Молекулярно-генетическое исследование аллергических заболеваний
На правах рукописи
КАРУНАС АЛЕКСАНДРА СТАНИСЛАВОВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Уфа – 2012
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, Хуснутдинова Эльза Камилевна профессор
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, Мустафина Ольга Евгеньевна профессор Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН доктор биологичеких наук, Карпухин Александр Васильевич профессор ГУ Медико-генетический научный центр РАМН доктор медицинских наук, Петрин Александр Николаевич профессор Московский государственный медико стоматологический университет МЗ РФ Учреждение Российской академии наук
Ведущая организация:
Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
Защита диссертации состоится «_» марта 2012 г. в «_ » часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (г.Уфа, просп. Октября, 71), с авторефератом – на сайте ВАК РФ и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected]
Автореферат разослан « _» _ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Аллергические заболевания (АЗ) являются одними из наиболее распространенных хронических заболеваний, в основе которых лежит повышенная чувствительность организма к воздействию некоторых факторов внешней среды, которые принимаются им за потенциально опасные. По данным Всемирной организации аллергии, около 30-40% населения мира страдают различными АЗ (World Allergy Organisation, http://www.worldallergy.org). Бронхиальная астма, аллергический ринит и атопический дерматит (атопическая триада) – три распространенных, взаимосвязанных между собой аллергических заболевания, часто трансформирующихся из одного в другое и сопутствующих друг другу.
Бронхиальная астма (БА) - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором играют роль многие клетки и клеточные элементы (GINA, 2010). БА относится к числу наиболее распространенных, тяжелых и инвалидизирующих хронических заболеваний, значительно изменяющих образ и качество жизни больных. В мире насчитывается около млн. больных БА, распространенность данной патологии в разных странах варьирует от 1 до 18% (GINA, 2010). Согласно данным Российского респираторного общества, в России распространенность БА среди детей составляет от 5,6 до 12,1%, среди взрослых – 5,6-7,3%, а общее количество больных БА в России приближается к 7 млн. (Глобальная стратегия по лечению и профилактике бронхиальной астмы. Пересмотр 2006 г.;
ФЦП РФ «Бронхиальная астма» на 2011-2015 годы). Аллергический ринит (АР) – заболевание, характеризующееся IgE-опосредованным воспалением, развивающимся в результате попадания аллергенов на слизистую оболочку носа. В мире АР страдают 10-30% взрослых и до 40% детей (Pawankar et al., 2011), в России распространенность АР в различных регионах колеблется от до 38% (http://www.pediatr-russia.ru). Симптомы, развивающиеся при AР, не являются угрожающими для жизни, однако они создают значительный дискомфорт, резко снижают работоспособность и качество жизни человека.
Поздняя диагностика АР и несвоевременное назначение патогенетической терапии могут привести к появлению осложнений и развитию БА. Атопический дерматит (АД) – хроническое воспалительное заболевание кожи, которое чаще всего является первым проявлением аллергии у ребенка, может продолжаться в зрелом возрасте и приводит к физической и эмоциональной дезадаптации пациента. Почти у половины детей на фоне АД в последующем формируется бронхиальная астма или аллергический ринит. Распространенность АД у детей составляет 15-30%, у взрослого населения – 2-10% (Pawankar et al., 2011).
Аллергические заболевания имеют сложную многофакторную природу и развиваются при взаимодействии факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Во всем мире ведется активный поиск генов, отвечающих за формирование предрасположенности к АЗ, что связано как с несомненной актуальностью изучения факторов риска развития АЗ, так и с появлением новых возможностей генетических исследований. К настоящему времени выполнены анализы ассоциации БА и других АЗ с полиморфными вариантами сотен генов. Проведено более 20 полногеномных анализов сцепления БА, атопии, АР и АД. Выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АЗ, идентифицированы позиционно-клонированные гены для БА (ADAM33, DPP10, MS4A2 (FCERIB), GPR154 (GPRA), PHF11, HLA-G, CYFIP2) и АД (COL29A1) (Van Eerdewegh et al., 2002;
Allen et al., 2003;
Zhang et al., 2003;
Laitinen et al., 2004;
Nicolae et al., 2005;
Soderhall et al., 2007).
Одним из наиболее перспективных современных методов изучения сложных признаков является метод полногеномного анализа ассоциаций Association Studies, GWAS), в котором проводят (Genome-wide генотипирование и тестирование ассоциации с заболеванием сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) (Manolio et al., 2010). При первом GWAS БА обнаружена ассоциация ОНП, локализованных в области 17q12-q (гены ORMDL3 и GSDMB), с детской астмой в Германии и Англии (Moffat et al., 2007). За последние годы GWAS БА проведены в различных популяциях мира, обнаружены новые гены, ассоциированные с развитием БА у индивидов европейского происхождения - DENND1B, PDE4D, RAD50, IL1RL1/IL18R1, HLA-DQ, IL33, IL6R, SMAD3 и IL2RB;
африканского происхождения - ADRA1B, PRNP и DPP10;
мексиканцев - TLE4, корейцев - CTNNA3 (http://www.genome.
gov/GWAStudies/). Опубликованы результаты двух GWAS для АД, выявивших ассоциацию с ОНП области 11q13.5 у индивидов европейского происхождения (Esparza-Gordillo et al., 2009), и ОНП, локализованными в областях 5q22.1, 20q13.33 и 1q21.3 (FLG), у китайцев (Sun et al., 2011).
В целом, генетические исследования показали, что в этиопатогенезе АЗ принимает участие множество функционально взаимосвязанных генов.
Идентифицировано более 150 генов-кандидатов АЗ, однако только около 40 из них ассоциированы с АЗ более чем в пяти независимых исследованиях (Dvila et al., 2009;
Holloway et al., 2010;
Meng et al., 2010;
Michel et al., 2010;
Boguniewicz et al., 2011;
March, 2011). Среди них гены цитокинов (IL4, IL4RА, IL12B, IL13, TNFA, CCL5), главного комплекса гистосовместимости (HLA 2-адренорецепторов (ADRB2), ферментов биотрансформации DRB1), ксенобиотиков (GSTM1, GSTP1 и GSTT1);
гены, белковые продукты которых участвуют в распознавании консервативных структур микроорганизмов (CD14, TLR2, TLR4, CD14, CARD15), в регуляции барьерной функции эпителия (FLG, SPINK5), позиционно-клонированные гены (ADAM33, DPP10, GPR154), гены ORMDL3 и GSDMB, обнаруженные при GWAS.
В России несколькими группами исследователей проводилось изучение полиморфных вариантов генов цитокинов и генов системы биотрансформации у больных АЗ (Иващенко и др., 2000-2002;
Ляхович и др., 2002;
Макарова и др., 2002, 2011;
Фрейдин и др., 2002, 2003, 2007, 2010;
Казначеев, 2005;
Келембет и др., 2008;
Полоников и др., 2006;
2009;
Тюменцева, 2011). Проведен GWAS АЗ у русских жителей Западной Сибири: выявлены новые гены-кандидаты детской БА, АЗ, АР и атопической сенсибилизации (YWHAB, PPP1R12B, KCNE4, BAT1, MAGI2, ACPL2) (Фрейдин и др., 2011).
Несмотря на многочисленность генетических исследований АЗ, полученные результаты противоречивы, плохо воспроизводятся в последующих работах и характеризуются наличием выраженных межэтнических различий. Широкая вариабельность клинических проявлений АЗ свидетельствует о необходимости изучения как общих генетических факторов риска развития АЗ, так и специфических факторов, предрасполагающих к определенным клинико-патогенетическим вариантам течения АЗ. В связи с этим актуальной является идентификация этноспецифических факторов риска развития АЗ – БА, АР, АД и их сочетанного проявления, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболеваний и разрабатывать профилактические мероприятия с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.
На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.
Цель исследования Комплексный анализ генетической предрасположенности к развитию трех распространенных аллергических заболеваний - бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита.
Задачи исследования 1. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов-кандидатов аллергических заболеваний - цитокинов (IL4, IL4RA, IL10, IL13, CCL11, TNFA), дизинтегрина и металлопротеазы (ADAM33), ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2) у больных аллергическими заболеваниями и в контрольной группе индивидов.
2. Провести анализ частоты встречаемости мутаций гена профилаггрина (FLG) у больных аллергическими заболеваниями и в контрольной группе индивидов.
3. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов и мутаций генов с предрасположенностью к различным клинико патогенетическим вариантам течения аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов.
4. Провести полногеномный анализ ассоциации 610000 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием бронхиальной астмы с учетом этнической принадлежности индивидов и тяжести течения заболевания.
5. Провести исследование ассоциированных с бронхиальной астмой по данным полногеномного анализа полиморфных локусов на расширенных выборках больных бронхиальной астмой, аллергическим ринитом и атопическим дерматитом.
6. Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию различных клинико-патогенетических вариантов течения аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов.
7. Идентифицировать маркеры повышенного риска развития бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита и сочетанных форм аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Научная новизна Впервые молекулярно-генетическое исследование аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности проведено с использованием двух основных подходов, применяемых в настоящее время для поиска генов предрасположенности к многофакторным заболеваниям – исследования генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциаций. Проведен анализ ассоциации полиморфных вариантов 6 генов цитокинов (IL4, IL13, IL4RA, IL10, TNFA, CCL11), 7 генов системы ферментов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2) и гена ADAM33 с развитием БА, АР, АД и сочетанных форм аллергопатологии у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Выявлены маркеры риска развития различных клинико-патогенетических вариантов аллергических заболеваний. Установлена роль мутаций гена профилаггрина в развитии атопического дерматита и других АЗ на фоне АД.
Впервые проведен полногеномный анализ ассоциации 610 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием БА у индивидов русской, татарской и башкирской этической принадлежности.
