Жирные кислоты морских организмов: таксономические и трофические маркеры

На правах рукописи

ЖУКОВА Наталья Владимировна

ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ:

ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ И ТРОФИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Владивосток 2009

2

Работа выполнена в Институте биологии моря Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Калинин В.И.

доктор биологических наук Санина Н.М.

доктор биологических наук Розенцвет О.А.

Ведущая организация: Институт биофизики СО РАН

Защита состоится « 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета »

Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН.

Факс: (4232)314050, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан 2009 г.

« »

Ученый секретарь диссертационного совета, д.х.н., с.н.с. С.А. Авилов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение липидов является актуальным направлением совре менной биохимии. Липиды обеспечивают жизнедеятельность клеток любой организации жи вого: от прокариот до многоклеточных эукариотических организмов. Липиды играют жиз ненно важную роль как источник энергии и как структурные компоненты клеточных мем бран (Bishop, 1976). Важной структурной и функциональной составляющей молекулы любо го класса липидов являются ЖК1.

Особый интерес представляют ЖК морских организмов, многие из которых богаты ПНЖК, которые необходимы для поддержания жидкостности клеточных мембран, они уча ствуют в адаптации организма к окружающей среде, являются эссенциальными факторами пищи животных и человека, обладают разнообразной биологической активностью. Большин ство беспозвоночных не способны синтезировать длинноцепочечные ПНЖК и получают их через диетарные источники, обеспечивая свои потребности в этих эссенциальных компонен тах для поддержания нормальной биохимической и физиологической функции (Watanabe et al, 1983). С такими представителями ПНЖК n-3, как эйкозапентаеновая и докозогексаеновая кислоты, связывают высокую биологическую активность морских липидов и их благотвор ное влияние на здоровье человека (Dyerberg, 1986;

Tapiero et al., 2002).

В результате многолетних исследований накоплен обширный материал по липидам и жирным кислотам морских беспозвоночных (Joseph, 1982;

Ackman, 1983;

Thiel et al., 2002).

Однако некоторые таксоны до сих пор слабо изучены, другие остаются без внимания. Рабо ты по исследованию биосинтеза жирных кислот и путей их метаболизма в морских беспо звоночных единичны (Moreno et al., 1979;

Morales Litchfield, 1977). Кроме этого, согласно современному методу идентификации бактерий, основанному на полифазной таксономии, оценка ФЛ и ЖК, отражающих филогенетические связи, как хемотаксономических характе ристик является важной задачей. Поэтому изучение ЖК различных групп морских организ мов до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено тем, что доста точно полно понять закономерности распределения ЖК можно лишь, располагая обширной информацией и заполнив пробелы в знаниях по липидной биохимии отдельных групп, уде лив особое внимание установлению структур молекул, путей биосинтеза и происхождения ЖК в морских организмах.

Сокращения, используемые в работе: ЖК – жирные кислоты, ФЛ – фосфолипиды, ГЛ – гликолипиды, СД – симбиотические динофлагелляты, ФАР – фотосинтетически-активная радиация, ТАГ – триацилглицерины, ПНЖК – полиненасыщенные ЖК, СДЖК – сверхдлин ноцепочечные ЖК, НМР – неметиленразделенные ЖК, СЖК – свободные жирные кислоты, ФЛЖК – жирные кислоты фосфолипидов, МЭЖК – метиловые эфиры ЖК.

Развитие современных методов анализа ЖК, таких как капиллярная ГЖХ и ГЖХ в со четании с масс-спектрометрией, дает широкие перспективы получения достоверной инфор мации, что поможет выявить ряд особенностей распределения и структур этих компонентов, а также сравнить с известными в литературе данными.

Современное направление в биохимии липидов – использование ЖК как биохимиче ских маркеров для решения важнейших вопросов трофической экологии, связанных с анали зом источников и путей трансформации органического вещества в морских экосистемах (Sargent et al., 1987;

Dalsgaard et al., 2003). Сложность трофических связей в морских экоси стемах привела к поиску новых эффективных методов исследования. Для детального изуче ния пищевых взаимоотношений между организмами может служить метод биохимических маркеров, в качестве которых используются ЖК. Этот подход основан на специфичности со става ЖК микроорганизмов и водорослей, которые служат пищей для животных, и на огра ниченной способности животных синтезировать ЖК, значительную часть которых животные получают из потребляемой пищи. Это позволяет рассматривать ЖК в качестве биохимиче ских маркеров как весьма эффективный и перспективный инструмент для определения пи щевого спектра и разнообразия источников пищи для морских организмов и для исследова ния пищевых цепей в морских экосистемах.

Для изучения трофических связей в морских экосистемах большое значение имеет знание особенностей состава ЖК микроводорослей и бактерий, которые являются первич ными источниками пищи для морских беспозвоночных, а также выявление специфических компонентов, которые могут служить биомаркерами в таких исследованиях. Поскольку све дения о ЖК микроорганизмов доступны для ограниченного числа видов, информация для большего числа видов весьма желательна и полезна для установления характерных особен ностей этих организмов.

Цель и задачи исследования. Цель работы – определение закономерностей распре деления, химической структуры и путей биосинтеза жирных кислот в морских организмах, а также оценка роли жирных кислот как биомаркеров в трофических исследованиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Исследовать состав липидов и жирных кислот морских организмов из различных таксо нов, включая бактерии, простейшие, водоросли и беспозвоночные, используя современ ные методы анализа.

• Определить влияние эндогенных и внешних факторов (среды) на состав и распределе ние липидов и жирных кислот в морских микроводорослях.

• Установить химическое строение ряда неидентифицированных и новых жирных кислот.

• Совершенствовать технику анализа меченных жирных кислот, которая позволит изу чать пути их биосинтеза.

• Определить способности ряда морских организмов синтезировать ЖК из меченых предшественников.

• Охарактеризовать состав жирных кислот морских беспозвоночных, имеющих симбио тические микроорганизмы.

• Исследовать состав жирных кислот ряда брюхоногих и двустворчатых моллюсков, усо ногих раков (баланусов) и полихет для определения их пищевых спектров и трофиче ских взаимоотношений в отдельных сообществах.

• Определить пищевые источники в экосистеме мелководной гидротемы б. Кратерной (о.

Янкич, Курильские острова), используя потенциал жирных кислот как биомаркеров.

Положения, выносимые на защиту:

Распределение жирных кислот в морских микроорганизмах – бактериях и микроводо 1.

рослях, отражает их систематическое положение. Жирные кислоты микроорганизмов имеют хемотаксономическое значение.

Гетеротрофные простейшие, составляющие первые звенья детритной пищевой цепи, 2.

способны продуцировать эссенциальные полиненасыщенные жирные кислоты и могут их источником в морских экосистемах.

Специфичность состава жирных кислот микроорганизмов позволяет оценить их вклад в 3.

симбиотические сообщества с морскими беспозвоночными.

Морские моллюски способны синтезировать неметиленразделенные жирные кислоты.

4.

Состав жирных кислот морских беспозвоночных хотя и зависит от собственных био 5.

синтетических способностей, но в значительной степени определяется характером по требленной пищи. Жирные кислоты беспозвоночных служат трофическими маркерами.

Научная новизна работы. Получены данные о распределение ЖК в липидах около 200 видов морских организмов, включая бактерии, простейшие, водоросли, а также предста вителей губок, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, ракообразных, полихет. Выявле ны закономерности распределения ЖК в морских организмах.

Установлена связь состава жирных кислот с систематическим положением бактерий и микроводорослей. Получены новые данные по составу ФЛ и ЖК для ряда таксонов бактерий, которые были использованы для идентификации 4 новых родов и 39 новых видов морских протеобактерий. Эти хемотаксономические характеристики позволяют идентифицировать бактерии на уровне рода, а в некоторых случаях до вида. Найдено, что состав ФЛ и ЖК бак терий является отражением филогенетического положения исследованных организмов, а в ряде случаев и экофизиологического разнообразия штаммов. Выявлены таксономические различия в составе ЖК микроводорослей на уровне отделов. Редкие кислоты, группы обыч ных кислот или соотношение кислот могут служить полезными биохимическими индикато рами микроводорослей в экологических исследования.

Изучено влияние ряда факторов (жизненный цикл и интенсивность освещения) на ли пиды и ЖК микроводорослей. Установлено, что, несмотря на вариабельность состава липид ных компонентов, черты, характерные для отдельных отделов, сохраняются.

На основе экспериментальных данных впервые показана способность простейших, составляющих первые звенья детритной пищевой цепи, продуцировать разнообразные эс сенциальных ПНЖК, включая арахидоновую, ЭПК и ДГК. Таким образом, доказано, что Protozoa наряду с микроводорослями являются источником ПНЖК в морских экосистемах.

Установлена структура ряда ЖК из водорослей, губок и моллюсков. Впервые описана нечетная кислота 21:27,15 в голожаберных моллюсках. Впервые доказана способность мол люсков синтезировать НМР ЖК de novo, установлены пути биосинтеза этих компонентов.

Установлено, что по составу ЖК беспозвоночных можно определить присутствие симбиотических микроорганизмов в тканях животных. Определены специфические ЖК мар керы, позволяющие идентифицировать различные группы симбиотических микроорганизмов (хемоавтотрофные бактерии, симбиотические динофлагелляты – зооксантеллы, зеленые мик роводоросли, цианобактерии) в клетках хозяина (моллюсков, кораллов и губок).

Экспериментально подтверждена способность ЖК передаваться по пищевым цепям и служить биомаркерами в трофических исследованиях. Определены пищевые источники для ряда морских бентосных беспозвоночных и трофические связи в сообществах и мелководной гидротермальной экосистеме.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные по распреде лению липидов и ЖК в различных видах бактерий, водорослей и беспозвоночных. Эти дан ные полезны для решения вопросов филогении, эволюции и экологии морских организмов. В виду сильного фенотипического сходства морских аэробных гетеротрофов, разработка пер спективных хемотаксономических маркеров, полезна для быстрой и точной идентификации, по крайней мере, на уровне рода для изолятов из окружающей среды, особенно, в экологиче ских исследованиях. Получены данные об эффективной продукции эссенциальных ЖК, та ких как ЭПК и АК, микроводорослями, простейшими и некоторыми видами бактерий, что открывает перспективы использования этих микроорганизмов как источника биологически активных веществ.

Разработка метода биохимических маркеров – жирных кислот может внести вклад в решение ряда проблем трофической экологии и понимание трофических структур морских экосистем. Получена важная характеристика пищевого спектра промыслового и культиви руемого моллюска приморского гребешка, обитающего на разных типах донных осадках.

