Бактериальная трансформация и иммобилизация тяжелых металлов и радионуклидов
На правах рукописи
ХИЖНЯК ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОБИЛИЗАЦИЯ
ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАДИОНУКЛИДОВ
Специальность 03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
доктора биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, Кондратьева Тамара Федоровна, зав. лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов, ИНМИ РАН Доктор биологических наук, Карначук Ольга Викторовна, профессор Томского государственного университета Доктор химических наук, Новиков Александр Павлович, в.н.с., зав. лабораторией, институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН
Ведущая организация – Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Защита состоится «25» марта 2013 г. в 14 час. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.224.01 при Институте микробиологии им.С.Н.
Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им.
С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak.ed.gov.ru и на сайте Института www.inmi.ru.
Учёный секретарь диссертационного совета Актуальность.
Загрязнение окружающей среды токсичными веществами, такими как тяжелые металлы и радионуклиды, в настоящее время представляет острую проблему для биосферы. Радиоактивные отходы попадают в окружающую среду в ходе переработки продуктов ядерного цикла, медицинских исследований и техногенных аварий типа Чернобыльской (1986) (Balonov, 2003) или Фукусимской (в Японии, 2011 г.) (Bolsunovsky, Dementyev, 2011). В связи с этим необходимы разработка и внедрение процессов, обеспечивающих безопасность окружающей среды и переработку ядерных отходов для дальнейшего развития ядерного топливного цикла.
К настоящему времени накоплен значительный материал о биотехнологических методах очистки растворов, содержащих уран, стронций, цезий и йод (Macaskie, 1991), как наиболее экономически выгодных и экологически безопасных. Поэтому микробная трансформация тяжелых металлов и радионуклидов является предметом повышенного внимания многих научных коллективов. Результаты исследований в этой области могут быть востребованы для теории и практики радиохимии, послужат основой новых биотехнологических систем очистки природных объектов и промышленных отходов от тяжелых металлов и радионуклидов.
Современные биотехнологии ориентированы на уменьшение, уничтожение или безопасное хранение отходов. В основе этих технологий лежит широко известная способность микроорганизмов и, в меньшей степени, растений, трансформировать и разлагать практически все химические соединения. Эти процессы многообразны и зависят от физико-химических условий среды, природы загрязнителя, состава микробных сообществ и биоценозов. Биологическая очистка основана на процессах, происходящих в природе, и технологически может быть существенно ускорена внесением специализированных микроорганизмов, добавлением питательных веществ для их развития или соединений, снижающих токсичность металлов и т.д.
(NABIR, 2002).
Взаимодействие микроорганизмов и металлов представляет собой сложный комплекс различных по природе процессов и включает: 1) адсорбцию металлов на клеточной поверхности;
2) комплексообразование с компонентами клеточных оболочек;
3) внутриклеточную аккумуляцию металлов;
4) окисление или восстановление металлов;
5) трансформацию, в частности, путем метилирования или 6) образование комплексов с неорганическими лигандами и осаждение комплексов;
7) связывание металлов с экзополимерами. При этом, некоторые типы взаимодействия могут иметь место в случае как мертвых, так и живых клеток, тогда как для других – необходимы активно метаболизирующие микроорганизмы (Macaskie, 1991).
Данная диссертационная работа сфокусирована главным образом на изучении трансформации и иммобилизации различными микроорганизмами таких долгоживущих радионуклидов, как технеций, нептуний, плутоний, америций, кюрий и некоторых других. Период полураспада перечисленных радионуклидов составляет более 105 лет, поэтому разработка теоретических основ очистки окружающей среды от таких опасных загрязнителей является приоритетным направлением. В отличие от большинства работ, где рассматривается обычно только один тип преобразования элементов (Lloyd et al., 1996), наши исследования охватывают как процессы сорбции, так и окислительно-восстановительные процессы, а также их комбинации в природных условиях. Приближаясь к природным системам, мы изучали трансформационные процессы взаимодействия микроорганизмов и металлов/радионуклидов как в стандартных нейтральных условиях, так и при экстремальных (кислых и щелочных) значениях рН среды.
Целью работы было исследовать в широком диапазоне экологических факторов бактериальную трансформацию растворимых форм радионуклидов и тяжелых металлов в нерастворимые, а также биоаккумуляцию микроорганизмами этих загрязнителей для уменьшения их объема.
Основные задачи исследования.
1. Определить способность микроорганизмов различных физиологических групп сорбировать и трансформировать растворимые формы радиоактивных элементов.
2. Исследовать процессы бактериального восстановления технеция (Tc(VII)), хрома (Cr(VI)) и урана (U(VI)), используемых в качестве конечных акцепторов электронов в энергетическом метаболизме бактерий для целей их детоксификации в широком диапазоне значений рН среды.
3. Определить основные продукты бактериальной трансформации радионуклидов и токсичных элементов, образующихся в кислых, нейтральных и щелочных условиях среды.
4. Исследовать иммобилизацию технеция и некоторых трансурановых элементов (Np, Pu, Am, Cm) микробными сообществами илов пресных водоемов.
5. Выяснить возможности снижения токсического воздействия тяжелых металлов и радионуклидов на почвенную микробиоту.
Научная новизна работы.
Показано, что микроорганизмы различных таксономических групп способны сорбировать и трансформировать трансурановые элементы и тяжелые металлы, что обусловливает важную роль микробиоты в процессах самоочистки природных объектов (почв, водоемов) от радиоактивных загрязнений.
Выявлены принципиальные различия в биосорбции микробными клетками элементов с постоянной и переменной валентностью (катионы металлов и включающие их анионы кислотных групп).
Обнаружено существенное повышение трансформирующей (радионуклиды) активности микроорганизмов за счет сочетания их сорбционных свойств и способности восстанавливать ионы трансурановых элементов и металлов.
Впервые установлена способность восстанавливать пертехнетат (TcO4-) в анаэробных условиях в широком диапазоне рН:
(1) сульфатредуцирующими бактериями Desulfovibrio desulfuricans в нейтральных условиях среды с образованием нерастворимого оксида TcO2;
(2) ацидофильными тионовыми бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans и A. thiooxidans в кислых условиях среды с образованием растворимых коллоидов, содержащих восстановленный технеций;
(3) галоалкалофильными бактериями рода Halomonas в щелочных условиях среды с образованием растворимого комплекса TcIVO(OH)3(CO3)-, а также образованием трехвалентного технеция.
Впервые показано восстановление хромата в щелочных аэробных условиях галоалкалофильными бактериями рода Halomonas в ходе процесса его детоксификации. Выделен и описан новый вид Halomonas chromatireducens sp. nov., обладающий этими свойствами.
Показана способность к энзиматическому восстановлению шестивалентного урана у ряда сульфат- и железоредуцирующих бактерий, которые использовали эти реакции для получения энергии. Впервые показано восстановление шестивалентного урана из твердой фазы термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens, использующей его в качестве акцептора электронов c образованием нерастворимого восстановленного соединения.
Выявлена доминирующая роль микробных сообществ анаэробных осадков пресноводных водоемов в удалении технеция и долгоживущих трансурановых элементов из водной толщи в придонные илы.
Продемонстрирована высокая устойчивость почвенных мицелиальных и немицелиальных актинобактерий к сочетанному токсическому действию радионуклидов, тяжелых металлов и химических токсикантов (три- и тетрахлорэтилена). В модельных экспериментах показана эффективность применения гидроксиапатита для снижения токсического воздействия на бактерии тяжелых металлов и радионуклидов.
Практическая ценность исследования.
Доказана и апробирована в лабораторных условиях эффективность использования для очистки растворов от радионуклидов микроорганизмов, обладающих высокой восстановительной активностью, обеспечивающей существенное увеличение сорбционной способности бактериальных клеток.
Для очистки (детоксификации) жидких радиоактивных отходов с низкой активностью разработана и испытана модельная лабораторная система, на основе иммобилизованных клеток сульфатредуцирующих бактерий, обладающих нитратредуктазной активностью. Система обеспечивала в проточном режиме полное удаление пертехнетата из раствора.
Из загрязненных радионуклидами почв выделены новые штаммы актиномицетов, устойчивых к высоким концентрациям двухвалентных катионов (никель, кобальт, кадмий) и шестивалентных анионов (уран и хром).
Полученные результаты могут быть использованы для разработки микробиологических методов очистки промышленных сточных вод, содержащих технеций, хром, а также природных водоемов, загрязненных технецием и некоторыми трансурановыми элементами.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:
• Russian Radiochemical Conference, Dubna, 16 – 23 September 1994;
• 5-th International Conference on Chemistry and migration behaviour of actinides and fission products in the Geosphere, MIGRATION'95, Saint-Malo, France, 10-15 September 1995;
• Annual Report of the Centre de Recherches Nucleaires, Strasbourg, France, 1996;
• Fourth International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe, 15-17 September 1998, Warsaw, Polland;
•EUROCONFERENCE: Bacterial Metal/Radionuclide Interaction: Basic Research and Bioremediation, Rossendorf/Dresden, Germany, 2-4 December 1998;
• The second Japanese-Russian Seminar on Technetium, Shizuoka, Japan, Nov. 29 - Dec.2 1999;
•International Conference 29 Journets des Actinides. Luso, Portugal, 15-17 April 1999, Luso, Portugal;
• Migration'99, Seventh International Conference on the Chemistry and Migration Behavior of Actinides and fission Products in the Geosphere, Incline Village, Lake Tahoe, Nevada, USA, September 26 October 1, 1999;
• EPA/DOE/NSF/ONR Bioremediation Research Program Review, Bloomingdale, IL, USA, 3-5 November 1999;
• National American Society for Microbiology Meeting, Los Angeles, CA, USA, May 2000;
• 15th International Biohydrometallurgy Symposium (IBS 2003), September 14-19, Athens, Hellas.
