Mолекулярно-генетический анализ наследственной предрасположенности к хроническим заболеваниям органов дыхания
На правах рукописи
КОРЫТИНА ГУЛЬНАЗ ФАРИТОВНА MОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ХРОНИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
УФА – 2012
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный консультант доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна Официальные доктор биологических наук, профессор Иващенко Татьяна Эдуардовна, оппоненты:
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН доктор медицинских наук, профессор Полоников Алексей Валерьевич, Курский государственный медицинский университет доктор биологических наук, доцент Хидиятова Ирина Михайловна, Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Ведущая организация: ГУ Медико-генетический Научный Центр РАМН, г. Москва
Защита состоится «»марта_2012 г. в «_» часов на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской Академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: [email protected] Автореферат разослан «_»2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Перспективы в изучении природы широко распространенных заболеваний связаны с познанием генома человека, с выявлением его особенностей, создающих предпосылки для формирования патологического фенотипа (Пузырев, 2009;
Баранов, 2009). В развитии предрасположенности человека к многофакторной патологии важную роль играют как генетическая конституция индивидуума, так и действие факторов внешней среды. При этом соотношение средовых и генетических факторов сильно варьирует при различных заболеваниях (Пузырев, 2009;
Баранов, 2009). В структуре общей заболеваемости населения России болезни органов дыхания традиционно занимают лидирующую позицию - на их долю приходится до 27,8% всей зарегистрированной и 42,7% выявленной впервые в жизни патологии (Щепин, 2001). Среди хронических респираторных заболеваний у взрослых значительная часть приходится на хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), у детей и подростков - на хронические бронхолегочные заболевания (ХБЛЗ) (Чучалин, 2009). Профессиональный бронхит формируется у 4,5-24,6% лиц, работающих во вредных и неблагоприятных производственных условиях (Лещенко с соавт., 2004). К факторам, которые способствуют развитию заболеваний органов дыхания, относят курение табака, профессиональную вредность (воздействие аэроирритантов, пыль, химических веществ), атмосферные поллютанты (диоксид серы, азота и углерода, свинец, угарный газ, кремний, асбест, уголь), частые инфекции респираторного тракта, а также социально-экономический статус пациента (GOLD, 2010). Наследственная предрасположенность является важным внутренним фактором риска развития хронических заболеваний органов дыхания, с которыми тесно связаны особенности иммунологической реактивности, роста и развития легких (GOLD, 2010).
Многие аспекты развития хронических заболеваний органов дыхания до сих пор не ясны, но известны ключевые звенья, патогенеза. Это, прежде всего, хроническое воспаление, запускающее весь каскад патогенетических реакций, приводящих к нарушению баланса протеолитических ферментов и их ингибиторов, и развитию окислительного стресса. Генетические механизмы формирования ХОБЛ в последние годы стали объектом широкомасштабных исследований во всем мире.
В результате проведенного полногеномного анализа сцепления при ХОБЛ, показана высокая степень сцепления локусов на хромосоме 19q - TFGB (transforming growth factor, beta 1, трансформирующий фактор роста бета1) и хромосоме 2q - SERPINE2 (serpin peptidase inhibitor, clade E, серпиновый ингибитор пептидаз, тип E) (Silverman, 2002;
Palmer, 2003). Из опубликованных к настоящему моменту данных полногеномных исследований генетических ассоциаций (GWAS), выявлено несколько локусов, связанных с развитием ХОБЛ, на 4-й и 15-й хромосомах в области 15q25.1 - CHRNA3, CHRNA5, (cholinergic receptor nicotinic alpha 3, холинергические никотиновые рецепторы альфа 3 и 5), IREB2 (iron-responsive element binding protein 2, белок железо-связывающего элемента 2), PSMA4 (proteasome subunit alpha type 4, субъединица альфа 4-го типа протеосомного комплекса), 4q31.21 - HHIP (hedgehog interacting protein, взаимодействующий протеин hedgehog сигнального пути), 4q22.1 - FAM13A (family with sequence similarity 13 member A, член А семейства со схожей последовательностью 13) и новый маркер rs7937 на хромосоме 19q13 (Pillai, 2009;
Wilk, 2009;
Repapi, 2009;
Cho, 2010;
Wan, 2010;
Kong, 2010, 2011;
Siedlinski, 2011;
Cho, 2011). До «Эры GWAS» генетическая составляющая ХОБЛ достаточно активно изучалась с использованием анализа генов-кандидатов (Wang et al., 2009;
Sadeghnejad et al., 2009;
Haq et. al., 2010;
Silverman et al., 2011). Данный метод до сих пор наиболее широко иcпользуется при проведении исследований по генетике ХОБЛ, поскольку позволяет сосредоточиться на одном или нескольких функционально значимых аллельных вариантах гена, кодирующих соответственно варианты белка, различающиеся по структуре и функциям, некоторые из которых могут быть вовлечены в развитие патогенетических изменений. Несмотря на значительное число исследований, выполненных с использованием разных подходов, молекулярно-генетические основы ХОБЛ до сих пор остаются во многом не ясными. На сегодняшний день перспективным является изучение не только генетических и молекулярных, но и эпигенетических факторов (метилирования ключевых генов, анализ активности гистонов, роли микро-РНК) (Silverman et al., 2011). Работа в различных направлениях позволит приблизиться к пониманию сложных процессов, приводящих к развитию болезни. Выбранные для настоящего исследования хронические заболевания органов дыхания хроническая обструктивная болезнь лгких, хронические бронхолегочные заболевания у детей, хронический профессиональный бронхит - занимают лидирующие позиции по распространенности, тяжести течения, серьезности осложнений и являются основными причинами высоких темпов роста заболеваемости, инвалидизации и смертности населения, как в Российской Федерации, так и во многих других странах, что свидетельствует об актуальности изучения генетических основ данных заболеваний и выяснения основных причин их возникновения.
Цель работы: на основе комплексного анализа полиморфных локусов генов кандидатов и факторов окружающей среды охарактеризовать особенности формирования наследственной предрасположенности к развитию хронической обструктивной болезни легких, хроническим бронхолегочным заболеваниям у детей и профессиональному хроническому бронхиту Задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза в трех этнических группах жителей Республики Башкортостан (русские, татары, башкиры).
2. Изучить ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с предрасположенностью к хронической обструктивной болезни легких, хроническим бронхолегочным заболеваниям у детей и профессиональному хроническому бронхиту.
3. Выявить генетические локусы, ассоциированные с развитием хронических заболеваний органов дыхания, с учетом этнической принадлежности и полового диморфизма.
4. Исследовать взаимосвязь полиморфных вариантов генов-кандидатов с клиническими формами, тяжестью течения и возрастом манифестации хронической обструктивной болезни легких с учетом влияния факторов окружающей среды и гендерных различий.
5. Проанализировать характер взаимодействий между генами-кандидатами и средовыми факторами (статус и интенсивность курения, стаж работы во вредных производствах), определить их роль в этиопатогенезе хронических заболеваний органов дыхания.
6. На основе изучения моделей взаимодействия генов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза оценить значимость ключевых генов в формировании наследственной предрасположенности к хроническим заболеваниям органов дыхания.
Научная новизна: Впервые проведен комплексный анализ формирования наследственной предрасположенности к развитию хронических заболеваний органов дыхания, спровоцированных курением, профессиональной деятельностью и респираторными инфекциями, на основе анализа функционально значимых полиморфных локусов генов-кандидатов, изучения взаимодействия генетических и средовых факторов, выявления этнической гетерогенности полученных ассоциаций. Впервые получены данные о частотах аллелей и генотипов полиморфных локусов генов CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2S1, NQO1, EPHX1, UGT2B7, GPX1, MMP1, 2, 3, 9, 12;
TIMP2, 3;
SERPINA1, SERPINA3, VDBP в этнических группах русских, татар и башкир, проживающих в Республике Башкортостан. Впервые установлена ассоциация полиморфных вариантов генов NQO1, MMP3, CYP2S1, CYP2F1, TIMP3, UGT2B7, MMP9 с развитием хронических заболеваний органов дыхания. Определены значимые ген-средовые взаимодействия с курением для локусов ADAM (12418AG), TIMP3 (-1296TC), VDBP (1296TG), CYP1A1 (2454AG), CYP2F (c.14_15insC), GPX1 (599CT), SOD3 (691CG), UGT2B7 (2146C), EPHX (415AG) и со стажем работы для локусов IL1RN (VNTR), VDBP (1307CA) и CYP1A1 (3798TC) при формировании хронических заболеваний органов дыхания. Выявлена ассоциация полиморфных локусов UGT2B7 (2146CT), NAT (590GA), CYP1A1 (2454AG) с возрастом манифестации, LTA (252AG), IL6 ( 174GC), CYP2E1 (-1053CT), MMP9 (-1562CT) с тяжестью течения, UGT2B (2146CT), ADAM33 (13491 CG), IL1RN (VNTR), VDBP (1296TG) с клиническими вариантами хронической обструктивной болезни легких.
Научно-практическая значимость работы: Полученные результаты вносят вклад в понимание структуры наследственной предрасположенности к развитию хронических заболеваний органов дыхания и являются базой для познания механизмов их патогенеза, профилактики, диагностики и лечения. Результаты исследования широкого спектра генов-кандидатов с хроническими заболеваниями органов дыхания, анализ их взаимодействия с факторами среды, особенности ассоциации генетических маркеров в дифференцированных по полу и этнической принадлежности группах могут быть использованы в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска. Данные диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза в этнических группах (русских, татар, башкир), проживающих в Республике Башкортостан, характеризуется широким аллельным разнообразием. Межэтнические различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов CYP1A1 (3798TC), CYP1A1 (2454AG), CYP1A2 (-2467delT), CYP2A6 (del), CYP2E1 (-1053CT), SOD1 (c.239+34AC), IL1RN (VNTR), IL10 (-627CA), VDBP (1296TG).
2. С развитием хронической обструктивной болезни легких ассоциированы полиморфные варианты генов NQO1 (465CT), CYP2A6 (del), CYP1A2 (-163CA), CYP2S1 (13255AG), EPHX1 (337TC), GSTP1 (313AG), SOD3 (691CG), CAT ( 262CT), IL6 (-174GC), VDBP (1296TG и 1307CA), MMP3 (-11715А6А), ADAM33 (12418AG). Развитие хронических бронхолегочных заболеваний у детей ассоциировано с полиморфными вариантами генов CYP2F1 (c.14_15insC), CYP1A (2454AG, 3798C), NQO1 (465CT), GSTT1 (del), GSTP1 (313AG), CAT ( 262CT), IL6 (-174GC), IL1RN (VNTR), VDBP (1296TG и 1307CA), MMP1 ( 1607 GGG), MMP12 (-82AG), MMP3 (-11715А6А), MMP9 (2660AG).
Ассоциация с профессиональным хроническим бронхитом полиморфных вариантов генов VDBP (1296TG и 1307CA), UGT2B7 (2146CT), CYP1A2 ( 2467delT), GSTP1 (313AG), NQO1 (465CT), CAT (-262CT), IL8 (-251TA), ADAM33 (13491CG), MMP9 (2660AG), MMP1 (-519AG). Спектр выявленных маркеров наследственной предрасположенности при каждой патологии существенно варьирует в зависимости от этнической принадлежности и полового диморфизма.
