Изучение биомаркеров метаболизма -3 и -6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин
На правах рукописи
ШИЛИНА НАТАЛИЯ МИХАЙЛОВНА ИЗУЧЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ МЕТАБОЛИЗМА -3 и -6 ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ У ДЕТЕЙ И БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте питания» Российской академии медицинских наук доктор медицинских наук, профессор,
Научный консультант:
заслуженный деятель науки РФ Конь Игорь Яковлевич
Официальные оппоненты: Северин Евгений Сергеевич доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», профессор кафедры биоорганической химии Биологического факультета Яровая Галина Алексеевна доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России, заведующая кафедрой биохимии, декан Медико-биологического факультета Терентьев Александр Александрович доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой биохимии Лечебного факультета
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук
Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в 14 часов на заседании Диссетрационного совета Д 001.002.01 при ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: г. Москва, Устьинский проезд, 2/14.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу:
г. Москва, Устьинский проезд, 2/14.
Автореферат разослан «_»_20 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Коденцова Вера Митрофановна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), Актуальность проблемы.
принадлежащие к числу незаменимых факторов питания, служат предметом значительного внимания исследователей как в нашей стране (Левачев М.М., 2002, Тутельян В.А., Погожева А.В., 2000), так и за рубежом (Koletzko B., 1997, 2001, Carlson S., 1997, Calder P., 2001, Uauy R., 2002, 2009). За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации многочисленных физиологических и биохимических процессов в организме в норме и при патологических состояниях. К их числу относятся: формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, поддержание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции.
Изучены многие стороны метаболических превращений ПНЖК, лежащих в основе указанных процессов. В то же время, ряд путей метаболизма жирных кислот и, особенно, взаимодействие этих путей, в значительной мере определяющее их функциональные эффекты, остаются малоизученными. Это, в частности, относится к участию ПНЖК в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты, образовании различных классов эйкозаноидов и построении и функционировании биомембран. Изучение взаимодействия этих путей представляет особый интерес с точки зрения поиска новых биомаркеров метаболизма ПНЖК у детей и беременных женщин.
Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ (Семенов Н.Н., 1956, Эммануэль Н.М., 1958, Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972, Тутельян В.А., 2003, 2009, и др.). Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие (Бурлакова Е.Б., 1975, Dormandy S., 1983, Budovsky, 1996, Храпова Н.В., 1997, Сторожок Н.Б., 2000, Погожева А.В., 2000, King V.R., 2006, Leung, 2006). В связи с этим возникает вопрос о возможной роли длинноцепочечных (ДЦ) ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови. С этой точки зрения значительный интерес представляет изучение АОА и химического состава отдельных хроматографических фракций сыворотки крови, в которых возможно присутствуют ДЦ ПНЖК, а также параллельная клинико-биохимическая оценка показателей ПОЛ, АОА и жирнокислотного состава плазмы крови у беременных женщин и недоношенных детей.
Следует подчеркнуть, что роль системы ПОЛ/АОА не может рассматриваться только с позиций патогенетического механизма развития заболеваний. В ряде исследований показана тесная связь между балансом этих систем и процессами клеточной пролиферации и роста (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1985, Скулачев В.П., 1999, Henry P.D., 2000, Pierce G.N., 2004, 2010). В связи с этим целесообразно проведение исследования возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.
В многочисленных работах установлены пути образования из -6 и -3 ПНЖК различных серий одного из видов эйкозаноидов – лейкотриенов (ЛТ) (Lee T.N. et al., 1985, Okamoto M. et al., 2000). Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим представляется важным провести детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особого внимания заслуживает выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.
Как было уже упомянуто, ПНЖК принимают участие в регуляции процессов воспаления в качестве субстратов ПОЛ и предшественников ЛТ, что сопровождается значительным расходом этих соединений. В то же время, ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства (Uauy R., 2002, Северин Е.С., 2005). В связи с этим представляется целесообразным изучение возможных изменений спектра жирных кислот (ЖК) КМ у детей при различных видах воспалительных заболеваний, относящихся к числу распространенной патологии детского возраста, характеризующейся тяжелым хроническим течением. При этом представляло интерес сравнить ЖК КМ крови (эритроцитов, лейкоцитов) у детей при двух видах воспаления (аллергическом и альтеративно экссудативном).
Изучение указанных биохимических показателей (МДА, АОА, ЛТ и ЖК состав крови) представляется важным не только с позиций решения фундаментальных задач биохимии, но и с позиций проблемы расширения спектра биомаркеров как скрининговых показателей различных метаболических процессов в норме и при патологии. В связи с этим представляло интерес изучить возможность использования указанных трех групп показателей в качестве биомаркеров метаболизма -3 и -6 ПНЖК в организме детей и беременных женщин.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках тем №051 «Обоснование оптимального белкового и липидного компонентов рационов питания для детей различных возрастных групп» и № 074 «Разработка системы диагностики, профилактики и лечения ожирения у детей раннего, дошкольного и школьного возраста».
Цель и задачи исследования:
Цель: Изучение роли длинноцепочечных ПНЖК в формировании антиоксидантной системы и соотношения основных путей метаболизма ПНЖК: процессов ПОЛ, участия в построении клеточных мембран и образования лейкотриенов в крови детей и беременных женщин.
Задачи:
1. Изучить роль -3 и -6 ПНЖК в формировании антиоксидантной системы (АОС) крови у взрослых мужчин и женщин и у детей.
2. Исследовать особенности участия -3 и -6 ПНЖК в формировании антиоксидантного потенциала у беременных женщин (при физиологически протекающей беременности и преэклампсии (ПЭ)) и у недоношенных детей.
3. Исследовать возрастную динамику АОА крови у детей и экспериментальных животных и оценить возможную роль АОА крови в процессах клеточной пролиферации.
4. Провести параллельное изучение интенсивности ПОЛ, уровня АОА и образования лейкотриенов крови в норме и при патологии (бронхиальной астме, ожирении).
5. Изучить состав жирных кислот клеточных мембран в норме и при воспалительных заболеваниях органов желудочно-кишечного тракта и бронхиальной астме.
Научная новизна исследования Впервые доказана важная роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные -3 и -6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного (АО) потенциала крови. Установлено, что АОА сыворотки крови максимальна в раннем возрасте у детей и экспериментальных животных и коррелирует со скоростью клеточной пролиферации. Показано, что обогащение рациона беременных женщин с ПЭ -3 ПНЖК увеличивает уровень АОА их крови и подавляет ПОЛ, повышенное при ПЭ. Впервые доказано, что соотношение различных видов ЛТ у детей в норме и при патологии меняется при изменении в организме уровня -3 ПНЖК. Установлено существование реципрокных отношений между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и различных видов (В, С, Д, Е).
Недостаточный уровень в организме детей -6 ПНЖК вследствие их сниженного поступления (недоношенные дети) или повышенного расхода на образование провоспалительных эйкозаноидов (бронхиальная астма) сопровождается снижением уровня ПОЛ, а обогащение их рациона ПНЖК приводит к нормализации уровня ПОЛ. На основании параллельного изучения ПОЛ, АОА и образования ЛТ сформулировано положение о реципрокности метаболических превращений ПНЖК. Впервые установлено, что различные виды воспаления - альтеративно-экссудативное и аллергическое, а также состояние недоношенности у детей вызывают сходные изменения в составе различных типов КМ (эритроцитов и лейкоцитов) и в плазме крови, заключающиеся в накоплении в них эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), снижении докозагексаеновой кислоты (ДГК) -3 и общего уровня -6 ПНЖК. На основании результатов исследования показана возможность использования указанных трех групп показателей (ПОЛ/АОА, лейкотриены, жирнокислотный состав биомембран) в качестве биомаркеров метаболизма ПНЖК.
Научно-практическое значение работы Выявленный в работе факт взаимодействия трех исследованных путей метаболизма ПНЖК (участие в формировании АОС и регуляции ПОЛ, образование ЛТ и построение биомембран), позволивший сформулировать положение об их реципрокности, открывает новые направления в изучении особенностей биохимической регуляции этих соединений в организме. Не описанный ранее феномен накопления в крови ЭПК в сочетании со снижением уровня ДГК и -6 ПНЖК при патологических состояниях у детей вносит новые представления в концепцию патогенеза этих состояний. Обнаружение АО свойств у ДЦ ПНЖК расширяет спектр известных к настоящему времени АО факторов и указывает на перспективность использования этих соединений в клинической практике. Полученные данные раскрывают новые стороны метаболизма ПНЖК и могут способствовать пониманию их физиологической роли у детей, а также служат теоретической основой для разработки новых подходов к диетотерапии болезней детского возраста. Данные о положительных эффектах обогащения рациона беременных женщин -3 ПНЖК используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин.
Апробация диссертации Результаты работы были доложены на Всероссийских и международных конференциях: Y и VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998, 2002);
Y и YII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2000);
Y Конгрессе педиатров России (Москва, 1999), International Congress of Pediatrics (Амстердам, Нидерланды, 1998), Международном симпозиуме "Питание XXI века. Медико биологические аспекты, пути оптимизации" (Владивосток, 1999), Международном семинаре "Проблемы беременности высокого риска" (Москва, 1999);
I Всероссийском Конгрессе с международным участием "Питание детей: XXI век" (Москва, 2000);
II российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2002);
YII Всероссийском Конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003);
Second International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (Мюнхен, Германия, 2004);
38th, 42th, 44th Annual Meetings of the European Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) (Порто, Португалия, 2005;
Будапешт, Венгрия, 2009;
Сорренто, Италия, 2011);
Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология:
проблемы и горизонты» (Москва, 2006);
конгрессе «Внутриутробный ребенок и общество.
Роль перинатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии» (Москва, 2007);
10th European Nutrition Conference (Париж, Франция, 2007);
World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Сан-Паоло, Бразилия, 2008);
IX, X, XI, XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010).
Публикации и внедрение в практику По теме диссертации опубликовано 64 работы, из них 19 публикаций - в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, другие издания – 10 публикаций, материалы научных конференций – 35 публикаций, 1 методические рекомендации, 4 главы в коллективных монографиях. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры питания детей и подростков ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (354 ссылки). Объем работы составляет 280 страниц, содержит 50 рисунков и 35 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Отбор и обследование больных проведены врачами на базе отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, отделения пульмонологии ФГБУ «Московский НИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России, детского клинического санатория «Малаховка», отделения недоношенных родильного дома ДГКБ №8;
ДГКБ №13 им. Н.Ф.
