Механизмы поддержания гетерогенного воспроизводства в популяциях млекопитающих

На правах рукописи

ГЕРЛИНСКАЯ ЛЮДМИЛА АЛЕКСЕЕВНА МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ВОСПРОИЗВОДСТВА В ПОПУЛЯЦИЯХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 03.00.13 – физиология, 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск 2008

Работа выполнена в Институте систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской Академии Наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАН, профессор В.И. Евсиков член-корреспондент РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.И. Дубровина, Институт физиологии СО РАМН доктор биологических наук, профессор А.Л. Маркель, ИЦиГ СО РАН доктор медицинских наук, профессор А.А. Останин, Институт клинической иммунологии СО РАМН

Ведущая организация: Кафедра высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ имени Ломоносова

Защита диссертации состоится года в часов на заседании диссертационного совета Д 0010.14.01 при ГУ НИИ физиологии СО РАМН по адресу:

630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ физиологии СО РАМН

Автореферат разослан декабря 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Бузуева И.И.

кандидат биологических наук Актуальность проблемы. Поддержание внутрипопуляционной морфофункциональной изменчивости является одним из необходимых условий устойчивого существования вида на фоне динамичной среды обитания (Шилов, 1991). В дополнение к мутагенезу и рекомбинациям, обеспечивающим популяционную изменчивость, у позвоночных животных сформировались специализированные механизмы подбора половых партнеров, поддерживающие внутривидовое разнообразие.

При этом свободный выбор, как правило, обеспечивает рождение наиболее жизнеспособного потомства, что подтверждается экспериментами, выполненными на разных видах животных, включая млекопитающих (Gowaty et al., 2007).

У большинства видов грызунов в качестве важнейшего сигнального фактора при взаимодействии особей выступает запах (Penn, Potts, 1998), чья привлекательность для самок также коррелирует с андроген-зависимыми поведенческими и метаболическими признаками. В частности, самки грызунов хорошо различают хемосигналы самцов разного иерархического ранга и предпочитают спариваться с доминантами (Dewsbury, 1982;

Hurst, 1987;

Coppersmith, Lenington, 1992;

Ellis, 1995;

Evsikov et al., 1995). Для понимания механизмов, предопределяющих сигнальную эффективность самцов, важно понять с какими физиологическими свойствами коррелирует их запаховая привлекательность.

Вместе с тем, такая очевидная проблема, как анализ сопряженной изменчивости хемосигналов и уровня стрессированности, который, по мнению многих авторов, является универсальным критерием благополучия животных в естественной среде обитания (Герлинская, Мошкин, 1984;

Мошкин, 1989;

Sapolsky et al., 2000;

Kloet et al., 2006), практически не разработана.

Успешность реализации репродуктивного потенциала самцов, как правило, зависит от их способности владеть ключевыми ресурсами среды обитания, включая корм, убежища и живущих на контролируемой ими территории самок (Crowcroft, Rowe, 1963, Hurst, 1987). У грызунов ключевым оружием территориальной конкуренции самцов являются мочевые метки (Hurst, Beynon, 2004). При этом у мышей и многих других видов грызунов эффективность маркировки и, соответственно, затраты на маркировочное поведение определяются экскрецией низкомолекулярных белков (major urinary proteins, MUP). Территориальная собственность обеспечивает самцу не лимитированный во времени доступ к самкам, обитающим на его индивидуальном участке. В то время, как половые контакты особей, вторгающихся в «чужое пространство», должны укладываться в ограниченные временные рамки. Но экстерриториальное спаривание не редкость не только у мышей (Potts et al., 1991), но даже и у видов, образующих относительно стабильные семейные колонии (Randell et al., 2005). При этом дисассортативное спаривание, как следствие свободного выбора самкой полового партнера, чаще наблюдается при экстерриториальном покрытии (Penn, Potts, 1998). В этой связи возникает вопрос о том, в какой мере изменчивость социально наивных самцов по маркировочной эффективности и, в частности, по производству и выведению MUP, коррелирует с их репродуктивным поведением. В естественных условиях свободный выбор партнеров ограничивают не только особенности социальной организации, но и паразиты, которые модифицируют хемосигналы зараженных животных (Kavaliers, Colwell, 1993, 1995;

Kavaliers et al., 1997;

Penn, Potts, 1998). Это может нарушить оптимальный выбор партнера и, соответственно, отразиться на развитии потомков. Вопрос о роли естественных ограничений свободного выбора только ставится в современных обзорных работах (Gowaty et al., 2007).

Среди генетических факторов, определяющих выбор полового партнера, наиболее глубоко исследованы гены главного комплекса гистосовместимости (MHC). Особая значимость этого высокополиморфного семейства генов объясняется тем, что МНС молекулы играют ключевую роль в формировании специфической иммунной реакции против паразитарной инвазии. Изучение природных популяций разных видов позвоночных показывает, что встречаемость гетерозигот по МНС генам обычно превышает теоретическую ожидаемую (Penn, Potts, 1999). Существенный вклад в поддержание полиморфизма вносит не только более высокая устойчивость гетерозигот к паразитарному прессу, но и диссасортативный ольфакторный выбор брачных партнеров (Potts et al., 1991). Но не только на этапе выбора партнеры, отличающиеся по МНС генам, получают преимущество. Фертилизация также происходит с большей вероятностью в том случае, если МНС гаплотипы сперматозоида и яйцеклетки не совпадают (Ho et al., 1994;

Gill, 1999;

Wedekind et al., 1996).

На последующих этапах беременности иммуногенетические различия матери и зародышей чаще оказывают позитивное, чем негативное, влияние (Billington, 1964;

James, 1965;

Евсиков, Морозова, 1977, 1978;

Ober, 1998;

Fernandez et al., 1998). В отличие от реакции организма на паразитарные и трансплантационные антигены, распознавание антигенного фенотипа зародыша приводит к активации субпопуляции хелперных Т клеток второго типа (Th2) и к подавлению активности хелперных Т-клеток первого типа (Th1), стимулирующих цитотаксические клетки (Piccinni et al., 2000). Переключение пролиферации Т-лимфоцитов в пользу Th2-клеток происходит при участии прогестерона (Szekeres-Bartho et al., 2000), который вовлекается в регуляцию всех важнейших этапов, обеспечивающих нормальное течение беременности (Lydon et al., 1996). Однако следует отметить, что исследования механизмов иммуноэндокринных взаимоотношений мать плод проведены, главным образом, в условиях in vitro, и это обстоятельство подводит нас к необходимости исследовать эндокринные последствия разных иммуногенетических взаимоотношениях матери и зародышей в условиях in vivo.

Координированная реализация программы развития в период беременности проходит под контролем систем нейрогуморальной регуляции. Изменения гормонального баланса во время беременности, вызванные внутренними или внешними факторами, влияют на программу развития и, как следствие, изменяется фенотип потомков (Henry et al., 1994;

Sekl, 1998;

Knackstedt et al., 2005). Большинство экспериментальных исследований в этой области относится к поздним периодам беременности, на которых идет формирование нервной ткани и эндокринной системы зародышей. Вместе с тем, наиболее драматичными этапами беременности, зависящими от иммуногенетических различий матери и зародышей, являются этапы пре- и раннего постимплантационного развития эмбрионов (Fernandez et al., 1995;

1999;

Choudhury, Knapp, 2001). Но этой проблеме посвящены лишь единичные исследования, в которых для изучения роли условий пренатального периода онтогенеза в формировании поведенческого фенотипа мышей был использован метод внутри и межлинейных пересадок эмбрионов. Эти работы показали, что изменчивость сенсорных и моторных характеристик взрослых потомков определяется различными компонентами материнской среды (Carlier et al., 1992, Roy et al., 2001). Для понимания микроэволюционной значимости онтогенетических последствий, обусловленных иммуногенетическими взаимоотношениями мать-плод, особый интерес представляет изучение адаптивных ответов потомков на внутри- и внепопуляционные стимулы, включая поведенческую и гормональную реакции на эмоциогенный и социальный стрессы, иммунный ответ на антигены и способность к поддержанию температурного гомеостаза в условиях холода.

Исходя из сказанного, были сформулированы цель и задачи диссертационного исследования.

Цель – исследовать эколого-физиологические факторы, определяющие выбор брачного партнера, и оценить влияние генотип-обусловленного выбора на процесс беременности и становление адаптивно значимых свойств потомков.

Направление исследования определило конкретные задачи:

1. Изучить зависимость ольфакторных предпочтений самок от эндокринных и поведенческих особенностей самцов аутбредных мышей и оценить жизнеспособность при скрещивании с привлекательным или непривлекательным самцом.

2. В опытах на самцах мышей аутбредной линии ICR исследовать корреляции индивидуальной изменчивости затрат на маркировку территории, оцененных по интенсивности выведения белка с мочой, с показателями полового поведения и особенностями пренатального развития их потомков.

3. Исследовать модифицирующее влияние нереплицируемых антигенов и заражения субклинической дозой вируса клещевого энцефалита на ольфакторную привлекательность и репродуктивный успех самцов мышей аутбредной линии ICR.

4. Изучить эндокринное обеспечение беременности и особенности пренатального роста эмбрионов при различных иммуногенетических отношениях в системе мать-плод, складывающихся у самок линий BALB и C57BL при внутри- и межлинейных скрещиваниях и пересадках зародышей.

5. Исследовать значение иммуноэндокринных взаимоотношений мать-плод для формирования фенотипической изменчивости адаптивно значимых поведенческих и физиологических признаков взрослых потомков.

Научная новизна. В наших исследованиях впервые установлено, что запаховые сигналы самцов несут информацию не только о поведенческих свойствах, но и об уровне стрессированности, отражающем их физиологическое благополучие. Спаривание с предпочитаемым самцом обеспечивает более эффективное внутриутробное развитие зародышей, но не влияет на показатели потенциальной и фактической плодовитости.

