Медицинский университет удк 578.835.15:578.53 кучеров игорь иванович вич-инфекция: экспериментальное моделирование
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.06 – вирусология Минск 2010 1 Работа выполнена в ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии».
Научный консультант: Рытик Петр Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории диагностики ВИЧ и сопутствующих инфекций ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» Официальные оппоненты: Жаворонок Сергей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, директор ГУ «Республиканский методический центр по высшему и среднему медицинскому и фармацевтическому образованию» Коломиец Наталья Дмитриевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой эпидемиологии и микробиологии ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» Семенов Валерий Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, декан лечебного факультета УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» Оппонирующая организация: УО «Гомельский государственный медицинский университет» Защита состоится 24 июня 2010 года в 14.00 на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.04 при УО «Белорусский государственный медицинский университет» по адресу: 220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83;
e-mail:
[email protected] (тел. 272-55-98).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УО «Белорусский государственный медицинский университет».
Автореферат разослан «» мая 2010 года.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат медицинских наук, доцент А. М. Близнюк ВВЕДЕНИЕ За истекший период с момента выявления первых больных СПИДом (1981 г.) и обнаружения возбудителя заболевания – вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (1983 г.) – проделана большая работа по изучению этиопатогенеза инфекции, генетической структуры вируса, разработаны методы лабораторной диагностики и химиотерапии заболевания. В настоящее время ведутся интенсивные работы по созданию профилактических вакцин и разработке методов вакцинотерапии инфекции. Создано уже более 40 различных образцов вакцин, нуждающихся в проверке их эффективности.
В то же время лабораторная модель ВИЧ-инфекции на мелких лабораторных животных, позволяющая проводить доклинические испытания вакцинных препаратов, до сих пор не разработана.
В последнее время было установлено, что, несмотря на неоспоримые успехи комбинированной антиретровирусной (АРВ) химиотерапии ВИЧ/СПИДа, подобная стратегия имеет ряд существенных недостатков. Основными из них являются: быстрое развитие у вируса резистентности к используемым этиотропным средствам (в т. ч. и перекрестной), выраженные побочные эффекты АРВ препаратов и высокая стоимость лечения (2,5–3,0 тыс. долларов США на годовой курс лечения одного пациента) [A.S. Bourinbaiar, V. Jirathitikal, 2003]. Эти факты явились основополагающим моментом для поиска новых ингибиторов ВИЧ среди природных, синтезированных и лекарственных соединений с включения их в новые схемы химиотерапии ВИЧ/СПИДа.
Третья, требующая решения задача заключалась в разработке и производстве импортозамещающей подтверждающей тест-системы, основу которой составляют натуральные белки выделенного на территории Беларуси вируса.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Связь работы с научными программами и темами. Диссертация выполнена на базе ГУ «РНПЦ эпидемиологии и микробиологии» в рамках выполнения проектов ГНТП «Изучить эпидемиологию ВИЧ-инфекции, свойства выделенных штаммов, разработать экспериментальную модель, осуществить поиск ингибиторов возбудителя СПИДа» (1991–1995 гг., № госрегистрации 1993100), «Приготовить диагностикум для обнаружения антител к ВИЧ- методом иммунного блоттинга» (1996–1997 гг., № госрегистрации 19971373), «Осуществить поиск отечественных лекарственных препаратов для лечения и профилактики СПИДа» (1998–2000 гг., № госрегистрации 19983420), «Разработать и испытать отечественную схему этиотропной терапии СПИДа и ВИЧ-инфекции» (2001–2005 гг. № госрегистрации 20012332), а также НИР № Б05К-014 фонда фундаментальных исследований НАН Беларуси «Провести поиск анти-ВИЧ препаратов среди природных и синтетических соединений» (2005–2007 гг., № госрегистрации 2053709), проекта В-984 Международного научно-технического Центра «Поиск новых эффективных ингибиторов ВИЧ на основе соединений класса полидисульфидов» (2005–2008 гг.) и ГКПФОФПИ МЗ РБ «Современные технологии в здравоохранении» по теме «Провести лабораторный контроль за эффективностью двухкомпонентной схемы химиотерапии ВИЧ-инфекции (пентоксифиллин + азидотимидин)» (2006– 2008 гг., № госрегистрации 20062773).
Цель и задачи исследования. Цель работы – повышение эффективности мер противодействия эпидемии ВИЧ/СПИДа на территории Республики Беларусь с помощью разработки экспериментальной модели инфекции на лабораторных животных, расширения арсенала антивирусных средств, конструирования и организации производства отечественного конфирматорного диагностикума.
В соответствии с целью исследования решались следующие задачи:
– определить оптимальные параметры моделирования ВИЧ-инфекции на хлопковых крысах на основе клинических, морфологических и вирусологических данных;
– испытать антиретровирусную активность природных меланин глюкановых комплексов (МГК) из высших базидиомицетов;
– осуществить поиск ингибиторов ВИЧ среди химических соединений оригинального синтеза класса полисульфидов;
– провести скрининг лекарственных средств различной фармакологической направленности на анти-ВИЧ активность;
– оценить способность найденных ВИЧ-ингибиторов подавлять репликацию резистентного к азидотимидину (АЗТ) варианта вируса;
– определить характер фармакологического взаимодействия выявленных ингибиторов между собой и в комбинациях с АЗТ;
– разработать технологию пролонгированного культивирования высокорепликативного штамма ВИЧ без существенного снижения инфекционной активности вируса;
– сконструировать отечественную диагностическую тест-систему на принципе иммунного блоттинга.
Объект исследования: отечественный высокорепликативный изолят вируса иммунодефицита человека, Т-лимфобластоидные клеточные линии (4), хлопковые крысы (132 особи), природные (7) и синтезированные химические соединения (79) и официнальные лекарственные средства (307).
Предмет исследования: клинико-лабораторные особенности ВИЧ инфекции у хлопковых крыс;
антиретровирусная активность природных, синтезированных соединений и различных лекарственных средств;
взаимодействие их с эталонным ингибитором – азидотимидином;
процесс стабильного получения высокотитражного антигенного материала для производственных целей.
Положения, выносимые на защиту:
1. Хлопковые крысы (Sigmodon fulviventer) восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека и являются оригинальной, доступной лабораторной моделью ВИЧ-инфекции in vivo. Этот факт подтверждается высокой летальностью инфицированных животных (29,3±3,4%), фактом интеграции провирусной ДНК с хромосомной ДНК клеток органов-мишеней и прогрессирующей дегенерацией этих органов. Клиническими предвестниками гибели ВИЧ-инфицированных особей, доминирующей среди самцов (82% всех случаев, Р0,05), являются повышение температуры и снижение массы тела.
Интеграционный феномен генетических материалов вируса и клеток хозяина зарегистрирован в 82,5% препаратов селезенки и 76,2% образцах головного мозга. Заключительная фаза морфологических изменений в этих органах характеризуется признаками атрофии и дегенерации (в ЦНС – некроз и некробиоз нейронов, в селезенке – редукция лимфоидных фолликулов с разрежением лимфоидных элементов). Частота генетической интеграции, выраженность морфологических изменений и гибель подавляющего большинства (88%) подопытных животных нарастает в динамике развития инфекционного процесса и приходится на вторую половину 6-месячного срока наблюдения.
2. Некоторые природные меланин-глюкановые комплексы (МГК) из высших базидиомицетов (Inonotus obliquus, Lentinus edodes, Phellinus igniarius и Fomes fomentarius), а также соединения оригинального синтеза класса полисульфидов и их производные (металлокомплексы дифенолов) активно подавляют репликацию вируса иммунодефицита человека в Т-лимфоидных клетках человека. Все 5 выявленных образцов МГК отличаются низкой цитотоксичностью, а показатели их химиотерапевтических индексов (ХТИ) располагаются в пределах 8,8–16,3. Два из 79 испытанных химических соединений класса полисульфидов обладают выраженной антиретровирусной активностью. ХТИ полисульфида орто-аминобензойной кислоты составляет 7,9, а металлокомплекса меди с лигандом 4,6-ди-трет-бутил-3-[(2-гидроксиэтил) тио]бензен-1,2диолом, – 8,4. Оба соединения существенно (на 71–79%) подавляют синтез вирусного капсидного белка р24 ВИЧ-1 in vitro и относятся к разряду умеренно токсичных.
3. Три из 307 испытанных и широко используемых терапевтических средств (ксантинола никотинат, пентоксифиллин и тардиферон) в условиях экспериментов in vitro обладают способностью подавлять репликацию как чувствительного к эталонному ингибитору ВИЧ – азидотимидину (АЗТ), – так и резистентного к нему вариантов вируса. Уровни ХТИ указанных медикаментов в первом случае составляют 30,0;
25,0 и 12,0, во втором – 8,0;
7, и 24,0 соответственно. Эти препараты оказывают синергическое влияние на анти-ВИЧ активность АЗТ в составе 2- и 3-компонентных комбинаций.
В первом случае ХТИ АЗТ в отношении резистентного к нему клона ВИЧ возрастает до 12,3±1,4 (Р0,05), 13,2±1,8 (Р0,05) и 7,5±1,1 (Р0,05) соответственно, а в комбинациях (АЗТ+ПФ+ксантинола никотинат и АЗТ+ПФ+тардиферон) на чувствительном варианте вируса – с 58,3±6,8 до 75,0±8,7 (Р0,05) и 61,1±6,9 (Р0,05) соответственно. Пентоксифиллин в сочетании с АЗТ существенно (на 27,1±3,4%, Р0,05) усиливает ингибирующие свойства последнего в отношении синтеза вирусного белка р24.
4. Разработанная оригинальная методика культивирования высокорепликативного (rapid-high) штамма ВИЧ-1 позволяет получать производственные объемы полноценного вирусного материала, содержащего весь его антигенный спектр, включая диагностически значимые высокомолекулярные гликопротеиды gp41, gp120 и gp160. Технология обеспечивается путем поддерживания в клетках-продуцентах перманентного состояния острой инфекции и активации затухающего процесса с помощью фитогемагглютинина (5,0–10,0 мкг/мл в течение 24–48 часов). На этой основе разработана нормативно-техническая документация (лабораторный, регламент, технические условия и инструкция по применению) на производство отечественной конфирматорной тест-системы «Бел.ВИЧ-1 Блот» для выявления в специфических антител к ВИЧ методом иммунного блоттинга. Произведено и реализовано 17 серий, проведено более 1500 анализов.