3. Полиморфизм генов UGT2B7 (2146CT), NAT2 (857GA), GSTM1 (del), CYP1A (2454AG) вносит вклад в вариабельность возраста манифестации хронической обструктивной болезни легких;
ассоциированы с тяжестью течения заболевания полиморфные варианты генов LTA (252AG), IL6 (-174GC), CYP2E1 (-1053CT) MMP9 (-1562CT);
развитие эмфиземы легких ассоциировано с локусами UGT2B (2146CT), ADAM33 (13491CG), IL1RN (VNTR), VDBP (1296TG).
4. Структура наследственной предрасположенности при формировании хронических заболеваний органов дыхания различается у индивидов подверженных курению и некурящих. При хронической обструктивной болезни легких и профессиональном хроническом бронхите наблюдаются значимые взаимодействия средовых факторов (статуса и интенсивности курения, стажа работы во вредных производствах) с полиморфными вариантами генов ADAM (12418AG), TIMP3 (-1296TC), VDBP (1296TG), CYP1A1 (2454AG), CYP2F (c.14_15insC), GPX1 (599CT), SOD3 (691CG), UGT2B7 (2146CT), EPHX (415AG), IL1RN (VNTR).
5. Характер межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза варьирует в зависимости от конкретного заболевания, этнической принадлежности, полового диморфизма и статуса курения.
Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 14 - 21 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания, (Москва, 2003, 2005, 2009, 2010;
Санкт-Петербург, 2004, 2006;
Казань, 2007;
Екатеринбург, 2008;
Уфа, 2011);
на ежегодных международных конгрессах Европейского респираторного общества (Вена, 2003, 2009;
Глазго, 2004;
Копенгаген, 2005;
Мюнхен, 2006;
Стокгольм, 2007;
Берлин, 2008;
Барселона, 2010;
Амстердам, 2011);
на конференциях Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004, 2009);
на V и VI и Съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005;
Ростов-на-Дону, 2010);
на IX и Х Всероссийских Форумах с международным участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005, 2006);
на XIX международном конгрессе аллергологов и клинических иммунологов (Мюнхен, 2005);
на ежегодных конференциях Европейского общества по генетике человека (Копенгаген, 2005;
Амстердам, 2006, 2011;
Ницца, 2007;
Барселона, 2008;
Вена, 2009;
Гтенбург, 2010);
на международном конгрессе «Геном человека» Human Genome Meeting (Киото, 2005);
на Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», (Новосибирск, 2005);
на II Санкт-Петербургском международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008);
на 3-м конгрессе Европейского общества педиатров «Europaediatrics» (Стамбул, 2008).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 78 работ, из них 32 статьи в журналах из Перечня ВАК, в том числе, 15 в журналах из международной базы цитирования (PubMed), 1 статья в зарубежной печати. В виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций опубликовано 45 работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 411 страницах машинописного текста. Данные проиллюстрированы таблицами (85), рисунками (51) и приложениями (2). Список литературы включает 577 источников.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь в проведении совместных исследований и обсуждении результатов работы, директору ИБГ УНЦ РАН, д.б.н., проф. Вахитову В.А., зав. Отделом геномики ИБГ УНЦ РАН д.б.н., проф. Хуснутдиновой Э.К., главному пульмонологу РБ, зав.
кафедрой пропедевтики внутренних болезней БГМУ д.м.н., проф. Загидуллину Ш.З. (БГМУ), зав. пульмонологическим отделением ГКБ №21 д.м.н, проф.
Фархутдинову У.Р., к.м.н. Байнак О.В. (БГМУ), директору Уфимского научно исследовательский института медицины труда и экологии человека, г. Уфы д.м.н., проф. Бакирову А.Б. и врачу–профпатологу отделения профессиональной аллергологии и иммунореабилитации к.м.н., Мингазовой С.Р., зав. кафедрой детских болезней БГМУ д.м.н., проф. Эткиной Э.И., к.м.н. Бабенковой Л.И.
(БГМУ), врачу-педиатру пульмонологического отделения РДКБ Нуриахметовой А.Ж.;
аспиранту Department of Genetic Epidemiology, George-August University of Goettingen (Германия) Викторовой Е.В. Сотрудникам и коллегам лаборатории экологической генетики человека ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Ахмадишиной Л.З., к.б.н.
Кочетовой О.В., к.б.н. Янбаевой Д.Г., к.б.н. Данилко К.В., к.б.н. Целоусовой О.С., сотрудникам лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН к.б.н.
Хусаиновой Р.И., к.м.н. Карунас А.С. и всем коллегам лаборатории физиологической генетики и молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Для оценки частот полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза в этнических группах жителей Республики Башкортостан была сформирована выборка из человек, включающая индивидов разной этнической принадлежности: русские (N=376), татары (N=301) и башкиры (N=147). Для проведения анализа ассоциации генов-кандидатов с хроническими заболеваниями органов дыхания были сформированы три группы, подобранные по принципу «случай-контроль», с учетом возраста, пола, этнической принадлежности и влияния факторов среды.
Характеристики изученных групп приведены в таблицах 1, 2, 3. Диагноз ХОБЛ устанавливался лечащими врачами городских клинических больниц г. Уфы №21, 13, 22, 18 в соответствии с международной классификацией болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) и с учетом рекомендаций GOLD (Global initiative for chronic obstructive lung disease, 2010). Больные ХОБЛ ранее не имели профессиональной вредности и не подвергались действию комплекса вредных производственных факторов. Критериями исключения из группы являлись наличие симптомов аллергических заболеваний, бронхиальной астмы, онкологических заболеваний, специфических инфекционных заболеваний органов дыхания (туберкулез). Группу контроля составили практически здоровые индивиды - жители Республики Башкортостан без патологии дыхательной системы в анамнезе и без профессионального контакта с вредными химическими веществами. Для выявления ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с тяжестью течения, возрастом манифестации и развитием эмфиземы легких внутри выборки больных выделяли следующие подгруппы: ХОБЛ с эмфиземой легких (N=202) и ХОБЛ без эмфиземы легких (N=189);
группа больных с тяжелой ХОБЛ (N=296), включающая больных с IV стадией заболевания и осложнениями в виде пневмосклероза и/или эмфиземы легких, и ХОБЛ средней тяжести (N=95), которая включала больных со II и III стадиями ХОБЛ без осложнений;
больные ХОБЛ с ранней манифестацией заболевания (до 40 лет, средний возраст манифестации составил 29.92±10.68 лет) и группа с поздней манифестацией ХОБЛ (после 40 лет, средний возраст манифестации - 56.01±8.79 лет).
Таблица Характеристика больных ХОБЛ и группа сравнения Больные ХОБЛ Контроль n (%) n (%) мужчин 312 (79.79) 417 (81.13) женщин 79 (20.21) 97 (18.87) возраст (лет) M±m 61. 3 ± 12.7 55.8 ±7. татары 183 (46.80) 279 (54.28) русские 208 (53.2) 235 (45.72) индекс курения для курильщиков 35.5±21.41 13.19±8. (пачка-лет) M±m статус курения:
курильщики 267 (68.29) 348 (67.70) некурящие 124 (31.71) 166 (32.3) Всего 391 Исследовано 257 детей с хроническими бронхолегочными заболеваниями (ХБЛЗ) в возрасте от 2 до 18 лет (табл. 2). Диагноз был верифицирован на основании комплексного клинико-инструментального исследования лечащими врачами Республиканской детской клинической больницы и клиники БГМУ г. Уфы. Более, чем у половины детей (65% обследованных) установлены необратимые морфологические изменения в виде деформации бронхов и пневмосклероза в одном или нескольких сегментах, сопровождающиеся рецидивами воспаления в бронхах и легочной ткани, что трактовалось как затяжная (рецидивирующая) пневмония (J18 по МКБ-10).
Таблица Характеристика детей ХБЛЗ и группы сравнения ХБЛЗ Контроль n (%) n (%) мальчики 123 (47.86) 153 (45.67) девочки 134 (52.14) 182 (54.33) возраст (лет) M±m 12.44 ± 3.96 15.51±3. русские 94 (36.58) 104 (31.05) татары 163 (63.42) 231 (68.95) всего 257 У 35% обследованных с диагнозом хронический бронхит (J41 по МКБ-10) отмечались распространенные поражения бронхов, сопровождающиеся продуктивным кашлем (более 3-х месяцев в год), постоянными разнокалиберными хрипами в легких (в течение нескольких месяцев) при наличии 2-3 обострений заболевания в год на протяжении не менее 2-х лет подряд. Критерии исключения из исследования: дети с бронхиальной астмой, аллергическими заболеваниями и муковисцидозом. В качестве группы сравнения обследованы практически здоровые дети и подростки в возрасте от 4 до 18 лет. Все индивиды контрольной группы от 1 до 3-х раз в год переносили острые респираторные заболевания, не приводившие к развитию затяжного воспалительного процесса и госпитализации по поводу бронхолегочных заболеваний.
Диагностика профессионального хронического бронхита (ПХБ) (табл. 3) проводилась сотрудниками ФГУН УфНИИ Медицины труда и экологии человека Роспотребнадзора г. Уфы Таблица Характеристика больных с профессиональным хроническим бронхитом и группы сравнения ПХБ Здоровые рабочие n (%) n (%) мужчин 87 (71.31) 158 (95.18) женщин 35 (28.69) 8 (4.82) возраст (лет) M±m 55.69±9.46 46.01±6. русские 45 (36.89) 84 (50.60) татары 77 (63.11) 82 (49.40) стаж работы во вредных условиях 21.70±8.27 16.57±6. труда, лет превышение ПДК, раз 7.52±13.17 н/д индекс курения у курильщиков, (PY) 19.97±12.32 18.62±12. M±m статус курения:
курильщики 37 (30.33) 104 (62.65) некурящие 85 (69.67) 62 (37.35) Всего 122 в соответствии с нормативами, изложенными в сборнике нормативно методической документации по профпатологии и гигиене труда от 1998 и 2005 гг.
Исследовался характер действующего этиологического фактора и выполняемой работы, особенности клинической формы заболевания, конкретных санитарно гигиенических условий производственной среды и трудового процесса, учитывался стаж работы во вредных условиях труда. По профессиональному составу в группу больных ПХБ вошли рабочие следующих специальностей:
электрогазосварщики (34.43%);
рабочие горнообогатительных комбинатов (42.64%);
рабочие других редких профессий (22.93%). Комплекс воздействующих вредных производственных факторов включал в себя сварочный аэрозоль, токсические вещества, силикатную, металлическую, известковую и стеклянную пыль. В качестве группы сравнения были обследованы практически здоровые высокостажированные рабочие со сходными условиями труда:
электрогазосварщики, машинисты буровых и насосных установок, проходчики, крепильщики, взрывники, горные мастера. Проведенное исследование было одобрено Комитетом по этике Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. От всех участников исследования было получено информированное добровольное согласие на использование биологического материала в планируемых исследованиях.
Методы исследования. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Нами были изучены функциональные полиморфные локусы генов, продукты которых потенциально могут быть вовлечены в патогенез заболеваний органов дыхания. Гены и локусы для генотипирования выбирались с учетом распространения аллельных вариантов, функционального характера полиморфного локуса, ассоциированного с изменениями уровня экспрессии гена, активности, количества соответствующего белкового продукта (табл. 4). Полиморфные локусы генов анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или рестрикционного анализа.
