного сырья. Так при исходной активности Р-ортофосфата до 1 мКи в реакционной смеси выход реакции стабильно достигает 98%. С увеличением активности до 10 мКи выход несущественно снижается до 95%, а при активности 50 мКи – до 85-90%.

С увеличением загрузки свыше 100 мКи выход снижается до 70%. Одновременно резко возрастает чувствительность всей системы к химическим микропримесям, содержащимся в исходном 32Р-ортофосфате, что также отражается на выходе продукта.

Исследование моделей реакционной смеси синтеза [-32P]АТР с различным количеством ортофосфата от 1 до 100 нмоль, но с одинаковым аналитическим количеством радиоактивности (0,1 мКи), показало, что в исследуемом диапазоне -8 применяемый избыток ферментов обеспечивает стабильный выход [-32P]АТР более 95%.

Это означает, что фактором, снижающим выход [-32P]АТР, является количество радиоактивного ортофосфата, т.е. на ферментативный синтез оказывает влияние ионизирующее излучение.

Сравнивая синтез [-32P]АТР по реакции «обмена» и синтез [-32P]АТР по прямой реакции из ADP, мы предположили, что наибольшую чувствительность к ионизирующему излучению проявляет GPD. Остальные ферменты (TPI и LDH) намного стабильнее, а LDH к тому же вообще выполняет «вспомогательную» функцию поддержания постоянной концентрации NAD+ и напрямую в синтезе [-32P]АТР не участвует. Так как GPD и TPI катализируют реакции на первой и второй стадиях, которые протекают без участия радиоактивного ортофосфата, их функция в синтезе подготовительная – наработка 3-pGla.

Мы несколько изменили порядок прибавления реагентов, и, оказалось, что если провести инкубацию всех ферментов с компонентами реакционной смеси без радиоактивного ортофосфата, а затем добавить в реакционную смесь нейтральный раствор Р ортофосфата (рН 7.0), то выход [-32P]АТР стабилизируется (см. рис.1, реакция 2). При таком порядке проведения синтеза получается стабильный выход около 95%, c количеством радиоактивного ортофосфата вплоть до 200 мКи.

Дальнейшее развитие этого подхода привело к технологическому решению создания набора компонентов для синтеза [-32P]АТР – «кита» для синтеза. Состав такого кита представлен в табл.1.

Таблица 1. Состав набора компонентов для синтеза [-32P]АТР.

Смесь реагентов Смесь ферментов (конечная концентрация) 50 мМ Трис-НСl, рН 8,0 GPD 1 ед. акт./мл 5 мМ MgCl2 TPI 2 ед. акт./мл 5 мМ ДТТ GAPD 3 ед. акт./мл 2 мМ 3-рGly PGK 10 ед. акт./мл + 4 мМ -NAD LDH 25 ед. акт./мл 20 мМ пируват натрия Общий объем реакционной смеси: 60 -70 мкл Особенность ферментативного синтеза [-32P]АТР заключается в значительном избытке ферментов (в 10-50 раз по количеству единиц ферментативной активности) при незначительном избытке нерадиоактивных компонентов (в 2 – 4 раза по отношению к количеству ортофосфата). Соотношение ферментов, подобранное для максимального -9 выхода [-32P]АТР, в цепи катализируемых реакций характеризуется увеличением количества каждого последующего фермента цепи по сравнению с предыдущим.

Значительный избыток пирувата и LDH необходим для эффективной регенерации NAD+.

Просто использовать значительный избыток NAD+ нельзя, потому что образующийся в реакции NADH ингибирует реакции на стадиях 1 и 3, и выход [-32P]АТР сразу снижается.

Объединенная смесь реагентов и ферментов инкубируется при 37оС, а затем добавляется расчетное количество АDР и нейтральный (рН 7,0) раствор Р-ортофосфорной кислоты.

После 20 мин. инкубации при 37оС синтез завершен. Более того, оказалось очень технологичным готовить единую смесь для синтеза сразу на 20-30 китов, проводить первую инкубацию, расфасовывать киты по пластиковым пробиркам и хранить их при 70оС или в жидком азоте. При этих условиях они могут храниться несколько месяцев без заметного снижения ферментативной активности. В этом варианте синтез [-32P]АТР заключается в добавлении к раствору Р-ортофосфата АDР и размороженного кита, и после инкубации в отобранной аликвоте определяется выход синтезированного [ P]АТР.

1.3. Синтез [-32P]NТР конверсией из [-32P]АТР.

Для различных биохимических исследований часто необходимо синтезировать [ P]NТР, где N – химически модифицированный нуклеозидный фрагмент. Исходным соединением является соответствующий нуклеозид-5’-дифосфат (NDР). Если фосфоглицераткиназа (PGK) не фосфорилирует модифицированный NDР как представлено на схеме 2, то можно воспользоваться иным способом, представленным на схеме 3.

NDPk ррN + *pppA *pррN + ppA схема NDPk – это нуклеозиддифосфаткиназа – фермент, осуществляющий обмен «концевой» -фосфатной группой между [-32P]АТР и NDР. Константа равновесия этой реакции близка к 1, а низкая специфичность NDPk к гетероциклическому основанию нуклеотидов позволяет легко синтезировать этим методом широкий круг разнообразных химически модифицированных производных. На схеме 4 представлены структуры модифицированных нуклеозид-5’-дифосфатов, которые были успешно профосфорилированы с помощью NDPk и [- P]АТР до соответствующих [-32P]NТР.

Выход реакции зависит от молярного соотношения [-32P]АТР : NDР и составляет около 90%. На рис. 2 представлен автограф ТСХ продуктов реакции синтеза некоторых модифицированных [-32P]NТР.

- 10 O O NH NH CH CH HN N N N N O O O O O O O N N N HO PO PO N N HO P O PO HO P O PO O O O OH OH OH OH OH OH N OH OH OH OH ABzDP ABnDP AZTDP NH O O N N CH O O HN N N HO PO PO O O O O N OH OH HO PO PO O OH OH OH OH AN-ODP d4TPD Схема 4.

.

AZTTP d4TTP Рис. 2. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе аликвот реакционных смесей синтеза [-32P]NTP.

ADP Элюент – 1 М КН2РО 1 – [-32P]ATP (контроль), 2 – синтез [-32P]d4TTP, 3 – синтез [-32P] ABzTP, ATP 4 – синтез [-32P] ABnTP, 5 – синтез [-32P] AN-OTP, 6 – синтез [-32P]AZTTP, Выход продукта в реакциях 3,4,5 определялся ВЭЖХ.

1 2 3 4 5 Основным недостатком этого метода является необходимость использования значительного избытка NDР по отношению к [-32P]АТР. Очевидно, что, увеличивая избыток до 20-ти кратного, можно получить выход около 95%. Однако, при таком соотношении возникают проблемы очистки целевого соединения от избытка непрореагировавшего NDР. Поэтому оптимальным для этого метода является соотношение [- P]АТР : NDР = 1 : 9, при котором высокий выход сочетается с умеренными трудностями хроматографической очистки.

2. Синтез нуклеозид-5’-[-32(33)P] трифосфатов.

Синтез нуклеозид-5’-[-32(33)P] трифосфатов состоит из двух разных задач: синтеза нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов и их последующего фосфорилирования - 11 нерадиоактивными фосфатами до конечного продукта. При этом синтез меченого нуклеотида иногда проводится химически, а иногда – с помощью ферментов. Никаких существенных различий в химических или ферментативных процессах между фосфором 32 и фосфором-33 при синтезе меченных радиоактивным фосфором нуклеотидов не обнаружено, и первоначальная разработка синтеза нуклеотидов для изотопа фосфор- была без особых технологических трудностей использована для изотопа фосфор-33.

2.1. Ферментативный синтез нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов.

нуклеозид-[5’-32(33)P] В основе технологии ферментативного получения монофосфатов мы использовали работу Валсеса [Walseth T.F., Yuen P.S., Moos M.C. Jr Methods Enzymol. 1991, 195, 29-44], в которой целевой продукт получается в две стадии (см. схему 4). Сначала нуклеозид-3’-фосфат (Np) фосфорилируется до нуклеозид 3’,5’- [5’ 32(33) P] дифосфата с помощью Т4-полинуклеотидкиназы (PNK). На этой стадии донором [-32(33)P]АТР.

радиоактивной фосфатной группы является Затем проводится дефосфорилирование «лишней» 3’-фосфатной группы с помощью нуклеазы Р1.

PNK_ 1. Np + *pppA *pNp + ppA _P 2. *pNp *pN + pi схема 4.