Личный вклад соискателя. Все основные научные результаты диссертационной работы получены автором лично. Соискатель лично выполнил эксперименты по моделированию ВИЧ-инфекции на хлопковых крысах;
провел скрининг природных, синтезированных и лекарственных препаратов на анти-ВИЧ активность;
осуществил комплексные испытания потенциальных ингибиторов ВИЧ на АЗТ-чувствительном и АЗТ-резистентном вариантах вируса;
провел испытания препаратов в составе 2- и 3-компонентных комбинаций;
определил уровни инфекционной активности вируса в условиях обедненной питательной среды;
провел эксперименты по активации инфекционного процесса в инфицированных клетках;
выполнил статистическую обработку экспериментальных данных. Детекция провирусной ДНК ВИЧ-1 в клеточном геноме хлопковых крыс проводилась диссертантом при методической помощи профессора В.Е.Г. Мюллера (Институт физиологической химии Университета г. Майнца, Германия) [5, 9, 23, 60];
гисто-морфологические исследования препаратов головного мозга и селезенки животных проводились совместно с заведующим отделом эпидемиологии и иммунопрофилактики инфекционных заболеваний ГУ «РНПЦЭМ» профессором Н.Н. Полещуком и сотрудником лаборатории диагностики ВИЧ и сопутствующих заболеваний ГУ «РНПЦЭМ» Г.П. Дубойской [6];
отработка режимов проведения электрофореза и переноса вирусных белков на нитроцеллюлозную мембрану проведена совместно с научным сотрудником лаборатории биотехнологии и иммунодиагностики особо опасных инфекций ГУ «РНПЦЭМ» Т.В. Школиной [31, 63]. Эксперименты по определению токсической дозы соединений in vivo проводились совместно с сотрудником Научно-технического центра РУП «МБИ» Н.И. Мельновой [77]. В работах [4, 8, 10–22, 24–30, 32–39, 41–59, 61, 62, 64–76] диссертанту принадлежит анализ данных литературы и итогов собственных экспериментальных исследований и формулирования выводов. Автор принимал активное участие в разработке рекомендаций по практическому использованию результатов научной работы [1–3, 7, 30, 40, 78, 79].
Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований и положения диссертации доложены на 3-й международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека» (г. Санкт-Петербург, 1995 г.), 4–10, 12, и 17-й международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (г. Санкт-Петербург, 1995–2002 гг., 2007–2008 гг.), Х международном конгрессе вирусологов (г. Иерусалим, Израиль, 1996 г.), международной научно практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии» (г. Минск, 1998 г.), II международной конференции «Вирусные гепатиты и ВИЧ-инфекция» (г. Минск, 1999 г.), расширенном Пленуме инфекционистов Республики Беларусь с участием фтизиатров, иммунологов и дерматовенерологов (г. Гомель, 2000 г.), 2-й итоговой научно-практической конференции НИИЭМ «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (г. Минск, 2001 г.), республиканской научно-практической конференции инфекционистов и эпидемиологов (г. Гомель, 2001 г.), 3-й итоговой научно-практической конференции НИИЭМ «Современные проблемы инфекционной патологии человека и медицинской биотехнологии» (г. Минск, 2002 г.), международной конференции «Роль антропогенных и природных патогенов в формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека «Медико-экологические проблемы» (г. Минск, 2002 г.), республиканской научно-практической конференции «Медико-социальные проблемы ВИЧ-инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и инфекций, передаваемых половым путем» (г. Минск, 2002 г.), 4-й итоговой научно-практической конференции НИИЭМ «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (г. Минск, 2003 г.), республиканской научно-практической конференции «Медико-социальные аспекты ВИЧ-инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и ИППП» (г. Минск, 2003 г.), республиканской научно-практической конференции «Медико-социальные аспекты ВИЧ-инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и ИППП» (г. Минск, 2003 г.), 13-м международном симпозиуме «HIV & Emerging Infectious Diseases» (г. Тулон, Франция, 2004 г.), республиканской научно-практической конференции, посвященной 80-летию НИИЭМ «Проблемы инфекционной патологии XXI века» (г. Минск, 2004 г.), 26-м африканском Конгрессе по здравоохранению (Египет, 2005 г.), XVI международной конференции по СПИДу (г. Торонто, Канада, 2006 г.), международном межведомственном научном семинаре (г. Патайя, Таиланд, 2006 г.).
Опубликованность результатов диссертации. По теме диссертации опубликовано 79 научных работ: в т.ч. статьи в рецензируемых научных журналах – 29 (из них 14 опубликованы за пределами Республики Беларусь), публикации в рецензируемых сборниках научных трудов – 9, статьи в сборниках научных трудов – 21 (из них 2 опубликованы за пределами Республики Беларусь), тезисы в сборниках материалов съездов и конференций – 13 (из них 12 опубликованы за пределами Республики Беларусь), методические рекомендации – 1, авторские свидетельства на изобретения СССР – 2, патента на изобретения Республики Беларусь – 3, лабораторный регламент на производство диагностической тест-системы – 1. В авторских листах:
публикаций, соответствующих пункту 18 Положения о присуждении ученых степеней и присвоения ученых званий в Республике Беларусь – 18,5, других публикаций – 14.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах (без списка литературы и приложений). Работа иллюстрирована 24 таблицами и 29 рисунками (объем по тексту 22 страницы). Диссертация состоит из оглавления, перечня условных обозначений, введения, общей характеристики работы, шести глав (включая обзор литературы), заключения, библиографического списка (333 использованных источника и 79 публикаций соискателя) и приложений. Общий объем диссертации составляет 338 страниц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Клетки. Эксперименты проводили на перевиваемых Т-лимфобластоидных клеточных линиях CEM.SS, Jurkat-tat3, Molt4/8 и МТ-4. Криоконсервацию клеток осуществляли по стандартной методике [A. Aldovini, B. Walker, 1990] в собственной модификации с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО).
Вирус. В экспериментах использовали лабораторный rapid/high штамм ВИЧ-1zmb, выделенный от проживавшего на территории республики вирусоносителя [П.Г. Рытик и др., 1989]. Культивирование ВИЧ в условиях низкого (1,5–2,5%) содержания эмбриональной сыворотки проводили по собственной методике [И.И. Кучеров, И.А. Подольская, 1997, 1998].
Резистентные (R+) к азидотимидину (АЗТ) варианты вируса получали путем его культивирования в присутствии постоянно повышающихся концентраций АЗТ в питательной среде.
Животные. Хлопковые крысы (Sigmodon fulviventer) обоего пола массой 70–80 г получены из питомника «Столбовая» РАМН (РФ). Определение острой токсичности химических соединений осуществляли на беспородных мышах самках, содержащихся на обычном пищевом режиме и стандартизованных по массе тела (18–20 г).
Препараты. Образцы меланин-глюкановых комплексов (МГК) из представителей высших базидиальных грибов предоставлены сотрудниками Института клеточной биологии и генной инженерии) НАН Украины (рук.
проф. Л.Ф. Горовой). Химические соединения класса полисульфидов, являющиеся продуктами оригинального синтеза, предоставлены сотрудниками химического факультета Белорусского государственного университета (рук.
проф. О.И. Шадыро). Официнальные лекарственные средства поступали непосредственно от заводов-изготовителей (АО «Минмедпрепараты», ОАО «Борисовский фармацевтический завод») или через аптечную сеть.
Определение антиретровирусной (АРВ) активности. Скрининг проводили методикой формазанового теста (ФТ) в МТТ-варианте по собственной модификации. Реакцию проводили на 96-луночных планшетах («Costar», США) в конечном объеме 200 мкл. Результаты учитывали на 4-е сутки на спектрофотометре («Organon Teknika» 230S) при длине волны 540 нм.
Индекс защиты клеток рассчитывали по формуле R. Pauwells et al. (1988).
В качестве позитивного контроля АРВ активности в каждом эксперименте использовали коммерческий препарат азидотимидина (АЗТ).
Определение степени жизнеспособности клеток производили с помощью прижизненной окраски клеток 0,2% водным раствором трипанового синего (ОТС) путем подсчета в камере Горяева живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток.
Контроль интенсивности репродукции вируса в инфицированных клетках проводили методом непрямой иммунофлюоресценции (НИФ). Методические приемы осуществляли по стандартному протоколу [F.G. Burleson et al., 1992] в собственной модификации. Для устранения неспецифических эффектов в раствор конъюгата вносили краситель Эванс-блю (Evans blue) в разведении 1:1000 из расчета 1,0 мкл на 60,0 мкл готового раствора. Учет результатов проводили путем подсчета 200 клеток в УФ диапазоне с определением процентного содержания клеток с характерным для вируса изумрудно-зеленым мембранным свечением.
Присутствие в культуральной среде белка р24 ВИЧ определяли через 24 часа после заражения клеток («острая инфекция») с помощью иммуноферментного анализа на тест-системах, произведенными фирмами «Вектор-Бест» (п. Кольцово, РФ) и «Vironostika HIV-1 Antigen» (Финляндия).
Токсичность исследуемых препаратов определяли по величине МПК (максимально переносимая концентрация). Выраженность ВИЧ-ингибирующей активности оценивали по химио-терапевтическому индексу (ХТИ):
соотношению МПК и МАК (минимальная активная концентрация). Показатели ХТИ, равные 2,0 и ниже указывали на отсутствие антивирусной активности, 2–8 – средневыраженную, выше 8,0 – высокую степень антивирусной активности исследуемых образцов [Е.И. Бореко, 2003].
Определение острой токсичности химических соединений на мышах осуществляли в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» (Москва, 2005 г.).
Биохимические методы. Концентрацию вируса проводили путем ультраскоростного центрифугирования (ротор SW-27 при 22000 об/мин в течение 1 часа при t=4оС). Очистку белков ВИЧ осуществляли повторным центрифугированием в прерывистом 15% и 45% градиенте урографина (SW-27, 22000 об/мин, 2 часа при t=4оС), после чего вирус переосаждали в «бляшку» путем центрифугирования (SW-60, 35000 об/мин, 1 час при t=4оС). Осажденный вирус ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (pН=7,2) в пропорции 1:100 от исходного объема и инактивировали путем прогревания на водяной бане в течение 1 часа при t=56оС. Концентрацию белка определяли на спектрофотометре DU-70 при длине волны 280 нм.
Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Laemmli U.K. (1970) в пластинах толщиной 1,5 мм в течение 18 часов при напряжении 60V. Электроперенос вирусных белков на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) осуществляли полусухим способом [Н. Towbin et al., 1979] с использованием НЦМ («Schleicher & Schuell») с диаметром пор 0,45 мкм.
Реакцию иммунного блоттинга при использовании отечественной тест системы «Бел. ВИЧ-1 Блот» осуществляли согласно разработанной с участием автора инструкции.
Приготовление образцов для морфологического контроля. Образцы головного мозга и селезенки хлопковых крыс для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали парафином. Перед проведением исследований проводили депарафинизацию и обезвоживание срезов, после чего их окрашивали гематоксилином/эозином по Нисслю (крезиловым фиолетовым) и азуром II-эозином.
Морфологические исследования (ультраструктурный анализ) препаратов головного мозга и селезенки осуществляли методом прямой электронной микроскопии. Для этого образцы органов животных помещали на 1 час в 2,5% забуференный раствор глутарльадегида (рН=7,2) при 4оС, фиксировали в течение 1 часа в 1% растворе OsO4 и обезвоживали путем проведения через ряд спиртов повышающейся концентрации, после чего заключали в аралдит.
Ультратонкие срезы обрабатывали уранилацетатом, цитратом свинца и изучали под электронным микроскопом (JEM-100 CX-II).
Получение препаратов нуклеиновой кислоты (НК). Выделение суммарной НК из клеток головного мозга и селезенки подопытных животных проводили в соответствии с руководством Маниатиса Т. и др. (1979) путем их обработки протеиназой К в присутствии 1% SDS. Препараты хромосомной НК получали методом фенольной экстракции.
Определение провирусной ДНК ВИЧ осуществляли с помощью модифицированной полимеразной цепной реакции (ПЦР) («Roche HIV-1 test»).
Амплификацию проводили на термоциклере «Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 thermal cycler». Процесс амплификации состоял из 20–35 повторяющихся циклов (1–2 мин при t=50оС, 2–6–10 сек. при t=95оС, 10 сек. при t=55оC, 10 сек.
при t=72оС, 7–35: 10 сек. при t=90оС, 10 сек. при t=60оC и 10 сек. при t=72оС).
Гибридизация. Полученные ампликоны ДНК методом химического денатурирования переводили в односпиральное состояние путем добавления в каждую пробу по 100 мкл денатурирующего раствора. Затем в лунки 96-луночного микропланшета, сорбированные ампликон-специфическими антителами, вносили по 100 мкл гибридизационного буфера и по 25 мкл денатурированных ампликонов ДНК. Детекция. После инкубации в течение 60 мин при t=37оС в лунки вносили по 100 мкл субстрата (TMB – tetramethylbenzidine) и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре добавляли по 100 мкл стоп-реагента (4,9% H2SO4). Результаты учитывали на спектрофотометре «Organon Teknika» 230S при длине волны 450 нм.
Статистическая, математическая и графическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0, BIOSTAT, Microsoft Excel. Для описания полученных результатов рассчитывали среднюю арифметическую (М) и ошибку средней арифметической (m). На рисунках и в тексте результаты представлены в виде M±m [С. Гланц, 1999].
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Экспериментальная ВИЧ-инфекция на хлопковых крысах С целью создания модели ВИЧ-инфекции in vivo в качестве подопытных животных были использованы хлопковые крысы. Выбор был обусловлен фактами восприимчивости этих животных к полиовирусам, многим респираторным вирусам, возбудителю сыпного тифа [П.Г. Рытик, 1971] и вирусу осповакцы [В.Г. Гудков, 1981].
Инфицирование животных проводилось двумя способами:
ретробульбарным и внутрибрюшинным. В первом случае (50 особей) вируссодержащий материал вводился инъекционно по 0,4 мл под правое и левое глазное яблоко, во втором (50 особей) – однократно по 0,8 мл в подвздошную впадину. Контрольной группе (32 особи) вводился аналогичный материал, не содержащий ВИЧ. Срок наблюдения составил шесть месяцев. Ежемесячно часть животных опытных и контрольных групп подвергали вивисекции, а их органы (головной мозг и селезенка) исследовали морфологическими (гистологический и ультраструктурный анализ) и вирусологическими (ПЦР) методами.
Клинические наблюдения. Термометрия. В течение двух первых недель у контрольных и экспериментальных животных развивалась схожая лихорадочная реакция, обусловленная введением гетерологичных белков.
Пик повышенной температуры приходился на 6–9 сутки после инъекции.
К концу 1-го месяца температурная реакция у животных обеих групп возвращалась к норме. Начиная с 3-го месяца, у отдельных инфицированных особей регистрировалась повторная лихорадочная волна, сопровождающаяся признаками респираторного заболевания и заканчивающаяся их гибелью.
Динамика массы тела. У отдельных ВИЧ-инфицированных особей, начиная с 4-го месяца, регистрировалось резкое падение массы тела на фоне выраженных катаральных явлений и лихорадки, приводивших к летальному исходу. В группе контрольных животных подобных явлений не отмечено.
В динамике массы селезенки на начальной стадии эксперимента отчетливо прослеживалась тенденция увеличения относительной массы органа зараженных особей по сравнению с контрольными, достигшее к концу 2-го месяца показателя +20,9±2,3% (p0,05). Однако, по мере удлинения срока наблюдения она сменилась на противоположную и к концу 6-месячного срока снизилась на 19,3±1,9% (p0,05) по сравнению с контрольной группой. Эта динамика более отчетливо проявилась в группе самцов, получивших внутрибрюшинную инъекцию.
Кумулятивная летальность инфицированных особей составила 29,3±3,4% (в контрольной группе – 6,25±1,1%, p0,05). Гибель подавляющего числа опытных животных (15 из 17, или 88%) пришлась на вторую половину эксперимента (4–6-й месяцы). Предварявшие гибель катаральные явления (насморк и чихание) постепенно сменялись одышкой и хриплым дыханием.
Животные становились малоподвижными, отказывались от пищи и заметно теряли в массе. С момента появления первых признаков болезни до гибели животного проходило 1–1,5 месяца. У части инфицированных особей (как правило, самцов) на 5–6-м месяцах обнаруживались парезы конечностей, выраженный рвотный рефлекс и судороги. На вскрытии у 64,7±5,3% (p0,05) павших особей обнаружены изменения легких в виде потемнений («опеченения»), частичной атрофии с очагами геморрагий и некроза.
У контрольных животных кроме признаков полнокровия селезенки в конечной стадии эксперимента других нарушений не отмечено.
Гисто-морфологические исследования. Гистологическими анализами установлено, что на ранней (1–2-й месяцы) стадии эксперимента в контрольных органах (головной мозг и селезенка) ВИЧ-инфицированных животных четко выявлялись признаки воспалительной реакции. В головном мозге она проявлялась в виде пролиферации микро- и макроглии, а в селезенке на первый план выступали явления гиперплазии белой пульпы и гипертрофии фолликулов на фоне увеличения количества бластных клеток. Начиная с 3-го месяца в обоих органах нарастали дегенеративные процессы. Для ЦНС были характерны признаки прогрессирующей дезинтеграции (во всех участках мозга появлялись узелковые инфильтраты на фоне полного некроза нейронов).
В селезенке регистрировалась резкая (вплоть до полной) редукция фолликулов.
Более выраженная и интенсивная патология отмечена при внутрибрюшинном введении инфекционного материала.
При ультраструктурном анализе препаратов головного мозга инфицированных особей в глиальных клетках наблюдались явления пролиферизации наряду с признаками дистрофии отдельных астроцитов, усиливающиеся по мере увеличения срока эксперимента. К 5-му месяцу у всех животных формировалась картина очаговой демиелинизации аксонов, сопровождавшаяся их распадом. Часто наблюдались 2–3-ядерные астроциты, обусловленные появлением узких перетяжек ядерной мембраны (псевдомногоядерность) (рисунок 1).
В селезенке на ранних сроках наблюдения регистрировалось увеличение числа герминативных центров, что свидетельствовало об активации периферической генерации В-лимфоцитов. На более поздних стадиях отмечалось резкое уменьшение лимфоидных элементов в парафолликулярной зоне, увеличение количества макрофагов на единицу площади и появление очагов дегенерирующих клеток, что позволяет косвенно судить о развитии иммунологической недостаточности.
Рисунок 1 – Ультраструктура астроцитов коры головного мозга крыс в терминальной стадии инфекции: двуядерный астроцит (стрелки) с сохраненными внутрицитоплазматическими органеллами. Окраска уранилацетатом и цитратом свинца (ув. 15 500) Вирусологический контроль осуществлялся путем детекции генетического материала ВИЧ в тканях головного мозга и селезенки животных с помощью ПЦР. Всего исследовано 126 образцов ДНК от 67 особей: 82 образца от подопытных и 44 – от контрольных животных. На основании проведенных анализов была установлена следующая картина (таблица 1).
Таблица 1 – Присутствие провирусной ДНК ВИЧ в тканях инфицированных хлопковых крыс Источник ДНК Способ Месяцы селезенка головной мозг заражения наблюдения опыт контроль опыт контроль 2/3*) 0/ 2/ 0/ 2-й 0/ 3/ 0/ 3-й 6/ Внутри 0/ 6/ 0/ 4/ 5-й брюшинный 0/ 6/ 0/ 6/ 6-й Всего 18/19 0/12 17/20 0/ 1/ 1-й 1/ 0/ 1/ 2-й 0/ 2/ 0/ 4/ 3-й 0/ 2/ Ретробуль 1/ 5/ 0/ 5/ барный 5-й 0/ 4/ 0/ 5/ 6-й Всего 15/21 0/11 15/22 1/ Примечание – *) В числителе – количество позитивных результатов обнаружения провирусной ДНК ВИЧ, в знаменателе – общее число исследованных образцов ДНК.
Провирусная ДНК ВИЧ обнаружена в 33 из 40 образцов селезенки (82,5%) и в 32 из 42 (76,2%) образцов головного мозга. Динамика этих находок была схожей: количество позитивных результатов ПЦР увеличивалось по мере удлинения сроков наблюдения. Так, если по окончании 3-месячного периода в геноме клеток селезенки провирусная ДНК ВИЧ была обнаружена у 13 из 19 (68,4%) подопытных животных, то на 5–6-х месяцах – уже в 20 из 21 образцов (95,2%). В препаратах ЦНС эти цифры составили соответственно 11 из 19 (57,9%) за первый квартал и 21 из 23 (91,3%) за 5–6-й месяцы (p0,05).