Статистическая обработка результатов. Для количественных показателей вычислялись средние величины и их стандартные ошибки (M±m). Сравнение групп проводили с помощью непараметрического U-теста Манна-Уитни. При сравнении частот качественных признаков использовался критерий 2 Пирсона.
Статистическая обработка проводилась в программе Biostat (Primer of Biostatistics version 4.03). Оценка частоты редкого аллеля (minor allele frequency, MAF), соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга (тест ), анализ ассоциации с использованием базового аллельного теста и расчета Таблица Гены-кандидаты хронических заболеваний органов дыхания № Ген полиморфный локус HGVS Names* Ch RefSNP 1 2 Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков c.1384AG 1 CYP1A1 2454AG, I462V 15 rs p.Ile462Val 2 CYP1A1 3798TC g.1759AG 15 rs 3 CYP1A2 -163CA g.32035CA 15 rs 4 CYP1A2 -2467delT g.29731delT 15 rs 5 CYP1B1 4326CG, L432V - 2 rs 6 CYP2A6 large deletion g.10817_11469del653 19 rs71790353 - 7 CYP2E1 -1053CT g.3979CT 10 rs 8 CYP2F1 c.14_15insC c.14_15insC 19 rs 9 CYP2J2 -76GT g.4930GT 1 rs 10 CYP2S1 13106CT, P466L c.1397CT p.Pro466Leu 19 rs 11 CYP2S1 13255AG, 3' UTR c.*31AG 19 rs 12 GSTM1 large deletion - 13 GSTT1 large deletion c.528+1_529-1del204 22 rs 14 GSTP1 313AG, I105V c.313AG p.Ile105Val 11 rs c. 341CT 15 GSTP1 341CT, A114V 11 rs p.Ala114Val c.445CT 16 NQO1 609CT, P187S 16 rs p.Pro187Ser 17 NQO1 465CT, R139W - 16 rs 18 EPHX1 337TC, Y113H - 1 rs c.416AG 19 EPHX1 415AG, H139R 1 rs p.His139Arg c.481CT 481C Т, L161L 20 NAT2 8 rs1799929 - p.Leu161= c.590GA 21 NAT2 590GA, R197Q 8 rs1799930 - p.Arg197Gln c.857GA 22 NAT2 857GA, G286E 8 rs1799931 - p.Gly286Glu c.802TC 23 UGT2B7 2146CT, H268Y 4 rs p.Tyr268His Гены ферментов антиоксидантной защиты 24 SOD1 c.239+34AC c.239+34AC 21 rs c.691CG 25 SOD3 691CG, R231G 4 rs1799895 p.Arg231Gly 26 CAT -262CT g.4760CT 11 rs c.1167CT 27 CAT 1167 CT, D389D 11 rs p.Asp389= c.599CT 28 GPX1 599CT, P197L 3 rs p.Pro200Leu Продолжение таблицы на следующей странице Продолжение таблицы полиморфный № Ген HGVS Names Ch RefSNP локус 1 2 Гены ферментов системы протеолиза 29 MMP1 -1607 GGG g.3471delG 11 rs 30 MMP1 -519 AG g.4757AG 11 rs 31 MMP12 -82 AG g.102745791AG 11 rs -1171 5А6А 32 MMP3 g.3395_3396insA 11 rs 33 MMP9 -1562CT g.3430CT 20 rs c.836AG 34 MMP9 2660AG, R279Q 20 rs p.Gln279Arg 35 MMP2 -735CT g.4297CT 16 rs 36 ADAM33 13491CG c.*449GC 20 rs c.2213AG 37 ADAM33 12418AG, M738T 20 rs2280091 p.Met738Thr Гены ферментов сывороточных и тканевых игибиторов протеаз 38 TIMP2 -418GC g.76921889CG 17 rs 39 TIMP3 -1296TC g.4892TC 22 rs 40 SERPINA1 1237GA c.*224GA 14 rs c.863AT 41 SERPINA1 2313AT, E264V 14 rs p.Glu288Val c.1096GA 42 SERPINA1 4628AG, E342K 14 rs p.Glu366Lys 43 SERPINA3 25GA, A15T c.25GA, p.Ala9Thr 14 rs Гены медиаторов воспаления 44 TNFA -308GA g.4682GA 6 rs 45 LTA 252AG g.5438AG 6 rs 46 IL1B -511CT g.4490TC 2 rs16944 47 IL1B 3539CT - 2 rs VNTR интрон 2 48 IL1RN - 2 rs 49 IL6 -174GC g.4880CG 7 rs1800795 50 IL8 -251TA g.74606024AT 4 rs 51 IL10 -627CA g.4433AC 1 rs c.896AG 52 TLR4 896AG, D299G 9 rs4986790 p.Asp299Gly c.1296TG 53 VDBP 1296TG, D432E 4 rs p.Asp432Glu c.1307CA 54 VDBP 1307CA, T436K 4 rs p.Thr455Lys 55 TGFb -509CT g.3473AG 19 rs4803457 Примечание: Ch –хромосома, HGVS Names - номенклатура Human Genome variation Society (2011 года), RefSNP - Reference SNP (National Center for Biotechnology Information (NCBI)), 1 - ХОБЛ, 2 - ХБЛЗ у детей, 3 - ПХБ показателя отношения шансов OR для редкого аллеля каждого анализируемого локуса, статистическую значимость различий между группами по частотам аллелей и генотипов (тест 2 на гомогенность выборок и значение P-value для теста) проводили в программе PLINK v. 1. (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/contact.shtml#cite). Учитывая этническую гетерогенность выборок, были использованы тесты Кохрана-Мантеля-Хензеля и Бреслоу-Дэя, а также тест на гомогенность отношения шансов (OR), предусмотренные в пакете программ PLINK v. 1.07, которые позволяли оценить ассоциацию аллелей полиморфных локусов в стратифицированной выборке.
Логистическая регрессия использовалась для выявления ассоциации полиморфных локусов и гаплотипов сцепленных локусов с учетом количественных (возраст, возраст манифестации заболевания, индекс курения, стаж работы) и бинарных признаков (пол, этническая принадлежность, статус курения), вводимых в уравнение регрессии в качестве независимых переменных. Статистически значимыми считали различия при P0.05. Для минимизации статистической ошибки первого типа вводили поправку на множественность сравнений (поправка Бонферрони) и получали новое значение Р cor. Проверку гипотез о значимости независимых факторов проводили на основе коэффициента t-статистики и уровня значимости (P-value) для коэффициента t. Экспоненту отдельного коэффициента регрессии (beta) интерпретировали как отношение шансов (OR) для логистической модели с расчетом 95% доверительного интервала. Проверку гипотезы о существенности построенной модели в целом с учетом всех переменных проводили на основании теста отношения правдоподобия и его значимости P adj (уровень значимости с учетом всех переменных, включенных в уравнение регрессии). Для выбора лучшей модели использовали информационный критерий Акайке (AIC). Для каждого локуса из статистически значимых выбирались модели с наименьшим значением AIC. Логистическая регрессия использовалась также для оценки взаимодействия полиморфного локуса и фактора окружающей среды (статус и индекс курения, стаж работы во вредных производствах). Все расчеты проводили в программах PLINK и SNPStats v. 1. Частоты гаплотипов и величину (http://bioinfo.iconcologia.net/).
стандартизированного коэффициента неравновесия по сцеплению D', а также различия в частотах гаплотипов между группами рассчитывали в программе Haploview 4.2 (http://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/programs/ анализ ассоциации medical-and-population-genetics/haploview/haploview), гаплотипов сцепленных локусов в аддитивной модели проводили в программе SNPStats. Для исследования межгенных взаимодействий использовали метод MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) (Moore J.H. et al., 2002;
http://www.multifactordimensionalityreduction.org/), а также его модификацию GMDR (Lou X et al., 2007;
http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/addiction genomics/Software/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ распространенности полиморфных вариантов генов-кандидатов в этнических группах Республики Башкортостан.
Принимая во внимание генетически неоднородную этническую структуру населения Республики Башкортостан, нами проведен анализ частот генотипов, аллелей и гаплотипов полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, медиаторов воспаления, протеолитических ферментов и ингибиторов протеолиза в трх этнических группах (русских, татар и башкир). Полученные данные сравнивались с различными популяциями мира. Полиморфные локусы изученных генов в исследуемых этнических группах характеризовались широким аллельным разнообразием. Статистически значимые различия в распределении частот аллелей между тремя изученными группами были выявлены по локусам CYP1A (3798TC) (P=0.007), CYP1A1 (2454AG) (P=0.0001), CYP1A2 (-2467delT) (P=0.017), CYP2A6 (del) (P=0.044), CYP2E1 (-1053CT) (P=0.013), SOD (c.239+34AC) (P=0.032), IL1RN (VNTR) (P=0.005), IL10 (-627CA) (P=0.003), VDBP (1296TG) (P=0.0001), связанные с увеличением частоты редких аллелей в этнической группе башкир. Башкиры существенно отличались по распределению частот полиморфных вариантов генов CYP1A1 (2454AG), CYP1A1 (3798C), CYP2A6 (del), CYP2E1 (-1053CT), GSTP1 (313AG), SOD1 (c.239+34AC), MMP (-1117 5A6A), IL10 (-627CA), VDBP (1296TG), IL1RN (VNTR) от этнической группы русских, тогда как между русскими и татарами выявлено сходство по большинству изученных локусов. По частотам аллелей исследованных полиморфных локусов русские и татары не отличались от других европеоидных популяций тогда как (Hapmap, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP), c представителями монголоидной расы были выявлены значимые различия. С другой стороны, для этнической группы башкир различия в распределении частот генотипов и аллелей оказались статистически значимыми как с популяциями европеоидов и негроидов, так и с монголоидными популяциями (Hapmap, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).
2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием хронической обструктивной болезни легких Результаты выявленных статистически значимых ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов с учетом таких факторов, как этническая принадлежность, возраст, статус и индекс курения, вводимых в уравнение регрессии в качестве независимых переменных резюмированы в табл. 5.