Впервые показано, что потенциальная способность социально наивных самцов к значительным ресурсным затратам, выражающаяся в повышенной экскреции низкомолекулярных белков и обеспечивающая, тем самым, эффективную маркировку территории, сочетается с меньшей сексуальной настойчивостью в первые часы после встречи с самкой и с меньшей эффективностью эмбрионального развития у покрытых ими самок.

Модификация хемосигналов, обусловленная инфекцией или антигенной стимуляцией иммунной системы, негативно влияет на репродуктивный успех самцов.

Причем впервые показано, что в случае субклинического заражения вирусом клещевого энцефалита самцы становятся более привлекательными для самок, но спаривание с такими самцами сопровождается большими эмбриональными потерями и меньшими темпами роста эмбрионов. Снижение массы эмбрионов, наблюдаемое при скрещивании самок с самцами, экскретирующими больше белка, или с самцами, зараженными вирусом клещевого энцефалита сочетается и с меньшей концентрацией прогестерона в крови беременных самок.

Впервые показано, что спаривание с половым партнером, отличающимся от самки по МНС генам, приводит к повышению концентрации прогестерона в материнской крови в период имплантации. Повышение концентрации прогестерона при аллогенной беременности является следствием стимулирующего действия аллоантигенов плода.

Впервые получены прямые доказательства, что для индукции иммуноэндокринных механизмов, приводящих к повышению концентрации прогестерона в период имплантации, достаточно однократного введения антигенов генетически отличного самца.

Активация прогестеронпродуцирующей функции в период имплантации позитивно влияет на формирование материнских качеств, определяющих жизнеспособность потомства на постнатальном этапе онтогенеза.

Особенности иммуноэндокринных взаимоотношений матери и эмбрионов приводят к модификации у взрослых потомков вегетативной и адренокортикальной реакций на эмоциогенные стрессоры, но не влияют на адренокортикальный ответ, вызванный холодовым воздействием. Антигенная стимуляция матерей на доимплантационной стадии беременности повышает способность потомков к социальному доминированию и улучшает их половое поведение. Вопреки принципу компромиссного распределения ресурсов (трэйд-офф) более выраженная экспрессия этих вторичных половых признаков не приводит к подавлению адаптивного гуморального иммунитета.

Научно-практическая значимость.

Полученные в работе данные о взаимозависимости запаховой привлекательности, уровня стрессированности и репродуктивного успеха самцов мышей служат обоснованием для использования показателей адренокортикальной активности в качестве одного из базовых критериев благополучия животных. Это особенно важно при разведении редких видов в условиях неволи, а также при организации мероприятий по их сохранению в природе. Реальность практического применения такого критерия подкрепляют разработанные нами, вне рамок диссертации, методы неинвазивной оценки концентрации глюкокортикоидов в фекалиях и оставленных на снегу мочевых метках (Герлинская и др., 1993).

В ходе выполнения диссертационной работы впервые были получены данные о заражении эмбрионов вирусом клещевого энцефалита при спаривании здоровых самок с инфицированными самцами. Возможность передачи данного вируса половым путем должна быть принята во внимание при организации лечебно-профилактических мероприятий, направленных на ограничение распространения вируса клещевого энцефалита.

Данные о влиянии иммуногенетических различий матери и эмбрионов на эндокринный статус беременных самок и на характер пре- и постнатального развития потомков могут быть использованы при разработке программ формирования оптимальных брачных пар в деле разведения различных видов млекопитающих. Они также могут быть полезны при подборе суррогатных матерей в случае экстракорпорального оплодотворения, а также при разработке подходов к прогнозированию психофизиологических свойств потомков в зависимости от иммуноэндокринных процессов, развертывающихся во время беременности.

Материалы диссертации используются в лекционных курсах «Популяционная физиология» и «Экологическая и популяционная физиология», которые читаются в Новосибирском государственном университете и в Томском государственном университете.

Положения, выносимые на защиту.

1. При ольфакторном выборе половых партнеров самки мышей отдают предпочтение наименее стрессированным и наиболее конкурентоспособным особям, спаривание с которыми обеспечивает эффективное развитие эмбрионов. Социальная среда и инфекции ограничивают оптимальный выбор партнеров, что негативно влияет на качество потомства.

2. Вынашивание эмбрионов иного по отношению к матери МНС генотипа оказывает дополнительное стимулирующее воздействие на прогестеронпродуцирующую функцию, что создает предпосылки для более успешного внутриутробного развития и для снижения смертности потомков в раннем постнатальном периоде.

3. Иммуноэндокринные процессы, складывающиеся при аллогенной беременности, влияют на приспособительные свойства потомков, что выражается в повышении их устойчивости к эмоциогенным стрессам и в увеличении социальной и половой конкурентоспособности.

Апробация работы. Основные материалы работы были представлены и обсуждались на Российских и Международных конференциях: IV Conf. Rodens & Spatium, Poland, 1993;

«Chemical Signals in Vertebrates VII» (Eberhard-Karls-University Tubengen, Germany, 1994;

«Cenetics, Neurogenenics and Behavior II» La Londe-les-Maures, France;

XXV International Ethological Conference, Viena, Austria, 1997;

XXV IEC Satelite Symposium # 4, «The Analysis of Steroid Hormones from Unrestrained Animals: Methodology and Application of Non-invasive Technoloque», Grunau, Austria, 1997;

«Вирусные, реккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами», Иркутск, 1996;

3-м Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока. Институт физиологии СО РАМН, Новосибирск, 1997;

Workshop “Assessment of Sponsored Biological Research in Russia For The New Millennium”, Novosibirsk, 1999;

«3rd International Symposium on Physiology and Ethology of Wild and Zoo Animals» Berlin, 2000;

XXVII International Ethological Conference, Tubingen, 2001;

“Animal Nutrition In Australia”, 2003;

Сибирская Зоологическая конференция. Новосибирск, 2004.

Публикации. По материалам, включенным в диссертационную работу, опубликовано работ, в том числе в журналах ВАК – 18, в других рецензируемых изданиях – 10, в сборниках тезисов конференций – 9.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 3-х отдельных глав, включающих следующие разделы – обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, общее заключение, выводы, список литературы, включающий литературный источник. Работа изложена на 260 страницах, содержит 20 рисунков и таблицы.

Благодарности: Автор выражает глубокую признательность чл.-корр. РАН В.И. Евсикову, проф. М.П. Мошкину, Ph.D. Ю.М. Мошкину, О.А. Роговой, О.Ф. Потаповой, С.В.

Скоровой, Т.Д. Осетровой, Л.Е. Овчинниковой за многолетнее сотрудничество, поддержку и за помощь в выполнении экспериментальной части исследования.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ: 94-04-12018;

97-04-50073;

99-04 49938;

02-04-48674;

06-04-49088.

Содержание работы ГЛАВА 1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ САМЦОВ И РЕПРОДУКТИВНЫЙ УСПЕХ САМОК Различные формы половых демонстраций несут информацию, направляющую выбор самок в пользу оптимального брачного партнера, спаривание с которым обеспечивает успешное течение беременности и высокое качество потомства. Вместе с тем, видовые особенности социальной организации, которые предопределяют спаривание значительного числа самок с самцами, на чьей территории находятся их индивидуальные участки, а также зараженность паразитами, искажающими половые сигналы инфицированных особей, могут ограничивать оптимальный выбор партнера.

Конкретизации этих общих принципов посвящены три серии экспериментов, выполненных нами на мышах аутбредной линии ICR.

Изменчивость запаховой привлекательности самцов и успех беременности Методы исследования.

Половую привлекательность самцов исследовали в тесте ольфакторного выбора.

Тестирование запаховой привлекательности самцов проводили в ольфактометре, состоящим из стартовой камеры, соединенной с 4-мя заменяемыми рукавами. В 3 рукава помещали загрязненную подстилку от 3-х самцов, а в 4-й – чистые опилки. Расположение стимулов в рукавах меняли при каждом последующем тестировании. Запаховый стимул каждого самца предъявляли 3-м самкам, находящимся в стадии эструса. Самок помещали в стартовую камеру и открывали рукава с запаховыми стимулами. В течение 15 мин регистрировали общую продолжительность пребывания самки в каждом из рукавов. К привлекательным относили того из трех самцов (доноров запаха), чью подстилку самка исследовала наибольшее время. В соответствии с этим все самцы были разделены на группы: предпочитаемые (привлекательные для двух или трех самок);

частично предпочитаемые (привлекательные для одной самки);

не предпочитаемые (не привлекательные для всех самок, исследовавших их запах).

К самцам, запах которых исследовали самки, подсаживали на ночь, в случайном порядке, по 3 самки. Факт беременности устанавливали по наличию вагинальной пробки.

День обнаружения вагинальной пробки считали 0-вым днем беременности. На 16-й день беременности самок декапитировали и подсчитывали число желтых тел и мест имплантаций. Эмбрионы извлекали из матки, освобождали от плодных оболочек и взвешивали.

После спариваний самцов, приблизительно равного веса, ссаживали по 3 особи на нейтральной арене диаметром 50 см. Тестирование социальных взаимодействий самцов длилось 30 мин. В течение этого времени регистрировали такие проявления агрессии, как атаки, инициацию драк, укусы, преследования, биения хвостом, и проявления субмиссии – защитные стойки, убегания, вокализацию. В качестве индекса агрессивности использовали отношение агрессивных актов к общему числу агонистических актов (сумма всех проявлений агрессии и субмиссии). После завершения теста животных декапитировали, извлекали и взвешивали семенники, семенные пузырьки и препуциальные железы.

За два дня до ссаживания у самцов брали пробы крови из ретроорбитального синуса. На процедуру взятия крови затрачивали не более 2-х мин от момента взятия животного в руки. Концентрацию 11-оксикортикостероидов (11-ОКС) в плазме крови измеряли флюориметрическим методом (Юденфренд, 1962).