Суммарно позитивными оказались 24 из 38 (63,2%) проб ДНК, полученных в течение первых 3-х месяцев, а на протяжении двух последних – 41 из 44 (93,2%).
Отмечены некоторые различия развития инфекционного процесса в зависимости от способа заражения животных. При внутрибрюшинном пути инфицирования ткань селезенки 100% инфицировалась уже к концу 3-го месяца. В ткани ЦНС этот процесс несколько запаздывал, однако и здесь начиная с 5-го месяца во всех без исключения (12 из 12) пробах был обнаружен ДНК-провирус. Ретробульбарный способ оказался менее эффективным, хотя и в этом случае в подавляющем большинство (30 из 42, или 71,4%) образцов были ПЦР-позитивными. При этом вирус депонировался практически с одинаковой частотой в тканях обоих органов. Так, позитивными были 15 из 21 (71,4%) образцов селезенки и 15 из 22 (68,2%) – головного мозга. Следует отметить, что в образцах мозговой ткани (в отличие от селезенки) не отмечено 100%-ых результатов ПЦР даже через полгода после заражения животных.
Таким образом, полученные экспериментальные данные клинических, морфологических и вирусологических наблюдений за инфицированными хлопковыми крысами дают основание полагать, что эти животные чувствительны к вирусу иммунодефицита человека и являются доступной моделью ВИЧ-инфекции in vivo. Для испытания на ней вакцинных препаратов необходимо соблюдение следующих рекомендаций:
1. В качестве подопытных животных предпочтение следует отдавать самцам.
2. Испытуемые вакцинные препараты следует вводить до инфицирования животных, т. е. до реализации процесса интеграции провирусной ДНК с клеточным геномом.
3. Предпочтение следует отдавать внутрибрюшинному инфицированию.
4. ПЦР-детекцию генетического материала ВИЧ в органах инфицированных животных следует начинать не ранее 5-го месяца после заражения.
5. В качестве тестируемого материала целесообразнее использовать ткани селезенки.
Скрининг новых ингибиторов ВИЧ среди природных, синтезированных и лекарственных средств С целью поиска новых ингибиторов ВИЧ для включения их в новые схемы комбинированной терапии ВИЧ/СПИДа испытаниям на наличие антиретровирусной активности были подвергнуты 393 соединения: 7 образцов природных продуктов, содержащих меланин-глюкановые комплексы (МГК), 79 соединений оригинального синтеза класса полисульфидов и 307 официнальных лекарственных средств различного фармакологического профиля.
Испытания природных субстанций из высших базидиомицетов на анти-ВИЧ активность. Основанием для проведения испытаний природных МГК на анти-ВИЧ активность явились научные публикации последних лет о наличии у них антиоксидантных, антибактериальных, антивирусных (грипп, герпес) и генопротекторных свойств (L.F. Gorovoj et al., 2002). Полученные в результате экспериментов данные подтвердили обоснованность этого предположения (таблица 2). В результате комплексных испытаний установлено наличие у природных субстанций, экстрагированных из представителей ряда высших базидиомицетов, высоких уровней анти-ВИЧ активности. Показатели ХТИ образцов из Inonotus obliquus (№7) колеблются в пределах 6,6–11,0, Lentinus edodes (№8) – 12,5–20,8, Phellinus igniarius (№10) – 8,8–17,7, Fomes fomentarius (№11) – 14,5–27,2, а также препарат «Меланин» (357) – 8,6–15,9, что свидетельствует об их принадлежности к высокоактивным ингибиторам вирусной активности.
Таблица 2 – Антиретровирусная активность меланин-глюкановых комплексов из высших базидиомицетов в испытаниях in vitro АРВ активность МГК в испытаниях различными методиками ФТ ОТС НИФ МГК МАК МАК МАК ХТИ ХТИ ХТИ мкг/мл мкг/мл мкг/мл №7 50,3±3,8 10,93 83,6±2,6 6,58 64,7±4,8 8, №8 18,3±1,4 13,66 12,0±0,7 20,83 20,0±2,7 12, №9 100,3±5,7 2,49 45,4±4,8 5,50 41,3±3,5 6, № 10 50,1±4,2 8,8 25,4±1,7 17,72 32,0±3,4) 14, № 11 33,7±2,1 16,32 20,2±1,9 27,23 38,0±3,5 14, № 357 37,7±3,1 15,92 40,0±4,3 15,0 70,0±5,7 8, № 358 150,2±7,4 3,99 123,5±5,5 4,85 104,0±6,3 5, Обращает на себя внимание факт почти полного отсутствия у меланин глюкановых субстанций токсичности в отношении лимфоидных клеток.
Максимально переносимые концентрации (МПК) представленных образцов составляли 250–550 мкг/мл, что характеризует их как препараты с низкой цитотоксичностью.
Проверка соединений оригинального синтеза на антиретровирусную активность. Проведенные в недавнем прошлом сотрудниками химического факультета БГУ исследования показали, что некоторые производные фенолов, дифенолов и аминофенолов являются универсальными ингибиторами свободнорадикальных процессов, эффективно замедляющими процессы окисления и фрагментации биомолекул (пептидов, липидов, углеводов и др.) (O.I. Shadyro et al., 2003). Не менее примечательными в этом отношении объектами считаются и некоторые металлокомплексы (МК), представляющие собой комплексы металлов с различными органическими соединениями (лигандами). Некоторые МК, в первую очередь комплексы меди (Cu), активны в отношении жизнедеятельности многих бактерий, дрожжей и грибков (N.V. Loginova et al., 2006). С учетом вышеизложенного представлялось интересным проведение испытаний некоторых представителей этого класса соединений в отношении ВИЧ. Испытания проводились по терапевтической схеме на клетках MT-4. Всего на анти-ВИЧ активность было изучено 79 синтезированных соединений (65 образцов полисульфидов и 14 металлокомплексов).
Из 65 испытанных соединений оригинального синтеза класса полисульфидов одно (полисульфид о-аминобензойной кислоты формулы C14H12N2O4Sn) отличалось высоким уровнем АРВ активности. Показатели ХТИ при оценке различными методиками (ФТ, ОТС, НИФ) укладывались в параметры 6,26–7,89, что свидетельствует о достаточно высоком уровне противовирусной активности соединения. В дозах 0,6–75,0 мкг/мл препарат существенно (на 77–79%, Р0,01) снижает уровни синтеза капсидного белка р24 ВИЧ-1 в инфицированных клетках. По результатам испытаний на острую биотоксичность соединение относится к V разряду, что соответствует определению «умеренная токсичность».
Изучение металлокомплексов (МК) с синтетическими лигандами позволило выявить ряд закономерностей. Во-первых, некоторые лиганды проявили слабовыраженные АРВ свойства. Во-вторых, активность МК напрямую зависела как от самого лиганда, так и входящего в состав комплекса металла.
При этом выраженность ВИЧ-ингибирующих свойств у МК в подавляющем большинстве случаев была выше, чем у лиганда вне комплекса. В-третьих, присутствие металла в комплексе, как правило, существенно снижало цитотоксичность лиганда, независимо от природы последнего.
Наиболее выраженные АРВ свойства проявили металлокомплексы меди.
Выявлена анти-ВИЧ активность МК меди с 4,6-ди-трет-бутил-3-[(2 гидроксиэтил)тио]бензен-1,2диолом (МК-64): ХТИ соединения, по данным формазанового теста, составило 8,36. В дозах 0,16–4,0 мкг/мл металлокомплекс существенно (на 71–79%, Р0,01) подавлял продукцию вирусного антигена р24.
Согласно принятой классификации оценки фармакологического эффекта, данное соединение относится к категории умеренно токсичных соединений (V разряд токсичности).
Обнаружение среди 79 соединений оригинального синтеза из класса полидульфидов двух активных в отношении ВИЧ образцов различной пространственной конфигурации дают основание продолжать поиск активных соединений в этом направлении.
Поиск ингибиторов ВИЧ среди лекарственных средств различного фармакологического профиля. Позитивные результаты обнаружения АРВ ингибиторов среди природных и синтезированных соединений подразумевают дальнейшие их испытания по подбору эффективных и безопасных доз препаратов, проверку их тератогенности и другие стандартные фармакологические процедуры, предшествующие внедрению новых лекарственных средств в медицинскую практику. Как правило, этот процесс занимает от 3 до 5 лет. В этом свете выгодно выглядит поиск эффективных АРВ средств среди уже используемых в лечебной практике препаратов с известными фармакологическими свойствами, применяемыми по своему прямому, не связанному с ВИЧ/СПИДом, назначению.
Всего было испытано 307 медикаментозных средств различного фармакологического профиля, производимых преимущественно отечественной фармацевтической промышленностью (68%) и предприятиями Российской Федерации (27%). У 11 медикаментов (белласпон, витогепат, гепарин, димедрол, ксантинола никотинат, линкомицина гидрохлорид, нитрогранулонг, пентоксифиллин, тардиферон, L-тироксин и ФиБС) при скрининговых тестах обнаружены различные уровни АРВ активности в условиях экспериментов in vitro. Показатели ХТИ этих препаратов в формазановом тесте составили 9,5;
8,3;
27,5;
5,5;
30,0;
6,0;
6,0;
25,0;
12,0;
5,5 и 8,0 соответственно. Комплексными испытаниями с использованием трех методик учета результатов (ФТ, ОТС и НИФ) наличие ВИЧ-ингибирующих свойств было подтверждено у 6 из них (белласпон, гепарин, ксантинола никотинат, линкомицина гидрохлорид, пентоксифиллин и тардиферон): уровни ХТИ располагаются в интервалах 9,5–23,8;
27,5–137,5;
30,00;
6,0–12,0;
25,0–100,0 и 12,0–20,0 соответственно (таблица 3).