Показано негативное влияние симбиотической полихеты на развитие моллюска. Эти данные могут быть полезны для марикультуры этого вида.

Разработанный метод анализа метиловых эфиров жирных кислот обеспечивает эф фективное разделение, высокую чувствительность и недеструктивное обнаружение, что по зволяет использовать метод для анализа меченых радиоактивными изотопами ЖК.

Апробация работы. Результаты работы были представлены автором на Всероссийском симпозиуме «Полиненасыщенные жирные кислоты и семейств: медико n-6 n- биологические, биохимические и биотехнологические аспекты» (Владивосток, 1995), меж дународных конференциях PICES (Владивосток, 1995, 1999, 2005гг.), международном сове щании International Workshop on the Global Change Studies in the Far East (Владивосток, 2002), международной конференции «Мосты науки между Северной Америкой и ДВ России. Про шлое, настоящее и будущее» (Владивосток, 2004), международной конференции Mollusks of the Northeastern Asia and Northern Pacific: biodiversity, ecology, biogeography and faunal history (Владивосток, 2004), третьей международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Влади восток, 2008), международной конференции Marine biodiversity and bioresources of the North Eastern Asia. (Чеджу, Ю. Корея, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 статьи в отечественных и меж дународных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры, пяти глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающе го 358 источников. Диссертация изложена на 274 стр. машинописного текста, содержит рисунка и 44 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Жирные кислоты морских организмов. Обзор литературы В обзоре литературы, состоящем из пяти разделов, обобщены литературные сведения о разнообразии и специфичности распределения ЖК в различных группах морских организ мов. Проанализированы имеющиеся в литературе данные. Обоснованы преимущества ЖК как биохимических маркеров в трофических исследованиях.

2. Материалы и методы исследования Бактерии содержатся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) в ТИБОХ ДВО РАН. Для анализа липидов штаммы выращивали при 28оС на морском агаре. После 48 часов роста клетки собирали для анализа. Микроводоросли содержатся в культуре в коллекции ИБМ ДВО РАН. Культуры для эксперимента выращивали при 20 ± 2оС в фильтрованной морской воде соленостью 32%о, обогащенной средой F (Guillard, Ryther, 1962) или средой Гольдберга. Животных собирали в заливах Петра Великого, у Курильских островов, у побе режья Вьетнама, с окаймляющего рифа о. Окинава и в о. Байкал. Сбор проводили на литора ли, водолазным способом, планктонной сетью и драгированием.

Липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол (Bligh, Dyer, 1959). Анализ ли пидов проводили методом высокоэффективной ТСХ (Беленький и др., 1984). Для разделения нейтральных липидов выполняли одномерную хроматографию, применяя смесь растворите лей: гексан–диэтиловый эфир–уксусная кислота, 80:20:1. Для разделения индивидуальных ФЛ использовали системы растворителей (Vaskovsky, Terekhova, 1979). В первом направле нии: хлороформ–метанол–бензол–28% NH4OH, 65:30:10:6, во втором направлении: хлоро форм–метанол–уксусная кислота–ацетон–бензол–вода, 70:30:4:5:10:1. Для обнаружения и идентификации липидов использовали неспецифические и специфические реагенты (Kates, 1986). Количество ФЛ определяли по содержанию фосфора (Vaskovsky et al., 1975).

Метиловые эфиры жирных кислот получали по методу Carreau, Dubacq (1978). МЭЖК бактерий обычно получали кислотным метанолизом (5%HCl/MeOH, 80о 3 ч). Перед анализом очистку метиловых эфиров проводили ТСХ в бензоле. МЭЖК анализировали ГЖХ на на бивных колонках (фазы DEGS, FFAP и Silar 5CP на Chromaton N, длина 2-5 м) и капилляр ных кварцевых колонках с иммобилизованными фазами Carbowax 20M, OV-101, а также на готовых колонках Supelcowax 10 и SPB-5 длина 25-30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, тем пература 200-220оС. В работе использовали хроматографы Shimadzu-GC5A, Shimadzu-GC9A и Shimadzu-GC14A. ЖК идентифицировали сравнением времен удерживания со стандартами и по рассчитанным значениям эквивалентной длине цепи. Дополнительно для идентифика ции ЖК проводили разделение МЭЖК по степени ненасыщенности на ТСХ, пропитанных AgNO3, и каталитическое гидрирование над PtO2. Физико-химические исследовании прово дили на оборудовании ТИБОХ РАН. Для доказательства структуры ЖК использовали хими ческие методы (озонолиз, частичное восстановление двойных связей гидразином) и ГЖХ МС анализ МЭЖК или их пирролидиновых производных. ГЖХ-МС анализ проводили на приборе Shimadzu QP-5050A, снабженном капиллярной кварцевой колонкой (0.25 мм 30 м) с фазой MDN-5S или Supelcowax 10. Газ-носитель – гелий. Энергия ионизации 70 eV.

Величины среднего квадратического отклонения (SD) использовали как показатель вариации величин средней. Для обнаружения различий между средними использовали кри терий Стьюдента (t-test) или дисперсионный анализ (ANOVA). Различия считали статистиче ски значимыми при Р 0.05. Для оценки степени сопряженности (связи) между признаками (величинами) использовали корреляционный анализ.

3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА МЕЧЕНЫХ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ДВУМЕРНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ При изучении метаболизма жирных кислот морских беспозвоночных встала задача – анализировать индивидуальные ЖК с низкой радиоактивностью. Обычно это делают с по мощью ГЖХ с последующим сцинтилляционным счетом собранных фракций, или используя специальные радиоактивные детекторы. Оба метода не лишены недостатков.

Основываясь на методе высокоэффективной ТСХ с прочно закрепленным слоем сор бента (Беленький и др., 1984), нами была предложена техника анализа меченых ЖК, которая представляет собой двумерную ТСХ на силикагеле, импрегнированном нитратом серебра в первом направлении и обратно-фазовую хроматографию во втором направлении. Использо вание пластинок с прочно закрепленным слоем сорбента позволяет погружать пластинки в различные водные реагенты без разрушения слоя. Это свойство позволило отмывать их рас твором тиосульфата натрия после ТСХ на силикагеле, пропитанном AgNO3, для того, чтобы удалить нитрат серебра, который мешал бы последующей процедуре разделения МЭЖК по длине цепи обратно-фазовой хроматографией во втором направлении. Декан, которым про питывались пластинки для обратно-фазовой хроматографии, легко удалялся с пластинки струей теплого воздуха, что позволяло исследовать разделенные вещества любыми физико химическими методами. В ряде экспериментов было показано, что степень пропитки нитра том серебра при используемых условиях составляла 8%, а деканом – 10-12%.

На рис. 1 показаны результаты разделения МЭЖХ из общих липидов печени крысы ТСХ и ГЖХ. Число пятен на тонкослойной хроматограмме соответствует числу пиков на га зовой хроматограмме. Это доказывает высокую эффективность разделения смеси разрабо танным методом двумерной ТСХ.

Таблица 1. Действие времени отмывки тонкослойных пластинок на сохранение мече ных метиловых эфиров жирных кислот на ТСХ Время отмывки (мин) Радиоактивность (cpm) Сохранность (%) Тиосульфатом Водой Нанесено на ТСХ После процедуры 0.5 3 15 737 15 637 99. 1.0 5 77 055 70 058 90. 2.0 10 19 517 16 774 85. Эксперименты с индивидуальными мечеными МЭЖК (16:0, 18:0 и 18:1) и смесью, полученной после введения 1-14С-ацетата в эмбрионы морского ежа, показали, что сохраня ется более 90% радиоактивности (табл. 1). Разработанная нами процедура отличается высо кой чувствительностью (для анализа требуется 50-100 мкг смеси МЭЖК), она позволяет не деструктивное обнаружение, а также относительно проста и дешева. При этом разрешающая способность ТСХ близка к разрешению при ГЖХ на набивных колонках.

Б А Рис. 1. (А.) Двумерная ТСХ МЭЖК липидов печени крысы (100 мкг): первое направ ление – хроматография на силикагеле, пропитанном AgNO3, второе направление – обратно фазовая хроматография. Обнаружение 10% H2SO4 в метаноле с последующим нагреванием 180оС. (Б.) ГЖХ МЭЖК липидов печени крысы. Обозначения 1 – 16:0, 2 – 16:1, 3 – 18:0, 4 – 18:1, 5 – 18:2n-6, 6 – 18:3n-3, 7 – 20:3n-6, 8 – 20:4n-6, 9 – 22:4n-6, 10 – 22:5n-6, 11 – 22:5n-3, – 22:6n-3.

4. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ В настоящей главе представлены результаты многолетних исследований по изучению состава ЖК в липидах около 200 видов морских организмов, включая бактерии, простейшие, водоросли (микро- и макро-), а также представителей губок, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, ракообразных, полихет.

4.1. Фосфолипиды и жирные кислоты бактерий В этой главе приведены результаты исследования ФЛ и ЖК морских бактерий как важных хемотаксономических показателей, являющихся составной частью полифазной так сономии бактерий. Эти работы выполнены мною в ходе совместных исследований по иден тификации новых таксонов бактерий с сотрудниками Лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН Е.П. Ивановой, О.И. Недашковской и Л.И. Романенко.

Поскольку описание новых организмов вместе с филогенетическим доказательством обязательно должна подтверждаться рядом фенотипических свойств, необходимых для диф ференциации видов и родов, оценка хемотаксономических характеристик, отражающих фи логенетические связи, является важной задачей. Разработка перспективных хемотаксономи ческих маркеров полезна для быстрой и точной идентификации морских бактерий, по край ней мере, на уровне рода для изолятов из окружающей среды, особенно, в экологических ис следованиях.

4.1.1 Alteromonas-подобные бактерии Для того чтобы оценить значение ЖК и ФЛ для дифференциации группы бактерий, родственных Alteromonas, был проанализирован состав ЖК и ФЛ всех видов родов Alteromonas, Pseudoalteromonas Marinomonas, Glaciecola и Idiomarina, выделенных из мор ской воды, водорослей, морских беспозвоночных в Лаборатории микробиологии ТИБОХ ФЛ составляли от 55до 85% от общих липидов. ТСХ анализ показал, что ФЭ и ФГ бы ли главными ФЛ всех культур этой группы. Соотношение классов ФЛ имело характерное для родов распределение (рис. 2).