Идентифицированы полиморфные локусы, локализованные в области 17q12 q21 и ассоциированные с развитием БА с полногеномным уровнем значимости (p4,79x10-7). Обнаружена выраженная ассоциация БА с полиморфными локусами, локализованными в областях 9р13 и 7р12.3. Выявлены этноспецифические маркеры риска развития бронхиальной астмы у русских, татар и башкир.
Определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена профилаггрина, гена ADAM33 и гена гасдермина В, предрасполагающих к развитию различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Научно-практическая значимость работы Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к аллергическим заболеваниям - бронхиальной астме, атопическому дерматиту и аллергическому риниту. На основании результатов данной работы разработан «Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы». Патент на изобретение № 2324937. Приоретет изобретения 27.11.2006. Зарегистрирован 20 мая 2008 г. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития АЗ и разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту 1. Развитие аллергических заболеваний у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов IL4 и ADAM33, у татар - c полиморфными вариантами генов NAT2, IL13 и TNFA, у башкир - с полиморфными вариантами генов CCL11 и ADAM33. Маркерами повышенного риска тяжелого течения бронхиальной астмы у русских являются генотип А/А полиморфного локуса rs44707 гена ADAM33, у татар – генотип T/T rs гена NAT2, у башкир - генотип A/A rs1800629 гена TNFA.
2. Развитие атопического дерматита, бронхиальной астмы и аллергического ринита с сопутствующим атопическим дерматитом в объединенной выборке больных и во всех этнических группах ассоциировано с носительством мутации c.2282del4 в гене профилаггрина FLG. Полиморфный локус rs1800629 гена TNFA ассоциирован с развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления в объединенной выборке больных.
3. Полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21, ассоциированы с полногеномным уровнем значимости (p4,79x10-7) с бронхиальной астмой и тяжестью ее течения. Наиболее высокий уровень ассоциации БА установлен с полиморфным локусом rs7216389 в гене гасдермина В GSDMB (p=1,01x10-7). Полиморфные локусы, локализованные в областях 9р13 в гене бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1 и 7р12.3 в гене IGFBP3, кодирующем белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста, ассоциированы с развитием и тяжестью течения бронхиальной астмы.
4. Этноспецифическими маркерами риска развития бронхиальной астмы, идентифицированными при полногеномном анализе ассоциации у русских, являются полиморфные варианты гена муцина 19 MUC19 (12q12);
у татар – полиморфные локусы, расположенные в области 15q26.3, у башкир полиморфные варианты гена субъединицы AMPA – ионотропного рецептора глутамата GRIA1 (5q33).
5. Полиморфные локусы гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) ассоциированы с развитием собственно бронхиальной астмы и БА с сопутствующими аллергическим ринитом и атопическим дерматитом.
Исследованные ДНК-локусы гена GSDMB не ассоциированы с развитием атопического дерматита и аллергического ринита, не сопровождаемых развитием бронхиальной астмы.
6. Межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов GSDMB и IL детерминирует развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом в объединенной выборке больных. Специфические комбинации полиморфных вариантов исследованных генов ассоциированы с развитием различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Апробация работы Основные положения диссертации были представлены на российских и международных конференциях: XVII Всемирном конгрессе по астме (Санкт Петербург, 2003), V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005;
Ростов-на-Дону, 2010), 14-м, 16-м и 21-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2004;
Санкт-Петербург, 2006;
Уфа, 2011), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология:
состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), I и II школах-семинарах «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007;
2011), II Всероссийской научно практической конференции с международным участием «Медико биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), Санкт-Петербургском научном форуме «Наука и общество. Физиология и медицина XXI века» (Санкт-Петербург, 2011), конференциях Европейского общества генетики человека (Мюнхен, 2004;
Прага, 2005;
Ницца, 2007;
Барселона, 2008;
Вена, 2009;
Гетебург, 2010;
Амстердам, 2011), 7-ом Балканском конгрессе по генетике человека (Скопье, 2006), конгрессах Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Гетебург, 2007;
Барселона, 2008;
Варшава, 2009;
Стамбул, 2011), конгрессах Европейского респираторного общества (Мюнхен, 2006;
Стокгольм, 2007;
Берлин, 2008;
Вена, 2009;
Барселона, 2010;
Амстердам, 2011), Международном конгрессе по геному человека (Дубай, 2011).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 58 работ, из них 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, из них 5 из международной базы цитирования, две главы в монографиях и один патент на изобретение.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 458 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и таблицами. Список литературы включает 725 источников.
Конкурсная поддержка исследования Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Европейской Комиссии в рамках проекта GABRIEL (контракт № LSHB-CT-2006-018996) и Минобрнауки России (госконтракт № 02.434.11.7115 от 18.08.2006, госконтракт №П601 от 18.05.2010).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал для исследования Основная группа исследования включала 1000 неродственных индивидов (620 мужского пола, 380 женского пола) с различными аллергическими заболеваниями (БА, АР и АД) в возрасте от 1 года до 67 лет (средний возраст 20, лет). Обследованные являлись пациентами детского отделения Клиники Башкирского государственного медицинского университета, пульмонологического и аллергологического отделений городской клинической больницы № 21 г. Уфы, аллергологического отделения Республиканской клинической детской больницы г.Уфы. Диагноз заболеваний устанавливался квалифицированными врачами на основании данных клинического, общелабораторного и инструментальных методов исследования в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний. В зависимости от наличия того или иного АЗ выборка больных была разделена на следующие группы: 1) общая выборка (ОВ) больных БА, в которую входили все пациенты с установленным диагнозом «Бронхиальная астма»;
2) ОВ больных АР – все пациенты с диагнозом «Аллергический ринит»;
3) ОВ больных АД – все пациенты с диагнозом «Атопический дерматит». Выборка больных была также подразделена на группы в зависимости от наличия и сочетания различных АЗ: 1) больные с сочетанными клиническими проявлениями БА, АР и АД;
2) больные БА и АД (без проявлений АР);
больные БА и АР (без АД);
больные АР и АД (без БА);
больные с клиническими проявлениями только БА (без АР и АД);
больные АР (без БА и АД);
больные АД (без БА и АР). Сведения о численности и этнической принадлежности больных, входящих в различные клинико-патогенетические группы, представлены в табл. 1. В качестве контроля исследована группа, состоящая из 589 практически здоровых лиц (338 мужского пола, 251 женского пола) от 2 до 66 лет (средний возраст 24,01 года), не имеющих проявлений аллергических заболеваний (на момент осмотра и в анамнезе) и отягощенной наследственности по атопическим заболеваниям (212 русских, 152 татар, башкир, 101 индивид метисного происхождения). Все участники исследования или их родители (у индивидов детского возраста) дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований.
Таблица Численность и этническая принадлежность пациентов, входящих в различные клинико-патогенетические группы № Группы больных Объед.
Русские Татары Башкиры Метисы группы выборка Больные БА 1 186 71 38 30 Больные АР 2 95 37 9 2 Больные АД 3 166 56 42 8 Больные БА, АР и АД 4 164 60 32 10 Больные БА и АД 5 40 9 12 1 Больные БА и АР 6 248 85 57 31 Больные АР и АД 7 101 46 21 4 Общая выборка 8 1000 364 211 86 больных АЗ Общая выборка больных 9 638 225 139 72 БА (группы 1+4+5+6) Общая выборка больных 10 608 228 119 47 АР (группы 2+4+6+7) Общая выборка больных 11 471 171 107 23 АД (группы 3+4+5+7) Методы исследования ДНК выделяли из 5-8 мл периферической крови методом фенольно хлороформной экстракции (Mathew et al., 1984). Анализ полиморфных вариантов генов IL4, IL13, IL4RA, IL10, TNFA, CCL11, ADAM33, GSDMB и мутаций гена осуществляли методом FLG (с.2282del4, p.Arg501Ter) полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и ПДРФ-анализом с последующим электрофорезом в 7-8% полиакриламидном геле.
Генотипирование полиморфного локуса c.236-1199СT (rs7216389) гена GSDMB проводили с использованием TaqMan® SNP Genotyping Assays C29062108_10 и TaqMan® Genotyping Master Mix (“Applied Biosystems”) согласно протоколу фирмы-производителя. Исследование полиморфных локусов генов системы биотрансформации ксенобиотиков – CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTT1, GSTM1 и NAT2 выполняли при помощи биочипа, разработанного в лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Глотов и др., 2005).
Перечень исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов представлен в табл. 2.
Полногеномное генотипирование 610000 однонуклеотидных полиморфизмов у больных БА и в контрольной группе индивидов проводили на Illumina Platform c использованием Illumina Human610 quad array («Illumina») в Национальном центре генотипирования в г. Эври (Франция) в рамках гранта Шестой рамочной программы Eвросоюза GABRIEL.
Таблица Исследованные полиморфные локусы генов Ген № rs Изменение Изменение Ранее принятые на уровне ДНК на уровне белка обозначения IL4 rs2243250 -590CT (g.4782CT) - -589 CT IL13 rs20541 c.431GA p.Arg144Gln 2044GA (Arg130Gln) р.Ile75Val IL4RA rs1805010 c.223AG Ile50Val IL10 rs1800872 -627CA (g.4433CA) - TNFA rs1800629 -308GA (g.8156GA) - CCL11 rs17809012 -384AG (g.4758AG) - ADAM33 rs2787095 c.255-191GC - D-1, 6716GC rs2485700 c.601-62AG - G-1,7667AG rs44707 c.2162+427CA - ST+4, 11434CA rs2280091 c.2213AG p.Met738Thr T1,12433AG CYP1A1 rs1799814 c.1382CA p.Thr461Asn 4887CA, 2452CA rs1048943 c.1384AG p.Ile462Val 4889AG, 2454AG rs4646903 g.1759TC - 6235TC, 3798TC CYP2D6 rs3892097 c.353-1GA - 1934GA, 1846GA CYP2C9 rs1799853 c.430CT p.Arg144Cys rs1057910 c.1075AC p.Ile359Leu CYP2C19 rs4244285 c.681GA - NAT2 rs1799929 c.481CT - rs1799930 c.590GA p.Arg197Gln rs1799931 c.857GA p.Gly286Glu Статистическая обработка Математическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), STATISTICA v.6.0.
