Молекулярный механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой

На правах рукописи

CИЛЕЦКИЙ Сергей Алексеевич МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ГЕНЕРАЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА ЦИТОХРОМ с ОКСИДАЗОЙ 03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Официальные оппоненты:

Андреев Игорь Михайлович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН Звягильская Рената Александровна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биологического окисления Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Тихонов Александр Николаевич - доктор физико-математических наук, профессор, главный научный сотрудник каф. Биофизики Физического факультета МГУ им.

М.В.Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук.

Защита состоится “15” октября 2012 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан “ “ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, Медведева Марина Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работа посвящена выяснению молекулярного механизма преобразования энергии, осуществляемого в мембранных ферментах электрон-транспортных цепей митохондрий, бактерий и хлоропластов. В процессе дыхания энергия окислительно-восстановительных реакций трансформируется электрон транспортной цепью митохондрий и многих бактерий в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране (H+). Возникающая таким образом протон-движущая сила служит в клетке источником энергии в реакциях биохимического синтеза, мембранного транспорта, механического движения бактериальных клеток и т.д. В концевом участке дыхательных цепей аэробных организмов образование протон-движущей силы обеспечивается в результате работы терминальных оксидаз, катализирующих восстановление кислорода цитохромом c или хинолом. Основная подгруппа этих ферментов, включающая цитохромоксидазу (ЦО) из митохондрий, образует суперсемейство структурно-родственных гем-медных оксидаз.

Отличительной особенностью представителей суперсемейства является каталитический центр, который образован близко расположенными ионом железа гемовой группы и ионом меди (т.н. биядерный или бинуклеарный центр, BNC), и в котором непосредственно происходит восстановление молекулы кислорода с образованием двух молекул воды.

В ходе каталитического цикла, сопряженно с химической реакцией, ЦО образует H+ в результате двух процессов. Во-первых, электроны поступают в BNC ЦО от цитохрома с с внешней стороны мембраны (P-сторона), в то время как участвующие в восстановлении кислорода и образовании молекул воды протоны (т.н. “субстратные” или “химические” протоны) переносятся в BNC из внутренней водной фазы (N-сторона). Во вторых, цитохромоксидаза является редокс-зависимым протонным насосом и дополнительно переносит с N-стороны на P-сторону мембраны в среднем четыре протона (т.н. “помпируемые” протоны) на каждую восстановленную молекулу кислорода.

Таким образом, цитохромоксидаза представляет собой сложную и уникальную в своем роде молекулярную машину, осуществляющую сопряжение одноэлектронного окисления цитохрома с, 4-х электронного восстановления и протонирования молекулы кислорода с образованием воды и редокс-зависимого направленного трансмембранного переноса протонов. Сочетание этих процессов требует сложной организации и точной взаимной артикуляции перемещения зарядов (электронов и протонов) и превращения молекулы кислорода в ходе каталитического цикла. Отдельные одноэлектронные этапы восстановления кислорода в каталитическом цикле цитохромоксидазы сопряжены с набором частных реакций переноса электрона между редокс-центрами фермента и транслокации протонов в нем, происходящих в недоступном для быстрого смешивания временном диапазоне и потому практически неизученных с временным разрешением.

В последние годы для ряда цитохромоксидаз была получена трехмерная кристаллическая структура с атомным разрешением, что в сочетании с возможностями направленного мутагенеза и кинетических методов с необходимым временным разрешением предоставляет уникальную возможность для изучения механизма сопряжения энергии и внутрибелкового переноса протонов в данном ферментном комплексе. Выяснение молекулярного механизма редокс-сопряженного разделения зарядов в ЦО, динамики и траекторий внутрибелкового переноса протонов являются одними из наиболее важных и сложных задач биэнергетики, а также необходимой предпосылкой для установления общих закономерностей механизмов образования трансмембранного потенциала ферментами энерго-сопрягающих мембран.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выяснение молекулярного механизма сопряженного трансмембранного переноса зарядов (электронов и протонов) в цитохромоксидазе. Ставилась задача описать механику векторного переноса зарядов, разрешив во времени частные стадии электрогенного переноса электронов и протонов в цитохромоксидазе, составляющие суть отдельных одноэлектронных переходов в каталитическом цикле. Выяснить точную стехиометрию переноса помпируемых протонов в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла. Требовалось установить сопряженные электрон-транспортные стадии и конформационные изменения, контролирующие частные стадии транслокации протонов. Выявить внешние факторы, способные влиять на динамику проведения протонов в ЦО. Ставилась задача выяснить роль протон-проводящих путей в отдельных одноэлектронных переходах в каталитическом цикле ЦО. Локализовать траектории проведения протонов в цитохромоксидазе и выявить взаимную артикуляцию частных электрон и протон транспортных реакций внутри отдельного одноэлектронного перехода фермента.

Выяснить точную структуру каталитических интермедиатов ЦО, включая промежуточную локализацию протонов в кислород-редуктазном центре и в его окрестности. Выяснить структурно-функциональные особенности неканонических цитохромоксидаз, обусловливающие сниженную эффективность трансмембранной перекачки протонов.

Научная новизна работы. Впервые показано, что перенос на кислород 3 и электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы митохондрий (переходы PF и FO, соответственно) сопряжен с суммарным электрогенным переносом равного количества зарядов через мембрану. Впервые показано, что фотоиндуцированный электрон-донорными комплексами рутения переход PF цитохромоксидазы митохондрий включает две миллисекундные (“средняя” и “медленная”) компоненты генерации мембранного потенциала, отражающие электрогенный перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а биядерным центром фермента.

Впервые показано, что в фотоиндуцированных одноэлектронных переходах PF и FO цитохромоксидазы митохондрий, половина суммарной величины электрогенного перемещения протонов образуется в “средней” электрогенной фазе синхронно с редокс реакцией переноса электрона от гема а в BNC (с 0.3 м“ и 1.2 м“, соответственно).

Другая часть электрогенного переноса протонов в переходах PF и FO происходит в “медленной” электрогенной фазе (с 1.3 мс и 4.5 мс, соответственно), засчет сохранения части свободной энергии редокс-реакции в метастабильном состоянии фермента.

Впервые разрешена кинетика генерации мембранного потенциала прокариотической цитохромоксидазой aa3-типа из Rhodobacter sphaeroides. Показано сходство общей организации разрешенных ст=д,й "…32!,Kел*%"%г%.ле*2!%ге……%г% Cе!е…%“= зарядов представителями гем-медных терминальных оксидаз семейства А (митохондриальной цитохромоксидазой и цитохромоксидазой аа3, R.sphaeroides).

Впервые показано, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидазы aa3-типа из R.sphaeroides происходит через протон-проводящие D и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы. Впервые показано, что протонный D-канал обслуживает перенос помпируемых протонов, а также перенос субстратных протонов в окислительной полуреакции каталитического цикла (стадии PF, FO), в то время как K-канал участвует в переносе субстратных протонов в восстановительной полуреакции (при переносе в BNC первых двух электронов в каталитическом цикле).

Впервые показано, что FO переход ЦО c мутацией N139D, характеризующейся ингибированием протон-помпирующей функции, сопряжен с суммарной транслокацией через мембрану одного элементарного заряда. Дополнительный вклад электрогенного переноса протонов в ЦО дикого типа из R. sphaeroides и ЦО митохондрий соответствует трансмембранному переносу не более одного (~0.9) помпируемого протона в каждом из переходов PF и FO окислительной фазы каталитического цикла.

Впервые показано, что “средняя” электрогенная фаза в переходе FO ассоциирована с переносом помпируемого протона к внешней стороне мембраны, в то время как “медленная” электрогенная фаза связана с переносом субстратного протона из внутренней водной фазы к BNC. Впервые показано, что ионы цинка, ингибирующее стадии переноса протонов в ряде мембранных белков, тормозят “медленную” электрогенную фазу переноса протонов при добавлении к протеолипосомам с ЦО с внешней стороны мембраны.

Предложена модель организации двухстадийного электрогенного переноса протонов в переходе FO каталитического цикла цитохромоксидаз семейства А. Первая стадия включает в себя перемещение помпируемого протона из внутренней водной фазы, через консервативный остаток глутамата E286 в верхней части D-канала, к промежуточному акцептору протона над биядерным центром. Вторая стадия включает в себя высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, сопряженное с электрогенным перемещением субстратного протона с внутренней стороны мембраны к биядерному центру.