Таблица 3 – Комплексная оценка противовирусной активности лекарственных средств (терапевтическая схема) АРВ активность лекарственных средств в испытаниях различными методиками Препарат ФТ ОТС НИФ МАК (мкг/мл) ХТИ МАК (мкг/мл) ХТИ МАК (мкг/мл) ХТИ Белласпон 10,0±1,6 9,5 4,0±0,9 23,8 4,0±0,7 23, Гепарин (МЕ/мл) 4,0±0,5 27,5 0,8±0,25 137,5 4,0±0,5 27, Ксантинола 2,0±0,8 30,0 2,0±0,8 30,0 2,0±0,9 30, никотинат (КН) Линкомицина 1,0±0,2 6,0 1,0±0,2 6,0 0,5±0,12 12, гидрохлорид (ЛГ) Пентоксифиллин 2,0±0,7 25,0 2,0±0,5 25,0 0,5±0,08 100, Тардиферон (ТФ) 10,0±1,0 12,0 10,0±1,0 12,0 6,0± 1,1 20, Тем не менее, полученные экспериментальные данные об обнаружении у известных лекарственных средств новых фармакологических свойств, а именно – способности в той или иной мере подавлять репликацию ВИЧ в культуре клеток – явились основанием для проведения дальнейших испытаний всех 11 медикаментов на АЗТ-резистентном штамме ВИЧ, а также в составе двух- и трехкомпонентных комбинаций с азидотимидином.
Испытания выявленных ингибиторов ВИЧ на АЗТ-резистентном варианте вируса и в составе различных комбинаций Испытания на АЗТ-резистентном варианте ВИЧ. Хорошо известно, что длительное время (в течение 10 и более лет) азидотимидин оставался единственным этиотропным лечебным средством при ВИЧ/СПИДе, и многие штаммы вируса приобрели за этот период устойчивость к препарату. По этой причине особую важность приобретают медикаментозные средства, способные ингибировать репликацию АЗТ-резистентных вариантов вируса. Это предопределило дальнейшее направление экспериментальных исследований.
Все 11 отобранных на первом этапе испытаний медикаментов были протестированы на лабораторном АЗТ-резистентном (R+) штамме ВИЧ-1zmb (таблица 4).
Таблица 4 – Антивирусная активность лекарственных средств в отношении АЗТ-резистентного варианта ВИЧ-1zmb в испытаниях на клетках MT- АРВ активность лекарственных средств в испытаниях различными методиками Препарат ФТ ОТС НИФ МАК (мкг/мл) ХТИ МАК (мкг/мл) ХТИ МАК (мкг/мл) ХТИ Белласпон 15,0±2,3 6,3 17,5±3,6 5,4 50,0±4,2 1, Витогепат не активен 1:400±50 3,4 не активен – – Гепарин (МЕ/мл) 10,0±2,1 11,0 0,8±0,1 137,5 4,0±0,6 27, Димедрол не активен не активен не активен – – Ксантинола никотинат 7,5±1,5 8,0 5,0±0,8 12,0 7,5±1,5 8, (КН) Линкомицина 2,0±0,2 3,0 2,0±0,2 3,0 2,5±0,3 2, гидрохлорид (ЛГ) Нитрогранулонг 2,5±0,1 3,0 не активен не активен – – Пентоксифиллин (ПФ) 6,5±1,1 7,7 6,0±0,9 8,3 1,0±0,1 50, Тардиферон (ТФ) 5,0±0,8 24,0 10,0±1,6 12,0 8,5±1,2 14, L–тироксин 2,0±0,08 2,75 не активен не активен – – ФиБС не активен не активен не активен – – – Полученные результаты демонстрируют способность 6 из 11 лекарственных средств подавлять активность (R+) варианта вируса. Несмотря на повышение значений МАК у большей их части, 4 из них (гепарин, ксантинола никотинат, пентоксифиллин и тардиферон) по-прежнему оставались в группе высокоактивных препаратов (уровни ХТИ сохранялись выше 8,0). С другой стороны, 2 высокоактивных в отношении (R-) штамма вируса препарата (белласпон и линкомицина гидрохлорид) при испытаниях на устойчивом варианте ВИЧ резко снизили свою активность. Остальные 5 медикаментов (витогепат, нитрогранулонг, L-тироксин, димедрол и ФиБС) практически не оказывали никакого действия на резистентный к АЗТ вирус. Другими словами 7 из 11 лечебных средств оказались неэффективными в отношении устойчивого к АЗТ клону ВИЧ.
Проверка совместимости лекарственных средств в составе различных комбинаций. Влияние лекарственных препаратов на активность АЗТ в двухкомпонентных сочетаниях. Несмотря на то, что современная стратегия терапии ВИЧ/СПИДа подразумевает полный и повсеместный отказ от монотерапии, почти во всех используемых в настоящее время схемах комбинированной химиотерапии наличие АЗТ (или его аналогов) остается неизменным. Принципиальным положением при разработке отечественной схемы химиотерапии ВИЧ/СПИДа также является использование АЗТ в качестве основного звена этиотропного воздействия на возбудителя инфекции. Дополнительным же фактором подавления репродукции вируса, препятствующим развитию у него резистентности, должно стать применение новых анти-ВИЧ активных лекарственных средств, круг которых был определен предыдущими испытаниями.
Учитывая это, была проведена серия экспериментов, целью которых заключалась в выяснении характера взаимодействия каждого из 11 отобранных лечебных средств с азидотимидином. Эффективность комбинаций проверяли одновременно на чувствительном (R-) и резистентном (R+) вариантах вируса.
В каждой серии испытаний тестировали по 4 двухкомпонентные комбинации с каждым из препаратов, концентрация АЗТ в которых составляла соответственно 4,0–1,0–0,2–0,04 мкг/мл. Усиливающими антивирусные свойства АЗТ считали те препараты, комбинация с которыми в 5 раз и более снижали показатель МАК у АЗТ. Повышение этого показателя трактовали как проявление антагонизма между препаратами. В остальных случаях результаты рассматривали как нейтральные.
В итоге испытаний 2-компонентных комбинаций АЗТ с выявленными ингибиторами ВИЧ установлено, что 4 лекарственных препарата (гепарин, ксантинола никотинат, пентоксифиллин и тардиферон) расширяли диапазон активных концентраций АЗТ в отношении обоих вирусных клонов. Наиболее эффективными в этом плане оказались комбинации АЗТ+КН и АЗТ+ПФ, продемонстрировавшие сходные уровни ингибирующей активности как в отношении (R-), так и (R+) вариантов ВИЧ. Остальные 7 препаратов негативно влияли на антиретровирусные свойства АЗТ и ингибировали его активность.
Испытания трехкомпонентных комбинаций. Полученные экспериментальные данные о влиянии лекарственных средств на антиретровирусную активность азидотимидина и пентоксифиллина в диплетных комбинациях явились основанием для проведения испытаний 3-компонентных композиций препаратов, обязательными элементами состава которых являлись АЗТ и ПФ. Главной целью экспериментов являлось изучение влияния лекарственных средств на вирусингибирующие свойства азидотимидина. Эксперименты проводились в терапевтическом варианте на АЗТ-чувствительном варианте ВИЧ. Всего были испытаны по 4 парных комбинаций АЗТ+ПФ (их концентрации составили 4,0+40,0;
1,0+10,0;
0,2+2, и 0,04+0,4 мкг/мл соответственно) с добавлением эффективной в отношении ВИЧ дозы третьего ингредиента. Учет и интерпретация результатов велись согласно критериям предыдущих испытаний (таблица 5).
Таблица 5 – Показатели минимальной активной концентрации (МАК) АЗТ в составе триплетных комбинаций АРВ активность АЗТ в 3-компонентных сочетаниях с лекарственными средствами Состав комбинаций ФТ ОТС НИФ МАК МАК МАК ХТИ ХТИ ХТИ (мкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл) АЗТ (монопрепарат) 0,04±0,01 125,0 0,2±0,08 25,0 0,2±0,08 25, АЗТ+ПФ+белласпон 2,0±0,6 2,5 1,2±0,4 4,2 1,4±0,3 3, АЗТ+ПФ+витогепат 4,5±0,2 1,1 не активен – 3,5±0,7 1, АЗТ+ПФ+гепарин 0,2±0,08 25,0 1,0±0,3 5,0 0,8±0,1 6, АЗТ+ПФ+димедрол 1,5±0,3 3,3 4,2±0,4 1,2 не активен – АЗТ+ПФ+КН 0,04±0,01 125,0 0,1±0,06 50,0 0,1±0,06 50, АЗТ+ПФ+ЛГ 1,0±0,5 5,0 не активен – 4,0±0,3 1, АЗТ+ПФ+НГ 2,5±0,5 2,0 1,8±0,3 2,8 3,0±1,1 1, АЗТ+ПФ+тардиферон 0,04±0,01 125,0 0,15±0,01 33,3 0,2±0,08 25, АЗТ+ПФ+L-тироксин 2,8±0,2 1,8 2,2±0,2 2,3 не активен – АЗТ+ПФ+ФиБС 3,5±0,8 1,4 3,0±0,4 1,7 не активен – Результаты испытаний триплетных комбинаций показали, что в таких сочетаниях подавляющее большинство испытуемых лекарственных средств подавляли антивирусную активность АЗТ. Наиболее показательными в этом отношении являются данные, зарегистрированные с помощью НИФ. Итогом проведенных испытаний 3-компонентных сочетаний лекарственных средств, явился тот факт, что лишь в двух таких комбинациях (АЗТ+ПФ+КН и АЗТ+ПФ+тардиферон) анти-ВИЧ активность АЗТ несколько усиливалась.
Добавление же в комбинацию АЗТ+ПФ остальных испытуемых медикаментов приводило к подавлению ВИЧ-ингибирующих свойств АЗТ.
Таким образом, проведенными экспериментами была установлена возможность эффективного терапевтического воздействия на репликацию ВИЧ в инфицированных клетках при использовании 3-компонентных композиций, состоящих из АЗТ+ПФ и ксантинола никотината или тардиферона.
Влияние потенциальных ингибиторов на продукцию антигена р24 ВИЧ.
С целью подтверждения обнаруженных АРВ свойств у 3 наиболее перспективных лекарственных средств (пентоксифиллин, ксантинола никотинат и тардиферон) они были подвергнуты тестированию на способность подавлять продукцию капсидного антигена р24 ВИЧ. Определение концентрации вирусного белка в культуральной среде проводили через 24 часа после инфицирования клеток.
Проведенные испытания показали, что все три лекарственных препарата существенно снижали продукцию этого вирусного антигена. Степень подавления синтеза р24 инфицированными клетками была сопоставима с действием АЗТ. Например, при концентрациях АЗТ 0,2–0,04 мкг/мл наблюдался минимальный (70–65±1,5 пг/мл) уровень продукции р24, который был на 40,9% ниже (p0,05), чем в контроле вируса (110±8,8 пг/мл). В то же время после обработки клеток пентоксифиллином в дозе 2,0 мкг/мл также наблюдалось существенное (p0,05) снижение продукции р24 на 36% (с 125±7,6 до 80±2,5 пг/мл). Схожие данные получены и у ксантинола никотината (2,0 мкг/мл) и тардиферона (2,0 мкг/мл). Уровни р в культуральной среде при этих условиях снижались с 70±3,4 пг/мл (контроль вируса) до 45±1,9 и 50±2,2 пг/мл соответственно (p0,05).