Филатова, родильного дома №6 ЦАО г. Москва, женской консультации при поликлинике № ЮАО г. Москва и родильных домов г.г. Рязань, Люберцы.
Всего в исследовании приняло участие 672 человека, в числе которых 441 ребенок в возрасте от 0 до 18 лет, 201 беременная женщина, 30 взрослых добровольцев;
экспериментальные исследования выполнены на 30 крысах линии Вистар. Всего проанализировано 5860 биологических образцов с использованием следующих методов.
1. Хроматографические методы.
Гель-фильтрацию сыворотки крови человека на колонке с «Sephadex G-200» (1,6х69 см, объем 138 мл, скорость элюирования 30 мл/час) фирмы “Amersham Biotech Pharmacia”, Швеция, и эксклюзионную хроматографию на колонках “Superose 6” (1х30 см, скорость элюирования - 2 мл/мин) той же фирмы и «TSK-GEL G4000 SW» (2,1х60 см, скорость элюирования - 4 мл/мин) фирмы “Tosoh Bioscience”, Япония, проводили, используя образцы объединенного пула сыворотки крови от здоровых взрослых добровольцев 20-40 лет, и пуповинной крови детей из родильных домов г.г. Москвы, Рязани, Люберец, хранившихся при –18°С до момента исследования. Элюцию фракций проводили 10 мМ трис-HCl буфером, рН 7,5, с 0,15 М NaCl). Колонки предварительно были откалиброваны по стандартным водорастворимым глобулярным белкам.
2. Методы определения АОА в крови и ее хроматографических фракциях.
Определение АОА сыворотки (плазмы) крови в системе Fe2+-зависимого ПОЛ, инициированного в липосомах липопротеинов яичного желтка. Суммарную АОА сыворотки крови (в относительных единицах) определяли по методу Клебанова и др., 1988, основанному на оценке способности сыворотки крови к подавлению Fe2+-зависимого ПОЛ в желточных липопротеинах (ЖЛП) in vitro, в собственной модификации. ПОЛ инициировали в суспензии ЖЛП, добавляя эту суспензию к смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) и 20 мМ Fe2SO4. Для подавления индуцированного ПОЛ в пробы добавляли аликвоты сыворотки крови. Смесь инкубировали 1 ч при 37°С, после чего в пробы добавляли 0,25М ЭДТА, 50% трихлоруксусную кислоту и центрифугировали 15 мин при 1600 g. К надосадку добавляли 0,9% тиобарбитуровую кислоту (ТБК) и инкубировали пробы в течение 15 мин при 100°С, после чего в надосадочной жидкости определяли содержание ТБК-активных продуктов (МДА) спектрофотометрически (при 532 нм). Уровень суммарной АОА крови (в относительных единицах) рассчитывали как отношение А532 в пробах, не содержащих сыворотку крови, к А532 в пробах с сывороткой крови.
Для исследования АОА фракций, полученных при разделении сыворотки крови на «SEPHADEX G-200», отбирали по 1 мл фракций;
при разделении сыворотки крови на «SUPEROSE 6» и «TSK-GEL G4000 SW» - по 300 мкл фракций и исследовали АОА как описано выше.
Определение АОА методом TAS (Total Antioxidant Status). Общую АО емкость сыворотки (плазмы) крови определяли в модельной системе TAS с использованием набора RANDOX TAS (Randox Laboratories, Великобритания). Метод основан на торможении внесенными антиоксидантами образования окрашенного стабильного радикала ABTS·+ (2,2’ азино-ди-(3-этилбензтиазолина сульфонат)) в смеси ABTS-метмиоглобин-Н2О2 (Miller N.J. et al., 1993).
Определение АОА с помощью оценки окисления метилолеата манометрическим методом. Свободно-радикальное окисление (СРО) инициировали с помощью термического разложения азобисизобутиронитрила (АИБН), (6х10-4 моль/л). АОА рассчитывали как отношение разности периодов индукции в опыте и в контроле (=оп - к) к периоду индукции контроля к.
3. Определение МДА в сыворотке (плазме) крови людей и экспериментальных животных проводили по методу Кагана В.Е. и соавт., 1986, Wade C.R. et al., 1988, в собственной модификации. Для определения МДА к 10-100 мкл сыворотки (плазмы) крови в физиологическом растворе прибавляли 50% ТХУ, центрифугировали 15 мин при 855 g, отбирали 2 мл супернатанта, добавляли к нему 35 мМ FeCl3 и 0,6% ТБК в 50% уксусной кислоте. Пробы инкубировали 20 мин при 1000С, затем охлаждали, добавляли 4 мл n бутанола, перемешивали и центрифугировали 20 мин при 855 g. В органической фракции измеряли флуоресценцию на флуориметре “Perkin Elmer”, 1=515 нм, 2=553 нм.
Интенсивность флуоресценции сравнивали с таковой стандарта – 1,1,3,3 тетраэтоксипропана (“Sigma”, США). Содержание МДА в сыворотке крови выражали в нмоль/мл.
4. Определение белка в сыворотке крови и во фракциях проводили по методу Spector T., 1978, с Кумасси G-250.
5. Определение содержания в сыворотке крови и хроматографических фракциях трансферрина, церулоплазмина, альфа-фетопротеина, аполипопротеинов апо А1 и апо В.
Содержание трансферрина (ТФ) и церулоплазмина (ЦП) определяли методом простой радиальной иммунодиффузии по Manchini, используя антисыворотку свиньи к ТФ и ЦП человека (“Sevac”, Чехия), альфа-фетопротеина - с помощью иммуноферментного анализа, используя набор Accu-Bind ELISA Microwells (Monobind Inc., USA), аполипопротеинов - с помощью иммунотурбидиметрии, используя тест-наборы фирмы «Human» (Германия).
6. Активность параоксоназы (PON-1) определяли по методу Boltowsky, 2005, основанному на измерении увеличения оптического поглощения окрашенного продукта реакции ферментативного расщепления субстрата (фенил ацетата). Активность параоксоназы рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции E270 = 1310 М-1см-1 и выражали в ммоль фенола в мин на мг белка (или мл фракции).
7. Определение общих липидов в хроматографических фракциях проводили с помощью нативного электрофореза в градиентном ПААГ в концентрации 3-12% (ICN Pharmaceuticals, Inc, США), используя специфическое окрашивание на липиды красителем OIL RED с последующей денситометрией образцов.
8. Определение содержания общего холестерина и триглицеридов в хроматографических фракциях проводили с помощью автоанализатора “Airone 200”, Crony Instruments, Италия, ферментным методом, используя комбинированные диагностические наборы «Biocon Diagnostik GmbH», Германия;
фосфолипидов - методом двумерной тонкослойной хроматографии;
липопротеинов - с помощью электрофореза в агарозе с последующей специфической окраской на липопротеины и денситометрией электрофореграмм.
9. Определение жирнокислотного состава сыворотки крови, мембран клеток крови и хроматографических фракций проводили в экстрактах липидов, выделенных по методу Folch J. et al., используя разделение метиловых эфиров ЖК с помощью газожидкостной хроматографии на хроматографе “Dani 1000” с пламенно-ионизационным детектором.
Капиллярная кварцевая колонка длиной 60 м и диаметром 0,25 мм с фазой HP-23. Газ носитель - азот (42 метра в минуту);
температура испарителя, колонки и детектора (230: 100 220: 2400С). Результаты выражали в % от суммы ЖК сыворотки крови, ее фракций и клеточных мембран.
10. Определение витаминов А, Е и -каротина в сыворотке крови и хроматографических фракциях проводили с помощью обращённо-фазной ВЭЖХ после экстракции их гексаном (совместно с к.х.н. Бекетовой Н.А.) 11. Определение лейкотриенов в крови детей. проводили с помощью обращённо фазной ВЭЖХ после экстракции их по Clancy and Hugli, 1983, используя стандарты лейкотриенов В4, С4, Д4, Е4, В5, Д5 фирмы “Sigma Aldrich”, США.
12. Изучение возрастной динамики процессов пролиферации и апоптоза у крыс методом проточной цитометрии. Опыты проводили на 30 белых беспородных крысах Вистар обоего пола разного возраста - 0,5;
6;
11 и 24 недели. После декапитации крыс под легким эфирным наркозом, собирали кровь для получения сыворотки, извлекали печень и тимус, получали суспензии клеток в 4% формалине на фосфатном буфере и хранили их в холодильнике до момента измерений на цитометре. Для определения апоптоза и фаз клеточного цикла суспензии клеток окрашивали пропидиума йодидом в гипотоническом буфере. Измерения проводили на проточном цитометре “FACSCalibur” (“Becton Dicinson”) при длине волны 610±5 нм по программе “CellQuest”. При этом в каждом образце выставляли гейты, обозначающие отдельные популяции клеток (гепатоциты, лимфоциты, макрофаги и т.д.). В каждом гейте анализировали 10 тыс. событий.
13. Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического программного пакета SPSS версий 11-18 с использованием параметрических и непараметрических методов анализа (критерий Фишера-Стьюдента, ранговые критерии Манна-Уитни и Вилкоксона). Различия считали достоверными при p0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Оценка возможной роли -3 ПНЖК и отдельных антиоксидантов крови в формировании ее суммарной антиоксидантной активности.
Изучение химической природы соединений, ответственных за формирование суммарной АОА сыворотки крови у взрослых и детей, было проведено в серии экспериментов по хроматографическому разделению сыворотки крови на фракции с различной молекулярной массой, в которых была измерена суммарная АОА.
Хроматографическое разделение сыворотки крови на фракции проводили на колонках с носителями «Sephadex G-200», «Superose-6» и «TSK-GEL G4000 SW», которые характеризовались нарастающей разделяющей способностью*.
На рисунке 1А приведены результаты изучения АОА фракций с различной молекуляр Рис. 1А. АОА фракций сыворотки крови взрослых людей, полученных на колонке «Sephadex G-200».