Впервые разрешены интермедиаты каталитического цикла представителя семейства B гем-медных терминальных оксидаз (цитохромоксидазы ba3 из Thermus thermophilus) в быстрой реакции с кислородом в режиме одного оборота. Выявлено отличие оксидаз семейств А и B в локализации внутреннего акцептора протона в кинетическом интермедиате, соответствующем состоянию F. В цитохромоксидазах семейства А перенос субстратного протона происходит непосредственно в биядерный центр (к связанному с CuB гидроксил-аниону), тогда как в цитохромоксидазе ba3 акцептор протона локализован вне биядерного центра.

Впервые показано, что причиной сниженной усредненной эффективности протонного насоса ba3 ЦО из T.thermophilus является отсутствие сопряженного трансмембранного переноса протона в ряде одноэлектронных стадий каталитического цикла. В тоже время другие одноэлектронные стадии сопряжены с трансмембранным переносом 1 протона также, как в цитохромоксидазах семейства А.

Установлено, что при восстановлении низкоспинового гема b каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и функционировании цитохромоксидазы и могут оказаться полезными при изучении других протон-транспортирующих белков. В частности, важно выяснение механизма внутрибелкового проведения протонов в ЦО для понимания работы белковых ионных насосов. Детальный анализ восстановления кислорода в ЦО и его связь с механизмом работы пероксидаз дают ценную информацию о ферментативном превращении кислорода, необходимую для расшифровки путей регуляции кислородного метаболизма в клетке и для создания кислородных биосенсоров.

Материалы работы используются в учебном процессе на факультете Биоинженерии и Биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ. Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике.

Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 9 ой, 12-ой, 14-ой, 15-ой и 16-й Европейских Биоэнергетических конференциях – EBEC (Лувен-ла-Нев, 1996;

Аркашон, 2002;

Москва, 2006;

Дублин, 2008;

Варшава, 2010), на 2 ом и 7-ом Европейских Биофизических конгрессах (Орлеан, 1997;

Генуя, 2009), на 26-м съезде Федерации Европейских биохимических обществ – FEBS (Ницца, 1999), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов – IUBMB (Бирмингем, 2000), Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул ECSBM (Сегед, 2003), конференции “Российская биоэнергетика: от молекул к клетке” (Москва, 2005), на 8-й Европейской конференции по Биологической химии Eurobic (Авиеро, Португалия, 2006), на V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), а также на ряде Гордоновских конференций по биоэнергетике. Работа была также апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ. Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых, премии Европейской академии для молодых ученых СНГ, премии им. А.Д.Каулена за лучшую работу молодых ученых МГУ НИИФХБ, премии Биохимического общества при Российской Академии Наук для молодых ученых России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 статей в рецензируемых журналах и 15 тезисов конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 180 страниц, рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 297 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Изоляция митохондриальной цитохромоксидазы. Цитохромоксидазу изолировали из митохондрий бычьей сердечной мышцы по методике [Fowler et al., 1962;

MacLennan & Tzagoloff, 1965].

Штаммы бактерий. Использовался штамм бактерий Rhodobacter sphaeroides (JS100), несущий делецию в гене cta D, кодирующем субьединицу I цитохромоксидазы.

Клетки данного штамма содержат плазмиду (pRK-415) с геном cta D, модифицированным добавлением последовательности из шести остатков гистидина [Mitchell & Gennis, 1995].

В результате С-конец субьединицы I цитохромоксидазы несет полигистиновую последовательность, что позволяет изолировать ЦО из мембран в одну стадию с помощью аффинной хроматографии (Ni-NTA агароза).

Выращивание клеток и получение мембран. Выращивание клеток штамма R.sphaeroides (JS100) проводилось аэробно, на модифицированной среде Систрем при 30C, как описано в [Hosler et al., 1992, Shaleigh et al., 1992]. В среде присутствовали антибиотики: стрептомицин (50 мкг/мл), спектиномицин (50 мкг/мл), а также канамицин (25 мкг/мл) или тетрациклин (1 мкг/мл). Собранные клетки ресуспендировали в 50 мМ Tрис (pH 8.0) и разрушали с помощью пресса Френча (в присутствии 50 мкг/мл ДНКазы 1). Остатки клеток удаляли центрифугированием (30000 g, 30 минут).

Очистка ЦО aa3–типа из R.sphaeroides. Препарат мембран гомогенизировали в 100 мМ KH2PO4 (pH 8.0), после чего инкубировали 30 минут (при 4С) в присутствии додецил-мальтозида (1%) и PMSF (ингибитор протеаз) при постоянном перемешивании.

После центрифугирования (75000 g, 35 минут, 4 С), к супернатанту добавляли имидазол (10 мМ) и Ni-NTA сефарозу (Quiagen). После инкубации (60 минут, 4С), смесь наносили на хроматогрфическую колонку и промывали не менее 15 объемами буфера (50 мМ KH2PO4, pH=8.0, 10-15 мM имидазол, 0.1% мальтозид). Цитохромоксидазу элюировали (~0.1 мл/мин) буфером с ~120 мM имидазола. Избыток имидазола удаляли гельфильтрацией по [Fry et al., 1978]. Препарат очищенного белка концентрировали до концентрации 50-100 мкМ с помощью фильтров Amicon.

Определение активности ЦО aa3–типа из R.sphaeroides. Активность ЦО из R.sphaeroides определялась спектрофотометрически по скорости окисления 30 мкМ цитохрома с в 50 мМ KH2PO4 (pH=6.5), в присутствии 0.02% лаурил мальтозида, при 25С.

Цитохромоксидаза ba3 из T.thermophilus была очищена согласно [Soulimane et al., 2002]. Дрожжевой цитохром с, модифицированный по остатку cys-102 трис-бипиридил рутениевым комплексом, был предоставлен Ф.Миллетом (Арканзасский университет, США).

Встраивание цитохромоксидазы в протеолипосомы. Для встраивания цитохромоксидазы в протеолипосомы использовались два метода: Ракера [Racker, 1972] и Риго [Rigaud et al., 1995]. Суспензию азолектина (40-60 мг/мл) в 2% растворе холата натрия в буфере (50 мМ HEPES либо KH2PO4, pH=7.5, 2 мM MgSO4), озвученную в присутствии аргона в ледяной бане до просветления с помощью ультразвукового дезинтегратора (0.4А, 22 кГц), смешивали с ЦО до концентрации 4-6 мкМ (метод Ракера) либо 6-9 мкМ (метод Риго). Для удаления детергента cогласно [Racker, 1972], суспензию диализовали два раза по 3 часа против 200 объемов и, в течение ночи, против 500 объемов буфера, не содержащего детергент. После диализа липосомы осаждали центрифугированием (Ti-50, 48000 об/мин, 4C, 1 час). Ресуспендированный осадок протеолипосом использовали для приклеивания к плоской мембране. Для удаления детергента по методу [Rigaud et al., 1995], в суспензию протеолипосом вносили гранулы SM2 Bio-Beads (“Bio-Rad”, 30 мг гранул сырого веса/мл) при постоянном перемешивании, в течении 6 часов с интервалом 0.5-1 час, согласно [Verkhovskaya et al. 1997, Jasaitis et al.

1999]. Содержащую протеолипосомы жидкую фазу отделяли от гранул Bio-Beads, разделяли на порции и замораживали в жидком азоте.

Электрометрические измерения. Быструю кинетику образования разности потенциалов цитохромоксидазой на мембране протеолипосом регистрировали методом емкостной потенциометрии с разрешением 100 нс [Drachev et al., 1979, Drachev et al., 1989], адаптированным для измерений на протеолипосомах ЦО из митохондрий и бактерий [Zaslavsky et al., 1993, Siletsky et al., 1996, Verkhovsky et al., 1997, Siletsky et al., 1999]. На отверстие диаметром 4 мм, разделяющее 2 отсека тефлоновой ячейки, наносили коллодиевую пленку, смоченную в растворе фосфолипида в декане (99% лецитин, мг/мл;

стеариламин, 1 мг/мл). В один из отсеков ячейки, заполненной буфером (10 мМ HEPES-KOH, рН 7.4), вносили протеолипосомы с ЦО и инкубировали 3-5 часов при перемешивании в присутствии 30 мМ MgSO4. Разность потенциалов между отсеками регистрировали при помощи светозащищенных Ag/AgCl электродов, после замены буфера в отсеках на среду измерений (5 мМ Трис/ацетат, рН 8.1, 10 мМ анилин). Сигнал поступал в операционный усилитель (Burr-Brown), после чего заводился в компьютер через аналого-цифровой преобразователь фирмы DATALAB (Англия) или Datascope (США).