Определена ассоциация гетерозиготного генотипа локуса NQO1 (465CT) (23.27% против 10.58% в контроле, P adj=0.000001, Pcor=0.000002, OR=2.53) и гаплотипа C-T гена NQO1 по локусам 609CT и 465CT (Padj=0.00014 в целом, OR=2.77 95%CI 1.75-4.40) с развитием ХОБЛ. НАД(Ф)Н-хинон оксидоредуктаза, кодируемая геном NQO1, предотвращает образование свободных радикалов семихинона и активных форм кислорода (АФК), а также активирует нитрозамины и гетероциклические амины. Замена 465CT приводит к изменению активности фермента (Park et al., 2011). Гомозиготный по частому аллелю генотип 6A6A локуса MMP3 (-1171 5А6А) является маркером риска заболевания (P adj=0.0047, OR=2.42), в то время как гетерозиготный генотип маркирует устойчивость (OR=0.41). Гомозиготы по редкому аллелю 5A5A в нашей выборке выявлены не были. MMP3 является одним из ключевых ферментов семейства MMP, так как активирует и индуцирует синтез других ММР, таких как ММР1 и ММР9, он также взаимодействует с цитокинами, факторами роста, разлагает протеогликаны, ламинины и коллаген IV типа, образующие внеклеточный матрикс легочной ткани (Santus et al., 2009). Полиморфный вариант MMP3 (-1171 5А6А) представляет инсерционно-делеционный полиморфизм, который изменяет сайт связывания транскрипционного фактора NFB, что влияет на экспрессию ММР3 (Juran et al., 2011). Ассоциация с частым генотипом может объясняться возможным сцеплением с другим функциональным локусом гена MMP3. Частота делеции гена CYP2A6 в группе больных была снижена (6.14% против 17.14% в контроле;
Padj=0.00001, OR=0.27), маркером развития ХОБЛ является частый генотип без делеции (OR=3.16). Главной функцией фермента CYP2A6 является катализ процесса окисления никотина - основного соединения, который вызывает и поддерживает табачную зависимость. Изученная нами протяжнная делеция гена блокирует процесс экспрессии гена, что продлевает период полураспада никотина от двух до одиннадцати часов (Nelson, 2009). Вероятно, у носителей делеционного аллеля в гомозиготном состоянии удлиняется время метаболизма никотина, и это объясняет протективную роль данного генетического маркера в отношении развития целого комплекса заболеваний, напрямую связанных с курением, таких как ХОБЛ, рак легкого и т.д. (Gyamfi et al., 2005). Генотип GG локуса CYP2S (13255AG) является маркером устойчивости к развитию ХОБЛ (Padj=0.0006, Pcor=0.0012, OR=0.26).
Таблица Ассоциация полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ с ХОБЛ в целом с ХОБЛ в группе русских с ХОБЛ в группе татар (N=827) (N=406) (N=421) Локус Генотип риска Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) NQO1 (465CT) CT 0.000001 2.53 (1.72-3.86) 0.00001 3.74 (1.99-7.02) 0.021 1.88 (1.09-3.25) 0.00001 3.16 (1.89-5.33) 0.0035 2.55(1.30-4.98) 0.00001 5.48 (2.59-11.60) CYP2A6 (del) n 0.0006 0.26 (0.11-0.59) 0.013 0.28 (0.10-0.80) 0.0064 0.23 (0.07-0.74) CYP2S1 (13255AG) GG MMP3 (-1171 5А6А) 0.0047 2.42 (1.42-4.13) 0.0069 2.86 (1.45-5.37) 0.023 2.37 (1.09-5.12) 6A6A 0.0022 1.72 (1.21-2.44) 0.021 1.62 (1.07-2.45) 0.012 1.84 (1.14-2.97) EPHX1 (337TC) TC СT 0.016 0.40 (0.19-0.87) 0.033 0.39 (0.16-0.95) 0.041 0.39 (0.15-1.01) CAT (-262CT) CAT (-262CT) TT 0.011 1.61 (1.12-2.33) - - - 0.0053 1.51 (1.13 - 1.99) - - 0.018 1.69 (1.08-2.46) GSTP1 (313AG) AA GSTP1( 313AG) AG 0.0043 0.65 (0.49-0.88) 0.04 0.65 (0.42-0.98) 0.043 0.65 (0.43-0.99) CYP1A1 (3798TC) TC 0.028 0.63 (0.42-0.96) 0.0083 0.41 (0.21-0.81) - IL6 (-174GC) GG 0.0042 1.38 (1.12-1.84) - - 0.018 1.41 (1.12-2.11) 0.032 0.58 (0.35-0.96) 0.0012 0.29 (0.13-0.64) IL6 (-174GC) CC 0.0062 1.47 (1.12-1.95) - - 0.042 0.62 (0.39-0.98) CYP1A2 (-163AC) AA 0.018 1.49 (1.07-2.09) - - 0.032 1.62 (1.11-2.48) ADAM33 (12418AG) AA аддитивная 0.021 1.81 (1.08-3.02) - - 0.03 2.00 (1.05-3.80) SOD3 (691CG) CC(0) CG(1) GG (2) CYP1A2 (-2467delT) - - - - 0.014 2.42 (1.03-5.72) del/del аддитивная 0.015 1.33 (1.06-1.68) - - 0.061 VDBP (1307CA) CC(0) CA(1) AA (2) Примечание: Здесь и далее в таблицах и тексте: Padj - значимость для теста отношения правдоподобия лог-регрессионной модели с учетом возраста, этнической принадлежности, статуса и индекса курения. ORadj - отношение шансов с учетом всех факторов. *аддитивная модель на дозу редкого аллеля - увеличение дозы редкого аллеля в ряду: гомозигота по частому аллелю (0) - гетерозигота (1) - гомозигота по редкому аллелю (2). N - количество индивидов (больные - контроль), включенных в анализ ассоциации.
Выявлено значимое увеличение доли гетерозигот по локусу EPHX1 (337TC) (45.01% против 35.7%, в контроле;
Padj=0.0022, Pcor=0.0044, OR=1.72) и частоты гаплотипа C-A гена EPHX1 по локусам 337TC и 415AG среди больных ХОБЛ (Padj=0.00056 в целом, OR=2.16 95%CI 1.48-3.14). Показана ассоциация гомозиготного по редкому аллелю генотипа TT полиморфного локуса CAT (-262CT) (Padj=0.011, Pcor=0.022, OR=1.61) и гаплотипа C-T гена CAT по локусам -262CT и 1167CT (P=0.032 в целом, OR=1.43 95%CI 1.08 - 1.90) с ХОБЛ. Гомозиготный по частому аллелю генотип AA локуса GSTP1 (313AG) связан с развитием заболевания (Padj=0.0053, Pcor=0.0106, OR=1.51), тогда как гетерозиготный генотип маркирует устойчивость к формированию ХОБЛ (Padj=0.0043, Pcor=0.009, OR=0.62 95%CI 0.44-0.89). Частота генотипа AA полиморфного локуса CYP1A2 (-163AC) в группе больных значимо выше, чем в контроле (50.9% против 41.3%, P=0.0062, OR=1.47), гетерозиготный генотип локуса CYP1A2 (-163AC) Pcor=0.0124, является маркером устойчивости к развитию ХОБЛ (P=0.0044, P cor=0.0088, OR=0.67 95%CI 0.51-0.88). Гомозиготы по редкому аллелю GG локуса SOD (691CG) были выявлены только в группе больных с частотой 4.21% (P adj=0.0008, Pcor=0.0016);
статистически значимая ассоциация локуса SOD3 (691CG) показана в аддитивной модели (Padj=0.021, OR=1.81). Выявлено повышение доли гетерозигот по локусу ADAM33 (12418AG) среди здоровых индивидов (29.76% против 21.99% в группе больных, Padj=0.022, Pcor=0.044, OR=0.61 95%CI 0.40-0.93);
риск развития ХОБЛ возрастает у гомозигот по частому аллелю AA (P=0.018, Pcor=0.036, OR=1.49), а гаплотип G-G гена ADAM33 по локусам 13491 CG и 12418 AG маркирует устойчивость к развитию ХОБЛ (Padj=0.0071 в целом, OR=0.40 95%CI 0.23-0.68). Значимые ассоциации с ХОБЛ были выявлены для локуса VDBP (1307CA) в аддитивной модели (P=0.015, OR=1.33) и гаплотипа C-T (GC*F) гена VDBP по локусам 1307CA и 1296TG (P=0.00036 в целом, OR=0. 95%CI 0.56 - 0.89). Маркером риска развития ХОБЛ является гомозиготный по частому аллелю генотип GG локуса IL6 (-174GC) (Padj=0.0042, Pcor=0.0084, OR=1.38).
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с ХОБЛ с учетом этнической принадлежности Тесты Кохрана-Мантеля-Хензеля и Бреслоу-Дэя, а также тест на гомогенность отношения шансов в стратифицированных по этнической принадлежности выборках (русских и татар) показали гетерогенность выявленных ассоциаций по некоторым локусам. Анализ ассоциации в дифференцированных по этнической принадлежности группах проводился с учетом статуса и индекса курения, возраста и пола обследованных. В табл. 5 представлены полученные данные. Определены ключевые генетические маркеры, ассоциации с которыми были подтверждены как в этнической группе русских, так и татар NQO1 (465CT), MMP3 (-1171 5А6А), CYP2A6 (del), CYP2S1 (13255AG), EPHX1 (337TC), CAT ( 262CT), GSTP1 (313AG). Необходимо отметить, что для локусов NQO (465CT) и MMP3 (-1171 5А6А) уровень значимости был ниже в этнической группе русских, тогда как для татар более информативными были локусы CYP2A (del) и CYP2S1 (13255AG). Ассоциация локусов CYP1A1 (3798TC) и LTA (252AG) с развитием ХОБЛ выявлена только в этнической группе русских. В выборке татар ассоциация с развитием заболевания показана для локусов SOD (691CG), IL6 (-174GC), ADAM33 (12418AG), CYP1A2 (-163CA), CYP1A2 ( 2467delT) и гаплотипа C-T гена VDBP по локусам 1307CA и 1296TG (P=0.017 в целом, OR=0.67 95%CI (0.49 - 0.92).
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с ХОБЛ с учетом пола обследованных Большая часть больных ХОБЛ в нашем исследовании представлена мужчинами (80%), однако выявление специфических генетических маркеров заболевания, связанных с полом, является важным этапом молекулярно генетического анализа наследственной предрасположенности к заболеванию.
Известно, что ХОБЛ, при прочих равных условиях, более тяжело протекает у женщин (Чучалин, 2009), что указывает на генетическую модификацию предрасположенности к заболеванию у мужчин и женщин. Анализ ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с ХОБЛ в дифференцированных по полу выборках проводился с учетом возраста, этнической принадлежности, статуса и индекса курения. Результаты представлены в табл. 6. Выявлены генетические маркеры, показавшие ассоциацию с ХОБЛ как в выборке мужчин, так и в выборке женщин - это полиморфные варианты локусов NQO1 (465CT), MMP3 (- 5А6А), CYP2A6 (del), CYP2S1 (13255AG), EPHX1 (337TC), CYP1A2 (-163CA).
С развитием ХОБЛ у мужчин ассоциируют полиморфные варианты локусов GSTP1 (313AG), VDBP (1307CA), ADAM33 (12418AG), CAT (-262C), CAT (1167CT). Ассоциации с заболеванием у женщин установлены для локусов IL (-174GC), CYP1A1 (3798TC), SERPINA3 (25GA). Для исключения возможного влияния на выявленные ассоциации этнической гетерогенности нами был проведен анализ ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ у мужчин и женщин в стратифицированных по этнической принадлежности группах. Соотношение русских и татар среди мужчин ( (49.01%) : 336 (50.99%)), среди женщин (83 (49.40%) : 85 (50.60%)). Ассоциация локуса NQO1 (465CT) с низким уровнем значимости (P=0.0007) как у мужчин, так и у женщин, выявлена только у русских. Локус CYP2A6 (del) ассоциировал с ХОБЛ у мужчин обеих этнических групп и у женщин татарской этнической принадлежности.