Такой путь достаточно универсален. Все природные нуклеотиды, входящие в состав нуклеиновых кислот, легко синтезируются по этой схеме из соответствующих нуклеозид-3’-фосфатов. Полинуклеотидкиназа фага Т4 – фермент доступный и широко применяется в молекулярной биологии и биотехнологии. Так же доступны все природные нуклеозид-3’-монофосфаты, которые производятся многими фирмами. Несколько сложнее проблема с нуклеазой Р1. Этот фермент, выделяемый из Penicillium citrum, производится только фирмой Sigma, и довольно дорог. Мы исследовали возможность использования для синтеза нуклеазы S1, доступного и широко применяемого фермента, который выделяется из Aspergillus aryzae. Данные по начальным скоростям ферментативного 3’ дефосфорилирования нуклеазой S1 различных нуклеозид-3’,5’-дифосфатов (pNp), приведенные в табл.2, показывают, что гидролиз 2’-дезоксинуклеозидных производных проходит примерно в 40-80 раз медленнее, чем гидролиз рибонуклеозидных аналогов.

Таблица 2. Начальные скорости гидролиза *нуклеазой S1 различных субстратов.

pAp pCp pGp pUp pdAp pdCp pdGp pTp Скорость реакции в 275 350 250 232 6,6 7,9 3,2 13, пмоль/мин - 12 *- количество фермента во всех экспериментах – 10 ед.нуклеазной активности.

Тем не менее, активность нуклеазы S1 достаточна, чтобы использовать этот фермент вместо нуклеазы Р1 для препаративного синтеза [-32(33)P] dNTP.

2.2. Синтез нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов химическим фосфорилированием.

В силу специфики процессов наработки радиоактивных изотопов фосфора (фосфор-32 и фосфор-33) их получают в виде соответствующих ортофосфорных кислот.

Стремление к максимально высокой молярной активности заставляет избегать методов синтеза, которые приводят к изотопному разбавлению радиоактивного фосфора «холодным» изотопом фосфором-31, например, используя меченный радиоактивным фосфором хлорооксид фосфора РОCl3. Поэтому исходным сырьем для химического 32(33) синтеза меченых нуклеотидов также является Р-ортофосфорная кислота.

Фосфорилирование нуклеозиодов проводится в присутствии конденсирующего агента в безводной среде. Так как химическое фосфорилирование не имеет ярко выраженной селективности, то для фосфорилирования только 5’-гидроксильной группы необходимо использовать 3’-защищенные 2’-дезоксинуклеозиды или 2’,3’-защищеннные рибонуклеозиды. В качестве защитной группы мы использовали ацетильную или изопропилиденовую (для рибонуклеозидов). После конденсации защитная группа удаляется и нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфат выделяется хроматографически. Очевидно, что такой путь синтеза более трудоемкий, чем ферментативный, и выход целевого нуклеотида значительно ниже. К тому же выделение продукта после химического синтеза также является более сложной задачей, т.к. в реакционной смеси присутствует значительное количество побочных радиоактивных продуктов. Поэтому химический синтез мы использовали только для фосфорилирования нуклеозидов (их структуры представлены на схеме 5), которые невозможно синтезировать ферментативно, как описано выше на схеме 4.

В частности, это синтетические аналоги нуклеозидов: 2’,3’-дидезокси-2’,3’ дегидронуклеозиды или 3’-замещенные нуклеозиды. На примере 3’-азидотимидина (AZT) было проведено сравнение эффективности нескольких конденсирующих агентов, широко применяемых в химии фосфорилирования нуклеозидов, а именно, 2,4,6 триизопропилбензолсульфохлорид (TPSCl), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC), N морфолиноэтил- N'-циклогексил карбодиимид (MCC), и трихлороацетонитрил (TCN).

Выходы целевого [32P]-AZTMP (структура А на схеме 6) и составы реакционных смесей в этих реакциях приведены в таблице 3.

- 13 Thy Thy Cyt O O O HO HO HO S N3 d4T AZT 3TC Ade Gua O O HO HO d2A ACV Схема 5.

Таблица 3. Состав продуктов реакции фосфорилирования АZТ [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии различных конденсирующих агентов Содержание компонентов в реакционной массе, % Конденсирующий [ P]-AZTMP бис(азидотимидин) агент H332PO4 НП* [32P]-дифосфат (B) (A) TPSCl 35 4 61 TCN 15 0 84 DCC 18 50 23 MCC 30 26 39 *Неидентифицированные примеси Выход [32P]-AZTMP, полученный в условиях классического синтеза Симонса с использованием TCN [Symons R.H. Methods Enzymology 1974, 29, 102–8] составлял 1-2%.

Замена растворителя (пиридин вместо DMSO) позволила нам существенно увеличить выход продукта (до 15%) и снизить количество побочных продуктов.

Выбранное нами соотношение реагентов характерно для химического радиоактивного синтеза, в котором радиоактивная компонента используется в значительном недостатке (к 1 экв. [32Р]-фосфорной кислоты добавляли 100 экв. АZТ и экв. соответствующего конденсирующего агента). Столь значительный избыток нуклеозидной компоненты позволяет провести реакцию в условиях, при которых скорость реакции практически не зависит от изменения концентрации АZТ. В случае применения ВЭЖХ такой избыток АZТ не вызывает дополнительных потерь при выделении.

- 14 Использование 10 эквивалентов конденсирующего агента позволяет значительно повысить воспроизводимость реакции за счет нивелирования влияния качества растворителей и реактивов. Реакции проводили в среде абсолютного пиридина при 180С.

Ход реакции и выход продукта оценивали по ТСХ на силикагеле. На рис. 3 представлен радиоавтограф такого анализа с помощью пластинки Кизельгель 60. Точки отобраны в моменты времени, соответствующие максимальным выходам продукта [32P]-AZTMP ( мин для TPSCl, 1 ч для TCN, 2,4 ч для DCC и 1,8 ч для MCC).

При использовании наиболее распространенного конденсирующего агента DCC, так же как и его водорастворимой формы МСС, достигались сравнительно невысокие выходы целевого продукта [32P]-AZTMP (20-25%). Кроме того, в этих реакциях наблюдалось образование значительного количества (до 50%) бис(азидотимидин)-[32P] дифосфата ( структура В на схеме 6).

O - -O O O P OАЗТ H АЗТО P O P OАЗТ O O O A B Схема 6.

В случае TPSCl количество примесей было минимально, однако выход целевого нуклеотида не превышал 30-32%.

1 2 3 4 Рис. 3. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммы (Кизельгель 60  F254)  реакции фосфорилирования АZТ [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии различных конденсирующих агентов: 1- реакция с TPSCl, 2- реакция с TCN, 3- реакция с DCC, 4 реакция с MCC, 5- реакция с BrCN (элюция в системе диоксан : изопропанол : вода : 25% водный аммиак 3:3:3:1).

- 15 Поскольку ни один из изученных конденсирующих агентов не показал высокой эффективности в реакции фосфорилирования АZТ, была исследована возможность использования в этом качестве BrCN – активирующего агента, который ранее применяли для синтеза олигонуклеотидов [Shabarova et. аl. Orig Life Evol Biosph. 1997, 27, 555-66].

Использование N-алкилморфолинов в качестве основания нам показалось неприемлемым, поскольку отмеченное авторами в этой работе расщепление третичных аминов под действием BrCN приводит к нецелевому расходованию активирующего агента и накоплению побочных продуктов. Проведение реакции в присутствии BrCN в условиях, описанных выше для других конденсирующих агентов, невозможно, так как было показано, что в среде абсолютного растворителя основным продуктом является дифосфат (В). Мы провели реакцию в 5 М водном пиридине и получили [32P]-AZTMP с выходом 46%. Выход дифосфата [32P]- (В) составил 4%. Следует отметить, что существенное преимущество BrCN заключается в том, что избыток этого реагента может быть полностью удален упариванием в вакууме, что уменьшает потери при выделении продукта [32P]-AZTMP. Другим преимуществом BrCN является крайне высокая скорость реакции. Мы сравнили динамику реакции фосфорилирования АZТ в присутствии TPSCl и BrCN в пиридине при 200С при оптимизированных соотношениях реагентов (рис. 4 и 5).

Скорости этих реакций различаются, по крайней мере, на порядок. Для реакции с TPSCl оптимальное время реакции 10–20 мин, а затем выход незначительно уменьшается, вероятно, за счет процесса димеризации [32P]-AZTMP. Для реакции с BrCN оптимальное время реакции 1 мин.

