Молекулярный механизм функционирования терминальных оксидаз типа bd

На правах рукописи

БОРИСОВ Виталий Борисович МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ ТИПА bd 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2008 2

Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич

Ведущая организация: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Защита состоится “17” ноября 2008 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан “” 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работа посвящена актуальной проблеме биохимии изучению механизмов преобразования энергии у бактерий на молекулярном уровне.

Запасание энергии в дыхательной цепи аэробных бактерий осуществляется за счет электрогенного переноса H+ или Na+ из цитоплазмы в периплазматическое пространство.

Создаваемая при этом на цитоплазматической мембране протон- или натрий-движущая сила используется клеткой для энергообеспечения основных типов работы: химической, осмотической, механической. В дыхательной цепи электроны по градиенту редокс потенциала последовательно передаются от НАДН на О2 с помощью нескольких ферментных комплексов. Терминальная оксидаза является концевым ферментным комплексом дыхательной цепи. Обнаружено два класса терминальных оксидаз: гем/Cu-содержащие ферменты и цитохромы bd. Про гем-медные оксидазы известно уже довольно много. В частности, с помощью рентгеноструктурного анализа удалось увидеть трехмерную структуру гем-медных оксидаз из сердца быка и ряда бактерий. Цитохром bd не имеет гомологии с гем медными оксидазами, не содержит меди, но способен генерировать мембранный потенциал.

По сравнению с гем-медными оксидазами, цитохром bd остается малоизученным ферментом.

Не известно, как устроен его активный кислородоредуктазный центр, является ли он биядерным;

какие интермедиаты образуются в ходе его каталитического цикла;

каков механизм образования мембранного потенциала, какие из частных каталитических стадий сопряжены с генерацией потенциала. Цитохром bd является ключевым энергопреобразующим дыхательным ферментом как у микроорганизмов, безвредных для человека и животных, так и у бактерий, вызывающих различные заболевания, среди которых дизентерия, пневмония, сальмонеллез, периодонтит, бруцеллез, брюшной тиф, туберкулез.

Замечена положительная корреляция между вирулентностью бактериальных патогенов, ответственных за эти болезни и уровнем экспрессии цитохрома bd. Именно поэтому изучение цитохромов bd представляет интерес не только для фундаментальной науки, но и полезно с медицинской точки зрения. Полученные знания могут помочь созданию антибактериальных медицинских препаратов, используя в качестве мишени терминальные оксидазы bd-типа.

Цель и задачи исследования. Целью этой работы было изучение молекулярного механизма функционирования терминальных оксидаз типа bd. Особое внимание было уделено исследованию цитохромов bd из Escherichia coli и Azotobacter vinelandii. Требовалось понять, является ли наличие биядерного редокс-центра у терминальных оксидаз необходимым условием для восстановления кислорода до воды и если это так, то для какой из стадий каталитического превращения интермедиатов. Альтернативой могла бы быть необходимость наличия второго редокс-центра для переноса протонов через мембрану.

Таким образом, установление роли высокоспинового гема b595 у цитохрома bd представляет особый интерес. Ставилась задача выявить и охарактеризовать основные интермедиаты каталитического цикла фермента;

понять, каким образом цитохром bd генерирует потенциал в отсутствие механизма трансмембранной перекачки «помповых» протонов;

определить устройство и механизм функционирования его активного кислородоредуктазного центра.

Изучение механизма образования цитохромом bd мебранного потенциала помогает понять, как именно бактерии, включая патогенные штаммы, запасают энергию при недостатке кислорода и других неблагоприятных условиях. Кроме того, выявление общих черт и различий в механизме восстановления кислорода до воды у цитохрома bd и основных протон-транслоцирующих терминальных оксидаз помогает установить принципиальные компоненты протон-переносящей «машины», присущей гем-медным концевым дыхательным ферментам.

Научная новизна работы. Впервые разработан удобный метод окисления цитохрома bd, что позволило провести систематическое исследование взаимодействия с лигандами не только восстановленного, но и окисленного фермента.

Обнаружено, что в окисленном ферменте, Н2О2 реагирует с гемом d с кажущейся константой диссоциации (Kd) 30-40 мкМ, но не взаимодействует с высокоспиновым гемом b595. Реакция носит необратимый характер, приводя к образованию оксоферрильного комплекса гема d (Fe4+=O2-). Показано, что как в мембранах, так и в выделенном цитохроме bd, СО и цианид связываются с гемом d. Кажущаяся Kd гема d с СО составляет 70-80 нМ.

Существенно новым результатом работы является то, что связывание СО с гемом b595 не превышает 6% даже при низких температурах. Предлагается модель устройства кислородоредуктазного центра, который состоит из близко расположенных (~10 ) гемов b и d, проявляющих антикооперативность в связывании лигандов.

Впервые идентифицирована индивидуальная полоса Соре восстановленного гема b595.

Удалось определить сродство цитохромов bd из E. coli и A. vinelandii к кислороду, а также измерить скорости связывания О2 с одноэлектронным (MV) и полностью восстановленным (R) цитохромом bd. В случае R формы цитохрома bd, скорость реакции возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации О2. Напротив, для MV фермента, такая зависимость не является линейной, а носит гиперболический характер.

Предполагается, что MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать О2 может только в одном из них.

Впервые зарегистрирована быстрая кинетика генерации разности потенциалов цитохромом bd на мембране протеолипосом и последовательное образование спектрально различимых каталитических интермедиатов в пределах одного молекулярного оборота фермента. Идентифицирован новый каталитический интермедиат, вероятно являющийся перекисным комплексом гема d (Fe3+–O–O–(H)). Показано, что связывание восстановленного цитохрома bd с кислородом и дальнейшее превращение оксикомплекса в перекисный комплекс не сопряжены с генерацией потенциала, тогда как две последующие каталитические стадии - переход перекисного комплекса в оксоферрильную и затем в окисленную форму, являются электрогенными. Предлагается схема реакции полностью восстановленного цитохрома bd с кислородом.

Измерены константы скорости спонтанной диссоциации O2, NО и СO от цитохрома bd в разных редокс-состояниях фермента. NO и СО диссоциируют из цитохрома bd гораздо быстрее, чем из гем-медных терминальных оксидаз. Диссоциация этих лигандов из MV формы цитохрома bd замедлена в сравнении с R ферментом. Предполагается, что редокс состояние гема b595 контролирует внутрибелковый путь ухода лиганда из активного центра цитохрома bd.

На основании сравнительной характеристики мутантной формы фермента Е445А и цитохрома bd дикого типа предлагается модель внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме bd.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современные знания о свойствах и механизме функционирования терминального участка дыхательной цепи организмов и могут найти применение в исследованиях гемопротеинов дыхательной или фотосинтетической редокс-цепей.

Разработанный метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленное состояние может быть использован для окисления других гидрофобных редокс-ферментов, не взаимодействующих с традиционными акцепторами электронов типа феррицианида или персульфата. На основе цитохрома bd можно разработать биосенсоры О2, СО и NO.

Информация о структуре и функционировании активного центра цитохрома bd открывает возможности для использования оксидазы этого типа в качестве мишени при антибактериальной терапии.

Материалы работы используются в учебном процессе на факультете Биоинженерии и биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ. Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике.

Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 23-м, 26-м, 27-м, 29-м, 30-м и 32-м съездах Федерации европейских биохимических обществ FEBS (Базель, 1995;

Ницца, 1999;

Лиссабон, 2001;

Варшава, 2004;

Будапешт, 2005;

Вена, 2007), 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й и 14-й Европейских биоэнергетических конференциях EBEC (Лёвен-ля-Нёв, 1996;

Гётеборг, 1998;

Сассекс, 2000;

Аркашон, 2002;

Пиза, 2004;

Москва, 2006), 2-м Европейском биофизическом конгрессе – EBSA (Орлеан, 1997), конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов – IUBMB (Бирмингем, 2000), конференции Федерации европейских микробиологических обществ – FEMS «Физиология, регуляция и биохимия электронного транспорта в катаболизме микробов» (о.Терсхеллинг, 2001), 18-м Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Киото, 2002), 2-й Международной конференции «Ферменты в окружающей среде: активность, экология и приложения» (Прага, 2003), конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), 2-й Всемирной конференции по стрессу (Будапешт, 2007). Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ.

Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых (1999), премии Биохимического Общества при Российской Академии Наук для молодых ученых России (2000), премии им. А.Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИФХБ МГУ (2000), премии Академии наук высшей школы России (2000), премии в конкурсе молодых ученых МГУ (2001), премии Европейской академии для молодых ученых СНГ (2002) и премии им. И.И. Шувалова МГУ (2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 статьи в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 232 страницы, 84 рисунка и таблицы. Список литературы включает 291 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты проводили как на бактериальных субклеточных пузырьках, так и на изолированном ферменте, - солюбилизированном в детергенте либо встроенном в искусственную фосфолипидную мембрану (липосомы).

Штаммы бактерий. Использовали оксидазы bd-типа, полученные из Escherichia coli и Azotobacter vinelandii. Штамм GO105/pTK1 E.coli любезно предоставлен проф. Р.Геннисом (Иллинойский университет в Урбане-Шампейн, США);

штамм MK8 A.vinelandii - дар проф.

Р.Пула (университет г. Шеффилда, Англия). Эти штаммы удобны тем, что за счет введения плазмиды с геном цитохрома bd обеспечивается суперпродукция изучаемого фермента.

Вдобавок, в штамме GO105/pTK1 E.coli проведена делеция в гене цитохрома bo3 (вторая терминальная оксидаза у E.coli), что дает возможность получения препарата цитохрома bd без примеси другой оксидазы. Кроме того, исследования проводили на мутантных ферментах из E.coli – Е445А и «L65C». В мутантном ферменте «L65C» шесть эндогенных остатков цистеина заменены на серин либо аланин (субъединица I: C128A, C396S, C479A;

субъединица II: C214S, C301S и C358S);

также в субъединицу I введен один добавочный цистеин (L65C). В мутантной оксидазе «L65C» отсутствует гем d, но сохраняются гемы b558 и b595.