“Biohydrometallurgy: a sustainable technology in evolution”;
• 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (IBBS-13), 4-9 September 2005, Madrid, Spain;
• Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» Саратов, 14 – 16 сентября 2005;
• II Российская молодежная школа «Радиохимия-2006», 2-8 сентября 2006, Озерск;
• 6-я Российская конференция по радиохимии, 23-27 октября 2006, Дубна;
• Международный симпозиум по современной радиохимии «Радиохимия: достижения и перспективы» в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Москва, 23- сентября 2007 г;
• Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ – Улан Батор, 5-16 сентября 2011;
• 7th International Symposium on Technetium and Rhenium, Moscow, July 4-8, 2011.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе экспериментальная статья, 2 обзора и 27 тезисов и докладов конференций.
Структура диссертации Диссертация состоит из введения, 3 частей, включающих 10 глав, заключения и выводов, изложенных на 225 страницах, включая 28 таблиц, 54 рисунка и списка литературы из 267 наименований, из них 20 на русском и 247 на иностранном языке.
Место проведения работы Основная часть работы была выполнена в Институте микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН под руководством д.б.н. Н.Н. Ляликовой-Медведевой и в Институте физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина РАН совместно с к.х.н. К.Э. Германом и под руководством д.х.н. В.В. Перетрухина. Эксперименты по восстановлению пертехнетата иммобилизованной биомассой сульфатредуцирующих бактерий были выполнены совместно с Д. Ллойдом (J. Lloyd) в лаборатории в Университете Бирмингема, Великобритания. Часть исследований восстановления пертехнетата в щелочных условиях проводили в лаборатории проф.
М. Симонофф в Центре ядерных исследований Университета Бордо, Франция.
Восстановление соединений урана термофильными микроорганизмами исследовали совместно с д.б.н. А.И. Слободкиным (ИНМИ РАН) и Д. Ллойдом (Манчестерский Университет, Великобритания). Исследования по токсическому воздействию радионуклидов и тяжелых металлов проводили в Медицинском Университете Южной Каролины, США в лаборатории П. Моррис (P. Morris). Соискатель выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.
Основные защищаемые положения:
1. Способность восстанавливать долгоживущие радионуклиды и тяжелые металлы присуща микроорганизмам различных филогенетических групп.
2. Сульфатредуцирующие бактерии, как в ассоциациях, так и в чистых культурах (Desulfovibrio desulfuricans) способны восстанавливать растворимый пертехнетат до нерастворимого оксида технеция TcO2.
3. Ацидофильные тионовые бактерии способны использовать семивалентный технеций в качестве акцептора электронов. В кислых условиях среды восстановленный технеций находится в растворимом состоянии.
4. Галоалкалофильные бактерии способны энзиматически восстанавливать тяжелые металлы и радиоактивные элементы с переменной валентностью. В щелочных условиях преобладает растворимый комплекс, содержащий четырехвалентный технеций.
5. Термофильные прокариоты способны к восстановлению малорастворимого урамфита ((NH4)(UO2)(PO4) х3H2O) с образованием нерастворимого нингиоита (CaU(PO4)2 хH2O).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Для сорбционных экспериментов были использованы микроорганизмы различных таксономических групп: бактерии – Pseudomonas fluorescens, P. isachenkovii, P. vanadiumreductans, P. chromatophila, Methylobacterium organophilum, Arthrobacter sp.;
грибы Aspergillus niger;
дрожжи Pichia wicker, Rhodotorula rubra, актиномицеты Streptomyces galbus, Streptomyces scabies.
В опытах с тионовыми бактериями использовали Acidithiobacillus ferrooxidans ВКМ-В-458, выделенную Ляликовой Н.Н. из шахтных вод Подмосковного угольного бассейна, и Acidithiobacillus thiooxidans ВКМ-В-460 из Роздольского серного месторождения, любезно предоставленную Г.И. Каравайко.
В опытах с сульфатредуцирующими бактериями использовали Desulfovibrio desulfuricans ATCC 29577.
В опытах с галоалкалофильными бактериями использованы штаммы из коллекции лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН.
Для культивирования сульфатредуцирующих бактерий вида Desulfovibrio desulfuricans использована среда Постгейта С, г/л: KH2PO4 – 0.5;
NH4Cl – 1;
Na2SO4 – 4.5;
CaCl2*6H2O – 0.06;
MgSO4*7H2O – 0.06;
лактат натрия – 6 мл (50% раствор);
дрожжевой экстракт – 1;
FeSO4*7H2O – 0.004;
цитрат натрия двуводный – 0.3;
вода дистиллированная – 1 л;
pH среды – 7.0-7.2. Для экспериментов использовали часовую культуру, трижды отмытую стерильным 20мМ MOPS (3-N-Morpholino propane-sulfonic acid) для полного удаления сероводорода.
Для культивирования тионовых бактерий: для Acidithiobacillus ferrooxidans использовали среду 9К с меньшим количеством железа. Раствор А: 700 мл дистил.
воды, (NH4)2SO4 – 3 г;
KCl – 0.1 г;
K2HPO4 – 0.5 г;
MgSO4 – 0.5 г;
Ca(NO3)2 – 0.01 г;
Раствор Б: 300 мл дистил. воды, 1 мл конц. H2SO4;
FeSO4*7H2O – 10 г. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуются и непосредственно перед употреблением смешиваются. pH среды 2.5. Перед экспериментами клетки отмывали подкисленной водой для удаления трехвалентного железа.
Для Acidithiobacillus thiooxidans использовали среду Ваксмана, г/л: (NH4)2SO4 – 0.2 г;
KH2PO4 – 3 г;
MgSO4 –- 0.5 г;
CaCl2 – 0.25 г;
FeSO4*7H2O – следы;
вода водопроводная 1л. Серу (порошок) стерилизовали отдельно в колбе 96% этиловым спиртом.
Для хромвосстанавливающих бактерий использовали среду следующего состава: NH4Cl – 0.3 г;
KH2PO4 – 0.3 г;
MgSO4*7H2O – 0.1 г;
NaCl – 0.1г;
(NH4)2CrO4 – 0.2 г;
лактат натрия - 2 мл (50% раствор);
вода дистиллированная 1 л. pH – 7.0.
Для сульфатредуцирующей ассоциации использовали среду: лактат натрия – 1.5 мл (50% раствор);
NH4Cl – 0.5 г;
KH2PO4 – 0.3 г;
дрожжевой экстракт – 0.05 г;
MgSO4 – 0.1 г;
микроэлементы по Пфеннигу – 1 мл, вода дистиллированная 1 л.
Для галоалкалофильных бактерий использовали среду следующего состава на 1 л дистиллированной воды: Na2CO3 – 13;
NaHCO3 – 4;
NaCl – 50;
K2HPO4 – 0.5;
MgSO4 – 0.1;
дрожжевой экстракт – 0.1;
NH4Cl – 0.1;
ацетат натрия – 2.8;
микроэлементы по Пфеннигу – 2 мл (Pfennig, Lippert, 1966). Конечный рН среды 10.
Двух и трехвалентное железо определяли колориметрическим методом (Резников и др., 1970).
Разновалентные формы технеция Tc(VII), Tc(V) и Tc(IV) определяли хроматографическим методом (Shukla, 1966).
Биомассу бактерий определяли по количеству белка микрометодом Бредфорда (Bradford, 1976) или с бисинхониновой кислотой (Smith et.al., 1985).
Определение радиоактивности раствора. Определение плутония и кюрия в растворах проводили радиометрически или по альфа-спектрам образцов, приготовленных нанесением на полированные мишени из нержавеющей стали, высушенные и прокаленные в течение 1 мин. при температуре 500-600 °С на отечественном спектрометре типа СЭА-01 (золото-кремниевый детектор типа ДКП сд-125). Точность измерений ± 3%. Технеций определяли либо на бета-установке типа NZQ 605 (ЧСР) после нанесения раствора на мишени из нержавеющей стали и высушивания при комнатной температуре либо на жидкостном сцинтилляционном счетчике LKB Wallak Oy RACKBETA. Во всех экспериментах (кроме оговоренных) был использован долгоживущий изотоп технеция – 99Tc (T1/2 = 2.12*105 лет).
РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Микробная трансформация технеция в растворах 1.1. Способность микроорганизмов различных таксономических групп сорбировать радионуклиды. Сорбция технеция в нейтральных условиях Проведен сравнительный анализ способности микроорганизмов различных таксономических групп сорбировать радионуклиды на примере метастабильного 99m технеция Tc с периодом полураспада 6.01 ч (табл. 1). Сорбционная способность микроорганизмов зависела от состава и структуры клеточных оболочек.
Грамположительные бактерии с заряженной отрицательно клеточной стенкой плохо сорбировали семивалентный технеций в анионной форме (табл. 1). Наиболее эффективно сорбировали технеций грамотрицательные бактерии родов Pseudomonas, Methylobacterium, дрожжи Pichia wicker и микроскопические грибы Aspergillus niger.
Таким образом, способность сорбировать радионуклиды широко распространена среди микроорганизмов, которые различаются выраженностью этого свойства, зависящей от состава и строения клеточных стенок.
Таблица 1. Сорбция метастабильного 99mTc суспензией микроорганизмов различных таксономических групп в нейтральных условиях среды и температуре 20 °C. Начальная концентрация 99mTc – 0.6 Ci.
№ Микроорганизм Сорбция технеция-99м, % Pseudomonas (3 вида) 76- Aspergillus niger Methylobacterium organophilum 27- Arthrobacter sp 30- Pichia wicker 25- Rhodotorula rubra Streptomyces galbus Streptomyces scabies 1.2. Восстановление радионуклидов микроорганизмами в нейтральных условиях 1.2.1. Восстановление технеция микроорганизмами различных таксономических групп Исходя из того, что на трансформирующую радионуклиды способность микроорганизмов может влиять, помимо сорбционных свойств, также метаболическая активность, а именно, восстановительные свойства, для последующих экспериментов были отобраны: Scopulariopsis brevicaulis (восстанавливает арсенат и теллурат), Pseudomonas vanadiumreductans, P. isachenkovii (восстанавливают ванадат и нитрат);
а также ассоциации бактерий, восстанавливающие хромат, хлорат и сульфат (табл. 2). В нейтральных условиях среды практически полностью пертехнетат удалялся из растворов бактериальной ассоциацией, восстанавливающей хромат (табл. 2). Достаточной эффективностью восстанавливать технеций обладали ассоциация сульфатредуцирующих бактерий и микроскопические грибы. Отмечено, что мертвые клетки ванадатвосстанавливающих псевдомонад удаляли из раствора в 5 раз меньше технеция, чем живые, обладающие редуктазной активностью. Из клеток этих бактерий были выделены и охарактеризованы две специфические нитратредуктазы (мембрансвязанная и периплазматическая), которые восстанавливали нитрат, ванадат и некоторые другие анионы тяжелых металлов 1. Мы предполагаем, что эти ферменты принимают участие в восстановлении семивалентного технеция.