* - совместно с д.б.н. А.Н. Котеровым и к.б.н. С.Н. Зориным ной массой, полученных при разделении сыворотки крови взрослых людей на колонке «Sephadex G-200», на рисунке 1Б - на колонке «Superose-6». Как видно на рисунке 1А, наибольший вклад в суммарную АОА сыворотки крови взрослых людей вносили пики №№ I, II и III (30, 17 и 31%) с молекулярной массой 1063 кДа, 674 кДа и 248 кДа, соответственно.
Профиль АОА сыворотки крови, разделенной с помощью «Superosе 6» (рис.1Б), характеризовался четко выраженным максимумом во фракции №13, молекулярная масса которой составила 585 кДа, что близко к молекулярной массе фракции II с высокой АОА, выявленной в предыдущем опыте с использованием колонки с «Sephadex G-200» (рис. 1А).
Наблюдался также еще один пик АОА в области 67 кДа, образуемый 15 и 16 фракциями.
Распределение АОА во фракциях, полученных при хроматографическом разделении сыворотки крови на колонке «TSK-GEL G4000 SW» принципиально не отличалось от данных, полученных на колонке с «Superosе 6».
Рис. 1Б. АО А фракций сыворотки крови взрослых людей, получе нных на колонке с «Superosе 6» АОА АО А, отн.ед.
усл.ед. белка Содержание по Кумасси G-250, мкг/фракцию Содержание белка во фракциях, усл.ед.опт.пл. при 280нм 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Ном ера фракций Таким образом, в трех независимых опытах с использованием различных типов колонок и хроматографических носителей доказано, что максимальная АОА крови была выявлена в высокомолекулярных фракциях. Вместе с тем, АОА в 15-й и 16-й фракции сыворотки крови взрослых людей определяется присутствием ТФ и ЦП, выявленных с помощью иммунохимического определения. При этом фракция с максимальной АОА (№13) этих белков не содержала.
Изучение химического состава фракций с максимальной и минимальной АОА, выделенных с помощью разделения сыворотки крови на колонке «Sephadex G-200», показало (таблица 1), что фракция с максимальной АОА содержит несколько меньшее количество белка, но существенно большее количество общих липидов, чем фракция с минимальной АОА. Содержание холестерина, триглицеридов, фосфолипидов и аполипопротеина В также было выше во фракции с максимальной АОА, в особенности при расчете на количество белка во фракции.
Эти результаты были подтверждены с помощью электрофоретического определения в указанных фракциях общих липидов (рис. 2).
Таблица 1.
Химический состав фракций с максимальной и минимальной АОА, полученных на колонке с «Sephadex G-200» Удельное Удельное Фракция содержание Фракция с содержание Компоненты фракций, без компонента, мг/мг максимальной компонента, мг/мг АОА белка во фракции мг/мл белка во фракции с АОА с минимальной максимальной АОА АОА Общий белок 2,5 3, Общие липиды, усл. ед. 48,9 19,6 27,8 8, Общий холестерин 0,52 0,21 0,26 0, Триглицериды 0,23 0,09 0,09 0, Фосфолипиды 0,168 0,07 0,135 0, апо А1 0,075 0,03 0,22 0, апо В 0,23 0,09 0,04 0, Результаты электрофорети Рис. 2.
ческого определения содержания общих липидов во фракциях с минимальной (А) и максимальной (Б) АОА.
Фракции получены с помощью хроматографического разделения сыворотки крови взрослых людей на колонке “Sephadex G-200”.
А и Б – денситограммы (1) и электорофореграммы (2) фракций с низкой и высокой АОА, соответственно.
Гели окрашены специфическим для липидов красителем “OIL RED”.
Как видно на рисунке, выявлено более высокое содержание липидов во фракции с высокой АОА (рис. 2Б), чем во фракции с низкой АОА (рис. 2А).
Содержание низкомолекулярных антиоксидантов витаминов А и Е в сыворотке крови составило - 79,9 мкг/дл и 1,81 мг/дл, против нормы 30-70 мкг/дл и 0,8-1,5 мг/дл, соответственно. Однако, во фракции с максимальной АОА витамин А обнаружен не был, а витамин Е присутствовал в незначительном количестве (0,054 мг/дл).
Представленные в предыдущем разделе данные были получены с помощью оценки общей АОА в системе ЖЛП/Fe2+. Поскольку АОА является интегральным показателем, величина которого зависит от взаимодействия многих компонентов, закономерно возникает вопрос о правомерности данного вывода при использовании иных методов детекции АОА, основанных на оценке других составляющих АОС. С этой целью было проведено определение АОА в двух других модельных системах индуцированного СРО.
Определение АОА с помощью оценки ингибирования окисления метилолеата.
Максимум АОА, выявившийся в системе окисления метилолеата, обнаружен в области высокомолекулярных фракций №9 и 10 (0,47 и 1,26 отн.ед., соответственно), второй пик АОА обнаруживается во фракциях №15-18 (0,54-1,10 отн.ед), характеризующихся значительно меньшей молекулярной массой, которые включают ТФ и ЦП. Полученные данные согласуются с результатами, полученными в системе ЖЛП, в которой наиболее высокая АОА сыворотки крови выявлена в высокомолекулярных фракциях.
Определение АОА с помощью торможения ПОЛ в системе определения общего антиоксидантного статуса (total antioxidant status, TAS).
Максимальные значения АОА, определенной этим методом, наблюдались (в порядке убывания) во фракциях № 13–17, №20, №25 и №11. В системе ЖЛП максимальные значения АОА наблюдались во фракциях №12, №15 и №27. В обеих модельных системах пики АОА наблюдались в близких областях молекулярных масс, а именно в области фракций № 14-16, в которой обнаружено присутствие ТФ и ЦП, и в области фракций 12-13, совпадающей с областью высокомолекулярных компонентов (около 600 кДа).
Таким образом, при использовании трех независимых методов оценки АОА сыворотки крови были получены сходные результаты, свидетельствующие о том, что высокая АОА связана с высокомолекулярными фракциями сыворотки крови.
Определение жирнокислотного состава фракций сыворотки крови. Фракция с максимальной АОА характеризовалась более высоким (в 2-4 раза по сравнению с контролем) - совместно с д.х.н. Сторожок Н.М - совместно с к.х.н. Медведевым Ф.А содержанием ДЦ ПНЖК -3 и -6 семейств (таблица 2), причем содержание ДГК (22:6 -3) составляло во фракции с максимальной АОА 2,8±0,97% против 0,5±0,3% во фракции с низкой АОА (p0,05).
Таблица 2.
Суммарное содержание ДЦ ПНЖК -3 и -6 семейств в липидах, выделенных из фракций сыворотки крови с максимальной и минимальной АОА, % от суммы жирных кислот.
Семейства ПНЖК Фракция сыворотки крови с Фракция сыворотки крови минимальной АОА с максимальной АОА -3 ДПК+ДГК 1,3 5, -6 АК+ДГЛК 2,1 4, -3+-6 ДЦ ПНЖК 3,4 9, Приведенные данные указывают на возможную роль -3 ПНЖК как одного из важных компонентов АОС крови. Известно, что ПНЖК и, в частности, -3 ПНЖК переносятся в крови в составе ФЛ, входящих в липопротеидные комплексы. В то же время в предыдущем разделе было показано, что АОА крови связана в основном с высокомолекулярной фракцией, богатой липидами. Основными высокомолекулярными комплексами крови являются различные классы ЛП. В связи с этим, на следующем этапе работы была проведена оценка присутствия в указанной фракции ЛП, содержащих в своем составе ФЛ, способные переносить в крови ПНЖК. Эти исследования были проведены с помощью двух подходов: 1) электрофоретического разделения белков сыворотки крови в агарозе с последующей специфической окраской на ЛП;
2) исследования активности фермента, ассоциированного с ЛПВП, - параоксоназы-1 (paraoxonase-1, PON-1, ЕС 3.1.1.2) как маркера присутствия во фракции сыворотки крови ЛПВП, позволяющего дифференцировать ЛПВП от ЛПНП.
Результаты электрофоретического изучения ЛП показали, что АОА во фракциях с ее максимальными значениями (рис.3, А), определяется присутствием в них, в отличие от фракций с минимальной АОА (рис. 3, Б), ЛП (а) – фракцией -ЛП, представляющих собой ЛПНП, на поверхности которых находится ковалентно связанная с апобелком ЛПНП молекула апо(а) – белка, с помощью которого осуществляется направленный перенос эссенциальных ПНЖК к клеткам (Титов В.Н., 2008).
Во втором независимо проведенном опыте были получены сходные результаты:
фракция с максимальной АОА также содержала ЛП, которые совпадали с - совместно с к.м.н. Амелюшкиной В.А.
электрофоретической подвижностью -ЛП - ЛПВП, в ассоциации с апобелком (апоА-1) которых переносятся фосфолипиды, диглицериды, небольшое количество эфиров холестерина, содержащие в своем составе ПНЖК.
Рис. 3. Денситограммы электрофореграмм липопротеинов фракций сыворотки крови с максимальной (А) и минимальной (Б) АОА.
А) Chylomicrons Chylo- Alpha Beta хиломикроны microns Beta – бета-ЛП Alpha – альфа - ЛП ЛП (a) Б) Chylo- Alpha Beta microns Изучение распределения во фракциях крови активности антиоксидантного фермента PON-1, являющегося маркером присутствия в исследуемых фракциях ЛПВП, проведено с использованием аналитического («Superose 6») и препаративного варианта колонки с высокой разрешающей способностью («TSKGel G4000SW»). При использовании колонки «TSKGelG4000SW» выраженная активность PON-1 наблюдалась во фракциях №№15 и 16 с максимальным значением 49,52 µмоль/мин/мг белка в 16 фракции;
а максимум АОА (3, отн.ед.) был выявлен во фракции №12. При использовании же для разделения крови колонки «Superose 6» и максимальная АОА, и активность PON-1 были обнаружены в одной фракции (№13).
Учитывая, что активность PON-1 – маркера ЛПВП - выявлена в 15 и 16 фракциях, можно полагать, что АОА этих фракций определяется присутствием в них ЛПВП, а АОА фракции – другими классами ЛП, что согласуется с результатами предыдущей серии опытов с электрофоретической детекцией различных классов ЛП во фракциях крови. При использовании же колонки с «Superose 6» ЛПНП и ЛПВП выходили в одном пике с высокой АОА. Тем самым эти результаты подтверждают, что АОА в высокомолекулярных фракциях крови связана не только с ЛПВП, но и с другими классами ЛП, способными переносить в крови ПНЖК, в том числе ПНЖК -3 семейства, в составе ФЛ.