Pi (2) % (3) 0 10 20 Время, мин40 60 Рис. 4. Динамика реакции фосфорилирования в присутствии TPSCl. Pi – содержание неорганического фосфата;

(2) – содержание в реакционной смеси [32P]-AZTMP;

(3) – содержание в реакционной смеси бис(азидотимидин)-[32P]-дифосфата.

- 16 Pi % (2) (3) 0 1 2 4 6 8 Время, мин Рис. 5. Динамика реакции фосфорилирования в присутствии BrCN. Pi – содержание неорганического фосфата;

(2) – содержание [32P]-AZTMP;

(3) – содержание бис(азидотимидин)-[32P]-дифосфата Фосфорилирование других нуклеозидных аналогов в присутствии BrCN также протекает достаточно быстро (см. Табл.4), и глубина прохождения реакции мало зависит от увеличения времени реакции. На примере фосфорилирования ACV хорошо видно, что даже значительное увеличение длительности реакции не увеличивает выход целевого продукта.

К сожалению, такой метод фосфорилирования нуклеозидов не является селективным в отношении гидроксильных групп углеводного фрагмента (см. Табл.5). Он требует введения защитных групп на 3’ (или на 2’ и 3’) гидроксильные группы нуклеозидов перед фосфорилированием с последующим удалением защитных групп после окончания реакции и для фосфорилирования природных нуклеозидов нецелесообразен.

Таблица 4. Состав продуктов реакции фосфорилирования нуклеозидных аналогов [32Р] ортофосфорной кислотой в присутствии BrCN.

Cоотношение продуктов фосфорилирования, % Выход 5’ Нуклеозид монофосф 5’-монофосфат 5’-дифосфат биснуклеозид ата, % Ам*** Pi 1 2 -дифосфат AZT 55 3 14 11 d4T 58 4 10 12 3TC 53 3 5 9 d2A 46 1 11 18 ACV* 7 менее 1% менее 1% 82 ~ менее ACV** 9 менее 1% менее 1% ~ 1% *Время реакции 4 ч, - 17 ** Время реакции 24 ч *** Ам – побочный продукт (фосфоамид) Таблица 5. Состав продуктов реакции фосфорилирования нуклеозидов [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии BrCN.

Соотношение продуктов фосфорилирования, % Нуклеозид 5’-монофосфат 3’-монофосфат 3’,5’-дифосфат тимидин 53 44 2’-дезоксиуридин 50 45 аденозин 39 60* 1** * ** смесь 2’- и 3’-монофосфатов смесь 2’,5’ и 3’,5’- дифосфатов Тем не менее, такой метод имеет свои преимущества. При фосфорилировании ортофосфорной кислотой в присутствии BrCN не затрагиваются аминогруппы нуклеозида, и, следовательно, нет необходимости использовать защиту NH2-групп. Также возможно фосфорилирование без введения защитных группировок модифицированных нуклеозидов, содержащих тиагруппы и двойные связи.

3. Ферменты для фосфорилирования нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов.

Ферментативное фосфорилирование нуклеозид-5’-монофосфатов в клетках обеспечивается группой фосфотрансфераз, которая получила собирательное название нуклеозидмонофосфаткиназы или нуклеотидкиназы. Строгое название по Номенклатуре ферментов Международного биохимического союза – АТР: нуклеозид-5’-монофосфат фосфотрансферазы, (КФ 2.7.4.4.). В клетках прокариот и эукариот эти ферменты специфичны к гетероциклическому основанию акцептора фосфатной группы и слабо различают рибозный и 2’-дезоксирибозный фрагмент нуклеотида. Следовательно, для фосфорилирования природных нуклеотидов необходимы 5 ферментов:

аденозинмонофосфаткиназа (АМР-киназа), гуанозинмонофосфаткиназа (GMP-киназа), цитидинмонофосфаткиназа (СМР-киназа), тимидинмонофосфаткиназа (ТМР-киназа) и уридинмонофосфаткиназа (UMP-киназа). Коммерчески доступным препаратом является только АМР-киназа. Коммерческий препарат GMP-киназы мало пригоден к использованию в синтезе [-32(33)P] GTP, т.к. часто загрязнен примесями фосфатаз и других нуклеотид-разрушающих ферментов. Для фосфорилирования пиримидиновых нуклеотидов существует коммерческий препарат под названием «нуклеозидмонофосфаткиназа», который представлял собой сульфат-аммонийную фракцию суммы нуклеозидмонофосфаткиназ переменного состава. Колебания в - 18 соотношении целевых ферментативных активностей и значительные количества примесей нуклеотид-разрушающих ферментов делают этот препарат крайне ненадежным при использовании в препаративном синтезе [-32(33)P] NTP. Поэтому нами была разработана технология выделения индивидуальных нуклеозидмонофосфаткиназ из E.coli с чистотой, необходимой для ферментативного синтеза [-32(33)P] NTP.

3.1. Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ из E.coli.

Источником нуклеозидмонофосфаткиназ была выбрана E.coli MRE-600. В дальнейшем было обнаружено, что можно успешно использовать E.coli В. Колебания в уровне содержания различных нуклеозидмонофосфаткиназ в биомассе зависят, прежде всего, от условий выращивания. При этом наибольшая зависимость уровня ферментативной активности лизата от условий выращивания E.coli была обнаружена для ТМР-киназы. Активность ТМР-киназы в лизатах колебалась более, чем в 10 раз, в то же время для остальных нуклеозидмонофосфаткиназ такая зависимость менее характерна.

Очистка нуклеозидмонофосфаткиназ включала следующие стадии:

1.Разрушение биомассы E.coli ультразвуком и осветление лизата.

2.Осаждение нуклеиновых кислот полиэтиленимином и сульфат-аммонийное фракционирование.

3.Обессоливание сульфат-аммонийной фракции.

4.Фракционирование хроматографией на DEAE-целлюлозе.

5.Фракционирование аффинной хроматографией на биогелях со специфическими красителями.

6.Концентрирующий диализ.

Три первых стадии являются традиционной процедурой лизиса клеток и подготовки белкового раствора к хроматографическому фракционированию.

Ионообменная хроматография позволила разделить все нуклеозидмонофосфаткиназы между собой, кроме АМР-киназы и UMP-киназы, проводя элюцию ферментов линейным градиентом концентрации KCl (см. рис 6.).

- 19 A280 E, отн.ед.акт. [KCl], M 0, 10 1,2 3 4 5 0, 0, 20 40 60 80 № фракций Рис. 6. Профиль хроматографического разделения NMPk E.coli на DEAE целлюлозе.

поглощение элюата при длине волны 280 нм концентрация KCl ферментативная активность NMPk E.coli 1 – АМР-киназа;

2 – UMP-киназа;

3 – GMP-киназа;

4 – TMP-киназа;

5 – CMP киназа.

Дальнейшую очистку ферментов проводили с использованием аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих биоспецифические красители («dye-ligand chromatography»). Фракции, содержащие АМР-киназу и UMP-киназу, фракционировали хроматографией на биогеле Blue A (цибакроновый голубой). При этом АМР-киназная активность сорбировалась на колонке и элюировалась линейнам градиентом KCl (см.

рис.7а). UMP-киназная активность не сорбировалась на биогеле Blue A, поэтому элюат с несорбировавшеся UMP-киназой фракционировали на колонке с биогелем Red A (проционовый красный) и также элюировали градиентом концентрации KCl (см. рис.7б).

Для очистки СМР-киназы и ТМР-киназы после ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе фракции, содержащие соответствующие активности, хроматогрфировали на колонке с биогелем Blue A. Типичный профиль элюции СМР киназы градиентом концентрации KCl представлен на рис.7в.

- 20 - 21 А280 Е, отн.ед акт.

[KCl], M 1,0 3, 2, 0,5 1, 10 20 30 40 номера фракций Рис.7в. Профиль хроматографии СМР-киназы E.coli на колонке с биогелем Blue A.

поглощение элюата при длине волны 280 нм;

концентрация KCl;

активность СМР-киназы Для очистки GМР-киназы после ионообменной хроматографии на DEAE целлюлозе фракции, содержащие соответствующую активность, хроматогрфировали на колонке с биогелем Green A.

После концентрирующего диализа растворы очищенных ферментов в 50% глицерине могли храниться при -20оС несколько лет без заметного снижения активности.

Основным критерием пригодности нуклеозидмонофосфаткиназ для препаративного синтеза [-32(33)P] NTP или [-32(33)P] dNTP является их способность разрушать (гидролизовать) нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфаты. При инкубации с соответствующим нуклеотидом, меченным фосфором-32, с молярной активности более 1000 Ки/моль препараты АМР-киназы, СМР-киназы и ТМР-киназы не разрушали [ P]АМP, [-32P]СМP и [-32P]TМP в течение 12-18 часов. Использование всех очищенных таким способом ферментов для синтеза соответствующих [-32P] NTP показало, что даже длительные инкубации по 18 часов не приводят к значительному накоплению Р ортофосфата. Энзимологическая чистота выделенных ферментов приведена в табл. 6.