Выращивание клеток. Клетки E.coli выращивали аэробно в ферментере (с контролируемой подачей О2), либо в колбах на качалке (с 200 об/мин) при температуре °С. Среда выращивания состояла из 80 мM фосфата натрия, 2,5 мM цитрата натрия, 19 мM сульфата аммония, 1%-ного триптона, 0,5%-ного дрожжевого экстракта, 0,5%-ных казаминовых кислот, 0,01%-ного L-триптофана, 2%-ного глицерина, 0,8 мM MgSO4, 0,18 мM FeSO4•7H2O, 0,1 мM CuSO4•5H2O, 0,005%-ного канамицина, 0,01%-ного ампициллина, pH 7,2.

Клетки A.vinelandii выращивали аэробно в ферментере (с контролируемой подачей О2), либо в качалочных колбах на качалке (с 250-300 об/мин) при температуре 30 °С. Состав среды выращивания: 6 мМ фосфат калия, 1,27 мМ сульфат натрия, 15 мМ ацетат аммония, 2%-ная сахароза, 3,3 мкМ CaCl2, 8,5 мкМ MgCl2, 0,33 мкМ FeSO4, 0,097 мМ Na2MoO4, 0,002%-ный рифампицин, 0,0001%-ный канамицин, pH 7,6.

За ростом клеток следили по увеличению мутности при 600 нм. Процесс культивирования обычно занимал 22-24 ч. На поздней логарифмической стадии клетки осаждали (5500 g, 10 мин, 4 С°) и дважды промывали в среде, содержащей 172 мM NaCl, мМ фосфат натрия и AЭБСФ (на кончике шпателя), pH 7,5 (E.coli), либо 50 мM NaCl, 10 мМ фосфат калия, 1 мМ MgSO4 и AЭБСФ (на кончике шпателя), pH 7,5 (A.vinelandii).

Получение мембран. После промывки клетки E.coli суспендировали в среде, содержащей 20 мМ трис, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO4, 20 мМ бензамидин, 1 мкМ леупептин, рН 8,3. Непосредственно перед разрушением клеток в суспензию добавляли AЭБСФ (на кончике шпателя), а также 1 мМ 1,4-дитиотреитол и ДНКазу I (0,01 мг/мл). Суспензию дважды пропускали через пресс Френча (French Pressure Cell Press J5-598AE, American Instrument Company, division of travenol laboratories, Inc.) порциями по 35 мл. Оставшиеся целыми и частично разрушенные клетки удаляли центрифугированием (14500 g, 15 мин, С°). Из полученного супернатанта ультрацентрифугированием осаждали субклеточные пузырьки (160000 g, 2 ч, 4 С°), которые затем гомогенизировали в среде требуемого состава.

После промывки клетки A.vinelandii суспендировали в среде, содержащей 20 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSO4, 20 мМ бензамидин, 1 мкМ леупептин, рН 7,5.

Непосредственно перед разрушением клеток в суспензию добавляли AЭБСФ (на кончике шпателя), либо спиртовой раствор фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) до конечной концентрации 0,3 мМ, а также 1 мМ 1,4-дитиотреитол и ДНКазу I (0,01 мг/мл). Суспензию пропускали один раз через пресс Френча порциями по 35 мл. Оставшиеся целыми и частично разрушенные клетки удаляли центрифугированием (17600 g, 7 мин, 4 С°). Из полученного супернатанта ультрацентрифугированием осаждали субклеточные пузырьки (160000 g, 2 ч, С°).

Выделение фермента. Цитохром bd из E.coli выделяли и очищали по методу, описанному ранее Миллером и Геннисом [Miller and Gennis, 1986], с некоторыми модификациями. Размороженные мембраны E.coli гомогенизировали в среде для уравновешивания хроматографической колонки без детергента (50 мМ фосфат калия, 25 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, AЭБСФ, pH 6,5). К гомогенату добавляли монолаурат сахарозы до конечной концентрации 1,8% и инкубировали при перемешивании в бане со льдом в течение 2 ч. Суспензию центрифугировали (160000 g, 60 мин, 4 °С), осадок отбрасывали, а супернатант наносили на колонку с ДЭАЭ-сефарозой Fast Flow, уравновешанную 50 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим также 25 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, и 0,1%-ный монолаурат сахарозы, pH 6,5. Колонку промывали 100 мл этого буфера при скорости тока 100-120 мл/ч и температуре 4 °C (скорость тока задавали с помощью перистальтического насоса фирмы «Pharmacia», Швеция), затем проводили элюцию градиентом KCl (25-350 мМ) при скорости тока 90-100 мл/ч. Собирали фракции объемом 7 мл (коллектор 2070 Ultrorac II фирмы «LKB»), регистрируя поглощение при 405 нм (спектрофотометр UA-5 с проточной ячейкой фирмы «ISCO»). Для дальнейшей работы отбирали фракции с соотношением оптических плотностей A412/A280 0,7. Эти фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией с помощью ячейки фирмы «Amicon» и фильтра типа YM-30.

Полученный раствор диализовали при 4 °С против 50 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА и 0,05%-ный N-лаурилсаркозинат натрия, pH 7,0, с двукратной сменой буфера через каждые 5 ч. Иногда диализ заменяли гель-фильтрацией на колонке PD10 с Сефадекс G-25 (фирмы «Pharmacia», Швеция).

Цитохром bd из A.vinelandii выделяли и очищали по методу, описанному ранее Джунеманн и Ригглсвортом [Junemann and Wrigglesworth, 1995], с незначительными модификациями. Мембраны гомогенизировали в 20 мМ трис/HCl буфере, содержащем мМ ЭДТА, 0,5 М KCl и AЭБСФ, pH 8,0;

при этом концентрация белка составляла 10 мг/мл.

Гомогенат инкубировали 1 ч. при перемешивании в бане со льдом и затем центрифугировали (168000 g, 2 ч, 4 °С). Супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 100 мМ калий фосфатном буфере, pH 7,2 (концентрация белка - 10 мг/мл). К суспензии добавляли 10%-ный раствор холата натрия (до конечной концентрации 2%) и оставляли на ночь при перемешивании. На следующий день полученную смесь центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С). Супернатант отбрасывали, а осадок, дважды промывали в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,2), чтобы избавиться от следов холата натрия (режим центрифугирования был тем же - 45000 g, 15 мин, 4 °С). Затем осадок суспендировали в том же фосфатном буфере (концентрация белка - 10-15 мг/мл) и добавляли n-додецил--D-мальтозид до конечной концентрации 1,5%. Суспензию инкубировали 1 ч. при перемешивании в бане со льдом и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С). Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли 4 М раствор сульфата аммония до 55%-ного насыщения при перемешивании в течение 2-3 минут. Суспензию инкубировали 20 мин без перемешивания и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С). Осадок красного цвета отбрасывали, а к супернатанту желто-зеленого цвета добавляли сульфат аммнония (в сухом виде, предварительно измельченный) до 80%-ного насыщения при перемешивании в течение 2- минут. Полученную смесь инкубировали 20 мин без перемешивания и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С). Плавающий осадок цитохрома bd осторожно извлекали и растворяли 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 0,02% n додецил--D-мальтозид. Для удаления сульфата аммония применяли гель-фильтрацию на колонке PD10 с Сефадекс G-25.

Определение степени чистоты препарата. Степень чистоты препарата изолированного цитохрома bd определяли по содержанию гема d в пересчете на мг белка.

Это соотношение, как правило, составляло 6-7 нмолей гема d/мг белка.

Определение концентрации цитохрома bd. Концентрацию цитохромов bd дикого типа из E.coli и A.vinelandii определяли по разностным спектрам поглощения (восстановленные дитионитом минус «окисленные на воздухе»), используя значения миллимолярных коэффициентов экстинкции 628-607 = 10,8 мМ-1см-1 [Borisov et al., 1999] и 628-605 = 9,5 мМ-1см-1 [Belevich et al., 2007b] для ферментов из E.coli и A.vinelandii, соответственно. Концентрацию мутантного цитохрома bd Е445А из E.coli определяли по абсолютным спектрам поглощения восстановленного дитионитом фермента, используя значение 628-670 = 25 мМ-1см-1 [Belevich et al., 2005b]. Концентрацию мутантного цитохрома bd L65C из E.coli определяли по абсолютным спектрам поглощения восстановленного дитионитом фермента, используя значение 531 = 9 мМ-1см-1 для -полосы гема b558, измеренное относительно опорной линии, соединяющей точки при 505 и 544 нм [Arutyunyan et al., 2008].

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли по методам Лоури [Lowry et al., 1951] и Брэдфорд [Bradford, 1976] используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Определение концентрации СО, NO и О2. Концентрацию СО и NO определяли, принимая растворимость этих газов в воде при 20 °С и атмосферном давлении равной 1 мМ и 2 мМ, соответственно [Anderson and Antonini, 1968;

Brunori et al., 1974;

Brunori et al., 1997].

Концентрацию О2 в воздухе, уравновешанной с воздухом воде и насыщенной кислородом воде при 21 °С принимали равной 8,6 мМ, 278 мкМ и 1,32 мМ, соответственно [Montgomery et al., 1964].

Встраивание цитохрома bd в липосомы. Цитохром bd встраивали в липосомы двумя методами. На начальном этапе исследований использовали диализный метод Рэкера [Racker, 1972] с некоторыми модификациями. На более поздних этапах исследования стали применять более простой и эффективный метод Риго (Bio-Вeads) [Rigaud et al., 1995], который успешно зарекомендовал себя в опытах на хинолоксидазе типа bo3 [Verkhovskaya et al., 1997].