Для одноэлектронной инъекции в субмикросекундном временном диапазоне использовалось фотовосстановление цитохромоксидазы комплексом трис(2,2’бипиридил)рутений(II)хлорид (Rubpy) [Nillson, 1992]. Фотовозбуждение Rubpy достигалось при помощи импульсного лазера (NdYAG;

532 нм, 15 нс, 40-100 мДж). В условиях низкой ионной силы, возбужденный Rubpy(II)* восстанавливает входной редокс-центр ЦО, CuA, в субмикросекундной временной шкале. Окисленный Rubpy(III) ревосстанавливался анилином. Для перевода фермента в соединение P, через липосомный отсек электрометрической ячейки в течение 1 минуты продували окись углерода [Nicholls & Channady, 1981]. Для субмикросекундной инициации быстрой реакции окисления молекулярным кислородом восстановленной цитохромоксидазы в режиме одного оборота использовался метод “флоу-флэш” [Gibson et al., 1963]. При анаэробной инкубации в присутствии окиси углерода цитохромоксидаза образует комплекс гема а32+ c CO.

Кислород вносится в систему с помощью быстрого смешивания, чтобы недопустить спонтанного вытеснения кислородом окиси углерода. Оксидазная реакция запускается фотолизом комплекса гем а32+-CO (NdYAG;

532 нм, 15 нс, 40 мДж), в результате чего молекула кислорода связывается с гемом а3 и восстанавливается электронами, присутствующими в ферменте, в режиме одного оборота.

Разрешенные во времени спектрофотометрические измерения при одиночной длине волны. Быстрая кинетика спектральных изменений гемовых центров ЦО, в ответ на инъекцию электрона с помощью Rubpy, регистрировалась методом “флэш-фотолиза”.

Световой поток от галогеновой лампы (70-100 вт) попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора Jobin Yvon с шириной щели 2-8 мм. Пройдя через помещенный в микрокювету (33 мм либо 44 мм) образец, световой поток поступал через призменный монохроматор в ФЭУ. После аналого-цифрового преобразования (DATALAB, Англия;

Datascope, США) сигнал заводился на компьютер.

Фотовозбуждение Rubpy достигалось при помощи импульсного лазера (NdYAG, Quantel либо Spectraphysics;

532 нм, 15 нс, 40-300 мДж). Возбуждающий свет подавался в кюветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света, перпендикулярно последнему. Для уменьшения ионной силы, перед измерением c Rubpy препарат изолированной цитохромоксидазы переводили в деионизованный буфер с помощью гель-фильтрации [Fry et al., 1978]. В некоторых случаях, вместо Rubpy, использовалось производное двухядерного рутениевого комплекса Ru2C [Siletsky et al.

2006], характеризующееся более высокой эффективностью фотовозбуждения.

Регистрация спектральных изменений ЦО c микросекундным временным разрешением. Для регистрации кинетики переноса электронов в ходе многостадийных превращений каталитического центра ЦО использовался спектрофотометр на базе CCD (ПЗС) матрицы (DV420-UV-FK, Andor Technology, Северная Ирландия), позволяющий проводить регистрацию спектров с разрешением 1-16 мкс в течение нескольких миллисекунд после начала реакции. В случае измерения быстрой кинетики окисления ЦО кислородом в режиме одного оборота, предвосстановленный и уравновешенный с окисью углерода фермент смешивался с помощью приставки стоп-флоу (Applied Photophysics, Великобритания) с буфером, насыщенным кислородом. Соотношение смешиваемых объемов составляло 1:5, соответственно. Для инициации реакции в субмикросекундном временном диапазоне, CO фотодиссоциировали из комплекса с гемом а3 ЦО коротким лазерным импульсом (NdYAG;

532 нм, 15 нс, ~100 мДж), спустя 5 мс после начала смешивания (чтобы предотвратить спонтанное вытеснение CO кислородом).

Обработка данных. Для обработки данных использовались программы Discrete [Provencher, 1976], Origin (OriginLab Corp., США), GIM (разработана А.Л.Драчевым в НИИФХБ МГУ), MatLab (MathWorks Inc., США), Pro-Kineticist (Applied Photophysics Ltd., Великобритания). Для разрешения кинетических кривых генерации мембранного потенциала на индивидуальные экспоненты использовался алгоритм программы Discrete [Provencher, 1976]. В случае кинетической модели последовательных стадий истинные амплитуды электрогенных стадий связаны с наблюдаемыми амплитудами алгебраическими выражениями [Medvedev et al., 2005;

Siletsky et al., 2006]. Истинные значения амплитуд генерации потенциала V1 и V2 могут быть вычислены из измеряемых экспериментально амплитуд, Vobs, и констант скоростей, k1, k2, с помощью системы уравнений:

k V1 V1, obs V2, obs k ( k1 k 2 ) V2 V2,obs (1) k РЕЗУЛЬТАТЫ КИНЕТИКА ГЕНЕРАЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА, СОПРЯЖЕННАЯ С ОДНОЭЛЕКТРОННЫМИ ПЕРЕХОДАМИ В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель - разрешить стадии электрогенного переноса электронов и протонов в ходе одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы.

Цитохромоксидаза митохондрий содержит четыре редокс-центра. CuA располагается вблизи места взаимодействия ЦО с цитохромом с на внешней (P) стороне мембраны. Низкоспиновый гем а и биядерный каталитический центр, состоящий из высокоспинового железа гема a3 и иона меди (CuB), располагаются в гидрофобном ядре белка на сходном расстоянии от поверхности мембраны.

В каталитическом цикле цитохромоксидазы выделяют две части.

Восстановительная часть включает в себя перенос от цитохрома с в окисленный биядерный центр ЦО (состояние О) 1-го и 2-го электрона с образованием состояния R (схема 1). В окислительной фазе молекула кислорода связывается с восстановленным BNC и расщепляется, принимая одновременно 4 электрона от гема а3, CuB и входящего в состав активного каталитического центра ЦО остатка тирозина Y288, образующего ковалентную связь с одним из гистидиновых лигандов CuB. Возникшие 2 электронные вакансии заполняются в каталитическом центре ЦО переносом 3-го и 4-го электронов, переводя ЦО последовательно из состояния P в F и из F в окисленное состояние (O).

Схема 1-й, 2-й e 3-й e 4-й e O R А P F O a33+ а32+ a32+-O2 a34+=O2-Tyr* a34+=O2- a33+-OH На схеме изображены состояния гема а3, в комплексе с которым происходят редокс превращения кислорода. Tyr* -радикал редокс-активного остатка тирозина.

Активируемый с помощью короткой лазерной вспышки (532 нм, ~10 нс), комплекс трис(бипиридил)рутения (Rubpy) может быть использован для фотоиндуцированного переноса электрона в белки в субмикросекундной временной шкале [Sutin et al., 1978;

Geren et al., 2009]. В случае природного субстрата цитохромоксидазной реакции, цитохрома с, ковалентно модифицированного Rubpy по периферическим остаткам на поверхности белка, в ответ на фотоактивацию наблюдается восстановление окисленного гема цитохрома с [Geren et al., 1991;

Pan et al., 1990]. Электрогенная составляющая быстрой кинетики перераспределения электронной плотности от гема цитохрома с внутрь встроенной в протеолипосомы ЦО и сопряженного переноса протонов может быть зарегистрирована с помощью “прямого” электрометрического метода [Drachev et al., 1978;

Drachev et al., 1979].

На рисунке 1 представлена кинетика генерации трансмембранной разности потенциалов встроенной в протеолипосомы окисленной ЦО, при использовании в качестве фотовосстановителя цитохрома с из дрожжей, ковалентно модифицированного по остатку цистеина 102 трис-бипиридиловым комплексом рутения (Ru-102-Cyt c). В условиях низкой ионной силы (pH~8), Ru-102-Cyt c образует фермент-субстратный комплекс с ЦО, связываясь благодаря электростатическим взаимодействиям в специфическом сайте обращенной во внешнюю водную фазу поверхности ЦО. В присутствии избытка анилина, необходимого чтобы исключить обратный перенос электрона на окисленный Rubpy, в ответ на короткую лазерную вспышку (532 нм, 10 нс, 40 мДж) ЦО генерирует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по знаку переносу отрицательного заряда внутрь протеолипосом (рис. 1А). Кривая нарастания регистрируемой разности потенциалов отражает кинетику образования на мембране протеолипосом [Drachev, et al.1978;

Drachev et al., 1974].