Таким образом, проведенные исследования показали, что -3 ПНЖК могут проявлять свое антиоксидантное действие в качестве компонентов ЛП, в которых они транспортируются в составе ФЛ. В пользу этого вывода говорят также литературные данные о том, что ПНЖК проявляют свои антиоксидантные эффекты, связанные с восстановлением радикала витамина Е, именно в составе ФЛ, и эти эффекты тем более выражены, чем больше степень ненасыщенности ПНЖК, входящих в состав ФЛ (Сторожок Н.М., Храпова Н.Н., 1995;
Луконькин И.Н., 2004).
2. Изучение уровня АОА, МДА и спектра жирных кислот в крови у беременных женщин с преэклампсией и с нормально протекающей беременностью.
Другим подходом к оценке возможной роли -3 ПНЖК в формировании АОА крови явилось параллельное изучение ПОЛ, АОА и спектра ЖК у беременных женщин с ПЭ в сравнении с нормально протекающей беременностью.
Исследование было проведено совместно с профессором Л.Е. Мурашко, к.м.н. О.Л.
Ивановой и др. на базе ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития РФ. Обследовали 141 беременную женщину в возрасте от 17 до 44 лет с ПЭ и 60 женщин с нормально протекающей беременностью. Диагностическими критериями развития ПЭ служило возникновение у беременных гипертензии, протеинурии, отеков. Все обследованные женщины в зависимости от срока выявления ПЭ были разделены на три группы: 17–28 неделя беременности (I группа), 29–34 нед (II группа) и 35–40 нед (III группа) соответственно. Изучение спектра ЖК плазмы крови было проведено методом ГЖХ. Проведенные исследования показали (таблица 3), что содержание ЭПК (20:5) и ДГК (22:6) -3 ПНЖК во второй половине беременности у женщин с ПЭ было достоверно снижено по сравнению со здоровыми женщинами. В то же время уровень -6 ПНЖК при ПЭ возрастал по сравнению с нормально протекающей беременностью. Соотношение -6/-3 ПНЖК при нормально протекающей беременности составляло 10:1, тогда как при ПЭ в период с 20 по 28 и с 35 по 40 неделю беременности оно было повышено до 30:1.
Таблица 3.
Уровень ПНЖК -3 и -6 семейства в плазме крови беременных женщин с ПЭ в сравнении с их уровнем в плазме крови женщин с нормально протекающей беременностью (% от суммы жирных кислот, M±SD).
Семейство Течение Группы беременных женщин Жирные кислоты ПНЖК беременности 17-28 нед. 29-34 нед. 35-40 нед.
ПЭ 0,5±0,08* 0,5±0,1* 0,3±0,03* 20:5 (ЭПК) норма 0,6±0,12 0,8±0,3 0,7±0, - ПЭ 1,0±0,23* 0,6±0,3* 1,2±0,2* 22:6 (ДГК) норма 2, 2±0,8 1,8±0,9 2,0±0, 18:2 ПЭ 36,0±8,4* 28,3±6,3 39,3±9,8* (Линолевая к-та) норма 24,0±5,3 25,3±7,5 23,0±6, 20:3 ПЭ 0,6±0,3* 0,3±0,15 0,4±0, - 6 (Дигомо-гамма норма 0,3 ±0,15 0,4±0,27 0,3±0, линоленовая к-та) ПЭ 5,7±2,5* 3,9±1,8 5,3±2, 20: норма 4,3±2,1 3,7±1,6 4,0±1, (Арахидоновая к-та) * - отличия достоверны по сравнению с нормально протекающей беременностью, p0, Параллельное исследование динамики изменений уровня МДА и АОА крови женщин при неосложненной беременности и беременности с ПЭ показало, что при нормальной беременности содержание в крови МДА в период с 17 по 30 неделю беременности остается неизменным (рис. 4, кривая 2), в то время как у беременных с ПЭ отмечается нарастание этого показателя с максимумом в период с 30 по 34 неделю (рис. 4, кривая 1).
Вместе с тем, у женщин с ПЭ, в отличие от здоровых беременных, АОА (рис. 5, кривая 1) и уровень одного из компонентов АОС крови ТФ в сыворотке крови в динамике беременности не нарастали. Выявлена достоверная обратная корреляция между концентрацией МДА и lg АОА как у здоровых беременных (r = -0,534, p0,01, n=24), так и у беременных с ПЭ (r=-0,425, p0,01, n=35) и прямая корреляция между АОА и уровнем ТФ в сыворотке крови беременных обеих групп (r=+0,45, p0,001, n=62).
С целью коррекции соотношения -6/-3 ПНЖК рацион беременных женщин с ПЭ был обогащен -3 ПНЖК, источником которых служила биологически активная добавка к пище «Эйконол» (НПП «Тринита», Россия), свидетельство о государственной регистрации № 77.99.232.3.У.11459.12.08 от 30.12.2008, в капсулах по 1 г, содержащих 0,3 г концентрата ПНЖК. Содержание -3 ДЦ ПНЖК (ЭПК и ДГК) в добавке составляло 25% от суммы всех ЖК, витамина Е - 1 мг на капсулу (5,9% от суточной потребности в этом витамине для беременных женщин, МР 2.3.1.2432-08).
Рис. 4. Уровень МДА в сыворотке крови женщин в динамике нормально протекающей беременности и беременности, осложненной преэклампсией.
МДА, нмоль/мл Срок беременности, недели 1 — женщины с преэклампсией, 2 — нормальная беременность;
* - отличия достоверны, p0, Рис. 5. Антиоксидантная активность сыворотки крови здоровых беременных (2) и женщин с преэклампсией (1).
АОА, отн.ед.
Срок беременности, недели 1 — женщины с преэклампсией, 2 — здоровые беременные;
* - отличия достоверны, p0, Включение в комплексную терапию ПЭ -3 ПНЖК (по 1 капсуле 1 раз в сутки в течение 30 дней) достоверно увеличивало относительное содержание ЭПК и ДГК в крови у беременных женщин с ПЭ, особенно в 29-ю и 34-ю недели. При этом содержание ЭПК увеличилось в среднем в 1,4 раза, а ДГК - удвоилось. Отношение -6/-3 ПНЖК при этом составило 11:1 -14:1 и приблизилось к его значениям при физиологической беременности.
Прием -3 ПНЖК полностью устранял рост концентрации МДА в крови, вызванный ПЭ, и приводил к резкому (в 1,5–2 раза) снижению этого показателя даже по сравнению с неосложненной беременностью (табл. 4). Этот эффект был особенно выраженным в период с 29-й по 34-ю неделю беременности, когда снижение содержания МДА, вызванное приемом -3 ПНЖК, достигало 50% по сравнению с его уровнем при нормально протекающей беременности. АОА сыворотки крови, сниженная при ПЭ, повышалась при приеме - ПНЖК на всех изученных сроках беременности.
Таблица 4.
Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови беременных женщин, нмоль/мл (M±m) Прием -3 ПНЖК Срок при Беременность, Нормальная гестации, % беременности, % осложненная беременность нед осложненной преэклампсией преэклампсией 5,87±0,72 6,36±0,52 3,24±0,48 51±8** 17–28 108±19% n=10 n=18 n=18 р0, 66±8* 5,63±0,89 8,02±0,98 142±17%* 3,73±0, 29–34 47±6** n=10 n=14 p0.1 n= р0, 68±4* 5,12±0,87 4,49±0,42 3,49±0, 35–40 88±8% 78±5** n=7 n=14 n= р0, * — изменения достоверны по сравнению с нормальной беременностью;
** — изменения достоверны по сравнению с беременностью, осложненной ПЭ.
Прием -3 ПНЖК значительно повышал также содержание в крови ТФ, сниженного у беременных женщин при ПЭ, что может служить дополнительным фактором стимулирующего влияния -3 ПНЖК на АОА.
Полученные данные, в сочетании с другими проведенными нами исследованиями, подтверждают гипотезу об АО эффектах -3 ПНЖК, обусловленных, очевидно, не прямым обрывом ими цепей СРО, а включением в состав ЛП комплексов, обладающих максимальной АОА в крови, а также стимуляцией синтеза ТФ - как одного из важных АО факторов крови.
Важно подчеркнуть, что дополнительный прием -3 ПНЖК позволил снизить тяжесть течения ПЭ, что проявлялось более ранним (на 2-3 дня), чем при применении общепринятой терапии, исчезновением клинических проявлений ПЭ, более благоприятным исходом беременности и родов для матери и плода (своевременные роды в 2 раза чаще, а преждевременные - в 5 раз реже, чем у пациенток с ПЭ, не получавших -3 ПНЖК) и в доле детей, родившихся доношенными (90% в группе женщин, принимавших, и 47% у пациенток, не принимавших -3 ПНЖК). Эти результаты послужили основанием для использования - ПНЖК в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ. Изучение уровня суммарной АОА, МДА и спектра жирных кислот в крови у недоношенных детей.
Еще одним подходом к оценке возможной роли -3 ПНЖК в формировании АОА крови явилось параллельное изучение ПОЛ, АОА и спектра ЖК у недоношенных детей, для которых характерно снижение уровня ПНЖК в организме вследствие прерывания их внутриутробного развития во второй половине беременности, когда идет максимальное накопление плодом ПНЖК.
Исследования были проведены у 43 недоношенных детей с гестационным возрастом 33-37 недель с массой тела при рождении 1740-2690 г. В зависимости от вида вскармливания дети были разделены на 2 группы: дети 1-й группы вскармливались смесью для недоношенных детей, обогащенной АК и ДГК («PreNAN» т.м. «Nestle», свидетельство о государственной регистрации № RU.77.99.19.005.E.015625.05.11), дети 2 группы аналогичной смесью, не обогащенной указанными ЖК («PreNAN» т.м. «Nestle», свидетельство о государственной регистрации № 77.99.19.5.У.10017.12.07). Содержание МДА, АОА и состав ЖК изучали в плазме пуповинной крови, а затем через 14 дней в плазме венозной крови детей. Референсную группу составили 50 здоровых доношенных детей из родильных домов г.г. Москвы, Рязани и Люберец, у которых МДА, АОА и состав ЖК изучали только в пуповинной крови.