Поведенческие и морфофизиологические индикаторы половой привлекательности самцов. Группы самцов, ранжированные самками по степени привлекательности запаха, различались по комплексу поведенческих и морфофизиологических показателей, относящихся к адаптивно значимым признакам (табл. 1). При этом привлекательные самцы, чью подстилку самки обнюхивали достоверно дольше, отличались от непривлекательных меньшим уровнем глюкокортикоидов в плазме крови, большей агрессивностью и большей массой препуциальных желез. По другим признакам, массе тела, семенников и семенных пузырьков, исследованные группы самцов не различались.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что запах загрязненной подстилки несет информацию об адаптивной ценности самцов, и это качество дает возможность самкам осуществить оптимальный выбор полового партнера.

Таблица 1. Поведенческие и морфофизиологические показатели, определяющие запаховую привлекательность самцов для самок Группы самцов Признаки Предпочитаемые Частично Не предпочитаемые предпочитаемые Время 211±17.0 165±12.0* 117±6.0** обнюхивания (n=11) (n=16) (n=11) (сек) Индекс 74.6±8.0 75.7±5.6 40.3±11.5** агрессивности n=11 n=16 n= (%) 11-ОКС (нг/мл) 129±4.0 144±8.0 173±19.0* базальный n=11 n=16 n= уровень Масса 117±12.0 115±3.0 88±9.0* препуциаль- n=11 n=16 n= ных желез (мг) t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони:

• * - различия достоверны при сравнении с предпочитаемыми самцами;

P0.05;

• ** - различия достоверны при сравнении с предпочитаемыми и частично предпочитаемыми самцами;

P0. Репродуктивный успех самок при спаривании с самцами разной привлекательности.

Потенциальная и фактическая плодовитость самок, оцененные по числу желтых тел и числу живых эмбрионов, не зависели от групповой принадлежности их половых партнеров. Вместе с тем, масса 16-ти дневных эмбрионов была достоверно выше у самок, покрытых предпочитаемыми самцами, по сравнению с таковой при покрытии непредпочитаемыми самцами (табл. 2). Проведенный анализ влияния плодовитости на массу эмбрионов показал, что при многоплодной беременности эмбрионы, зачатые предпочитаемыми самцами, достоверно превосходили по массе тела эмбрионов, полученных при скрещивании с непредпочитаемыми самцами.

Таблица 2. Зависимость массы 16-ти дневных эмбрионов (мг) от плодовитости самки и запаховой привлекательности полового партнера.

Половой партнер Число эмбрионов на одну самку Средняя масса на 5 5-9 10-14 самку Предпочитаемые 788±9.4 773±4.9 651±0.71 603±1.35 657±0. n=7 n=19 n=127 n=45 n= Не предпочи- 960±19.23 657±4.05 645±0.51 542±1.54 623±0. таемые n=6 n=23 n=139 n=72 n= Достоверность P0.01 P 0.001 P0.001 P0. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. n= число эмбрионов.

Таким образом, способность самок распознавать по запаху адаптивно значимые признаки потенциального полового партнера проявляется в более эффективном развитии эмбрионов, особенно при многоплодной беременности, что обеспечивает максимизацию репродуктивного выхода в условиях оптимального выбора.

Затраты на маркировку и репродуктивная эффективность самцов.

Методы исследования. Исследование выполнено на мышах линии ICR. У 22 самцов исследовали взаимозависимость экскреции белка и репродуктивного успеха. У 5-ти самцов была определена суточная экскреция белка и креатинина для последующей оценки суточных потерь белка на основе креатининового индекса. В первый день эксперимента через час после выключения света к самцам подсаживали по две самки. Далее в течение суток по окончании каждой ночи всех самок осматривали на наличие вагинальной пробки.

На 4-е и 16-е сутки у покрытых самок брали образцы крови, на 4-е сутки прижизненно из ретроорбитального синуса, а на 16-е сутки в момент декапитации.

Во время 1-й, 3-й и 5-й ночей в 3-х часовом интервале проводили 10 минутные видеозаписи (в инфракрасном свете) поведения в каждой группе, образованной в начале эксперимента одним самцом и двумя самками, а затем, по мере удаления покрытых особей, одним самцом и одной самкой. В 1-й день регистрацию поведения начинали через 3-5 мин после подсадки самок к самцу. При обработке видеозаписей использовали компьютерную программу Е.А. Новикова (Новиков, 2007). При анализе результатов использовали только данные по продолжительности поведенческих актов.

После 1-й, 3-й и 5-й ночей самцов отсаживали на 4 часа в цилиндрические клетки (диаметр – 10 см) с сетчатым полом и, при регулярном (каждые 30 мин) осмотре, собирали мочу. Сразу после последнего сбора мочи самцов декапитировали, выделяли и взвешивали семенники, семенные пузырьки, каудальные отделы эпидидимисов и препуциальные железы.

Содержание белка в моче определяли методом Бредфорда (Bradford, 1976).

Измерение концентрации креатинина в моче проводили с помощью стандартного набора реактивов - Creatinine “FL” (Vital Diagnostics). Разделение белковых фракций мочи проводили на гель-фильтрационной колонке (TSK-GEL G3000SW) размером 7.5 мм x мм и размером частиц 10 мкм с помощью жидкостного хроматографа (HPLC) - Agilent 1100. Концентрацию тестостерона в моче после предварительного центрифугирования определяли радиоиммунным методом.

Самок декапитировали на 16-й день беременности. После декапитации и взятия образцов крови у самок извлекали и взвешивали эмбрионы и их плаценты. Для оценки репродуктивных характеристик определяли число овулировавших яйцеклеток (по числу желтых тел - ЖТ), общее число эмбрионов (по числу мест имплантации - МИ) и число живых эмбрионов без видимых признаков нарушения развития. Содержание прогестерона в плазме крови определяли иммуноферментным методом с помощью наборов СтероидИФА-прогестерон-01 (ЗАО «Алкор Био»).

Индивидуальная изменчивость выведения белка и тестостерона с мочой. Гель фильтрационная хроматография 13 образцов мочи, взятых от самцов максимально различающихся по концентрации общего белка, показала существенное сходство в соотношении белковых фракций с преобладанием белков молекулярной массы 15-19 кДа.

Изменчивость их суммарной площади высокодостоверно коррелировала с концентрацией общего белка мочи (r=0.80, P0.001). Это обстоятельство послужило основанием для применения к изучению сопряженной изменчивости маркировочных затрат (экскреция MUP) и репродуктивного успеха самцов мышей менее затратного метода Брэдфорда.

Для оценки интенсивности выведения белка и тестостерона мы использовали креатининовые индексы. Экскреция креатинина у самцов исследуемой линии мышей варьировала от 1.98 до 2.71 мкмоль/сут и составила в среднем 2.3 мкмоль/сут. Исходя из этого значения, можно заключить, что проба с максимальным креатининовым индексом ( мг белка/мкмоль креатинина) соответствует белковым потерям равным 11.5 мг/сут.

Как показал однофакторный дисперсионный анализ (фактор - номер животного) индивидуальные величины креатининового индекса белка достоверно воспроизводились в повторно собранных пробах (F20,40=14.4;

P0.001). Для тестостерона повторяемость индивидуальных значений была ниже критического уровня значимости (F20,40=1.62;

P=0.09). Корреляции между креатининовыми индексами белка и тестостерона в отдельных пробах и в усредненных по каждому самцу значениях была положительной и статистически достоверной (r=0.43;

df=52;

P0.01 и r=0.52;

df=20;

P=0.012, соответственно;

линейная корреляция Пирсона).

Таким образом, для такого андрогензависимого признака, как выведение белка с мочой, характерно устойчивое воспроизведение индивидуальных значений, несмотря на то, что сбор образцов поводился на фоне сексуальных взаимодействий самцов с половозрелыми самками. При последующем анализе взаимозависимостей между экскрецией белка и характеристиками приспособленности самцов мы использовали среднее для каждой особи значение креатининового индекса, как более надежную характеристику индивидуальных особенностей животного.

Зависимость полового поведения от индивидуального уровня экскреции белка. Для сокращения числа признаков, используемых при описании полового поведения, первичные данные обработаны методом главных компонент. В анализ были включены только показатели, отражающие взаимодействие между самцами и самками, в том числе и признаки демонстрации агрессии. Редко наблюдаемые показатели (эякуляция, укусы и виляние хвостом) не анализировали. Две главных компоненты (ГК) в сумме определяли 46.1 % изменчивости исследуемых показателей. Поскольку в ГК 1 наибольший вклад вносили преследования самцами самок, садки и защитные реакции самок, эту компоненту можно рассматривать как интегральную характеристику поведенческого проявления половой активности самцов. В ГК 2 существенный вклад вносили назогенитальное обнюхивание самок и интромиссии, что позволяет отождествить эту компоненту с показателем сексуального интереса самок.

Судя по значениям ГК 1 и ГК 2, интенсивность взаимодействия самцов и самок была наибольшей во время первого наблюдения, а затем она достоверно снижалась (P 0.05;

LSD-тест). В 1-й день наблюдения индивидуальные значения ГК 1 отрицательно коррелировали с креатининовым индексом белка r = -0.60;

P 0.001. Иными словами, самцы с низкой экскрецией белка характеризовались наибольшим проявлением половой мотивации при первой встрече с самками. Для ГК 2, отражающей сексуальную мотивацию самок, достоверных корреляций с креатининовым индексом белка выявлено не было.

Креатининовый индекс белка и вероятность покрытия в разные сроки от подсадки самок. У 6 самцов первые покрытия были зарегистрированы после первых 2-х ночей пребывания вместе с самками (группа I), у 12 самцов покрытия имели место на 3-е - 5-е сутки (группа II) и 4 самца не покрыли ни одной самки (группа III). При этом у самцов группы I креатининовый индекс белка был достоверно ниже по сравнению с самцами группы III (рис. 1).

Поскольку каждый самец имел шанс покрыть более одной самки, мы проанализировали зависимость их репродуктивных качеств от интенсивности выведения белка, разделив самцов по креатининовому индексу на группы - с индексом ниже среднего уровня (низкая экскреция белка – НБ) и группу с индексом выше среднего уровня (высокая экскреция белка – ВБ). После первых двух суток количество самок, покрытых самцами группы НБ (7 из 22), существенно превосходило таковое у самцов 3, А Белок/креатинин, мг/г 2, Рис. 1. Креатининовый индекс белка у самцов 2, с разными сроками первого покрытия Группа I – покрытие в 1-е - 2-е сутки;

группа II – А,Б 1, покрытие на 3-и – 5-е сутки;

группа III – отсутствие Б покрытий в течение всего периода наблюдения ( 1, суток). Различные буквы над столбцами соответствуют достоверно различающимся средним 0, (P 0.05;

LSD – тест).