Pseudoalteromonas Glaciecola mesophila Alteromonas macleodii haloplanktotis 71, 69, 37, 60, 23, 23, 2, 2,8 2, 3,7 3, ФЭ ФГ бис-ФК ЛФЭ ФЭ ФГ бис-ФК ЛФЭ ФЭ ФГ бис-ФК ДФГ Рис. 2. Состав фосфолипидов различных видов альтеромонад Доминирующими кислотами этой группы бактерий были 16:1n-7, 16:0, 17:1n-8 и 18:1n-7, тогда как 14:0, 15:0, 15:1n-8 и 17:0 относились к минорным компонентам. Основыва ясь на полученных результатах, установлено, что для Idiomarina характерен высокий уровень iso-15:0, для Glaciecola – 16:1n-7, для Marinomonas – 18:1n-7. Эти компоненты могут Рис. 3. Дендрограмма сходства жирных кислот Alteromonas-подобных видов.

считаться специфическим маркерами для этих родов. Продолжая оценку ЖК как таксономи ческих показателей, мы оценили состав описанных видов Alteromonas и Pseudoalteromonas.

Хотя профили ЖК представителей этих родов показали высокую степень сходства, соотно шения некоторых компонентов вполне различались для каждого рода, что позволило разде лить штаммы каждого рода в отдельные кластеры (рис. 3.). Таким образом, для дифферен циации бактерий родственных Alteromonas (Pseudoalteromonas, Alteromonas, Marinomonas, Glaciecola и Idiomarina) успешно использован состав ЖК и ФЛ бактерий. Полученные дан ные подтверждают, что ЖК являются ценными хемотаксономическими маркерами для диф ференциации филогенетически сходных родов, которые нельзя разделить на основании фе нотипических данных.

4.1.2. Бактерий рода Shewanella Род Shewanella включает группу грамотрицательных, аэробных и факультативно ана эробных, гаммапротеобактерий, адаптированных как к умеренным, так и низким температу рам, высокому давлению и глубоководной среде. Существуют определенные трудности при идентификации штаммов Shewanella, выделяемых из природной среды, что связано с высо кой степенью сходства фенотипических признаков с другими морскими гаммапротеобакте Таблица 2. Состав главных клеточных жирных кислот бактерий видов Shewanella (в % от суммы кислот). n – число проанализированных штаммов.

S. colwelliana S. japonica S. waksmanii S. fidelis S. pacifica S. affinis n=4 n=7 n=2 n=2 n=6 n= 12:0 1.9 1.7 2.0 1. iso-13:0 6.7 8.1 10.0 10.7 9.3 6. 14:0 1.3 3.1 1.7 2. iso-15:0 25.0 33.0 32.5 22.3 34.0 20. aiso-15:0 0.5 1.9 0. 15:0 6.8 3.7 5.3 8.7 6. 15:1n-6 2.3 0.2 1. 16:0 7.9 8.8 6.2 12.9 8.9 6. 16:1n-7 21.5 14.5 9.8 20.0 14.8 21. iso-17:0 1.9 1.9 0. 17:0 2.8 0.7 1. 17:1n-8 14.7 5.0 - 6.3 14. 18:0 0.3 0.5 0.3 0. 18:1n-7 2.5 3.2 2.0 5. 20:5n-3 1.1 4.9 6.7 – 5.3 2. риями. Для выявления надежных хемотаксономических показателей этого рода был опреде лен состав ЖК различных штаммов Shewanella, выделенных из ряда видов беспозвоночных (офиуры, сипункулиды, голотурий), а также морской воды и донных осадков Северо западной Пацифики (Японское море и Курильские острова).

Главные характерные черты ЖК профилей проанализированных штаммов (табл. 2) сходны с тем, что известно для других видов Shewanella (Russel, Nichols, 1999). Во всех изу ченных штаммах кислоты iso-13:0, iso-15:0, 15:0, 16:0, 16:1n-7 и 17:1n-8 были главными ком понентами, и уровень разветвленных ЖК достигал 54% от суммы кислот. ЭПК 20:5n-3 иден тифицирована во всех изолятах, за исключением S. fidelis, и составляла от 1.1 до 6.7% от суммы. Несмотря на вариабельность состава ЖК между исследованными видами Shewanella, специфические особенности рода сохраняются. Показано, что кластерный анализ, основан ный на составе клеточных ЖК, может быть полезным дополнительным инструментом для дифференциации родов. Однако, этот метод неэффективен для разделения видов родов как Shewanella так и Pseudoalteromonas.

4.1.3. Бактерии типа Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides Бактерии типа Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), являющиеся одним из доминирующих компонентов микробных сообществ морских экосистем и освоившие разно образные экологические ниши, часто перекрываются фенотипически с членами других ти пов. В результате исследования разнообразных штаммов флавобактерий нами оценена важ ность хемотаксономической информации, полученной в результате анализа ФЛ и ЖК. Полу чены новые данные, часть из которых легла в основу описания хемотаксономических харак Таблица 3. Состав жирных кислот новых описанных видов флавобактерий Жирные Mesonia Formosa Salegentibacter Algibacter кислоты lectus algae mobilis algae agariphila flavus holothuriorum i-15:1 36.7 38.3 9.9 6.5 5.4 18.2 13. ai-15:0 11.4 4.0 4.7 3.4 11.1 7. i-15:0 9.8 9.7 17.1 12.7 5.4 26.3 12. 15:0 6.0 7.6 15.5 8.7 8.6 9.6 13. 15:1n-6 2.9 2.3 8.5 6.0 2.9 10. i-16:0 3.4 1.0 1.1 2.1 7. ai-16:1 1.0 0.6 2.5 3. 16:0 0.9 2.2 1.1 1.6 5. 16:1n-7 3.6 8.1 3.3 4.0 7.5 10. i-17:1 6.5 6.2 1.3 1.4 1.8 8. 17:1n-6 2.9 3.6 4.7 3.2 4. i-15:0 2OH 2.9 8.3 3.0 11.8 3.6 7. ai-15:0 2OH 3. i-15:0 3OH 6.7 7.7 1.0 9. i-16:0 2OH 1.0 0.7 4. i-16:0 3OH 1.4 0.5 4.0 8.9 6. i-17:0 3OH 3.7 2.3 9.6 8.5 3.2 9. ai-17:0 3OH 1.0 4. 15:0 2OH 1.5 1. 15:0 3OH 2.3 2. 16:0 3OH 2. 17:0 2OH 1. теристик трех новых родов: Mesonia (Nedashkovskaya et al., 2003), Formosa (Ivanova et al., 2004) и Algibacter (Nedashkovskaya et al., 2004), а также семи новых видов.

Профили ЖК новых описанных видов имеют специфические черты семейства Flavobacteriacea, т.е. комбинацию разветвленных (iso- и anteiso-) кислот, составляющих 50 70% от суммы кислот, а также значительную концентрацию разнообразных гидрокси 2ОН и 3ОН жирных кислот (табл. 3). Обнаружены существенные различия в распределении отдель ных компонентов между родами. Наличие единственного фосфолипида ФЭ специфично для флавобактерий. Таким образом, новые изоляты содержали высокие пропорции разветвлен ных насыщенных и моноеновых клеточных ЖК, которые, как и наличие гидрокси кислот, аминосодержащих липидов и единственного среди фосфолипидов ФЭ, специфичны для фла вобактерий и отличались гетерогенностью состава ЖК между родами.

4.1.4. Вибрионы, аэромонады Состав ФЛ и клеточных ЖК как хемотаксономических маркеров был использован для выявления различий между родами и видами вибрионов Aeromonas и Vibrio, выделеных из водохранилища. Состав ФЛ изученных бактерий обоих родов был сходен, среди них глав ными были ФЭ, ФГ, ДФГ. Хотя не существовало дифференциации по составу ФЛ между ро дами, этот анализ полезен в качестве дополнительной хемотаксономической характеристики.

Анализ клеточных ЖК видов Aeromonas и Vibrio изолятов позволил дифференциро вать роды и виды. Некоторая видоспецифичность наблюдалась, как по соотношению этих главных компонентов – 16:0, 16:1n-7 и 18:1n-7, так и по распределению минорных кислот. В результате кластерного анализа данных по ЖК в изученных штаммах Aeromonas и Vibrio сформировалось несколько кластеров на Эвклидовом расстоянии 10-15, что доказывает их связь на уровне родов и видов (Sasser, 1997). Таким образом, ФЛ и профили ЖК представля ют полезную информацию, эффективную для таксономии этих бактерий, а также для эколо гического мониторинга Aeromonas и Vibrio.

Сходные хемотаксономические особенности были обнаружены у нового описанного рода и вида Oceanisphaera litoralis, выделенного из донных песчаных осадков (Romanenko et al, 2003). ФЛ представлены ФЭ и ФГ. Главные ЖК – 16:0, 16:1n-7 и 18:1n-7 (в сумме почти 90%). Филогенетический анализ показал высокую степень сходства с членами семейств Vibrionaceae и Aeromonadaceae.

Полученные данные значительно расширили знания о биохимическом разнообразии бактерий и подтвердили представление, о том, что ЖК отражают внутривидовое сходство и являются ценными таксономическими маркерами для дифференциации филогенетически сходных родов.

4.2. Липиды и жирные кислоты микроводорослей 4.2.1. Планктонные микроводоросли Микроводоросли являются главным поставщиком органического вещества и энергии в морских экосистемах, источником эссенциальных ПНЖК и пищей для морских животных, определяя их функционирование и жизнеспособность. В результате детального исследования состава ЖК 15 видов планктонных микроводорослей (рис. 4), культивированных в одинако вых условиях, относящихся к отделам Chlorophyceae (виды 1-4), Prasinophyceae (5, 6), Bacillariophyceae (7-10), Prymnesiophyceae (11), Dinophyceae (12), Eustigmatophyceae (13), Cryptophyceae (14) и Rhodophyceae (15), культивированных в одинаковых условиях было найдено, что каждый отдел микроводорослей характеризовался специфическим профилем ЖК. Показано, что необычные или некоторые обычные ЖК или соотношение кислот явля ются полезными хемотаксономическими маркерами отделов микроводорослей.

C16ПНЖК n-3, n-6 14: % от суммы жирных кислот % от суммы жирных кислот C16ПНЖК n-4, n- 20:5n- 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 12345 6 7 8 9 10 11 12 13 14 % от суммы жирных кислот C18 ПНЖК 20:4n- % от суммы жирных кислот 16:1n- 22:6n- 123456 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Виды микроводорослей Виды микроводорослей Рис. 4. Распределение маркерных жирных кислот в различных отделах микроводорос лей (в % от суммы всех кислот).