Таблица Ассоциация полиморфных вариантов локусов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ у мужчин и женщин с ХОБЛ в группе мужчин с ХОБЛ в группе женщин Локус Генотип риска (N=659) (N=168) Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) 0.0004 2.19 (1.41-3.41) 0.0005 5.01 (1.79-14.02) NQO1( 465CT) CT CYP2A6 ( del) n 0.0001 3.57 (2.03-6.26) 0.0004 4.36 (1.63-11.46) CYP2S1 (13255AG) GG 0.0001 0.22 (0.09-0.51) 0.011 0.17 (0.03-0.80) MMP3 (-1171 5А6А) 6A6A 0.041 1.87 (1.01-3.45) 0.0029 5.17 (1.64-16.3) 0.022 1.61 (1.07-2.43) 0.022 2.09 (1.10-3.95) EPHX1 (337TC) TC CYP1A2 (-163AC) AC 0.03 0.71 (0.52-0.97) 0.026 1.85 (1.05-3.25) CAT (-262CT) CT 0.0005 2.15 (1.39-3.33) - GSTP1(313AG) AA 0.0014 1.72 (1.26-2.40) - 0.0004 0.47 (0.30-0.72) - GSTP1 (313AG) AG аддитивная 0.018 1.39 (1.06-1.83) - CAT (1167CT) CC(0) CT(1) TT(2) аддитивная 0.012 1.39 (1.07-1.79) - VDBP (1307CA) CC(0) CA (1)AA (2) ADAM33 (12418AG) AA 0.016 1.57 (1.08-2.28) - CYP1A1 (3798TC) TT - - 0.0053 2.82 (1.29-6.18) CYP1A1 (3798TC) TC - - 0.0045 0.31 (0.14-0.72) аддитивная - - 0.016 0.58 (0.37-0.91) SERPINA3 (25GA) GG(0)AG(1)AA(2) - - 0.0091 2.05 (1.12-3.87) IL6 (-174GC) GG Примечание: Padj - значимость для теста отношения правдоподобия лог-регрессионной модели с учетом возраста, этнической принадлежности, статуса и индекса курения. ORadj отношение шансов с учетом всех факторов. N - количество индивидов (больные контроль), включенных в анализ ассоциации.
Локус MMP3 (-1171 5А6А) ассоциировал с ХОБЛ у женщин, как русских, так и татар, у мужчин значимых ассоциаций в дифференцированных по этнической принадлежности группах выявлено не было. Ассоциации с полиморфными вариантами гена GSTP1 (313AG) были выявлены у мужчин русских и татар.
Локус CYP2S1 (13255AG) ассоциировал с развитием ХОБЛ у мужчин в этнической группе татар. Полиморфный вариант локуса CYP1A1 (3798TC) ассоциировал с развитием ХОБЛ у русских женщин. Локус CAT (-262CT) подтвердили свою значимость в только группе мужчин татар. Локус IL6 ( 174GC) значимо ассоциировал с ХОБЛ только в группе женщин татар. Таким образом, особенности ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ у мужчин и женщин, дифференцированных по этнической принадлежности, в целом отражает тот спектр генетических маркеров, который был определен отдельно в группах, подразделенных по этнической принадлежности и полу. Выявленные гендерные различия могут быть связаны с особенностями гормональной регуляции и спецификой воспалительных реакций у мужчин и женщин. Так, только у женщин риск развития ХОБЛ связан с двумя генами цитохромов P450 (CYP1A2 и CYP1A1), кодирующими ферменты метаболизма ксенобиотиков, а также эндогенной активации и деградации половых гормонов (Nelson, 2009) и геном IL6 (-174GC), кодирующим ключевой цитокин острой фазы воспаления, оказывающего влияние на транскрипционный уровень С реактивного белка (СРБ). Известно, что СРБ, в свою очередь, ассоциирует со снижением функций легких у здоровых лиц и у некурящих больных ХОБЛ (Shaaban et al., 2006;
He et al., 2009). Для мужчин специфичной является ассоциация с генами, кодирующими ферменты антиоксидантной защиты (GSTP1, CAT, SOD3). Свободнорадикальное окисление играет первостепенную роль в патогенезе ХОБЛ. Большая часть мужчин с ХОБЛ являлись курильщиками с длительным стажем курения, поэтому, возможно, полученные ассоциации связаны с проявлением эффекта генов в сочетании с фактором курения.
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с ХОБЛ с учетом курения, выявление ген-средовых взаимодействий Комплексная оценка влияния генетических и средовых факторов на риск возникновения хронических заболеваний органов дыхания позволяет не только установить ключевые ген-средовые взаимодействия, формирующие основу предрасположенности к болезни, но и понять механизмы, посредством которых факторы внешней среды способны спровоцировать патологические изменения (Hunter, 2005;
Полоников, 2006). Наибольший интерес для нашего исследования представляли факторы, влияние которых на организм непосредственно связано с поражением дыхательной системы. Это, прежде всего, статус и индекс курения, а также стаж работы во вредных производствах, характеризующий интенсивность воздействия пылевых и токсических веществ на органы дыхания. Нами были изучены ген-средовые взаимодействия статуса и индекса курения с полиморфными вариантами генов-кандидатов при формировании ХОБЛ.
Статистически значимые взаимодействия со статусом курения определены для локусов ADAM33 (12418AG) (Pinteract=0.026), TIMP3 (-1296TC) (Pinteract=0.044), VDBP (1296TG) (Pinteract=0.05104), CYP1A1 (2454AG) (Pinteract=0.047), CYP2F (c.14_15insC) (Pinteract=0.049), GPX1 599CT (Pinteract=0.041). Взаимодействия с индексом курения установлены для локуса SOD3 (691CG) (Pinteract=0.05402).
Анализ взаимодействий генотип-среда проводился также путем сопоставления величин отношения шансов, рассчитанных для полиморфных вариантов генов кандидатов, в группах больных и контроля, сформированных по критерию наличия или отсутствия влияния средового фактора - курильщиков и некурящих.
Результаты анализа представлены в табл. 7.
Таблица Ассоциация полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ в группах, дифференцированных по статусу курения с ХОБЛ в группе с ХОБЛ в группе некурящих Локус генотип риска курильщиков (N=560) (N=267) Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) NQO1(465CT) CT 0.00001 2.71 (1.62-4.53) 0.0081 2.60 (1.26-5.38) CYP2A6 (del) n 0.0001 2.82 (1.55-5.13) 0.00001 6.24 (3.01-10.75) CYP2S11(3255AG) GG 0.0001 0.14 (0.05-0.44) 0.018 0.34 (0.11-0.99) EPHX1 (337TC) TC 0.02 1.51 (1.06-2.14) 0.052 CAT (-262CT) TT 0.0057 0.33 (0.14-0.76) - CAT (-262CT) CT 0.015 1.57 (1.09-2.25) - GSTP1 (313AG) AA 0.0039 1.66 (1.17-2.35) - GSTP1 (313AG) AG 0.0085 0.62 (0.43-0.89) - аддитивная VDBP (1307CA) 0.02 1.39 (1.05-1.82) - CC(0) CA(1) AA(2) ILRN (VNTR) 2/2 0.028 1.94 (1.06-3.56) - MMP3 (-1171 5А6А) 6A6A - - 0.0023 3.97 (1.53-10.2) IL6 (-174GC) GG - - 0.042 1.74 (1.12-2.52) CYP1A2 (-163AC) AA - - 0.0098 1.90 (1.16-3.11) CYP1A2 (-163AC) AC - - 0.013 0.56 (0.34-0.94) ADAM33 (12418AG) AA - - 0.0023 2.41 (1.34-4.32) ADAM33 (12418AG) AG - - 0.0021 0.37 (0.19-0.71) TIMP3 (-1296TC) TT - - 0.011 1.59 (1.10-2.53) CYP1A1 (3798TC) TT - - 0.033 1.83 (1.04-3.22) CYP1A1 (3798TC) TC - - 0.018 0.50 (0.28-0.90) Примечание: Padj значимость для теста отношения правдоподобия лог-регрессионной модели с учетом возраста, пола и этнической принадлежности. ORadj - отношение шансов с учетом всех факторов. N - количество индивидов (больные - контроль), включенных в анализ ассоциации.
Только три локуса ассоциировали с развитием ХОБЛ как у курильщиков, так и у некурящих индивидов - NQO1 (465CT), CYP2A6 (del), CYP2S (13255AG). Выявлены специфические генетические маркеры развития ХОБЛ в группах, дифференцированных по статусу курения. У курильщиков - это локусы EPHX1 (337TC), CAT (-262CT), GSTP1 (313AG), VDBP (1307CA), IL1RN (VNTR). У некурящих спектр выявленных ассоциаций представлен локусами MMP3 (-1171 5А6А), IL6 (-174GC), CYP1A2 (-163CA), ADAM33 (12418AG), TIMP3 (-1296TC), CYP1A1 (3798TC). Для курильщиков формирование хронической обструктивной болезни легких детерминировано, прежде всего, генами биотрансформации ксенобиотиков и антиоксидантой защиты;
для некурящих - генами медиаторов воспаления и системы протеолиза антипротеолиза. Таким образом, проявление эффектов полиморфных вариантов отдельных генов при развитии ХОБЛ существенно зависит от характера и интенсивности влияния факторов среды.
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с возрастом манифестации ХОБЛ Для выявления ассоциации полиморфных вариантов изученных генов с возрастом манифестации сравнивали две группы больных ХОБЛ, с ранней и поздней манифестацией заболевания, как между собой, так и отдельно каждую группу - с контрольной. Группы больных не различались по соотношению мужчин и женщин, по статусу и индексу курения, по тяжести заболевания. В группе ХОБЛ с ранней манифестацией частота генотипа СС локуса UGT2B7 (2146CT) была значимо выше, чем в группе с поздней манифестацией (44.10% против 30.40%, P=0.0005, OR=2.83 95%CI 1.73-4.61). Среди больных с манифестацией заболевания после 40 лет частота гомозиготного генотипа по редкому аллелю AA локуса NAT (590GA) составляет 11.21% против 3.37% у больных с ранней манифестацией ХОБЛ (P=0.018, OR=0.27 95%CI 0.06-0.99), а доля гетерозигот по локусу CYP1A (2454AG) достигала 10% против 2.90% (P=0.0097, OR=0.27 95%CI 0.06-0.96).
Сравнительный анализ с контролем показал, что для больных с ранней манифестацией значимые ассоциации были получены с полиморфными вариантами генов NQO1 (465CT) генотип CT (P=0.0018, OR=3.31 95%CI 1.47 7.44), CYP2A6 (del) генотип без делеции (P=0.001, OR=3.06 95%CI 1.77-5.30), EPHX1 (337TC) в аддитивной модели (P=0.0018, OR=1.84 95%CI 1.26-2.68), SOD3 (691CG) в аддитивной модели (P=0.015, OR=2.06 95%CI 1.17-3.62), VDBP (1307CA) генотип CA (P=0.0062, OR=1.85 95%CI 1.19-2.88), IL1RN (VNTR) генотип 2/4 (P=0.0024, OR=0.48 95%CI 0.29-0.78). Выявленные ассоциации полиморфных локусов изученных генов-кандидатов с возрастом манифестации ХОБЛ свидетельствуют о том, что данные генетические маркеры могут выступать в качестве модификаторов начала проявления первых симптомов ХОБЛ.