- 22 Таблица 6. Энзимологическая чистота нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

Степень Активность нуклеотид Фермент хроматографической дефосфорилирующих очистки ферментов, % 1 АМР-киназа 30 0, 2 СМР-киназа 180 0, 3 UМР-киназа 60 0, 4 GМР-киназа 130 0, 5 ТМР-киназа 90 0, Степень хроматографической очистки для каждого фермента дана по отношению к активности фермента во фракции после сульфат-аммонийного фракционирования. Точное количественное измерение активности выделяемых ферментов в клеточном лизате затруднительно из-за высокой активности фосфатаз и нуклеотид-разрушающих ферментов, содержащихся в гомогенате. Следует отметить, что все выделенные вышеизложенным способом ферменты не являлись чистыми белками и содержали значительное количество балластного белка. Например, для очистки СМР-киназы до чистоты не ниже 90% по электрофорезу в ПААГ, потребовалось провести дополнительно гельфильтрацию на колонке LKB Ultrapac TSK G 3000 SWG и ионообменную хроматографию на колонке DEAE-Toyopearl 650 M. Конечная очистка СМР-киназы составила 2650 раз, выход по активности около 10%. Для технологических целей такая высокая чистота не требуется, и подобную глубокую очистку нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli не проводили, считая ее нецелесообразной.

3.2. Свойства нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

Для использования нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli в препаративном синтезе [ 32(33) P] NTP и [-32(33)P] dNTP необходимо знать основные свойства ферментов: оптимум рН и температуры, необходимые для активности кофакторы, ионы металлов, стабильность при хранении, оптимальные концентрации субстратов, возможные ингибиторы. Особенно важно определить субстратную специфичность ферментов и их чувствительность к ионизирующему излучению в растворе, т.к. эти факторы определяют возможность использования фермента и возможный масштаб синтеза меченого соединения.

Температурный оптимум для всех выделенных ферментов был близок и находился в интервале 35-40оС.

- 23 Несмотря на некоторые различия, все ферменты проявляют практически максимальную активность в интервале рН 7,5-8,0 (см. рис 8).

Активность NMPk,% АМР-киназа UМР-киназа GMP-киназа рН 4 5 6 78 9 10 4 5 6 78 9 10 4 5 6 7 8 9 Активность NMPk, % ТМР-киназа СМР-киназа рН 4 5 6 7 8 9 10 4 5 6 7 8 9 Рис.8. Влияние рН на ферментативную активность NMPk E.coli.

Для активности всех исследуемых NMPk E.coli абсолютно необходимы катионы двухвалентных металлов, максимальная активность проявляется ферментами в присутствии 5мМ MgCl2 (см. табл. 7). В присутствии 0,5 мМ ЕДТА активность ферментов полностью подавлялась, однако процесс обратимый, и после добавления MgCl2 до 5мМ концентрации ферментативная активность восстанавливалась. ДТТ, -меркаптоэтанол, N этилмалеилимид не оказывали заметного влияния на активность NMPk E.coli.

Специфичность нуклеозидмонофосфаткиназ в отношении доноров E.coli фосфатной группы проявляется в явном предпочтении АТР и dАТР всем остальным нуклеозид-5’-трифосфатам (см. табл.8), однако предпочтение явно не является абсолютным и различные ферменты проявляют различную способность к замене АТР на СТР или dGТP. Для технологических целей важно, что существует возможность полноценной замены АТР на dАТР в качестве донора фосфата, поскольку это расширяет возможности синтеза [-32(33)P] NTP и [-32(33)P] dNTP.

- 24 Влияние катионов двухвалентных металлов на активность Таблица 7.

нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli * Mg2+ Mn2+ Co2+ Ca2+ Ферменты Аденилаткизаза 100% 100% 46% 70% Гуанилаткиназа 100% 95% 70% 85% Цитидилаткиназа 100% 100% 93% 50% Уридилаткиназа 100% 65% 45% 20% Тимидилаткиназа 100% 72% 40% 1% *Максимальная активность каждого фермента, проявившаяся в присутствии 5мМ MgCl2 взята за 100%.

Таблица 8. Доноры фосфатной группы для нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli Относительная скорость фосфорилирования, % Донор АМР-киназа СМР-киназа GMP-киназа TMP-киназа UMP-киназа AТP 100 100 100 100 dAТP 75 97 78 84 CТP 22 9 13 35 dCТP 0 4 7 16 GТP 0 9 2 3 dGТP 0 14 0 0 TТP 8 10 5 5 UТP 1,5 6 3 2 Специфичность нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli в отношении акцепторов фосфатной группы существенно иная (см. табл.9). Наблюдается строгая специфичность к гетероциклическому основанию нуклеотида, что ограничивает широкое использование этих ферментов для фосфорилирования модифицированных нуклеотидов.

Таблица 9. Акцепторы фосфатной группы для нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli Относительная скорость фосфорилирования, % Акцептор АМР-киназа СМР-киназа GMP-киназа TMP-киназа UMP-киназа AMP 100 0 0 0 dAMP 50 0 0 0 CMP 0 100 0 0 dCMP 0 68 0 0 GMP 0 0 100 0 dGMP 0 0 75 0 TMP 0 0 0 100 UMP 0 0 0 0 dUMP 0 0 Исследование зависимости скоростей реакций фосфорилирования, катализируемых соответствующими NMPk E.coli, от концентрации субстратов показало, что для АМР киназы высокие концентрации АМР (или dAMP) снижают скорость реакции - 25 фосфорилирования, в то же время для АТР, который является донором фосфатной группы, такой эффект не обнаружен (см. рис.9). Для СМР-киназы заметно ингибирование при высокой концентрации АТР, а акцепторы фосфатной группы СМР и dCMP ингибирующего эффекта при высоких концентрациях не проявляют (см. рис.10).

Константы Михаэлиса для СМР-киназы и АМР-киназы приведены в табл.10.

Таблица 10. Константы Михаэлиса для СМР-киназы и АМР-киназы Субстрат СМР-киназа, мкМ АМР-киназа, мкМ АТР 78 АМР - dAMP - СМР 300 dCMP 250 V, V мкмоль нмоль мин мин 0, 1 0, 1, 6 3,2 4,8 6,4 [S], мМ 0,1 0,2 0,3 0,4 [S], мМ Рис.9. Зависимость скорости реакции, Рис.10. Зависимость скорости реакции, катализируемой АМР-киназой от катализируемой СМР-киназой от концентрации субстратов: концентрации субстратов:

1 – переменная концентрация АТР 1 – переменная концентрация АТР 2 – переменная концентрация АМР 2 – переменная концентрация СМР Подробные кинетические исследования для остальных NMPk E.coli не проводили, однако экспериментально было установлено, что при концентрациях субстратов до мкМ ингибирование соответствующих ферментативных реакций не обнаружено. Это означает, что в условиях реального препаративного синтеза [-32(33)P] NTP, когда концентрации субстратов не превышают 200 мкМ, эффектами ингибирования ферментов избыточной концентрацией субстрата можно пренебречь.

- 26 Исследование стабильности нуклеозидмонофосфаткиназ в условиях E.coli радиоактивного синтеза [-32(33)P] NTP подробно проводились для АМР-киназы.

Длительная инкубация фермента с радиоактивными соединениями приводит к потере ферментативной активности, однако, в течение 1-3 часов активность сохраняется даже при объемной активности более 3000 мКи/мл (см. рис.11). Такая стабильность фермента означает, что для синтеза в масштабе 100 мКи фосфора-32 эффектом радиационной инактивации можно пренебречь.

Активность фермента, % 50 100 200 t, мин.

Рис. 11. Инактивация АМР-киназы E.coli ионизирующим излучением фосфора- Ферментативная активность определялась спектрофотометрически после прединкубации:

1 – Н332РО4 4 Ки/мл;

2 – [5’-32P] AMP 3,5 Ки/мл;

3 - Н332РО4 4 Ки/мл + 50 мкМ АМР Снижение активности АМР-киназы под действием ионизирующего излучения фосфора-32 в ходе ферментативной реакции представлено на рис.12. Ферментативная активность определялась спектрофотометрически в присутствии радиоактивных субстратов - [5’-32P] AМР или [-32P] ATP.