Таким образом, экспериментально установлено, что введение пентоксифиллина, ксантинола никотината или тардиферона состав комбинации с АЗТ не вызывает антагонизма между отдельными ее компонентами и, возможно, усиливает его вирусингибирующий эффект. Этот факт позволяет использовать все три лекарственных средства по своему основному фармакологическому профилю при лечении ВИЧ-инфицированных пациентов.
В то же время полученные при испытаниях комбинаций препаратов данные являются основанием для исключения 8 лекарственных средств (белласпона, витогепата, гепарина, димедрола, линкомицина гидрохлорида, нитрогранулонга, L-тироксина и ФиБС) из списка применяемых лечебных средств для получающих АРВ терапию ВИЧ-инфицированных пациентов при лечении сопутствующих, не связанных с ВИЧ заболеваний и/или оппортунистических инфекций.
Конструирование отечественного подтверждающего диагностикума на принципе иммунного блоттинга Характеристика производственного штамма ВИЧ. Предварительными шагами на пути к поставленной цели конструирования отечественного диагностикума иммунного блоттинга на основе натуральных вирусных антигенов являлись: выбор штамма вируса и определение оптимальных условий его культивирования для производственных целей, а также отработка основных параметров его длительного культивирования для постоянного получения высокотитражного антигенного материала.
Для решения этих задач были уточнены культуральные характеристики 4 перевиваемых Т-клеточных линий лимфобластоидной этиологии (CEM.SS, Jurkat-tat3, Molt4/8 и MT-4). Установлено, что для поддержания наиболее комфортного состояния клеточных линий требовалось проведение пассажей в культурах клеток МТ-4 через каждые 48 часов, в остальных случаях – через 72 часа. В случае крайней необходимости при использовании линии CEM.SS этот срок мог быть увеличен до 4-х суток включительно.
В качестве производственного штамма для получения натуральных вирусных антигенов был использован лабораторный rapid/high изолят ВИЧ-1zmb, проявивший большую по сравнению со штаммом IIIB репликативную активность. После этого были проведены эксперименты по определению уровней репродукции данного штамма на 4 Т-клеточных линиях (рисунок 2).
6,0 6, 5, 6,0 5,5 5,5 5, 5,0 5,0 5, 5,0 4,5 4, 4, Титр вируса (Ig ТЦД50) 4,0 4, 4,0 3, 3,0 3, 3, 2,0 2, 2,0 1, 1, 0, 5 сутки наблюдения 1 2 3 Zmb/CEM.SS Zmb/Molt4/8 Zmb/Jurkat-tat3 Zmb/MT Рисунок 2 – Инфекционная активность штамма zmb на Т-клеточных линиях Как следует из приведенных на рисунке 2 данных, максимальные уровни продукции вируса на клетках Molt4/8 приходились на первые сутки после инфицирования клеток, на линии Jurkat-tat3 – на 2–3 сутки, причем ее уровни (5,5 lg ТЦД50) между собой практически не отличались. Сопоставимые (6,0 lg ТЦД50) данные получены и на клеточных линиях CEM.SS и МТ-4, однако пик вирусной активности у них приходился на 48 и 72 часа соответственно.
Средний уровень максимальной продукции вируса на всех клеточных линиях оказался схожим и составил от 4,5 до 6,0 lg ТЦД50 (p0,1).
Принимая во внимание полученные данные, можно получать максимально высокие «урожаи» вируса на каждой из используемых клеточных линий. Так, в системе zmb/Molt4/8 оптимум сбора вирусных белков приходится на первые 48 часов после заражения клеток. Для моделей zmb/CEM.SS и zmb/Jurkat-tat этот срок сдвигается на 3 сутки, а при использовании клеток MT-4 – вплоть до 4 суток после инфицирования. Учет этих данных играет существенную роль при культивировании ВИЧ с целью перманентного получения препаративных количеств вирусной биомассы, необходимой для производства иммуноблоттинговых (ИБ) диагностикумов на основе натуральных антигенов.
Разработка методики непрерывного получения антигенного материала.
Методика длительного культивирования вируса. Как известно, в инфицированных ВИЧ клетках происходит быстрая репликация вируса, что делает затруднительным использование таких клеточных линий для получения больших количеств антигенной массы. Собственными экспериментами было установлено, что приемлемые уровни репликативной активности вируса (титр не ниже 5,0 lg ТЦД50) при культивировании ВИЧ-1zmb на линии CEM.SS достигались, начиная со 2-го пассажа, и сохранялись вплоть до 14-го пассажа включительно. В эти же сроки регистрировали и наибольшие содержание в клеточной суспензии антиген-продуцирующих клеток (33,6–24,5%). В клеточной линии MТ-4 наблюдались аналогичные, хотя несколько смещенные по времени, процессы. Так, активность вируса достигала отметки в 5,0 lg ТЦД50 не ранее 5-го пассажа, но сохранялась до 16-го пассажа включительно. В обоих случаях вирусная активность от 5,0 lg ТЦД50 и выше соответствовала (по данным НИФ) 25%-му порогу числа антигенпозитивных клеток в суспензии.
Таким образом, с учетом различий в сроках проведения пассажей, с помощью непрерывного культивирования вируса удавалось поддерживать высокие уровни вирусной продукции на линии CEM.SS в течение 40–50 суток после первичного инфицирования клеток, а на линии клеток МТ-4 оптимальные сроки получения высокотитражного вируса приходились в период между 15– 17-ми и 65–70-ми сутками. По истечении этих сроков оба показателя (титры вирусной активности и число ВИЧ-позитивных клеток) неуклонно снижались, несмотря на соблюдение всех условий протокола культивирования вируса.
Культивирование ВИЧ на обедненной питательной среде. После решения одной из основных задач поддержания постоянно высокого уровня репликативной активности вируса необходимо было добиться получения как можно более чистого антигенного материала за счет снижения содержания в нем посторонних компонентов, присутствие которых могло бы сказаться на специфичности реакции ИБ. В первую очередь, это касалось белков эмбриональной сыворотки. Задача решалась путем использования обедненной питательной среды, концентрация сыворотки в которой не превышала 2,5%.
Испытывались два способа перевода клеточных культур в такие условия.
Первым вариантом предусматривалась адаптация инфицированных клеточных линий к постепенному снижению уровня содержания сыворотки в питательной среде. Для этого при каждом очередном пассаже концентрацию сыворотки постепенно снижали от 10% до 2,5% с шагом 2,5%. Во втором случае производили одномоментный перевод неинфицированных клеток на «обедненную» среду с последующим заражением. Динамика происходящих процессов отражена на примере лабораторной модели zmb/Molt4/8 (рисунок 3).
6, 6 5, 5, Титр вируса (Ig ТЦД50) 5, 5, 5,0 5,0 4, 4, 4,5 4, 4, 4, 3, 3, 3, 2, 2 1, 1, 1 0,5 0, 120 часы 12 24 36 48 72 10% сыворотки (стандартная методика) 2,5% сыворотки (I способ) 2% сыворотки (II способ) Рисунок 3 – Инфекционная активность ВИЧzmb в зависимости от способа культивирования Представленные на рисунке 3 данные демонстрируют тот факт, что имеются достоверные различия (на 1,0–1,5 lg ТЦД50, p0,05) в уровнях продукции вируса при культивировании его в стандартных условиях и при пониженном содержании эмбриональной сыворотки в питательной среде.
Однако при этом репликативная активность вируса оставалась на достаточном для сбора полноценного «урожая» уровне.
При сравнении двух способов перевода инфицированных клеток на «обедненную» культуральную среду достоверных различий не обнаружено, хотя обращают на себя внимание некоторые различия тенденции в динамике вирусной активности в зависимости от методики перевода культур в эти условия. Так, при поэтапном переходе интенсивность репликации вируса в течение первых 2-х суток находилась на несколько более низком уровне по сравнению с одномоментной заменой среды, достигая своего максимума через 36 часов (5,0 и 5,5 lg ТЦД50 соответственно). Начиная с 3-х суток, отчетливо наблюдалось плавное снижение показателей (на 1,0–1,5 lg ТЦД50 за каждые сутки наблюдения). Во втором варианте (одноразовом переходе) в течение первых 48 часов титры вируса находились на стабильно высоком (не ниже 4,5 lg ТЦД50) уровне, после чего происходило их резкое падение. Таким образом, начиная с 3-х суток, ни один из испытанных вариантов культивирования не обеспечивал накопления достаточных вирусной биомассы.
Влияние фитогемагглютинина (ФГА) на течение ВИЧ-инфекции in vitro.
Несмотря на точное следование всем методологическим приемам культивирования, репликативная активность вируса с течением времени (обычно через 2–2,5 месяца, т. е. 14–17 пассажей) начинает постепенно затухать. Эта фаза культивирования вируса характеризуется прекращением почкования полноценных вирионов в культуральную среду, что делает ее непригодной для производственных целей. Общепринятым выходом из создавшегося положения является отказ от дальнейшего культивирования данного «стока» вируса и замена его другим. Альтернативный подход решения проблемы заключается в активации инфекционного процесса с помощью митогенов. Для изучения такой возможности была предпринята попытка стимулировать продукцию вируса с помощью ФГА. Эксперименты проводились при культивировании вируса на обедненной питательной среде при одномоментном переводе клеток в эти условия.
На лабораторной модели zmb/Molt4/8 было испытано 4 дозы ФГА (конечная концентрация – 1, 5, 10 и 20 мкг/мл) при 3-х экспозициях (24, и 72 часа). Полученные результаты свидетельствуют об интенсификации инфекционного процесса в зараженных клетках под действием ФГА.