Метод Рэкера. Всю процедуру встраивания проводили в бане со льдом. Азолектин (40 мг/мл) диспергировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 2%-ный холат натрия и 2 мМ MgSO4, рН 7,5. После этого суспензию продували аргоном в течение 10 мин, чтобы уменьшить вероятность перекисного окисления. Для формирования липидного бислоя суспензию озвучивали 2-4 раза по 20-30 с на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при токе 0,4 А и частоте 22 кГц до полного ее просветления. Озвучивание проводили в ледяной бане с NaCl (температура -15°) для предотвращения перегрева. После озвучивания к суспензии добавляли выделенный цитохром bd, так, чтобы соотношение белка и липида составляло 1:40 и диспергировали под током аргона. Для удаления холата смесь подвергнутых ультразвуковой обработке липидов и фермента диализовали против 300- объемов того же буфера, в котором проводили озвучивание, но не содержащем холата, с двукратной сменой буфера.

Метод Риго. Азолектин (8 мг/мл) диспергировали в 200 мМ Hepes-KOH буфере, содержащем 55 мМ n-октил--D-глюкозид, рН 7,4. После этого суспензию продували аргоном в течение 5-10 мин, чтобы уменьшить вероятность перекисного окисления. Для формирования липидного бислоя суспензию озвучивали 3 раза по 20-30 с (с 1 мин перерывами) на ультразвуковом дезинтеграторе до полного ее просветления. Озвучивание проводили в ледяной бане для предотвращения перегрева. Все дальнейшие процедуры встраивания проводили при комнатной температуре. После озвучивания к суспензии добавляли выделенный цитохром bd до конечной концентрации 0,2 - 0,8 мкМ и перемешивали в течение 15 мин. После этого к суспензии добавляли предактивированные гранулы SM2 Bio-Beads фирмы “Bio-Rad” (80 мг гранул сырого веса/мл), инкубировали мин при перемещивании и затем вносили вторую порцию 80 мг/мл Bio-Beads. Вслед за новым 30 мин перемешиванием добавляли третью порцию 160 мг/мл Bio-Beads. Такое же количество гранул Bio-Beads вносили еще через 1 час перемешивания. После этого смесь инкубировали при перемешивании еще 2 часа для полного удаления детергента. Жидкую фазу, содержащую протеолипосомы, осторожно изымали пипеткой с тонкой насадкой, не пропускающей гранулы Bio-Beads.

Амперометрия. Определение дыхательной активности. Потребление O препаратами цитохрома bd определяли амперометрически при помощи закрытого электрода типа Кларка на полярографе LP 7e фирмы “Laboratorni pristroje” (Чехословакия). На платиновый электрод подавали напряжение 0,6 В;

ток регистрировали на связанном с полярографом самописце “Servograph” Rec 80” фирмы “Radiometer” (Дания). Раствор в измерительной ячейке, рабочий объем которой составлял 1,1 мл, термостатировали при 25 °С и интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. Среда измерения активности субклеточных пузырьков содержала 50 мМ трицин, 50 мМ K2SO4, 10 мМ MgSO4, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0. Активность выделенного цитохрома bd определяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0), включающем также 40 мкМ ЭДТА и детергент: 0,05%-ный N лаурилсаркозинат натрия (для фермента из E.coli), либо 0,02%-ный n-додецил--D-мальтозид (для фермента из A.vinelandii). В качестве субстратов использовали 250 мкМ убихинол-1 с мМ дитиотреитолом либо 4-5 мМ аскорбат с 0,1-0,5 мМ ТМФД. Реакцию начинали добавлением убихинола-1 или ТМФД. Во всех случаях отдельно регистрировали скорость самоокисления субстратов, которую учитывали при расчете удельной активности.

Амперометрические измерения в присутствии NO и О2. Метод амперометрии применяли также для изучения взаимодействия цитохрома bd с NO как без кислорода, так и в присутствии разных его концентраций в среде измерения. Для этого использовали специальные О2- и NO- электроды (ISO2 и ISO-NO MarkII, World Precision Instruments, Сарасота, США) встроенные в одну и ту же полярографическую ячейку и соединенные с компьютером, что позволяло одновременно следить за изменением концентрации О2 и NO в пробе [Borisov et al., 2004].

Электрометрия. Быструю кинетику образования разности потенциалов бактериальным ферментом на мембране протеолипосом регистрировали прямым электрометрическим методом с разрешением 100 нс [Drachev et al., 1979;

Drachev et al., 1989], адаптированным для измерений на протеолипосомах с цитохромоксидазой [Jasaitis et al., 1999;

Verkhovsky et al., 1997]. На отверстие (d=4 мм), разделяющее два отсека тефлоновой ячейки для электрометрических измерений, наносили пленку, смоченную в декановом растворе фосфолипида. Ячейку заполняли 100 мМ бис-трис-пропан/HCl буфером, рН=7,0. В один из отсеков ячейки вносили липосомы с оксидазой, добавляли в оба отсека мМ CaCl2 и инкубировали 1,5-2 часа при постоянном перемешивании. В этих условиях липосомы со встроенным ферментом сорбировались на поверхности мембраны, разделяющей два отсека ячейки. После инкубации липосомы, не связавшиеся с мембраной, удаляли путем замены объема ячейки с помощью перистальтического насоса, и оба отсека заполняли конечной буферной средой для измерений (100 мМ MOPS/KOH, рН = 7,0).

Электрометрическую ячейку помещали в газонепроницаемый футляр, уравновешивали с атмосферой аргона и для достижения полного анаэробиоза добавляли 50 мМ глюкозу, мкг/мл каталазу, 130 мкг/мл глюкозоксидазу. Затем пробу инкубировали в атмосфере СО. В опытах по взаимодействию восстановленого цитохрома bd с кислородом в ячейку добавляли также 10 мкМ ТМФД. Требуемое количество кислорода впрыскивали в виде насыщенного О2 буферного раствора, используя управляемый компьютером насос со шприцем (SP200i, World Precision Instruments, Англия) и присоединенную к шприцу длинную иглу (22S RN, Hamilton). Струя от иглы была направлена на измеряющую мембрану, что создавало высокую локальную концентрацию кислорода во время реакции. Разность потенциалов в отсеках регистрировали при помощи защищенных от света хлор-серебряных электродов (World Precision Instruments, Англия). Изучаемые реакции запускали лазерной вспышкой (YAG лазер Quantel Brilliant, мощность вспышки 180 мДж), вызывающей фотодиссоциацию СО из фермента.

Методы спектроскопии. Регистрация изменений поглощения. Поглощение регистрировали на соединенных с компьютером двухлучевых/двухволновых спектрофотометрах Aminco-SLM DW-2000, Cary 300 UV-Vis, Shimadzu UV-vis 1601, Jasco V 550, Unisoku Instruments (Киото, Япония), HR2000+ (Ocean Optics Inc., США). Использовали кюветы различных типов с длиной оптического пути 0,1-1 см. Регистрацию быстрой кинетики взаимодействия цитохрома bd с лигандами методом быстрого смешивания первоначально осуществляли с использованием приставки к Aminco DW-2 Aminco-Morrow J4-9602 Stopped flow. Впоследствии стали использовать спектрофотометр с диодной матрицей (DX.17MV, Applied Photophysics, Leatherhead, Великобритания), позволяющей записывать с миллисекундным временным разрешением спектры поглощения фермента целиком (350-800 нм), а не по отдельным точкам, как в случае приставки Aminco-Morrow. В опытах по взаимодействию фермента с кислородом применили установку по быстрому смешиванию с матрицей DV420-UV-FK (Andor Technology, Белфаст, Северная Ирландия), что позволило записывать спектры поглощения целиком с интервалом 1 мкс (детальное описание установки можно найти в работе [Belevich et al., 2007a]). Для исследования быстрых изменений поглощения света фоточувствительными комплексами частично или полностью восстановленного цитохрома bd с лигандами проводили эксперименты по фотолизу лазерным светом с использованием следующих подходов: (1) Для изучения вызываемых светом спектральных изменений и их рекомбинации в микро/миллисекундной временной шкале была задействована неодимовая лазерная установка YAG (Quantel 481, вторая гармоника, длина волны 532 нм, длительность импульса 15 нс, мощность вспышки 40-120 мДж) [Azarkina et al., 1999]. Мониторный свет от галогеновой лампы мощностью Вт попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора фирмы Jobin Yvon с шириной щели 2-8 мм. Пройдя через образец, свет поступал через призменный монохроматор на фотоумножитель. Отцифровка сигнала с фотоумножителя происходила с помощью аналого-цифрового преобразователя DL-1080 (Datalab, Англия).

Далее сигнал поступал в компьютер. Для увеличения отношения сигнал/шум проводили накопление 50-250 кривых с интервалом 5 с. Возбуждающий свет с помощью отражающего зеркала подавался в кюветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света перпендикулярно последнему. (2) Для исследования сверхбыстрых процессов (фемто/пикосекунды) применяли фемто/пико-секундную лазерную абсорбционную спектроскопию [Martin and Vos, 1994], которая позволяла записывать непрерывные спектры поглощения как в полосе Соре, так и в видимой области. Длина волны возбуждения находилась в области 590 нм, 620 нм либо 655 нм, что давало возможность следить за поведением отдельных гемовых центров в фемто-пикосекундном временном интервале [Vos et al., 2000]. (3) Наносекундная лазерная спектроскопия отличается очень высоким оптическим разрешением (0,00001 OD). Сочетание вышеупомянутых подходов позволило наблюдать за динамикой поведения редокс-центров цитохрома bd во всем значимом для поставленных целей и задач временном диапазоне - от нескольких фемтосекунд до нескольких часов.

Низкотемпературная абсорбционная спектроскопия. Изучение взаимодействия восстановленного цитохрома bd с СО при низких температурах (в основном от -70 до - °С) проводили как описано в работах [Borisov et al., 2001;

Chance et al., 1975;

Kalnenieks et al., 1998;

Poole et al., 1994]. Типичный эксперимент выглядит следующим образом. Выделенный фермент, содержащий 30%-ный этиленгликоль, восстанавливали в кювете с оптическим путем 2 мм (общий объем – 1 мл) в течение 15 мин небольшим количеством сухого дитионита натрия, либо 10 мМ аскорбатом/50 мкМ ТМФД в течение 25 мин, и затем образец продували СО в течение 2 мин при комнатной температуре. После этого кювету с образцом в условиях полной темноты переносили в термос, содержащий смесь сухого льда с этанолом при -78 °С и быстро замораживали. Фотолиз СО проводили с помощью освещения образца сфокусированным лучом от 150-Вт вольфрамовой лампы в течение 3 мин, после чего регистрировали во времени разностные спектры поглощения (против записанной прежде и хранящейся в памяти базовой линии). Параллельно готовили и замораживали образец восстановленного фермента без СО, чтобы иметь базовую линию для слежения за изменениями поглощения при связывании СО с ферментом и для сравнения с соответствующими спектральными изменениями, индуцированными фотодиссоциацией СО от цитохрома bd.