Снижение активности фермента наблюдается только при очень высокой объемной активности радионуклида (около 1000 мКи/мл). Для объемной активности радионуклида менее 100 мКи/мл существенных изменений ферментативной активности АМР-киназы не обнаружено. Некоторые различия инактивирующего воздействия [5’-32P] AМР (линия 1) и [-32P] ATP (линия 2) невозможно однозначно объяснить без специальных исследований.

Эти различия могут определяется как природой субстратов, так и артефактными примесями, содержащимися в высокомеченных субстратах.

- 27 100 Рис. 12. Снижение активности АМР-киназы под действием 32Р-радионуклида.

Начальная концентрация АМР и АТР в Активность фермента,% реакционной смеси по 67 мкМ 1 – [5’-32P] AMP и ATP 2 – [-32P] ATP и AMP lg [32P] 1 2.

Остальные NMPk E.coli были протестированы на устойчивость к действию ионизирующего излучения фосфора-32 только по изменению ферментативной активности в присутствии 100 мКи фосфора-32. Для всех исследованных ферментов снижения ферментативной активности не обнаружено.

Таким образом, было определено, что для масштаба синтеза 100 мКи по радиоактивному сырью инактивирующим действием ионизирующего излучения на ферментативную активность NMPk E.coli можно пренебречь.

3.3. Свойства дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5.

В середине 60-х годов группой Бессмана было опубликовано сообщение [M.J.Bessman, S.T.Herriot, M.J.V. Bibber Orr, J.Biol.Chem. 1965, 240(1),439-445] о ферменте бактериофага Т5 – дезоксинуклеозидмонофосфаткиназе, способной фосфорилировать все природные 2’-дезоксинуклеозидмонофосфаты. Правда, количество фермента, которым располагала эта группа исследователей, было весьма ограничено, поэтому в этой работе утверждалось, что рибонуклеотиды фосфорилируются этим ферментом очень плохо.

Позднее, коллеги из Пущинского биологического научного центра РАН смогли проклонировать и получить эффективную экспрессию гена дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 (dNMPk T5), а также наработать фермент в препаративных количествах [G.V. Mikoulinskaia et al. Protein Expr. Purif 2003, 27, 195–201]. Это позволило нам подробно охарактеризовать субстратную специфичность фермента. Основные кинетические параметры – константы Михаэлиса (Км) и каталитические константы (Ккат) – приведены в табл. 11. Хотя скорость - 28 фосфорилирования dNMP выше скорости фосфорилирования NMP, тем не менее, скорости фосфорилирования AMP, CMP и GMP достаточно высокие для измерения спектрофотометрическим методом. Следовательно, появляется реальная возможность замены нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli одним ферментом.

Таблица 11. Субстратные свойства Т5-киназы.

Ккат, сек- нуклеотид Км, мМ Ккат/ Км dAMP 0,275 58 AMP 0,367 31 dGMP 0,267 43,2 GMP 0,81 0,29 0. dCMP 0,037 32,8 CMP 0,39 11 TMP 0,190 38,7 dUMP 4,2 10 2. ATP 0, Весьма удобным оказалось, что условия оптимальные, для активности dNMPk Т (рН, концентрация ионов Mg2+, концентрация KCl), совпадают с условиями действия NMPk E.coli.

К сожалению, скорость фосфорилирования UMP оказалась чрезвычайно низкой – примерно в 20 000 раз ниже скорости фосфорилирования ТМР. Собственно, сам факт такой реакции удалось установить только благодаря высокой чувствительности метода с использованием [5’-32P]UMP с молярной активностью более 1000 Ки/ммоль (см. рис.13).

UMP Рис. 13. Радиоавтограф хроматоргаммы на PEI целлюлозе аликот реакции фосфорилирования [5’-32P]UMP с помощью dNMPk T5. Элюент – 0,5 М KCl. Состав реакционной смеси: 50 мМ Трис UDP НCl рН=7,6;

5 мМ MgCl2;

50 мкМ АТР;

0,1 М KCl;

2 мкКи [5’-32P]UMP с молярной активностью Ки/ммоль и 2 ед. акт. фермента. Инкубация при 37оС.

1 – 0 мин. инкубации (контроль) 2 – 15 мин. инкубации 3 – 60 мин. инкубации Доля [ -32P]UDP в аликвоте 3, определенная с помощью фосфоиммиджера составила 10% от 1 2 общей активности в реакционной смеси.

- 29 Поэтому, использование этого фермента для синтеза [-32P]UТP не представляется целесообразным.

Устойчивость dNMPk Т5 к инактивирующему действию ионизирующего излучения на ферментативную активность оказалась аналогичной устойчивости NMPk E.coli.

3.4. Ферментативное фосфорилирование нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов.

Препаративное ферментативное фосфорилирование [5’-32(33)P] (d)NMP проводили с помощью NMPk E.coli и пируваткиназы (РК) – фермента, который неспецифически фосфорилирует NDP до NTP. Реакция синтеза [-32(33)P] (d)NTP протекает в две стадии и представлена на схеме 7.

NМРк_ 1. *рN + pppA р*pN + ppA 2. р*pN + РЕР РK_ рр*pN + Pyr схема 7.

нуклеозид-[5’-32(33)P] Реакция 1 на схеме 7 отражает фосфорилирование монофосфатов до соответствующих дифосфатных производных с помощью NMPk E.coli.

Реакция 2 показывает завершающую стадию фосфорилирования, которая осуществляется с помощью пируваткиназы (РК) и фосфоенолпирувата (РЕР) до соответствующих трифосфатных производных. Пируваткиназы из различных источников имеют одинаковую специфичность – они фосфорилируют нуклеозид-5’-дифосфаты до нуклеозид-5’-трифосфатов, слабо различая производные рибозы и 2’-дезоксирибозы, а пуриновые производные в 7-10 раз эффективнее, чем пиримидиновые. Поэтому для фосфорилирования всех 8 основных природных нуклеотидов были использованы 5 NMPk E.coli: АМР-киназа, GMP-киназа, CMP-киназа, UMP-киназа и TMP-киназа, а также пируваткиназа из мышц кролика. Оптимальные условия для действия NMPk E.coli и РК достаточно близки, и это позволило унифицировать состав реакционной смеси для ферментативного фосфорилирования (табл.12). Ферменты для синтеза берутся в значительном избытке (20-100 кратный избыток по количеству единиц ферментативной активности), также как РЕР. В то же время избыток АТР по отношению к меченому нуклеотиду сравнительно небольшой (в 3-10 раз). Это упрощает выделение целевого продукта и его очистку от АТР. Такая схема фосфорилирования нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов универсальна, однако имеется одно ограничение – фосфорилирование [5’ 32(33) P] АMP. Очевидно, что при синтезе [-32(33)P] ATP по этой схеме происходит изотопное разбавление за счет донора фосфатной группы – «холодного» АТР.

- 30 Таблица 12. Состав реакционной смеси для фосфорилирования нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов Компоненты универсальной Ферменты для синтеза реакционной смеси 50 мМ Трис-HCl рН 7,8 0,1 ед. акт. соответствующей NMPk 5 мМ MgCl2 0,5 ед. акт. РК 0,1 M KCl 10мМ РЕР 50 мкМ АТР Общий объем: 100 мкл Общий объем: 20 – 30 мкл Например, фосфорилирование [5’-32P] АMP в количестве 5 мКи по этой схеме снижает молярную активность целевого [-32P] ATP почти в 5 раз – до 1000 Ки/моль.

Чтобы избежать снижения молярной активности, вместо АТР в качестве донора фосфатной группы можно использовать dATP, т.к. при хроматографической очистке конечного продукта [-32P] ATP хорошо отделяется от dATP.

Таким образом, для ферментативного фосфорилирования нуклеозид-[5’-32(33)P] монофосфатов к меченому нуклеотиду необходимо добавить компоненты универсальной реакционной смеси и соответствующую смесь ферментов NMPk и РК. Выход реакции около 90%.

Дезоксинуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 (dNMPk Т5) была успешно использована для синтеза [-32(33)P] dNTP, а также [-32P] ATP, [-32P] GTP и [-32P] CTP.

Все компоненты и условия реакций синтеза при использовании dNMPk Т5 были аналогичны компонентам и условиям реакций синтеза с использованием NMPk E.coli. В то же время для синтеза [-32(33)P] UTP этот фермент оказался непригоден.

4. Очистка нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

Способ выделения синтезированных меченых нуклеотидов из реакционной смеси зависит от состава реакционной смеси и требований к чистоте выделяемого соединения.