Исследования проводили совместно с к.б.н. Антиповым А.Н., ИНБИ им. А.Н. Баха, за что автор выражает ему большую благодарность.
Таблица 2. Удаление технеция-99 из раствора микроорганизмами в нейтральных условиях среды, температура – 28-30°C, время экспозиции 5-7 сут.
Микроорганизм Начальная концентрация Удаление технеция, % технеция, мг/л 24 Aspergillus niger 24 58- Scopulariopsis brevicaulis 24 Pichia wicker Бактериальная ассоциация, восстанавливающая сульфат 30 30- хромат 12 хлорат 40 18- 25-40 20- P. vanadiumreductans 25-40 20- P. isachenkovii 1.2.2. Восстановление технеция анаэробной ассоциацией сульфатредуцирующих бактерий Опыты проводили с выделенной нами анаэробной ассоциацией сульфатредуцирующих бактерий, которую выращивали в модифицированной среде Постгейта С с технецием (40 мг/л). Через 8 сут инкубации радиоактивность раствора уменьшилась на 30-50% параллельно с образованием темно-коричневого осадка.
Попытки его идентификации методом рентгеноструктурного анализа не увенчались успехом, так как осадок оказался рентгеноаморфным, что и следовало ожидать, так как осадки микробного происхождения обычно рентгеноаморфны и только по прошествии нескольких месяцев или даже лет начинают структурироваться.
Элементный состав полученного осадка, определенный методом рентгеновского микроанализа, выявил присутствие в нем технеция и серы. Технеций, исходя из его химических свойств, по-видимому, находится в осадке, в основном, в форме образующихся в данных условиях сульфидов смеси Tc2S7 и TcS2. Первый образуется в результате взаимодействия сероводорода бактериального происхождения и пертехнетата, при этом восстановления технеция не происходит, второй образован прямым восстановлением пертехнетата сульфатредуцирующими бактериями, что подробно рассмотрено ниже.
1.2.3. Восстановление технеция бактерией Desulfovibrio desulfuricans при использовании различных доноров электронов Эксперименты проводили с суспензиями клеток Desulfovibrio desulfuricans ATCC 29577, выращенных в среде Постгейта С (48 час, окончание экспоненциальной фазы роста), отмытых и ресуспендированных в буферном растворе MOPS (20 мМ, рН 7).
Суспензии инкубировали анаэробно в присутствии пертехнетата аммония (0.25 мМ).
В качестве доноров электронов в экспериментах использовали водород, формиат, пируват, лактат, этанол, сукцинат, ацетат и некоторые другие субстраты (табл. 3), из которых наиболее предпочтительными донорами были водород и формиат. В первом случае остаточная радиоактивность раствора через 4 ч инкубации составляла 1-2%, однако использование водорода имеет ряд ограничений по технике безопасности, в связи с чем его применение в больших количествах в промышленных условиях нецелесообразно. Процесс сопровождался выпадением темно-коричневого осадка, структуру которого, как и в случае использования сульфатредуцирующей ассоциации (гл. 1.2.2), определить не удалось. Наименьшее количество технеция было восстановлено в присутствии метанола. Отмечено, что, как и в вариантах с ванадатвосстанавливающими бактериями (гл. 1.2.1), использование неактивных мертвых клеток сульфатредуцирующих бактерий в присутствии доноров электронов было неэффективным (CR= 20-28) и отражало неспецифическую биосорбцию технеция на поверхности клеток. В равной степени нерезультативно было применение для детоксификации метаболически активных бактериальных клеток в отсутствие доноров электронов (CR=68).
Таким образом, трансформирующая радионуклиды активность бактерий зависит от их способности восстанавливать радионуклиды, которые в этой новой форме сорбируются клетками в большей на порядки степени.
При изучении динамики восстановления Tc(VII) бактериальной суспензией с использованием в качестве доноров электронов водорода, формиата или лактата (рис.
1) было показано, что скорость восстановления пертехнетата была наибольшей на начальных этапах инкубации: 85% технеция было удалено из раствора менее чем за час в случае использования бактериями формиата. Анализ супернатанта методом хроматографического разделения показал, что только 5% технеция от его исходного количества остается в семивалентном состоянии, а еще 10% обнаруживается в пятивалентном состоянии. При использовании лактата наблюдали значительно более низкую скорость восстановления Tc(VII) (рис. 1). Отмечено, что отмытые клетки сульфатредуцирующих бактерий сохраняли свою восстановительную активность в течение нескольких недель при хранении при 4 С и, более того, 15 мин продувка суспензии воздухом не оказывала отрицательного влияния на восстановление пертехнетата.
Таблица 3. Эффект различных доноров электронов на восстановление технеция суспензией D. desulfuricans в анаэробных условиях, концентрация TcO4- – 0.25 мкМ, концентрация доноров электронов – 10 мМ, инкубация без перемешивания в течение 24 ч, температура – 30 С.
Донор электронов Коэффициент концентрирования* (CR) Водород....................................................................................... Формиат........................................................................................ Пируват.......................................................................................... Лактат............................................................................................ Этанол.......................................................................................... Сукцинат...................................................................................... Глицерин....................................................................................... Ацетат........................................................................................... Метанол...................................................................................... Мертвая биомасса + донор электронов 20- Живая биомасса, отсутствие доноров электронов * Коэффициент концентрирования CR - отношение (беккерель Tc в биомассе) к (беккерель Tc в растворе).
Остаточная радиоактивность, % T 0 1 2 3 4 Б Время, ч Рис. 2. Срез клеток D. desulfuricans, Рис. 1. Восстановление Tc(VII) клеточной инкубированных c 1 мМ TcO4- (А) или без суспензией D. desulfuricans при использовании пертехнетата (Б). Донор электронов – водорода (), формиата () и лактата (). В водород. Электронно-плотный осадок контроле () донор электронов отсутствует.
восстановленного технеция по периферии Концентрация технеция – 0.25 мМ.
клеток. Метка – 1 мкм. Для уточнения локализации восстановленного технеция были проанализированы в трансмиссионном микроскопе срезы клеток бактерий D. desulfuricans, инкубированных 24 ч в растворе с концентрацией технеция 1 мМ и донором электронов – водородом (восстановлено 89% технеция). Рентгеновский микроанализ выявил наличие электронно плотного слоя восстановленного технеция по периферии клеток (рис. 2А), тогда как в отсутствие технеция такого контрастирования клеток не наблюдали (рис. 2Б). Судя по полученным данным, в процессе восстановления пертехнетата участвуют периплазматические ферменты. По аналогии с показанной ранее функцией гидрогеназы 3 E. coli в восстановлении технеция (Lloyd, 1997) периплазматическая гидрогеназа D. desulfuricans может работать как технеций-редуктаза. Для проверки этого предположения клетки были прединкубированы с 0,5 мМ Cu(II), которая, как известно, ингибирует периплазматичекую, но не цитоплазматическую гидрогеназу (Fitz et al, 1991).
Отсутствие восстановления семивалентного технеция в эксперименте подтверждает участие периплазматической гидрогеназы D. desulfuricans в восстановлении технеция.
1.2.4. Восстановление и удаление технеция из раствора иммобилизованными клетками сульфатредуцирующих бактерий Использование иммобилизованных клеток бактерий для решения ряда биотехнологических задач, в том числе для удаления радионуклидов из раствора, имеет некоторые преимущества по сравнению с суспензионными. Так, клетки, прикрепленные к носителю, не вымываются раствором, имеют более длительный срок эксплуатации системы, более устойчивы к неблагоприятным факторам среды, предполагают возможность самовосстановления системы. Нами была разработана лабораторная установка на основе иммобилизованных клеток D. desulfuricans (рис.
3а). Выращенные на среде Постгейта бактерии, были механически (сорбционно) иммобилизованы на трубчатых акриловых фильтрах (12 Romicon XM50, США) с внутренним диаметром 1,1 мм, количество иммобилизованной биомассы составляло около 5 г/л реактора. Очищаемый раствор содержал пертехнетат (50 мкМ) и формиат (25 мМ). В контрольном биореакторе донор электронов отсутствовал.
При работе экспериментального биореактора в периодическом режиме через 3 5 час инкубации наблюдали потемнение волокон фильтра биореактора, через 72 час – образование черного осадка;
через 130 час эксперимента – полное удаление технеция по результатам измерения радиоактивности раствора. В контрольном варианте в отсутствие формиата удалялось только 1% радиоактивности.
Была показана также возможность работы лабораторного биореактора в проточном режиме (рис. 3б). В процессе 100 часовой циркуляции очищаемого раствора технеция (50 мкМ) со скоростью протока до 16 мл/ч наблюдали полное удаление технеция из раствора иммобилизованными клетками бактерий, тогда как при более высоких скоростях протока очистка становилась неполной.
А. Б.
% удаленного технеция E.coli, дикий E.coli, мутант Desulfovibrio desulfuricans 0 5 10 Скорость протока, мл/ч Рис. 3. Удаление пертехнетата гетеротрофными бактериями из раствора. А. - Лабораторная установка с использованием иммобилизованных клеток сульфатредуцирующих бактерий. Верхний биореактор: в системе находится формиат и пертехнетат, в нижнем - только пертехнетат. Б – кинетические характеристики восстановления пертехнетата D. desulfuricans и Escherichia coli.