(StatSoft), PLINK 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/ index.shtml).
При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982).
Анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ выполняли с помощью программы Haploview 4.2 (Barrett, 2005). Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007;
Chen et al., 2011).
Анализ ассоциации 610000 ОНП выполняли с помощью пакета программ Провели строгий контроль качества образцов ДНК и PLINK 1.06.
прогенотипированных маркеров. Из анализируемой выборки исключили дуплицированные образцы ДНК, а также образцы ДНК, в которых не прошло генотипирование более чем 5% маркеров и образцы ДНК, у которых выявлено несоответствие между обозначенным и установленным при генотипировании полом. Из дальнейшего анализа также исключили ОНП, по которым не прошло генотипирование более чем у 5% индивидов, ОНП с частотой редкого аллеля менее 0,01 и ОНП со статистически значимым отклонением (p0,001) от равновесия Харди-Вайнберга. Полногеномный уровень значимости p4,79x10-7, при котором ожидаемая доля ложноположительных результатов не превышает 5% (5% false discovery rate), определили с использованием функции q value в среде программирования R (www.r-project.org) (Benjamini, Hochberg, 1995;
Для учета популяционной гетерогенности Storey, Tibshirani, 2003).
исследуемых выборок больных и контроля провели EIGENSTRAT-анализ, позволяющий сделать поправку на наличие популяционной стратификации в полногеномном масштабе (Price et al., 2006).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных аллергическими заболеваниями и индивидов контрольной группы Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с развитием аллергических заболеваний Среди значительного количества генов-кандидатов АЗ особое место занимают гены цитокинов, участвующих в модулировании иммунного ответа практически на всех стадиях аллергического воспаления. Нами проведено изучение полиморфных вариантов генов интерлейкина 4, 10, 13, -цепи рецептора интерлейкина 4, фактора некроза опухолей и эотаксина у больных АЗ и индивидов контрольной группы. Выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса гена IL4 (rs2243250, –590CT) между контрольными группами русских и башкир, русских и татар, а также полиморфного локуса гена IL10 (rs1800872, 627СA) между русскими и башкирами, в связи с чем анализ ассоциации данных полиморфных локусов проводился только с учетом этнической принадлежности индивидов.
При исследовании объединенной выборки больных АЗ и контроля установлено, что аллель А полиморфного локуса rs1800629 (-308GA) гена TNFA является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (р=0,036;
OR=1,34 (CI95% 1,02-1,77));
бронхиальной астмы (p=0,02;
OR=1,41 (CI95% 1,05-1,89)), АР (p=0,021;
OR=1,41 (CI95% 1,05-1,9));
БА, сочетанной с АР (p=0,014;
OR=1,55 (CI95% 1,08-2,2)) и БА с АД (p=0,045;
OR=1,88 (CI95% 1,01 3,51)). Маркером повышенного риска развития БА с сопутствующим АР также является аллель A полиморфного локуса rs20541 (p.Arg144Gln) гена IL (p=0,037;
OR=1,3 (CI955 1,02-1,66)).
При анализе ассоциации полиморфных локусов генов цитокинов с учетом этнической принадлежности индивидов установлено, что у русских развитие АЗ ассоциировано с полиморфным локусом rs2243250 (–590CT) гена IL4.
Генотип Т/Т является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,029;
OR=4,17 (CI95% 1,26-13,81)), БА (p=0,0088;
OR=4,97 (CI95% 1,47 16,81)), АР (p=0,011;
OR=4,82 (CI95% 1,42-16,3)) и их сочетанного проявления (р=0,0086;
OR=5,78 (CI95% 1,56-21,04)).
У индивидов татарской этнической принадлежности выявлена ассоциация аллеля rs20541*A гена IL13 с развитием АР (p=0,022;
OR=1, (CI95% 1,07-2,55)) и сочетанного проявления БА и АР (p=0,039;
OR=1, CI95% 1,03-2,89)). Аллель A полиморфного локуса rs1800629 (-308GA) гена TNFA является маркером повышенного риска развития АД (p=0,039;
OR=1, (CI95% 1,03-3,64)) и сопутствующих БА, АР и АД (p=0,003;
OR=3,16 (CI95% 1,44-6,94)).
У индивидов башкирской этнической принадлежности обнаружена ассоциация аллеля G полиморфного локуса rs1800629 (-384AG) гена CCL11 с развитием АЗ в целом (р=0,046;
OR=1,7 (CI95% 1,01-2,86)), БА (р=0,053;
OR=1,71 (CI95% 0,99-2,93)), АР (р=0,019;
OR=2,01 (CI95% 1,12-3,61)) и их сочетанного проявления (р=0,026;
OR=2,1 (CI95% 1,09-4,06)). Маркерами повышенного риска тяжелого течения БА у башкир являются аллель A и генотип A/А полиморфного локуса rs1800629 (-308GA) гена TNFA (p=0,038;
и OR=2,62 (CI95% 1,03-6,63) p=0,041;
OR=4,82 (CI95% 0,96-24,31), соответственно.
В целом, проведенный нами анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с развитием АЗ у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности показал значимость исследованных генов в развитии БА, АР, АД и сочетанных форм аллергопатологии, а также наличие межэтнических различий обнаруженных ассоциаций.
Анализ ассоциации мутаций в гене FLG с развитием аллергических заболеваний Мутации в гене профилаггрина, приводящие к прекращению выработки филаггрина, являются одним из основных факторов риска развития АД и других АЗ в различных популяциях. Следствием мутаций является нарушение барьерной функции кожи, что облегчает проникновение аллергенов через эпидермис, инициирует развитие местной и системной аллергической реакции (Palmer et al., 2006;
Smith et al., 2006;
Elias et al., 2008;
Akiyama et al., 2010;
Bnnelykke et al., 2010;
Mildner et al., 2010;
Poniska et al., 2011;
Zhang et al., 2008, 2011;
Kezic et al., 2011). Нами проведено исследование двух распространенных в европейских популяциях мутаций гена FLG - с.2282del (c.2282delAGCT) и p.Arg501Ter (p.R501X), у больных АЗ и в контрольной группе. Мутация с.2282del4 в гене FLG в объединенной выборке больных АЗ выявлена у 7,85% больных в гетерозиготном состоянии и 0,41% больных – в гомозиготном. В контрольной группе 3,86% индивидов являлись гетерозиготными носителями этой мутации (рис. 1). Аллельная частота делеции с.2282del4 в ОВ больных АЗ составила 4,34%, в контроле - 1,93% (p=0,0033;
OR=2,31 (CI95%1,3-4,09)). У больных с сочетанными проявлениями трех АЗ мутация с.2282del4 встречалась с частотой 5,0% (р=0,0069;
OR=2,68 (CI95% 1,27-5,62)). С более высокой частотой мутация с.2282del4 определялась у больных с АД: в ОВ больных АД - 6,36% (p=1,4x10-5;
OR=3,45 (1,91-6,24)), у больных с проявлениями только АД - с максимальной частотой 8,79% (р=1,72х10-7;
OR=4,9 (CI95% 2,55-9,4)). В ОВ больных БА отмечалась тенденция повышения частоты встречаемости делеции по сравнению с контролем (3,22% vs 1,93%) (р=0,092), у больных с сопутствующими БА и АД частота мутации была выше - 6,25% (р=0,042;
OR=3,39 (CI95% 1,19-9,67)).
FLG2282*del ОВ БА OR=1,96 (1,06-3,6) ОВ АР OR=3,45 (1,91-6,24) ОВ АД OR=2,31 (1,3-4,09) ОВ АЗ БА+АР+АД OR=2,6 (1,24-5,46) БА+АР OR=3,39 (1,19-9,67) БА+АД АР+АД БА АР АД OR=4,9 (2,55-9,4) Контроль 0,0% 1,0% 2,0% 3,0% 4,0% 5,0% 6,0% 7,0% 8,0% 9,0% Рис. 1. Частота мутации c.2282del4 в гене FLG в объединенной выборке больных АЗ и в контрольной группе.
В ОВ больных АР частота мутации с.2282del4 составляла 3,71% (р=0,028;
OR=1,96 (CI95% 1,06-3,6)), у больных с сочетанными АР и АД – 4,46%. У больных БА и АР без сопутствующего АД частота мутации статистически значимо не отличалась от контроля.
Среди исследованных этнических групп с наибольшей частотой мутация с.2282del4 определялась у татар – у 10,94% пациентов, больных АЗ (9,45% гетерозигот, 1,49% гомозигот). У русских и башкир она обнаружена в гетерозиготном состоянии у 8,61% и 7,14% пациентов с АЗ, соответственно. У татар аллельная частота мутации в ОВ больных АЗ составила 6,22%, в контроле – 1,65% (р=0,029;
OR=3,96 (CI95% 1,18-13,28)). Статистически значимое повышение частоты этой мутации выявлено у больных с проявлениями всех трех АЗ (8,33%, р=0,036;
OR=5,42 (CI95% 1,26-23,42), в ОВ больных АД (10,48%, р=0,00078;
OR=6,98 (CI95% 2,05-23,73)), у больных с проявлениями только АД (14,29%, р=3,3х10-5;
OR=9,94 (CI95% 2,73-36,28)). У русских статистически значимое повышение частоты делеции обнаружено в общей выборке больных АД (5,69% по сравнению с 1,65% в контроле (р=0,0026;
OR=3,59 (CI95% 1,21-10,69)) и подгруппе больных с проявлениями только АД (9,82%, р=0,0011;
OR=6,48 (CI95% 2,02-20,83)). В контрольной группе башкир данная мутация встречалась с частотой 1,96%, у больных АЗ частота мутации была выше и составляла в ОВ больных АЗ – 3,57%, ОВ больных БА – 3,57%, ОВ больных АР – 4,44%, ОВ больных АД - 7,14%.