[-32P]АТР, Например, синтезированный реакцией «обмена», обычно выделялся ионнообменой хроматографией. Мы использовали колоночную хроматографию на PEI целлюлозе с градиентной элюцией бикарбонатом триэтиламмония (ТЕАВ). Одноразовые колонки объемом 1 мл позволяли четко отделять [-32P]АТР от других радиоактивных продуктов (см. рис.13).

- 31 У этого метода было два серьезных недостатка. Во-первых, [-32P]АТР получался в объеме 3,5-4 мл раствора бикарбоната триэтиламмония высокой концентрации (около 0,7М) и после выделения приходилось удалять соль лиофилизацией или упариванием под вакуумом. Во-вторых, несмотря на высокую радиохимическую чистоту (более 95%), [-32P]АТР, выделенный таким образом, содержал значительное количество нерадиоактивных химических примесей, которые часто снижали качество конечного продукта. Для выделения [-32(33)P] dNTP хроматографическая очистка на PEI-целлюлозе оказалась хуже, т.к. чувствительность реакций, в которых использовались [-32(33)P] dNTP к химическим примесям очень высокая, и чистота целевого продукта после такой очистки недостаточна.

[-32P]АТР A, мКи [ТЕАБ], М 1, Pi 0, 0 4 8 12 16 V, мл Рис.13. Профиль выделения [-32P]АТР, синтезированного реакцией «обмена», хроматографией на PEI-целлюлозе в линейном градиенте концентрации ТЕАБ.

Объем колонки – 1,0 мл;

объем градиента – 20 мл(от 0 до 1М);

скорость элюции – 12 мл/час показания проточного детектора радиоактивности, концентация ТЕАБ Следующим шагом в повышении чистоты меченых нуклеотидов стало применение для их очистки ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В качестве сорбента использовался аминопропилсиликагель. Сравнение различных марок:

Silosorb, Silochrom, Lichrosorb, Zorbax и др. показало, что для выделения нуклеотидов - 32 градиентной элюцией бикарбоната триэтиламмония различия в качестве сорбента несущественны. Гораздо важнее - качество упаковки хроматографической колонки и качество раствора ТЕАВ. Химическая чистота меченых нуклеотидов, выделенных ионообменной ВЭЖХ, существенно возрастает, и заметно снижается количество нерадиоактивных примесей, ингибирующих ферментативные реакции с использованием [-32(33)P] dNTP.

Однако, этот способ очистки имел несколько существенных недостатков. Во первых, меченые нуклеотиды элюировались с колонки раствором ТЕАВ с концентрацией 0,4-0,6 М (в зависимости от природы гетероциклического основания нуклеотида), и, по прежнему, требовалась операция по удалению ТЕАВ. Во-вторых, концентрированный раствор ТЕАВ достаточно быстро разрушает силикагельный сорбент. В среднем, одна колонка выдерживает 10-15 хроматографий, после чего резко увеличивается необратимая сорбция радиоактивно материала на сорбенте и ухудшается разделение. Колонки для ВЭЖХ – достаточно дорогостоящие комплектующие и такой режим их использования делает весь процесс слишком затратным. В-третьих, использование концентрированного раствора ТЕАВ (1 М) осложняет стандартизацию процесса, т.к. этот раствор нестабилен, быстро «теряет» СО2 в процессе работы, что приводит к защелачиванию раствора. Более того, стандартный процесс подготовки растворов к ВЭЖХ включает дегазацию растворов, а для раствора ТЕАВ эта процедура бессмысленна и губительна.

Все эти недостатки удалось преодолеть при переходе на обратнофазовую хроматографию. Для повышения сорбции нуклеотидов на обратной фазе С-18 мы использовали ион-парный вариант хроматографии. В качестве источника противоиона мы попытались использовать различные алкиламмонийные производные: триметиламмоний ацетат, триэтиламмоний бикарбонат, трибутиламмоний хлорид и тетраэтиламмоний хлорид.

Трибутиламмоний и тетраэтиламмоний оказались весьма эффективными противоиноинами и способствовали высокой сорбции нуклеозид-5’-монофосфатов и их дифосфатных и трифосфатных производных. Однако, из-за сильной сорбции снижается селективность хроматографического разделения, т.к. нуклеотидные производные элюируются этанолом или ацетонитрилом высокой концентрации. Снижение концентрации противоионов в элюирующем буфере не приводит к улучшению хроматографического разделения нуклеотидов. Триметиламмоний оказался недостаточно эффективным для сорбции всех исследованных нуклеотидов, и от него также пришлось отказаться.

- 33 Наиболее эффективным оказался триэтиламмоний – 50 мМ раствор бикарбоната или ацетата позволял проводить хроматографическую очистку в градиенте концентрации этанола или ацетонитрила. Так как удаление ацетата триэтиламмония сложнее, чем бикарбоната, то оптимизация условий проводилась для градиента 50 мМ ТЕАВ – 70% этанол. Учитывая незначительные молярные количества компонентов ферментативных реакционных смесей, размер хроматографических колонок 4х150 мм оказался достаточным для качественного разделения продуктов реакции. Типичные профили хроматографического выделения [-32P]АТР и [-32P] dАTP приведены на рис.14.

[-32P]dATP Pi [-32P]ATP Pi Рис.14. Хроматографическая очистка [-32P]dАTP (А) и [-32P]АТР (Б) обратно фазовой ВЭЖХ. Колонка 4х150 мм, 5 мкм, Lichrosorb C-18, градиентная элюция 70% этанолом со скоростью 0,5 мл/мин.

1 – профиль элюции по УФ-поглощению при длине волны 254 нм, 2 – профиль элюции по проточному детектору радиоактивности.

Регистрация элюата проточными детекторами по УФ-поглощению и по радиоактивности значительно облегчает идентификацию целевых продуктов и делает всю процедуру очистки достаточно рутинной.

- 34 Очищенные обратно-фазовой хроматографией меченные фосфором нуклеотиды характеризуются высокой радиохимической чистотой – не ниже 97%. Особенно следует подчеркнуть, что такие препараты не содержат химических примесей, ингибирующих ферментативные реакции с участием [-32(33)P] NTP и [-32(33)P] dNTP.

В настоящее время при серийном производстве нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, их очистка проводится обратно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме, как описано выше. Такой способ очистки обеспечивает необходимые параметры качества конечной продукции и широко применяется в лабораторной практике.

32(33) 5. Радиопротектор для Р-меченых нуклеотидов.

Срок годности нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, весьма ограничен и определяется не только химической нестабильностью полифосфатного фрагмента или периодом полураспада радионуклида. Основным фактором нестабильности нуклеотидов, меченных фосфором с высокой молярной активностью, является радиолиз. Под радиолизом понимают процесс изменения химических соединений под действием совокупности различных химических реакций, индуцированных ионизирующим излучением. Различают первичный и вторичный радиолиз. Первичный радиолиз вещества – это химические превращения, возникающие в молекулах при непосредственном взаимодействии с ионизирующим излучением (-, или - частицами). Вторичный радиолиз вещества – это химические превращения, индуцированные активированными продуктами первичного радиолиза растворителя.

Большинство реакций вторичного радиолиза по природе является свободнорадикальными и протекает по длинной цепи различных превращений. Очевидно, что из-за крайне низкой концентрации меченых нуклеозид-5’-трифосфатов в растворах, вклад первичного радиолиза в их нестабильность очень незначителен. Поэтому для снижения радиолиза меченых нуклеозид-5’-трифосфатов в растворах, необходимо подавить свободнорадикальные реакции продуктов радиолиза растворителя. Среди известных радиопротекторов – «ловушек свободных радикалов» - часто использовались меркаптаны или политиоловые соединения, замещенные амины, нитрилы, полициклические ароматические и гетероциклические соединения, содержащие карбонильные (альдегидные) или карбоксильные группы, а также соединения, с сопряженными ненасыщенными связями. Однако, не смотря на широкий выбор, есть достаточно жесткие ограничения:

1. Радиопротектор должен хорошо растворяться в воде, т.к. для биохимических исследований основным растворителем является вода.

- 35 2. Сам радиопротектор не должен оказывать влияния на изучаемые биохимические процессы.

3. Продукты радиолиза радиопротектора не должны оказывать влияния на изучаемые биохимические процессы.

4. Желательно, чтобы радиопротектор был окрашен, что делает работу с такими растворами удобной.

Мы предложили использовать в качестве радиопротектора цианкобаламин (витамин В12) в виде водного раствора. Мы сравнили несколько известных радиопротекторов и предложенный нами В12 по их эффективности. В качестве модели для изучения эффективности радиопротектора использовался раствор [-32P]АТР с высокой молярной активностью (более 5000 Ки/ммоль), который хранился при + 4оС. Анализ изменений радиохимической чистоты (РХЧ) раствора [-32P]АТР во времени позволяет сравнить эффект «защиты» целевого соединения от радиолитического разрушения.