Максимальная стимуляция образования вируспродуцирующих клеток при их обработке дозой 5 мкг/мл была зарегистрирована при 48-часовой экспозиции в то время, как при концентрации митогена 20 мкг/мл пик активности вируса приходился на первые 24 часа после стимуляции клеток. Использование дозы 10 мкг/мл вызывало заметный рост титра вируса как при 24-часовой, так и 48-часовой экспозициях (на 1,5 и 2,0 lg ТЦД50 соответственно). В то же время присутствие ФГА в питательной среде свыше 48 часов было неэффективным и не приводило к сколь-нибудь существенному росту репликативной активности вируса. Обработка инфицированных клеток более низкой концентрацией ФГА (1 мкг/мл) не приводила к активации инфекционного процесса ни в одном из испытанных вариантов.
В результате проведения данной серии экспериментов было установлено, что возможна активация ВИЧ-инфекции in vitro с помощью обработки инфицированных клеток ФГА. Оптимальными параметрами такого воздействия в условиях дефицита эмбриональной сыворотки являлась 24-часовая экспозиция ФГА в концентрации 10 мкг/мл или 48-часовая при дозе ФГА 5 мкг/мл, причем второй вариант более предпочтителен. Этот подход был использован для стимуляции затухающего инфекционного процесса в хронически инфицированных клетках и позволил значительно (на 1–1,5 месяца) удлинить сроки культивирования вируса без существенной потери вирусной активности.
Таким образом, была разработана оригинальная методика длительного культивирования вируса с целью получения антигенного материала для производства отечественного диагностикума иммунного блоттинга. Она состоит из следующих этапов:
– первичное инфицирование клеток рабочей дозой вируса;
– культивирование вируса в стандартных условиях до достижения титра не менее 5,0 lg ТЦД50;
– перевод инфицированных клеточных линий на «обедненную» питательную среду с содержанием фетальной сыворотки не выше до 2,5%;
– длительное культивирование вируса в таких условиях с постоянным мониторингом уровней его репликативной активности и сбором антигенного материала;
– активация инфекционного процесса в случае его затухания с помощью фитогемагглютинина;
– «пулирование» полученного вирусного материала для последующей его концентрации и очистки.
Разработанный простой, достаточно быстрый, не требующий больших производственных объемов способ перманентного получения вирусных антигенов был в дальнейшем использован для производства диагностической тест-системы на принципе иммунного блоттинга.
Конструирование тест-системы иммунного блоттинга. На первом этапе производственного процесса с помощью ультрацентрифугирования в прерывистом (15%, 45%) градиенте урографина и повторного концентрирования проводили концентрацию и очистку вирусного антигена.
В результате обеспечивалась 100-кратная концентрация исходного материала с содержанием в конечном продукте не менее 1 мкг/мл вирусного белка [B. Hoffman, 1991].
В дальнейшем процессе использовали содержавшие не менее 700 мкг белка антигенные образцы, поскольку меньшее его количество не давало возможности адекватного разделения вирусных пептидов по их молекулярным массам. После фракционирования структурных вирусных антигенов с помощью препаративного электрофореза в полиакриламидном геле [J.P. Phair et al., 1989] полусухим способом осуществляли электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ). По окончании переноса качество его проведения определяли путем специальной обработки небольшого фрагмента НЦМ для выявления присутствия на ней белков ВИЧ-1 в зонах, соответствующих их молекулярным массам, после чего НЦМ нарезали на узкие (4 мм) полоски, которые и являлись диагностическими стрипами для реакции иммунного блоттинга (ИБ). Показателем качественно проведенного технологического процесса являлось обязательное наличие на стрипах не менее 8 вирусспецифических белков ВИЧ-1: р17, р24 и р55 (продуктов гена gag), p и р51/66 (продуктов гена pol) и гликопротеидов gp41 и gp120 (продуктов гена env). Эти белки являются основными вирусными белками и обнаружение соответствующих антител в сыворотках крови пациентов должно приниматься в расчет при интерпретации результатов проведенного ИБ-анализа.
Позитивный контроль (К+) готовили из предоставленных Республиканским Центром профилактики СПИДа образцов высокотитражных (по данным ИФА) сывороток крови ВИЧ-позитивных пациентов. Из образцов сывороток, содержащих антитела ко всем диагностически значимым белкам ВИЧ-1, формировался общий пул, использовавшийся для приготовления (К+) контроля.
Из сывороток доноров крови, серонегативных к маркерам ВИЧ и вирусным гепатитам В и С, аналогичным образом готовился отрицательный (К-) контроль.
В качестве субстрата разрабатываемой тест-системы были испытаны два реагента: 4-хлор-1-нафтол и диаминобензидин (ДАБ). Проведенные эксперименты показали, что использование первого приводило к менее интенсивной окраске полос в местах связывания антител с иммобилизованными на НЦМ антигенами, хотя в этом случае полностью отсутствовало фоновое окрашивание стрипов. Применение ДАБа давало легкое фоновое окрашивание стрипов, однако интенсивность окраски полос была более четкой и интенсивной, что и предопределило выбор в его пользу.
Исследовано влияние времени контакта сывороток со стрипами на полноту связывания антител с иммобилизованными на НЦМ вирусспецифическими белками. Наиболее полноценное окрашивание развивалось после инкубации не менее 2 часов при комнатной температуре.
Дополнительное время инкубации в течение ночи не приводило к усилению окрашивания стрипов.
После подбора всех необходимых для проведения теста реагентов, определения основных этапов постановки анализа и компоновки набора экспериментальные серии диагностикума «Бел. ВИЧ-1 Блот» были подвергнуты испытаниям на специфичность путем параллельного тестирования сывороток крови на тест-системе «New Lav Blot-1» производства известной коммерческой фирмы «Diagnostics Sanofi Pasteur» (Франция) (рисунок 4).
Сравнение параллельных тестов показало, что специфичность разработанного отечественного диагностикума практически не отличалась от импортного.
Таким образом, проведенные эксперименты по уточнению и детализации особенностей репликации лабораторного rapid/high штамма ВИЧ-1zmb в условиях экспериментальной инфекции in vitro позволили разработать оригинальную методику длительного культивирования вируса с целью получения антигенного материала, необходимого для производства отечественного диагностикума на основе иммунного блоттинга. Отличительной чертой разработанного диагностикума является использование натуральных вирусных белков из выделенного на территории республики эпидемического штамма. Основные этапы производственного процесса были утверждены в лабораторном регламенте и Технических условиях на производство диагностического препарата, а также в Инструкции по его применению, утвержденной Министерством здравоохранения РБ 29.04.2004 г. В соответствии с этими документами было получено Регистристрационное удостоверение № ИМ-7.4755 на применение тест-системы «Бел. ВИЧ-1 Блот» в медицинской практике на территории Республики Беларусь. За 5 лет с использованием вышеприведенной методики было произведено и реализовано 17 производственных серий отечественного диагностикума на основе иммунного блоттинга «Бел. ВИЧ-1 Блот», с помощью которых было проведено более 1500 исследований.
GP P P53/ GP P P 1 – негативный контроль («Sanofi Pasteur») 2 – позитивный контроль («Sanofi Pasteur») 3 – негативный контроль («Бел. ВИЧ-1 Блот») P 4 – позитивный контроль («Бел. ВИЧ-1 Блот») 1 2 3 Рисунок 4 – Проверка специфичности разработанного диагностикума ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные научные результаты диссертации 1. Хлопковые крысы (Sigmodon fulviventer) восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека и являются оригинальной, доступной лабораторной моделью ВИЧ-инфекции in vivo. Показатели смертности за 6-месячный срок наблюдения в группе инфицированных животных – 29,3±3,4% (в контрольной – 6,25±1,3%, Р0,05). Самцы более чувствительны к ВИЧ по сравнению с самками (на их долю приходится 76,47%±5,8% павших особей, Р0,05).
Гибель подавляющего большинства (88,2%±6,7%, Р0,01) подопытных животных приходится на вторую половину 6-месячного срока наблюдения.
В большинстве случаев (80,6%±4,3%, Р0,05) заболевание протекает с клиническими признаками пневмонии. К концу срока наблюдения (5–6 месяцы) у 15–20% инфицированных самцов имеют место парезы передних или задних конечностей, выраженный рвотный рефлекс и регулярно повторяющиеся 15–20-секундные судороги. На вскрытии у большинства больных особей (67,1%±4,8%, Р0,05) отмечаются различной степени тяжести поражения легких вплоть до частичной атрофии долей легкого с очагами геморрагий и некроза легочной ткани. Временной интервал от появления первых признаков заболевания до гибели животного составляет 1–1,5 месяца.
У животных контрольных групп подобные явления не отмечаются [5, 19, 60].
2. Морфологическими проявлениями инфекции в органах-мишенях ВИЧ инфицированных животных (селезенка и головной мозг) являются поэтапные изменения от воспалительной реакции на ранних стадиях эксперимента до появления признаков глубокой дегенерации и атрофии обоих органов, усугубляющихся по мере удлинения срока наблюдения. Картина ранних (1–2 месяцы после инфицирования) морфологических изменений в головном мозге обусловлена воспалительными процессами в виде пролиферации микро и макроглии, а в селезенке – гиперплазии белой пульпы и гипертрофии фолликулов на фоне увеличения количества бластных клеток и активации В-лимфоцитов. Через 2 месяца после внутрибрюшинного введения инфекционного материала показатель относительной массы селезенки у животных этой группы на 20,9±2,3% (Р0,05) увеличен по сравнению с контрольными особями. У самцов этот показатель еще более выражен:
превышение 26,8%±2,7 (Р0,05).
В более поздний период (начиная с 3-го месяца) в ЦНС преобладают явления прогрессирующей дезинтеграции, выражающиеся в появлении по всей ткани мозга узелковых инфильтратов на фоне некроза и некробиоза нейронов.
В селезенке наблюдается атрофия и редукция фолликулов с разрежением лимфоидных элементов. Показатель относительной массы селезенки у инфицированных внутрибрюшинно животных (0,8794±0,0997) по сравнению с контрольными особями (1,1105±0,0623) снижается на 19,3%±2,8%, (Р0,05).
Морфометрическим анализом площади фолликулов белой пульпы селезенки установлено снижение этого показателя между третьим и шестым месяцами с 0,28 до 0,46 lg (Р0,05) условных единиц площади (УЕП). При ретробульбарном заражении эти показатели существенных различий по сравнению с контрольной группой не имеют: относительная масса селезенки снижена на 4,7%±0,85% (Р0,05) и УЕП 0,32–0,46 lg (Р0,05) [6, 23, 41, 68, 69].
3. Динамика показателей смертности и морфологических изменений у ВИЧ-инфицированных хлопковых крыс коррелирует с результатами обнаружения генетического материала вируса в клеточном геноме животных.