При исследовании мутации р.R501X установлено, что у больных из РБ она встречается с низкой аллельной частотой, составляющей в объединенной группе больных АЗ 0,98%;
у русских, больных АЗ, - 0,64%;
у татар, больных АЗ, - 0,8%;
у башкир мутация не обнаружена. В контроле в объединенной группе аллельная частота мутации составила 0,37%, у русских – 0,61%, у татар и башкир мутация не обнаружена. В целом, в объединенной выборке больных АЗ мутации в гене FLG обнаружены у 96 больных. Четверо больных оказались гомозиготами по делеции c.2282del4 и один больной – гомозиготой по мутации p.R501X. У 76 больных в гетерозиготном состоянии выявлена мутация c.2282del4, у 15 больных – мутация p.R501X. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о значимости мутаций в гене FLG в развитии АД и других АЗ на фоне АД у русских, татар и башкир.
Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена ADAM с развитием аллергических заболеваний Ген АDАМ33 является первым геном предрасположенности БА, детектированным с помощью позиционного клонирования (20р13) (Van Eerdewegh et al., 2002). ADAM33 принадлежит к семейству Zn-зависимых металлопротеиназ, экспрессируется преимущественно в гладкой мускулатуре и фибробластах легких, вовлечен в развитие субэпителиального фиброза, гипертрофии гладких мышц, гиперреактивности бронхов и воспаления (Cakebread et al., 2004;
Holgate et al., 2004;
Zhang et al., 2009;
Awasthi et al., 2010). Нами проведено исследование четырех полиморфных локусов гена ADAM33 (rs2787095, rs2485700, rs44707, rs2280091) у больных АЗ и в контрольной группе. При анализе ОНП полиморфного варианта rs (c.2162+427CA), локализованного в 11 интроне гена ADAM33, обнаружена ассоциация данного локуса с развитием АЗ у русских. Генотип A/A является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,0033;
OR=1,98 (CI95% 1,25-3,12)), и, в частности, БА (р=0,0011;
OR=2,2 (CI95% 1,36-3,57)), АР (р=0,0198;
OR=1,77 (CI95% 1,09-2,86)), сочетанного проявления БА и АР (р=0,023;
OR=1,97 (CI95% 1,09-3,54)). Выявлена ассоциация данного генотипа с тяжелым течением БА (p=0,0008, OR=3,35 (CI95% 1,62-6,93)).
Анализ полиморфного локуса rs2280091 (c.2213AG, p.Met738Thr), расположенного в 20 экзоне гена ADAM33, показал, что у индивидов башкирской этнической принадлежности аллель G является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,048, OR=2,41 (CI95% 0,99-5,87)), БА (p=0,038, OR=2,52 (CI95% 1,03-6,19)), АР (р=0,0044;
OR=2,63 (CI95% 1,0 6,95)) и сочетанных проявлений БА и АР (р=0,041;
OR=2,83 (CI95% 1,01-7,89)).
Проведен анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ исследованных полиморфных вариантов гена ADAM33 в выборках больных АЗ и контрольной группе. У русских обнаружены статистически значимые отличия в распределении частот гаплотипов гена ADAM33 между больными АЗ и контрольной группой. Установлено, что гаплотип ACAC (rs2280091-rs44707 rs2485700-rs2787095) у русских является маркером пониженного риска развития аллергических заболеваний в целом (p=0,0041), БА (р=0,0017), АР (р=0,0314), сопутствующих БА и АР (р=0,0207).
Результаты проведенного нами анализа ассоциации свидетельствуют о роли полиморфных вариантов гена в формировании ADAM предрасположенности к АЗ заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у русских и башкир.
Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков с аллергическими заболеваниями Развитие АЗ тесно связано с воздействием на организм человека различных неблагоприятных факторов окружающей среды. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) участвуют в метаболизме множества токсичных веществ окружающей среды, лекарственных препаратов, медиаторов аллергического воспаления лейкотриенов и простагландинов (Carroll, 2005). С помощью биочипа-ИМБ нами было проведено исследование полиморфных локусов генов ФБК: CYP1A1 (rs1799814, rs1048943, rs4646903), CYP2D6 (rs3892097), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), NAT2 (rs1799929, rs1799930, rs1799931), CYP2C9 (rs1799853, rs1057910) и CYP2C19 (rs4244285) у больных АЗ русской и татарской этнической принадлежности и в соответствующих контрольных группах. В результате проведенного исследования полиморфного локуса rs3892097 (c.353-1GA) гена CYP2D6, установлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между контрольными группами русских и татар. Выявлена тенденция повышения частоты аллеля А, определяющего фенотип медленного лекарственного метаболизма, у татар, больных АР (р=0,099) и больных с сочетанными проявлениями БА и АР (р=0,091).
Анализ полиморфного локуса rs1799929 (c.481CT) гена NAT2 показал наличие статистически значимых различий в распределении частот аллелей между контрольными выборками русских и татар. Анализ ассоциации показал, что у русских аллель С является маркером повышенного риска развития АД (p=0,032;
OR=1,57 (CI95% 1,04-2,38)) и сочетанных проявлений трех АЗ (р=0,015;
OR=1,94 (CI95%1,14-3,33)). Полученные ассоциации согласуются с исследованиями Макаровой С.И., в которых было показано, что аллель NAT2*481T является протективным, а отсутствие этого аллеля связано с развитием астмы у детей русской этнической принадлежности (Makarova et al., 2000;
Макарова, 2011). У индивидов татарской этнической принадлежности, напротив, генотип T/T данного локуса является маркером повышенного риска развития АЗ в целом (p=0,036;
OR=2,54 (CI95% 1,04-6,19)), БА (p=0,029;
OR=2,69 (CI95% 1,08-6,69)) и ее тяжелого течения (p=0,0019;
OR=5,26 (CI95% Обнаруженные ассоциации БА у татар согласуются с 1,71-16,17)).
результатами исследований, проведенных в Польше, Турции и Индии (Zielinska et al., 1997;
Gawronska-Szklars et al., 2001;
Nacak et al., 2002;
Batra et al., 2006;
Tamer et al., 2006;
Pawlik et al., 2009). Распространенность различных аллелей полиморфного варианта rs1799929 (c.481CT) гена NAT2 широко варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением (Sabbagh et al., 2011). Индивидуальные и этнические различия в скорости ацетилирования оказывают влияние на терапевтический эффект и наличие побочных действий некоторых лекарств и, вероятно, различные аллельные варианты гена NAT2 могут модулировать риск развития АЗ у лиц разной этнической принадлежности.
Таким образом, анализ 12 полиморфных локусов 7 генов системы биотрансформации у больных АЗ и здоровых индивидов из РБ выявил статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между контрольными группами русской и татарской этнической принадлежности по полиморфным локусам генов CYP2D6 (rs3892097) и NAT (rs1799929). Установлена ассоциация полиморфного варианта гена NAT (rs1799929) с развитием АЗ у русских и татар.
В целом, анализ полиморфных вариантов и мутаций генов-кандидатов позволил выявить ряд маркеров повышенного риска развития АЗ в целом, БА, АД, АР и их сочетанных форм у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности (табл. 3), показал наличие межэтнических различий выявленных маркеров риска, а также сходство маркеров риска, предрасполагающих к развитию БА, АР и их сочетанного проявления.
Таблица Маркеры повышенного риска развития АЗ, БА, АР, АД у индивидов различной этнической принадлежности Русские Татары Башкиры Объедин.
выборка БА IL4 NAT2 CCL11 TNFA rs2243250*Т/Т rs1799929*T/T rs17809012*G rs1800629*A р=0,053;
OR=1, p=0,0088;
OR=4,97 p=0,029;
OR=2,69 p=0,02;
OR=1, ADAM33 ADAM rs44707*А/А rs2280091*G р=0,0011;
OR=2,2 p=0,038;
OR=2, АР IL4 IL13 CCL11 TNFA rs2243250*Т/Т rs20541*A (144Gln) rs17809012*G rs1800629*A р=0,019;
OR=2, p=0,011;
OR=4,82 p=0,022;
OR=1,66 p=0,021;
OR=1, ADAM33 FLG с.2282*del rs44707*А/А р=0,0198;
OR=1,77 р=0,028;
OR=1, ADAM rs2280091*G р=0,0044;
OR=2, АД FLG TNFA FLG с.2282*del4 с.2282*del rs1800629*A p=1,4x10-5;
р=0,0026;
OR=3,59 p=0,039;
OR=1, OR=3, NAT2 FLG с.2282*del rs1799929*С р=0,0008;
OR=6, p=0,032;
OR=1, NAT rs1799929*T p=0,032;
OR=1, АЗ IL4 FLG CCL11 TNFA с.2282*del rs2243250*Т/Т rs17809012*G rs1800629*A р=0,029;
OR=3,96 р=0,046;
OR=1,7 р=0,036;
OR=1, p=0,029;
OR=4, ADAM33 NAT2 ADAM33 FLG с.2282*del rs44707*А/А rs1799929*T/T rs2280091*G p=0,0033;
OR=1,98 p=0,036;
OR=2,54 p=0,048;
OR=2,41 p=0,003;
OR=2, NAT2 TNFA FLG БА, с.2282*del rs1799929*С/С rs1800629*A АР р=0,0069;
OR=2, p=0,015;
OR=1,94 p=0,003;
OR=3, и FLG с.2282*del АД р=0,036;
OR=5, IL4 IL13 CCL11 IL БА rs2243250*Т/Т rs20541*A (144Gln) rs17809012*G rs20541*A и р=0,026;
OR=2, (р=0,0086;
OR=5,78) p=0,039;
OR=1,72 p=0,037;
OR=1, АР ADAM33 ADAM33 TNFA rs44707*А/А rs2280091*G rs1800629*A р=0,041;
OR=2, (р=0,023;
OR=1,97) p=0,014;
OR=1, 2. Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы.