Определение РХЧ проводилось методом ТСХ на РЕI-целлюлозе. Типичная хроматограмма продуктов радиолитического разрушения [-32P]АТР приведена на рис. 15.

Рис. 15. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе аликвот препаратов [-32P]АТР после 48 часов Pi хранения при +4оС в присутствии различных радиопротекторов. Исходная объемная активность всех препаратов – 12 мКи/мл (444МБк/мл). Элюент ATP – 1 М КН2РО4.

1 – в присутствии В12;

2 – в бидистиллированной воде (без добавок);

polyP 3 – в присутствии 10 мМ DTT;

4 – в присутствии 50% этанола:

5 – в присутствии 50 мМ Трис-HCl, рН=8,0.

1 2 3 4 Обращает на себя внимание появление значительного количества неидентифицированного продукта (или продуктов) с хроматографической подвижностью более низкой, чем АТР (на рис.15 он обозначен «polyР»). Этот продукт радиолиза, получивший в литературе название «полифосфат», чрезвычайно важен для качества целевых меченых нуклеотидов, т.к. именно при его появлении возникают крайне нежелательные эффекты ферментативного ингибирования и высокой неспецифической сорбции. Поэтому в параметрах качества меченых радиоактивными изотопами нуклеотидов обязательно жестко регламентируется максимально допустимое содержание «полифосфатной фракции» - не более 1%. В табл. 11 приведены данные по снижению РХЧ [-32P]АТР в ходе хранения в присутствии некоторых радиопротекторов при +4оС.

- 36 Сравнивая продукты радиолиза [-32P]АТР, накопившиеся при хранении в присутствии разных радиопротекторов, видно, что в воде быстро накапливается «полифосфатная» фракция, в то же время в присутствии радиопротекторов скорость накопления полифосфатов значительно ниже. Очень эффективным радиопротектором оказался ДТТ, однако, продукты радиолиза и/или окисления ДТТ оказались весьма токсичными для некоторых ферментативных реакций. Поэтому при длительном хранении в присутствии ДТТ, несмотря на достаточно высокую РХЧ, использование в некоторых [-32P]АТР и, особенно [-32P] (d)NTP приводит к ферментативных системах нежелательным артефактам.

Табл.11 Изменение РХЧ [-32P]АТР при хранении в присутствии радиопротекторов Радиопротектор РХЧ % Через 1 сутки Через 2 суток Через 4 суток Через 7 суток вода 30 10 1 50% этанол* 80 65 40 10 мМ ДТТ 90 85 70 Трис-НСl рН=8,0 80 60 35 В12 95 90 80 * - для объемной активности 10 мКи/мл 6. Параметры и методы контроля качества конечного продукта.

Соединения, меченные радиоактивными изотопами, характеризуются следующими параметрами:

- наименование радионуклида (изотопа) и его место в молекуле, - радионуклидная чистота (содержание целевого радионуклида) в %, - объемная активность (концентрация радионуклида) в мКи/мл или МБк/мл, - молярная (удельная) активность в Ки/ммоль или ТБк/моль, - радиохимическая чистота (РХЧ) в %, а также другие характеристики, например, состав растворителя, примеси солей тяжелых металлов и др.

Радионуклидная чистота – параметр, который определяется измерением спектра излучения радионуклида, и для радиоактивных изотопов фосфора содержание радионуклидных примесей не должно превышать 2%. Следует отметить, что для биохимических исследований примеси фосфора-33 в целевом соединении, меченном фосфором-32, совершенно несущественны. Однако, примеси фосфора-32 в целевом - 37 соединении, меченном фосфором-33, являются во многих случаях очень важными, поэтому радионуклидная чистота фосфора-33 установлена на уровне 98%.

Радиохимическая чистота (РХЧ) или доля основного радиоактивного вещества традиционно определяется ТСХ на PEI-целлюлозе в калий-фосфатом буфере с измерением распределения радиоактивности после хроматографии. Такой унифицированный для всех [-32(33)P]NТР и [-32(33)P] NTP метод легко воспроизводится и позволяет сопоставлять данные по РХЧ, полученные в различных лабораториях и в ходе длительного хранения. Обычно РХЧ меченых нуклеотидов не ниже 95%. Содержание полифосфатов не более 1%.

Молярная активность – весьма важная для пользователей величина, которая фактически показывает доли радиоактивного и нерадиоактивного соединения в общей массе. Молярная активность – расчетная величина, которая определяется из молярной концентрации целевого вещества и его объемной активности. Для нуклеотидов, меченных фосфором-32, молярная активность обычно составляет не менее 5000 Ки/ммоль ( ПБк/моль), для соединений фосфора-33 – не менее 4000 Ки/ммоль (148 ПБк/моль).

Объемная активность – это количественный параметр, который определяет концентрацию радиоактивного соединения в растворе и определяется с помощью измерительной радиометрической аппаратуры, путем сравнения скорости счета [-32P]NТР, [-32P] NTP и [-32P] dNTP, измеряемого образца и эталона. Препараты которые начинали серийно производить для биологических исследований, имели объемную активность 1 мКи/мл (37-40 МБк/мл) и были растворены в 50% этаноле. Такие препараты были достаточно стабильны за счет этанола в качестве радиопротектора и антибактериального соединения, однако были не удобны в работе. Ферментативные реакции ингибируются высокой концентрацией этанола, и перед работой меченые соединения приходилось упаривать под вакуумом досуха, а затем растворять в рабочем буфере. По требованию исследователей, использующих в работе меченые нуклеотиды, объемную активность препаратов пришлось повысить до 10 мКи/мл (370-400 МБк/мл) и отказаться от этанола в качестве растворителя.

Нуклеозид-5’-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора, предназначаются для различных биохимических исследований, поэтому для их характеристики вышеперечисленных параметров оказалось недостаточно. Необходимо было ввести параметр, количественно определявший возможность использования меченых NTP. Таким параметром стало тестирование меченых NTP на их способность участвовать в качестве субстрата в определенных ферментативных реакциях. Такое тестирование получило название – определение биологической активности или просто – - 38 Для [-32(33)P]АТР и [-32(33)P]GТР использовалась реакция биологическая активность.

ферментативного фосфорилирования цитидин-3’-монофосфата с помощью Т 32(33) полинуклеотидкиназы. Для [- P] NTP использовалась реакция ферментативного синтеза РНК с помощью Т7 РНК-полимеразы. Для [-32(33)P] dNTP использовалась реакция ферментативного синтеза ДНК с помощью ДНК-полимеразы I E.coli в реакции «ник трансляции». Позднее этот тест был заменен реакцией синтеза фрагментов ДНК по методу «случайной затравки».

Следует подчеркнуть, что биологическая активность является с точки зрения потребителей главным критерием качества. Поэтому количественная оценка биологической активности препарата всегда являлась наиболее значимой для потребителей и вызывала острые дискуссии. Для биологической активности препаратов [-32(33)P]АТР удовлетворительным был принят уровень фосфорилирования не ниже 50%.

Для биологической активности [-32(33)P] NTP включение в РНК должно составлять не менее 40%. Для биологической активности [-32(33)P] dNTP включение в ДНК должно составлять не менее 50%, с получением удельной активности фрагментов ДНК не ниже 108 имп./мин на мкг синтезированной ДНК.

7. Технологический процесс синтеза нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

32(33) [-32(33)P] dNTP ([-32(33)P] NTP) начинается из Синтез [- P]NТР или 32(33) соответствующей Р-ортофосфорной кислоты, штоковый раствор которой хранится в 0,05 М HCl в кварцевой емкости для снижения сорбции меченого фосфата на стенках сосуда. После нейтрализации HCl, в реакционную смесь добавляют расчетное количество 10 мМ ADP и кит для синтеза [-32(33)P]AТР. После 20 мин. инкубации при 37оС отбирается аликвота для определения технологического выхода и хроматографией на пластинке PEI-целлюлозы в 0,5 М КН2РО4 определяется степень конверсии меченого фосфата в [-32(33)P]АТР (см. рис.15, стадия 1). Реакционная смесь прогревается 5 мин.

95оС для инактивации ферментов синтеза [-32(33)P]АТР. Если необходим [-32(33)P]AТР – следует стадия выделения продукта ВЭЖХ.