Характерной чертой Chlorophyceae являлась высокая концентрация С16 ПНЖК, 16:2n-6, 16:3n-3 и 16:4n-3, а также С18 ПНЖК, 18:2n-6 и 18:3n-3. Ни один вид не содержал 22:6n-3, а 20:5n-3 найдена в следовых количествах. В представителях Prasinophyceae главны ми были 16:4n-3, 18:3n-3 и 18:4n-3. Кислота 20:5n-3 присутствовала в заметных количествах.

Кроме того, зеленые водоросли характеризовались повышенной концентрацией 16:1n- trans, специфичной для липидов, участвующих в фотосинтезе. Индикаторами диатомовых водорослей Bacillariophyceae служит высокая концентрация 16:1n-7 и превалирование 16:1n 7 над 16:0, высокий уровень 20:5n-3 и 14:0, а также незначительная концентрация С18 кислот и 22:6n-3. К дополнительным маркерам диатомей относятся 16:2n-4, 16:3n-4 и 16:4n-1, доля которых очень велика по сравнению с другими водорослями. Prymnesiophyceae подобно диа томовым, содержат 14:0, 16:0, 16:1n-7 и 20:5n-3, как главные компоненты, но отличительной чертой является высокое содержание 18:4n-3 и присутствие 22:6n-3. Главными индикатора ми фотосинтетичеких динофлагеллят Dinophyceae служит необычная 18:5n-3, высокое со держание 22:6n-3, редкой среди микроводорослей, а также С18 ПНЖК. Высокая концентра ция 16:0, 16:1n-7 и 20:5n-3 при незначительном вкладе других компонентов могут считаться хемотаксономическими индикаторами отдела Eustigmatophyceae. Cryptophyceae богаты 16:0, C18 ПНЖК и 20:5n-3, при этом содержат едва заметные количества 18:0 и C16 ПНЖК.

Rhodophyceae имели характерный профиль ЖК, с доминирующими 16:0, 20:4n-6 и 20:5n-3. К их отличительной особенности относится высокое содержание 20:4n-6.

В заключении, выявлены таксономические различия в составе ЖК отделов микроводо рослей. Редкие кислоты или группы обычных кислот могут служить полезными биохимиче скими индикаторами отдельных отделов.

4.2.2. Биохимический подход к оценке разнообразия симбиотических динофлагеллят В герматипных кораллах с окаймляющего рифа о. Сесоко (Окинава, Япония) были обнаружены три типа симбиотических динофлагеллят (СД), названных L, B и G, различаю щихся по своим морфологическим и физиологическим характеристикам (Titlyanov et al., 2001). Колонии гидрокоралла Millepora intricata содержали симбионтов типа L, склеракти ниевые кораллы содержали тип B в Pocillopora damicornis, тип G в Seriatopora caliendrum и Seriatopora hystrix, а в Stylophora pistillata были обнаружены оба типа B и G. Различные типы СД различаются размерами клеток, формой и структурными элементами, максимальными скоростями клеточного деления и деградации клеток, первичной продукцией, по фотосинте тическим способностям и способностям аккумулировать пигменты. Учитывая связь ЖК со става микроводорослей с их систематическим положением, мы предположили, что анализ этих компонентов может прояснить вопрос о таксономической принадлежности типов СД.

Исследованные типы СД в целом обнаруживают черты, специфические для фотосин тетических динофлагеллят: присутствие высоких концентраций 18:4n-3, 18:5n-3, 22:6n-3 и 20:5n-3, причем 18:5n-3 и 22:6n-3 – кислоты редкие для других отделов микроводорослей. В тоже время распределение ЖК среди исследованных типов СД достаточно различается, что бы отличить один тип от другого.

Главная особенность состава ЖК полярных липидов СД из M. intricata – практически полное отсутствие кислот 20:4n-6 и 20:5n-3, которые являются доминирующими в других типах СД. Принципиальным отличием СД типа L от других типов является высокая концен трация 18:5n-3 в полярных липидах, а также 22:5n-6 (10% от суммы кислот), которая отсут ствует в других типах СД. Таким образом, сочетание высоких пропорций 18:4n-3, 18:5n-3, 22:5n-6 и 22:6n-3 со следовыми количествами 20:4n-6 и 20:5n-3 в СД типа L из M. intricata является уникальным. Профили жирных кислот СД типов B и G довольно сходны, главное различие состоит в уровне 18:4n-3 и 22:6n-3. Тип B имеет высокое содержание 18:4n-3 и низ кое 22:6n-3. Тип G имеет обратную пропорцию этих кислот.

Анализ ЖК показал принципиальные различия между типом L, выделенным из M. in tricata и типами B и G, найденными в склерактиниевых кораллах. Существенные различия были также обнаружены между типами B и G. Более того, эти различия были найдены как в полярных липидах, структурных компонентах клеточных мембран, так и запасных липидах клетки – ТАГ. Известно, что вариации состава ЖК микроводорослей определяет геном орга низма. Можно предположить, что различия в ЖК составе между морфофизиологическими типами СД являются отражением генетических различий этих типов. Анализ ЖК служит по лезным инструментом для определения таксономических различий между симбиотическими динофлагеллятами беспозвоночных.

4.2.3. Влияние условий среды на липиды и жирные кислоты микроводорослей Состав липидов фототрофных организмов может меняться под влиянием факторов окружающей среды и в зависимости от физиологических характеристик, таких как стадии жизненного цикла.

4.2.3.1. Изменение состава липидов и жирных кислот в течение жизненного цикла диа томовых водорослей Некоторые диатомовые водоросли в неблагоприятные периоды оседают на дно, обра зуя покоящиеся клетки и споры. Считается, что образование покоящихся стадий является стратегией выживания микроводорослей при неблагоприятных условиях окружающей среды и, следовательно, для поддержания популяции диатомовых в морских экосистемах. Молеку лярные механизмы происходящих адаптационных процессов практически не исследованы. В связи с этим, исследованы вегетативные клетки и клетки в покоящейся стадии диатомовых Chaetoceros salsugineus и Thalassiosira pseudonana. с целью определения роли липидов в эко логии и физиологии этих организмов.

Результаты исследования показали, что в течение жизненного цикла диатомей проис ходят заметные биохимические изменения. Соотношение классов липидов и их ЖК профили меняются в зависимости от жизненных форм. Количество полярных липидов, включающих ФЛ и ГЛ, являющихся структурными компонентами клеточных мембран и мембран тила коидов, быстро увеличивается в период образования покоящихся клеток (рис. 5).

Рис. 5. Изменение состава липидов Рис. 6. Изменение относительного содер Thalassiosira pseudonana в течение жиз- жания жирных кислот в полярных липидах ненного цикла. 1 – полярные липиды, 2 – Thalassiosira pseudonana в течение жиз триацилглицерины, 3 – стерины, 4 – сво- ненного цикла. 1 – 20:5n-3, 2 – 16:3n-4, 3 – бодные жирные кислоты, 5 – углеводоро- 16:0, 4 – сумма 18:0 и 18:1n-9.

ды.

В полярных липидах главными были ПНЖК 16:3n-4 и 20:5n-3, составляющие до 59% от суммы ЖК и достигающие максимума в период образования покоящихся клеток (рис. 6).

Таким образом, изменения, наблюдаемые в липидном составе микроводорослей, яв ляются результатом активных биохимических процессов, происходящих при формировании покоящихся клеток. В клетках покоящихся стадий аккумулируются структурные компонен ты фотосинтетических и клеточных мембран, что, вероятно, обеспечивается быстрый рост клеток и массовое развитие вида при возникновении благоприятных условий в природной среде.

4.2.3.2. Влияние света на состав жирных кислот симбиотических динофлагеллят Свет является наиболее важным фактором в жизненных процессах фототрофных ор ганизмов. Биосинтез органического вещества симбиотическими динофлагеллятами (СД) яв ляется жизненно важным процессом в кораллах, а свет – наиболее важным фактором в эко логии коралловых рифов, поскольку липиды, синтезированные и аккумулированные фотоав тотрофными симбионтами, служат важнейшим источником энергии и клеточного материала для животного-хозяина.

Рис. 7. Содержание главных полиненасыщенных жирных кислот и хлорофилла a в симбиотических динофлагеллятах при различном уровне освещения (% от ФАР). Средние значения ± стандартное отклонение, n=3.

Впервые исследован состав ЖК симбиотических динофлагеллят из склерактиниевых кораллов Pocillopora damicornis, Seriatopora caliendrum, Seriatopora hystrix, Stylophora pistillata, Echinopora lamellosa, и из гидрокоралла Millepora intricata, адаптированных к раз личному уровню света: 95%, 30%, 8% и 2% ФАР. Полярные липиды и ТАГ существенно раз личались по составу ЖК. Полярные липиды были богаты ПНЖК, а ТАГ – насыщенными ЖК. Свет оказывал существенное влияние на состав ЖК как полярных липидов, так и ТАГ.

Повышение уровня света вызывало увеличение содержания 16:0 в обеих группах липидов и 16:1n-7 – в ТАГ. Очевидно, на ярком свету происходит активный синтез 16:0 de novo, обес печивая утилизацию излишков энергии для энергетически затратных процессов. При умень шении интенсивности света в полярных липидах уровень 22:6n-3 и 20:4n-6 снижался, тогда как происходило увеличение концентрации 18:4n-3 и 20:5n-3, которое сопровождалось по вышением содержания хлорофилла a в клетках зооксантелл, (рис. 7). Хотя относительное содержание индивидуальных ЖК существенно варьировало при изменении света, в целом баланс между насыщенными и ПНЖК менялся незначительно. Это доказывает, что роль фо тоадаптации не сводится к изменению жидкостности клеточных мембран. Вызванные светом изменения в составе жирных кислот отражают взаимосвязь фотосинтетических процессов и биосинтеза ЖК.

В целом, обнаружено, что, не смотря на заметные изменения в составе ЖК микроводо рослей, характерные черты исследованных таксонов, сохраняются.

4.3. Биосинтез жирных кислот в простейших В морских экосистемах первичными продуцентами ПНЖК n-3 и n-6 серий являются микро- и макроводоросли, эти эссенциальные компоненты передаются далее по пищевой це пи животным. Таким образом, морские животные, неспособные синтезировать эти компо ненты, получают эссенциальные ЖК необходимые для их нормальной жизнедеятельности.