Однако при снижении скорости протока система возвращалась к рабочему состоянию и технеций полностью удалялся из раствора. Отметим, что трансформирующей способностью обладают только бактерии с высокой редуцирующей способностью. В сравнении с детоксифицирующим действием E. coli (Lloyd et al, 1997) клетки D. desulfuricans более эффективно восстанавливали и удаляли из раствора технеций (рис. 3б).
Так как в данных экспериментах в качестве донора электронов был использован формиат, было важно выяснить, какая группа ферментов вовлечена в восстановление пертехнетата у D. desulfuricans в этих условиях и будет ли наблюдаться конкурентное влияние нитратов на восстановление пертехнетата. При добавлении нитрата к очищаемому раствору технеция в первую очередь потреблялся нитрат, в это время не наблюдалось восстановления технеция и снижения остаточной радиоактивности раствора. После полного потребления нитрата процесс удаления технеция возобновлялся. При повторном добавлении нитрата в очищаемый раствор, снова в первую очередь удалялся нитрат и увеличивалась конечная радиоактивность раствора, так как система продолжала работать в проточном режиме. При замене очищаемого раствора на раствор, не содержащий нитрата, система возвращалась в исходное рабочее состояние, обеспечивая полное или почти полное удаление технеция из раствора. Из полученных данных можно заключить, что, вероятнее всего, в восстановление технеция сульфатредуцирующими бактериями, которые обладают нитратредуктазной активностью, вносит вклад и нитратредуктаза, которая в отсутствие конкуренции субстратов функционирует как технеций-редуктаза.
1.3. Восстановление технеция в кислых условиях среды Известно, что жидкие радиоактивные отходы (ЖРО), хранящиеся в специальных танках, поверхностных сооружениях или закачиваемые в пластовые хранилища, имеют либо сильно кислую, либо сильно щелочную реакцию среды.
Поэтому необходимо было исследовать трансформирующую активность бактерий в этих условиях. При выборе ацидофильных тионовых бактерий А. ferrooxidans и А. thiooxidans мы руководствовались тем, что еще Брок и Густафсон установили их способность к анаэробному росту при окислении элементной серы и трехвалентного железа как акцепторов электронов (Brock & Gustafson, 1976). В наших экспериментах при использовании в качестве акцепторов электронов не только серы и железа, но и семивалентного технеция, наблюдали уменьшение радиоактивности растворов, причем более эффективное в анаэробных условиях (табл. 4). При замораживании культуральной жидкости ацидофильных тионовых бактерий образовывался коллоид коричневого цвета, в состав которого, по данным рентгеновского микроанализа, входили сера, железо и технеций. Подобный эффект может иметь место в том случае, если тионовые бактерии восстанавливают семивалентный технеций, а восстановленная форма менее растворима и при замораживании отделяется.
Хроматографическими анализами было показано, что технеций в коллоиде имеет различную валентность: Tc(IV) – 27.5%, Tc(V) – 61.6%, Tc(VII) – 11%. Отметим, что в исходной (незамороженной) культуральной жидкости технеций обнаруживался в формах: Tc(IV) – 7%, Tc(V) – 13%, Tc(VII) – 80%. Соотношение восстановленных форм технеция варьировало от эксперимента к эксперименту и зависело от времени культивирования. В случае использования элементной серы как донора электронов восстанавливалось около 70% технеция, который был представлен, согласно хроматографическим данным, формами Tc(IV) и Tc(V) (табл. 5).
Таблица 4. Биоаккумуляция технеция-99 ацидофильными бактериями A. ferrooxidans, pH 2.5, температура 30°C, время инкубации 7 сут.
Радиоактивность раствора, Bq* Условия Удаление начальная конечная коллоид Tc, % Аэробные 1.8 1.3 0.30 Анаэробные 3.5 1.9 0.35 1.9 1.3 0.11 В других экспериментах, моделирующих природные условия, тионовые бактерии культивировали с технецием и пиритной рудой. За время инкубации (1 мес) рН раствора снизился с 3.20 до 2.43, и 200 мг/л трехвалентного железа было обнаружено в ростовой среде. При соосаждении восстановленного технеция с частицами руды и адсорбированными на них бактериями радиоактивность раствора уменьшилась на 40%.
Таблица 5. Удаление 99Tc из раствора тиобациллами, растущими на молекулярной сере, исходный объем раствора 4 мл, температура – 30 °C, время инкубации 7 сут.
Удаление 99Tc, Микроорганизм Условия Концентрация Остаточная радиоактивность, Bq* Tc, мг/л % A. ferrooxidans аэробные 50 0.69 0.62 Контроль (химический) 1.6 A. thiooxidans аэробные 40 0.36 0.13 анаэробные 0.46 0.35 64. Контроль (химический) 1.05 В отдельной серии экспериментов были определены допустимые концентрации технеция в очищаемых растворах, что обусловлено его токсичным действием на клетки бактерий (рис. 4). При добавлении пертехнетата (в различных концентрациях) в культуру бактерий A. ferrooxidans, растущих в оптимальных условиях на минеральной среде и окисляющих двухвалентное железо, токсический эффект технеция был выявлен при концентрациях Tc 500 мг/л и выше (Рис. 4, табл. 6).
Таким образом, обнаружена способность автотрофных тионовых бактерий в кислых условиях среды (рН 2.5) расти в анаэробно с использованием в качестве акцептора электронов семивалентного технеция, который восстанавливается до пяти и четырехвалентного состояния с образованием растворимого коллоида.
Таблица 6. Образование трехвалентного железа А.
и накопление биомассы тиобацилл в присутствии различных концентраций пертехнетата в аэробных условиях.
Исходная Концентрация Концентрация концентрация образованного белка к концу Fe3+, мг/л технеция, эксперимента, мг/л мг/л Б. 0 2500-2800 50 275-285 100 300 37. 250 50-60 500 0 750 0 Рис. 4. Аккумуляция пертехнетата клетками тиобацилл. Рентгеновский микроанализ клеток, выросших (А) - без пертехнетата и (Б) - в его присутствии (100 мг Tc/л).
1.4. Восстановление технеция в щелочных условиях На конечном этапе переработки жидкие радиоактивные отходы имеют преимущественно сильно щелочные значения среды (рН 9-13). Поэтому актуальным является изучение возможностей микробной трансформации технеция в этих условиях. В качестве биологических агентов использовали галоалкалофильные бактерии рода Halomonas, выделенные из содовых озер Монголии, Египта и Америки (Shapovalova et al, 2008).
Протестированные штаммы (Se1, Se3, Se4, Se5, AGJ 3, Mono) были способны восстанавливать семивалентный технеций (0.25 мМ) в анаэробных щелочных условиях. Рост галоалкалофильных бактерий сопровождался изменением окраски среды: прозрачная карбонатно-бикарбонатная среда становилась розовой через 23 ч роста, а через 10-12 дней бесцветной (рис. 5). Спектрофотометрический анализ показал наличие в среде Tc(IV) (512 нм) и Tc(III) (628 нм), а также, предположительно Tc(V) (418 нм), в дополнение к исходному Tc(VII) (290 нм) (рис.
5а, б, с). Никаких восстановленных форм технеция не обнаруживалось в контрольных образцах без бактериального роста, без донора электронов или в аэробных условиях (рис. 5а). Известно, что Tc(III) неустойчив в присутствии кислорода и мгновенно превращается в Tc(IV) - в опытах при нарушении анаэробных условий среда сразу окрашивалась в розовый цвет четырехвалентным технецием.
При этом пик Tc(III) при 628 нм полностью исчезал, а пик Tc(IV) при 512 нм увеличивался (рис. 5г). Если инкубирование продолжалось, то Tc(IV) восстанавливался до Tc(III), и раствор снова обесцвечивался.
По хроматографическим данным, количество восстановленных форм технеция Tc(IV) и Tc(III) через 3 сут инкубирования составляло около 62% от внесенного пертехнетата (0.25 мМ). Необходимо отметить, что восстановленные формы пертехнетата обладали существенно более низкой растворимостью, вследствие чего через 3 сут культивирования выпадало в осадок около 6% восстановленного продукта, а через 2 месяца – 25%.
Восстановленные формы технеция отличались растворимостью не только в воде, но и в других полярных растворителях, что может быть использовано в целях их идентификации, сорбции и удаления из растворов. В наших исследованиях при хроматографическом разделении восстановленных форм технеция, полученных при трансформации пертехнетата в качестве подвижной фазы, использовали: (1) 0.3 N HCl, (2) 0.9% NaCl и (3) ацетон. В системе (1) были растворимы Tc(VII), Tc(IV) и нерастворим Tc(V);
в системе (2) хорошо растворим Tc(IV)-комплекс и нерастворим Tc(IV)O2;
а в системе (3) растворим только семивалентный технеций (пертехнетат), тогда как все восстановленные формы технеция были нерастворимы.
Последовательное хроматографическое разделение восстановленных форм технеция в указанных системах полярных растворителей позволило выявить такие его формы, как отрицательно заряженный растворимый Tc(IV)-комплекс и электро-нейтральный TcO2. Что касается структуры Tc(IV)-комплекса, то, согласно литературным данным (Eriksen et al, 1992), возможно существование нескольких форм: TcO(OH)2 (aq), TcO(OH)3-, Tc(OH)2CO3 и TcIVO(OH)3(CO3)-. При этом в условиях эксперимента в области рН 8 – 11 и в карбонатной среде анионный комплекс TcIVO(OH)3(CO3) является доминантным.
Рис.5. Спектрофотометрический анализ бактериального восстановления TcVIIO4- на примере штамма Моно (концентрация клеточного белка 0,035 мг/мл). Tc(VII) = 290 nm, Tc(IV) = nm, Tc(III) = 628 nm. A - контроль;
время культивирования Б - 23 ч;
C - 12 сут;
Д - 12 сут при добавлении кислорода воздуха.
Динамика восстановления семивалентного технеция была изучена для Halomonas sp. штамм Моно при культивировании на минеральной карбонатной среде в течение 34 ч и 2 мес (рис. 6). Бактериальное восстановление технеция протекает как двухфазный процесс: первая - очень быстрая, когда 55% Tc(VII) остается в невосстановленном состоянии, 36% обнаруживался как Tc(IV) и 8 % - как Tc(V);
и вторая, длившаяся недели, когда восстановление технеция (до 80%) продолжалось с низкой скоростью.