Для получения [-32(33)P] dNTP или [-32(33)P] NTP в реакционную смесь после охлаждения добавляется раствор 3’-(d)NMP и ПНК. После инкубации отбирается аликвота, и хроматографией на пластинке PEI-целлюлозы определяется технологический выход.

- 39 Pi dCMP 3’,5’dCDP Рис.15. Технологический контроль синтеза [-32P] dCTP Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе в 0,5 М KH2PO аликвот реакционной смеси на разных стадиях:

dCTP 1 – исходная 32Р-ортофосфорная кислота, 2 – синтез [-32P]ATP – стадия 1, 3 – синтез 3’,5’-[5’-32P] dCDP – стадия 2, 4 – синтез -[5’-32P] dCМP – стадия 3, ATP 5 – синтез [-32P] dCTP – стадия 1 2 3 На рис.15 (стадия 2) показан выход 3’,5’-[5’-32P]dCDP при синтезе [-32P] dСTP.

Затем следует стадия дефосфорилирования 3’-фосфатной группы, для чего в реакционную смесь добавляется уксусная кислота до рН=4,5-5,0 и нуклеаза S1 (P1) и после инкубации также отбирается аликвота для определения технологического выхода хроматографией в тех же условиях (см. рис.15, стадия 3).

К реакционной смеси, содержащей [5’-32P]dCMP, добавляется необходимое количество КОН до рН=7,7-8,0, универсальная смесь для фосфорилирования и ферменты:

пируваткиназа и СМР-киназа E.coli или dNMPk Т5. После инкубации отбирается аликвота для определения выхода [-32P] dСTP хроматографией в тех же условиях (см. рис. 15, стадия 4).

Таким образом, все стадии синтеза [-32(33)P] dNTP ([-32(33)P] NTP) проводятся в одном реакционном сосуде без выделения промежуточных продуктов. Постадийный технологический контроль осуществляется с помощью ТСХ на PEI-целлюлозе, визуализация хроматограмм проводится авторадиографически или с помощью фосфоиммиджера.

нуклеозид-5’-[-32(33)P] 8. Синтез модифицированых трифосфатов – терминаторов биосинтеза ДНК.

Для некоторых фундаментальных и прикладных исследований полезными инструментами оказались меченные радиоактивными изотопами фосфора терминаторы биосинтеза ДНК. Это модифицированные нуклеозид-5’-трифосфаты, в которых 3’ гидроксильная группа углеводного фрагмента замещена или отсутствует. Примеры таких модификаций нуклеозидной части представлены на схеме 5. Ферментативный синтез таких [5’-32(33)P]-нуклеотидов с помощью ПНК невозможен, поэтому их синтезируют - 40 химическим путем. Однако, дальнейшее ферментативное фосфорилирование до трифосфатного производного также существенно ограничено специфичностью нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli в отношении акцепторов фосфатной группы. Например, для АМР-киназы E.coli число субстратов с модифицированной нуклеозидной частью невелико (см. табл.1) и касается углеводной части акцептора фосфата. Модификации гетероциклического основания (или замена аденина на другое основание) делают нуклеотид недоступным для фосфорилирования этим ферментом. Важную роль в распознавании акцептора играет 2’-гидроксильная группа рибозного остатка – ее отсутствие или этерификация резко снижают сродство фермента к такому соединению.

Следует отметить, что аналогичные результаты были получены для СМР-киназы E.coli, с некоторыми соответствующими производными цитозиновых нуклеотидов.

Таблица 11. Специфичность АМР-киназы E.coli к акцепторам фосфатной группы.

Нуклеотид Активность, % 5’-AMP 5’-dAMP 2’,3’-dd-3’-NH2-5’-AMP 2’,3’-dd-3’-N3-5’-AMP 3’-d-3’-N3-5’-AMP 8-Br-5’-AMP 8-(CH2)6-NH2-5’-AMP 2’,3’-O-изопропилиден-5’-AMP 3’-O-Ac-5’-dAMP Иногда за счет изменения рН среды удается добиться приемлемого уровня фосфорилирования модифицированного нуклеотида (см. рис. 16). Тем не менее, в большинстве случаев NMPk E.coli не могут успешно использоваться для этих целей.

Расширить возможности ферментативного фосфорилирования модифицированных нуклеотидов позволяет использование dNMPk T5. Например, фосфорилирование 2’,3’ дидезоксицитидин-5’-монофосфата легко проводится с помощью dNMPk T5, в аналогичных условиях СМР-киназа E.coli такую реакцию не катализирует (см. рис. 17).

- 41 Активность, % от максимальной Рис. 16. Влияние рН на активность АМР-киназы E.coli.

1 – для субстратов AMP и dAMP 2 – для субстрата 2’,3’-дидезокси-3’-аминоаденозин-5’-фосфата Рис. 17. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе в [-32P]dCDP [-32P]d2CDP 0,5 М KH2PO4 аликвот реакционных смесей фосфорилирования dCMP и d2CMP:

1 – [-32P]ATP (контроль), 2 – фосфорилирование dCMP dNMPk T [-32P]ATP 3 – фосфорилирование d2CMP dNMPk T 4 – фосфорилирование d2CMP СМРk E.coli 5 – фосфорилирование dCMP СМРk E.coli 123 Следует отметить, что ферментативное фосфорилирование модифицированных NDP до соответствующих NTP, как правило, без осложнений осуществляется с помощью пируваткиназы и фосфоенолпирувата.

- 42 9. Синтез нуклеозид-5’-[-32P] (ди)трифосфатов.

Для биологических исследований иногда необходимы нуклеозид-5’-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора в -положение. Синтез таких соединений с помощью ферментов проводится по схеме 8.

NМРк_ 1. рN + *pppA *рpN + ppA 2. *рpN + РЕР РK_ р*ppN + Pyr схема 8.

Фактически, это реакции фосфорилирования нуклеотидов, как уже было представлено на схеме 7, только для фосфорилирования нуклеотида используется [ P]ATP. Однако, в синтезе [-32P] NTP или [-32P] NDP есть несколько отличий. Во первых, на стадии 1 нуклеотид используется в 7-10 кратном избытке по отношению к [ P]ATP, что обеспечивает увеличение выхода реакции. Во-вторых, стадии 1 и обязательно проводятся последовательно, т. к. необходимо, чтобы стадия 2 начиналась, когда [-32P]ATP уже израсходован. Пример синтеза [-32P] СTP представлен на рис. 18.

[-32P] CDP Рис. 16. Синтез [-32P] CTP.

Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе в 0, [-32P] CTP М КН2РО4 аликвот реакционной смеси на разных стадиях:

1 – исходный [-32P]ATP, [-32P]ATP 2 – фосфорилирование СМР до [-32P] CDP, 3 – фосфорилирование до [-32P] CTP.

1 2 Аналогичным образом были синтезированы [-32P] UTP и [-32P] ATP, используя соответствующие NMPk По этой схеме удалось синтезировать 2 E.coli.

метилтиоаденозин-5’-[-32P]-дифосфат. Оказалось, 2-метилтиоаденозин-5’-фосфат распознается АМР-киназой E.coli и хорошо фосфорилируется с помощью [-32P]ATP, образуя целевой продукт, который представлял интерес для исследований клеточных рецепторов.

- 43 10. Технологическая линия по получению нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

Технология получения нуклеозид-5’-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора была разделена на отдельные блоки (технологические участки), которые вместе обеспечивали работу всей технологической цепочки (см. схему 8).

1. Участок радиоактивного сырья. На участке нарабатывалась, хранилась, 32(33) расфасовывалась и передавалась для синтеза Р-ортофосфорная кислота.

Участок был оснащен оборудованием и устройствами для дистанционной безопасной работы с активностью до 10 Ки на рабочем месте: защитные камеры, боксы, манипуляторы, система спецвентилляции и спецканализации, трехзональная схема организации работ.

2. Участок ферментативной подготовки производства. Участок фактически является биохимической лабораторией, в которой нарабатывались, хранились, расфасовывались и готовились к синтезу все необходимые ферментные препараты и другие нерадиоактивные компоненты и реагенты для синтеза. Здесь же проверялись ферментативные активности всех коммерческих ферментативных препаратов, которые используются в работе (входной контроль ферментов).

3. Участок синтеза целевых соединений. На участке осуществлялся синтез меченых соединений, для чего он был оснащен необходимым оборудованием для дистанционной работы в защитном боксе.

4. Участок выделения (очистки) синтезированных соединений. На участке проводилась хроматографическая очистка синтезированных меченых соединений, поэтому участок непосредственно был связан с участком синтеза целевых соединений. Участок оснащался хроматографическим оборудованием для ВЭЖХ, а также оборудованием для защиты персонала.