Альтернативой пастбищной пищевой цепи в морских экосистемах является детритная пище вая цепь, когда органическое вещество включается в пищевую цепь только после превраще ния ее в бактериальную биомассу. Отсутствие ПНЖК в бактериях приводит к потере этих важных компонентов в первых звеньях этой пищевой цепи. Следующие за бактериями зве нья составляют морские простейшие – бесцветные жгутиконосцы и инфузории. Существова ла неопределенность относительно судьбы этих эссенциальных компонентов в детритной пищевой цепи, поскольку данные о содержании ПНЖК в морских простейших отсутствова ли. Мы предположили, что представители Protista способны синтезировать ПНЖК. Для про верки этой гипотезы были исследованы ЖК простейших, выращенных на питательных сре дах (рис или крахмал) и включение меченого ацетата (рис.8). Состав ЖК жгутиконосцев Bodo sp. и инфузорий Euplotes crassus варьировал в зависимости от субстрата, но во всех экспериментах они содержали ПНЖК. Главными ЖК в инфузориях E. crassus, кормлен B A радиоактивности % от общей радиоактивности % от общей 20 Euplotes Euplotes sat 14: 16: 18: Bodo Bodo 20: PL 18: FFA 20: TAG 22: SE Рис. 8. Распределение радиоактивности из 1-14С ацетата по классам липидов (А) и (В) C Удельная радиоактивность жирным кислотам простейших, культиви рованных на рисе. Общая радиоактивность равна 100%. (С) Удельная радиоактив ность жирных кислот простейших. Обо значения: PL полярные липиды, FFA сво бодные жирные кислоты, TAG триацилг Euplotes лицериды, ES эфиры стеринов.

sat 14: 16: 18: Bodo 20: 18: 20: 22: ных бактериями, выращенными на рисе, были насыщенные и моноеновые кислоты, доля ПНЖК составляла 17.4%, среди них найдены 20:4n-6 (4.8%) и 20:5n-3 (2.3%). Продукция ПНЖК в жгутиконосцах Bodo sp.на рисовой культуре составляла в сумме 5.9%, а на крахма ле была выше (10.7%) за счет вклада 22:6n-3 (5.8%).

Опыты по включению 1-14C показали, что меченый ацетат наиболее активно включал ся в ФЛ обоих простейших (рис. 8А). Они были способны синтезировать ПНЖК (рис. 8B), и особенно высокой была скорость синтеза 22:6n-3 в Bodo sp. (рис. 8C). Несмотря на то, что скорость синтеза ПНЖК в инфузориях была ниже, чем в жгутиконосцах, присутствие эссен циальных ЖК в инфузориях значительной степени обогащает биохимический состав детрит ной пищевой цепи. Таким образом, установлено, что бесцветные жгутиконосцы и инфузо рии, составляющие первые звенья детритной пищевой цепи следом за бактериями, содержат ПНЖК и обладают способностью синтезировать эти эссенциальные компоненты. Это дока зывает, что простейшие могут быть источником эссециальных ПНЖК в морских экосисте мах.

4.4. Жирные кислоты макрофитов. Особенности состава жирных кислот бурой водоросли Sargassum pallidum Наиболее заметной особенностью состава ЖК S. pallidum является присутствие ком понента, который был предварительно идентифицирован как дигомо--линоленовая кислота.

Разделение МЭЖК S. pallidum по ненасыщенности ТСХ, импрегнированной AgNO3, показа ло, что эта кислота концентрируется в зоне триеновых МЭЖК. Каталитическое гидрирова ние дало n-эйкозеновую кислоту (20:0). Масс-спектрометрия МЭЖК показала [М]+ m/z 320, который соответствует метилэйкозатриеноату. УФ спектр исключил присутствие конъюги рованных связей, и на ИК спектре отсутствовали полосы поглощения, характерные для trans этиленной (960-980 см-1) и ацетиленной (2150 см-1) связей. Положения двойных связей, бли жайших к эфирной связи и к метильному концу, были определены окислительным озоноли зом с последующей ГЖХ продуктов, которые показали два пика на ГЖХ – ДМС8 и ММС6.

Доказательство структуры получено из результатов масс спектрометрии пирролидиновых производных. Структура кислоты, выделенной из Sargassum pallidum, была 20:38,11,14.

Образцы S. pallidum, собранные в разные сезоны в течение трех лет в различных бух тах залива Петра Великого Японского моря, имели сходный состав ЖК. Содержание 20:3n- в образцах варьировало от 12.8 до 17.7% от суммы кислот, и не было связано ни с сезоном, ни с местом сбора. Еще одна особенность этой водоросли состояла в доминировании n-6 над кислотами n-3 серии. Можно предположить, что высокое содержание 20:3n-6 является хемо таксономическим маркером S. pallidum. Эта кислота привлекает внимание как биологически активное вещество, поэтому высокое содержание этого компонента в распространенной мор ской водоросли может представлять как научный, так и практический интерес.

4.5. Жирные кислоты губок Жирные кислоты губок привлекают пристальное внимание биохимиков с точки зре ния уникальности компонентов, многообразия их структур, биогенеза и роли в организме. Из трех классов типа Porifera класс Hexactinellida (Стеклянные губки) мало изучен. Исследован ный вид глубоководной морской стеклянной губки Pheronema raphanus проявил черты, ха рактерные для класса Hexactinellida. К ним можно отнести высокую пропорцию СДЖК, сре ди которых главные изомеры 30:35,9,21 и 30:35,9,23 (более 55% от суммы ЖК), низкую концентрацию разветвленных ЖК (2.8%) и отсутствие типичных морских кислот n-3 серии – как ЭПК и ДГК, результат отсутствия планктонных микроводорослей в пище этого глубоко водного вида. Присутствие в СДЖК специфичной группировки двойных связей 5,9 указы вает на сходство механизмов биосинтеза этих кислот в разных классах губок. Низкая доля разветвленных кислот в P. raphanus, как и в других стеклянных губках может служить пока зателем ассоциированных микроорганизмов, отличных от бактерий, ассоциированных с ви дами класса Demospongiae.

4.6. Жирные кислоты моллюсков Моллюски представляют второй по числу видов тип животных, большинство из кото рых являются морскими видами. Пионерские исследования ЖК моллюсков, выполнены в начале 70-х. Биохимия липидов многих моллюсков хорошо изучена, но остаются еще нере шенные вопросы. Целью проделанной работы было восполнить пробел в знаниях по липид ной биохимии моллюсков.

4.6.1. Распределение неметиленразделенных жирных кислот К таким явным пробелам относились вопросы, связанные с НМР ЖК. Первым шагом на пути исследования НМР кислот было установление их структуры. Колоночная хромато графия на силикагеле, импрегнированном AgNO3 обеспечила эффективное разделение мети лового эфира 22:2 из двустворчатого моллюска Scapharca broughtoni. Чистота фракций, со ответствующих 22:2, была 99.7%. 1Н-ЯМР спектр метилового эфира имел следующие сигна лы (м.д.): 0.88 (т. СН3), 1.30 (м. СН2), 1.62 (м. Н3СО-СО-СН2-СН2), 2.03 (м. НС=СН-СН2), 2.32(т. СН3-О-СО-СН2), 367 (с. Н3С-О-СО), 5.34 (м. СН=СН). На 13С-ЯМР спектре были сле дующие сигналы химических сдвигов (м.д.): 14.2 (СН3), 22.7, 25.0, 28.9, 29.8, 32.0, 34.2 (СН2), 51.5 (СН3-О), 129.6, 130.1 (СН=СН), 174.3 (СО-О). Спектры показали присутствие двух двойных связей cis-конфигурации, отделенных от карбоксильной группы и друг от друга не сколькими метиленовыми связями. Масс-спектрометрия метилового эфира 22:2 показала мо лекулярный ион равный 350, который соответствовал метилдокозадиеноату. Каталитическое гидрирование дало метиловый эфир бегеновой кислоты 22:0.

Заключение о структуре изомеров 22:2 НМР ЖК было сделано на основании резуль татов масс-спектрометрии пирролидиновых производных и ГЖХ анализа продуктов окисли тельного озонолиза метиловых эфиров. Пирролидиды 22:2 МЭЖК из S. broughtonii дали се рию пиков с m/e 70, 98, 113, 126, 140, 154, 168, 180, 194, 208, 222, 236, 250, 262, 264, 276, 278, 290, 304, 318, 332, 346, 360, 374 и молекулярный ион m/e 389. Масс-спектр имел фрагменты, соответствующие полярной части молекулы (m/e 70 и m/e 98), и основной пик m/e 113. Нере гулярный интервал в 12 массовых единиц существует между максимумами пиков m/e 168 и 180, что указывает на двойную связь в положении 7, интервал между m/e 250 и m/e 262 – на двойную связь в положении 13, и интервал между m/e 278 и m/e 290 показывает существова ние двойной связи в положении 15. Характерные пики m/e 264 и m/e 276 доказывают, что двойные связи в положении 13 и 15 принадлежат разным изомерам 22:2 НМР ЖК.

Рис. 9. (А) ГЖХ продуктов окислительного озонолиза 22:2 НМР кислоты из Scapharca broughtoni. Пики соответствуют 1 – ММС5, 2 – ММС6, 3 – ММС7, 4 – ММС9, 5 – ММС11+ДДС5, 6 – ДДС6, 7 – ДДС7, 8 – ДДС8. (Б) Смеси стандартов. Пики соответствуют – ММС7, 2 – ММС9, 3 – ДДС6, 4 – ДДС7, 5 – ДДС8.

Для строго доказательства структуры изомеров 22:2 НМР ЖК провели окислительный озо нолиз в среде BF3–метанол. В результате окислительного расщепления двойных связей и этерификации фрагментов получается два типа продуктов: диметиловые эфиры дикарбоно вых кислот (ДДС) и метиловые эфиры монокарбоновых кислот (ММС) (Sebedio, Ackman, 1978). Сравнение ГЖХ анализа продуктов озонолиза 22:2 НМР со стандартами (рис. 9) по зволило определить, что пики 3 и 4 соответствуют ММС7 и ММС9, а пики 6, 7, 8 – ДДС6, ДДС7 и ДДС8, соответственно. Причем площадь пика ДДС7 соответствует сумме площадей пиков ДДС6 и ДДС8, указывая, что оба изомера 22:2 кислоты имеют первую связь в 7 по ложении. Наличие кислот ММС9 и ДДС6 показывает, что один изомер имеет структуру 22:27,13, а кислоты ММС7 и ДДС8 указывают на строение второго изомера – 22:27,15. На основании определения площадей пиков установили соотношение изомеров 22:27,15 – 61. ± 1.9% и 22:27,13 – 39.0 ± 1.9%.