Установлено, что уровень МДА и АОА в пуповинной крови у недоношенных детей был значительно и достоверно (p0,05) ниже, чем их уровень в пуповинной крови здоровых доношенных детей (58% и 46% от контроля для АОА и МДА, соответственно). Данные о низкой АОА крови недоношенных детей согласуются с литературными данными о высокой частоте у этой категории больных детей свободно-радикальной патологии (ретинопатии, бронхолегочной дисплазии, некротизирующего энтероколита и др.), а низкий уровень показателя интенсивности процессов ПОЛ – МДА – возможно относится к числу факторов, ответственных за нарушение роста и дифференцировки, которые вносят вклад в развитие ряда патологических состояний, сопровождающих недоношенность.
Изучение спектра ЖК плазмы крови у недоношенных детей выявило рост уровня среднецепочечных ЖК и снижение содержания всех представителей -6 ПНЖК – линолевой (18:2), ДГЛК (20:3) и, особенно, АК (20:4) по сравнению с доношенными новорожденными (рис. 6). В то же время на фоне снижения уровня АК и других -6 ПНЖК выявлено накопление в плазме ЭПК (20:5) и суммы -3 ПНЖК. Вместе с тем, уровень двух других ДЦ ПНЖК 3 семейства (ДПК 22:5 и ДГК 22:6) проявлял тенденцию к снижению. Таким образом, можно предполагать, что у недоношенных детей имеет место задержка метаболизма ЭПК в ее более длинноцепочечные производные, которая не была описана ранее в литературе.
Полученные данные позволяют предполагать, что причиной снижения уровня ПОЛ, проявляющегося в уменьшении содержания в крови МДА, может служить снижение в плазме крови недоношенных детей субстрата ПОЛ - -6 ПНЖК, а снижение АОА плазмы крови недоношенных детей обусловлено низким содержанием ДЦ ПНЖК (АК, ДПК и ДГК) в составе ФЛ липопротеинов.
В пользу данного предположения говорят результаты исследования ЖК состава крови недоношенных детей через 2 недели после начала их вскармливания смесью, обогащенной ДЦ ПНЖК (АК и ДГК), либо стандартной смесью для недоношенных детей (группа сравнения). Было установлено, что в крови детей, получавших обогащенную смесь (рис. 6), достоверно увеличивался, по сравнению с исходным, суммарный уровень -6 ПНЖК, и, в частности, линолевой кислоты (18:2). При этом снижался уровень ЭПК (20:5), что, возможно, указывает на прекращение компенсаторного накопления ЭПК в крови вследствие увеличения в ней уровня -6 ПНЖК.
АОА сыворотки крови при этом несколько снижалась (с 1,23±0,53 до 0,944±0, отн.ед.), что согласуется с отсутствием увеличения уровня ДЦ ПНЖК (АК, ДПК 22:5 и ДГК 22:6) в крови детей, а уровень МДА незначительно возрастал (с 0,41±0,2 до 0,53±0, нмоль/мл), что согласуется с увеличением суммарного уровня -6 ПНЖК как субстрата ПОЛ в крови у этих детей.
В группе сравнения, получавшей сходную по составу смесь, но не обогащенную ДЦ ПНЖК, уровень МДА к концу исследования, напротив, резко снизился (с 0,41±0,36 до 0,26±0,30 нмоль/мл), также как и уровень АОА (с 1,22±0,6 до 0,99±0,65 отн.ед.). При этом исследование спектра ЖК крови данной группы детей выявило нарастание его дисбаланса – дальнейшее снижение уровня АК, рост ЭПК и суммы -3 ПНЖК в плазме крови недоношенных детей по сравнению с их уровнем у доношенных детей. Полученные результаты подтверждают предположение об участии ДЦ ПНЖК в формировании АО системы сыворотки крови, достоверно сниженной у недоношенных детей, и возраставшей (в виде тенденции) при вскармливании их смесью, обогащенной ДЦ ПНЖК.
Рис. 6. Уровень жирных кислот в плазме крови недоношенных детей до и после их вскармливания специализированной смесью в сравнении с их уровнем у доношенных детей, % от суммы жирных кислот 30, ** 25, # % от суммы жирных кислот 20, Доношенные *# 15,0 Недоношенные, до Недоношенные, после ** * 10, *# ** ** ** # 5, ** *# ** ** ** ** 0, : : : : : : : : : : : : : : : Жирные кислоты * - отличия достоверны по сравнению с доношенными детьми, p0,05;
#- отличия достоверны по сравнению с уровнем жирных кислот в пуповинной крови недоношенных детей, p0, 3. Изучение возрастных особенностей АОА у детей.
Целью данного раздела работы было: 1) изучение возрастных особенностей АОС путем сравнительного изучения суммарной АОА сыворотки крови взрослых и детей разного возраста;
2) сравнительная оценка вклада отдельных компонентов АОС в суммарную АОА различных фракций сыворотки крови взрослых и детей.
4.1.Возрастная динамика суммарной АОА сыворотки крови.
Сравнительное изучение суммарной АОА в системе с ЖЛП у 131 ребенка раннего (I год жизни), 19 детей дошкольного (5 лет) и 30 детей школьного возраста (10-14 лет) в сравнении с взрослыми мужчинами и женщинами и беременными женщинами показало (рис.7), что суммарная АОА сыворотки крови детей первого года жизни (2,85±0,18 отн.ед., М±m) превышает АОА детей в возрасте 5 лет (1,51±0,07 отн.ед., р0,05) и 10-14 лет (1,96±0,43 отн. ед.), а также АОА взрослых мужчин и женщин и беременных женщин (Р0,05).
Рис. 7.
Динамика суммарной АОА сыворотки крови в зависимости от возраста, отн.ед.
3, ** АОА, отн.ед.
2, ** * ** ** 2 * 1, АОА, отн.ед.
0, д ые ы т т ле го ле ин сл щ ро - ен Вз еж ы нн ме ре Бе Возраст *- отличия достоверны по сравнению с 1 годом жизни, p0,05;
** - отличия достоверны по сравнению с возрастом 10-14 лет, p0,05.
АОА сыворотки крови детей обследованных возрастных групп, изученная в системе подавления Fe2+-зависимого ПОЛ в ЖЛП, была выше, чем у взрослых людей, несмотря на то, что по данным литературы, содержание большинства АО компонентов в крови в детском возрасте ниже, чем у взрослых (Berger H.M., 1995). Примечательно, что максимальная АОА в крови новорожденных детей совпадает с максимальной скоростью роста, наблюдающейся в этот период у детей. Повышение АОА крови наблюдается также и у подростков (рис. 7), т.е.
в период второго ростового скачка.
Учитывая полученные нами результаты изучения вклада отдельных АО в формирование АОА сыворотки крови (раздел 1), представлялось целесообразным сравнить спектр ЖК крови у детей разного возраста. Показано, что в плазме крови здоровых доношенных новорожденных детей выше уровень длинноцепочечных ПНЖК: ДГЛК (20:3), АК (20:4) и ДГК (22:6), а в мембранах эритроцитов – АК (20:4) и ДПК (22:5) по сравнению с их уровнем в плазме крови и мембранах эритроцитов подростков и беременных женщин. В то же время уровень АК и ДПК в крови у подростков, для которых характерен ростовой скачок, был выше по сравнению с беременными женщинами. Эти данные согласуются с нашим предположением о важной роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови.
В то же время, выдвинутое нами предположение о существенном значении АО фермента PON-1 для возрастной динамики АОА крови, не нашло, в отличие от ДЦ ПНЖК, своего подтверждения, поскольку средний уровень PON-1 в крови подростков (11,0±3,4 ммоль/л) был в 6 раз выше, чем в пуповинной крови (1,9±0,4 ммоль/л;
p=0,036).
4.2. Изучение АОА хроматографических фракций сыворотки крови детей.
Изучение распределения АОА в хроматографических фракциях сыворотки крови взрослых и детей, полученных с использованием колонки «Superose 6», показало (рис.8), что АОА сыворотки крови детей характеризовалась одним пиком с максимальной АОА, соответствующим фракции №13, и отсутствием дополнительного пика, соответствовавшего 16 фракции у взрослых.
Рис. 8. АОА фракций, полученных при хроматографическом разделении сыворотки крови детей на колонке с “Superose 6”.
1 – профиль элюции белков при 280 нм;
2 – профиль АОА, определенной в системе с ЖЛП Определение содержания ТФ и ЦП во фракциях сыворотки крови детей выявило присутствие этих белков в 15 и 16 фракциях (ТФ) и в 14, 15 и 16 (ЦП), но не в 13 фракции.
При этом содержание указанных белков в сыворотке крови детей было ниже, чем в сыворотке крови взрослых (табл. 5), особенно в случае ТФ.
Таблица 5.
Содержание трансферрина и церулоплазмина в сыворотке крови условно здоровых детей и взрослых.
Белки Взрослые в возрасте 20-40 Дети первого года жизни, лет, М±SD М±SD Трансферрин, мг/дл 231,6±54,0 132,7±34,3* Церулоплазмин, мг/дл 45,4±5,4 39,0±10, *-отличие достоверно по сравнению с уровнем ТФ в крови у взрослых, р0,001.
Учитывая важную роль, которую играет у новорожденных детей -фетопротеин (АФП), выполняющий роль переносчика ПНЖК в крови (вместо альбумина у взрослых людей), исследовали содержание АФП в хроматографических фракциях пуповинной крови с помощью иммуноферментного анализа. Проведенные исследования показали, однако, что этот белок содержится во фракциях среднемолекулярных белков (около 67 кДа) совместно с ТФ, ЦП и альбумином (фракции № 14-16) и не содержится в высокомолекулярных фракциях, обладающих максимальной АОА.
Таким образом, АОА крови детей определяется высокомолекулярным ЛП компонентом сыворотки крови, содержащим ПНЖК 6 и 3 семейства. В то же время, такие важные антиоксиданты сыворотки крови как ТФ и ЦП, присутствуют в крови в существенно меньшей концентрации, чем у взрослых, что согласуется с литературными данными (Berger, 1995), и не участвуют в формировании АОА у детей.