0, I II III Группы группы ВБ (1 из 22;

P=0.046;

точный критерий Фишера). В последующие трое суток количество покрытий было примерно одинаковым: 6 из 15 в группе НБ;

и 14 из 21 в группе ВБ (P=0.17;

критерий Фишера). Меньшее количество самок, доступных для покрытия, в 3-е – 5-е сутки было обусловлено удалением покрытых ранее особей. В связи с неравномерным распределением частоты покрытий репродуктивный выход, оцененный по числу живых эмбрионов, также варьировал от 1-х к 5-м суткам эксперимента. У самцов из группы НБ максимальный репродуктивный выход, судя по числу эмбрионов (78 из 150) приходился на 2-е сутки после подсадки самок, а у ВБ (100 из 139) на 4-е сутки (рис. 2).

НБ Живые эмбрионы, % от ВБ общего числа P0. P0. 1 2 3 4 В р е мя, д ни Рис. 2. Распределение числа эмбрионов у самок, покрытых в разные сроки от момента подсадки к самцам с высоким креатининовым индексом белка (ВБ) и низким индексом белка (НБ).

Достоверность различий между группами ВБ и НБ на 2-е и 4-е сутки после подсадки самок оценена по t-критерию Стьюдента с поправкой Бонферонни.

Креатининовый индекс белка самцов и течение беременности у покрытых ими самок. Величина креатининового индекса белка в моче самцов положительно коррелировала с постимплантационными и общими потерями эмбрионов и, соответственно, отрицательно с числом живых зародышей у покрытых ими самок (Табл.

3). Массы зародышей и плаценты находились в обратной зависимости от креатининового индекса. Концентрация прогестерона в плазме крови самок на 4-е сутки беременности не коррелировала с интенсивностью выведения белка у покрывших их самцов. А на 16-е сутки эта корреляция была отрицательной.

Поскольку масса тела эмбрионов возрастала в зависимости от дня покрытия (r=0.18;

n=289;

P=0.002), то смещение времени зачатия на более поздние сроки (от момента подсадки самок) могло частично компенсировать снижение темпов роста зародышей у самок, покрытых ВБ самцами. Тем не менее, средние значения размеров зародышей в группе НБ существенно превосходили таковые в группе ВБ (559±10 мг и 488±9 мг, соответственно, P0.001).

Таблица 3. Средние значения показателей плодовитости, массы эмбрионов, массы плаценты и концентрации прогестерона в крови беременных самок, и коэффициенты ранговой корреляции данных показателей с креатининовым индексом белка самцов, покрывших исследованных самок.

Число Средние Корреляция с # Показатели случаев значения креатининовым индексом белка M ± SE r P= Овулировавшие яйцеклетки 28 12.9 ± 0.5 0.27 0. Места имплантации 28 11.0 ±0.7 -0.13 0. Живые эмбрионы 28 10.1 ±0.7 -0.40 0. Доимплантационные потери 28 12.1 ±5.7 0.33 0. Постимплантационные потери, % 28 7.6 ±1.9 0.42 0. Общие потери, % 28 19.7 ±5.3 0.55 0. Прогестерон (4-е сут.), нг/мл 28 8.2 ±0.5 0.05 0. Прогестерон (16-е сут.), нг/мл 28 15.6 ±1.3 -0.39 0. Масса живых эмбрионов, мг 289 524.2 ± 7.1 -0.30 0. Масса плацент, мг 289 145.0 ± 1.9 -0.22 0. # - число случаев превышает число самцов использованных в эксперименте. Это обусловлено тем, что некоторые самцы покрыли по две самки, а также дали начало развитию от 7 до 15 эмбрионов.

Корреляции генеративных органов самцов с креатининовым индексом белка в моче.

Масса тела, размеры большинства генеративных органов самцов и число сперматозоидов не коррелировали с креатининовым индексом белка, отражающим его экскреторные потери. Исключение составила масса эпидидимиса, которая, при исключении из анализа самцов, которые не покрыли ни одной самки отрицательно коррелировала с экскреторными потерями белка (r=-0.47;

n= 18;

P=0.049).

Таким образом, самцы существенно различаются по экскреции низкомолекулярных белков, потери которых составляют основную «статью расходов» в общих затратах организма на маркировочное поведение (Desjardins et al., 1973;

Gosling et al., 2000;

Hurst, Beynon, 2004). При этом индивидуальные различия по креатининовому индексу белка коррелируют с распределением во времени сексуальной активности самцов. Отставленное по времени размножение ВБ самцов может иметь приспособительное значение, поскольку, как показали наши исследования, чем позднее покрыта самка, тем быстрее растут эмбрионы. Но даже при покрытии основного числа самок ближе к концу эксперимента ВБ самцы произвели более мелких зародышей по сравнению с НБ самцами. При этом не только масса, но и количество живых эмбрионов находились в обратной зависимости от креатининового индекса белка, последнее обусловлено ростом постимплантационных потерь у самок, покрытых самцами с высоким уровнем белковой экскреции. Важнейшим фактором успешного постимплантационного развития эмбрионов является концентрация прогестерона в материнском организме (Graham, Clarke, 1997), которая также отрицательно коррелировала с креатининовым индексом белка у отцов.

Особенности репродуктивного поведения обычно рассматриваются в контексте социальной среды, определяющей различный доступ к рецептивным самкам территориальных и нетерриториальных самцов (Crowcroft, Rowe, 1963;

Qvarstrom, Forsgren, 1998). В нашем случае все самцы находились в одинаковых условиях и, тем не менее, их репродуктивное поведение зависело от потенциальной способности к завоеванию и удержанию территории. Следовательно, мотивационные механизмы, определяющие стремление особи к той или иной форме поведения, и эффекторные механизмы, обеспечивающие реализацию этой формы поведения, находятся под общим регуляторным контролем. Но значительные вложения в маркировку, наряду с «выгодами», которые получают, владеющие репродуктивным ресурсом самцы, оборачиваются и определенными «проигрышами», что выражается в уменьшении числа и снижении качества их потомков, несмотря на возможность покрытия самок в оптимальные сроки.

Инфекционная и неинфекционная активация иммунной системы как фактор репродуктивного успеха самцов Методы исследования. Исследования выполнены на 15-17 недельных самцах аутбредной линии ICR, которых в течение 4-х недель до начала экспериментов содержали одиночно, и виргинных самках той линии, содержавшихся по 5 в одной клетке. Самцы были разделены на 3 экспериментальные группы. Группе антигенстимулированных самцов (n=30) были введены внутрибрюшинно 500 мкл 2% суспензии (2х10 8 клеток) эритроцитов барана (БЭ) в питательной среде 199. Самцам следующей группы (n=30) было введено 250 мкл питательной среды, содержащей субклиническую дозу вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) (Ларина и др., 1978;

Ларина, Левкович, 1983). Контрольные самцы (n=35) получали инъекции чистой питательной среды. После инъекций животных возвращали в чистые клетки. Заражение оценивалось с помощью ПЦР - анализа. У 14 из 30 зараженных самцов в тканях головного мозга была обнаружена РНК вируса клещевого энцефалита. Эти исследования были выполнены совместно с О.В. Морозовой – ИБХ СО РАН (Герлинская и др., 1997;

Moshkin et al., 2002). Таким образом, группа самцов, зараженная вирусом клещевого энцефалита, распалась на две подгруппы: ВКЭ+ (самцы с вирусной РНК) и ВКЭ- (самцы без вирусной РНК).

В период формирования максимального иммунного ответа, который составил 4 дня для БЭ и 6 дней для ВКЭ от момента введения этих антигенов (Ларина, Левкович, 1983) собирали образцы подстилки самцов. Образцы контрольной подстилки собирали в течение 4 и 6 дней соответственно. Запаховую привлекательность самцов из групп БЭ и ВКЭ оценивали относительно запаха контрольных особей в ольфактометре, описанном в предыдущем разделе. Загрязненную подстилку самца из одной из экспериментальных групп (БЭ или ВКЭ) помещали в противоположные рукава ольфактометра, а в два других рукава помещали образец подстилки контрольного самца. Эстральных самок помещали в центральный отсек и в течение 10 мин, от начала первого обнюхивания, фиксировали время обнюхивания каждого из образцов. Критерием привлекательности запаха являлось отношение времени обнюхивания экспериментального и контрольного образцов к общему времени, затраченному самкой на обнюхивание образцов подстилки во всех 4-х рукавах (Kavaliers, Colwell, 1995).

В день сбора подстилки, за два часа до выключения света, каждому самцу подсаживали на ночь по 2 виргинных самки, находящихся в состоянии эструса. Через часов от момента подсадки всех самок исследовали на наличие вагинальной пробки.

Самок с вагинальными пробками рассаживали в клетки по одной и декапитировали на 16 й день беременности. Для оценки показателей плодовитости подсчитывали число желтых тел, живых и резорбировавших эмбрионов (Евсиков и др., 1972).

Поведенческий ответ самцов на социальный конфликт исследовали через 1-3 часа после отсадки самок. Трех самцов по одному из каждой экспериментальной (ВКЭ и БЭ) и контрольной групп ссаживали на нейтральной арене с чистой подстилкой. Показатели агрессивных взаимодействий, включая прямые атаки оппонента, взаимные драки и оборонительные акты (замирания в вертикальной стойке и вокализации) фиксировали для каждого самца в течение всего периода тестирования, который длился 15 минут. На основании соотношения агрессивных и оборонительных актов самцов относили к доминантам или подчиненным.