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с тяжестью ХОБЛ С целью выявления генетических маркеров, ассоциированных с тяжестью заболевания, сравнивали больных с тяжелым течением ХОБЛ и больных со средне тяжелым течением заболевания. В нашем исследовании у 75.7% больных диагностировано тяжелое течение. Различий между группами больных по среднему возрасту, возрасту манифестации заболевания, соотношению мужчин и женщин, статусу и индексу курения выявлено не было. Ассоциация с тяжелым течением ХОБЛ получена для генотипа AA локуса LTA (252AG) (Padj=0.037, OR=1.63 95%CI 1.12-2.34). Гетерозиготный генотип локуса LTA (252AG) чаще встречался в группе больных со средней тяжестью ХОБЛ (Padj=0.0073, OR=0. 95%CI 0.33-0.84). Маркерами тяжелого течения ХОБЛ являются генотип GG локуса IL6 (-174GC) (Padj=0.015, OR=1.82 95%CI 1.11-2.96) и генотип СС локуса CYP2E1 (-1053CT) (Padj=0.015, OR=2.90 95%CI 1.20-6.97). Ассоциация с тяжелой ХОБЛ была выявлена для локуса MMP9 (-1562CT) (P=0.023 OR=1.88 в аддитивной модели), так как частота гомозигот по редкому аллелю (2% против 0%) и гетерозигот (23.6% против 15.8%) выше у больных с более тяжелым течением ХОБЛ. Таким образом, в результате анализа ассоциации всех изученных локусов генов-кандидатов выявлены генетические маркеры, которые связаны с более тяжелым течением ХОБЛ. Два локуса (IL6 и LTA) кодируют цитокины, играющие ключевую роль в патогенезе ХОБЛ и развитии хронического воспаления (Fishman et al., 1998). MMP9 участвует в процессах ремоделирования и деградации легочной ткани при ХОБЛ. Аллель T локуса -1562CT гена MMP9, с которым выявлена ассоциация, снижает способность промотора связываться с репрессором транскрипции, таким образом, повышая экспрессию гена, что может играть важную роль в быстром развитии тяжелых осложнений заболевания.
Генетические маркеры развития эмфиземы легких при ХОБЛ Согласно современным представлениям эмфизема легких (ЭЛ) является обязательным компонентом ХОБЛ. Однако степень выраженности эмфиземы различается у разных больных. Сравнительный анализ групп больных ХОБЛ с ЭЛ и без ЭЛ по таким показателям, как возраст больного, возраст манифестации ХОБЛ, пол, статус и индекс курения выявил достоверные различия между группами. Так, среди больных с ЭЛ было больше мужчин (P=0.0001) и курильщиков (P=0.0001). Индекс курения в этой группе был выше (P=0.0001).
Средний возраст манифестации ХОБЛ у больных с ЭЛ также был больше (P=0.024). В связи с этим анализ ассоциации проводился с учетом статуса и интенсивности курения, возраста манифестации ХОБЛ и гендерных различий больных. Ассоциация с развитием ЭЛ была выявлена для полиморфных вариантов локусов UGT2B7 (2146CT) (Padj=0.0072, OR=1.50 95%CI 1.11-2.04 в аддитивной модели), ADAM33 (13491 CG) (Padj=0.013, OR=1.74 95%CI 1.43-2.79 для генотипа GG);
IL1RN (VNTR) (Padj=0.042, OR=1.59 95%CI 1.11-2.57 для гетерозиготного генотипа);
VDBP (1296TG) (Padj=0.013, OR=0.58 95%CI 0.38-0.89) для генотипа TG). Таким образом, формирование ЭЛ детерминировано комплексом внешних факторов (курением и его интенсивностью), возрастам манифестации, полом и генетической конституцией индивида.
3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием хронических бронхолегочных заболеваний у детей Результаты выявленных статистически значимых ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ХБЛЗ у детей с учетом этнической принадлежности и пола резюмированы в табл. 8. Ассоциация с развитием ХБЛЗ с наименьшим уровнем значимости выявлена для локуса CYP2F1 (c.14_15insC).
Маркером риска является гомозиготный по частому аллелю генотип без инсерции (Padj=0.000001, Pcor=0.000002, OR=3.16). Локусы CYP1A1 (2454AG) и CYP1A (3798TC) ассоциируют с ХБЛЗ в аддитивной модели (Padj=0.001, Pcor=0.002, OR=2.31 и Padj=0.0003, Pcor=0.0006, OR=1.72, соответственно), частоты гомозигот по редкому аллелю и гетерозигот по данным локусам в группе больных значимо выше;
гаплотипы A-С и G-C по локусам 2454AG и 3798TC гена CYP1A являются маркерами риска заболевания (Padj=0.00022 в целом, OR=1.62 95%CI 1.16-2.26 и OR=2.28 95%CI 1.23-4.21). Среди больных детей доля индивидов с делецией гена GSTT1 составляет 35% против 21.3% в группе здоровых (Padj=0.0003, OR=1.98). Ассоциация с развитием ХБЛЗ у детей выявлена c гомозиготным по частому аллелю генотипом AA локуса GSTP1 (313AG) (Padj=0.0046, Pcor=0.0092, OR=1.65), тогда как гетерозиготный генотип является маркером устойчивости (Padj=0.0012, Pcor=0.0024, OR=0.55). Локус NQO1 (465CT) ассоциирует с развитием ХБЛЗ в аддитивной модели (Padj=0.006, OR=1.89), доля гетерозигот и гомозигот по редкому аллелю T среди больных выше, чем в контроле. Гомозиготный по частому аллелю генотип СС локуса CAT (-262CT) чаще встречается среди больных детей (71.6% против 57.7% в контроле;
Padj=0.0009, Pcor=0.0018, OR=1.84), а гаплотип T-C по локусам -262CT и 1167CT гена CAT является маркером устойчивости к заболеванию (Padj=0.0054 в целом, OR=0.65 95%CI 0.46-0.91). Маркером риска развития ХБЛЗ является гомозиготный по частому аллелю генотип AA локуса MMP12 (-82AG) (Padj=0.007, OR=1.83). Ассоциация с ХБЛЗ получена с генотипом 6A6A локуса 5А6А) MMP3 (-1171 (Padj=0.0013, OR=2.75).
Таблица Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ХБЛЗ у детей c ХБЛЗ в целом (N=558) с ХБЛЗ у русских (N=188) с ХБЛЗ у татар (N=370) Локус генотип риска Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) CYP2F1 (c.14_15insC) n/n 0.000001 3.16 (2.10-4.77) 0.0039 2.71 (1.35-5.46) 0.000001 3.41 (2.04-5.67) CAT (-262CT) CC 0.0009 1.84 (1.22-2.65) 0.0063 2.41 (1.27-4.58) 0.031 1.61 (1.04-2.49) аддитивная GG(0) GC(1) CC(2) IL6 (-174GC) 0.0009 0.64 (0.49-0.84) 0.035 0.62 (0.40-0.97) 0.012 0.66 (0.47-0. IL6 (-174GC) GG 0.0051 1.67 (1.16-2.39) 0.019 2.06 (1.12-3.79) - GSTP1 (313AG) AA 0.0046 1.65 (1.17-2.34) 0.0001 3.47 (1.85-6.54) - GSTP1 (313AG) AG 0.0012 0.55 (0.38-0.79) 0.00001 0.25 (0.13-0.49) - MMP3 (-1171 5А6А) - 6A6A 0.0013 2.75 (1.43-5.31) 0.0015 5.98 (1.60-21.45) TIMP3 (-1296TC) TT 0.033 1.48(1.11-2.01) 0.02 2.05 (1.11-3.76) - SERPINA1 (1237GA) GA - - 0.018 3.28 (1.15-9.39) - GSTT1 (del) del 0.0003 1.98 (1.36-2.89) - - 0. 2.18 (1.36-3.48) - MMP9 (2660AG) AG 0.0004 0.52 (0.36-0.75) 0. 0.44 (0.28-0.69) MMP9 (2660AG) AA 0.017 1.54 (1.08-2.21) - - 0. 1.59 (1.02-2.47) аддитивная TT(0) TC(1) TT(2) CYP1A1 (3798TC) 0.0003 1.72 (1.28-2.33) - - 0. 1.92 (1.33-2.76) - аддитивная AA(0) AG(1) GG(2) CYP1A1 (2454AG) 0.001 2.31 (1.38-3.88) 0. 3.14 (1.62-6.09) аддитивная CC(0) CT(1) TT(2) - NQO1 (465CT) 0.006 1.89 (1.19-3.02) 0. 1.80 (1.03-3.16) MMP12 (-82AG) AA 0.007 1.83 (1.16-2.89) - - 0. 1.92 (1.07-3.46) VDBP (1296TG) GG 0.0096 0.56 (0.35-0.87) - - 0. 1.64 (1.08-2.50) ILRN (VNTR) 2/2 0.018 0.37 (0.16-0.89) - - 0. 0.22 (0.06-0.78) - - - VDBP (1307CA) CA 0. 1.77 (1.15-2.74) аддитивная - - - MMP1 (-1607 GGG) 0.0027 1.53 (1.16-2.03) GG/GG(0) GG/G(1) G/GC(2) Примечание: Padj - значимость для теста отношения правдоподобия лог-регрессионной модели с учетом пола и этнической принадлежности, ORadj отношение шансов с учетом всех факторов Риск развития заболевания связан с генотипом AA локуса MMP9 (2660AG) (Padj=0.017, Pcor=0.034, OR=1.54), тогда как гетерозиготный генотип является протективным в отношении развития ХБЛЗ (Padj=0.0004, Pcor=0.0008, OR=0.52).
Локус IL6 (-174GC) ассоциирует с ХБЛЗ в аддитивной модели (Padj=0.0009, OR=0.64), поскольку доля гомозигот по редкому аллелю СС и гетерозигот выше среди здоровых детей;
маркером риска ХБЛЗ у детей является гомозиготный по частому аллелю генотип GG (Padj=0.0051, Pcor=0.01, OR=1.67). Частота генотипа TT локуса TIMP3 (-1296TC) в группе больных детей была выше (63.42% против 54.44% в контроле;
Padj=0.033, Pcor=0.066, OR=1.48). Генотип 2/2 VNTR-локуса гена IL1RN и гомозиготный по редкому аллелю генотип GG локуса VDBP (1296TG) чаще встречаются среди здоровых детей (Padj=0.018, Pcor=0.036, OR=0.37 и Padj=0.0096, Pcor=0.0019, OR=0.56, соответственно).
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ХБЛЗ у детей с учетом этнической принадлежности Тесты Кохрана-Мантеля-Хензеля и Бреслоу-Дэя, а также тест на гомогенность отношения шансов в стратифицированных по этнической принадлежности выборках выявили гетерогенность ассоциации по некоторым локусам. Результаты анализа в дифференцированных по этнической принадлежности группах представлены в табл. 8. По трем локусам ассоциации подтверждены как в этнической группе русских, так и татар - CYP2F (c.14_15insC), CAT (-262CT), IL6 (-174GC). В этнической группе русских ассоциации были выявлены для локусов GSTP1 (313AG), MMP3 (-1171 5А6А), TIMP3 (-1296TC), SERPINA1 (1237GA).. В этнической группе татар ассоциация с ХБЛЗ у детей показана для локусов CYP1A1 (2454AG), CYP1A1 (3798TC), GSTT (del), NQO1 (465CT), MMP12 (-82AG), MMP9 (2660AG), IL1RN (VNTR), VDBP (1296TG), VDBP (1307CA), MMP1 (-1607GGG). У русских самые значимые ассоциации (P0.001) с развитием ХБЛЗ у детей получены с полиморфными вариантами локуса GSTP1 (313AG), а у татар с полиморфными вариантами генов CYP2F1 (c.14_15insC), CYP1A1 (2454AG), CYP1A1 (3798TC) и MMP9 (2660AG).