Исследован состав ЖК семи видов двустворчатых и брюхоногих моллюсков. Наибо лее интересной особенностью было присутствие 22:2 НМР ЖК, количество которых варьи ровало от вида к виду (от 0.7 до 20.7%). Особый интерес вызывал высокий уровень 22:2 в липидах двустворки S. broughtoni сем Arcidae, который достигал 20.7%, Анализируя резуль таты, было замечено, что самые древние семейства Bivalvia превосходят другие по содержа нию НМР ЖК, тогда как в эволюционно продвинутых видах эти компоненты находятся в следовых количествах или отсутствуют. Кроме того, в наших видах найдены большие коли чества ПНЖК n-3 кислот: 37.5% 20:5n-3 и 22:6n-3 в сумме. Количество 20:5n-3 варьировало от 10.2 до 27.1%, тогда как уровень 22:6n-3 оставался почти постоянным в разных видах дву створок. Профиль ЖК Acmea pallida и Callisela dorsuosa типичен для гастропод, он отражает особенности их водорослевой диеты. Высокие концентрации 16:0,18:1, 20:4n-6 и 20:5n-3 при практически полном отсутствии 22:6n-3 типичны для растительноядных моллюсков.

4.6.2. Биосинтез 22:2 неметиленразделенных жирных кислот Не смотря на возрастающий интерес к НМР ЖК, вопрос об их происхождении оста вался открытым. Чтобы определить способность морских беспозвоночных синтезировать С20 и С22 НМР ЖК и выяснить пути их биосинтеза, были проведены прямые эксперименты по включению С-ацетата в ЖК морских двустворчатых моллюсков. В качестве моделей, богатых этими кислотами, взяты Scapharca broughtoni, Callista brevisiphonata и Mytilus edulis.

Главное включение С-ацетата было в ФЛ и в меньшей степени в ТАГ. Результаты распределения радиоактивности в ЖК S. broughtoni показали, что 22:2 метилась значительно во все периоды исследования, достигая 20.1% от суммарной активности в жабрах и 18.4% в мантии. Чтобы оценить возможность биосинтеза НМР ЖК de novo была определена удельная радиоактивность возможных предшественников 22:2, найденных в S. broughtoni (табл. 4.).

Практически все из них имели высокий уровень радиоактивности.

Чтобы получить прямое доказательство биосинтеза НМР ЖК de novo, был выполнен озонолиз меченой 22:27, 13 и 22:27,15, чтобы оценить распределения метки по цепи ЖК.

Все фрагменты, как с карбоксильного конца, так и с метильного и внутренние фрагменты имели 14С активность, что указывало на биосинтез 22:2 НМР ЖК из 14С-ацетата de novo. Та ким образом, было доказано, что моллюск Scapharca broughtoni имеет активные системы де сатурации и элонгации, позволяющие ситезировать 22:2 НМР ЖК de novo.

Таблица 4. Биосинтез жирных кислот из 14С-ацетата в Scapharca broughtoni Удельная радиоактивность Жирные Ткани кислоты 3 час 6 час 12 час 24 час Жабры насыщенные 2.04 1.96 1.77 1. 16:1 1.65 1.94 4.53 6. 18:1 2.53 2.60 3.37 4. 20:1 0.51 0.53 0.25 0. 22:2НМР 0.29 0.30 0.33 0. Мантия насыщенные 1.76 1.71 1.5 1. 16:1 3.25 3.81 3.69 4. 18:1 1.07 1.14 1.20 1. 20:1 0.42 0.35 0.47 0. 22:2НМР 0.38 0.38 0.48 0. Следующим шагом на пути исследования биосинтеза НМР ЖК было определение спо собности моллюсков продуцировать 20:25,11 и 20:25,13, интенсивности биосинтеза и ус тановению их биогенетической связи с 22:2 НМР ЖК. С этой целью изучено включение 14С ацетата в ЖК Mytilus edulis. 20:2 интенсивно метились во все периоды инкубации, достигая 18.1% при 12 час экспозиции. Радиоактивности в ПНЖК найдено не было, что указывает на эссенциальность этих кислот для моллюсков. Следовательно, НМР являются единственными ПНЖК, которые моллюски могут продуцировать. Уменьшение удельной радиоактивности в ряду: насыщенные, 16:1, 18:1, 20:1 и 20:2 НМР означает, что 20:2 НМР образуется de novo из насыщенных и моноеновых кислот, синтезированных из ацетата, а не являются результатом элонгации запасенных ЖК. Закономерная и последовательная связь удельной активности подтверждает предположение об элонгации 20:2 НМР, синтезированной из ацетата de novo до 22:2 НМР ЖК и показывает высокую скорость этого процесса. В заключении, результаты по включению 14С-ацетата в ЖК двустворчатых моллюсков, оценка их удельной активности и распределение С метки по цепи 22:27,13 и 22:27,15 позволили определить пути био синтеза С20 и С22 НМР ЖК в моллюсках:

16:1n-718:1n-720:1n-720:25,1322:27, 5десат 9десат 16: 5десат 9десат 18:018:1n-920:1n-920:25,1122:27, Таким образом, доказано, что моллюски имеют активные системы десатурации и элонгации, позволяющие синтезировать С20 и С22 диеновые НМР кислоты de novo.

4.6.3. Липиды и жирные кислоты голожаберных моллюсков Тип Mollusca является одним из хорошо изученных в плане липидов, однако до сих пор остаются не исследованными отдельные группы, в том числе Nudibranchia, которые при влекают огромное внимание как источник разнообразных биологически активных веществ.

Для того чтобы восполнить пробел в знаниях по липидной биохимии моллюсков, исследован состав липидов и ЖК голожаберных моллюсков, собранных в тропических водах северо западной Пацифики. Найдено, что пропорции классов липидов различались между видами за счет различного вклада нейтральных липидов. Это объясняется различиями в диете и биохи мии видов, поскольку запасные липиды имеют диетарное происхождение. Определено от сутствие видоспецифичности в распределении классов ФЛ, что является доказательством сходства природы биологических мембран морских организмов.

НЖК Chromodoris sp. Phyllidia coelestis 26,0 МЖК 27,0 27, 16, ПНЖК n- ПНЖК n- 26, 15,7 15,4 СД ЖК 34,4 2, 2,7 6, 12,0 12,0 НМР ЖК 7, Рис. 10. Распределение жирных кислот в голожаберных моллюсках.

Обнаружено огромное разнообразие ЖК в видах Nudibranchia (рис. 10). Уникальной особенностью ЖК Chromodoris sp. и Phyllidia coelestis, отличающей их от других гастропод и других классов моллюсков, является присутствие значительных количеств СДЖК, специ фичных для губок. Разнообразные СДЖК с прямой цепью и разветвленные (iso-), насыщен ные и диеновые с 5,9 группировкой были идентифицированы в обоих видах (12.0 и 9.4% от суммы кислот), основываясь на масс-спектрометрии МЭЖК и их пирролидиновых произ водных. К другой уникальной особенности этой группы моллюсков относится доминирова ние разнообразных нечетных iso- и anteiso- разветвленных «бактериальных» ЖК (15.7 и 34.4% от суммы кислот). Главными среди них были 15:0 и 17:0. Тогда как обычные ЖК, ха рактерные для морских организмов практически отсутствовали. ПНЖК n-3 были минорными компонентами (1.6 и 2.1% в сумме). Количество ПНЖК n-6 в исследованных видах (26.0 и 25.3% от суммы кислот) было на порядок выше, чем доля ПНЖК n-3. Содержание компонен тов уменьшалось в порядке 22:4n-6, 20:4n-6 и 18:2n-6. Таким образом, профили ЖК голожа берников во многих отношениях отличались от того, что известно для других гастропод и моллюсков в целом.

Определена структура 12 новых для моллюсков ЖК. Среди моноенов идентифициро вана новая кислота 21:17(около 6% от суммы кислот), масс-спектрометрией определена ее структура. МЭЖК показала молекулярный ион m/z 338 и главный ион m/z 306, указывая на присутствие 21:1. Молекулярный ион пирролидидов соответствовал m/z 377. Двойная связь при С7 идентифицирована по присутствию нерегулярного интервала m/z 12 между С6 m/z 168 и С7 m/z 180. Эти фрагменты послужили доказательством структуры кислоты 21:17.

Особый интерес представляла находка новой НМР кислоты, идентифицированной как 21:27,13 (рис. 11).

113 10000 140 154 250 262 276 318 332 150 200 250 300 Рис. 11. Масс спектр пирролидиновых производных 21:27,13.

Данные масс-спектра:

7,13-метиловый эфир хенэйкозадиеновой кислоты. MS m/z (относительная интенсив ность, %): 336 (M+, 13), 318 (0.1), 305 (3), 287 (3), 276 (0.5), 262 (1), 252 (0.6), 238 (2), 224 (6), 210 (4), 194 (10), 178 (11), 164 (8), 150 (16), 135 (14), 123 (21), 109 (35), 95 (75), 81 (96), (91), 55 (100).

7,13-пирролидиды хенэйкозадиеновой кислоты. MS m/z (относительная интенсив ность, %): 375 (M+, 9.8), 363 (0.3), 346 (1), 332 (1.7), 318 (1), 304 (2), 290 (3.2), 276 (3), (2.5), 250 (2.7), 236 (8), 222 (4.5), 208 (7.4), 194 (6), 180 (13.5), 168 (6.8), 154 (6.7), 140 (6), (53), 113 (100).

Описан путь биосинтеза 21:27,13 в моллюске из предшественников бактериального происхождения: 9-17:1 11-19:1 5десатураза 5,11-19:2 7,13-21:2.

Специфичность состава липидов доказывает хищничество на губках и возможность присутствия симбиотических бактерий в моллюсках.

5. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ – ПОТЕНЦИАЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ Характер пищи, в частности, ее ЖК компонентов, находит свое отражение в составе ЖК животных (Sargent 1987;

Dalsgaard et al., 2003). Симбиотрофия – способ получения орга нического вещества беспозвоночными за счет фото- или хемосинтеза внутриклеточными микроорганизмами. Поскольку различные группы микроорганизмов имеют характерные особенности ЖК, мы предположили и доказали, что по профилю ЖК беспозвоночных можно определить присутствие в его тканях симбиотических организмов.

5.1. Симбиоз моллюсков с хемоавтотрофными бактериями В результате скринингового исследования ЖК ряда беспозвоночных из бухты Кратер ной, испытывающей влияние подводного вулканизма, был обнаружен двустворчатый мол люск Axinopsida orbiculata, который по составу ЖК принципиально отличался от других жи вотных сообщества, а также от других моллюсков. Он характеризовался высокой концентра цией типичной бактериальной кислоты 18:1n-7 и некоторым увеличением разветвленных ки слот, а также существенным уменьшением количества n-3 ПНЖК 20:5n-3 и 22:6n-3, обычно главных в моллюсках-фильтраторах. Такие особенности A. orbiculata, по нашему мнению, указывают на отличительный способ питания моллюска за счет хемоавтотрофных симбиоти ческих бактерий. На основании микроскопического анализа структур клеток предполагается наличие у A. orbiculata симбиоза с нитрифицирующими бактериями.