Из ретроорбитального синуса каждого самца были взяты 2 пробы крови. Первый образец брали за сутки до экспериментального моделирования социального конфликта, а следующий сразу после завершения тестирования. У беременных самок образцы крови брали прижизненно из ретроорбитального синуса на 4-й день беременности и при забое на 16-й день. Концентрации кортикостерона, тестостерона и прогестерона измеряли радиоиммуным методом.

Влияние вирусной инфекции и активации иммунной системы нереплицируемыми антигенами на привлекательность запаха самцов. Активация иммунной системы вирусом ВКЭ и БЭ по-разному влияла на привлекательность запаха самцов для эстральных самок. Самки проводили больше времени в рукаве с подстилкой самцов, у которых в тканях головного мозга была обнаружена вирусная РНК ВКЭ(+), чем в рукаве с подстилкой контрольных самцов (59.4% - ВКЭ(+) и 40.6% - контроль, ts=4.0, P0.005).

Сравнение времени, затраченного самкой на обнюхивание подстилки самцов, собранной после введения бараньих эритроцитов (БЭ), и подстилки контрольных особей выявило противоположный эффект. В данном случае самки больше времени обнюхивали подстилку контрольных самцов (45.7% БЭ и 54.3% контроль, ts=2.2, P0.02).

Дисперсионный анализ относительного времени обнюхивания самками подстилок ВКЭ+, ВКЭ- и БЭ групп самцов также выявил различия в их привлекательности (F2.58=4.9;

P0.005). Наиболее привлекательным оказался запах самцов из ВКЭ(+) группы.

Б А Оборонительные акты Агрессивные акты Рис. 3. Показатели агонистического 45 поведения самцов в тесте ссаживания.

Агрессивные акты (А) представлены * в виде суммы агрессивных выпадов, биений хвостом, прямых атак и драк.

Оборонительные акты (В) 15 P0.02 P0. представлены в виде суммы поз замираний, писков и избеганий.

К ВКЭ(-) ВКЭ(+) БЭ К В (-) КЭ В (+) КЭ БЭ *- различия достоверны (P0.05) по сравнению с контрольной группой по критерию Mann–Whithney.

Указанные на рис. 3В различия между группами ВКЭ (+) – ВКЭ (-) и ВКЭ (+) и БЭ также установлены с помощью критерия Mann–Whithney.

Влияние вирусной инфекции и активации иммунной системы нереплицируемыми антигенами на показатели агонистического поведения. Анализ показателей агонистического поведения в тесте ссаживания самцов по 3 особи показал, что в условиях, провоцирующих социальные конфликты, самцы, у которых в тканях головного мозга был обнаружен вирус клещевого энцефалита ВКЭ(+), демонстрировали больше агрессивных актов, по сравнению с контрольными самцами (рис.3 А). Высокая агрессивность инфицированных самцов ВКЭ(+) сочеталась с минимальной демонстрацией актов пассивно-оборонительного поведения В). Агрессивность других (рис. экспериментальных самцов (группы ВКЭ(-) и БЭ) не отличалась от контрольной группы.

Сравнение экспериментальной и контрольной групп самцов показало, что самцы ВКЭ(+) чаще становились доминантами по сравнению с контрольными самцами (P0.05, по критерию 2).

А Стресс Фон 450 a Кортикостерон, нг/мл 300 b b b a ab c bc ) ) Э Э К К ) ) (+ (+ ( ( Б Б КЭ КЭ КЭ КЭ В В В В Б a Фон Стресс 2, Тестостерон, нг/мл 1,8 a a a 1,6 b b b 1, 1, b 0, ) ) Э Э ) ) К К (+ (+ ( ( Б Б КЭ КЭ КЭ КЭ В В В В Рис.4. Базальные (светлые колонки) и стресс-индуцированные (заштрихованные колонки) уровни кортикостерона (А) и тестостерона (Б) в плазме крови у самцов контрольной и экспериментальных групп.

Одинаковыми буквами обозначены средние достоверно не отличающиеся (P0.05) между собой (LSD тест). Статистические оценки выполнены отдельно для базальных концентраций гормонов (фон) и концентраций, измеренных сразу после социального конфликта (стресс).

Введенные антигены оказывали существенное влияние на функциональную активность коры надпочечников и гонад (рис. 4). Самцы, инфицированные вирусом клещевого энцефалита – группа ВКЭ(+), - значимо отличались от контрольных, ВКЭ(-) и БЭ групп мышей тем, что имели максимальный базальный уровень тестостерона в плазме крови (рис. 4Б). Самцы, стимулированные антигенами эритроцитов барана (БЭ), демонстрировали максимальные значения концентрации кортикостерона до ссаживания и, особенно, при обострении социальных конфликтов, обусловленных ссаживанием животных (рис. 4А). Уровень тестостерона у самцов из группы БЭ не отличался от значений, характерных для контрольных особей в фоновых условиях, но был значительно ниже после завершения экспериментального ссаживания животных (рис.8Б).

Суммируя результаты этих исследований можно заключить, что активация иммунной системы, вызванная реплицируемыми (ВКЭ) и нереплицируемыми (БЭ) антигенами, существенно модифицирует поведенческий и эндокринный статус самцов.

Репродуктивный успех самок при спаривании с самцами из разных экспериментальных групп. Результаты прямой оценки приспособленности самцов показали, что иммунный статус самцов, в конечном итоге, оказывает существенное влияние на репродуктивный успех покрытых ими самок. Исследованные группы не различались по числу фертильных покрытий. Количество живых эмбрионов в пересчете на одного самца, проведшего ночь с интактной самкой, оказалось минимальным в группах иммунизированных (БЭ) и инфицированных ВКЭ(+) самцов (рис. 5А). Сравнение до- и постимплантационных потерь показало, что самки, вынашивающие потомство самцов, зараженных вирусом клещевого энцефалита ВКЭ(+) характеризуются максимальными домплантационными потерями (рис. 5Б). У самок, покрытых самцами, которым были введены БЭ, а также самцами группы ВКЭ(-), не выявлено достоверных отличий по уровню эмбриональных потерь от самок, покрытых контрольными самцами.

Число живых эмбрионов на 1-го Б п р е и м п л ан тац и о н н ы е 3, Эмбриональные потери, % А п о сти м п л ан тац и о н н ы е 3 2,5 1, самца 0, 0 БЭ ВКЭ(-) ВКЭ(+) Контроль БЭ ВКЭ(-) ВКЭ(+) Контроль Рис.5. Репродуктивный успех самок при активации иммунной системы вирусом клещевого энцефалита и эритроцитами барана их брачных партнеров.

А. Число живых эмбрионов на одного самца с учетом особей, не покрывших ни одной самки (*- P0. по сравнению с контролем, тест Mann-Whitney).

Б. Эмбриональные потери на до- и постимплантационных стадиях беременности (* - P0.05 по сравнению с контролем, t-тест Стьюдента).

Наблюдаемые различия в репродуктивном успехе самок, покрытых контрольными и экспериментальными самцами, могут быть обусловлены неодинаковой жизнеспособностью потомков этих самцов. При сравнении масс тела 16-ти дневных эмбрионов самыми тяжелыми оказались потомки контрольных самцов, а самыми мелкими потомки самцов, зараженных ВКЭ (рис. 6).

Успешная реализация онтогенетической программы внутриутробного развития находится под контролем женских половых гормонов. Поскольку прогестерону принадлежит ключевая роль в процессе имплантации и индукции клеточного деления, мы проанализировали изменчивость концентрации этого гормона в периоды имплантации и максимального предродового роста эмбрионов. Сравнительный анализ эндокринной обеспеченности беременности интактных самок показал, что имплантация эмбрионов – потомков контрольных и экспериментальных самцов проходила при практически одинаковой гормональной поддержке (рис. 6). Иная картина наблюдалась на 16-й день беременности, на завершающемся этапе органогенеза. В этот период у самок, вынашивающих потомков самцов, зараженных вирусом клещевого энцефалита, была отмечена минимальная концентрация прогестерона в плазме крови.

Таким образом, экспериментальная активация иммунной системы самцов, вызванная введением реплицируемых и нереплицируемых антигенов повлекла за собой некоторые неожиданные последствия. Во-первых, субклиническая доза ВКЭ повысила половую привлекательность самцов, социальную конкурентоспособность и стимулировала эндокринную функцию гонад. Выраженность эндокринного ответа этих самцов на экспериментально спровоцированный социальный конфликт не отличалась от реакции контрольных самцов. Несмотря на имеющиеся предпосылки к максимальной реализации репродуктивного успеха, самки покрытые самцами, зараженными вирусом, в отличие от контрольных, демонстрировали худшие показатели плодовитости и качества потомков. В свою очередь, введение бараньих эритроцитов негативно влияло на половую привлекательность, показатели конкурентоспособности, а социальные конфликты приводили к максимальной активации адренокортикальной функции и подавлению эндокринной функции гонад. Их меньшая репродуктивная эффективность по сравнению с контролем был связан с очень низкой результативностью спариваний.

780 a D a a,b Масса эмбрионов, мг Прогестерон, нг/мл a,b b 720 b 680 К БЭ ВКЭ К БЭ ВКЭ Рис. 6. Масса 16-ти дневных эмбрионов и концентрация прогестерона в плазме крови на 4-й (светлые столбики) и 16-й дни (заштрихованные столбики) беременности у самок, покрытых самцами из разных экспериментальных групп.

Одинаковыми буквами обозначены не различающиеся группы (P 0.05, LSD –тест) Итак, установлено, что запаховые сигналы самцов несут информацию о таких морфофизиологических свойствах, как агрессивность и уровень стрессированности. При этом спаривание с предпочитаемым самцом обеспечивает более эффективное внутриутробное развитие зародышей, но не отражается на показателях потенциальной и фактической плодовитости самок. Вместе с тем, оптимальный выбор самки могут ограничивать видоспецифические особенности социальной организации, а также заражение паразитами способными нарушать формирование половых сигналов. Наши эксперименты показали, что потенциальная способность самцов к значительным ресурсным затратам на маркировочное поведение сочетается с меньшей эффективностью эмбрионального развития потомства. Искажения половых сигналов, обусловленные инфекцией или антигенной стимуляцией иммунной системы, также негативно влияют на показатели приспособленности самцов. Следует отметить, что снижение массы эмбрионов, наблюдаемое при скрещивании с самцами, экскретирующими больше белка, или с самцами, зараженным вирусом клещевого энцефалита, сочетается и с меньшей концентрацией прогестерона в крови беременных самок.