Б.
А.
Tc(VII) в среде, % Tc(VII) в среде, % 40 0 0 10 20 30 40 0 20 40 Время, сут Время, ч Рис. 6. Динамика бактериального восстановления пертехнетата (TcO4-) в культуре Halomonas sp, штамм Моно, в течение 34 ч (А) и 2 мес (Б). () – химический контроль 1, () – контроль 2, мертвая биомасса, () - Tc(VII) и () – Tc-восстановленный в супернатанте. Представлены средние значения из 4-х повторностей.
Реакции восстановления семивалентного технеция в щелочных условиях были возможны только в присутствии доноров органической природы. Все из апробированных соединений поддерживали реакцию восстановления (табл. 7).
Так же, как и при восстановлении пертехнетата в кислых условиях, для вариантов трансформации в щелочных условиях были определены допустимые концентрации, не вызывающие выраженного токсического эффекта у галоалкалофильных бактерий, штамм Моно, о чем судили по сохранению клетками восстановительной активности (табл. 8). При концентрациях пертехнетата 1.5 мМ и выше практически не наблюдалось восстановления исходного Tc(VII).
Таблица 7. Восстановление TcVIIO4- суспензией клеток штамма Моно, инкубация 28 ч. * Донор электронов Формы технеция в супернатанте (%) Tc(VII) Tc(IV) Tc(V) 65.0 ± 1 32 ± 1 3 ± 0. Формиат 67.0 ± 0.5 28.9 ± 0.5 4 ± 0. Ацетат 68.0 ± 0.75 28 ± 0.75 3 ± 0. Лактат 69.0 ± 0.2 29 ± 0.2 2 ± 0. Метанол 68.8 ± 0.2 28.8 ± 0.2 2.4 ± 0. Этанол 100.0 ± Контроль без бактерий 0 100.0 ± 1. Контроль без донора е 0 *Концентрация белка в опыте 0.035 мг/мл. Концентрация доноров 10мМ, [TcO4-] = 0.25 mM.
Количественное определение разновалентных форм технеция проведено с помощью PhosphorImager и подтверждено экстракционным методом. Все данные представлены как.
среднее из 2-х повторностей.
Таблица 8. Токсическое влияние различных концентраций технеция на восстановление пертехнетата суспензией клеток штамма Моно. * Tc в эксперименте (mM) Формы технеция в супернатанте (%) Tc(VII) Tc(IV) Tc(V) 62.4 ± 1 29.2 ± 1 8.4 ± 0,25 (100%) 82.6 ± 1.75 11.6 ± 1.75 5.8 ± 0,50 (100%) 94.5 ± 0.7 3.5 ± 0.4 2.0 ± 0. 1,00 (100%) 96.3 ± 1 2.6 ± 0.5 1.0 ± 0. 1,50 (100%) 98.4 ± 2 1.0 ± 0.2 0.5 ± 0. 2,00 (100%) *Концентрация белка в опыте 0.035 мг/мл. Количественное определение разновалентных форм технеция проведено с помощью PhosphorImager и подтверждено экстракционными методами.
Все данные представлены как среднее из 2-х повторностей.
Приведенные выше результаты получены впервые и потому не принимались в расчет другими при исследованиях трансформации радиоактивных элементов.
Вместе с тем, при разработке биотехнологий очистки радиоактивных отходов необходимо учитывать метаболические возможности как ацидофильных, так и алкалофильных бактерий, а не только их преобразование при нейтральных значениях рН, как принято в настоящее время. Мы полагаем, что галоалкалофильные гетеротрофные микроорганизмы, растущие на широком спектре субстратов и обладающие устойчивостью к высоким (до 500 мг/л) концентрациям технеция, перспективны в разработке биологической очистки низкоактивных ядерных отходов.
2. Микробное восстановление хромата 2.1 Восстановление хромата галоалкалофильными бактериями в аэробных и анаэробных условиях При переработке ядерных отходов, а также при сжигании минерального топлива накапливается большое количество хроматов, что ставит вопрос об очистке соответствующих промышленных стоков, имеющих высокие значения рН. Поэтому нами изучалась возможность использования для этой цели бактерий рода Halomonas. Работу проводили со штаммами, выделенными из проб воды и почв Кулунды, Монголии, Египта и Америки (США), для которых было определено филогенетическое положение (Se1, Se2, Se3, Se4, Se5, Mono, AGD 1, 12, 3 8-1, 8-2, 8-3, AGD KS) (рис. 7). Все штаммы оказались способны восстанавливать хромат при щелочных значениях рН среды как в аэробных, так и в анаэробных условиях (рис.8). При этом штаммы AGD, выделенные и растущие при высокой солености среды (2.4 М Na+, рН 9.8) более эффективно восстанавливали хромат в аэробных условиях (рис. 8, 9). Дальнейшие исследования, проведенные со штаммами, способными восстанавливать хромат аммония при аэробном росте в минеральной среде с ацетатом при рН 9,5, показали зависимость эффективности восстановления от исходной концентрации хрома в среде (рис. 9). Максимальное количество полностью восстановленного шестивалентного хрома в таких условиях составляло 1 мг/(л сут).
Восстановление хромата, % Восстановленный хром, % 60 40 0 10 20 AGD 3 AGD 8-2 Se D AGD K- Начальная концентрация Cr(VI), мг/л Штамм Рис.8. Восстановление хрома (VI) при Рис.9. Динамика восстановления хромата в аэробном и анаэробном культивировании аэробных щелочных условиях штаммами изучаемых галоалкалофильных бактерий. галоалкалофильных бактерий.
1 – аэробные и 2 – анаэробные условия. 1 – AGD 8-2;
2 – Моно;
3 – AGD 3.
Halomonas eurihalina ATCC 49336T, X 0.02 T 94 Halomonas elongata ATCC 33173, M T Halomonas halmophila ATCC 19717, AJ T 100 Halomonas salina F8-11, AJ Halomonas halophila DSM 4770T, M T Halomonas maura S-31, AJ T Halomonas pacifica DSM 4742, L Halomonas cupida DSM 4740T, L T Halomonas ventosae Al12, AY Halomonas halodenitrificans ATCC 13511T, L Halomonas halodenitrificans ATCC 13511T, L Halomonas halocynthiae KMM 1376T, AJ natronophila’ Z- ‘Halomonas SE SE AGj3_part SED mono AG1-3 part AG4 T 97 Halomonas campaniensis DSM 15293, AJ HLEBR4 T Halomonas campisalis ATCC 700597, AF Z-7398 part AGD1 part AGD2-1 part AGD AGDK- AGD8- AGD8- AGM CHG7-3 part Halomonas aquamarina DS40M3, AF Halomonas axialensis DSM 15723, AF Halomonas meridiana DSM 5425, AJ Halomonas nitritophilus IB-Ar4, AJ ‘Halomonas kenyensis’ air- AHBr2 part T Halomonas desiderata FB2, X nitrilicus’ ANL alphaCH ‘Halomonas Se1 part Se2 part AHBr1 part AGMa1 T Halomonas pantelleriensis AAP, X T Halomonas anticariensis FP35, AY T Halomonas muralis LMG 20969, AJ Рис.7. Филогенетическое положение выделенных изолятов рода Halomonas.
2.2 Условия восстановления хромата галоалкалофильными бактериями Динамика восстановления Cr (VI) имела следующие особенности. Культура, растущая в среде с хромом, имела удлиненную лаг-фазу с последующим экспоненциальным ростом. Восстановление хромата начиналось, когда количество биомассы увеличивалось ~ в 10 раз и сопровождалось накоплением биомассы, снижением скорости роста культуры, которая восстанавливалась до значений экспоненциальной фазы, когда более 80% хромата было детоксифицировано (рис.
10а). При этом наблюдали непрерывное увеличение биомассы.
А. 12 1 60 Рис.10. Динамика аэробного 9 восстановления хромата Cr (VI), мг/л Белок, мг/л аммония 40 галоалкалофильной бактерией Halomonas штамм AGD 8-3.
20 А – при однократном внесении хромата и ацетата.
Б – при многократном 0 0 внесении хромата и ацетата.
0 50 100 150 200 1 – накопление биомассы, 2- восстановление хромата в Время, ч аэробных условиях.
18 Б.
Белок, мг/л Cr (VI), мг/л 9 0 0 100 200 300 400 500 Время, ч Следующей важной особенностью галоалкалофильной бактерии Halomonas штамм AGD 8-3 была способность адаптироваться к повышающимся концентрациям хромата в среде (рис. 10б). В эксперименте восстанавливаемый субстрат вносили в развивающуюся культуру дробно в возрастающих концентрациях, каждый раз после полного восстановления хромата в предыдущей порции (рис. 10б). Такая схема восстановления токсичного оксианиона хрома представляет интерес для биотехнологий детоксификации соответствующих промышленных стоков, поскольку при одинаковой продуктивности восстановленного хрома не требуется дополнительных манипуляций с культивированием бактерий.
Другой прием восстановления хромата с использованием сгущенных суспензий клеток позволил увеличить его первоначальную концентрацию до 30 мг/л. В этой серии экспериментов было продемонстрировано, что процесс восстановления хромата, также как и трансформации технеция, осуществляется только живыми активными клетками и только в присутствии донора электронов, в данном случае ацетата (рис. 11).
Рис. 11. Восстановление Концентрация Cr (VI), мг/л хромата аммония галоалкалофильной бактерией Halomonas штамм AGD 8-3:
15 1 – живые клетки, 2 – убитые клетки, 3 – живые клетки, в среде отсутствует ацетат.