Спектроэлектрохимическое редокс титрование цитохрома bd проводили с помощью оптически прозрачной тонкослойной электродной ячейки (OTTLE). В ходе как окислительного, так и восстановительного титрования устанавливали потенциалы с шагом ± 20 мВ в диапазоне от -100 до +450 мВ (относительно стандартного водородного электрода) с использованием потенциостата PAR263A (Princeton Applied Research). На каждом шаге потенциала определяли начало установления равновесия на рабочем электроде. Двухслойная сеточка из золота (Buckbee-Mears Europe GmbH, Германия) служила в качестве рабочего электрода. В качестве измеряющего электрода использовали платиновую проволоку, погруженную в раствор 3 M KCl;

хлор-серебряный электрод являлся электродом сравнения.

В качестве редокс-медиаторов использовали гексааминорутений (Eс = +50 мВ), пентааминопиридинрутений (Eс = +250 мВ) и ферроценилэтанол (Eс = +430 мВ);

все – в концентрации 200 мкМ.

Измерение МКД и КД. Регистрацию спектров МКД проводили при комнатной температуре в кюветах с оптическим путем 10 мм на соединенном с компьютером дихрографе, сконструированном А.М.Арутюняном (Москва). Спектр МКД получали, вычитая из спектра, записанного в прямом поле, таковой в обратном поле (Н 0,7 Т).

Спектры КД записывали с помощью соединенного с компьютером дихрографа Mark V (Jobin Yvon, Франция).

Спектроскопия ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре ESP-300 фирмы Bruker. Частота модуляции 100 кГц. Температуру образца контролировали с помощью криостата с жидким гелием ESR 900 и температурного контроллера ITC4 (Oxford Instruments). Данные ЭПР корректировали, вычитая контрольную пробу (сигнал ЭПР трубки с буфером). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 2 мВт, СВ частота 9, ГГц, амплитуда модуляции 1,2 мТл, температура 12 K.

Обработка данных. Обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием программ GIM (Scientific Graphic Interactive Management System, разработана А.Л. Драчевым в НИИФХБ МГУ), Discrete [Provencher, 1976], MatLab (MathWorks Inc., США), Pro-Kineticist (Applied Photophysics Ltd., Англия), Origin 7. (OriginLab Corporation, США). Спектры КД и МКД анализировали с использованием программ RDA и WTEST, разработанных И. Хоменковым и А.М. Арутюняном (Москва).

Определение кажущейся константы диссоциации комплекса гема d с кислородом (Kd(O2)) в одноэлектронной форме цитохрома bd. Выделенный цитохром bd в аэробных условиях находится преимущественно в форме оксикомплекса, где гем d восстановлен и связан с О2. Чтобы определить Kd(O2), вначале получали одноэлектронную форму фермента без связанного кислорода. Для этого образец помещали в газонепроницаемую кювету флуоресцентного типа (кювета прямоугольной формы;

общий объем – 11,8 - 14,6 мл;

объем, занимаемый образцом - 0,35 – 0,5 мл;

внутренние размеры – 4 x 10 мм), приспособленную для соединения с газовой/вакуумной линией. С помощью последней образец переводили в атмосферу аргона [Belevich et al., 2005a]. Об удалении кислорода с гема d судили по смещению полосы поглощения гема d – от 645 нм до 629 нм. Затем проводили титрование анаэробного одноэлектронного фермента возрастающими добавками воздуха. Воздух добавляли в виде газа или уравновешанной с воздухом воды. Концентрацию О2 в воздухе и уравновешанной с воздухом воде при 21 °С принимали равной 8,6 мМ и 278 мкМ, соответственно [Montgomery et al., 1964]. Обычно эксперимент ставили следующим образом:

Порцию воздуха вносили против тока аргона с помощью газонепроницаемого микрошприца с длинной иглой непосредственно на дно кюветы (в жидкую фазу). Затем кювету перемешивали путем качания до тех пор, пока не устанавливалось равновесие между жидкой и газовой фазами. За наступлением равновесия следили по степени интенсивности полосы поглощения при 648 нм, то есть кислород распределялся между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения, примерно равным 31. Поскольку концентрация О2 и объем газовой фазы кюветы были намного выше таковых жидкой фазы, газовая фаза над образцом служила в качестве кислородного буфера, поддерживая концентрацию кислорода в жидкой фазе.

Значение Kd(O2) определяли в соответствии с уравнением:

[O2 ] [d 2+ O2 ] =, ( K d + [O2 ]) где: [d2+-O2] – фракция оксикомплекса гема d;

[O2] – концентрация свободного (несвязанного) кислорода в растворе образца.

Определение кажущейся константы диссоциации (Kd) комплекса гема d с СО.

Кажущуюся Kd комплекса гема d с СО определяли по формуле:

K [ Mb CO ] ([d ]o [d CO ]) K2 = 1, [d CO] ([ Mb]o [ Mb CO]) где: K1 - кажущаяся константа диссоциации для комплекса миоглобина с СО, K2 - кажущаяся константа диссоциации для комплекса гема d с СО, [d]о - общая концентрация цитохрома d, [Mb]о - общая концентрация миоглобина, которую определяли из 579-594 = 6,4 мМ-1см-1 для разностного спектра (карбоксимиоглобин (Fe2+-СО) минус деоксимиоглобин (Fe2+)), 435- = 121 мМ-1см-1 для абсолютного спектра востановленного миоглобина (деоксимиоглобина), а также из 502-600 = 10,2 мМ-1см-1 для абсолютного спектра окисленного миоглобина (Fe3+), значения для Mb взяты из работы Вуда [Wood, 1984], [Mb-CO] - концентрация комплекса миоглобина с СО, которую определяли как [Mb]о(А579-594 x мкМ СО)/(А579-594 1 мМ СО), А брали из разностного спектра (СО+восстановленный минус восстановленный), [d-CO] концентрация комплекса гема d с СО, которую определяли как [d]о(А643-623 x мкМ СО)/(А643 1 мМ СО ), А рассчитывали из разностного спектра (СО+восстановленный минус восстановленный), [CO]о - концентрация добавленной окиси углерода.

Обработка кривых титрования CO спектральных изменений цитохрома bd.

Кривые титрования СО спектральных изменений восстановленного дитионитом цитохрома bd обрабатывали в программе GIM по формуле:

A = 0,5 ( K d + [d ]o + [CO]o ( K d + [d ]o + [CO ]o ) 2 4 [d ]o [CO]o ), где: А - А644-624, разность поглощения восстановленного дитионитом цитохрома bd в присутствии и отсутствие СО, - коэффициент экстинкции комплекса гема d с СО (644-624), Kd - кажущаяся константа диссоциации комплекса гема d с СО, [d]о - общая концентрация цитохрома d, [CO]о - концентрация добавленной окиси углерода. При обработке кривых титрования и Kd задавали в качестве параметров.

Определение кажущейся константы диссоциации (Kd) комплекса гема d с Н2O2.

Кажущуюся константу диссоциации комплекса гема d с Н2O2 рассчитывали в программе GIM по формуле:

[d ]о [ H 2O2 ]о A=, K d + [ H 2O2 ]о где: А - А680, которую измеряли относительно опорной линии, соединяющей точки разностного спектра цитохрома d (обработанный Н2O2 минус окисленный BQCl4);

коэффициент экстинкции для комплекса гема d с Н2O2 (680);

Kd - кажущаяся константа диссоциации для комплекса гема d с Н2O2;

[d]о - общая концентрация цитохрома d;

[Н2O2]о концентрация добавленной перекиси водорода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ОКИСЛЕНИЕ ГЕМА d Цель– найти способ быстрого и эффективного окисления цитохрома bd.

Изолированный цитохром bd обнаруживает интенсивную полосу поглощения с максимумом при 648 нм, которая характеризует оксикомплекс восстановленного гема d (d2+ O2) (рис. 1, спектр 1). Какие-либо признаки восстановления гемов b558 и b595 отсутствуют.

Таким образом, выделенный фермент находится большей частью в оксигенированном состоянии b5583+ b5953+ d2+ -O2. Окислители феррицианид калия и персульфат аммония не изменяют исходный спектр цитохрома bd (рис. 1, спектры 2 и 3). Данный факт указывает на неспособность этих веществ разрушить оксикомплекс гема d, несмотря на то, что они являются весьма эффективными акцепторами электронов. Ввиду того, что субстратом оксидазы bd-типа служит липофильный хинол, можно ожидать, что активный центр фермента находится в гидрофобном окружении и потому плохо взаимодействует с заряженными донорами и акцепторами электронов вроде феррицианида или персульфата.

Мы предположили, что гидрофобные окислители соответственно могли бы более эффективно окислять гем d.

Рис. 1. Действие различных окислителей на оксикомплекс цитохрома bd E.coli.

Приведены абсолютные спектры: 1 - без добавок, 2 - 30 мин с 0,2 мМ K3[Fe(CN)6], 3 - 30 мин с 0,1 мМ персульфатом аммония, 4 - 1 мин с 15 мкМ ФМС, 5 - мин с 15 мкМ BQ, 6 - 20 мин с 40 мкМ феррицинием и 0,1 мМ персульфатом аммония, 7 - 1 мин с 16 мкМ BQCl4.