ГЛАВА 2. ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БРАЧНЫХ ПАРТНЕРОВ И ЭНДОКРИННОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ Распознавание иммунной системой матери антигенного статуса плода определяет особенности их иммуноэндокринных взаимоотношений и в конечном итоге успех беременности. Механизмы взаимной регуляции иммунной и эндокринной систем в период беременности имеют как общие черты с реакцией организма на паразитарные и трансплантационные антигены, так и свои особенности. Главное отличие заключается в том, что активация иммунной системы матери не сопровождается резорбцией и отторжением антигенно-отличных от материнского организма эмбрионов. Ведущую роль в переключении иммунной реакции на безопасный для эмбрионов противовоспалительный - Th2 путь играет прогестерон (Szekeres-Bartho, 2002). Поскольку в большинстве своем эти иммуноэндокринные взаимодействия были исследованы in vitro, мы проанализировали состояние прогестеронпродуцирующей системы при разных иммуногенетических взаимоотношениях матери и зародышей в условиях in vivo.

Методы исследования. Исследование выполнено на половозрелых (3-4 месяца) мышах линий, имеющих различия по Н-2 – локусу, BALB (Н-2d) и C57BL (H-2b). Вечером в клетку к каждому самцу подсаживали по 5 самок своей или иной линейной принадлежности. Факт покрытия устанавливали по наличию вагинальной пробки. В результате спаривания самки вынашивали чистолинейное BALB, C57BL и F1 BALB C57BL, F1 C57BL BALB потомство.

При пересадках эмбрионов в качестве доноров эмбрионов использовали самок линий BALB и C57BL, которых для получения чистолинейных эмбрионов подсаживали на ночь к, идентичным по линейной принадлежности самцам. Реципиентами эмбрионов были самки этих же линий, которых спаривали с вазэктомированными самцами.

Чистолинейных эмбрионов BALB и C57BL (72-84 часа развития) вымывали из маток 2-х доноров. Вымытые бластоцисты сортировали под микроскопом и 5-8 бластоцист, не имеющих визуальных отклонений, пересаживали в правый рог псевдобеременной самки на вторые сутки после покрытия.

Для изучения влияния на концентрацию прогестерона гуморальных факторов, содержащихся в спермальной жидкости, самок линии BALB спаривали с вазэктомированными самцами BALB или C57BL.

Эндокринные эффекты сингенной и аллогенной беременности были исследованы в период имплантации эмбрионов на 4-е сутки беременности и при полной инвазии в ткани эндометрия трофобласта на 7-е сутки беременности (Duc-Goiran et al., 1999). Беременных и псевдобеременных самок декапитировали на 4-е и 7-е сутки беременности. Образцы плазмы сразу замораживали и хранили до проведения измерений концентрации прогестерона.

После декапитации извлекали яичники и матки с эмбрионами, которые сразу помещали на лед. Все дальнейшие манипуляции, кроме взвешивания, проводили на льду.

По числу желтых тел (овулировавшие яйцеклетки) в яичнике, жизнеспособных и резорбировавших эмбрионов рассчитывали показатели теоретической и фактической плодовитости (Евсиков и др., 1977). Эмбрионы гомогенизировали на льду, гомогенат центрифугировали, супернатат декантировали в пробирки (эппендорф) и замораживали.

Антигенная стимуляция иммунной системы самок была выполнена по протоколу Хамбера (Humber et al., 1974). Через 40-42 часа после покрытия самкам вводили внутрибрюшинно 50 мкл гепаринизированной крови, взятой из ретроорбитального синуса сингенных (BALB) или аллогенных (C57BL) по отношению к самке самцов. На 16-й день беременности примерно 1/3 беременных самок была декапитирована для определения числа желтых тел (ЖТ) в яичниках, числа живых эмбрионов (ЖЭ) и их массы. Общие эмбриональные потери рассчитывали по формуле: общие эмбриональные потери = 100.(ЖТ-ЖЭ)/ЖТ. Другая часть самок завершала беременность родами. Сразу после родов проводился подсчет живых потомков и потомков, принятых к выкармливанию.

Радиоиммуный анализ концентрации прогестерона в плазме крови и эмбриональных тканях проводили после предварительной экстракции.

Концентрация прогестерона в плазме крови и эмбриональных тканях на ранних стадиях беременности при внутри- и межлинейных скрещиваниях. Имплантация сопровождалась значительным ростом уровня прогестерона (P0.001) (табл.4).

Дисперсионный анализ с факторами генотип самца, генотип самки и день беременности показал, что генотип родителей не оказывает значимого влияния на концентрацию прогестерона (F1,402 =0.032, P=0.80 для самцов и F1,402 = 0.001, P = 0.95 для самок). В то же время было обнаружено значимое влияние дня беременности (F1,402=7.04, P=0.007) и взаимодействия факторов - день беременности и генотип родителей (F1,402 = 9.68, P=0.002).

Концентрация прогестерона на 4-й день беременности была выше у самок, вынашивающих гибридное потомство.

Табл. 4. Концентрация прогестерона в плазме крови (нг/мл) самок до спаривания и на ранних стадиях внутрилинейной и межлинейной беременности Линейная До спаривания День беременности принадлежность Самки Самцы 4-й 7-й X±SE(n) X±SE(n) X±SE(n) b BALB BALB 1.8±0.4(11) 21.9±1.3(62) 30.5±2.3(68)** a C57BL 28.7±2.0(46) 27.1±2.7(41) b C57BL C57BL 4.8±1.0(11) 21.8±1.8(55) 29.3±2.7(53)** a BALB 28.8±2.1(43) 27.7±2.0(42) Различия между группами оценены на основе однофакторного дисперсионного анализа: для 4-го дня беременности – F3,202= 4.93, P0.01;

для 7-го дня – F3,220= 0.38. Здесь и в последующих таблицах средние значения, не отличающиеся друг от друга, обозначены одинаковыми буквами (LSD-test, P0.05). В скобках указано число особей.

** - P0.01 по сравнению с концентрацией прогестерона на 4-е сутки беременности.

На 7-й день беременности различия между группами самок, вынашивающих сингенных и аллогенных потомков, нивелировались.

Концентрация прогестерона во время беременности находится под контролем многих факторов. В частности, концентрация прогестерона в плазме крови матерей коррелирует с числом вынашиваемых потомков (Michael et al., 1975;

Barkley et al., 1979). В наших исследованиях среднее число эмбрионов (объединены данные по 4-м и 7-м суткам беременности), вынашиваемое одной самкой, было одинаковым (F = 1.77, P = 0.15) при внутрилинейной и межлинейной беременности, а связь уровня прогестерона в плазме крови с числом эмбрионов была обнаружена только на 7-й день у самок, вынашивающих сингенное потомство. Коэффициенты корреляции между концентрацией прогестерона в плазме крови и числом зародышей оказались следующими: у самок BALB при сингенной беременности r=0.43 (n=47;

P 0.01), при аллогенной r=0.11 (n=41);

у самок C57BL при сингенной беременности r=0.31 (n=49;

P 0.05) и при аллогенной r=0.10 (n=40). Таким образом, только при сингенной беременности мы обнаружили статистически значимую зависимость уровня прогестерона в плазме крови от числа эмбрионов.

При исследовании динамики концентрации прогестерона в эмбриональных тканях отмечено нарастание его концентрации от 4-го к 7-му дню беременности, за исключением тканей эмбрионов самок C57BL при их чистолинейном разведении (табл.5). Сравнение содержания прогестерона в тканях гибридных и чистолинейных зародышей самок линии BALB показало, что как на 4-й, так и на 7-й дни беременности гибридным эмбрионам присущи более высокие концентрации прогестерона по сравнению с чистолинейными эмбрионами. Содержания прогестерона в тканях эмбрионов, вынашиваемых самками линии C57BL, также было выше на 7-й день беременности у гибридных зародышей, чем чистолинейных.

Таким образом, на ранних стадиях аллогенной беременности отмечается более выраженная, по сравнению с сингенной, активация прогестеронпродуцирующей функции матерей. Наблюдаемые различия по концентрации прогестерона в плазме крови при внутрилинейной и межлинейной беременности отражаются на содержании прогестерона и в эмбриональных тканях. Ткани гибридных эмбрионов отличаются от чистолинейных зародышей большим содержанием прогестерона на 7-й день беременности.

Табл. 5. Содержание прогестерона в тканях зародышей (нг/мг) на ранних стадиях внутрилинейной и межлинейной беременности Линейная принадлежность День беременности Самки Самцы 4-й 7-й X±SE(n) X±SE(n) 2.5±0.3(27) b** BALB BALB 0.8±0.1(21) 3.8±0.6(24) a*# C57BL 1.3±0.1(14)* 1.6±0.2(25) b C57BL C57BL 1.2±0.1(15) 2.8±0.5(14) a,b*## BALB 1.2±0.2(15) Для 4-го дня – F3,60= 2.14, P=0.1;

для 7-го дня – F3,114= 5.66, P0.002.

** - P0.01 и * - P0.05 по сравнению с концентрацией прогестерона на 4-е сутки беременности.

## - P0.01 и # - P0.05 при сравнении гибридных зародышей с чистолинейными зародышами по t – критерию Стьюдента.

Среди причин, обеспечивающих поддержание большей концентрации прогестерона в крови и эмбриональных тканях у самок, вынашивающих гибридное потомство, можно выделить влияние гетерозиса на способность гибридных зародышей к синтезу веществ стимулирующих эндокринную функцию яичников, эффекты антигенов семенной жидкости и особенностей иммуногенетических взаимодействий матери и плода.

Концентрация прогестерона в плазме крови на ранних стадиях псевдобеременности.