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с ХБЛЗ у детей с учетом пола обследованных Установлено, что как для мальчиков, так и для девочек ассоциация с развитием ХБЛЗ сохраняется для локусов CYP2F1 (c.14_15insC), CYP1A1 (2454AG), GSTP (313AG), MMP9 (2660AG), IL6 (-174GC) (табл. 9). Выявлены генетические маркеры, связанные с развитием заболевания у мальчиков – это локусы GSTT (del), NQO1 (465CT), MMP12 (-82AG), TIMP3(-1296TC), SOD3 (691CG). Для девочек ассоциации были выявлены с полиморфными вариантами локусов CYP1A1 (3798TC), CAT (-262CT), MMP3 (-1171 5А6А), IL1RN (VNTR), VDBP (1296TG), CYP2S1 (13106CT). Для исключения возможного влияния на выявленные ассоциации этнической гетерогенности нами был проведен анализ в группах мальчиков и девочек, стратифицированных по этнической принадлежности.
Таблица Ассоциация полиморфных вариантов локусов генов-кандидатов с развитием ХБЛЗ у детей в зависимости от пола обследованных с ХБЛЗ у мальчиков с ХБЛЗ у девочек (N=264) (N=294) Локус Генотип риска Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) CYP2F1 (c.14_15insC) n/n 0.00001 3.95 (2.16-7.23) 0.0006 2.59 (1.47-4.55) MMP9 (2660AG) AG 0.0086 0.49 (0.29-0.84) 0.014 0.54 (0.33-0.89) GSTP1 (313AG) AG 0.011 0.52 (0.31-0.87) 0.04 0.59 (0.36-0.99) аддитивная CYP1A1 (2454AG) 0.014 2.55 (1.17-5.57) 0.025 2.11 (1.06-4.19) AA(0) AG(1) GG(2) аддитивная IL6 (-174GC) 0.018 0.64 (0.43-0.93) 0.018 0.65 (0.45-0.93) GG(0) GC(1) CC(2) CYP1A1 (2454AG) AG 0.0028 3.42 (1.46-8.04) - GSTT1 (de) del 0.001 2.45 (1.43-4.21) - аддитивная NQO1 (465CT) 0.036 1.93 (1.02-3.64) - CC(0) CT(1) TT(2) MMP12 (-82AG) AA 0.04 1.96 (1.02-3.78) - аддитивная SOD3 (691CG) 0.007 2.63 (1.26-5.48) - CC(0) CG(1) GG(2) TIMP3 (-1296TC) TT 0.011 2.95 (1.56-3.31) - аддитивная CYP1A1 (3798TC) - - 0.002 1.93 (1.26-2.96) TT(0) TC(1) TT(2) CAT (-262CT) CC - - 0.0001 2.78 (1.67-4.62) GSTP1 (313AG) AA - - 0.019 1.79 (1.09-2.93) MMP3(-1171 5А6А) 6A6A - - 0.006 3.16 (1.31-7.62) VDBP (1296TG) TG - - 0.021 1.74 (1.09-2.80) VDBP (1296TG) GG - - 0.0012 0.33 (0.16-0.67) аддитивная CYP2S1 (13106CT) - - 0.0046 2.32 (1.27-4.24) CC(0) CT (1) TT (2) Ассоциации с полиморфными вариантами гена GSTP1 (313AG) были значимы только у русских как мальчиков, так и девочек. Делеция гена GSTT ассоциировала с развитием ХБЛЗ у мальчиков - татар по этнической принадлежности с уровнем значимости (P=0.0004). Ассоциации полиморфных локусов CYP1A1 (3798TC), CYP1A1 (2454AG), IL6 (-174GC), MMP9 (2660AG) также были значимы только у татар. Для локуса CYP2S1 (13106CT) ассоциация была подтверждена только у русских девочек (P=0.014). Локус CAT (-262CT) был связан с развитием ХБЛЗ у девочек обеих этнических групп, но уровень значимости (P=0.0001) был выше у русских. В результате проведнного анализа выявлен широкий спектр генетических маркеров развития ХБЛЗ у детей.
Учитывая, что в данной группе больных отсутствует направленное и длительное влияние фактора среды, можно предположить, что риск развития заболеваний органов дыхания у детей обусловлен, в первую очередь, генетической компонентой, представленной генами всех изученных систем. Наиболее значимой является ассоциация с полиморфным вариантом гена CYP2F1 (c.14_15insC). Ген CYP2F1 (c.14_15insC) экспрессируется только в легочной ткани, функция его, помимо метаболизма токсических соединений и эндогенных молекул (холестерола, стероидных гормонов), до сих пор не изучена (Tornell et al., 2007).
Важнейшими маркерами риска развития ХБЛЗ являются также полиморфные локусы генов, кодирующих протеолитические ферменты и ингибиторы протеолиза. В детском возрасте идет активный процесс роста и развития легких, а влияние средовых факторов связано, в основном, с частыми инфекциями и неспецифичным воздействием неблагоприятных экологических условий. Вполне вероятно, что у детей с определенной генетической конституцией существуют нарушения регуляции воспалительного ответа, что влияет на физиологические процессы роста легких, приводит к структурной перестройке бронхиального дерева и патологическому повреждению ткани легкого с последующим формированием эмфиземы и пневмосклероза.
4. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием профессионального хронического бронхита Анализ частот генотипов полиморфных локусов генов-кандидатов в группе здоровых высокостажированных рабочих выявил отклонения от равновесия Харди-Вайнберга, связанные с увеличением доли гомозигот по частому аллелю по локусам CAT (1167CT) (25.30% против 35.95%;
P=0.0003), MMP1 (-519AG) (19.88% против 26.83%;
P=0.002), CYP1A2 (-2467delT) (17.47% против 26.00%;
P=0.00015), ADAM33 (13491CG) (35.54% против 49.91%;
P=0.00019), MMP (2660AG) (23.49% против 29.23%;
P=0.015), TIMP3 (-1296TC) (34.34% против 45.99%;
P=0.0012). Это может быть обусловлено отбором против гетерозигот и гомозигот по редким аллелям. Возможно, в связи с постоянным, направленным, происходящим в течение длительного времени воздействием определенных факторов производственной среды, среди работающих происходит отбор против аллелей, ассоциированных с высоким риском заболевания. Сравнительный анализ этой группы с популяционным контролем выявил значимые различия, в основном за счет увеличения доли гомозигот по частым аллелям по локусам генов CYP1A2 ( 2467delT) (75.9% против 58% в контроле), CYP2E1 (-1053CT) (94.6% против 88.8%), CYP2S1 (13106CT) (94.6% против 81.2%), MMP1 (-1607 GGG) (63.2% против 38.7%), MMP9 (2660AG) (70.5% против 40.2%), VDBP (1296 TG) (63.9% против 33.7%). Группа высокостажированных здоровых рабочих представляет интерес в плане выявления генетических маркеров устойчивости к воздействию вредных факторов производственной среды.
Результаты статистически значимых ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ПХБ с учетом таких факторов, как этническая принадлежность, стаж работы во вредных производствах, статус и индекс курения представлены в табл. 10. В группе больных ПХБ выявлено одновременное увеличение доли редких гомозигот GG и гетерозигот полиморфного локуса VDBP 1296TG (16.4% против 7.2% и 43.4% против 28.9%, соответственно), поэтому наиболее информативной моделью, описывающей риск развития заболевания у рабочих, является аддитивная модель (Padj=0.00005, OR=2.06);
гаплотип С-G (GC*1S) по локусам 1307CA и 1296TG гена VDBP является маркером риска развития ПХБ (Padj=0.00066 в целом, OR=2.54 95%CI 1.60-4.04). Показана ассоциация гетерозиготного генотипа локуса MMP1 (519AG) (Padj=0.0001, Pcor=0.0002, OR=2.52) с развитием профессионального бронхита. Генотип CG локуса ADAM33 (13491CG) является маркером развития ПХБ у рабочих (Padj=0.0004, Pcor=0.0008, OR=2.52). Выявлена ассоциация гомозиготного по частому аллелю генотипа СС локуса NQO1 (465CT) (Padj=0.001, Pcor=0.002, OR=4.11) и гаплотипа С-T по локусам 609CT и 465CT гена NQO1 (Padj=0. в целом, OR=0.31 95%CI 0.12 - 0.80) с ПХБ. Полиморфный вариант СС локуса UGT2B7 (2146CT) был связан с развитием заболевания у рабочих (Padj=0.0021, Pcor=0.0042, OR=2.34). Доля гетерозигот по локусу CYP1A2 (-2467delT) среди больных ПХБ была выше (30.33% против 17.47% в контроле;
P adj=0.008, Pcor=0.016, OR=2.17). Гетерозиготный генотип локуса CYP2F1 (c.14_15insC) чаще выявляется у здоровых рабочих (Padj=0.0048, Pcor=0.01, OR=0.44). Маркерами устойчивости к развитию заболевания также являются гетерозиготный генотип локуса GSTP1 (313AG) (Padj=0.0086, Pcor=0.017, OR=0.50) и гаплотип С-T гена CAT по локусам -262CT и 1167CT (Padj=0.0074 в целом, OR=0.54 95%CI 0.33 0.88).
Таблица Ассоциация полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ПХБ c ПХБ в целом c ПХБ у руcских c ПХБ у татар (N=288) (N=129) (N=151) Локус модель Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) MMP1 (-519 AG) AG 0.0001 2.52 (1.36-4.69) 0.040 2.28 (1.04-5.00) 0.0092 2.62 (1.25-5.51) NQO1 (465CT) CC 0.001 4.11 (1.91-8.85) 0.0064 4.60 (1.10-16.63) 0.0037 3.81 (1.44-10.11) CYP1A2 (-2467delT) de l/ n 0.008 2.17 (1.20-3.91) - - - CAT (1167CT) TT 0.015 0.27 (0.09-0.83) - - - MMP9 (2660AG) AG 0.015 0.27 (0.09-0.83) - - - - GSTP1 (313AG) AG 0.0086 0.50 (0.29-0.84) 0.0053 0.32 (0.14-0.74) - CYP2F1 (c.14_15insC) w / ins 0.0048 0.44 (0.24-0.79) 0.0007 0.20 (0.07-0.57) - - - CYP2F1 (c.14_15insC) w /w 0.0011 4.07 (1.63-10.16) ADAM33 (13491CG) CG 0.0004 2.52 (1.40-4.52) 0.023 2.34 (1.12-4.90) - аддитивная - - - TIMP3 (-1296TC) 0.01 1.83 (1.15-2.93) TT (0) TC (1) CC (2) аддитивная - - - IL8 (-251TA) 0.014 1.51 (1.02-2.23) TT (0) TA (1) AA (2) - IL8 (-251TA) AA 0.016 2.70 (1.18-6.19) аддитивная - VDBP (1296TG) 0.00005 2.06 (1.36-3.13) 0.0001 3.22 (1.86-5.59) TT (0) TG (1) GG (2) UGT2B7 (2146CT) CC 0.0021 2.33 (1.35-4.04) - - 0.016 2.44 (1.16-5.16) Примечание: Здесь и далее в тексте: Padj - значимость для теста отношения правдоподобия лог-регрессионной модели с учетом этнической принадлежности, стажа работы, статуса и индекса курения. ORadj - отношение шансов с учетом всех факторов. N - количество индивидов (больные - контроль), включенных в анализ ассоциации.