Полногеномное генотипирование 610000 однонуклеотидных полиморфных локусов выполнено у больных БА и индивидов контрольной группы русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. После проведения контроля качества генотипирования и корректировки генетической стратификации 550915 ОНП, прогенотипированных у 330 больных БА ( русский, 120 татар, 69 башкир) и 348 индивидов контрольной группы ( русских, 111 татар, 92 башкира) были отобраны для анализа ассоциации с БА.
Установлена статистически значимая ассоциация ОНП, локализованных на длинном плече хромосомы 17 в области 17q12-q21, с развитием БА (рис. 2).
Пять ОНП были ассоциированы с БА с полногеномным уровнем значимости p4,79х10-7 rs4795405) и (rs9303277, rs8067378, rs2290400, rs7216389, локализованы в интервале, охватывающем приблизительно 112 т.п.н. В этой области хромосомы 17 локализованы гены GSDMB и ORMDL3. Ген GSDMB кодирует один из белков семейства гасдерминдомен-содержащих протеинов гасдермин B, экспрессируется в эпителиальных клетках, лимфоцитах, желудке, кишечнике, печени, легких и других тканях. Роль гасдермина В в развитии БА ясна не до конца, однако известно, что он принимает участие в терминальной дифференцировке эпителиальных клеток (Carl-McGrath et al., 2008). Ген (orosomucoid 1 like 3) кодирует трансмембранный белок ORMDL эндоплазматического ретикулума ORMDL3, который входит в семейство оросомукоид-подобных белков и синтезируется во многих тканях, включая клетки печени и лимфоциты крови. ORMDL3 вовлечен в гомеостаз Ca(2+), способствует усилению отклика неструктурированных белков, инициируя развитие воспаления (Cantero-Recasens, 2010). Кроме того, белки ORM регулируют синтез сфинголипидов, участвующих в развитии аллергического воспаления и ремоделирования при БА (Ammit et al., 2001;
Masini et al., 2008;
Ryan et al., 2008;
Breslow et al., 2010).
Ассоциация БА с данной областью была впервые выявлена у детей из Германии и Великобритании (Moffatt et al., 2007). К настоящему времени проведен целый ряд работ, в которых установлена ассоциация ОНП области 17q12-q21, с БА в различных европейских и азиатских популяциях (Bouzigon et al., 2008;
Hirota et al., 2008;
Madore et al., 2008;
Sleiman et al., 2008;
Tavendale et al., 2008;
Bisgaard et al., 2009;
Leung et al., 2009;
Wu et al., 2009;
Halapi et al., 2010;
Moffat et al., 2010;
Ferreira et al., 2010;
Binia et al., 2011;
Hrdlickova et al., 2011;
Kavalar et al., 2011;
Yu et al., 2011). У русских жителей Западной Сибири при полногеномном анализе не обнаружено ассоциации ОНП из области 17q12 q21 с развитием БА (Фрейдин и др., 2011).
В исследованной нами выборке с наиболее высоким уровнем значимости с развитием БА был ассоциирован ОНП rs7216389 (c.236-1199СT), расположенный в первом интроне гена GSDMB (p=1,01x10-7). Частота встречаемости аллеля rs7216389*T у больных БА из РБ была выше (59,55%), чем в контрольной группе – 45,04% (p=1,01x10-7;
OR=1,8 (CI95% 1,45-2,23)).
GSDMB, ORMDL (17q12-21) Рис.2. Графическое изображение результатов полногеномного анализа ассоциации 550 915 ОНП с бронхиальной астмой (Manhattan plot). На оси X указана хромосомная локализация ОНП, на оси Y - значения отрицательного десятичного логарифма уровня значимости P-value. Горизонтальная черта соответствует принятому в данной работе пороговому уровню значимости, при котором доля ожидаемых ложноположительных результатов равна 5%.
Гомозиготный генотип rs7216389*T/Т в группе пациентов определялся в 37,27% случаев, в контроле – в 21,87% (p=1,2x10-5, OR=2,12 (CI95% 1,51-2,98)).
Ассоциация БА с ОНП области 17q12-q21 наблюдалась с различной степенью выраженности и при анализе ассоциации, проведенном в отдельных у русских (p=2,15x10-5 для rs7216389 при сравнении этнических группах – частот аллелей у больных БА и в контрольной группе), татар (p=0,049 для rs7216389) и башкир (p=0,0043 для rs7216389). Анализ ассоциации ОНП области 17q12-q21 в подгруппах с детской астмой (возраст манифестации лет) и БА с поздней манифестацией заболевания (18 лет) показал наличие выраженных различий в распределении частот аллелей ОНП данной области между больными и контролем в обеих подгруппах. Наиболее высокий уровень ассоциации БА и в той, и в другой подгруппах установлен для ОНП rs (р=1,97х10-6 и р=1,8х10-4, соответственно). Анализ ассоциации ОНП области 17q12-q21 в группах больных с различной тяжестью течения БА выявил тенденцию увеличения частоты аллелей и генотипов повышенного риска по данным локусам от легкой до тяжелой степени течения БА.
Анализ неравновесия по сцеплению ОНП области 17q12-21, показал, что 8 ОНП (rs9303277, rs12150079, rs11557467, rs2872507, rs8067378, rs2305480, rs2290400, rs7216389), ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости, находятся в тесном неравновесии по сцеплению (D`0,99) и входят в один гаплотипический блок, охватывающий примерно 93 т.п.н. (блок 1 на рис. 3).
При анализе гаплотипов обнаружено, что маркером повышенного риска развития БА является наиболее распространенный гаплотип CGGGAGTT (р=2,77х10-7, OR=1,76 (CI95% 1,42-2,18)). Этот гаплотип по генотипированным локусам оказался идентичным гаплотипу, ассоциированному с повышенным уровнем экспрессии генов GSDMB и ORMDL3 в клеточных линиях лимфобластов индивидов европейского происхождения (CEU, HapMap) Таким образом, при полногеномном исследовании (Verlaan et al., 2009).
установлена статистически значимая ассоциация полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-21, и составленных по ним гаплотипов с развитием бронхиальной астмы у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Рис. 3. Структура неравновесия по сцеплению между ОНП, локализованными в области 17q12-q21 (Haploview 4.2). В верхней части рисунка показана локализация ОНП в генах IKZF3, ZPBP2, GSDMB (GSDML), ORMDL3. Черными линиями очерчены гаплотипические блоки. В ячейках указаны значения коэффициента неравновесия по сцеплению D`(в ячейках без указанных значений D`=1). Различные оттенки серого цвета отображают силу неравновесия по сцеплению между ОНП.
Репликация результатов анализа ассоциации БА с полиморфными вариантами гена GSDMB Для подтверждения ассоциации полиморфных локусов, локализованных в области 17q12-q21, с развитием БА в РБ, нами проведен анализ трех ОНП гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389), в независимой выборке больных БА (202 чел.) и в контрольной группе русской, татарской и башкирской этнической принадлежности (220 чел.). Частоты аллелей и генотипов ОНП rs7216389 в новой выборке больных БА и контроля оказались сходными с таковыми в первоначально исследованных группах. Аллель rs7216389*Т встречался с более высокой частотой у больных БА – 57,43% по сравнению с 47,95% в контроле (р=0,0059;
OR=1,46 (CI95% 1,12-1,92)) Исследование ОНП rs2290400 также выявило наличие ассоциации данного локуса c БА (р=0,0047, ORT=1,48 (CI95% 1,13-1,94)). Анализ ассоциации гаплотипов по трем полиморфным вариантам гена гасдермина В с БА показал, что гаплотип GTT (rs2305480, rs2290400, rs7216389) является маркером повышенного риска развития БА (р=0,0028).
Анализ ассоциации трех ОНП гена GSDMB, проведенный с учетом возраста манифестации заболевания, выявил различия в распределении частот аллелей всех трех локусов между больными детской БА и контрольной группой:
rs2305480 (p=0,0451;
ORT=1,37 (1,01-1,88)), rs2290400 (p=0,0021;
ORT=1, (CI95% 1,19-2,21)), rs7216389 (р=0,0029;
ORT=1,59 (1,17-2,18)). Гаплотип GTT (rs2305480, rs2290400, rs7216389) у больных детской БА встречался на 59,5% хромосом, в контроле – на 46,3% (р=0,0007). У больных с поздней манифестацией заболевания частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов гена GSDMB статистически значимо не отличались от частот аллелей и генотипов данных локусов в контрольных группах (p0,05). Учитывая, что в независимой выборке больных БА и индивидов контрольной группы не подтверждена ассоциация полиморфных вариантов гена GSDMB с развитием БА в возрасте 18 лет, можно сделать вывод о том, что ОНП области 17q12 q21, имеют более важное значение в развитии БА в детском возрасте. По данным литературы, в большинстве предыдущих исследований была показана ассоциация ОНП области 17q12-21 только с БА, дебютировавшей в детском возрасте (Moffatt et al., 2007, 2010;
Bouzigon et al., 2008;
Hirota et al., 2008;
Tavendale et al., 2008;
Bisgaard et al., 2009;
Leung et al., 2009;
Wu et al., 2009;
Halapi et al., 2010;
Smit et al., 2010;
Binia et al., 2011;
Yu et al., 2011).
Анализ ассоциации полиморфных локусов гена GSDMB с аллергическими заболеваниями Анализ трех ОНП гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) также проведен на расширенной выборке больных (906 человек) с различными клиническими проявлениями и сочетаниями АЗ (рис. 4).