0 20 40 60 80 Время, ч Так как способность галоалкалофильных бактерий восстанавливать хромат была показана нами впервые и исследования с типовыми штаммами рода Halomonas ранее не проводились, в отдельной серии экспериментов была оценена способность к восстановлению этого оксианиона наиболее филогенетически близкими (рис. 7) к штамму AGD 8-3 видами: Halomonas campisalisT, H. desiderataT, H. campaniensisT, а также штаммами H. campisalis Z-7398, ‘H. kenyensis’ (AIR-2), ‘H. natronophila’(Z 7009) (рис. 12). Эффективность восстановления хромата убывала в ряду: штамм AGD 8-3 – 100%, штамм H. campisalis – 50%, штамм H. desiderata - 35%, штаммы ‘H.
kenyensis’ и ‘H. natronophila’ – 25%, штамм H. campaniensisT – около 5%.
Исходя из относительно низкого уровня филогенетического сходства и особенностей фенотипа, штамм AGD 8-3 предлагается выделить в новый вид Halomonas chromatireducens sp. nov..
Cr (VI), % AGD 8- Cr(III),% H. campisalis (T) H. campisalis (Z-7398) H. desiderata H.kenyensis' H. natronophila' H. campaniensis контроль 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Рис.12. Аэробное восстановление хромата (5 мг Cr/л) культурами типовых штаммов галоалкалофильных бактерий рода Halomonas и нового вида. Контроль – среда без бактерий.
Необходимо также отметить тот факт, что только в очень ограниченном числе исследований обращается внимание на содержание в среде для восстановления тяжелых металлов комплексного органического вещества. Вместе с тем известно, что сложные разветвленные соединения способны образовывать различного рода комплексы с тяжелыми металлами, иммобилизовывать или хелатировать их.
Модельные эксперименты с использованием дрожжевого экстракта показали, что комплексная органика временно иммобилизует хром, в результате чего токсическая нагрузка на клетку снижается. Если в минеральной среде галоалкалофильные бактерии были способны расти только при концентрации хромата 1 мМ, то в присутствии органики рост бактерий наблюдался вплоть до концентрации 20 мМ.
Надо отметить, что высокие дозы хромата оказывают токсическое действие на ферментные системы бактерий, и восстановление шестивалентного хрома замедляется, а при содержании выше 10 мМ – прекращается (рис. 13б). ).
Из этого раздела исследований следует общий вывод – доказательство высокой восстанавливающей способности галоалкалофильных бактерий в отношении Cr(VI), что позволяет рекомендовать эту группу бактерий для аэробного процесса трансформации высокотоксичного Cr(VI) в менее токсичный Cr(III). При построении биотехнологических схем очистки отходов соответствующих промышленных стоков эти данные должны также учитываться.
Накопление биомассы С_ А 1, С_ 1,2 С_ 1 С_ OD С_ 0, С_ 0, 0, 0, 0 2 4 Время, дни Б 0,1 мМ Концентрация хрома, мМ 1 мМ 2 мМ 4 3 мМ 4 мМ 5 мМ 6 мМ 7 мМ 0 5 10 Время, сут 8 мМ Рис.13. А - Накопление биомассы галоалкалофилов в органической среде с хроматом (мг/л) и дрожжевым экстрактом. Б – восстановление шестивалентного хрома.
3. Бактериальное восстановление шестивалентного урана Способность к энзиматическому восстановлению шестивалентного урана была выявлена у ряда сульфат- и железо-редуцирующих бактерий. Некоторые мезофильные бактерии оказались способны не только восстанавливать уран (VI), но и получать при этом метаболическую энергию, необходимую для роста (Geobacter, Shewanella, Desulfotomaculum), в то время как другие были способны только к восстановлению (Desulfovibrio). Несколько видов термофильных бактерий (включая Thermus scotoductus, Pyrobaculum islandicum, Thermoanaerobacter sp.) обладали способностью энзиматически восстанавливать U(VI), однако роста клеток не наблюдалось. Во всех экспериментах шестивалентный уран использовался в форме растворимых уранил-ацетата, уранил-нитрата или уранил-хлорида, которые в бикарбонатной среде образуют слабо растворимый уранил-карбонатный комплекс.
В нашей работе впервые исследовано восстановление U(VI) термофильной грамположительной железоредуцирующей бактерией Carboxydothermus ferrireducens.
Бактерии культивировали в анаэробных условиях при 65°С в бикарбонатной буферной среде (рН7) с глицерином и дрожжевым экстрактом, в которую добавляли уранил-ацетат. Сразу после внесения уранил-ацетата (1-2,5 мМ), в культуральной среде наблюдали образование желтого рыхлого осадка, через 48-72 ч инкубирования цвет осадка изменялся с желтого на серый при значительном снижении концентрации U(VI) и одновременном увеличении количества клеток (рис. 14).
Спектральный анализ исходного желтого осадка показал, что уран находится в виде шестивалентного фосфата – урамфита, [(NH4)(UO2)(PO4) х3H2O], с характерными линиями при 5.557, 3.799, 3.509, 3.279, 2.780, 2.179, 2.160, 1.698 A° (рис. 15а), тогда как в составе серого осадка присутствовал четырехвалентный уран - нингиоит, [CaU(PO4)2 хH2O], с характерными линиями при 4.333, 3.022, 2.809, 2.349, 2.128, 1.844, 1.736, 1.691A° (рис. 15б), что было подтверждено дополнительными анализами (X-ray absorption near-edge spectroscopy, EXAFS). Допустимые концентрации U(VI) составили 1-2.5 мМ, в этих вариантах через 68 ч инкубирования восстанавливалось 80-90% урана от исходного уровня, тогда как при концентрациях U(VI) 5 и 10 мМ ни роста бактерий, ни восстановления урана не наблюдалось (рис.15в). В дополнительных экспериментах было установлено, что при внесении урана в концентрациях 1-2.5 мМ большая его часть находится в виде осадка, и бактерии восстанавливают U(VI) из твердой фазы. Отметим, что C. ferrireducens использует шестивалентный уран в качестве акцептора электронов в процессе роста, так как параллельно восстановлению U(VI) увеличивалось количество клеток (рис. 14).
Таким образом, нами впервые установлен процесс внеклеточного восстановления U(VI) до U(IV) термофильной железоредуцирующей бактерией Carboxydothermus ferrireducens Уран, дрож. экстракт, глицерин, кол-во клеток, x Fe Уран, дрож. экстракт, глицерин Дрож. экстракт, глицерин, фумарат Уран, дрож. экстракт 2 Дрож. экстракт, глицерин, Fe Дрож. экстракт, глицерин 0 10 20 30 40 Время, ч Рис. 14. Рост C. ferrireducens при различных условиях.
В А Б 2, ) - U(VI) (mmole litre 1, 0,5 0 20 40 60 урамфит нингиоит T (hours) ime NH4)(UO2)(PO4)·3H2O CaU(PO4)2·H2O Рис. 15. Восстановление шестивалентного урана термофильной бактерией C. ferrireducens.
Дифракционный анализ исходного урамфита (А), в котором уран находится в виде U(VI) и полученного нингиоита (Б), где уран в виде U(IV). (В) Динамика восстановления шестивалентного урана в растворе при 65 С: 1 – химический контроль;
2 – культура C. ferrireducens, 3 – шестивалентный уран в осадке.
4. Трансформация долгоживущих радионуклидов илами пресноводных озер 4.1. Сравнительный анализ сорбции радионуклидов илами пресноводных озер Экологический мониторинг, проведенный в разных странах, выявил высокие уровни загрязненности среды радионуклидами, обусловленный как захоронением низкоактивных отходов непосредственно в грунты, так и последствиями техногенных катастроф и аварий. При этом достоверно зафиксировано, что радионуклиды, находящиеся в анионной форме мигрируют вместе с грунтовыми водами. В частности, технеций был обнаружен в грунтовых водах в районе завода Хэнфорд, перерабатывающего ядерные отходы (США) (Brown, 1967), в водах реки Рона ниже Маркульского Ядерного центра (Франция) (Barci-Funel et al., 1991), а нептуний-237 был обнаружен в водной системе реки Снейк, штат Айдахо, США (Beasley et al., 1998). Поэтому актуальным было проведение модельных исследований поведения долгоживущих радионуклидов Tc, Pu, Np, Cm, Am в илах пресноводных озер разного типа трофии.
Для исследований были выбраны два характерных озера: высокопродуктивное эвтрофное (Белое Косино, Московской области) и дистрофное (р-н Шатуры), в котором органический материал представлен преимущественно гуминовыми и фульвокислотами. В образцах ила и придонной воды соотношение взвешенных частиц и воды (по объему) составило 1 : 3 для обоих озер, соотношение твердой/жидкой фаз – 0.035 и 0.030 г/мл для евтрофного и дистрофного озер, соответственно. Модельные эксперименты проводили при естественном освещении без дополнительного подогрева и перемешивания при внесении в образцы Pu-239 и Cm-244. Итак, показано, что в течение 4.5 мес эксперимента имело место полное удаление радионуклидов из растворов, однако для каждой группы образцов были отмечены интересные особенности.
Сорбция плутония и кюрия илами пресноводного евтрофного озера в экспериментальных условиях составила 98-99%. При этом стерилизованный ил также сорбировал актиноиды, но менее полно, чем нативный. Поэтому сорбцию актиноидов естественными илами следует рассматривать как состоящую из двух процессов: (1) физико-химической сорбции, происходящей только за счет физико-химических взаимодействий и имеющей место в случаях, как мертвой, так и живой биомассы, и (2) биологической (биохимической) сорбции, связанной с метаболической активностью клеток. Обнаружено, что в исследуемых условиях биосорбция (62-66%) заметно превосходила физико-химическую (34-38%) (табл. 9).
Таблица 9. Удаление Pu-239 и Cm-244 нативным и стерильным илами. * Радионуклид Удельная радиоактивность раствора, Бк/мл В начале опыта В конце Стерильный ил Нативный ил Стерильный ил Нативный ил 1200 1100 800 (66%) 0.8 (0.07%) Pu- 3700 3600 2300 (62%) 50 (1.5%) Cm- * Время эксперимента 4.5 мес. Остаточная радиоактивность раствора выражена в % по отношению к начальной концентрации.