Быстрая часть кинетики генерации мембранного потенциала (40-70 мкс) отражает перенос электрона в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, от CuA к гему а [Zaslavsky et al., 1995]. Происходящий значительно быстрее ( 10 мкс, [Pan et al., 1993 ]), перенос электрона между цитохромом с и входным редокс-центром CuA не сопровождается заметной электрогенной стадией (рис. 1A, вставка), в соответствии с периферическим расположением CuA вблизи поверхности ЦО. В медленной части кинетики доминирует электрогенная фаза, характеризующаяся субсекундным значением 0.3 с (рис. 1A), значительно более медленным, чем стадии каталитического цикла ЦО.

Эта компонента является результатом реакции второго порядка между ЦО и избытком восстановленного Ru-102-Cyt c, образовавшегося в растворе в ответ на лазерную вспышку [Zaslavsky et al., 1995].

Несвязанный с цитохромом с свободный Rubpy также способен восстанавливать ЦО в ответ на вспышку лазера (рис. 1Б, [Nilsson et al., 1992;

Zaslavsky et al., 1993]).

Фотоэлектрический ответ с Rubpy и Ru-102-Cyt c сходны в начальной части (рис. 1). В отличие от Ru-102-Cyt c, вызванная Rubpy cветоиндуцированная генерация завершается в течение нескольких десятков миллисекунд, вслед за чем мембрана разряжается благодаря пассивной утечке ионов.

5. Б 3, 4. ф отопотенциал, м в A фотопотенциал, мв 4. 2, 3. 2, фотопотенциал, мв 0, 3. 0,06 2. 1, 2. 0, 1,0 1. 0, 1. 0, 0, 0. 0,0 0,1 0,2 10 20 30 время, мс 0,0 0. 0 2 4 6 8 10 200 400 600 800 0 2 4 6 8 10 200 400 600 800 время, мс время, мс Рисунок 1. Кинетика генерации трансмембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО. (A) в приcутствии восстановленного светом Ru-102-Cyt с. На вставке показана быстрая часть фотоэлектрического ответа. Условия: буфер 5 мМ трис ацетат (pH=8.1), 10 мМ анилин, 5 мкМ Ru-102-cyt c. (Б) в присутствие Rubpy. Условия:

буфер 5 мМ трис-ацетат (pH=8.1), 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин.

При использовании свободного Rubpy, донирование электрона в ЦО происходит в одноэлектронном режиме, от образующего с ЦО электростатический комплекс предсвязанного Rubpy. Вследствие короткого времени жизни возбужденного состояния Rubpy (~0.6 мкс), дополнительного диффузионного переноса электронов из объемной водной фазы от несвязанных с ЦО возбужденных молекул Rubpy не происходит.

Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы (FO переход).

Фиксация ЦО в гомогенном состоянии требует специфической обработки и оказывается возможной не для всех промежуточных состояний восстановленности молекулы кислорода. Инкубация с милимолярными концентрациями H2O2 переводит ЦО в состояние F [Wrigglesworth, 1984], соответствующее промежуточной восстановленности кислорода в активном центре фермента 3-мя электронами. Инъекция электрона от Rubpy в ЦО в присутствии миллимолярных концентраций H2O2 приводит к быстрому транспорту электрона через гем а в биядерный центр фермента [Nilsson, 1992], что эквивалентно переносу на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле, и, в случае встроенной в протеолипосомы ЦО, сопровождается генерацией трансмембранной разности потенциалов (рис. 2А). В кинетике набора мембранного потенциала хорошо разрешаются три компоненты, характеристические времена которых составляют ~40 мкс (“быстрая”), ~1.2 мс (“средняя”) и ~4.5 мс (“медленная”), а относительные вклады в суммарный фотоэлектрический ответ, соответственно: 20%, 20% и 60% (в согласии с [Zaslavsky et al., 1993]).

Для разрешенных электрогенных компонент характерно значительное различие в энергии активации, обусловленное природой транслоцируемых зарядов (электрона или протонов). Понижение температуры приводит к замедлению миллисекундных компонент генерации мембранного потенциала (“средней” и “медленной”), не сказываясь при этом заметно на скорости микросекундной фазы (рис. 2А). Константа скорости “быстрой” фазы слабо зависит от температуры в исследованном диапазоне (Еа3.6 ккал/моль, рис. 2Б).

Низкое значение энергии активации (0.2 эВ или 4.8 ккал/моль) свидетельствует об отсутствии значительных структурных перестроек в белке, что свойственно несопряженным электрон-транспортным реакциям [Laidler et al., 1972;

Farver et al., 2010].

A 5. Б 2. быстрая 4. фотопотенциал, мв 1.5 4. 3. медленная 1. log k средняя 3. 0.5 средняя 2. быстрая 2. 0.0 медленная 1. 0.00 0.05 0.10 0.15 10 20 30 3.3 3.4 3. время, мс 1000/T 2. Миллисекундные компоненты генерации мембранного потенциала, Рисунок сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле ЦО из митохондрий, специфически замедляются при уменьшении температуры. (А): Кинетика генерации мембранного потенциала в переходе FO ЦО при двух значениях температуры (1 - при 24С, 2 - при 19С). Условия как на рисунке 1Б;

в среде присутствует 4 мМ H2O2.

(Б): Зависимость компонент генерации ЦО от температуры в координатах Аррениуса.

Значения энергии активации для “быстрой”, “средней” и “медленной” компонент составили, соответственно: ~3.6 ккал/моль, ~19.4 ккал/моль и ~16.6 ккал/моль.

Константы скоростей “средней” и “медленной” фаз генерации потенциала, напротив, в значительной степени растут при повышении температуры и характеризуются относительно высокими значениями энергии активации, соответственно, 19.4 ккал/моль и 16.6 ккал/моль (рис. 2Б, [Siletsky et al., 2000, 2011]). Сходные значения энергии активации характерны для протон-транслоцирующих стадий генерации мембранного потенциала в других белках-генераторах H+, включая фотосинтетические реакционные центры и бактериородопсин [Mamedov et al., 2006]. Оба гемовых центра ЦО расположены на равном расстоянии от внешней поверхности мембраны [Iwata et al., 1995;

Yoshikawa et al., 1998], поэтому перенос электрона между ними не вносит существенный вклад в генерацию мембранного потенциала. “Cредняя” и “медленная” фазы отражают электрогенную составляющую процессов транслокации протонов в FO переходе ЦО, сопряженных с переносом электрона от гема а в биядерный центр фермента.

Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го и 3-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы (фотовосстановление состояний O и P).

Чтобы перевести цитохромоксидазу исходно в состояние P, соответствующее уровню восстановленности молекулы кислорода 2-мя электронами, нами был подобран метод, основанный на обработке аэробного раствора окисленного фермента газообразным CO [Nicholls & Chanady, 1981]. Окись углерода служит в качестве 2-х электронного донора биядерного центра, и последующее взаимодействие полностью восстановленного a3/CuB центра с атмосферным кислородом приводит к образованию стабильного во времени компаунда P. Полученный после пропускания CO разностный спектр характеризуется в видимой области -пиком при 607 нм и -полосой при 566 нм c типичным для компаунда P соотношением амплитуд ~4:1 [Fabian et al., 1995;

Rich et al., 1997]. Согласно величине молярной экстинкции при 607 нм (~6 мМ-1см-1), около 60% цитохромоксидазы образует соединение P, в то время как оставшаяся часть (~40%) находится в окисленном состоянии (O).

Генерация мембранного потенциала, наблюдающаяся в результате инъекции электрона в исходное окисленное состояние (O) ЦО (рис. 3, кривая 1), соответствует по знаку накоплению отрицательного заряда на протеолипосомальной мембране, обращенной во внутренний отсек. В кинетике доминирует фаза c ~45 мкс, отражающая электрогенный перенос электрона с CuA на гем а. Минорная миллисекундная часть кинетики генерации вызвана наличием в препарате окисленного фермента остаточной примеси P и F соединений (10-15%;

[Siletsky et al. 1999]), в то время как инъекция электрона от Rubpy в гомогенное окисленное состояние О ЦО из митохондрий ограничивается восстановлением гема а и не сопровождается дальнейшим переносом электрона в BNC в миллисекундной временной шкале ([Nilsson, 1992]).