5. Изучение АОА и клеточной пролиферации у экспериментальных животных в зависимости от возраста.
Рост обусловлен увеличением количества и размера клеток и ростом органов и тканей, в основе которых лежит изменение соотношения скоростей клеточной пролиферации и дифференцировки. Одним из механизмов их регуляции может, по-видимому, служить изменение баланса между прооксидантами и АОС организма. Показано, в частности, что для вступления клетки в митотический цикл и его быстрого завершения необходима высокая АОА липидов клетки (Алесенко, Бурлакова и др., 1967).
В связи с этим нами была изучена возможная зависимость показателей клеточного роста животных: объема клеточной массы и скорости пролиферации - от АОА сыворотки крови. Опыты были проведены на 30 белых крысах Вистар обоего пола в возрасте 0,5;
6;
11 и 24 недели. Исследовали* процессы клеточной пролиферации и апоптоза (рис. 9) в клетках тимуса, для которого характерна высокая скорость этих процессов, и в печени крыс, в сопоставлении с суммарной АОА их сыворотки крови и уровнем МДА в крови в различные возрастные периоды.
Проведенные исследования показали (табл. 6, рис. 10), что максимальные значения АОА крови наблюдались у новорожденных животных на 3-4 день жизни. Более поздние возрастные периоды характеризовались существенно меньшей (в 6-9 раз) АОА. Эти данные совпадают с данными о возрастной динамике АОА, полученными нами у детей (раздел 4.1).
Высокий уровень АОА совпадает, следовательно, с максимальной скоростью роста как у детей, так и у экспериментальных животных. В отличие от АОА, уровень одного из показателей процессов ПОЛ - МДА характеризовался большим разбросом значений и не имел такой четко выраженной возрастной динамики (табл. 6).
Изучение клеточных популяций печени и тимуса крыс с помощью проточной цитометрии показало (рис. 10, табл. 6), что число клеток на 1 грамм ткани в печени (рис.
10Д) и тимусе, так же, как и АОА, было максимальным у новорожденных животных, снижалось с возрастом и коррелировало с АОА (r =0,387, p0,05, n=30 и r = 0,568, p0,01, n=30 для печени и тимуса, соответственно). Динамика доли лимфоцитов и гепатоцитов в печени (табл. 6, Рис. 10 Б, В) была сходной с динамикой общего числа клеток в печени и также коррелировала с АОА (r = 0,815, p0,001, n=30 и r = 0,485, p0,01, n=30 для лимфоцитов и гепатоцитов печени, соответственно).
Скорость клеточной пролиферации (относительная доля делящихся клеток) в обоих изученных органах была максимальной у новорожденных животных, снижалась с возрастом, причем уменьшение числа делящихся клеток было намного более выраженным в тимусе, чем в печени, и коррелировала с АОА (r = 0,789, p0,001, n=30), что соответствует более высокой скорости деления лимфоцитов (табл. 6, рис. 10Г). В отличие от показателей клеточной пролиферации, количество клеток в апоптозе в тимусе с возрастом существенно не изменялось. В то же время в печени доля клеток в апоптозе имела сходную с АОА динамику (r =0,531, p0,01, n=30), что подтверждает известный факт тканевой специфичности процессов апоптоза. Динамика изменений других изученных показателей (относительное число тимоцитов по отношению к клеткам стромы тимуса и среднее геометрическое (G mean) флюоресценции делящихся клеток в тимусе) также была сходной с возрастной динамикой АОА.
Таким образом, наиболее высокая достоверная корреляция выявлена между АОА * - совместно с канд. мед. наук Мартыновой Е.А.
Рисунок 9. Пример распределения клеток в образце печени крыс при исследовании на проточном цитометре. Каждый гейт окрашен в собственный цвет и соответствует отдельной популяции клеток гепатоциты лимфоциты моноциты / макрофаги фибробласты, эпителий и т.д.
гепатоциты делящиеся Таблица 6. Уровень АОА, МДА в сыворотке крови и характеристика клеточных популяций печени и тимуса крыс в зависимости от возраста.
Печень Тимус % % Возраст, АОА, МДА, % % Клеток % Gmean % клеток Gmean нмоль/мл Клеток х10 / деля- клеток х108/г недели усл.ед. гепато- лимфо- делящихся делящихся в апо- апо г ткани щихся в апо цитов) цитов ткани клеток клеток птозе птоза клеток птозе 22,0±10,5 0,4±0, 0,5 (4,9±2,4) 3,5±0,8 26,3±2,3 14,4±4,7 6,2±2,4 5,7±1,5 50,4±9,1 159±147,4 1,2 ±1,1 7,4±3, 4,2±1,0a 1,0±0,0a 8,2±1,9a 11,2±2,4 3,8±0,62 13,6±2,2a a 0,2±0, 6 (4,13±0,56) 5,9±1,3 83,8±20,4 0,9 ±0,2 7,6±1, 2,4±0,5a,b (2,53±0,82)a,b 1,1±0,2a 8,9±1,7a 11,9±1,7 3,2±1,2a 16,1±5,7a 0,3±0, 11 4,6±2,0 72,1±10,8 1,0±0,4 6,4±1, 3,6±0,9a,c (1,75±0,47)a,b,c 3,1±0,7b,c 6,9±3,0a 7,4±2,6a,b,c 3,3±1,64a 9,5±4,0a,b,c 1,8±0,7b,c 0,4±0, 26 4,4±2,8 84,4±22,1 6,4±1, a –различия достоверны по сравнению с возрастом 0,5 недели, р0,05;
b – различия достоверны по сравнению с возрастом 6 недель, р0,05;
c – различия достоверны по сравнению с возрастом 11 недель, р0,05. Gmean – среднее геометрическое флюоресценции Г А Д Б Е В Рисунок 10. Возрастная динамика АОА сыворотки крови (А), относительного числа лимфоцитов (Б) и гепатоцитов (В), делящихся клеток (Г), удельного числа клеток (Д) и клеток в апоптозе в печени крыс (Е) (по данным проточной цитометрии).
сыворотки крови и количеством быстро делящихся клеточных популяций – лимфоцитов печени и делящихся клеток тимуса, которые были максимальны в раннем возрастном периоде, характеризующемся и максимальной скоростью роста. Можно предположить, поэтому, что высокая АОА может играть регуляторную роль в стимулировании процессов пролиферации и смещении равновесия в сторону их преобладания над процессами апоптоза.
Это предположение согласуется с давно выдвинутой концепцией, указывающей на роль ПОЛ в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки (Бурлакова Е.Б., 1967, Скулачев В.П., 2000).
В предыдущих разделах была показана роль ПНЖК в формировании АОА крови. В то же время, эти соединения являются основным субстратом ПОЛ. Таким образом, -3 ПНЖК, с одной стороны, выступают в качестве субстратов ПОЛ, с другой стороны, участвуют в формировании АО потенциала. Более того, сложные метаболические взаимоотношения, в которых участвуют -3 ПНЖК, дополняются еще одной группой метаболических реакций:
ПНЖК являются предшественниками различных классов эйкоза- и докозаноидов, причем их образование включает в качестве промежуточных метаболитов продукты ПОЛ.
Многообразие путей как превращения ПНЖК, так и путей образования и превращения различных видов ЛТ, позволяет предполагать возможность их реципрокных взаимоотношений, вытекающих из факта единого источника этих метаболических путей – пула -3 и -6 ПНЖК, образующихся в результате их поступления с пищей и освобождения из тканевых депо. Несмотря на всю очевидность данных представлений, эта гипотеза не была рассмотрена ранее в литературе. В связи с этим в работе была проведена оценка данной гипотезы, включающая исследование спектра ЛТ с параллельной оценкой одного из показателей ПОЛ – МДА и АОА крови у условно здоровых детей, детей с бронхиальной астмой (БА) и ожирением.
6. Изучение спектра лейкотриенов, образуемых лейкоцитами, АОА и ПОЛ в крови у детей в норме и при патологии.
6.1. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у условно здоровых детей.
Обследование условно здоровых детей в возрасте от 5 до 16 лет, поступивших на плановые хирургические вмешательства по поводу заболеваний, не сопровождавшихся воспалительной реакцией и не менявших общее состояние и самочувствие больных, позволило впервые установить, что у условно здоровых детей дошкольного и школьного возраста лейкоциты способны к продукции ЛТ и 4-й, и 5-й серии, причем основным видом ЛТ является производное ЭПК - ЛТД5, количество которого превышает уровень всех других изученных нами видов ЛТ (рис. 11). Этот факт согласуется с обнаруженным нами высоким содержанием -3 ПНЖК и, в особенности ЭПК, в мембранах лейкоцитов условно здоровых детей (см. раздел 7). В то же время в лейкоцитах условно здоровых детей практически отсутствовало образование ЛТЕ4, который образуется из ЛТД4, производного сульфидопептидного ЛТС4. Поскольку образование ЛТС4 у здоровых детей невелико, уровень его «дочерних» сульфидопептидных ЛТ – ЛТД4 и ЛТЕ4 также низкий, а баланс ЛТВ - ЛТС4 сдвинут в сторону образования ЛТВ4.
Рис. 11. Образование лейкотриенов лейкоцитами периферической крови условно здоровых детей, нг/107 лейкоцитов, M±m.
4, 4, 3, нг/10 лейкоцитов 3, 2, 2, 1, 1, 0, 0, В4 С4 D4 Е4 В5 D лейкотриены Содержание МДА в крови у условно здоровых детей было 1,13±0,28 нмоль/мл (n=19), а суммарная АОА - 1,68±0,57 отн.ед. (n=32).
6.2. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у детей в условиях детского клинического санатория.
В ходе двойного слепого рандомизированного, плацебо контролируемого исследования у 47 детей 7-14 лет, получавших в течение 2 месяцев стандартный рацион санатория с неоптимальным содержанием -3 ПНЖК или тот же рацион, обогащенный -3 ПНЖК в составе рыбьего жира, проводилось изучение спектра и уровня ЛТ, МДА и АОА.