Действительно, при добавлении таких липофильных акцепторов электронов, как феррициний или BQCl4 наблюдается исчезновение интенсивной полосы при 648 нм в абсолютном спектре поглощения фермента, что говорит о распаде оксикомплекса и окислении гема d. Инкубация гемопротеина с BQ или ФМС также приводит к частичному разрушению оксикомплекса. Среди исследованных липофильных акцепторов электронов BQCl4 оказался наиболее эффективным. Довольно хорошо действует также феррициний, особенно в присутствии 0,1 мМ персульфата аммония. Окисление оксикомплекса гема d BQCl4 происходит достаточно быстро (kэф = 6104 М-1с-1). Феррициний действует примерно в 300 раз медленнее (kэф = 2102 М-1с-1). BQ и PMS вызывают лишь частичное окисление оксикомплекса, но действуют довольно быстро (kэф соответственно около 103 и 104 М-1с-1).

Ингибитор хинолоксидазной активности цитохрома bd пентахлорофенол сильно тормозит окисление оксикомплекса гема d как BQCl4, так и феррицинием. Такое наблюдение свидетельствует о том, что гидрофобные акцепторы окисляют цитохром d через хинолоксидазный центр.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С H2O Цель – определить, какие из трех гемовых центров цитохрома bd взаимодействуют с H2O2 и какие спектрально различимые интермедиаты при этом образуются.

Описанный нами метод перевода цитохрома bd в полностью окисленное состояние позволил исследовать взаимодействие H2O2 с окисленной формой фермента. При добавлении H2O2 к оксикомплексу цитохрома bd регистрируется разностный спектр с максимумом при 680 нм и минимумом около 650 нм. Форма этого спектра схожа с таковой "перекисного состояния" комплекса bd, описанного Лоренсом и Геннисом [Lorence and Gennis, 1989].

Перекись водорода, добавленная к окисленному BQCl4 или феррицинием цитохрому bd, также вызывает появление пика при 680 нм. Форма разностного спектра (обработанный H2O минус окисленный) напоминает спектр так называемого "перекисного интермедиата", описанного в работе Лоренса и Генниса [Lorence and Gennis, 1989] и остается постоянной во всем исследованном нами диапазоне концентраций H2O2, 5 мкМ-5 мМ. Разность между спектрами продуктов взаимодействия H2O2 с оксигенированной и полностью окисленной формами фермента близко напоминает разность между спектрами окисленного и оксигенированного цитохрома bd. Таким образом, добавление H2O2 как к оксигенированному, так и полностью окисленному ферменту приводит к возникновению интермедиата с максимумом при 680 нм.

При добавлении H2O2 к полностью окисленной форме фермента в разностном спектре поглощения также регистрируется неглубокий провал с минимумом около 740 нм, обусловленный исчезновением полосы переноса заряда высокоспинового окисленного гема d (рис. 2). В предшествующих работах исследования взаимодействия перекиси водорода с цитохромом bd ограничивались видимой областью спектра поглощения. Мы обнаружили, что увеличение экстинкции при 680 нм в спектре окисленного цитохрома bd под действием H2O сопровождается спектральными изменениями и в полосе Соре. При внесении в образец H2O в -области возникает разностный спектр с пиком при 440 нм и провалом в области 405- нм, соответствующий длинноволновому сдвигу полосы Соре (рис. 2). Изменения поглощения в Соре и при 680 нм сравнимы по величине, тогда как в случае гемов типа a, b или c ответы в -области, как правило, в 5-10 раз больше, чем в видимом диапазоне длин волн [Poole, 1988].

Это указывает на то, что вызываемые перекисью водорода оптические изменения в области полосы Соре, сопутствующие возникновению максимума при 680 нм, принадлежат гему d.

Рис. 2. Сопоставление вызываемых H2O спектральных ответов цитохрома bd E.coli в видимой области и полосе Соре.

Фермент прединкубировали 5 мин с мкМ BQCl4. Представлены разностные спектры, записанные через 5 мин после добавления 40 мкМ (а) и 0,5 мМ H2O2 (б).

Кривая титрования спектральных изменений цитохрома bd при 680 нм перекисью водорода имеет вид изотермы адсорбции. Величина кажущейся константы диссоциации (Kd) составляет 30-40 мкМ. Изучение кинетики взаимодействия H2O2 с окисленным цитохромом bd проводили с использованием метода быстрого смешивания. На рис. 3 представлена типичная кривая при конечной концентрации H2O2 после смешивания 5 мМ. Обнаружено, что скорость реакции удовлетворительно описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой и возрастает пропорционально увеличению концентрации H2O2 (рис. 3, вставка). Значение константы скорости второго порядка для цитохрома bd составляет 600 М-1с-1.

Рис. 3. Кинетика реакции H2O2 с окисленным цитохромом bd.

Цитохром bd прединкубировали мин с 28 мкМ BQCl4 с последующим быстрым смешиванием с H2O2 (конечная концентрация после смешивания 5 мМ). Кинетику реакции отслеживали при 680 нм относительно 720 нм. Вставка:

зависимость константы скорости реакции первого порядка от [H2O2].

Таким образом, мы установили, что перекись водорода, добавленная к окисленному цитохрому bd, взаимодействует исключительно с гемом d3+, переводя его в оксоферрильную форму (d4+=O2-).

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЛОСЫ СОРЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЕМА b Цель – вычленить индивидуальную полосу Соре восстановленного гема b595 из спектра цитохрома bd методом фемто/пикосекундной спектроскопии.

На рис. 4 представлены изменения в области Соре спектра поглощения полностью восстановленного несвязанного с лигандами цитохрома bd, вызванные возбуждением при 590 нм, - вблизи максимума -полосы восстановленого гема b595. В течение первых 0,5 пс в разностном спектре наблюдается падение поглощения при 438 нм. Затем это выцветание полосы частично обращается и абсорбционные изменения трансформируются в “красный” сдвиг полосы при 440 нм в пикосекундной временной шкале. «Глобальный» компьютерный анализ (global fitting) полученного массива спектров выявляет две основные фазы фотовыцветания с 460 фс и 4 пс. В принципе, субпикосекундные спектральные компоненты должны включать вклад поглощения возбужденного состояния. Однако, для субпикосекундных спектральных компонентов (к примеру, для 460-фс компонента полностью восстановленного цитохрома bd) такое поглощение не велико и сильно смещено в “красную” область, поэтому оно не оказывает существенного влияния на форму спектра выцветания основного состояния. Однако таким вкладом уже нельзя пренебречь для более медленного компонента возбужденного состояния, который демонстрирует отчетливый спектральный сдвиг. (см. рис. 4, спектры при 1,4 и 2 пс).

по л но стью во сста но вл е нны й ф ерм ент возбуж дение при 590 нм Рис. 4. Спектральные изменения во времени, вызванные фемтосекундным возбуждением полностью восстановленного цитохрома bd E.coli при 590 нм.

A A = 0,0 0 Разностные спектры были 330 ф с записаны против стационарной 600 ф с формы R в указанные временные 870 ф с 1.4 п с интервалы после 2 пс фотовозбуждения.

410 420 430 440 Д лина волны, нм На рис. 5 показан 460-фс спектральный компонент, представляющий собой обесцвечивание полосы около 440 нм и удовлетворительно описываемый функцией Гаусса (сплошная линия). Мы приписываем этот спектр выцветанию полосы Соре восстановленного гема b595. Полоса Соре гема b595, идентифицированная в этой работе, имеет тот же экстремум, что и соответствующая полоса восстановленной цитохром с пероксидазы (фермента, содержащего высокоспиновый гем b). Идентификация индивидуального спектрального вклада гема b595 в полосу Соре цитохрома bd необходима для интерпретации сложных спектральных изменений, вызываемых связыванием лигандов с восстановленным ферментом.

Рис. 5. -полоса поглощения 460 ф с компонент восстановленного гема b цитохрома bd E.coli, вычлененная путем фотовыцветания формы R при 590 нм-возбуждении () и аппроксимированная функцией A=0, Гаусса (сплошная линия).

A полностью восстановленный фермент возбуждение при 590 нм 410 420 430 440 Длина волны, нм РЕАКЦИЯ ЦИТОХРОМА bd С СО Цель – выяснить, какие из трех гемовых центров цитохрома bd способны взаимодействовать с СО.

Взаимодействие СО с мембранной формой цитохрома bd. Добавление СО к связанному с мембраной восстановленному цитохрому bd вызывает в видимой области разностного спектра поглощения появление полосы с max = 644 нм и min = 624 нм, которая сопровождается пиком при 540 нм и W-образным ответом в области Соре. Красный сдвиг полосы поглощения около 630 нм обычно приписывают гему d. Что касается изменений в области Соре, то они, по мнению ряда авторов, объясняются вкладом гема b595 [Poole, 1994].

Мы обнаружили, что изменения в Соре, равно как и развитие пика при 540 нм, титруются СО параллельно с увеличением поглощения -полосы комплекса гема d с СО и достигают насыщения при 3-6 мкМ СО. В области Соре наблюдается также вторая фаза спектральных изменений, которая не достигает насыщения даже при концентрации СО 1 мМ и не вносит существенного вклада в полученную концентрационную зависимость спектральных изменений цитохрома d. Эта фаза отражает взаимодействие с лигандом незначительной части гема b558 (1-3%). Мы определили кажущуюся Kd комплекса СО с гемом d бактериальных мембран. Для этого проводили титрование СО спектральных изменений цитохрома bd и Mb, находившихся в одном растворе, следя за распределением лиганда между этими гемопротеидами и принимая Kd Mb равной 37 нМ. Величина Kd составляет около 70 нМ.

Взаимодействие СО с изолированным цитохромом bd. Разностный спектр выделенного цитохрома bd при низкой концентрации СО (рис. 6, спектр а) напоминает таковой комплекса СО с мембранной формой цитохрома d. Однако в случае выделенного фермента отличия между спектрами при высокой (1 мМ) и низкой (20 мкМ) концентрации СО гораздо более выражены: соответствующий разностный спектр представлен полосой с максимумом при 422 нм, минимумом при 434 нм и небольшим плечом около 440 нм в полосе Соре и двумя провалами, при 562 и 531 нм, в видимой области (рис. 6, кривая в).