2.5 + CO 2. фотопотенциал, мв 1. 1. + KCN 0. 0. 0.0 0.1 20 врем я, м с Рисунок 3. Генерация мембранного потенциала, сопряженная с одноэлектронным фотовосстановлением встроенной в протеолипосомы ЦО. Условия: 5 мМ Трис-ацетат буфер pH=8.1, 40 мкM Rubpy, 10 мM анилин. t = 19C. Экспериментальные кривые были зарегистрированы последовательно на одном препарате в следующем порядке: (1) после инкубации в течение 20 мин. в присутствии 200 мкМ феррицианида и 10 нМ каталазы, необходимых чтобы перевести ЦО в окисленное состояние (О) и убрать следовые количества H2O2, способствующие образованию состояний P и F;

(2) после пропускания в течение 1 мин. газообразного CO;

(3) после добавления 0.5 мМ KCN.

В ответ на обработку CO и формирование состояния P ЦО, миллисекундная часть кинетики генерации мембранного потенциала резко возрастает (рис. 3, кривая 2), отражая стадии электрогенного переноса протонов, сопряженные с реокислением гема а каталитическим центром ЦО в переходе PF. Добавление цианида, связывающегося с окисленным гемом а3 и блокирующего перенос электрона в активный центр от гема а, ингибирует фазы электрогенного переноса протонов (рис. 3, кривая 3). C учетом фракции ЦО в состоянии О (~40%), относительная амплитуда “быстрой” нечувствительной к цианиду электрогенной фазы (~45 мкс) для обоих одноэлектронных стадий FO и PF составляет ~20%. Взаимное соотношение скоростей и амплитуд двух чувствительных к цианиду электрогенных протонных фаз в переходе PF (~0.3 мс и ~1.3 мс) близко к таковому для “средней” и “медленной” фаз в переходе FO. Как было сказано выше, перенос электрона от гема а в каталитический центр ЦО не вносит существенный вклад в генерацию мембранного потенциала, поэтому чувствительные к цианиду стадии генерации потенциала обусловлены электрогенной транслокацией протонов.

Относительная амплитуда “быстрой” электрогенной фазы переноса электрона от CuA на гем а может быть использована для количественной оценки суммарной величины электрогенного переноса зарядов (и, в частности, протонов) в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла. Очевидно, переходы FO и PF сопряжены с равным суммарным числом транслоцируемых через мембрану зарядов.

КИНЕТИКА ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА ЧЕРЕЗ ГЕМОВЫЕ ЦЕНТРЫ В ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДАХ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель - установить стадии переноса электрона в ЦО, которые непосредственно сопряжены и контролируют отдельные электрогенные этапы перемещения протонов в одноэлектронных переходах фермента.

В случае исходного состояния F биядерного центра ЦО из митохондрий, разрешенная кинетика изменения экстинкции при 444 нм (максимум поглощения восстановленного гема а) содержит 3 компоненты. Микросекундная компонента нарастания поглощения А444 (40 мкс, неразрешаемый скачок поглощения на рисунке 4) соответствует восстановлению гема а “входной” медью CuA. Последующее снижение абсорбции А444 отражает реокисление гема а биядерным центром и содержит две компоненты, характеристические времена которых совпадают со значениями “средней” и “медленной” электрогенных компонент (~1 мс и ~4 мс). Основной вклад (80-90%) в спад абсорбции А444 принадлежит компоненте с ~1 мс.

Регистрация поглощения при 438 нм и 412 нм позволяет избирательно следить за превращением гема а3 в FO переходе. Данные длины волн близки, соответственно, к максимуму и минимуму поглощения в разностном спектре оксоферрильного комплекса гема а3 относительно окисленного гема а3;

вклад редокс-изменений гема а при этом минимален. Из рисунка 4 можно видеть, что изменения поглощения ЦО в ответ на фотохимическую подачу электрона от Rubpy, отражающие, соответственно, реокисление гема а (444 нм), исчезновение состояния F (438 нм) и появление окисленного состояния O гема а3 (412 нм), происходят параллельно и характеризуются ~1-1.5 мс.

0, 444 нм 0, 438 нм 412 нм -0, -0, 0 5 10 15 время, мс Рисунок 4. Кинетика изменения оптического поглощения в полосе восстановленного гема а при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении ЦО из соединения F ( нм), исчезновения оксоферрильного комплекса гема а3 (438 нм) и появления окисленного состояния гема а3 (412 нм) в FO переходе фермента. Условия: 20 мкМ ЦО, буфер 5 мМ Трис-ацетат (pH=8.1), 0.05% додецил-мальтозид, 80 мкМ Rubpy, 0.2 мМ феррицианида калия, 4 мМ H2O2. Амплитуда кинетики изменения А444 уменьшена в 2 раза.

На рисунке 5А приведено сравнение кинетики увеличения поглощения при 412 нм, отражающей появление окисленного гема а3 в FO переходе и параллельной кинетики электрогенного движения протонов через мембрану. Разрешаемый оптически переход FO биядерного центра совпадает во времени со “средней” фазой электрогенного протонного транспорта (~1 мс). В тоже время значительная часть электрогенного протонного транспорта происходит позднее, в “медленной” электрогенной фазе (4 мс, рис. 5А) [Siletsky et al., 2006].

Кинетика переноса электрона через гемовые центры ЦО из митохондрий в переходе PF регистрировалась в длинноволновой области спектра, где данные интермедиаты каталитического цикла ЦО имеют специфические и легко различимые полосы поглощения. Нарастание поглощения при 580 нм (рис. 6) отражает появление состояния F ЦО (максимум поглощения в видимой области ~583 нм) и характеризуется константой времени ~250 мкс.

0. Б A F O 0. P F 0. фотопотенциал погпощение поглощение 0. фотопотенциал 0. A 0. 0. A 0. 0. -0. 1.8 2.0 2.2 5 10 15 0 1 2 5 10 15 20 время, мс время, мс Рисунок 5. (А) Сравнение скорости фотоиндуцированного перехода FO, измеренной по увеличению поглощения при 412 нм, с паралельной кинетикой генерации мембранного потенциала. Нарастание поглощения при 412 нм и протонная часть фотоэлектрического ответа отнормированы по амплитуде ~1 мс фазы электрогенного протонного транспорта.

(Б) Сравнение скорости фотоиндуцированного перехода PF, измеренной по увеличению поглощения при 580 нм, с паралельной кинетикой генерации мембранного потенциала.

Нарастание поглощения при 580 нм и протонная часть фотоэлектрического ответа отнормированы по амплитуде ~0.3 мс фазы электрогенного протонного транспорта. Как в (А), так и в (Б) электрогенная компонента переноса электрона CuAгем a (~40 мкс) вычтена из соответствующей электрометрической кривой.

Cкачок поглощения, наблюдающийся в начальном участке кинетики при 605 нм (рис. 6), вызван восстановлением гема а от CuA с ~40 мкс. В кинетику уменьшения поглощения A605 вносят вклад как реокисление гема а, так и исчезновение состояния P.

Спектральные изменения при 605 нм и 580 нм, происходящие с ~250 мкс, отражают реокисление гема a и переход PF биядерного центра [Siletsky et al., 2006]. Как видно на рисунке 5Б, одновременно с переносом электрона в каталитический центр в переходе PF, цитохромоксидаза образует разность электрических потенциалов засчет сопряженного электрогенного переноса протонов в “средней” компоненте кинетики генерации (~0.3 мс). В тоже время, как и в случае FO перехода, значительная часть мембранного потенциала образуется в ходе электрогенного протонного транспорта, происходящего позднее, в “медленной” электрогенной фазе c ~1.3 мс [Siletsky et al., 2006].

0, 605 нм 0, 580 нм 0, -0, 0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0, время, с Рисунок 6. Кинетика изменения поглощения при 580 нм и 605 нм, вызванная одноэлектронным фотовосстановлением состояния P митохондриальной цитохромоксидазы в детергентном растворе. Реакционная среда содержала 10 мкМ ЦО, мкМ Ru2C, 10 мМ анилин, 5 мМ Трис-HCl буфере, pH 8.0, 0.1% додецил мальтозида.