Чтобы показана эффективность ЖК в качестве биохимических маркеров для обнаруже ния симбиотической ассоциации беспозвоночных с хемоавтотрофными бактериями, прове ден сравнительный анализ состава ЖК ряда видов морских двустворчатых моллюсков из за лива Восток Японского моря. Среди них представители семейства Lucinidae, Pillucina pisidium, содержащая сульфат-окисляющие эндосимбиотические бактерии, Axinopsida orbiculata subquadrata из семейства Thyasiridae, многие виды которого содержат хемоавто трофные бактерии в клетках жабр, а также моллюски-фильтраторы Raeta pulchella из семей ства Mactridae и Theora lubrica из семейства Semelidae. Между видами найдены существен ные различия (рис. 12) % от суммы кислот 35 Pillucina 30 Axinopsida Reata 15 Theora - е n- ны :6n 8 : ен л 1 + тв - ве :5n аз Р Рис. 12. Распределение некоторых жирных кислот в моллюсках (% от суммы кислот).

Это указывает на то, что присутствие в клетках жабр моллюсков хемоавтотрофных бактерий приводит к изменению состава ЖК хозяина-моллюска. Состав ЖК такой симбио тической ассоциации отличается высокой концентрацией типичных бактериальных кислот 18:1n-7 и некоторым увеличением разветвленных кислот, а также существенным уменьше нием количества n-3 ПНЖК 20:5n-3 и 22:6n-3. Необходимо подчеркнуть, что именно ком плекс названных особенностей может служить надежным биохимическим доказательством существования симбиоза животного с хемоавтотрофными бактериями, поскольку в некото рых случаях отдельные ЖК, предложенные как маркеры, могут варьировать значительно.

5.2. Губки – вклад симбиотических организмов в пул жирных кислот губок Многие губки содержат различные симбиотические микроорганизмы, которые вклю чают как автотрофов, таких как цианобактерии и микроводоросли, так и гетеротрофов, таких как дрожжи и бактерии. Эти микроорганизмы существенно различаются по составу ЖК, что дало основание предполагать, что анализ ЖК губки позволит определить вклад симбионтов в общий пул ЖК животного.

5.2.1. Жирные кислоты как биомаркеры симбионтов в губках из озера Байкал Анализ ЖК шести видов пресноводных губок из о. Байкал и двух морф (зеленой и се рой) Baicalospongia intermedia показал, что разветвленные ЖК, типичные для бактерий, со ставляли от 1.9 до 6.2%. в существенных концентрациях обнаружены С16 и С18 ПНЖК:

16:3n-3, 16:4n-3, 18:2n-6, 18:3n-3, 18:4n-3 (10.7-24.3% от всех кислот), которые служат марке рами зеленых водорослей. НМР 26:3, представленная изомерами 26:35cis,9cis,19cis и 26:35cis,9cis,19trans (Vysotsky et al., 1990), варьировала от вида к виду от 4.6 до 28.5%.

Для определения участия симбионтов в биосинтезе липидов и ЖК губок была прове дена серия опытов по включению 14С-ацетата и 14С-бикарбоната в липиды губки Lubomirskia baicalensis. Распределение радиоактивности из этих двух предшественников по классам ли пидов губки существенно различалось. Метка из 14С-ацетата почти полностью включалась в основном в ФЛ, и только незначительно в ТАГ, тогда как метка из С-бикарбоната распре делялась почти по всем классам липидов, доминируя в ФЛ и ТАГ. Примечательно, что 14С из С-бикарбоната включался в гликолипиды, что подтверждает участие фотоавтотрофных микроорганизмов в биосинтетических процессах. Увеличение удельной радиоактивности ФЛ с увеличением времени экспозиции свидетельствует об интенсивном биосинтезе липидов. Из меченого ацетата образовывались, главным образом, насыщенные и моноеновые ЖК. Интен сивный синтез из С-бикарбоната кислот 16:2n-6, 18:2n-6, 16:3n-3 и 18:3n-3, типичных для зеленых водорослей, и включение меченых ЖК в ГЛ – моногалактозилдиацилглицерин МГДГ и дигалактозилдиацилглицерин ДГДГ (18.5 и 12.3 % от суммарной радиоактивности липидов), которые являются главными структурными компонентами мембран хлоропластов, предполагает активное участие симбиотических зеленых микроводорослей в биосинтезе ли пидов губки. Таким образом, показано, что микроводоросли в большей степени и бактерии в меньшей степени вносят свой вклад в формирование общего пула ЖК пресноводных губок.

5.2.1. Жирные кислоты как биомаркеры цианобактерий в глубоководной стеклянной губке Pheronema raphanus Глубоководные стеклянные губки (Hexactinellida) в настоящее время являются пред метом интенсивного научного изучения, что связано с особенностями организации их крем нийорганических спикул. Проведенное комплексное изучение тропической глубоководной губки Pheronema raphanus (Дроздов и др., 2008) включало исследование морфологии спикул, спектров флуоресценции и поглощения;

автором изучен состав ЖК этого вида.

Обнаружено, что состав ЖК губки P. raphanus типичен для представителей класса Hexactinellida, характерной особенностью которого является высокое содержание ЖК от С до С30 атомов углерода в цепи (Thiel et al., 2002). Главная ЖК этого вида идентифицирована как 30:35,9,23 (более 55% от суммы кислот). Чтобы оценить возможный вклад цианобакте рий в общий состав ЖК губки, особое внимание было уделено компонентам от С14 до С18, которые характерны для этих микроорганизмов. Особый интерес представляет наличие С ПНЖК в липидах исследованной губки, поскольку именно по их присутствию классифици руют цианобактерий (Cohen et al., 1995;

Romano et al., 2000).

Рис. 13 Распределение жирных кислот, ха рактерных для цианобактерий, в губке Pheronema raphanus.

В липидах исследованной губки кислоты 18:3n-3 и 18:4n-3 обнаружены в следовых количествах, тогда как 18:2n-6 найдена в заметных концентрациях, составляя 4.5% от суммы С14-С18 ЖК (рис. 13). Таким образом, полученные результаты анализа ЖК не противоречат предположению об ассоциации этого вида стеклянной губки с цианобактериями.

На основании изучения морфологии спикул, спектров поглощения и флюоресценции, а также состава ЖК, можно утверждать, что симбионтами у стеклянной губки P. raphanus являются фотосинтезирующие цианобактерии.

5.3. Вклад симбиотических динофлагеллят в состав жирных кислот кораллов Мягкие кораллы Octocorallia: Alcyonaceae – самый богатый видами порядок восьмилу чевых кораллов представляет важную группу сессильных морских беспозвоночных в тропи ческих и умеренных водах. В некоторых районах их обилие и плотность поселения может даже превышать обилие твердых рифообразующих кораллов.

Сравнение состава ЖК видов альционарий, не имеющих зооксантелл, с видами, содер жащими эти фототрофные симбионты показало, что отличительной особенностью восьмилу чевых кораллов является присутствие 24:5n-6 (7.2-12.9% суммы кислот) и 24:6n-3 (0.5-4.7%).

Содержание маркерных ЖК динофлагеллят 18:4n-3 и 22:6n-3 колебалось значительно от ви да к виду. В двух видах Dendronephthya, не имеющих зооксантелл, концентрация 18:4n-3 не превышала следовых количеств (0.1-0.3%), тогда как в видах, содержащих зооксантеллы – Sarcophyton acutum и Lobophytum pusillum, уровень 18:4n-3 достигал 8.9 и 4.1%, соответст венно. Доля 22:6n-3 у симбионт-содержащих видов составляла 5.1 и 2.5%,что в несколько раз выше, чем у кораллов без симбионтов (1.3 и 0.9%). Сочетание высоких пропорций 18:4n 3 и 22:6n-3, специфичных для динофлагеллят, может служить показателем присутствия зоо ксантелл в клетках альционарий.

Таким образом, эти исследования доказывают эффективность ЖК в качестве биохими ческих маркеров для обнаружения симбиотических ассоциаций беспозвоночных с микроор ганизмами.

6. ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ДОННЫХ ОСАДКОВ НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ФОСФОЛИПИДОВ Специфические особенности ЖК микроорганизмов имеют огромный потенциал и на ходят применение для решения различных проблем, в том числе и для анализа структур мик робных сообществ.

Для исследования микробного сообщества донных осадков загрязненных нефтепродук тами районов в сравнении с чистыми районами был использован современный и доступный метод анализа жирных кислот фосфолипидов (ФЛЖК), как индикаторов микробных групп.

3- 0. ) 8- Станции, горизонт (см 0. 0. 0. 0- 3- 0. 3- 0. 0. 0 10 20 30 40 50 60 70 Общая микробная биомасса, мкг/г сухой массы осадка Рис. 14. Общая микробная биомасса в донных осадках с указанием районов исследования и глубины осадка.

Определена общая микробная биомасса, пространственные вариации микробных сообществ и воздействие промышленного загрязнения на микробные сообщества донных осадков.

Донные осадки различались как по содержанию общей микробной массы, так и по структуре микробных сообществ. Микробная масса, оцениваемая по абсолютному содержа нию ФЛЖК, колебалась от 9 до 78 мкг/г сухой массы осадка и зависела от разных факторов (рис. 14). Величина микробной биомассы уменьшалась с глубиной грунта (горизонтом) и была значительно выше на илистых грунтах, чем на песчаных. Районы промышленного за грязнения отличались от чистых районов более высокими значениями микробной биомассы.

Анализ ФЛЖК осадков позволил определить присутствие микроэукариот, аэробных, ана эробных и сульфатредуцирующих бактерий. Выявлены особенности изменения структуры микробных сообществ в зависимости от степени загрязнения районов, глубины осадка и гра нулометрического состава грунта (рис. 15).

Наилок (0.3 см) Грунт на глубине 3-10 см 1 25 Биомаркеры 20 3 15 10 5 5 0 I II III IV I II III IV Микробные группы Микробные группы 7 I микроэукариоты (микроводоросли и микрозообентос) II аэробные прокариоты и эукариоты III анаэробные бактерии IV сульфат-редуцирующие и другие анаэробные бактерии Рис. 15. Абсолютное содержание функциональных групп микроорганизмов (мкг ФЛЖК на г сухой массы осадка) в донных осадках исследованных районов (станции 1-8).