Рис. 6. Спектральные изменения изолированного цитохрома bd, вызываемые СО. Представлены разностные спектры поглощения цитохрома bd E.coli:

обработанный 20 мкМ (а) и 1 мМ СО (б) после восстановления дитионитом минус восстановленный дитионитом;

в разность между (б) и (а).

Спектральные изменения выделенного цитохрома bd при 540 нм и 644-623 нм, как и в случае с мембранным ферментом, титруются одновременно, имеют вид кривых с насыщением и отражают один и тот же процесс - связывание СО с гемом d (рис. 7, кривые б и в). Пик при 540 нм может быть как -полосой комплекса гема d с СО, так и частью его расщепленной -полосы. Концентрационная зависимость спектральных изменений в Соре имеет ярко выраженный двухфазный характер: первая фаза соответствует наблюдаемым изменениям в видимой области;

вторая фаза не насыщается даже при 1 мМ СО и вносит больший вклад в суммарную амплитуду изменений в -полосе, чем в случае мембранной формы фермента (рис. 7, кривая а). Амплитуда второй фазы соответствует взаимодействию лиганда с некоторой частью гема b558 (около 10-15%). Кажущуюся Kd выделенного цитохрома d с СО определяли как и для мембран. Ее значение оказалось равным ~80 нМ.

Рис. 7. Зависимость спектральных изменений изолированного цитохрома bd в разных диапазонах длин волн от концентрации СО.

Представлены кривые, полученные после обработки соответствующих разностных спектров поглощения: а - 470- нм;

б - 644-624 нм;

в - 540 нм Исследование магнито-оптической активности изолированного восстановленного цитохрома bd и его комплекса с СО. Спектроскопия МКД все шире применяется при изучении гемопротеинов. В частности, она позволяет следить за изменением спинового состояния гемов при связывании лигандов. Спектр МКД восстановленного цитохрома bd, записанный при комнатной температуре, показан на рис. сплошной линией (кривая 1). На спектре можно выделить 3 основных сигнала. В видимой области основной вклад вносит сигнал типа А с центром при 560,7 нм (рис. 8,б, кривая 1).

Этот сигнал принадлежит низкоспиновому гему b5582+. Отрицательная полоса с минимумом около 600 нм по форме и положению типична для высокоспинового гема b2+, соответствуя высокоспиновому гему b5952+. В области Соре наблюдается асимметричный сигнал с максимумом при 437 нм (рис. 8,а), также напоминающий по форме и величине сигнал высокоспинового гемопротеида. Этот сигнал может включать вклады каждого из трех гемовых центров фермента.

Добавление 20 мкМ СО вызывает сужение сигнала в области Соре, что выражается в разностном спектре МКД кривой W-образной формы. При этом не наблюдается изменений сигнала типа А гема b558 и отрицательной полосы при 600 нм гема b595. Поэтому наиболее вероятно, что эти изменения МКД в области Соре отражают образование комплекса низкоспинового гема d с лигандом, d2+-CO. Увеличение концентрации СО до 1 мМ приводит к уменьшению сигнала А-типа низкоспинового гема b5582+ (рис. 8,б), соответствующему переходу 15% этого гема в комплекс с СО, b5582+-CO. В то же время мы не обнаружили изменения формы или интенсивности сигнала МКД гема b595 при 600 нм. В полосе Соре наблюдаются лишь незначительные добавочные изменения, главным образом выражающиеся в небольшом нарастании провала при 430 нм (рис. 8,а). При этом величина минимума при 442 нм практически не меняется.

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует об отсутствии взаимодействия большей части (95%) высокоспинового гема b5952+ с окисью углерода.

Рис. 8. Изменения сигнала МКД цитохрома bd в полосе Соре (а) и видимой области (б), вызываемые 1 мМ СО. Представлены спектры МКД изолированного фермента: - восстановленный дитионитом (сплошная линия);

2 - после добавления СО (пунктирная линия);

3 - разность между 2 и 1.

Взаимодействие СО с изолированным цитохромом bd при низкой температуре.

Мы сравнили спектральные изменения, обусловленные связыванием и фотодиссоциацией СО при комнатной и низкой температурах, используя один и тот же препарат изолированного цитохрома bd A.vinelandii. Освещение замороженного комплекса восстановленного цитохрома bd с СО сфокусированным белым светом в течение 3 мин вызывает изменения поглощения, указывающие на красный сдвиг полосы Соре. Форма этого спектра типична для фотодиссоциации СО от высокоспинового гема b. В этих условиях, фотоиндуцируемых изменений гема d в длинноволновой области не наблюдается по причине парной рекомбинации СО с гемом d, скорость которой очень высока даже при -100 °С [Poole, 1988]. Благодаря этой особенности, исследования низкотемпературной фотодиссоциации являются селективными по отношению к гему b595. Таким образом, диссоциация СО от высокоспинового гема b595 – единственное событие, которое выявляют индуцированные светом спектры цитохрома bd при -100 °С. Нормированные фотоиндуцированные изменения поглощения гема b595 соответствуют фотодиссоциации СО от ~6% гема b595 при -70 °С и даже от меньшей фракции (~4%) при -100 °С.

Рекомбинация СО с восстановленным цитохромом bd A.vinelandii в микро/миллисекундной временной шкале при комнатной температуре. Независимое подтверждение связывания СО с небольшой фракцией гема b595 в том же препарате цитохрома bd A.vinelandii получено при исследовании рекомбинации СО с восстановленным цитохромом bd в микро/миллисекундной временной шкале вслед за индуцированным лалерным светом фотолизом комплекса фермента с лигандом при комнатной температуре.

Рекомбинация проходила в несколько фаз. Быстрая фаза хорошо разделялась кинетически с характеристическим временем =18±3 мкс при ~1 мМ СО (константа скорости второго порядка – 5,5108 М-1с-1). Разностный спектр быстрой фазы типичен для связывания СО с гемом d. Более медленная часть рекомбинации включает 2-3 фазы со значениями в пределах 0,2-2,3 мс;

однако разностные спектры этих фаз схожи между собой и указывают на связывание СО с гемом типа b. Из общей амплитуды спектральных изменений в медленной части ответа следует, что с СО при комнатной температуре взаимодействует не более 2-3% гема b595.

Изучение фотодиссоциации СО из комплекса с изолированным цитохромом bd E.coli, находящимся в полностью восстановленной форме (R) либо в состоянии смешанной валентности (MV) в пикосекундной временной шкале.

Мы сравнили изменения поглощения, вызываемые фотодиссоциацией СО от цитохрома bd E.coli в разных состояниях окисления в пикосекундной временной шкале. На рис. 9 приведены спектры фотолиза комплексов R-CO и MV-CO фермента. Как форма, так и динамика спектральных изменений заметно отличаются в этих двух комплексах. Разностные спектры фотодиссоциации СО, наблюдаемые в области Соре для формы R-CO фермента после завершения электронных релаксаций, показана на рис. 9А. Форма абсорбционных изменений напоминает обращенный разностный стационарный спектр, вызываемый связыванием СО с восстановленным цитохромом bd с его типичной W-образной формой.

Напротив, ответ комплекса MV-CO фермента характеризуется менее сложным разностным спектром, соответствующим нарастанию широкой полосы с максимумом при 431-434 нм (рис. 9Б). Мы склонны приписать эту полосу промежуточно генерируемому гему d, несвязанному с лигандами. Таким образом, впервые удалось зарегистрировать спектры изменения поглощения в области Соре при фотодиссоциации СО от цитохрома bd в MV состоянии.

Рис. 9. Фотодиссоциация СО из R (A) и MV (Б) редокс-состояний изолированного цитохрома bd E.coli.

Амплитуда изменений поглощения, наблюдаемая у MV-CO комплекса, увеличена в 2 раза. Длина волны возбуждения – 620 нм.

При сравнении изотропных пикосекундных спектров фотодиссоциации СО из комплексов R-CO и MV-CO фермента установлено, что взаимодействие СО с гемом d влияет на восстановленный гем b595, вызывая изменение поглощения в области 435 нм в пикосекундной временной шкале. Это свидетельствует о близком расположении гемов d и b595 и о формировании ими совместного двухъядерного центра восстановления кислорода.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С ЦИАНИДОМ Цель – изучить особенности реакции цитохрома bd с цианидом;

установить, взаимодействует ли этот лиганд с окисленным гемом b595 мембранной и изолированной форм фермента.

Реакция KCN с цитохромом bd бактериальных мембран. Добавление 50 мМ KCN к субклеточным пузырькам E.coli, содержащим цитохром bd, вызывает распад оксикомплекса гема d (падение поглощения при 648 нм). При этом наблюдается не описанный ранее длинноволновый сдвиг полосы Соре и рост поглощения при 562 нм. Увеличение амплитуды разностного спектра в Соре коррелирует во времени с нарастанием оптической плотности при 562 нм, но не совпадает с возникновением провала при 648 нм. Большая часть изменений в -полосе отражает восстановление гема b558 эндогенными источниками электронов, а не собственно связывание лиганда. Прединкубация мембран с окислителями феррицинием и персульфатом не вызывает окисления гема d. При добавлении KCN к таким мембранам вслед за описанным выше увеличением амплитуды разностного спектра в Соре в течение первых 4 5 мин происходит медленное обращение спектральных изменений и в конце концов возникает устойчивый ответ с 429-410 20 мМ-1см-1. Его небольшая величина свидетельствует о связывании цианида преимущественно с гемом d.

Реакция KCN с окисленной формой изолированного цитохрома bd. На рис. представлен разностный спектр поглощения фермента (обработанный KCN минус окисленный BQCl4). В видимой области добавление субмиллимолярных концентраций KCN приводит к появлению полосы с максимумом при 624 нм и небольшими провалами около и 650 нм, а также пика при 577 нм (рис. 10,б, спектр 1). Кроме того, наблюдается исчезновение полосы при 740 нм, являющейся полосой переноса заряда высокоспинового окисленного гема d. В области Соре регистрируется небольшой длинноволновый сдвиг с максимумом при 431 нм и минимумом при 409 нм с 431-409 25-28 мМ-1см-1 (рис. 10,а, кривая 1), напоминающий таковой у цитохром d - содержащих мембран в присутствии окислителей. Небольшая величина изменений в Соре указывает на отсутствие взаимодействия цианида с гемами типа b при данной концентрации лиганда. Повышение концентрации KCN до 50 мМ приводит к увеличению амплитуды ответа в Соре и появлению пика при 537 нм (рис. 10, кривая 2). Приращение спектральных изменений в -полосе отражает связывание цианида дополнительно с частью ( 10%) низкоспинового гема b558.