Данные свидетельствуют о том, что быстрая фаза снижения поглощения при 605 нм совпадает с образованием состояния F (увеличение поглощения при 580 нм).

Таким образом, перенос в биядерный центр электрона от гема а цитохромоксидазы из митохондрий характеризуется значением 0.3 мс (PF) и 1.2 мс (FO), соответственно, и сопряжен в обоих переходах с cинхронной генерацией мембранного потенциала в “средней” электрогенной фазе. Электрогенный перенос протонов в “медленной” электрогенной фазе (с 1.3 мс и 4.5 мс, соответственно), происходит за счет сохранения части свободной энергии редокс-реакции в промежуточном метастабильном состоянии ЦО. Фазы электрогенного переноса протонов в переходах PF и FO характеризуются сходными параметрами как по относительному соотношению соответствующих скоростей и амплитуд, так и по связи с сопряженными стадиями переноса электрона в ЦО, что указывает на универсальный характер механизма транслокации протонов на отдельных одноэлектронных стадиях окислительной полуреакции каталитического цикла.

ВНУТРИБЕЛКОВЫЕ ПУТИ ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В ХОДЕ ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДОВ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель – локализовать пути проведения протонов и выяснить их функциональную роль в каталитическом цикле цитохромоксидазы.

Электрогенная активность цитохромоксидазы аа3 типа из Rhodobacter sphaeroides Исследование бактериальных цитохромоксидаз, гомологичных митохондриальной ЦО, позволяет использовать возможности направленного мутагенеза по аминокислотным остаткам, предположительно участвующим в проведении протонов внутри белка. В качестве такого модельного объекта была выбрана ЦО аа3-типа из R.sphaeroides, относящаяся к тому же подсемейству А1 семейства А гем-медных оксидаз и обладающая высокой степенью гомологии (50% для первой субъединицы) с ферментом из митохондрий [Shapleigh et al., 1992].

На рисунке 8 приведена кинетика генерации мембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО дикого типа из R.sphaeroides при одноэлектронном фотовосстановлении состояния F (переход Разрешаемые кинетические FO).

компоненты бактериального фермента примерно в 2-3 раза быстрее соответствующих компонент кинетики митохондриальной ЦО, что согласуется с более высокой стационарной активностью бактериальной ЦО (750 с-1 против 250 с-1 при рН=8).

Рисунок 7. Кинетика генерации трансмембранной разности потенциала ЦО дикого типа из R.sphaeroides. Цианид калия ингибирует миллисекундные компоненты генерации.

Условия: буфер 5 мМ трис-ацетат (pH=8.1), 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин, 1 мМ H2O2;

где указано - добавлен 2 мМ KCN.

Величина относительных вкладов в фотоэлектрический ответ чувствительных к цианиду аналогов “средней” (0.35-0.6 мс) и “медленной” (1.2-1.7 мс) электрогенных компонент и их соотношение (~1:3) близки к таковым в случае ЦО из митохондрий.

Относительная амплитуда собственно электрон-транспортной стадии восстановления гема а от CuA в цитохромоксидазе из R.sphaeroides (~10 мкс) имеет близкое значение к таковой в митохондриальной ЦО, в соответствии со сходством трехмерной структуры обоих ферментов, и составляет ~18-20% [Siletsky et al., 2010].

Роль входных протонных D и К каналов в каталитическом цикле ЦО.

В результате рентгено-структурного анализа кристаллов цитохромоксидазы из митохондрий сердечной мышцы быка и гомологичных бактериальных оксидаз, в мембранной гидрофобной части фермента были обнаружены структуры [Iwata et al., 1995;

Svensson-Ek et al., 2002], потенциально способные к проведению протонов на пути из матрикса к двухядерному железо-медному центру. Первичная гипотеза связывала два потенциальных протон-проводящих “канала”, названные по остаткам лизина и аспартата в начальной части, соответственно, К и D каналами [Konstantinov et al., 1997], с проведением протонов разных типов (субстратных и помпируемых) [Iwata et al., 1995;

Tsukihara et al., 1996].

Одиночные замены на непротонируемые аналоги ряда ключевых консервативных аминокислотных остатков в протон-проводящих путях в значительной степени либо полностью ингибируют цитохромоксидазную активность в стационарных условиях (табл.1).

ТАБЛИЦА 1. Каталитическая активность цитохромоксидазы дикого типа и мутантных форм из Rhodobacter sphaeroides.

Дикий тип T359A D132N K362M E286Q Фермент Число оборотов, с-1 (%) 1500 (100) 250 (17) 50 (3.3) 5 (0.3) 5 (0.3) На рисунке 8A представлена кинетика генерации мембранного потенциала ЦО дикого типа при фотохимическом одноэлектронном восстановлении соединения F с помощью Rubpy, в сравнении c ЦО, мутантной по остатку Е286. Можно видеть, что единичная замена расположенного в конце D-канала, вблизи двухядерного центра, остатка Е286 не влияет на быструю микросекундную часть кинетики генерации потенциала, связанную с переносом электрона с CuA на гем а. Одновременно, полностью ингибируются милисекундные фазы фотоэлектрического ответа, то есть внутрибелковый перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а и восстановлением гема а3.

Мутация D132N в начальной части D-канала также не влияет на микросекундную часть кинетики, в то время как в миллисекундной временной шкале амплитуда фотоэлектрического ответа мутантной ЦО значительно снижена (рис. 8Б). Остаточная медленная часть кинетики генерации ингибируется цианидом и представляет собой электрогенное подтягивание протона в D-канале (выше остатка D132) в ответ на перенос электрона от гема а в двухядерный центр. Позднее, сходный эффект ингибирования электрогенного переноса протонов в результате перекрывания D-канала был обнаружен при замене на непротонируемые аналоги ряда консервативных остатков серина и аспарагина, расположенных в срединной части D-канала между остатками D132 и E [Lee et al. 2010, Siletsky et al., 2004, 2010].

Б WT A WT D132N фотопотенциал, мв E286Q D132N+KCN 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 K362M Г 4 В WT T359A 0 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 0,00 0,05 0,10 2 4 6 8 время, мс время, мс Рисунок 8. Кинетика генерации трансмембранного потенциала цитохромоксидазами дикого типа (WT) и ЦО с сайт-специфическими мутациями в протон-проводящих каналах.

Основные условия как на рисунке 7.

D-канал: (А) Кинетические кривые дикого типа (WT) и мутанта E286Q нормированы по амплитуде микросекундной компоненты. В случае мутанта, для поддержания гема а в окисленном состоянии добавлен 0.2 мМ феррицианида калия. (Б) Кинетики фотоэлектрических ответов дикого типа (WT) и ЦО с мутацией D132N отнормированы по амплитуде в микросекундной временной шкале. Там, где указано - добавлен 1 мМ KCN.

K-канал: (В) Фотоэлектрический ответ ЦО с одиночной заменой T359A во входном протонном К-канале практически не отличается от ответа ЦО дикого типа. (Г) Кинетика генерации трансмембранного потенциала цитохромоксидазой с мутацией K362M в К канале. Условия: 1) без добавок;

2) добавлено 100 мкМ феррицианида калия;

3) добавлен 1 мМ H2O2;

4) добавлен 1 мМ KCN.

Одиночные замены аминокислотных остатков в К-канале также приводят к заметному (Т359A) либо полному (К362M) ингибированию активности фермента (табл.

1). Однако, как можно видеть на рисунке 8, мутации в К-канале не оказывали значительного влияния на кинетику генерации, сопряженную с одноэлектронным фотовосстановлением интермедиата F, и не ингибировали электрогенный перенос протонов в ЦО, по крайней мере при однократном срабатывании.

Фотоэлектрический ответ цитохромоксидазы с заменой Т359А в присутствии 1 мМ H2O2 не отличается от кинетики ЦО дикого типа (рис. 8В). ЦО с мутацией К362M, в присутствии Rubpy, образует сильно заниженный по величине фотоэлектрический ответ (рис. 8Г, кривая 1), что связано со значительной степенью восстановленности гема а в исходном состоянии. Добавление феррицианида окисляет гем а и разрешает его фотовосстановление от Rubpy через CuA (рис. 8Г, кривая 2). Добавление перекиси водорода, переводящее фермент в оксоферрильное состояние F, приводит к появлению в практически неактивном K362M мутанте полностью развитой, чувствительной к цианиду миллисекундной части кинетики генерации потенциала (рис. 8Г, кривая 3,4).