OR=1,79 (1,45-2,23) ОВ БА OR=1,53 (1,26-1,85) ОВ АР OR=1,39 (1,14-1,69) ОВ АД OR=1,45 (1,22-1,73) ОВ АЗ OR=1,93 (1,46-2,54) БА+АР+АД OR=1,83 (1,43-2,35) БА+АР БА+АД АР+АД OR=1,71 (1,31-2,24) БА АР АД контроль 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% Рис. 4. Результаты анализа ассоциации полиморфного варианта rs7216389 гена GSDMB с развитием аллергических заболеваний. На оси Х указана частота встречаемости аллеля rs7216389*Т.
В объединенной группе больных установлена ассоциация полиморфных вариантов гена GSDMB с развитием АЗ в целом: rs2305480 (р=0,00047;
OR=1, (CI95% 1,15-1,64)), rs2290400 (p=5x10-5;
OR=1,44 (CI95% 1,21-1,72)), rs (p=3,2x10-5;
OR=1,45 (CI95% 1,22-1,73)). Кроме того, обнаружена ассоциация данных локусов с развитием БА в качестве единственного проявления аллергопатологии и БА в сочетании с другими аллергическими заболеваниями с АР или с АР и АД. Ассоциация данных локусов с собственно БА и БА с сопутствующими АР и/или АД наблюдается у русских и башкир. У татар обнаружена ассоциация ОНП rs2305480, rs2290400, rs7216389 гена GSDMB с развитием сопутствующих БА и АР. Проведенный анализ гаплотипов трех полиморфных локусов гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) подтвердил результаты ассоциаций отдельных полиморфных вариантов гена с различными клиническими проявлениями и сочетаниями аллергических заболеваний. Не выявлено ассоциации данных полиморфных локусов и составленных по ним гаплотипов с развитием АР и АД без клинических проявлений БА, что свидетельствует о значении данных локусов в развитии именно БА и о возможности использования их в качестве прогностических маркеров риска развития БА у больных АД и АР.
Ассоциация бронхиальной астмы с полиморфными локусами, локализованными в областях 9p13 и 7p12. В проведенном нами полногеномном анализе ассоциации было выявлено еще несколько полиморфных локусов, кроме локализованных в области 17q12 q21, ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости порядка 10-6.
Один из них, rs12342831 (c.649-4268TC), локализован в области 9p13 во втором интроне гена бета1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1. Установлено, что аллель rs12342831*Т, определенный с частотой 77,36% у больных и 66,03% в контрольной группе, является маркером повышенного риска развития БА (р=4,2х10-6;
OR=1,76 (CI95% 1,38-2,24). Генотип rs12342831*Т/Т у больных БА встречается с частотой 58,05%, у индивидов контрольной группы – 41,98% (p=3,1x10-5;
OR=1,91 (CI95% 1,41-2,59)). Наиболее выраженные различия в распределении частот аллелей и генотипов ОНП rs12342831 наблюдаются между больными тяжелой формой БА и контрольной группой. ОНП rs расположен в гаплотипическом блоке, охватывающем 36 т.п.н. В состав данного блока также входят еще 7 генотипированных ОНП, локализованных в интронах гена B4GALT1 и ассоциированных с БА с уровнями значимости от 0,05 до 3,6х10-4. Ген B4GALT1 является одним из семи генов бета1,4 галактозилтрансферазы и кодирует две изоформы белка, различающиеся по длине цитоплазматического домена (www.ncbi.nlm.nih.gov). Обе изоформы beta-1,4-GalT-I экспрессируются в моноцитарных дендритных клетках и CD4(+) T лимфоцитах человека и являются одними из ключевых молекул клеточной адгезии, участвующими во взаимодействии дендритных клеток с Т лимфоцитами (Han et al., 2009;
Cheng et al., 2010). Экспрессия длинной формы beta-1,4-GalT-I повышается под действием IL12 и IL4 в присутствии IL2, что свидетельствует о том, что данная форма белка может активно участвовать в дифференциации и функционировании Th1/Th2 клеток (Han et al., 2009).
При полногеномном анализе установлена также выраженная ассоциация БА с ОНП rs1496499 (g.45979023TG), локализованным в области 7p12. (p=4,77x10-6). Аллель rs1496499*Т, обнаруженный на 55,78% хромосом больных и 43,29% хромосом здоровых индивидов, оказался маркером повышенного риска развития БА (p=4,77x10-6;
OR=1,65 (CI95% 1,33-2,05)).
Генотип rs1496499*Т/Т встречался у больных БА с частотой 30,09%, в контрольной группе - 20,12% (р=0,0028;
OR=1,71 (CI95% 1,2-2,43)). Несколько ОНП, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению с rs1496499, также показали выраженную ассоциацию с БА: rs2965072 (р=4,98х10-6), rs (р=2,18х10-5), (р=6,88х10-5), (р=6,13х10-5). Анализ rs2949833 rs ассоциации ОНП области 7p12.3 с учетом тяжести течения БА выявил наиболее выраженные различия между индивидами с тяжелым течением заболевания и контрольной группой. Ближайшим геном, расположенным на расстоянии около 18 т.п.н. от ОНП rs1496499, является ген IGFBP3, который кодирует белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста IGF-I и IGF-II. ОНП rs (c.769-485TC), расположенный в 3-ем интроне гена IGFBP3 и находящийся в тесном неравновесии по сцеплению с ОНП rs1496499, также показал наличие ассоциации с БА (р=0,0058). В ряде работ было выявлено, что инсулино подобные факторы роста активируются при воспалении дыхательных путей и индуцируют пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных клеток, стимулируя выработку коллагена, ангиогенез и гиперплазию гладкомышечных клеток – основных процессов, происходящих при ремоделировании легких (Pascual, Peters, 2005;
Veraldi et al., 2009;
Kaplan et al., 2011).
Таким образом, впервые обнаружена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в областях 9p13 и 7р12.3, с развитием и тяжестью течения БА, что свидетельствует о вероятной роли в развитии данного заболевания расположенных в данных хромосомных областях генов (B4GALT1 и IGFBP3), в развитии бронхиальной астмы.
Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности С целью выявления этноспецифических генетических факторов риска развития бронхиальной астмы проведен полногеномный анализ ассоциации в отдельных этнических группах - русских, татар и башкир.
У русских наиболее выраженные различия между больными БА и контрольной группой выявлены по полиморфным локусам гена муцина (MUC19), локализованного в области 12q12. Ген MUC19 является одним из генов, кодирующих у человека муцины, высокомолекулярные гликопротеины, являющиеся главной составной частью слизистого геля, покрывающего большинство эпителиальных поверхностей и служащего селективным барьером между клеточной мембраной и внешним окружением. MUC19 относится к подсемейству гель-формирующих муцинов, экспрессируется в основном в клетках подслизистых желез трахеи и слюнных желез (Desseyn et al., 2000;
Chen et al., 2004). При некоторых заболеваниях MUC19 начинает экспрессироваться в эпителии – при аллергическом рините, хроническом среднем отите с эффузией (Kerschner, 2007;
Ji, Guo, 2009;
Zhu et al., 2010). Уровень продукции регулируется цитокинами и MUC19 TNF-alpha, IL1b, IL6 IL8, задействованными в аллергическом воспалении при БА (Kerschner et al., 2009).
В исследуемой нами выборке больных и контроля русской этнической принадлежности наиболее высокий уровень ассоциации БА обнаружен с ОНП rs2933346 (c.4048+292TG), расположенным в 52 интроне гена MUC19.
Частота аллеля rs2933346*G у больных БА была выше (85,25%), чем в контроле (р=2,59x10-6;
(68,53%) Частота генотипа OR=2,65 (CI95% 1,75-4,02)).
rs2933346*G/G у больных составляла 71,22%, в контрольной группе - 48,25% (p=8,5x10-5;
OR=2,65 (CI95% 1,62-4,34)). Семь ОНП гена MUC19 (rs (p.Arg1524Lys), rs2588401 (p.Ala1734Thr), rs2588402 (p.Ala1770Thr), rs (p.Pro1785Thr), rs2638864 (p.Thr1878Ile), rs1352940 (c.16916-41GA), rs (c.17123-477GA)), пять из которых локализованы в центральном, 56-ом, экзоне гена и приводят к заменам аминокислот, были ассоциированы с БА с одинаковым уровнем значимости (р=4,96x10-6). Анализ неравновесия по сцеплению показал, что все они находятся в тесном неравновесии по сцеплению и входят в один гаплотипический блок размером около 29 т.п.н.
Анализ гаплотипов 12 ОНП, входящих в данный блок, показал, что гаплотип GAAAATTAAGTA (rs2933346 - rs1492313 - rs2588401 - rs2588402 - rs2638863 rs2638864 - rs2638880 - rs2920833 - rs1352940 - rs17597637 - rs719228 rs2933373) является маркером повышенного риска развития БА у русских: его частота у больных составляла 68,8%, в контроле - 50,0% (р=4,96х10-6).
Таким образом, проведенный полногеномный анализ ассоциации показал наличие выраженной ассоциации БА у русских с ОНП, локализованными в гене муцина 19 (12q12). Ранее, по данным литературы, ассоциация БА и каких-либо других АЗ с данной областью и геном MUC19 не была выявлена ни в одной популяции. является относительно недавно клонированным и MUC просеквенированным геном среди всех муцинов (Chen et al., 2004;
Zhu et al., 2010), и результаты исследований по изучению его экспрессии, полиморфных вариантов весьма ограниченны. Однако, его структурное сходство с другими гель-продуцирующими муцинами, экспрессирующимся в респираторном тракте, и повышенная экспрессия этого гена у больных АР дают возможность предположить, что MUC19 играет важную роль в развитии БА.