4.2. Условия сорбции радионуклидов озерными илами Как отмечено выше, сорбция актиноидов характеризовалась двумя фазами поглощения – быстрого и медленного. При сорбции нептуния в течение первой фазы (1-2 ч) сорбировалось до 60% и 50% от начального количества для евтрофного и дистрофного озер, соответственно. Фаза медленного поглощения, приводящая к полному удалению радионуклидов, длится 1 -– 2 месяца (рис. 16а).
Экспериментальные данные для варианта удаления нептуния достаточно хорошо описываются уравнениями: у1= -31х +100 (R2= 1) для начальной фазы быстрой сорбции, и у2= 0.0186х2 – 1.7015х + 35.8669 (R2= 0.97) для второй фазы медленной сорбции. Нептуний сорбировался илом евтрофного озера с коэффициентом концентрирования 1428.
При удалении технеция из водной среды скорость его сорбции была постоянной в течение 1 мес, а затем снизилась. Время полувыведения составило 0.5 и 1 мес для евтрофного и дистрофного озер соответственно;
99.5%-ная сорбция фиксировалась через 1 мес в случае евтрофного и через 2.5 мес в случае дистрофного озер, соответственно (рис. 16б). Коэффициент концентрирования технеция илом евтрофного озера составил 808, илом дистрофного – 660. Показано, что поглощение технеция-99 илами евтрофного озера слабо зависело от температуры: время полувыведения увеличивалось с 16 до 18 сут при снижении температуры эксперимента с 22 °С до 6 °С. Введение дополнительных доноров или акцепторов электронов значительно влияло на эффективность поглощения технеция илами евтрофного озера (рис. 16в). Лактат или растительное органическое вещество (резаный тростник) как доноры электронов ускоряли поглощение технеция, время полувыведение технеция сокращалось вдвое, до 10 сут вместо 20 (рис. 16в). Введение сульфата или нитрата, как энергетически более выгодных акцепторов электронов, создавало конкурентные взаимоотношения с пертехнетатом и снижало эффективность его поглощения, поэтому время полувыведения технеция увеличивалось до 30 сут вместо 20 сут (рис. 16в).
Было отмечено, что илы пресноводного евтрофного озера, имеющие значительную поглотительную способность, сохраняли ее длительное время. Так, при многократном внесении технеция в течение года в один и тот же культиватор с илом он каждый раз поглощался полностью (рис. 17).
А. Б.
[Me] в водной фазе, % Tc-99 в водной фазе, % 60 40 20 0 0 20 40 60 0 20 40 Время, сут Время, сут В.
Рис. 16. Удаление радионуклидов илами пресноводных озер. А. Удаление технеция- Тс-99 в водной фазе, % 80 (n) и нептуния-237 () илом евтрофного озера.
Б. Удаление технеция-99 илами эвтрофного 60 (n) и дистрофного (g) озер, t=15 °C, [Tc]o= 10- M. В. Конкурентное влияние субстрата на 40 удаление технеция-99 илом эвтрофного озера, t=22 °C, твердая фаза – 0.035 мг/мл. Условия:
Что касается технеция, скорость () – без добавок, () – 100 мг/л NO3-, (g) – сорбции была постоянной в пределах 100 мг/л SO42-, (n) – 100 мг/л лактата, () – 1200 мг/л тростника.
экспериментальной точности и время 20 40 Время, сут В модельных опытах с илом дистрофного озера было показано, что к концу экспериментов около 3% технеция и 30% нептуния образовывали растворимые комплексы с гуминовыми кислотами (концентрация около 0.5%), которые выпадали из раствора в осадок при подкислении до рН 1. При этом в воде евтрофного озера концентрация гуминовых кислот составляла не более 0.005%, и поэтому во фракции связанного с ними нептуния его количество не превышало 1%.
Для индикации форм радионуклидов (на примере Tc-99), сорбируемых в водоемах иловой массой, был применен прием их десорбции (из ила евтрофного озера) при использовании селективных десорбентов: H2O, 1M HCl, 1M NaClO4 (эффективный десорбент пертехнетата в хроматографических процессах), а также 15% H2O2 (в данных условиях окисляет большинство соединений технеция до Тс(VII)). Доля десорбированного технеция по радиоактивности составила соответственно 0.05;
0.05;
0.08 и более 0.99 (рис.18). Эти результаты свидетельствуют о том, что технеций поглощается илами в виде восстановленных химических форм, которые образуются в результате деятельности микроорганизмов, по-видимому, в виде Tc(IV), что было показано нами для процессов, осуществляемых сульфатредуцирующими бактериями [гл. 1.2.2 – 1.2.4]. Таким образом, именно бактериальное восстановление является основным механизмом удаления технеция из растворов. Приведенные результаты перспективны для разработки эффективных недорогих и экологически безопасных методов очистки радиоактивных растворов.
T c-99 в водн ой ф азе, % Tc-99 в водной фазе, % 20 0 H2O HCl NaClO4 H2O 0 1 2 3 4 5 Десорбент Время, мес Рис.17. Удаление технеция-99 илом Рис.18. Десорбция Tc-99 различными евтрофного озера, т=18 С, [Tc]0=10-4 M десорбентами при многократном введении радионуклида.
4.3. Детекция зонального распределения радионуклидов между илами и водной средой Исследования, имеющие целью детектировать микрозональное распределение и зоны активного воздействия микроорганизмов на радионуклиды, были проведены нами на примере плутония-238 с использованием донных отложений, отобранных у о. Атамановский (р. Енисей). Эксперименты по аккумулированию плутония природным илом моделировали ситуации, возможные при выбросе радиоактивных отходов в окружающую среду. Поскольку при традиционном отборе проб иловых отложений нарушается их целостность, что искажает интерпретацию результатов, то впервые для подобных наблюдений был применен комплексный подход, Исследования выполнены совместно с сотрудниками каф. радиохимии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова включающий использование системы детекторов – (1) стекла обрастания для наблюдения за микробным сообществом, (2) альфа-трековый детектор типа «CZ» и (3) комбинированный альфа-трековый детектор для определения зональной радиоактивности, а также (4) традиционный пробоотбор воды для измерения в ней альфа-активности.
Через 2,5 мес инкубирования образцов донных отложений остаточная радиоактивность раствора составила 3% в вариантах с нативной системой и 67% в вариантах со стерилизованной. Альфа-трековый детектор, расположенный в инкубируемом образце 1, показал выраженное зональное распределение радиоактивности: ее повышение в верхней пленке, на границе воздух-вода – 500- Бк/м2 и зону высокой альфа-активности – 3000-4000 Бк/м2, на границе вода-осадок.
При этом в водной толще наблюдали равномерное распределение альфа-активности – Бк/м2.
100-250 Рентгеновский микроанализ стекол обрастания и данные комбинированного детектора подтвердили зональное распределение анализируемого как Pu-328, так и основных биогенных элементов. Активное развитие микробного сообщества наблюдалось в поверхностной пленке на границе воздух-вода. В иловых отложениях фиксировали изменение цвета ила и появление резкой границы между темной и более светлой полосами, обусловленные развитием бактериального сообщества в иловой зоне. Исследование альгобактериального сообщества показало присутствие в донных отложениях диатомовых водорослей родов Nitzchia, Cymbella, Cocconeis, а в поверхностной пленке Melosira sp.
Таким образом, комплекс методических приемов, включая применение альфа трековых детекторов, позволил, не нарушая целостности иловых отложений, определить зональное распределение актиноидов в донных отложениях и выявить зоны активного воздействия микроорганизмов на радионуклиды (на примере плутония-238).
Проведенные нами эксперименты убедительно продемонстрировали, что технеций-99, нептуний-237, плутоний-239 и кюрий-244 сорбируются илами пресноводных озер как евтрофного, так и дистрофного типа. При этом в течение одного летнего сезона может иметь место полное удаление радионуклидов из пресноводных водоемов, что, с одной стороны, демонстрирует важную роль микробиоты в процессах самоочистки биосферы водоемов, а с другой – может быть использовано в соответствующих биотехнологиях их очистки.
5. Токсическое действие катионов и анионов тяжелых металлов и радионуклидов на почвенные микроорганизмы 5.1. Исследование бактериального сообщества почв, загрязненных никелем и ураном Исследования проводили с образцами почв с высоким уровнем никеля и урана, отобранными (1999 г) на участке Savannah River Site (Ю. Каролина, США), который эксплуатировался более 50 лет как хранилище радиоактивных отходов. Помимо радиоактивных отходов, район загрязнен также органическими отходами, в частности, три- и тетрахлорэтиленом. В настоящее время место захоронения не эксплуатируется. В пробах загрязненных почв количество урана варьировало от 2. до 4900 мг/кг почв, никеля от 4.9 до 3200 мг/кг почв, рН 4.3-5.8. В контрольных пробах, взятых выше по течению от радиоактивного хранилища, концентрации урана составляли 3.8-10 мг/кг и никеля 1.2-3.3 мг/кг почв, рН 4.2-5.4.
Бактериальное сообщество загрязненных почв изучали при рассеве образцов на агаризованную модифицированную минеральную среду (4М), в которую в некоторых вариантах дополнительно вносили уран (U(VI)) и никель (Ni(II)) в концентрациях 10, 100, 1000 и 5000 мг/л. Численность микроорганизмов при инкубации посевов в аэробных условиях без дополнительного внесения металлов при рН 7 составила для образцов загрязненных почв 0.62 х106 КОЕ/г почвы (рис. 19). При этом в контрольных образцах почвы, взятых выше хранилища, число выросших колоний оказалось значительно выше – 1.045 х106 КОЕ/г почвы, что свидетельствует о постоянном ингибирующем факторе, присутствующем в загрязненных почвах. Хотя загрязненные и контрольные исследуемые почвы имели кислые значения рН среды 4.2-5.6, при посевах большее число колоний развивалось на средах с рН 6 и 7 (рис.