0, 0. 444 нм 605 нм 417 нм п о г л о ще н и е 1-E286Q 0. 2-D132N 0,30 0. 2 3-K362M 0. 4 4-WT 4 0. поглощение 0,25 3 0. 560 580 600 620 640 д л и н а в о л н ы, н м 0, 0, 1-E286Q 2-D132N 0,10 3-K362M 4-WT 0, 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Длина волны, нм Рисунок 9. Абсолютные спектры поглощения в полосе Соре и в видимой области спектра (на вставке) цитохромоксидазы дикого типа и мутантных форм в аэробных стационарных условиях, в присутствие аскорбата и TMPD в качестве доноров электронов. Условия:

кювета с постоянным перемешиванием и оптическим путем 1 см. Состав среды: 0.2–0. мкМ фермента (ЦО дикого типа или мутантной формы), 50 мМ К-фосфат (pH 8.0), 0.1% лаурил мальтозид, 1 мМ аскорбат, 100 мкМ TMPD.

Стационарные оптические спектры всех описанных выше мутантных форм, в присутствие избытка субстратов дыхания, свидетельствуют о значительном повышении степени восстановленности гема а (вставка к рис. 9), в соответствии с ингибированием реакции реокисления гема а двухядерным центром вследствие мутации. Однако, в отличие от мутаций по D-каналу, в случае мутанта К362М два раздельных пика с максимумами 444 нм и 420 нм в полосе Соре свидетельствует об окисленном высокоспиновом состоянии гема а3 (состояние O) на фоне восстановленного гема а (рис.

9). То есть, ингибирование стационарной активности в “мертвом” мутанте K362M в К канале вызвано замедлением переноса протонов в восстановительной части каталитического цикла, в ходе восстановления биядерного центра с образованием состояния R, что является необходимым этапом для связывания O2.

Таким образом можно заключить, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла ЦО происходит через протон-проводящие D и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы, включая остатки D132, N139, E286 в D-канале и T351, T359 и K362 в К-канале [Siletsky et al., 1996;

Konstantinov et al., 1997;

Siletsky et al., 2004]. Однако, протон-проводящие D и K каналы различаются не по типу переносимых протонов (субстратных или помпируемых), как предполагалось исходно, а задействованы на разных стадиях каталитического цикла.

АРТИКУЛЯЦИЯ ВНУТРИБЕЛКОВОГО ПЕРЕМЕЩЕНИЯ ПРОТОНОВ В ОДНОЭЛЕКТРОННОМ ПЕРЕХОДЕ FO ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Цель – выяснить точную стехиометрию сопряженного трансмембранного переноса протонов в отдельном одноэлектронном переходе;

выявить детали взаимной артикуляции проведения помпируемого и субстратного протонов в элементарном акте работы протонного насоса цитохромоксидазы.

Стехиометрия сопряженного электрогенного переноса протонов в одноэлектронном переходе FO цитохромоксидазы.

Точное число помпируемых протонов, сопряженных с отдельными одноэлектронными переходами ЦО, оставалось предметом дискуссий в течение длительного времени. Основываясь на анализе равновесных окислительно восстановительных титрований редокс-активных групп ЦО и переходов биядерного центра, Викстремом была предложена модель, в которой каждый из переходов PF и FO сопряжен с трансмембранным переносом двух помпируемых протонов [Wikstrom, 1989], в то время как перенос 2-х первых электронов в каталитическом цикле ЦО не сопряжен с перекачкой протонов через мембрану вовсе.

Количественная оценка числа переносимых зарядов в приведенных выше предстационарных измерениях генерации мембранного потенциала в одноэлектронных PF и FO переходах ЦО существенно зависит от степени электрогенности, приписываемой “быстрой” стадии, отражающей перенос электрона от CuA к гему а и использующейся в качестве внутреннего нормировочного параметра. Так, согласно стационарным измерениям влияния мембранного потенциала на редокс-равновесие между цитохромом с и гемом а [Hinkle & Mitchell, 1970], исходно предполагалось, что амплитуда “быстрой” электрогенной компоненты в ходе PF и FO переходов соответствует переносу электрона от CuA к гему a на 1/2 величины диэлектрического барьера мембраны. В этом случае, суммарная амплитуда миллисекундных протонных фаз (80% в FO или PF переходе) может соответствовать трансмембранной транслокации полных зарядов и включать в себя транслокацию из внутренней водной фазы в двухядерный центр субстратного протона на половину толщины мембраны и сопряженную электрогенную транслокацию двух помпируемых протонов: одного - через всю мембрану и еще одного - на половину ее толщины, то есть “полутора помпируемых протонов” на 1 одноэлектронный переход [Zaslavsky et al., 1993;

Siletsky et al., 1999].

0, 0, A при 444 нм 0, N139D 0, WT -0, 0 5 10 15 20 время, мс Рисунок 10. Кинетика редокс-превращений гема а в переходе FO в очищенной ЦО дикого типа из R.sphaeroides (WT) и мутанта (N139D). Условия: 20 мкМ ЦО, 5 мМ Трис/ацетат буфер, 0.1% додецилмальтозид, 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин, 2 мМ H2O2.

Две абсорбционные кривые отнормированы по амплитуде фотовосстановления гема а.

Чтобы достоверно оценить электрогенное расстояние между CuA и гемом а в предстационарных условиях и определить точное число зарядов, транслоцируемых в разрешенных во времени одноэлектронных переходах, нами была исследована генерация мембранного потенциала цитохромоксидазой с мутацией N139D в начальной части D канала [Siletsky et al., 2004]. Данная мутация полностью сохраняет кислород-редуктазную активность ЦО, но приводит к полной утрате способности к трансмембранной перекачке протонов.

Как можно видеть на рисунке 10, реокисление гема а биядерным центром (снижение поглощения A444) в переходе FO мутанта N139D и ЦО дикого типа происходят с близкими скоростями. То есть, мутация N139D не оказывает влияния на перенос электрона через гемовые центры ЦО. Фотоиндуцированная кинетика генерации мембранного потенциала непомпирующего мутанта N139D представлена на рисунке 11 и может быть использована в качестве калибровки суммарной транслокации помпируемых протонов в FO переходе протон-помпирующих оксидаз.

Генерация мембранного потенциала в мутантной ЦО обусловлена электрогенными составляющими микросекундной компоненты переноса электрона с внешней стороны мембраны к гему а и чувствительной к цианиду, миллисекундной (~0.6 мс) компоненты переноса субстратного протона из внутренней водной фазы в BNC, в ходе химического превращения интермедиата F в O. C учетом выхода соединения F в мутанте N139D (~70%), относительная амплитуда чувствительной к цианиду ~0.6 мс компоненты в фотоэлектрическом ответе составляет ~1.65 от амлитуды электрогенного переноса электрона между СuA и гемом а.

3, WT 2, фотопотенциал, мв 2, N139D 1, 1, E286Q 0, 0, FO переход -0, 0,00 0,05 5 время, мс Рисунок 11. Электрогенные ответы, сопряженные с FO переходом ЦО дикого типа из R.sphaeroides (WT) и мутантов с единичными заменами N139D и E286Q. Основные условия как на рисунке 7. Эксперименты проводились с приклеенными к коллодиевой пленке протеолипосомами ЦО в среде: 5 мМ Трис-ацетат (pH 8), 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин. Чтобы перевести фермент в исходное состояние F, добавляли 2 мM H2O2. В случае мутанта E286Q, был добавлен 0.2 мМ феррицианида калия, для того чтобы поддерживать гем а в окисленном состоянии.

Поскольку гем а и биядерный центр располагаются на одинаковом расстоянии от поверхности мембраны, то из полученного отношения следует, что электрогенное расстояние BNC и гема а от внешней поверхности мембраны составляет ~0.38 толщины мембранного диэлектрика. Эта величина близка к оценке геометрического расположения гема а в трехмерной структуре ЦО относительно внешней поверхности мембраны.