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ПХБ с учетом этнической принадлежности Тесты Кохрана-Мантеля-Хензеля, Бреслоу-Дэя, тест на гомогенность отношения шансов в стратифицированных выборках показали, что показатели отношения шансов не отличаются в выборках русских и татар для локусов UGT2B7 (2146CT), MMP1 (-519AG) и NQO1 (465CT). Наряду с этим для локуса VDBP (1296TG) показаны значимые различия по ассоциации в группе русских и татар (PBD=0.04602). Дальнейший анализ в дифференцированных по этнической принадлежности группах (см. табл. 10) подтвердил ассоциацию с развитием ПХБ следующих локусов в этнических группах русских и татар: NQO (465CT) и MMP1 (-519AG). Только в группе русских значимые ассоциации показаны для локусов GSTP1 (313AG), гаплотипа С-T гена CAT по локусам 262CT и 1167CT (P=0.048 в целом, OR=0.49 95%CI 0.26 0.94), ADAM (13491CG), CYP2F1 (c.14_15insC), TIMP3 (-1296TC). В этнической группе татар самые значимые ассоциации выявлены с локусом VDBP (1296TG) и гаплотипом С-G (GC*1S) по локусам 1307CA и 1296TG гена VDBP (P=0.00001 в целом, OR=4.86 95% CI 2.46-9.62). Маркерами риска развития ПХБ в данной этнической группе также являются полиморфные варианты локусов IL8 (-251TA), UGT2B (2146CT).
Анализ ассоциации генов-кандидатов с развитием ПХБ с учетом курения и стажа работы, выявление ген-средовых взаимодействий Нами изучены взаимодействия статуса и индекса курения с полиморфными вариантами генов-кандидатов при развитии ПХБ. Статистически значимые взаимодействия со статусом курения определены для локусов UGT2B7 (2146CT) (Pinteract=0.015), EPHX1 (415AG) (Pinteract=0.04), GPX1 (599CT) (Pinteract=0.037);
с индексом курения для локуса CYP2F1 (c.14_15insC) (Pinteract=0.05). Анализ взаимодействий генотип-среда проводился также путем сопоставления величин отношения шансов, рассчитанных для полиморфных локусов генов-кандидатов в группах, сформированных по критерию наличия или отсутствия влияния средового фактора - у курильщиков и некурящих. Результаты анализа представлены в табл. 11. Ассоциация с развитием ПХБ как в группе курильщиков, так и некурящих выявлена для локусов VDBP (1296TG), MMP1 (-519AG), ADAM33 (13491CG), GSTP1 (313AG), UGT2B7 (2146CT). Только у курильщиков ассоциация показана с полиморфными вариантами локусов CYP1A (-2467delT), CYP2F1 (c.14_15insC). Для некурящих ассоциации с развитием заболевания были выявлены с полиморфными вариантами генов MMP (2660AG), NQO1 (465CT), TIMP3 (-1296TC). Среди внешнесредовых факторов, оказывающих влияние на формирование профессиональной патологии, большое значение имеет стаж работы во вредных производствах. Стаж работы является своего рода показателем длительности воздействия определенного фактора на организм работающего и несомненно, играет важную роль в формирование ПХБ. Нами была проведена оценка влияние этого фактора на полученные ассоциации с генетическими локусами, а также выявлены ген средовые взаимодействия. Статистически значимые взаимодействия со стажем работы показаны для локусов IL1RN (VNTR) (Pinteraction=0.02656), VDBP (1307CA) (Pinteraction=0.02258) и CYP1A1 (3798TC) (Pinteraction=0.01657).
Таблица Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ПХБ в группах, дифференцированных по статусу курения с ПХБ у курильщиков с ПХБ у некурящих (N=141) (N=147) Локус модель Padj ORadj (CI95%) Padj ORadj (CI95%) аддитивная VDBP (1296TG) 0.028 1.88 (1.07-3.31) 0.0013 2.23 (1.33-3.73) TT (0) TG (1) GG (2) MMP1 (-519 AG) AG 0.025 2.54 (1.13-5.70) 0.017 2.53 (1.15-5.57) ADAM CG 0.014 2.62 (1.20-5.71) 0.026 2.22 (1.09-4.52) (13491CG) GSTP1 313AG AG 0.049 0.45 (0.20-1.02) 0.05 0.51 (0.26-1.00) аддитивная UGT2B7 (2146CT) - 0.03 0.53 (0.29-0.95) CC (0) CT (1) TT (2) - UGT2B7 (2146CT) CC 0.0029 3.62 (1.42-9.02) CYP1A2 (-2467delT) Del / n 0.031 2.64 (1.11-6.30) - CYP2F1 - w / ins 0.035 0.41 (0.17-0.98) (c.14_15insC) - MMP9 (2660AG) AG 0.0067 3.27 (1.31-8.17) СС TIMP3 (-1296TC) - - 0.041 2.29 (1.01-5.20) NQO1( 465CT) CC - - 0.0002 7.04 (2.22-22.33) Полученные данные показывают, что при реализации ПХБ большую роль играют такие внешнесредовые факторы, как стаж работы, уровень ПДК, тип воздействия (пыль или токсическое вещество). Профессиональный бронхит при воздействии промышленных аэрозолей возникает преимущественно у лиц с определенной генетической конституцией и является следствием взаимодействия генетических и средовых факторов. Вклад генетической компоненты в развитие профессионального заболевания, в отличие от ХОБЛ и ХБЛЗ у детей, ограничен небольшим количеством полиморфных маркеров. Наиболее значимые ассоциации получены нами с полиморфными вариантами гена VDBP. Показано существование отбора против гетерозигот и гомозигот по редким аллелям в группе здоровых высокостажированных рабочих. В работах Спицына В.А. (2008) был отмечен эффект поляризации больных и здоровых рабочих по генетическим маркерам, когда в группе здоровых высокостажированных рабочих наблюдается снижение частоты гомозигот по редким аллелям. В нашей работе в группе рабочих, подвергающихся воздействию промышленных аэрозолей, но не имеющих ПХБ, выявлено увеличение доли гетерозиготных генотипов по локусам GSTP (313AG), CYP2F1 (c.14_15insC), MMP9 (2660AG) и частоты гаплотипа С-T гена CAT по локусам -262CT и 1167CT, которые могут рассматриваться как маркеры устойчивости организма к воздействию промышленных факторов.
5. Анализ межгенных взаимодействий при формировании наследственной предрасположенности к хроническим заболеваниям органов дыхания Важным этапом ассоциативных исследований является выявление взаимодействий между генами с целью определения таких комбинаций генных локусов, которые имеют наибольшую патогенетическую значимость для развития болезни. В результате анализа межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, протеолиза, антипротеолиза и медиаторов воспаления определены модели, детерминирующие риск развития хронической обструктивной болезни легких, бронхолегочных заболеваний у детей и профессионального бронхита с учетом пола, этнической принадлежности индивидов и статуса курения. В табл. 12 представлены наиболее значимые 4-x локусные модели межгенных взаимодействий, выявленные при алгоритме выборочного поиска для каждой группы больных. На рис. 1 приведены результаты кластерного анализа межгенных взаимодействий при различных хронических заболеваниях органов дыхания.
Были выявлены три статистически значимые 4-х локусные модели, взаимодействие полиморфных вариантов которых лежит в основе предрасположенности к развитию ХОБЛ. Одна из них CYP2A6 (del), NQO (465CT), ADAM33 (12418AG), IL1B (3539CT) состоит их двух независимых кластеров. Первый включает гены CYP2A6 (del) и IL1B (3539CT), для которых характерно тесное взаимодействие и взаимное усиление эффектов (синергизм).
Второй кластер - это гены NQO1 (465CT) и ADAM33 (12418AG), между которыми также выявлено сильное взаимодействие, но их влияние на развитие ХОБЛ дублируется. Анализ данной модели в таблицах сопряженности, представляющей собой комбинации всех возможных вариантов 4-х локусной модели, выявил несколько протективных и рисковых комбинаций. В дифференцированных по этнической принадлежности группах выявлено несколько моделей, наиболее значимые из которых представлены в табл. 12. Для русских значимой является модель, включающая следующие полиморфные локусы MMP1(-519 AG), CYP1A2 (-163CA), NQO1 (465CT), ADAM (12418AG).
Таблица Модели межгенных взаимодействий при хронических заболеваниях органов дыхания Tr. Test. Sign Группа Bal. Bal. Test Se Sp CVC Pre.
Acc Acc (P) CYP2A6 (del), NQO1 (465CT), ADAM33 (12418AG), IL1B (3539CT) ХОБЛ в целом 10/10 0. 0.7412 0.6254 0.001 0.5627 0. MMP1(-519 AG), CYP1A2 (-163CA), NQO1 (465CT), ADAM33 (12418AG) ХОБЛ русские 0.8402 0.8196 0.7981 0.8824 10/10 0. 0. GSTP1 (313AG), CAT (-262CT), ADAM33 (12418AG), IL6 (-174GC) ХОБЛ татары 0.7732 0.6695 0.001 0.7760 10/10 0. 0. NQO1 (465CT), UGT2B7 (802CT), MMP1 (-1607GGG), ADAM33 (13491CG) ПХБ в целом 0.7159 10/10 0. 0.6158 0.010 0.7623 0. NQO1 (465CT), UGT2B7 (802CT), MMP1 (-1607 GGG), MMP1 (-519 AG) ПХБ русские 0.8461 0.7703 10/10 0. 0.7116 0.001 0. MMP1(-1607 GGG), CYP1B1 (4326CG), SERPINA3 (25GA), VDBP (1296TG) ПХБ татары 0.8836 0.001 0.8289 10/10 0. 0.8154 0. CYP2F1( c.14_15insC), NQO1 (465CT), MMP12 (-82 AG), ХБЛЗ в целом VDBP (1296TG) 10/10 0. 0.6878 0.615 0.001 0.8093 0. GSTT (del), GSTP1 (313AG), CAT (-262CT), MMP3 (-1171 5А6А) ХБЛЗ русские 0.7636 0.7742 10/10 0. 0.695 0.001 0. CYP2F1 (c.14_15insC), NQO1 (465CT), MMP12 (-82 AG), VDBP (1296TG) ХБЛЗ татары 0.7308 0.001 0.8188 10/10 0. 0.6972 0. Примечание Tr.Bal.Acc. – тренировочная сбалансированная точность, Test.Bal.Acc. – тестируемая сбалансированная точность, Sign Test (P) – тест на значимость, Se. – чувствительность, Sp. – специфичность, CVС – повторяемость результата, Pre. (Precision) – точность модели.