Рис. 10. Сопоставление вызываемых цианидом спектральных ответов изолированного окисленного цитохрома bd E.coli в полосе Соре (а) и видимой области (б).

Представлены разностные спектры, записанные через 30 мин после добавления 0,5 мМ KCN (1) и через 10 мин после добавления 50 мМ KCN (2).

Исследование магнито-оптической активности выделенного полностью окисленного цитохрома bd и его комплекса с цианидом. Мы исследовали сигналы МКД изолированного полностью окисленного цитохрома bd и его цианидного комплекса при комнатной температуре. В области Соре спектра МКД окисленного цитохрома bd наиболее выражен характерный для низкоспинового гема b3+ интенсивный сигнал типа А (рис. 11, кривая 1 (сплошная линия). Этот сигнал в основном относится к низкоспиновому гему b5583+.

Добавление 0,5 мМ KCN к окисленному ферменту не вызывает изменений в спектре МКД.

Отсутствие значительных изменений в сигнале МКД окисленного фермента после добавления субмиллимолярных концентраций лиганда однозначно свидетельствует против того, что какая-либо существенная фракция гема типа b связывает цианид. Сигнал гема d, по видимому, очень мал. 50 мМ цианид, добавленный к ферменту, вызывает некоторые изменения сигнала МКД, которые выражаются в появлении полосы с максимумом при нм и минимумами около 412 и 433 нм в разностном спектре МКД (рис. 11, кривая 3). Это соответствует переходу 15-17% низкоспинового гема b5583+ в комплекс с цианидом. Хотя мы не можем исключить, что небольшая фракция высокоспинового окисленного гема b (5%) также взаимодействует с цианидом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что большая часть гема b595 не связывает KCN даже при высокой концентрации лиганда.

Рис. 11. Изменения характеристик МКД цитохрома bd, вызываемые 50 мМ цианидом. Представлены спектры МКД изолированного фермента: 1 – окисленный (сплошная линия);

2 - после добавления KCN (пунктирная линия);

3 - разность между 2 и 1.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С КИСЛОРОДОМ Цель – определить сродство цитохрома bd к кислороду;

сравнить кинетику связывания разных редокс-форм фермента с О2;

охарактеризовать основные каталитические интермедиаты;

выяснить, какие из стадий каталитического цикла фермента сопряжены с генерацией мембранного потенциала.

Определение кажущейся константы диссоциации (Kd(O2)) комплексов изолированного цитохрома bd E.coli и A.vinelandii с кислородом. В отличие от гем-медных терминальных оксидаз, изолированный цитохром bd находится преимущественно в виде стабильного оксигенированного комплекса (b5583+b5953+d2+-O2), который характеризуется полосой поглощения при 645-650 нм. Оксигенированный цитохром bd может быть легко переведен в одноэлектронную форму без кислорода путем уравновешивания образца с атмосферой аргона. За уходом кислорода от гема d можно следить по сдвигу -полосы поглощения гема от 645-648 нм в область 626-630 нм. Оксикомплекс гема d можно регенерировать путем титрования анаэробного одноэлектронного (MV) фермента кислородом. Добавление возрастающих концентраций О2 к анаэробной MV форме цитохрома bd E.coli вызывает пошаговое увеличение амплитуды разностных спектров поглощения, соответствующее красному сдвигу -полосы поглощения гема d. Зависимость спектральных изменений фермента E.coli при 648-626 нм от концентрации кислорода имеет вид кривой с насыщением, соответствуя кажущейся Kd(O2) = 280 нМ для оксикомплекса гема d. Таким же способом определили кажущуюся Kd(O2) для фермента A.vinelandii. Ее значение составило 0,5 мкМ. Таким образом, оксидазы bd-типа этих двух бактерий имеют сходное и довольно высокое сродство к кислороду.

Кинетика связывания кислорода с изолированным цитохромом bd A.vinelandii.

На рис. 12А показаны типичные кинетические кривые связывания О2 с MV формой фермента после фотолиза СО при разных концентрациях кислорода. Скорость реакции описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой. Кинетический спектр реакции (рис. 12Б) идентичен стационарному разностному спектру, характеризующему образование оксикомплекса гема d. Скорость реакции возрастает с увеличением концентрации О2, однако эта зависимость не является линейной, но описывается гиперболической функцией (рис.

12В). Реакция кислорода с R формой цитохрома bd не останавливается на стадии образования оксикомплекса, а идет дальше с образованием других интермедиатов.

Остановимся на самой первой стадии реакции R формы фермента с О2 – образовании комплекса d2+–О2. Кинетический спектр этой фазы идентичен таковому для MV формы фермента. В отличие от MV формы цитохрома bd, скорость образования оксикомплекса у R формы фермента возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации О2 без признаков насыщения (рис. 12В). Полученное значение константы скорости второго порядка (kon) для R формы цитохрома bd составляет 1,96109 М-1с-1. Это очень близко по величине к пределу, контролируемому диффузией кислорода в воде (6,5109 М-1с-1).

Рис. 12. Кинетика связывания кислорода с цитохромом bd A.vinelandii. (А) Кинетические кривые связывания О2 с MV формой фермента при 650 минус 630 нм, [О2] - 50, 100, 195 и мкМ. (Б) Кинетический спектр реакции для MV формы фермента. (В) Зависимость наблюдаемой скорости реакции от концентрации О2 (R форма - квадратные символы, MV форма - символы-кружки). Сплошные линии представляют собой теоретические кривые.

Четыре последовательные стадии каталитического цикла цитохрома bd.

Обнаружение нового интермедиата – перекисного комплекса гема d.

На рис. 13А показаны оптические изменения в течение первых 100 мкс реакции для фермента E.coli в форме R с кислородом. Начальное, неразрешаемое во времени падение поглощения отражает фотолиз СО из восстановленного фермента (R-COR переход), вслед за которым наблюдаются еще три перехода, которые хорошо разрешаются во времени (рис.

13Б). Эти три перехода описываются тремя последовательными стадиями с 1,4, 4,5 и 47 мкс (рис. 13Б, главная панель). Соответствующие разностные кинетические спектры этих фаз представлены на рис. 13В. Спектр 1,4-мкс фазы имеет минимум при 630 нм и максимум при 654 нм, что характерно для образования оксикомплекса - интермедиата А (RA переход).

Спектр 4,5-мкс фазы имеет минимум при 654 нм (исчезновение интермедиата А) и максимум при 635 нм, который отражает образование интермедиата, не зарегистрированного ранее. Мы обозначили этот новый интермедиат «Р» и 4,5-мкс фазу как AP переход. В ходе AP перехода гем b595 окисляется. Спектр 47-мкс фазы имеет минимумы при 561 нм (окисление гема b558) и 640 нм (распад интермедиата Р) и максимум при 680 нм. Пик при 680 нм характерен для оксоферрильного комплекса гема d (интермедиат F);

таким образом, 47-мкс фаза соответствует PF переходу. Как показано во вставке к рис. 13Б, изменения поглощения цитохрома bd A.vinelandii, вызванные кислородом, очень напоминают таковые для фермента E.coli.

Поскольку цитохром bd несет три редокс-группы, R является трехэлектронной формой восстановленного фермента. Реакция трехэлектронной формы восстановленного фермента с кислородом останавливается на стадии образования интермедиата F. Однако при определенных условиях возможно получить изолированный цитохром bd E.coli, содержащий некоторое количество связанного хинола. Такая форма восстановленного фермента содержит пять восстановительных эквивалентов и реакция с кислородом идет дальше образования F.

Наши эксперименты с таким препаратом фермента выявляют дополнительную фазу с = 1, мс. Спектр 1,1-мс фазы имеет минимум при 680 нм и максимум при 645 нм (рис. 13В), что может соответствовать превращению F в полностью окисленный фермент (О) или, скорее, в оксикомплекс (А).

Рис. 13. Реакция полностью восстановленного изолированного цитохрома bd с кислородом при 21 °С. (A) Спектральные изменения во времени после индуцированной лазерным светом диссоциации СО из фермента E.coli в присутствии О2. (Б) Кинетические кривые реакции при 654 минус 635 нм для цитохромов bd E.coli (главная панель) и A.vinelandii (вставка).

Теоретическая кривая, описывающая экспериментальные данные (точки), показывает, что за неразрешаемой во времени фазой фотолиза СО (R-COR) следуют три экспоненциальных перехода с 1,4 мкс (RA), 4,5 мкс (AP) и 47 мкс (PF). (В) Разностные кинетические спектры четырех фаз в видимой области: 1,4-мкс (мелкопунктирная линия), 4,5-мкс (сплошная линия), 47-мкс (крупнопунктирная линия) и 1,1-мс (сплошная линия серого цвета).

Сравнение электрометрической и оптической кривых во времени для реакции восстановленного цитохрома bd с кислородом. На рис. 14 сопоставлены кинетики образования мембранного потенциала (пунктирная линия) и спектральных изменений при А654-635 (сплошная линия) в ходе каталитического акта фермента. Электрометрический ответ в ходе одного молекулярного оборота цитохрома bd зарегистрирован нами впервые. Он состоит из начальной неэлектрогенной фазы, за которой следует фаза электрогенная. Анализ электрометрической кривой с использованием констант скоростей, полученных в спектрофотометрических измерениях, показывает, что первые два процесса, приписываемые образованию интермедиата А, за которым следует AP переход, не являются электрогенными. Таким образом, как RA, так и AP переход не сопряжены с переносом заряда поперек мембраны. В трехэлектронной форме восстановленного цитохрома bd (без связанного хинола), за неэлектрогенным плато следует электрогенная фаза (рис. 14, пунктирная линия), которая развивается параллельно с 47-мкс фазой, наблюдаемой в спектрофотометрическом эксперименте (рис. 14, сплошная линия). Таким образом, эта электрогенная фаза соответствует превращению интермедиата Р в форму F (PF переход).