Кумулятивный уровень детекции провирусной ДНК ВИЧ за 6 месяцев наблюдения в ткани головного мозга составляет 32 из 42 образцов (76,2%;
P0,05) и 33 из 40 (82,5%;
P0,05) в образцах селезенки. Интенсивность процесса нарастает на поздних стадиях инфекции (5–6 месяцы). Уровни обнаружения провирусной ДНК за этот период в образцах ЦНС и селезенки составляют 21 из 23 (91,3%;
P0,01) и 20 из 21 (95,2%;
P0,01) соответственно.
Внутрибрюшинный путь инфицирования более предпочтителен по сравнению с ретробульбарным (89,7% и 71,4% положительных образцов соответственно), причем ткань селезенки 100% инфицировалась уже к концу 3-го месяца [9, 20, 46, 71].
4. Природные меланин-глюкановые комплексы (МГК), экстрагированные из высших базидиомицетов, обладают выраженными антиретровирусными свойствами. Показатели химиотерапевтических индексов (ХТИ) 5 наиболее активных образцов составляют: из Inonotus obliquus (№ 7) – 6,6–10,9;
Lentinus edodes (№ 8) – 12,5–20,8, Phellinus igniarius (№10) – 8,8–17,7 и Fomes fomentarius (№ 11) – 14,5–27,2, а также препарата «Меланин» (№ 357) – 8,6–15, соответственно. Эти данные свидетельствуют о принадлежности указанных образцов к группе высокоактивных ингибиторов вирусной активности.
Отличительной всех без исключения представителей МГК является их высокая толерантность к лимфоидным клеткам: показатели максимально переносимых концентраций расположены в интервале 250–550 мкг/мл, что указывает на чрезвычайно низкие уровни их цитотоксичности [25–27, 37, 56–59, 65, 66].
5. Ряд химических соединений класса полисульфидов и их производных обладают достаточно высоким уровнем анти-ВИЧ активности. ХТИ полисульфида орто-аминобензойной кислоты формулы C14H12N2O4Sn (n=1–3) составляет 6,3–7,9. В дозах 0,6–75,0 мкг/мл данное соединение существенно (на 77–79%, Р0,01) снижает уровни синтеза капсидного белка р24 ВИЧ- в инфицированных клетках. ХТИ металлокомплекса меди с лигандом 4,6-ди трет-бутил-3-[(2-гидроксиэтил)тио]бензен-1,2диолом, по данным формазанового теста, составляет 8,36. В дозах 0,16–4,0 мкг/мл металлокомплекс существенно (на 71–79%, Р0,01) подавляет продукцию вирусного антигена р24.
Присутствие в металлокомплексе меди (Cu2+) является определяющим в наличии антиретровирусной активности соединения: замена меди в составе МК на кобальт (Cо2+) или никель (Ni2+) существенно снижает показатели ХТИ до 0,00 (Р0,01) и 5,91 (Р0,05) соответственно (ХТИ самого лиганда вне составе МК составляет 1,09, Р0,01). Оба соединения отличаются умеренной биотоксичностью [26, 28, 36, 56, 73, 74, 77].
6. Из 307 испытанных 6 официнальных препаратов (белласпон, гепарин, ксантинола никотинат, линкомицина гидрохлорид, пентоксифиллин и тардиферон) в условиях экспериментов in vitro оказывают выраженное ингибирующее действие на активность ВИЧ. Уровни их ХТИ в формазановом тесте при терапевтическом варианте испытаний в отношении чувствительного (R-) к азидотимидину (АЗТ) варианту вируса составляют 9,5;
27,5;
30,0;
6,0;
25,0 и 12,0 соответственно. 4 лекарственных средства (гепарин, ксантинола никотинат, пентоксифиллин и тардиферон) подавляют также репликацию АЗТ-резистентного (R+) варианта ВИЧ в инфицированных клетках Т-лимфоцитарного ряда: средние уровни ХТИ этих медикаментов составляют 14,5;
9,09;
11,11 и 15,38 соответственно. Ксантинола никотинат, пентоксифиллин и тардиферон существенно (на 30–36%, Р0,05) подавляют продукцию капсидного белка ВИЧ-1 в инфицированных клетках [12, 15, 22, 24, 32, 34, 42–45, 47, 48, 51, 52, 64, 78].
7. В составе 2-компонентных комбинаций с азидотимидином ксантинола никотинат и пентоксифиллин существенно усиливают антиретровирусную активность АЗТ в отношении (R-) варианту вируса: показатель ХТИ у АЗТ возрастает с 58,3±6,8 до 100,0±13,4 (Р0,05) и 105,3±15,6 (Р0,05) соответственно. Пентоксифиллин существенно (на 27,1±3,4%, Р0,05) усиливает активность АЗТ по ингибированию синтеза вирусного белка р24.
В испытаниях на (R+) варианте вируса ксантинола никотинат, пентоксифиллин и тардиферон) при сочетании с АЗТ существенно усиливают его ВИЧ ингибирующие свойства: ХТИ последнего повышается с 3,0±0,8 до 12,3±1, (Р0,05), 13,2±1,8 (Р0,05) и 7,5±1,1 (Р0,05) соответственно. Гепарин почти полностью инактивирует анти-ВИЧ активность пентоксифиллина (ХТИ снижается в 20 раз – с 25,0 до 1,25, Р0,01) [35, 53, 55, 70, 72, 75, 76].
8. В 3-компонентных сочетаниях только в двух комбинациях (АЗТ+ПФ+ксантинола никотинат и АЗТ+ПФ+тардиферон) регистрируется усиление анти-ВИЧ активности АЗТ: ХТИ ингибитора возрастает 58,3±6,8 до 75,0±8,7 (Р0,05) и 61,1±6,9 (Р0,05) соответственно. В остальных случаях ВИЧ-ингибирующие свойства АЗТ подавляются [16, 18, 29, 33, 38, 49, 50, 54].
9. Поддержание перманентного состояния острой инфекции дает возможность пролонгированного культивирования высокорепликативного (rapid/high) штамма ВИЧ-1. Методика обеспечивает получение достаточно высоких уровней сбора полноценного вирусного антигенного материала, включая диагностически значимые высокомолекулярные гликопротеиды (gp41, gp120 и gp160), через каждые 36–72 часа в зависимости от используемой клеточной линии (титры вируса для линий CEM.SS, Jurkat-tat3, Molt4/8, и MT- составили 4,5–5,5;
5,0–5,5;
4,5–5,5 и 5,0–6,0 lg ТЦД50 соответственно.
Одномоментный перевод со стандартного способа культивирования производственного штамма вируса в условия «обедненной» питательной среды с содержанием не более 2,5% сыворотки эмбрионов коров позволяет сохранять достаточно высокие уровни инфекционной активности вируса (4,5–5,0 lg ТЦД50) в течение первых 48 часов. Этот прием позволяет понизить уровни экзогенных белков в исходном антигеном материале, в результате чего снижается количество неспецифических сайтов связывания на производимых иммуноблоттинговых стрипах. Это существенно повышает специфичность разработанного диагностикума с использованием реакции иммунного блоттинга [8, 10, 11, 13, 14, 39, 61, 62, 67].
10. Обработка хронически инфицированных клеточных линий фиксированными дозами фитогемагглютинина (5 мкг/мл при 48-часовой экспозиции или 10 мкг/мл в течение 24 часов) приводит к активации затухающего инфекционного процесса и существенному увеличению титра вируса (на 1,5 и 2,0 lg ТЦД50 соответственно, Р0,05). Такой подход позволяет значительно (на 1–1,5 месяца) удлинить сроки культивирования вируса без существенной потери вирусной активности. На его сконструирована отечественная диагностическая тест-система на принципе иммунного блоттинга. Созданный конфирматорный диагностический препарат обладает высокой специфичностью (99,9%) и его использование расширяет возможности комплексной диагностики ВИЧ-инфекции [1–4, 7, 17, 21, 30, 31, 40, 63, 79].
Рекомендации по практическому использованию результатов 1. Использование данных постоянного мониторинга за складывающейся в Республике эпидемической ситуацией по ВИЧ/СПИДу позволяет контролировать развитие эпидпроцесса и корректировать тактику мер по противодействию распространению инфекции. Ежемесячно осуществляемый лабораторный мониторинг за развитием эпидемического процесса был положен в основу подготовленных Министерством здравоохранения Государственных программ профилактики ВИЧ-инфекции на 2001–2005 годы (Постановление СМ РБ № 2041 от 29.12.2000 г.) и на 2006–2010 годы (Постановление СМ РБ № 1068 от 21.08.2006 г.) [8, 10, 11, 13, 14, 17, 21].
2. Разработанная экспериментальная модель ВИЧ-инфекции на хлопковых крысах позволяет проводить доклинические испытания профилактических вакцин и лекарственных средств. Модель может быть использована для исследований по уточнению деталей патогенеза ВИЧ/СПИДа. Приоритет и перспективность этой модели подтверждаются исследователями США из Национального Института здоровья (R.J. Landley et al., 1998;
C.D. Jorge et al., 2009).
3. Обнаруженные у некоторых химических соединений оригинального синтеза и природных субстанций антиретровирусные свойства дают основание продолжать поиск новых ингибиторов ВИЧ среди соединений подобной химической структуры. Низкие уровни их цитотоксичности и способность подавлять активность резистентных к азидотимидину вариантов вируса повышают их перспективность для дальнейших испытаний в качестве потенциальных ингибиторов ВИЧ (авторское свидетельство СССР № 1823443, авторское свидетельство СССР № 1822125, патент на изобретение РБ № 12529).
4. Способность ксантинола никотината, пентоксифиллина и тардиферона ингибировать репликацию АЗТ-чувствительных и АЗТ-резистентных вариантов ВИЧ, а также их синергическое влияние на активность азидотимидина в составе 2- и 3-компонентных комбинаций позволяют использовать эти препараты по своему основному фармакологическому профилю при лечении ВИЧ инфицированных пациентов (патент на изобретение РБ № 7675, патент на изобретение РБ № 7678). 8 официнальных лечебных препаратов (белласпон, витогепат, гепарин, димедрол, линкомицина гидрохлорид, нитрогранулонг, L-тироксин и ФиБС) должны быть исключены из арсенала медикаментозных средств у получающих антиретровирусную терапию пациентов при лечении не связанных с ВИЧ заболеваний и/или оппортунистических инфекций.