У всех наблюдавшихся детей до начала исследования было выявлено сниженное образование МДА по сравнению с условно здоровыми детьми данного возраста (0,40 против 1,13 нмоль/мл, соответственно), что позволило предположить существование у них дефицита ПНЖК и, в особенности, -3 семейства. В связи с этим дети были разделены на 2 группы, одна из которых (основная, n=26) получала ежедневно по 3 капсулы с рыбьим жиром («Биафишенол рыбий жир для детей» производитель ООО «Дель Риос», свидетельство о государственной регистрации №77.99.23.3.У.2822.3.05 от 13.04.2005), содержащим 0,23 г - ПНЖК, в т.ч. 0,16 г ЭПК+ДГК, и 1,17 мг витамина Е, что составляло 10-12% от - совместно с к.м.н. Коростелевой М.М. и к.м.н. Елезовой Л.И.
физиологической потребности детей 7-14 лет (МР 2.3.1.2432-08). Дети второй группы (сравнения, n=21) получали плацебо – капсулы с подсолнечным маслом (-6 ПНЖК – 0,32 г;
ЭПК+ДГК – 0 г).
Установлено (рис. 12), что продукция противовоспалительного ЛTD5 в основной группе детей, принимавших -3 ПНЖК в составе рыбьего жира, возросла на 88% (с 1,21±0,47 до 2,28±0,56 нг/107лейкоцитов), а в группе сравнения – снизилась на 42% (с 2,24±0,66 до 1,30±0,31 нг/107лейкоцитов). Изменения в продукции провоспалительного ЛTD носили противоположный характер: в основной группе она снижалась на 84% (с 3,06±2,38 до 0,52±0,29 нг/107лейкоцитов), а в группе сравнения – возрастала на 120% (с 1,11±0,61 до 2,45±1,86 нг/107лейкоцитов).
Рис. 12. Динамика образования ЛТ лейкоцитами у детей в основной группе и группе сравнения, в % от исходного уровня.
основная группа группа сравнения - -50 - - -68 - - - - LTB5 LTD5 LTB4 LTC4 LTD Продукция ЛTВ5 снижалась в 4 раза в основной группе (с 0,93±0,37 до 0,24±0,12 нг/107лей) и возрастала в группе сравнения (с 1,88±0,84 до 2,54±1,7 нг/107лей). Образование ЛTВ4 и ЛTС снижалось в обеих группах. Полученные данные подтверждают предположение о реципрокных отношениях между различными видами и сериями ЛТ, происходящими из единого пула их предшественников – ПНЖК. При этом прием рыбьего жира изменял спектр ЛТ у детей основной группы, приближая их к спектру и уровню, наблюдаемому у здоровых детей.
Уровень МДА в сыворотке крови у детей основной группы к концу исследования практически не менялся (0,43+0,13 и 0,42+0,09 нмоль/мл в начале и конце исследования, соответственно) на фоне тенденции к увеличению АОА (с 2,12±0,09 до 2,23±0,12 отн.ед.).
Напротив, в группе сравнения содержание МДА в сыворотке крови увеличилось на 18% от исходного уровня (с 0,34±0,05 до 0,40±0,08 нмоль/мл), а АОА уменьшилась на 4% (с 2,13±0,09 до 2,04±0,08 отн. ед).
Сопоставление данных о продукции ЛТ и скорости ПОЛ не выявило реципрокных отношений между уровнем ПОЛ и образованием ЛТ у обследованных детей. В то же время полученные данные говорят о том, что такие отношения существуют между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и ЛТ различных видов (В, С, Д и др.). Так, при увеличении образования ЛТД5 снижается образование ЛТД4. При снижении уровня сульфидопептидного ЛТС наблюдается рост несульфидопептидного ЛТВ4.
Таким образом, при умеренной стимуляции синтеза ЛТ в организме обследованных детей под влиянием рыбьего жира реципрокные отношения между ПОЛ и образованием ЛТ выявлены не были. Представляло интерес исследовать эти отношения в условиях резкого усиления синтеза ЛТ, что имеет место при воспалительных заболеваниях таких, как БА и ожирение.
6.3. Изучение спектра ЛТ, уровня МДА и АОА в крови у детей с бронхиальной астмой.
Обследовали 71 ребенка 7-12 лет с БА различной степени тяжести, находившихся на лечении в МНИИ педиатрии и детской хирургии, и их 8 условно здоровых сверстников.
Дети с тяжелой формой БА получали в качестве стандартной базисной терапии ингаляционные кортикостероиды (ИКС), со среднетяжелой формой – кромогликаты. Дети с легкой формой БА не получали никакой лекарственной терапии. Показано (рис. 13), что БА вела к значительному нарастанию продукции всех видов ЛТ при преимущественном увеличении уровня провоспалительных метаболитов АК -6 семейства – сульфидопептидных ЛТ и, особенно, ЛТС4 и ЛТЕ4 (р=0,018).
Рис. 13. Уровень ЛТ у больных БА (n=71) в сравнении с условно здоровыми детьми (n=8).
# нг больные БА здоровые ЛТВ4 ЛТС4 ЛТD4 ЛТЕ4 ЛТВ5 ЛТD5 CDE лейкотриены # - отличия достоверны по сравнению с группой условно здоровых детей, р=0,018.
Параллельное изучение АОА крови (таблица 7) выявило снижение суммарной АОА у детей с легкой БА, не получавших медикаментозного лечения. Напротив, АОА при средне - совместно с д.м.н. Погомий Н.Н. и к.м.н. Комаровой О.Н.
тяжелой форме заболевания увеличена. Последнее может быть связано с положительными сдвигами в ЖК составе клеточных мембран у больных БА под влиянием мембраностабилизирующего действия кромогликатов, препятствующего усилению ПОЛ.
Таблица 7.
Уровень МДА и АОА в сыворотке крови детей больных БА и здоровых детей.
Здоровые Легкая БА Средне-тяжелая Тяжелая БА (n=19) (n=14) БА (n=17) (n=36) АОА, усл.ед. 1,68±0,57 1,05±0,23* 2,94± 1,9* 1,9±0, МДА, нмоль/мл 1,13±0,28 0,55±0,54** 0,47±0,63** 0,47±0,6** * - отличия достоверны по сравнению со здоровыми детьми (с легкой р=0,0006, со средне-тяжелой p=0,02) ** - отличия достоверны по сравнению с группой здоровых детей (с легкой БА р=0,005, со средне тяжелой БА р=0,002, с тяжелой БА p=0,0001) В то же время, у детей с БА выявлено (таблица 7) достоверное снижение уровня МДА в крови при всех формах БА, что может быть отражением реципрокных отношений между метаболизмом ПНЖК по липоксигеназному и перекисному пути.
Можно полагать, что полученные данные о снижении уровня МДА следует рассматривать не как доказательство отсутствия вклада неконтролируемого СРО в развитие БА, а как свидетельство исчерпания запасов ПНЖК (АК, ДГЛК, ДГК) как субстратов ПОЛ, связанного с их расходом на синтез ЛТ, образующихся на развернутом этапе течения БА.
Для подтверждения предлагаемой гипотезы представляло интерес оценить возможное влияние дополнительного включения в рацион питания детей с БА -3 ПНЖК в виде льняного масла, богатого -линоленовой кислотой. Льняное масло (ЗАО «РеалКапс», Россия, свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2308.3.06 от 16.03.2006) было назначено 8 детям как дополнение к базисной терапии (кромогликатами или ИКС) и 8 детям без базисной терапии. 10 мл масла, содержащего 3,9 г -линоленовой кислоты и 1,08 мг витамина Е, что составляло 9-10% от физиологических потребностей детей 7-12 лет (МР 2.3.1.2432-08) вводили в рацион 6 недель. Группу сравнения составили 5 детей с тяжелой БА, в межприступном периоде, длительно получающих ИКС и не получавших льняное масло.
Показано (рис. 14), что под влиянием ИКС содержание в крови ЛТВ4 уменьшалось, а ЛТВ5 – увеличивалось, однако, в ряду сульфидопептидных ЛТ увеличивалось содержание ЛТС4, обладающего сильными бронхоконстрикторными свойствами, и снижалось содержание противовоспалительного ЛТД5.
Прием льняного масла (рис. 15) приводил к увеличению образования ЛТ 5 серии – ЛТВ5 и, особенно, ЛТД5. При этом соотношение ЛТВ4: ЛТВ5 уменьшалось. В то же время наблюдалось снижение образования ЛТВ4 и ЛТС4, сопряженное с увеличением уровня менее активных продуктов – ЛТД4 и ЛТЕ4.
Рис. 14. Влияние ИКС на уровень ЛТ у детей с БА.
Уровень лейкотриенов у больных БА, контроль, n=5.
нг до после ЛТВ4 ЛТС4 ЛТD4 ЛТЕ4 ЛТВ5 ЛТD лейкотрие ны Рис. 15. Влияние льняного масла на уровень ЛТ у детей с БА.
Уровень лейкотриенов у детей с БА, получающих льняное масло, n=6.
нг 15 до 10 после ЛТВ4 ЛТС4 ЛТD4 ЛТЕ4 ЛТВ5 ЛТD лейкотриены Вместе с тем, прием льняного масла вызывал тенденцию к нормализации уровня ПОЛ и увеличению АОА, в отличие от детей с БА, получавших только базисную терапию, у которых ПОЛ продолжало снижаться, а АОА увеличивалась в меньшей степени, чем при дополнительном приеме льняного масла (табл. 8).
Таблица 8. Влияние льняного масла и базисной терапии на показатели ПОЛ и АОА сыворотки крови детей с БА, M±SD Показатели Терапия В начале исследования В конце исследования Льняное масло 0,72 ± 0,84 1,14 ± 1, МДА, нмоль/мл Базисная терапия 0,29 ± 0,19 0,15 ± 0, Льняное масло 2,06 ± 0,47 2,59 ± 1, АОА, усл. ед.
Базисная терапия 2,16 ± 0,57 2,36 ± 2, Таким образом, проведенные комплексные исследования позволили получить данные, свидетельствующие о сложном характере изменений в метаболизме ПНЖК при БА у детей и, в частности, нарастании продукции всех ЛТ, особенно С4 и Е4, сопряженного с уменьшением образования МДА, одним из основных предшественников которого является АК, расходуемая при БА на образование ЛТС4 и Е4.
Дополнительное введение в рацион больных БА льняного масла как источника - ПНЖК увеличивало уровень МДА до его уровня в контрольной группе детей, снижало уровень ЛТ С4 и В4 и увеличивало ЛТ Д5 и В5. Это подтверждает наше предположение о реципрокных отношениях между процессами ПОЛ и образованием провоспалительных ЛТ 4-й серии.