Полногеномный анализ ассоциации БА, выполненный у индивидов татарской этнической принадлежности, показал наличие наиболее статистически значимой ассоциации с ОНП rs12719740 (g.99072905GA), расположенным в области 15q26.3 (p=4,65х10-7). В данном участке хромосомы локализовано два гена: FAM169B и IGF1R. Ген FAM169B принадлежит к семейству генов FAM169, кодирующих белки с неисследованной функцией. Ген рецептора инсулиноподобного фактора роста экспрессируется IGF1R практически во всех тканях. Рецептор IGF1R взаимодействует с высокой аффинностью с инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1) и инсулиноподобным фактором роста 2 (IGF2), с меньшей аффинностью – с инсулином Как уже было сказано выше, (Le Roith et al, 1995).
инсулиноподобные факторы роста играют важную роль в процессах пролиферации, дифференциации, апоптоза клеток и ремоделирования дыхательных путей при хронических заболеваниях легких (Kaplan et al., 2011).
При проведенном нами анализе распределения частот аллелей и генотипов ОНП установлено, что аллель rs12719740*G у больных БА rs встречается с более высокой частотой (90,34%), чем в контрольной группе (72,35%) (p=7,93x10-7;
OR=3,57 (CI95% 2,12-6,03)). Частота гомозиготного генотипа rs12719740*G/G у больных БА составила 81,51%, в контрольной группе - 52,29% (р=2,5x10-6;
OR=4,02 (CI95% 2,22-7,3)). Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных локусов, локализованных в области 15q26.3, показал, что ОНП rs12719740 находится в одном гаплотипическом блоке, размером около 20 т.п.н., с 10 другими полиморфными локусами. У больных БА была выше частота встречаемости гаплотипа GACACGGCATC (rs8034376 rs12914549 - rs4257189 - rs6598516 - rs12164914 - rs12719740 - rs8043332 rs11247355 - rs933813 - rs933812 - rs4641724) (17,0% vs 9,2%) (2=6,08;
p=0,014).
Таким образом, в результате проведенного исследования установлена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в области 15q26.3, с развитием БА у татар. Учитывая, что ассоциированные локусы находятся в непосредственной близости к гену рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), можно предположить, что данные ОНП играют роль в ремоделировании легких при бронхиальной астме.
У индивидов башкирской этнической принадлежности была обнаружена выраженная ассоциация БА с ОНП, локализованными в области 5q33. В хромосомной области 5q31-33 находится кластер генов цитокинов (IL4, 5, 9, 13, участвующих в реакциях аллергического воспаления и GM-CSF), ассоциированных с развитием АЗ по данным многочисленных исследований.
Полиморфные локусы, ассоциированные с БА в настоящей работе, локализованы в гене GRIA1, кодирующем субъединицу AMPA – ионотропного рецептора глутамата. Субъединицы рецептора экспрессируются AMPA тканеспецифично, главным образом, в тканях переднего мозга и гиппокампа. В настоящее время в литературе активно обсуждается иммуномодуляторная роль глутаматных рецепторов: глутаматные рецепторы обнаружены на поверхности Т-лимфоцитов;
установлено, что дендритные клетки секретируют глутамат, необходимый при взаимодействии Т-лимфоцитов и дендритных клеток (Pacheco et al., 2006). При полногеномном анализе обнаружена ассоциация ОНП в гене GRIA1 с аллергической реакцией на аспарагиназу у больных острой лимфобластной лейкемией (Chen et al., 2010).
Уровень значимости ассоциации ОНП с БА, выявленный в данном исследовании, достаточно широко варьировал при рассмотрении отдельных полиморфных вариантов гена GRIA1 (от р=0,0145 до р=4,25x10-7). С наиболее высоким уровнем значимости был ассоциирован ОНП rs (c.220+42404AC), расположенный во втором интроне гена GRIA1. У больных БА частота аллеля rs9324750*А (36,96%) была значительно выше, чем в контрольной группе (12,78%) (p=4,25x10-7;
OR=4,001 (CI95% 2,29-6,99)).
Анализ неравновесия по сцеплению показал, что ОНП rs9324750 находится в тесном неравновесии по сцеплению с 7 ОНП, также локализованными во интроне гена и входящими вместе с ним в один гаплотипический блок размером около 10 т.п.н. Гаплотип GTGCGGAT (rs495703 - rs480726 - rs - rs726876 - rs1463747 - rs17114771 - rs9324750 - rs10041179) у больных БА встречался значительно чаще (в 24,6% случаев), чем в контрольной группе индивидов (9,4% случаев) (р=3,0x10-4). Таким образом, полногеномный анализ ассоциации БА у башкир выявил ассоциацию с ОНП в гене GRIA1, локализованном в области 5q33 и кодирующем субъединицу AMPA – ионотропного рецептора глутамата, предположительно играющего роль в инициации и регуляции T-клеточного иммунитета.
В целом, проведенное полногеномное исследование однонуклеотидных полиморфных вариантов у больных БА и индивидов контрольной группы показало наличие ассоциации БА с полногеномным уровнем значимости (p4,79x10-7) с ОНП, локализованными в области 17q12-q21 (гены GSDMB и ORMDL3) и, по данным литературы, ассоциированными с развитием БА в популяциях различного этнического происхождения (табл. 4). Впервые обнаружена выраженная ассоциация БА с ОНП, локализованными в областях 9р13 (в гене B4GALT1) и 7р12.3 (в гене IGFBP3). Идентифицированы этноспецифические маркеры риска развития БА. У русских установлена значительная ассоциация БА с полиморфными вариантами гена муцина (12q12). У татар с наиболее высоким уровнем значимости с БА были ассоциированы ОНП, расположенные в области 15q26.3, в которой локализован ген рецептора инсулиноподобного роста 1. У башкир выявлена значимая ассоциация с полиморфными вариантами гена GRIA1, локализованного в области 5q33 и кодирующего субъединицу AMPA – ионотропного рецептора глутамата.
Таблица Маркеры повышенного риска развития бронхиальной астмы по результатам анализа генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциации Русские Татары Башкиры Общая выборка IL4 NAT2 CCL11 TNFA rs2243250*Т/Т rs1799929*T/T rs17809012*G rs1800629*A ADAM33 ADAM rs44707*А/А rs2280091*G GSDMB GSDMB GSDMB GSDMB rs7216389*T/T rs7216389*T/T rs7216389*T/T rs7216389*T/T B4GALT1 B4GALT1 B4GALT rs12342831*T/T rs12342831*T/T rs12342831*T/T IGFBP3 IGFBP3 IGFBP3 IGFBP rs1496499*T/T rs1496499*T/T rs1496499*T/T rs1496499*T/T MUC19 rs12719740*G/G GRIA rs2933346*G/G (15q26.3, IGFR1) rs9324750*A 3. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к бронхиальной астме Анализ ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов, вовлеченных в контроль многофакторных заболеваний, не дает достаточно полного представления о механизмах формирования наследственной предрасположенности, поскольку в основе возникновения многофакторной патологии лежат сложные взаимодействия генетических и средовых факторов, которые необходимо учитывать при прогнозировании риска развития заболевания и разработки профилактических мероприятий. В настоящей работе для моделирования межгенных взаимодействий были использованы программы MDR (Ritchie et al., 2001) и ее модифицированная версия – GMDR (Lou et al., 2007;
Chen et al., 2011). В этих программах с помощью многократного перекрестного пересчета первичных данных были выбраны оптимальные модели межгенного взаимодействия, позволяющие с наиболее высокой точностью предсказать человеку наличие предрасположенности к определенному аллергическому заболеванию.
Проведена оценка роли межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов цитокинов (IL4, IL4RA, IL13, IL10, TNFA и CCL11, гена ADAM33 (rs44707) и гена GSDMB (rs7216389) в детерминации риска развития аллергических заболеваний. При анализе объединенной выборки больных АЗ и контроля оптимальной моделью межгенного взаимодействия, предрасполагающей к развитию АЗ, оказалась комбинация из ДНК-локусов двух генов – интерлейкина 4 и гасдермина В (IL4 - GSDMB) (рис. 5). Основные характеристики моделей приведены в таблице 5. Эта же модель межгенного взаимодействия была предрасполагающей к развитию БА. Оптимальная модель ген-генного взаимодействия, ассоциированная с развитием АР, включала полиморфные локусы пяти генов (IL4 - IL13 - CCL11- ADAM33 – GSDMB). В оптимальную модель ген-генного взаимодействия при АД, входили полиморфные локусы трех генов - IL4, IL10 и GSDMB. Анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию сочетанных форм аллергопатологии, выявил трехлокусную модель (IL4 - IL13 – GSDMB), ассоциированную с развитием сочетанных БА и АР.
Исследование ген-генных взаимодействий у индивидов различной этнической принадлежности показало, что у русских оптимальной моделью, предрасполагающей к развитию АЗ в целом является трехлокусная модель IL4 IL4RA – GSDMB.
Повышенный риск Пониженный риск Рис. 5. Модель межгенных взаимодействий, предрасполагающая к развитию аллергических заболеваний (MDR).