19). Бактериальные сообщества как загрязненных, так и контрольных почв были способны расти на средах с дополнительно внесенными ураном и никелем, при этом, соответственно при более высоких концентрациях никеля (до 85.2 мМ), чем урана (до 4.2 мМ) (рис. 19). Морфологически различающиеся колонии, выросшие в присутствии 85.2 мМ Ni при рН 5 (штамм NR-3) и при рН 6 (штаммы NR-1, NR-2 и NR-4), были изолированы, получены в виде чистых культур и идентифицированы, на основе данных 16S рДНК секвенирования как актинобактерии, играющие, как известно, важную роль в разложении органического вещества. Изоляты принадлежали к известным видам: Arthrobacter oxydans NR-1 (0.996), Streptomyces galbus NR-2 (0.992), Streptomyces aureofaciens NR-3 (1.000), Kitasatospora cystarginea NR-4 (0.964).
Чистая почва Чистая почва 1, рН 5 рН 1, КОЕ х 10 6 на г осадка КОЕ х 10 6 на г осадка 1, 1,2 рН 6 рН рН 7 рН 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0 0,04 0,42 4,2 21 0 0,17 1,7 17 85, Концентрация урана, мМ Концентрация никеля, мМ Загрязненная почва Загрязненная почва рН 5 рН 1, 1, КОЕ х 10 6 на г осадка КОЕ х 10 6 на г осадка 1, 1,2 рН 6 рН рН 7 рН 0, 0, 0,6 0, 0,4 0, 0, 0, 0 0,17 1,7 17 85, 0 0,04 0,42 4,2 Концентрация никеля, мМ Концентрация урана, мМ Рис. 19. Общее число аэробных органотрофных бактерий в загрязненной и контрольной пробах почв.
5.2. Условия, влияющие на токсичность никеля, кобальта, хрома и урана Была исследована устойчивость выделенных штаммов актинобактерий к двухвалентным катионам никеля и кобальта, а также к шестивалентным анионам хрома и урана, которые вносили в ростовые среды с различными значениями рН (5, 6, 7) в концентрациях (мг/л): никеля – 0-5000;
кобальта – 0-1000;
урана – 0-1000;
хрома – 0-250. По результатам анализа ростовых характеристик выделенных актинобактерий токсичность Ni2+ и Co2+ была больше выражена при рН 7, а шестивалентных анионов хрома и урана, напротив, при рН 5 (рис. 20). Так, рост штамма K. cystarginea NR-4 в присутствии никеля при рН 5 наблюдался при концентрацях от 0 до 5000 мг/л, при рН 6 в более узком диапазоне – от 0 до мг/л, а при рН 7 – только до 500 мг/л (рис. 20а). В вариантах внесения в среду хрома:
при рН 5 рост отсутствовал, при рН 6 фиксировали незначительное увеличение биомассы только для концентрации 50 мг/л, а при рН 7 для этой концентрации наблюдали достоверный рост культуры (рис. 20б).
А. 0 Ni 250 500 Ni 1000 Ni Белок, мг/л 2500 Ni 4000 Ni Рис.20. Влияние различных 100 5000 Ni концентраций никеля (А) и хрома (Б) на рост штамма (Kitasatospora cystarginea) NR-4 при различных рН 5 6 среды.
рН Б.
0 Cr 50 Cr Белок, мг/л 200 100 Cr 250 Cr 5 6 рН Так как глубинный рост выделенных штаммов актинобактерий был хуже в кислой среде (рН 5), чем при рН 6 и 7, в экспериментах по оценке влияния органических токсикантов-загрязнителей использовали модельный штамм Burkholderia vietnamiensis PR1301, способный разлагать трихлорэтилен в аэробных условиях (рН 5-7). В серии экспериментов определили ростовые характеристики штамма PR1301, культивируемого в присутствии урана или никеля, или совместно урана и никеля (рис. 21), в зависимости от рН среды. Сравнительный анализ выявил:
(1) усиление токсичности сочетанного действия металлов при рН 7, по сравнению с рН 5;
(2) зависимость удельного вклада U или Ni в общую токсичность от рН среды роста. В среде с рН 5 больший удельный вклад в общую токсичность вносил уран, а в среде с рН 7 – двухвалентный никель.
Интерес представляла возможность снижения токсического воздействия никеля и урана на микробное сообщество. В модельных экспериментах в среду роста добавляли гидроксиапатит, который сорбировал металлы, вследствие чего общая токсичность среды снижалась (рис. 22). При этом зависимость детоксифицирующего действия гидроксиапатита от рН среды сохранялась. Так, при рН 7 и концентрации урана 500 мг/л и никеля 100 мг/л среды добавление 0.05 г/мл гидроксиапатита полностью снимало токсическое действие металлов. Однако даже в присутствии гидроксиапатита токсическое действие высокой концентрации (1000 мг/л) никеля сохранялось (рис. 22). Отметим, что при рН 5 гидроксиапатит снижал токсическое действие урана и никеля во всех вариантах.
Анализ бактериальных сообществ почв, загрязненных радионуклидами и органическими токсикантами, и фоновых почв выявил высокий потенциал их устойчивости к дополнительным токсическим воздействиям, который был существенно больше у сообществ фоновых почв. При совместном действии металлов (U и Ni) их удельный вклад в суммарную токсичность зависел от рН среды и проявлялся больше у урана при рН 5, а у никеля – при рН 7.
Такие природные сорбенты, как гидроксиапатит, позволяют снизить эту токсичность и обеспечить рост бактерий, в том числе, разлагающих такие органические токсиканты, как трихлорэтилен. Полученные результаты представляют интерес для разработки биотехнологии биоремедиации почв и защиты микробных популяций в случае техногенных катастроф и ситуаций, обусловливающих загрязнение среды значительными количествами радионуклидов, тяжелых металлов и сопутствующей токсичной органики.
0 U + 0 Ni 0, 100 U + 50 Ni 0, 100 U + 100 Ni 250 U + 50 Ni 0, 250 U + 100 Ni 250 U + 1000 Ni 0, 500 U + 50 Ni 0, 500 U + 100 Ni 5 Рис. 21. Аэробный рост модельного штамма PR1 при одновременном присутствии никеля и урана в среде.
90 0U/0Ni + ГА 100 U-50 Ni-Ha 100U-100Ni-Ha 50 250U-50Ni-Ha 250U-100Ni-HA 250U-1000Ni-HA 500U-50Ni-HA 0 500 U-100Ni-Ha 5 Рис. 22. Рост модельного штамма Burkholderia vietnamiensis PR1 при одновременном присутствии никеля и урана и добавлении гидроксиапатита (ГА) в культуральную среду.
5.3. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям тяжелых металлов Способность микроорганизмов выживать, адаптироваться и функционировать в ситуациях неблагоприятных воздействий на них факторов окружающей среды является основной биологической проблемой. Изучение механизмов формирования адаптивного ответа микроорганизмов в этих условиях представляет безусловный интерес ввиду постоянно нарастающего давления на биосферу антропогенный загрязнений. Во многих исследованиях особое место в комплексе механизмов адаптации занимают ферменты азотного обмена, в том числе нитратредуктаза. За более чем 50-летнюю историю изучения механизмов восстановления нитратов был выделен и охарактеризован целый ряд нитратредуктаз, содержащих в активном центре молибден в составе молибденового кофактора. Эти классические нитратредуктазы нестабильны при различных стрессорных воздействиях, таких, как высокие концентрации солей, экстремально высокие (9.0) или низкие (3.0) значения рН, температурные воздействия и влияние тяжелых металлов. В подобных стрессовых условиях фермент либо разрушается полностью, либо теряет в значительной степени свою активность Из клеток ванадатвосстанавливающей бактерии Pseudomonas isachenkovii нами были выделены две нитратредуктазы (периплазматическая и мембраносвязанная, гл.
1.2.1), не содержащие, как оказалось, в своем составе молибден и молибденовый кофактор (Antipov et al., 1998), что позволило предположить существование альтернативных ниратредуктаз. Бактерия P. isachenkovii была изолирована из кишечника морских асцидий с повышенным содержанием ванадия в крови (18%).
Культура оказалась устойчивой к токсическому действию ванадата в среде (до 6 г/л) и был способен восстанавливать в анаэробных условиях пятивалентный ванадий до четырех- и трехвалентного состояния (Ляликова, Юркова, 1986), используя ванадат как конечный акцептор электронов при анаэробном дыхании. Мы рассматриваем альтернативные нитратредуктазы как возможные участники восстановления технеция.
При анаэробном выращивании клеток Halomonas sp., штамм AGJ1-3, в присутствии 1 мМ вольфрамата не наблюдали ингибирование денитрификации, что указывало на синтез клетками альтернативной нитратредуктазы, которая была выделена и охарактеризована (Антипов и др., 2005). Помимо нитрата и нитрита, выделенный фермент был способен восстанавливать хлорат, что также указывает на его принадлежность к диссимиляторным дыхательным нитратредуктазам. Отмечено, что фермент оказался довольно устойчивым к воздействию высоких концентраций NaCl. В отличие от классических нитратредуктаз, у которых температурный оптимум составлял 30-40 С, у всех выделенных альтернативных нитратредуктаз оптимум был определен при 70-80 С (P. isachenkovii, Halomonas sp., штаммы AGJ1-3 и Моно).
Обнаружено, что некоторые из выделенных нами штаммов рода Halomonas (AGJ1-3, Моно, Se1, Se2, Se3, Se4, Se5), оказались способны наряду с нитратом восстанавливать ванадат, хромат, селенат, селенит и пертехнетат (гл. 2). Из штамма Моно была выделена и очищена нитратредуктаза, восстанавливающая нитрат, ванадат и селенат (Антипов, 2010). При этом на всех стадиях роста культуры активность и уровень экспрессии нитратредуктазы в клетках оставались на постоянном уровне. Хотя активнось очищенных ферментов не проверялась в отношении восстановления хромата или пертехнетата, мы полагаем, наиболее вероятным участие этих альтернативных нитратредуктаз галоалкалофильных и ванадатвосстанавливающих бактерий в процессе восстановления токсичных и радиоактивных оксианионов.
Приведенные данные указывают на универсальную роль и полиредуктазную активность безмолибденовых нитратредуктаз в метаболизме микроорганизмов различных таксономических групп. Возможно, появление в ходе эволюции широкой субстратной специфичности фермента - один из механизмов адаптации организмов к экстремальным условиям среды обитания.