В структуре сообществ донных осадков во всех районах доминировали прокариоты, среди них существенную долю составляли аэробные бактерии. Следующей по вкладу в ЖК донных осадков являлась группа анаэробных бактерий, доля которых была больше в загряз ненных районах, и их концентрация повышалась с глубиной осадка. Наибольшие пропорции биомаркеров сульфатредуцирующих бактерий – показателя органического загрязнения, оп ределены в кутовой части загрязненных бухт. ЖК эукариот, находились в большей концен трации в поверхностных слоях осадков, чем в более глубоких слоях грунта. Среди них доми нировали кислоты – маркеры диатомовых водорослей. Довольно высокое содержание бакте рий в донных осадках загрязненных районов, существенный вклад анаэробных и сульфатре дуцирующих бактерий, небольшая доля микроэукариот являются показателем существова ния развитого микробного сообщества, испытывающего влияние органического загрязнения.

Однако отсутствие принципиальных отличий в структуре микробных сообществ между чис тыми и загрязненными районами свидетельствует о том, что микробное сообщество не ис пытывает угнетающего воздействия.

7. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ – МАРКЕРЫ В ТРОФИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Сложность трофических связей в морских экосистемах привела к поиску новых эф фективных методов исследования. Для детального изучения пищевых взаимоотношений ме жду организмами может служить метод биохимических маркеров, в качестве которых ис пользуются ЖК (Sargent et al., 1987;

Dalsgaard et al., 2003). Этот подход основан на специ фичности состава ЖК микроорганизмов и водорослей, которые служат пищей для животных, и на ограниченной способности животных синтезировать ЖК, значительную часть которых они получают из потребляемой пищи.

7.1. Экспериментальное доказательство полезности жирных кислот как биомаркеров в изучении трофологии морских организмов Для получения доказательств влияния диеты на состав ЖК животных, нами выполнен ряд экспериментов по кормлению науплей Artemia salina различными видами микроводорослей и дрожжами, которые принципиально отличались по составу липидов и ЖК. Установлено, что Artemia способна включать и избирательно концентрировать некоторые липиды диеты.

Запасные липиды были более чувствительны к изменению состава липидов диеты, чем глав ные структурные липиды – ПЛ и стерины. Состав ЖК животного варьировал с диетой. Кон 30 A B 20:5n-3 18: %о с м ы 16: тум 15 18: 20:5n- 18: 18: 16:2 16: 18: 0 5 10 15 0 5 10 Сутки Сутки Рис. 16. Изменение состава жирных кислот общих липидов (% от суммы) Artemia salina в те чение кормления микроводорослями и дрожжами.

A - Phaeodactylum tricornutum, B - Isochrysis galbana.

центрация насыщенных ЖК, по-видимому, поддерживалась в науплиях биосинтезом этих компонентов de novo. Тогда как кислота 16:1n-7 происходила из диеты и зависела от ее уров ня в микроводорослях (рис. 16). Концентрация ПНЖК n-3 варьировала в зависимости от ее уровня в диете. Эти находки поддерживают мнение о ЖК как пищевых маркерах.

7.2. Жирные кислоты двух видов баланусов как индикаторы источников пищи Особый интерес в изучении спектров питания представляют массовые виды бентос ных беспозвоночных. Среди них усоногие раки, которые в изобилии встречаются в зонах ли торали и сублиторали. Анализ ЖК баланусов Hesperibalanus hesperius и Balanus rostratus из эпибиоза морского двустворчатого моллюска Patinopecten (Mizuchopecten) yessoensis, соб ранных на различных участках Японского моря, был выполнен, чтобы оценить спектр и раз нообразие их пищевых источников, а также трофические связи с хозяином-гребешком, ис пользуя ЖК маркеры (табл. 5). Наблюдаемые различия в составе ЖК разных размерных (возрастных) групп можно объяснить как результат увеличения разнообразия источников пищи, потребляемой баланусами. Распределение ЖК в молоди обоих видов (2-6 мм) харак теризовалось доминированием насыщенных и моноеновых ЖК и небольшим количеством ПНЖК, что является отражением потребления детрита. Кроме того, высокая концентрация 18:1n-9 (до 18.4%) и ее многократное превышение над долей 18:1n-7 (в 4.6 и 3.5 раз для обо их видов) в молоди обоих видов указывает на то, что они являются мусорщиками (некрофа гами). С увеличением размера мелкого вида H. hesperis пропорция ЖК, характерных для диатомовых заметно возрастает. Высокий уровень 20:5n-3, доминирование 16:1n-7 над 16: и, кроме того, присутствие 16:2n-4, 16:3n-4 и 16:4n-1 являются специфическими маркерами диатомей (гл. 4.2). Таким образом, анализ ЖК маркеров подтверждает мнение, основанное на анализе со Таблица 5. Состав жирных кислот (% от суммы) различных размерных групп баляну сов Hesperibalanus hesperius и Balanus rostratus из эпибиоза с моллюском Patinopecten (Mizuchopecten) yessoensis из разных мест обитания. Средние значения, n=3.

Hesperibalanus hesperius Balanus rostratus P. yessoensis Жирные б. Алексеева п.Старка пролив Старка б.Алексеева п.Старка кислоты 2-3 mm 4-6 mm 11 mm 4-6 mm 6 mm 50 mm 14:0 3.9 4.8 4.9 5.5 5.5 8.6 3.0 3. 16:0 21.3 19.7 15.2 22.7 22.3 12.1 13.8 12. 16:1n-7 2.8 5.8 9.3 5.8 3.5 17.9 12.5 15. 18:0 16.6 7.6 6.3 9.7 8.0 1.4 4.2 2. 18:1n-9 14.8 12.0 10.6 15.2 18.4 4.2 3.3 2. 20:5n-3 8.3 16.0 20.2 8.4 7.4 27.2 19.8 29. 22:6n-3 4.3 6.5 7.6 3.7 3.3 4.1 12.6 8. Нечетные* 2.1 2.6 1.2 2.5 2.3 0.5 1.1 0. iso, anteiso** 1.8 1.5 1.6 1.7 2.3 1.6 1.3 0. 16:1n-7/16:0 0.1 0.3 0.6 0.3 0.2 1.5 0.9 1. 18:1n-9/n-7 3.5 2.1 1.6 3.6 4.6 0.7 0.5 0. С 16 ПНЖК 1.5 1.9 3.1 1.9 2.4 5.6 1.2 2. * ЖК с нечентым числом атомов углерода в цепи (С15 и С17).

** Разветвленные: iso и anteiso ЖК.

держимого желудка циприд, что баланусы относятся к всеядным животным. Взрослые особи B. rostratus содержали большие количества ЖК, типичных для диатомовых, что обеспечивает веское доказательство питания их диатомовыми. Сходство профилей ЖК особей сходных размеров видов H. hesperius и B. crenatus из одного и того же местообитания является ре зультатом сходства потребленной пищи. Различия в составе ЖК H. hesperius, собранных из разных мест, происходят из различий в источниках пищи этих животных. Следовательно, пищевой спектр баланусов зависит также от доступности пищи. Что касается состава ЖК хо зяина – двустворчатого моллюска P. yessoensis, на котором живут баланусы, он является от ражением планктона. Профиль его ЖК включает как маркеры диатомовых (высокий уровень 16:1n-7 и 20:5n-3), так и маркеры динофлагеллят (18:4n-3 и 22:6n-3). Различия в составе ЖК баланусов и их хозяина гребешка указывает на отсутствие пищевой конкуренции между эти ми видами.

7.3. Питание приморского гребешка Patinopecten yessoensis на различных типах донных осадков: доказательство на основании анализа жирных кислот Состав донных осадков – один из главных факторов, который определяет трофиче ский потенциал для бентосных организмов. Подвижный бентосный приморский гребешок Patinopecten (=Mizuhopecten) yessoensis широко распространен в прибрежной зоне северо западной Пацифики и часто доминирует в бентосных сообществах. Для определения источ ников пищи гребешка анализировали ЖК пищеварительной железы и мягких тканей моллю ска и его потенциальных источников пищи: планктона, сестона из придонного слоя воды и донных осадков (рис. 17). Главную долю ЖК моллюска составляли 14:0, 16:0, 16:1n-7 и 20:5n-3, которые являются маркерами диатомей, а также 18:2n-6, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:4n-6 и 22:6n-3, происходящие из флагеллят и простейших, а также зоопланктона.

Таким образом, распределение маркерных ЖК в липидах гребешка отражало потреб ление в пищу диатомей, флагеллят и личинок беспозвоночных. ЖК, ассоциированные с бен тосными бактериями и детритом, были идентифицированы во всех образцах, но в основном в следовых количествах, что указывало на их незначительное потребление моллюском незави симо от места обитания. Гораздо выше доля этих компонентов в органическом веществе придонного слоя - наилка. (рис. 17). Таким образом, данные биохимического анализа, позво ляющего определить, что именно было усвоено животным, не подтверждают мнение о важ ности детрита в питании гребешка, как считалось ранее на основании данных по содержи мому пищевого комка, в котором детрит составляет 30-70% (Микулич, Цихон-Луканина, 1981). По нашим данным, с увеличением обилия бентосных диатомей в наилке заиленного участка, их пропорция заметно увеличивалась в пище гребешка. У особей с песчаного ВОВ придонного слоя Patinopecten yessoensis % от суммы ЖК % от сум мы Ж К OBFA 18:2(n-6) 18:4(n-3) 20:4(n-6) 20:5(n-3) 22:6(n-3) OBFA 18:2(n-6) 18:4(n-3) 20:4(n-6) 20:5(n-3) 22:6(n-3) Sandy site 1 Muddy site Рис. 17. Содержание маркерных жирных 12 Планктон % от суммы Ж К кислот (в % от суммы всех кислот) в пище варительной железе Patinopecten yessoensis и потенциальных источниках пищи на уча стках с различным типом донных осадков (песчаный участок 1 и илистый участок 2).

OBFA: сумма нечетных и разветвленных 0 жирных кислот (iso- и anteiso-). Данные OBFA 18:2(n-6) 18:4(n-3) 20:4(n-6) 20:5(n-3) 22:6(n-3) представлены как средние ±SD.

участка, были выше показатели ЖК, происходящие из флагеллят и личинок беспозвоночных.

Вклад бактерий в питание моллюска был несколько повышен у особей, обитающих на заи ленном участке. Таким образом, различия в составе ЖК гребешков, собранных на участках с различным типом донных осадков, отражали пространственную вариабельность пищевых компонентов, прежде всего, состав и обилие пищи в придонном слое.