При сравнении концентрации прогестерона в плазме крови на 4-е и 7-е сутки внутри- и межлинейной псевдобеременности у самок BALB, покрытых вазэктомированными самцами линий BALB и C57BL, значимых различий не обнаружили (табл. 6). В дальнейшем, на 7-е сутки, отсутствие эмбриональных сигналов приводит к снижению концентрации гормона.

Табл. 6. Концентрация прогестерона в плазме крови (нг/мл) самок до спаривания и на ранних стадиях внутрилинейной и межлинейной псевдобеременности Линейная принадлежность Эструс День псевдобеременности 4-й 7-й Самки Самцы X±SE(n) X±SE(n) X±SE(n) BALB BALB 1.8±0.4(13) 20.8±2.6(29) 4.9±2.1(12)** BALB C57BL 23.4±2.5(26) 6.0±3.2(13)** ** - P0.01 по сравнению с концентрацией прогестерона на 4-е сутки беременности.

Концентрация прогестерона в плазме крови и эмбриональных тканях на ранних стадиях беременности после внутри- и межлинейных пересадок эмбрионов.

Результаты трехфакторного дисперсионного анализа (генотипы матери и эмбрионов, день беременности), выявили значимое влияние материнского (F1,145 =14.50;

P 0.001) и эмбрионального (F1,145 =3.89;

P 0.05) генотипов, а также взаимодействие всех трех факторов (F1,145 =5.68;

P 0.02) на концентрацию прогестерона при беременности, наступившей в результате эмбриональных пересадок. На концентрацию прогестерона на 4-й день беременности оказывали влияние и материнский генотип, и генотип трансплантированных эмбрионов (Табл. 7). На 7-е сутки беременности эти различия нивелировались. Как и при естественной беременности, концентрация прогестерона в плазме крови оказалась выше после трансплантаций аллогенных эмбрионов. Сравнение содержания прогестерона в тканях эмбрионов разных генотипов показало, что на 4-й день беременности оно было самым высоким у зародышей линии BALB, трансплантированных самкам C57BL (Табл. 8). К 7-му дню беременности выявленные различия нивелировались.

Табл. 7. Концентрация прогестерона в плазме крови (нг/мл) у беременных самок после внутри- и межлинейных пересадок эмбрионов Генотип День беременности Процедуры Мать Эмбрионы 4 X±SE(n) X±SE(n) b 15.7±2.6(24)b BALB BALB 19.9±2.5(27) 27.8±2.9(31)a 19.1±1.8(25)b Пересадки C57BL 17.6±3.2(6)a,b 37.7±5.3(10)a C57BL C57BL 29.6±2.6(16)a* 29.3±2.7(14)a BALB Для 4-го дня – F3,98=2.50, P0.05;

для 7-го дня – F3,85= 8.75, P0.001.

*- P=0.06 при сравнении по t- критерию Стьюдента аллогенной и сингенной беременности у самок C57BL.

Полученные данные можно отнести к косвенным доказательствам ведущей роли антигенных различий системы мать-плод в гормональной поддержке беременности.

Дополнительные аргументы в пользу этой точки зрения были получены в последующих экспериментах, в которых была использована иммуностимуляция беременных самок, находящихся на ранней стадии внутрилинейной беременности, эритроцитами аллогенных самцов.

Табл. 8. Содержание прогестерона (нг/мг) в тканях зародышей на ранних стадиях беременности после внутри- и межлинейных трансплантаций Гепотип День беременности Мать Эмбрионы 4-й 7-й X±SE(n) X±SE(n) 1.3±0.2(11) b BALB BALB 4.7±0.6(25) 1.6±0.3(16) b C57BL 4.1±0.6(29) 2.2±0.5(5) b C57BL C57BL 6.5±1.0(11) 3.9±0.5(17) a BALB 6.0±1.2(13) Для 4-го дня – F3,45= 11.69, P0.001;

для 7-го дня – F3,73=2.11, P=0.11.

Аллогенная иммуностимуляция беременных самок кровью самцов. Дополнительная иммуностимуляция самок линии BALB, вынашивающих чистолинейное потомство, проведенная на доимплантационной стадии беременности (1-е сутки), аллоантигенами крови самцов линии C57BL, оказала значимое влияние на гормональное обеспечение процесса имплантации, которое проявилось в существенном увеличении концентрации прогестерона в плазме крови в период имплантации (рис. 7). Введение же эритроцитов сингенных самцов не оказывало влияния на уровень прогестерона, который не отличался от значений, наблюдаемых при инъекции беременным самкам физиологического раствора A Рис. 7. Концентрация прогестерона в Прогестерон, нг/мл плазме крови на 4-й день беременности у B самок линии BALB, получивших через 20 B 18 сутки после покрытия инъекции 16 физиологического раствора (контроль) или 50 мкл крови самцов своего генотипа (BALB) или иного генотипа (C57BL).

Достоверно различающиеся средние Контроль BALB/c C57BL обозначены разными буквами (P0.05, LSD Доноры эритроцитов тест).

Как следует из данных, представленных в таблице 9, иммуностимуляция не оказывала существенного влияния на показатели потенциальной и фактической плодовитости, а также на величину эмбриональных потерь. Вместе с тем, судя по массе 16-ти дневных зародышей, иммуностимуляция антигенами крови самцов повлияла на темпы роста эмбрионов, которые были выше при аллогенной иммуностимуляции.

При анализе перинатальных потерь (первые сутки после рождения) оказалось, что полная гибель потомков, обусловленная отказом матерей от кормления, была нулевой в группе самок, подвергнутых аллогенной иммуностимуляции (табл. 10). У контрольных матерей и матерей, которым вводили кровь самцов своего генотипа, отказ от выкармливания наблюдался более чем в 20 % случаев. В результате при одинаковых размерах пометов самки, подвергнутые аллогенной иммунизации, выкормили наибольшее число потомков.

Табл. 9. Показатели плодовитости и масса эмбрионов у самок разных экспериментальных групп Экспериментальные группы Параметры Аллогенные Сингенные эритроциты эритроциты Контроль Число желтых 7.55±0.91 (10) 6.61±0.42 (13) 8.08±0.67 (13) тел беременности Число живых 5.4±0.63 (10) 4.15±0.73 (13) 5.92±0.68 (13) эмбрионов Эмбриональные 34.9±5.2 37.2±5.2 26.7±4. потери, % 557±5.2 (54)a 519±8.0 (54)b 498±7.0 (77)b Масса эмбрионов, мг Средние значения, не отличающиеся друг от друга, обозначены одинаковыми буквами (LSD-test, P0.05), а в скобках указано число случаев.

Табл. 10. Потери новорожденных в период вскармливания Экспериментальные группы Параметры Аллогенные Сингенные эритроциты эритроциты Контроль Отношение Отвергнутые/выкормленные 0/18 6/20 5/ потомки 30.0±10.2** 21.7±8.6* Отвергнутые 0± потомки, % 3.85# 3.78# Выкормленных потомков на 5. одну самку Размер помета 5.44±0.41 5.50±0.44 4.83±0. * ** - P0.05;

- P0.01 по сравнению с аллогенной стимуляцией по t – критерию Стьюдента.

# P0.05 по сравнению с аллогенной стимуляцией, тест Манн-Уитни.

Полученные однонаправленные изменения эндокринного статуса, наблюдаемые при межлинейных скрещиваниях, аллогенных пересадках зародышей и аллогенной иммуностимуляции, указывают на ведущую роль антигенных различий между матерью и плодом в стимуляции прогестеронпродуцирующей функции яичников. Суммируя результаты исследований концентрации прогестерона при сингенных и аллогенных скрещиваниях, пересадках эмбрионов и иммуностимуляции, можно заключить, что повышение концентрации прогестерона при аллогенной беременности является следствием прямого или опосредованного стимулирующего действия аллоантигенов плода на эндокринную функцию яичников. Согласно нашим наблюдениям, для индукции иммуно-эндокринных механизмов, ответственных за повышение концентрации прогестерона в период имплантации, достаточно однократного воздействия антигенами генетически отличного самца в том случае, если максимальная иммунная реакция на это воздействие совпадает по времени с моментом имплантации. Усиление прогестеронпродуцирующей функции, индуцированное действием на материнский организм отцовских антигенов в период имплантации, оказывает существенное влияние не только на процессы, связанные с текущим эмбриональным развитием, но и на формирование материнских качеств, определяющих жизнеспособность потомства на постнатальном этапе онтогенеза.

ГЛАВА ЭНДОКРИННЫЙ СТАТУС БЕРЕМЕННЫХ САМОК И 3.

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АДАПТИВНЫХ СВОЙСТВ ПОТОМКОВ Строго координированный ход всех процессов реализации онтогенетической программы обеспечивается совокупностью соответствующих регуляторных механизмов, среди которых особое место занимают системы иммуноэндокринной регуляции. Именно иммуноэндокринные изменения, наблюдаемые нами у беременных самок при межлинейных скрещиваниях, аллогенных трансплантациях и антигенной стимуляции, могут быть основной причиной модификационной изменчивости потомства при различиях МНС генотипов матери и эмбрионов.

Методы исследования. Исследования выполнены на самцах мышей инбредных линий BALB/cLac, C57BL/6J, их реципрокных гибридах, а также на самцах BALB/cLac и C57BL/6J, полученных путем внутри и межлинейных эмбриональных пересадок. Возраст тестированных животных варьировал от 3.5 до 4.5 месяцев, В соответствии с типами спариваний и эмбриональных трансплантаций потомки составили следующие экспериментальные группы: группа С - потомки BALB/cLac BALB/cLac;

группа В потомки C57BL/6J C57BL/6J;

группа СВ - потомки BALB/cLac C57BL/6J;

группа ВС потомки C57BL/6J BALB/cLac;

группа Т-С – потомки, полученные путем трансплантации эмбрионов линии BALB/cLac самкам линии BALB/cLac (BALB BALB);

группа Т-В – потомки, полученные путем трансплантации эмбрионов линии C57BL/6J самкам линии BALB/cLac (C57BL/6J BALB/cLac). После завершения периода вскармливания детенышей отнимали от матерей и помещали по 5 самцов в стандартные клетки для содержания мышей. В возрасте 7-9 недель животных пересаживали в индивидуальные клетки и далее содержали одиночно.