Таблица Ключевые межгенные взаимодействия, определяющие предрасположенность к развитию АЗ Оптимальная модель межгенного Точность CV P Группы взаимодействия модели Сonsistency value Объединенная группа больных АЗ и контроля АЗ IL4- GSDMB 0,5892 9/10 0, БА IL4 - GSDMB 0,6206 8/10 0, АР IL4 - IL13 - CCL11 - ADAM33 - GSDMB 0,7397 7/10 0, АД IL4 - IL10 - GSDMB 0,6110 10/10 0, БА и АР IL4 - IL13 - GSDMB 0,6704 10/10 0, Больные АЗ и контрольная группа русской этнической принадлежности АЗ IL4 - IL4RA - GSDMB 0,6745 10/10 0, БА IL4 - GSDMB 0,664 10/10 0, БА, АР и IL10 - GSDMB 0,6871 8/10 0, АД Больные АЗ и контрольная группа татарской этнической принадлежности БА IL4 - IL4RA - IL13 - CCL11 – GSDMB 0,8867 10/10 0, АР IL4 - IL13 - CCL11 - GSDMB 0,8201 9/10 0, АД IL4 - IL13 - IL10 - CCL11 - GSDMB 0,9035 8/10 0, Больные АЗ и контрольная группа башкирской этнической принадлежности АЗ IL4 - IL13 - CCL11 0,8004 10/10 0, БА IL4 - IL4RA - IL10 - CCL11 0,901 7/10 0, АР IL4 - IL13 - CCL11 0,8231 9/10 0, Примечание: CV Сonsistency – cross-validation consistency (перекрестная проверка достоверности) Для БА у русских выявлена двухлокусная модель, аналогичная обнаруженной при анализе в объединенной выборке больных и контроля (IL4 GSDMB). К развитию сочетанной аллергопатологии у русских предрасполагает взаимодействие полиморфных локусов генов интерлейкина 10 и гасдермина В (IL10 – GSDMB).
При анализе межгенных взаимодействий у индивидов татарской этнической принадлежности была выявлена модель межгенного взаимодействия полиморфных локусов пяти генов (IL4 - IL4RA - IL13 - CCL11 – GSDMB), предрасполагающая к развитию БА. С аллергическим ринитом у татар была ассоциирована четырехлокусная модель, в которую входили те же полиморфные локусы, что и при БА, за исключением IL4RA (IL4 - IL13 - CCL – GSDMB). При атопическом дерматите статистически значимая пятилокусная модель включала полиморфные локусы генов IL4, IL13, IL10, CCL11 и GSDMB.
У башкир была выявлена статистически значимая трехлокусная модель межгенных взаимодействий, предрасполагающая к развитию аллергических заболеваний в целом и аллергическому риниту, в частности (IL4 - IL13 CCL11), а также четырехлокусная модель, ассоциированная с развитием бронхиальной астмы (IL4 - IL4RA - IL10 - CCL11).
Проведенный анализ межгенных взаимодействий дал возможность установить ДНК-локусы исследованных генов, взаимодействующие при формировании наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям в целом и к различным клинико-патогенетическим вариантам их течения. Несмотря на то, что в структуре и характере взаимосвязей между локусами, предрасполагающих к развитию разных АЗ в различных этнических группах, наблюдаются существенные отличия, полученные результаты анализа межгенных взаимодействий свидетельствуют, что ключевая роль в формировании предрасположенности к АЗ принадлежит полиморфным локусам генов интерлейкина 4, интерлейкина 13 и гасдермина В, входящих в состав большинства статистически значимых моделей.
Таким образом, в результате исследования полиморфных вариантов ряда генов-кандидатов АЗ и полногеномного анализа ассоциации БА выявлены маркеры риска, предрасполагающие к развитию различных клинико патогенетических вариантов развития АЗ у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Установлено, что в развитии БА во всех исследованных этических группах ведущую роль играют полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21. По результатам проведенных до настоящего времени работ, ассоциация БА именно с этой областью многократно подтверждена в популяциях различного этнического происхождения, что однозначно свидетельствует о роли локализованных в ней генов (GSDMB и ORMDL3) в развитии этого многофакторного заболевания.
Впервые выявлена значительная ассоциация БА и ее тяжелого течения с полиморфными локусами, локализованными в областях 9р13 и 7р12.3.
Идентифицированы этноспецифические маркеры риска развития БА и других АЗ по результатам анализа генов-кандидатов и GWAS. Во всех этнических группах установлено сходство маркеров риска развития АЗ верхних и нижних дыхательных путей – аллергического ринита, бронхиальной астмы и их сочетанного проявления. Показана ключевая роль мутаций в гене профилаггрина в развитии атопического дерматита и других аллергических заболеваний, развивающихся на фоне АД. Анализ межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов позволил выявить ключевые ген-генные взаимодействия, предрасполагающие к развитию различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
ВЫВОДЫ 1. Обнаружены генетические маркеры, предрасполагающие к развитию аллергических заболеваний во всех исследованных этнических группах, и этноспецифические маркеры риска развития АЗ у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Выявлены полиморфные варианты генов, обусловливающие развитие определенных клинико-патогенетических вариантов течения аллергических заболеваний.
2. Установлена ассоциация полиморфных вариантов генов IL4 (rs2243250) и ADAM33 (rs44707) c развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления у индивидов русской этнической принадлежности.
3. Выявлено, что у индивидов татарской этнической принадлежности развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом ассоциировано с полиморфным вариантом гена NAT2 (rs1799929), развитие аллергического ринита и бронхиальной астмы, сочетанной с аллергическим ринитом – с полиморфным вариантом гена IL13 (rs20541), развитие атопического дерматита - с полиморфными вариантами генов TNFA (rs1800629) и NAT (rs1799929).
4. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов генов CCL11 (rs17809012) и ADAM33 (rs2280091) c развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления у индивидов башкирской этнической принадлежности.
5. Установлено, что развитие атопического дерматита, бронхиальной астмы и аллергического ринита с сопутствующим атопическим дерматитом в объединенной выборке больных и во всех этнических группах ассоциировано с носительством мутации c.2282del4 в гене профилаггрина FLG. Полиморфный локус rs1800629 гена TNFA ассоциирован с развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления в объединенной выборке больных.
6. Выявлено, что маркерами повышенного риска тяжелого течения бронхиальной астмы у русских является генотип А/А полиморфного локуса rs44707 гена ADAM33, у татар – генотип T/T rs1799929 гена NAT2, у башкир - генотип A/A rs1800629 гена TNFA.
7. Установлена статистически значимая при полногеномном исследовании ассоциация пяти полиморфных локусов, локализованных в области 17q12 q21, с развитием БА (p4,79x10-7). Наиболее высокий уровень ассоциации БА обнаружен с полиморфным локусом rs7216389, расположенным в первом интроне гена гасдермина В GSDMB (p=1,01x10-7). С наибольшей частотой аллели и генотипы повышенного риска данных локусов встречались у больных с тяжелой формой заболевания.
8. Обнаружена ассоциация полиморфных локусов, локализованных в областях 9р13 в гене бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT и 7р12.3 в гене IGFBP3, кодирующем белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста, с развитием и тяжестью течения бронхиальной астмы.
9. Выявлены этноспецифические маркеры риска развития бронхиальной астмы по результатам полногеномного анализа ассоциации. У русских установлена ассоциация БА с полиморфными локусами гена муцина 19 MUC19, локализованного в области 12q12;
у татар – с полиморфными локусами, расположенными в области 15q26.3, у башкир - с полиморфными вариантами гена субъединицы AMPA – ионотропного рецептора глутамата GRIA1, локализованного в области 5q33.
10. Обнаружена ассоциация трех полиморфных локусов гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) с развитием собственно бронхиальной астмы и БА с сопутствующими аллергическим ринитом и атопическим дерматитом при исследовании на расширенной выборке больных аллергическими заболеваниями. Установлено, что исследованные ДНК локусы гена GSDMB не ассоциированы с развитием атопического дерматита и аллергического ринита, не сопровождаемых развитием БА, что свидетельствует об их роли в развитии именно бронхиальной астмы.
11. Выявлено межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов GSDMB и IL4, детерминирующее развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом в объединенной выборке больных. Установлены комбинации полиморфных вариантов генов, предрасполагающие к развитию аллергического ринита (IL4 – IL13 – CCL11 – ADAM33 – GSDMB) и атопического дерматита (IL4 – IL10 – GSDMB). Идентифицированы модели межгенного взаимодействия, ассоциированные с развитием различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ Статьи в рецензируемых научных журналах 1. Эткина И.А., Карунас А.С., Вялкова А.А., Гурьева Л.В., Хуснутдинова Э.К.
Генетические аспекты бронхиальной астмы // Здравоохранение Башкортостана. 1999. № 6. С.69-80.
2. Карунас А.С., Измайлова А.Р., Загидуллин Ш.З., Хуснутдинова Э.К.
Исследование молекулярно-генетических основ предрасположенности к бронхиальной астме в Башкортостане // Медицинская генетика. 2004. № 6.
С.284-290.
3. Kutuev I., Khusainova R., Karunas A., Yunusbayev B., Fedorova S., Lebedev Yu., Hunsmann G., Khusnutdinova E. From east to west: patterns of genetic diversity of populations living in four Eurasian regions // Human Heredity. 2006.
V.61(1). P.1-9.
4. Хузина А.Х., Карунас А.С., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетические аспекты аллергического ринита // Медицинская генетика. 2007. №6. С.9-16.
5. Карунас А.С., Измайлова А.Р., Хуснутдинова Э.К., Загидуллин Ш.З. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан // Цитокины и воспаление. 2007. Т.6. № 4. C.22-28.
6. Рамазанова Н.Н., Эткина Э.И., Хузина А.Х., Карунас А.С., Гурьева Л.Л., Орлова Н.А., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфизма генов IL4 (- СТ) и IL4R (Ile50Val) с бронхиальной астмой в республике Башкортостан // Казанский медицинский журнал. 2007. Т.8. №6. С.574-576.
7. Хузина А.Х., Карунас А.С., Бикташева А.Р., Юлдашева А.А., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Исследование ассоциаций полиморфных вариантов ряда генов цитокинов с аллергическим ринитом в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. 2008. №7. С. 27-35.
8. Юнусбаева М. М., Карунас А.С., Гарифуллин З.Р., Хуснутдинова Э.К.
Исследование полиморфных локусов ряда генов цитокинов (TNFA,IL1B, IL1RA) и генов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1,GSTM1) у больных инфильтративным туберкулезом легких // Пульмонология. 2008.
№3. С.59-63.