6.4. Изучение спектра ЛТ, ПОЛ и АОА крови у детей с ожирением.
Обследовано 52 ребенка в возрасте 12-17 лет с ожирением I-III степени* и 9 условно здоровых детей.
Выявлено достоверное увеличение (по сравнению с условно здоровыми детьми) уровня провоспалительных ЛТ 4-й серии, в особенности, ЛТD4, а также ЛТЕ4, небольшое, но достоверное снижение уровня ЛТВ4 и отсутствие отличий в уровне ЛТС4 и В5 у условно здоровых детей и детей с ожирением. Ни у одного больного ожирением не выявлен ЛТD5 преобладающий вид ЛТ у здоровых детей.
У детей с ожирением выявлено также снижение на 38% по сравнению с условно здоровыми детьми образования МДА в сыворотке крови. Суммарная АОА сыворотки крови при этом также имела тенденцию к снижению (до 1,85±0,08 отн.ед. против 2,11 ±0,23 отн.ед.
у условно здоровых детей).
Полученные данные, указывающие на снижение у детей с ожирением ПОЛ в сочетании с увеличением образования провоспалительных лейкотриенов 4-й серии, согласуются с результатами, полученными у детей с БА, и, тем самым, подтверждают гипотезу о реципрокности двух путей метаболизма ПНЖК: ПОЛ и образование ЛТ.
Учитывая, что ПНЖК являются также компонентами биологических мембран, можно предположить, что изменения в продукции ЛТ и МДА отражаются и на уровне ПНЖК в клеточных мембранах. В связи с этим было проведено изучение спектра ЖК мембран клеток крови в условиях резкого увеличения продукции ЛТ, характерного для различных видов воспаления.
7. Изучение спектра жирных кислот мембран клеток крови при воспалительных заболеваниях у детей.
Изучен состав жирных кислот мембран клеток крови (эритроцитов и лейкоцитов) детей с двумя типами воспалительных реакций: воспалительными заболеваниями желудочно * - совместно с д.м.н. Строковой Т.В. и к.м.н. Сурковым А.Г.
кишечного тракта (ВЗЖКТ) (эзофагитами, гастродуоденитами, язвенной болезнью желудка), возникающими под воздействием инфекционных, механических или химических факторов и относящихся к преимущественно нормергической альтеративно-экссудативной форме воспаления, сопровождающейся болевой и температурной реакцией;
и аллергическим воспалением, лежащим в основе БА, инициируемым реакцией антиген-антитело, носящим гиперергический характер и сопровождающимся обструкцией бронхов, серозной экссудацией, отеком тканей бронхиального дерева при отсутствии болевого синдрома и лихорадки.
Обследовано* 57 детей 7 - 14 лет, из них 13 детей с ВЗЖКТ и 25 детей с ВЗЖКТ с сопутствующим ожирением I-III степени;
9 детей с БА в межприступном периоде заболевания и 10 условно здоровых детей, поступивших на плановые хирургические вмешательства по поводу заболеваний, не сопровождавшихся воспалительной реакцией и не менявших общее состояние и самочувствие больных.
Установлено, что в мембранах эритроцитов (МЭ) детей с ВЗЖКТ резко и достоверно снижается уровень -6 ПНЖК - линолевой (18:2), АК (20:4) и ее предшественницы - ДГЛК (20:3) (рис. 16 А). При этом наблюдались полярные изменения уровня -3 ПНЖК - резкое увеличение содержания в МЭ ЭПК (20:5) и -линоленовой (18:3) кислоты, что вело к повышению суммарного содержания в МЭ -3 ПНЖК. Однако одновременно имело место снижение содержания в МЭ ДГК (22:6 -3). Это вело к резкому повышению отношения ЭПК/ДГК (с 1,5 у здоровых до 12,6 у больных детей). В результате отмеченных изменений в уровне -6 и -3 ПНЖК соотношение ПНЖК -6 и -3 в МЭ у детей с ВЗЖКТ резко (в 3, раза) снизилось по сравнению с условно здоровыми детьми, и составило у них 0,7 против 2, у условно здоровых детей. Одновременно в МЭ существенно снижался коэффициент эффективности метаболизации (КЭМ) (0,21 – у больных против 1,2 – у здоровых) и незначительно уменьшался индекс ненасыщенности (1,15 – при воспалении, 1,3 – у здоровых детей). Изменение этих индексов указывает на изменение физико-химических характеристик мембран и позволяет предполагать снижение их текучести вследствие снижения ненасыщенности ЖК, входящих в состав мембран, и уменьшения содержания ДЦ ПНЖК - АК и ДГК.
Таким образом, ВЗЖКТ сопровождаются значительным изменением жирнокислотного состава МЭ, которое, возможно, связано с увеличением образования в мембранах из АК * - совместно с д.м.н. Дубровской М.И., к.м.н. Комаровой О.Н., к.м.н. Пустограевым Н.Н.
- КЭМ=20:4/20:2+20:3+20:5+22:5+22:6 [Левачев М.М. и др., 1967];
- индекс ненасыщенности – отношение суммы ненасыщенных жирных кислот к сумме насыщенных жирных кислот провоспалительных эйкозаноидов и нарушением превращения ЭПК в ДГК.
Сходные, но менее выраженные изменения в спектре ЖК МЭ наблюдались при ВЗЖКТ с сопутствующим ожирением (рис. 16 А).
Рис. 16 А.
Уровень ДЦ ПНЖК в МЭ у детей с ВЗЖКТ и ВЗЖКТ с сопутствующим ожирением, % от суммы ЖК МЭ, M±SD Здоровые ВЗЖКТ+ожирение % от суммы жирных ВЗЖКТ * * * кислот МЭ * * * ** ** ДГЛК АК ЭПК ДГК 3 Виды жирных кислот Исследование содержания ЖК в мембранах другого класса клеток – лейкоцитов у детей с иным типом воспалительной реакции - аллергическим воспалением, имеющим место при БА, показало (рис. 16 Б), что хроническое аллергическое воспаление также сопровождалось значительным и достоверным увеличением уровня ЭПК в мембранах лейкоцитов (МЛ), сопровождавшемся тенденцией к накоплению -линоленовой кислоты и суммы -3 ПНЖК и Рис. 16 Б.
Уровень ДЦ ПНЖК в МЛ у детей с БА в сравнении с их уровнем у здоровых детей, % от суммы ЖК МЛ, M±SD % от суммы жирных 25 Здоровые * БА кислот МЛ ДГЛК АК ЭПК ДГК 3 Виды жирных кислот *- отличия достоверны по сравнению с условно здоровыми детьми, p0, тенденцией к снижению ДГК (22:6 -3) и ПНЖК 6 семейства.
При этом соотношение -6/-3 ПНЖК снижалось в 2 раза (до 0,39 у больных БА против 0,79 у здоровых детей), а отношение ЭПК/ДГК, напротив, резко возрастало (26, против 6,0). Это приводило к росту индекса ненасыщенности (1,23 – при БА, 0,72 – у здоровых детей). При этом КЭМ, так же как и в МЭ при ВЗЖКТ, значительно снижался (до 0,06 против 0,13 у здоровых детей). Таким образом, полученные результаты показывают, что и воспалительные заболевания ЖКТ, и хроническое аллергическое воспаление при БА, приводят к значительным и сходным изменениям состава ЖК клеточных мембран у детей – накоплению ЭПК и снижению уровня ДГК. Этот феномен был выявлен и в МЭ, и в МЛ, которые были избраны в качестве моделей клеток, существенно различающихся по своим функциональным и метаболическим особенностям. Однако, несмотря на существенные функциональные различия этих клеток, изменения, происходящие в их мембранах при воспалении, имели много общих признаков, к числу которых следует отнести накопление в мембранах ЭПК -3 семейства и снижение уровня ее длинноцепочечного производного ДГК (22:6 -3) с увеличением соотношения ЭПК/ДГК в 4-8 раз. Увеличение этого соотношения указывает, очевидно, на торможение метаболизации ЭПК в ее длинноцепочечные производные, что подтверждается накоплением в мембранах предшественника ЭПК – эссенциальной -линоленовой кислоты (18:3) 3 семейства. Рост в МЭ и МЛ уровня ЭПК и -линоленовой кислоты и резкое снижение, особенно в МЭ, уровня -6 ПНЖК приводили к увеличению в них суммы 3 ПНЖК и снижению отношения -6/-3. Выявленный у детей с ВЗЖКТ и БА феномен нарастания уровня ЭПК и снижения уровня ДГК в МЭ и МЛ не был описан ранее в литературе и требует дальнейшего изучения. Можно предполагать, что его причинами у детей могут быть: недостаточное поступление -6 ПНЖК в составе пищевых рационов;
усиленный расход АК на образование провоспалительных эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов);
недостаточность субстрата для фосфолипаз, элонгаз и десатураз, либо нарушение превращения ЭПК в ДГК вследствие возникновения ферментативного блока. В частности, в пользу справедливости гипотезы о тесной связи ЖК состава мембран и синтеза из ЖК эйкозаноидов говорят наши данные о снижении уровня -6 ПНЖК в МЛ и повышении образования провоспалительных эйкозаноидов при БА (раздел 6). Вместе с тем, накопление ЭПК в КМ при воспалении, по видимому, является причиной снижения образования из нее противоспалительных эйкозаноидов, в частности лейкотриена Д5, выявленного нами у детей с ожирением (см.
раздел 6), а снижение уровня ДГК – причиной снижения образования докозаноидов (резолвинов и протектинов), играющих важную роль при разрешающей фазе воспаления.
Выявленные изменения состава ЖК КМ при воспалении могут оказывать существенное влияние на свойства и функции этих мембран (Покровский А.А., 1972;
Левачев М.М. и др., 1976). Все эти факторы могут, очевидно, являться важными патогенетическими звеньями указанных заболеваний, требующими соответствующей алиментарной коррекции. С этой точки зрения, полученные результаты могут рассматриваться как указание на необходимость дальнейшего изучения вопроса об оптимальном соотношении в диетических рационах -3 и -6 ПНЖК как патогенетически обоснованном дополнительном подходе к терапии воспалительных заболеваний у детей.