Гормональную реакцию самцов на социальный конфликт исследовали в 15 мин тестах: парного ссаживания на нейтральной арене диаметром 50 см с чистой подстилкой и межгруппового ссаживания на нейтральной арене 5-6 самцов в течение 30 мин. Пары составляли из 2-х самцов, принадлежащих к одной экспериментальной группе с приблизительно равным весом тела. Гормональная реакция на парное ссаживание была исследована в группе С - у 26 самцов, в группе В – у 30 самцов, в группе СВ – у самцов, в группе ВС – у 14 самцов, в группе Т-С – у 30 самцов и в группе Т-В – у самцов. В тесте межгруппового ссаживания приняли участие по 14 самцов из групп С, В, СВ, ВС, Т-С и 4 из группы Т-В.

Для измерения в плазме крови концентрации кортикостерона у всех животных, за 2-3 дня до тестирования и сразу же после него, были взяты пробы крови из ретроорбитального синуса.

Адренокортикальная реакция сингенных и аллогенных потомков на социальный конфликт. Исследование адренокортикальной реакции на социальный конфликт самцов, полученных в результате внутрилинейных и межлинейных спариваний, а также путем внутри- и межлинейных пересадок бластоцист, проведено в двух независимых экспериментах.

Внутригрупповое парное ссаживание. Двухфакторный дисперсионный анализ результатов, полученных при внутригрупповом парном ссаживании, выявил достоверное влияние на концентрацию кортикостерона в плазме крови самцов типа экспериментальной группы (F5,253 = 18.17;

P0.001), социального конфликта (F1,253 = 453.47;

P0.001) и их взаимодействия (F5,253 = 20.56;

P0.001). Стрессирующее влияние поведенческих взаимодействий самцов при ссаживании парами проявлялось в увеличении концентрации кортикостерона у мышей во всех экспериментальных группах (рис.8). Максимальный адренокортикальный ответ на социальный конфликт отмечался в группах реципрокных гибридов. По адренокортикальному ответу на действие стрессирующих факторов в условиях парного ссаживания самцы из групп С, Т-С и В занимали промежуточное положение. Потомки межлинейных трансплантаций эмбрионов мышей линии C57BL/6J (группа Т-В) отличались от самцов других экспериментальных групп, в том числе и от линии C57BL/6J (группа В), минимальной гормональной реакцией на социальный конфликт.

500 A B Кортикостерон, нг/мл Кортикостерон, нг/мл 300 150 T-C C BC CB B T-B BC CB C T-C B T-B Группы самцов Группы самцов Рис. 8. Концентрация кортикостерона в плазме самцов в возрасте 3.5-4.5 мес. после теста парного ссаживания (А) и межгруппового ссаживания по 5-6 особей (В).

Стрелки над столбиками объединяют достоверно не различающиеся средние значения (Множественное сравнение средних – LSD-тест, P0.05).

Сравнение адренокортикальной реакции на межгрупповое ссаживание 5-6 самцов, проведенное методом двухфакторного дисперсионного анализа, показало, что на концентрацию кортикостерона в этих условиях значимое влияние оказывают принадлежность к экспериментальной группе (F5,136 = 12.40;

P0.001), ссаживание (F1,136 = 994,11;

P0.001) и взаимодействие этих факторов (F5,136 = 6.15;

P0.001). У самцов всех групп ссаживание вызывало достоверный прирост концентрации кортикостерона относительно базального уровня. Максимальный адренокортикальный ответ на социальный конфликт был обнаружен у мышей BALB/cLac (рис. 8), полученных в результате внутрилинейных эмбриональных трансплантаций (группа Т-С). Минимальная гормональная реакция, также как и при парном ссаживании, была отмечена у межлинейных трансплантантов (Т-В) - самцов линии C57BL/6J. Самцы, полученные в результате естественных внутри- и межлинейных спариваний, занимали промежуточное положение по гормональной реакции на межгрупповое ссаживание. При сравнении гормональной реакции на ссаживание самцов BALB/cLac (группа С) и C57BL/6J (группа В) оказалось, что так же, как и при парном ссаживании, концентрация кортикостерона в этих условиях была выше у мышей BALB/cLac.

Таким образом, на адренокортикальную реакцию - главный индикатор неспецифического адаптивного ответа организма на действие стрессирующих факторов, в данном случае стрессоров социальной природы, - влияют и генотип мышей, и особенности условий материнской среды, которые складываются в период внутриутробного вынашивания сингенного или аллогенного потомства. Самцы линии BALB превосходили линию C57BL/6J по гормональной реакции на социальный конфликт в каждом из проведенных экспериментов. Гормональная реакция гибридных потомков зависела от условий проведения экспериментов и была максимальной, по сравнению с другими группами, при внутригрупповом парном ссаживании. При изменении экспериментальных условий, ссаживание по одному самцу из каждой группы, гибридные самцы не отличались от самцов чистой линии C57BL/6J, характеризующихся минимальной реактивностью адренокортикальной функции. Условия внутриутробного развития, складывающиеся при внутрилинейных трансплантациях эмбрионов (Т-С) не влияли на адренокортикальную реакцию половозрелых потомков на социальные конфликты. У потомков, полученных путем межлинейных трансплантаций эмбрионов, наблюдалась минимальная адренокортикальная реакция на социальные конфликты в разных экспериментальных моделях.

Поведенческие реакции потомков матерей, подвергнутых во время беременности сингенной или аллогенной иммунизации Методы исследования. Исследование выполнено на самцах BALB/cLac в возрасте 3.5-4. месяцев, потомках самок BALB/cLac, подвергнутых аллогенной или сингенной иммунизации во время беременности, по схеме, описанной выше. На основании типа воздействия на самок в период беременности их потомки (самцы) составили следующие экспериментальные группы по 30-35 особей в каждой: группа АС – потомки матерей BALB/cLac, подвергнутых аллогенной иммуностимуляции кровью самцов C57BL/6J;

группа СС – потомки матерей BALB/cLac, которым вводили кровь сингенных самцов BALB/cLac;

группа К – контроль, потомки матерей BALB/cLac, которым вводили физиологический раствор.

Этолого-физиологические свойства были последовательно оценены у 20- животных из каждой группы следующим набором методов: 1) тест открытого поля;

2) внутригрупповое парное ссаживание;

3) межгрупповое ссаживание 3-х самцов по одному из каждой группы;

4) ссаживание самки с самцом для исследования полового поведения;

5) измерение гуморального иммунного ответа. Интервал между проведением выше перечисленных тестов составлял 5-7 дней. Все поведенческие тесты проводили в период максимальной двигательной активности животных с 02:00 до 06:00 часов. Для определения максимального потребления кислорода были исследованы по 10 особей из каждой экспериментальной группы, не подвергавшиеся, каким либо дополнительным воздействиям.

Концентрацию кортикостерона и тестостерона в плазме крови определяли радиоиммуным методом.

Поведенческая и вегетативная реакция на новизну. Эмоциональная реакция грызунов при помещении их в новые условия сопровождается, как правило, изменением поведения и активацией вегетативной нервной системы, основные проявления которой включают Рис. 9. Вегетативная реакция потомков 5 38, контрольных и Болюсы 38, Температура тела антигенстимулированных матерей на 4, Температура тела помещение в открытое поле.

4 37, Экспериментальные группы: СС – введение * Болюсы 37,8 крови самцов линии BALB;

АС – введение крови 3, самцов линии C57Bl.

37, *- P0.05 для дефекации по сравнению с 3 37, контролем (тест Манн-Уитни) и для 37, температуры по сравнению с введением 2, 37, сингенной крови самцов линии BALB/cLac (t 2 37,3 критерий Стьюдента).

Контроль BALB C57BL Доноры эритроцитов в себя увеличение частоты дефекаций и температуры тела (Markel et al., 1985). При исследовании комплекса поведенческих реакций на новые условия в тесте открытого поля у взрослых потомков BALB/cLac, рожденных самками BALB/cLac, которым во время беременности вводили эритроциты самцов сингенной (BALB/cLac) или аллогенной (C57BL/6J) линий мышей, различий между экспериментальными группами выявлено не было. Вегетативная реакция на новые условия в тесте открытого поля была неодинаковой у особей разных экспериментальных групп. Оба показателя, - число актов дефекаций и ректальная температура, измеренная сразу после теста, - были минимальными у самцов экспериментальной группы АС (рис.9).

В тесте парного внутригруппового ссаживания мы практически не наблюдали агрессивных взаимодействий между самцами, только в 8.3 % тестов были зафиксированы драки между партнерами, что не позволило провести сравнение агрессивности между исследуемыми группами мышей. При ссаживании 3-х самцов (по одному из каждой группы) количество драк между партнерами нарастало. При этом участие в драках самцов разных экспериментальных групп было одинаковым. На основании соотношения числа агрессивных и пассивно-оборонительных актов в каждом тесте межгрупповых ссаживаний животные были разделены на доминантов и подчиненных. В трех, из всех проведенных тестов, мы не смогли определить иерархический статус животных, поскольку все самцы, участвовавшие в этих тестах, демонстрировали очень низкую агрессивность. Соотношение доминантов/субординантов было максимальным в группе АС (9/8), а минимальным в группе СС (3/14). Самцы контрольной группы занимали промежуточное положение (5/12). Различия между группами АС и СС были достоверно значимыми: 2 =4.64;

P=0.03.

Результаты прямого наблюдения полового поведения самцов показали, что при подсаживании на 30 мин к самкам потомки антигенстимулированных матерей (группа АС) демонстрируют больше садок и интромиссий по сравнению с самцами группы СС (табл. 11). Судя по вагинальным пробкам, обнаруженным у самок после ночи проведенной с самцом, большая половая активность самцов группы АС сочетается с их лучшей репродуктивной эффективностью.

Таблица 11. Половое поведение и вероятность покрытия (% самок с вагинальной пробкой) у самцов из разных экспериментальных групп.