В случае, когда фермент содержит связанный хинол, наблюдается дополнительная электрогенная фаза с 0,6-1,1 мс. Эта медленная электрогенная фаза совпадает во времени со спектральной фазой, отражающей FА переход.

Рис. 14. Сравнение электрометрической и оптической кривых во времени для реакции трехэлектронной формы восстановленного цитохрома bd E.coli с кислородом.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С NO Цель – исследовать механизм ингибирования активности цитохрома bd окисью азота;

выяснить, с какими формами фермента способен взаимодействовать NO.

Связывание NO с MV и R формами цитохрома bd. Цитохромы bd из E.coli и A.vinelandii как в состоянии смешанной валентности, так и полностью восстановленной форме способны связывать NO. NO связывается с восстановленным гемом d, образуя нитрозильный комплекс (Fe2+–NO).

Ингибирование активности цитохрома bd окисью азота. NO является сильным ингибитором О2-редуктазной активности цитохрома bd E.coli. Кажущаяся константа ингибирования (Ki) для NO составляет 100 ± 34 нМ (n = 10) при [O2] ~ 70 мкМ. Эта величина не сильно отличается от таковой для фермента A.vinelandii. При более высокой концентрации О2 (~ 1мМ O2) измеряли значительно большую величину Ki (~ 230 нМ NO), что свидетельствует о конкуренции между NO и О2. В аэробном растворе NO спонтанно деградирует, реагируя с кислородом. Когда концентрация NO падает ниже 200 нМ, происходит обращение ингибирования цитохрома bd и фермент постепенно восстанавливает первоначальную (до добавления NO) активность. Кинетику восстановления активности измеряли с использованием окси-Hb в качестве «утилизатора» NO. При исчерпании NO после добавления Hb наблюдается быстрое и полное восстановление О2-редуктазной активности цитохрома bd E.coli. То же наблюдали для фермента, выделенного из A.vinelandii.

Тест на NO-редуктазную активность цитохрома bd. Способность терминальных оксидаз типа bd из E.coli и A.vinelandii катализировать восстановление NO в анаэробных восстанавливающих условиях проверяли амперометрически при концентрациях NO 3- мкМ, используя в качестве восстановителей ДТТ/Q1, либо пару аскорбат/ТМФД. Такая активность у фермента E.coli не обнаруживается;

схожие результаты получены и для оксидазы A.vinelandii. В присутствии избытка восстановителей, NO действительно медленно разлагается, однако скорость этого процесса не меняется при добавлении как выделенного, так и предварительно восстановленного фермента.

Взаимодействие NO с оксоферрильным интермедиатом цитохрома bd.

Добавление цитохрома bd A.vinelandii в форме F к анаэробному буферу, содержащему избыток NO, вызывает исчезновение из раствора примерно равного количества NO (1,04 ± 0,08 (n = 12) моль NO на моль фермента). При смешивании в анаэробных условиях с буфером, содержащим 100 мкМ NO, F состояние фермента исчезает в пределах 1 с и вместо него появляется форма с широкой полосой около 625 нм (рис. 15А). Реакция описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой. Константа скорости псевдо-первого порядка линейно зависит от концентрации NO (рис. 15Г). Полученное значение константы скорости второго порядка (kon) составляет 1,2 ± 0,1 105 M-1 с-1. Продукт реакции оксоферрильной формы (F) цитохрома bd с NO является комплексом полностью окисленного фермента (О) с нитритом, по-видимому связанным с гемом d3+.

А Б 0. 0. Поглощение A 0. 0. -0. 0. 500 550 600 650 700 750 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Длина волны, нм 0. Г В 0.02 Амплитуда, отн.ед.

A 0. k' (с ) 0. - -0. 500 600 700 (нм) 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 200 400 600 800 1000 [NO], мкM Время, с Рис. 15. Кинетика реакции оксоферрильной формы цитохрома bd A.vinelandii с NO. (A) Абсолютные спектры поглощения после смешивания F с 100 мкМ NO. (Б) Разностные спектры поглощения. (В) Теоретическая кривая. Вставка: кинетический спектр, полученный при анализе. (Г) Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции от [NO].

ДИССОЦИАЦИЯ ЛИГАНДОВ (O2, NO, СО) ОТ ГЕМА d Цель – изучить диссоциацию O2, NО и СO от цитохрома bd;

выяснить, зависит ли скорость диссоциации лиганда от редокс-состояния фермента.

Диссоциация О2. После смешивания выделенного цитохрома bd E.coli (представленного в основном формой MV-O2) с избытком NO, во времени разрешаются два процесса. Менее чем за 100 мс, исходная -полоса гема d уменьшается по величине и смещается от 645 до 641-642 нм, после чего наблюдается ее дальнейший синий сдвиг до нм, одновременно с исчезновением плеча при 680 нм. Первый интермедиат реакции, детектируемый через 75 мс после смешивания, является ферментом в MV форме, в которой NO связан с восстановленным гемом d (MV-NO). Таким образом, после смешивания с NO, O2, связанный с гемом d2+, быстро диссоциирует, замещаясь NO, без редокс изменений на уровне гемов. Происходящее вслед за этим исчезновение полосы 680 нм свидетельствует о том, что после обмена лигандов (O2/NO) происходит медленная (несколько секунд) реакция NO с маленькой фракцией оксоферрильного (F) фермента, присутствующая в цитохроме bd при выделении. Кинетические кривые изменения поглощения при 649 нм при разных концентрациях NO описываются суммой двух экспонент. Первая фаза соответствует обмену лигандов (O2/NO) на геме d2+, с константой, достигающей порогового значения (плато) 78 с- при 1 мM NO. Эту скорость-лимитирующую величину мы приписываем koff для O2, связанного с гемом d2+ в MV ферменте. Вторая фаза линейно зависит от концентрации NO, соответствуя реакции NO с фракцией оксоферрильного фермента.

Диссоциация NO. Связанный с NO цитохром bd быстро смешивали с уравновешенным с воздухом буфером, содержащим Mb-O2 и об высвобождении NO из фермента судили по появлению мет-Mb при 581 нм. Свободный NO убирался из раствора при взаимодействии с Mb-O2 за время перемешивания ( 2 мс);

после этого NO, связанный с гемом d2+, вытеснялся О2, диссоциировал и окислял Mb-O2. Диссоциация NO протекает моноэкспоненциально с k = 0,133 ± 0,005 с-1 и 0,036 ± 0,003 с-1 из R и MV форм цитохрома bd, соответственно (рис. 16). После замещения NO с MV ферментом не происходит ничего, тогда как в случае R фермента, за NO/O2 обменом следует полное окисление цитохрома bd.

- 80 (Mb-O2), мM cм Рис. 16. Диссоциация NO. Приведены Амплитуда, отн.ед.

- кинетические кривые диссоциации NO от 60 MV-NO цитохрома bd. Регистрировали изменения - 500 600 40, нм поглощения при 581 нм после смешивания связанного с NO фермента с уравновешенным с воздухом буфером, R-NO содержащим Mb-O2. Вставка: разностный спектр поглощения - Mb-O2 минус мет-Mb.

0 20 40 60 80 Время, с Диссоциация СО. В похожем эксперименте исследовали кинетику диссоциации СО из цитохрома bd;

при этом в качестве замещающего лиганда использовали О2. О вытеснении СО из MV фермента судили по моноэкспоненциальному падению поглощения при 632 нм и его одновременному увеличению при 648 нм, при этом величина k сотавила 4,20 ± 0,34 с-1.

Реакция О2 с СО-связанным ферментом в R форме, измеряемая при 632 и 560 нм, протекала быстрее, моноэкспоненциально (k = 6,0 ± 0,2 с-1);

и являлась скорость-лимитирующей стадией для полного окисления фермента кислородом.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ ФЕРМЕНТА Е445А И ОКСИДАЗЫ ДИКОГО ТИПА Цель – с помощью каталитически неактивного мутантного фемента Е445А выяснить роль гема b595 в активном центре, а также специфическую функцию высококонсервативного остатка Е445 в сопряжении электронного транспорта с переносом протонов в цитохроме bd.

Недавно вышло сообщение о том, что точечная замена глутамата-445 на аланин в субъединице I цитохрома bd E.coli приводит к инактивации фермента и потере гема b [Zhang et al., 2001]. В данной работе мы показали, что гем b595 в мутанте Е445А сохраняется, но теряет способность к восстановлению даже в присутствии сильного восстановителя (дитионита). Столь уникальная возможность получить двухэлектронную форму фермента была использована для анализа роли гема b595.

Гем b595 присутствует в мутантной форме Е445А цитохрома bd. При сравнении изменений поглощения после фотолиза СО из гема d2+ в восстановленных дитионитом ферментах дикого типа и мутантном Е445А оказалось, что в случае дикого типа, разностный спектр рекомбинации СО в присутствии 1% СО имеет минимум при 642 нм и максимум при 622 нм, что соответствует ресвязыванию СО с гемом d2+. Напротив, в мутантном ферменте, спектр фазы рекомбинации СО включает не только связывание СО с гемом d2+, но также и некоторое перераспределение электрона, соответствующее переносу электрона от восстановленного гема b595 к окисленному гему d. Разностный спектр рекомбинации СО мутанта Е445А и дикого типа имеет максимумы при 595 и 562 нм и минимум при 630 нм, что очень напоминает «восстановленный минус окисленный» спектр гема b595, с добавлением провала при 630 нм, свидетельствующего об окислении гема d при фотолизе СО у мутанта.

Таким образом, гем b595 в мутантном ферменте присутствует. Применение метода пиридин гемохромогена подтвердило этот вывод: как в мутантном ферменте, так и в оксидазе дикого типа, стехиометрия гемов b558/d составляет 1 и обшее отношение гемов b к гему d равно 2.