Сравнение амплитуды ~0.6 мс электрогенной фазы, отражающей перенос субстратного протона из внутренней водной фазы в BNC на расстояние ~0.62 толщины мембранного диэлектрика, с ответом митохондриальной ЦО и бактериальной ЦО дикого типа позволяет оценить дополнительный электрогенный вклад, возникающий в одноэлектронном переходе помпирующего фермента в результате транслокации помпируемого протона [Siletsky et al., 2004].

Поскольку амплитуда “быстрой” электрогенной фазы, соответствующей переносу электрона от CuA к гему а, составляет ~20% от полной величины фотоэлектрического ответа в одноэлектронных FO и PF переходах [Zaslavsky et al., 1993;

Siletsky et al., 2010], суммарная амплитуда “средней” и “медленной” протонных электрогенных фаз соответствует транслокации ~1.52 заряда через всю толщину мембранного диэлектрика.

Учитывая амплитуду переноса субстратного протона в биядерный центр (~0.62), дополнительный электрогенный вклад, наблюдающийся в помпирующем ферменте, соответствует трансмембранному переносу ~0.9 (то есть не более 1) помпируемого протона.

Последовательность проведения помпируемого и субстратного протонов в переходе FO цитохромоксидазы.

В отличие от “быстрой” электрогенной фазы, для чувствительной к цианиду части фотоэлектрического ответа ЦО, отражающей стадии сопряженного переноса протонов, наблюдается заметный эффект изотопного замещения при проведении измерений в D2O (рис. 12). Как оказалось, различие в чувствительности к D2O/H2O изотопному замещению может служить независимым инструментом для разделения и идентификации “средней” и “медленной” фаз генерации потенциала в FO переходе. При проведении измерения в D2O, “средняя” протонная фаза в ЦО дикого типа замедлялась в 1.4-1.5 раза, в то время как характеристическое время “медленной” электрогенной фазы увеличивалось в 3.5- раза (табл. 2, [Siletsky et al., 2004]).

A Б A 0, H2O фотопотенциал, мв WT N139D H2O D2O 0, D2O 0, 0 5 10 0 5 время, мс время, мс Рисунок 12. Действие замены D2O/H2O на кинетику генерации мембранного потенциала ЦО дикого типа (A) и мутантной ЦО с заменой N139D (Б). Основные условия как на рисунке 7. Где указано, буфер среды измерения был приготовлен на основе D2O.

В фотоэлектрическом ответе мутанта N139D, замедление в D2O чувствительной к цианиду ~0.6 мс электрогенной фазы в 3.5-4 раза практически идентично кинетическому изотопному эффекту, наблюдаемому для “медленной” (~1.5 мс) электрогенной фазы в диком типе и, в тоже время, значительно больше, чем кинетический изотопный эффект на “среднюю” (~0.5 мс) фазу (табл. 2). Это означает, что ~0.6 мс протонная фаза в N139D мутанте соответствует “медленной” фазе электрогенной кинетики дикого типа, то есть электрогенное движение субстратного протона в ЦО дикого типа происходит в “медленной” электрогенной фазе [Siletsky et al., 2004].

Таблица 2. Чувствительность перехода FO к изотопному замещению ионов водорода.

Дикий тип N139D Протонная электрогенная H2O D2O H2O D2O фаза мс мс “Средняя” 0.53 0. 0.62 2. “Медленная” 1.46 4. Поскольку оксидаза c мутацией N139D не переносит протоны через мембрану, то, следовательно, отсутствующая в мутанте “средняя” электрогенная фаза отражает в цитохромоксидазе дикого типа электрогенное перемещение помпируемого протона.

Отсюда также следует, что в механизме сопряженного протонного транспорта цитохромоксидазы, электрогенное перемещение помпируемого протона предшествует электрогенному перемещению субстратного протона.

Высвобождение протона на внешнюю сторону мембраны происходит в ”медленной” электрогенной фазе. Ингибирование электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе ионами цинка.

В настоящее время принято считать, что выход помпируемого протона из ЦО на внешнюю сторону мембраны может осуществляться с помощью разветвленной сети гидрофильных остатков и молекул воды вблизи внешней поверхности ЦО [Mills et al., 2000;

Sugitani et al., 2009]. Однако более точно локализовать траектории выхода протона на внешнюю сторону мембраны в трехмерной структуре фермента пока не удалось, несмотря на применение методов направленного мутагенеза. В этой связи, продуктивным оказалось использование ионов цинка, как поверхностного ингибитора протонного транспорта в ЦО [Kuznetsova et al., 2005].

Ионы цинка специфически ингибируют протонный транспорт в ряде мембранных белков [Skulachev et al., 1967;

Lorusso et al., 1991;

Paddock et al., 1999;

Nicholls et al., 1988;

Berry et al., 2000;

Kuznetsova et al., 2005]. В ходе исследования влияния Zn2+ на ЦО выяснилось, что в цитохромоксидазе имеются сайты связывания цинка, располагающиеся как со стороны внутренней водной фазы, вблизи входа в D-канал, так и с внешней стороны мембраны.

контроль Переход F в O фотопотенциал, мВ 2+ + 100 мкМ Zn 0,1 10 20 30 время, мс Рисунок 13. Ингибирование ионами Zn2+ электрогенной активности митохондриальной ЦО, сопряженное с переходом фермента из состояния F в состояние O. Перед опытом протеолипосомы в течение 30 мин. инкубировались в среде измерения, содержащей 5 мМ Трис-ацетат, pH 8.0, 10 мМ анилин, 40 мкМ Rubpy и 4 мМ Н2О2. После записи контрольной кривой 1, в кювету был добавлен 100 мкМ ZnCl2 и через 5 мин. записана кривая 2. Кривые 1 и 2 нормированы по амплитуде “быстрой” электрогенной фазы.

Взаимодействие Zn2+ с цитохромоксидазой с внутренней стороны мембраны отвечает за основные эффекты ионов цинка на солюбилизированный фермент [Kannt et al., 2001;

Aagaard et al., 2002;

Martino et al., 2011]. В тоже время, в некоторых условиях продемонстрировано действие ионов цинка на стационарную активность ЦО с внешней стороны цитохромоксидазных протеолипосом [Mills et al., 2002;

Kuznetsova et al., 2005].

Как можно видеть на рисунке 13, при измерении с временным разрешением фотоиндуцированной генерации мембранного потенциала ЦО в переходе FO в Zn2+, присутствии 100 мкМ добавленного с внешней стороны мембраны к цитохромоксидазным протеолипосомам, протонная составляющая кинетики образования значительно замедляется. Существенно, что вызванное ионами цинка замедление обусловлено специфическим торможением “медленной” электрогенной фазы, что свидетельствует о связи “медленной” компоненты кинетики генерации с процессом высвобождения помпируемого протона во внешнюю водную фазу. Кроме того, это указывает на возможное контролирование, вцелом, электрогенного переноса протонов в “медленной” электрогенной фазе стадией высвобождения помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны.

ОСОБЕННОСТИ ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДОВ В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ ba3-ТИПА ИЗ T. THERMOPHILUS Цель - выяснить структурно-функциональные особенности неканонической цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, обусловливающие уменьшение усредненной стехиометрии протонного насоса;

установить интермедиаты каталитического цикла;

выяснить особенности взаимодействия каталитического центра с лигандами.

В отличие от классических цитохромоксидаз семейства А гем-медного суперсемейства, ЦО ba3 из Thermus thermophilus относится к эволюционно удаленному малоизученному семейству B и характеризуется вдвое меньшей усредненной стехиометрией помпирования протонов [Kannt et al., 1998], то есть переносит через мембрану в среднем ~0.5 H+/e. Как соотносится усредненная дробная стехиометрия протонного насоса ЦО с транслокацией помпируемых протонов на отдельных одноэлектронных стадиях каталитического цикла? Может ли изменение усредненной стехиометрии помпирования свидетельствовать о принципиальном отличии механизма помпирования и сопряжения в оксидазах семейства B?

Электрогенные события, сопряженные с одноэлектронным фотовосстановлением ЦО ba3-типа из T.thermophilus.

На рисунке 14 показана генерация встроенной в протеолипосомы окисленной (состояние О) цитохромоксидазы ba3 в ответ на вспышку лазера в присутствие Rubpy.

Фотовосстановление от комплекса Rubpy сопровождается быстрым нарастанием мебранного потенциала, соответствующего переносу положительного заряда изнутри липосом наружу. Основной вклад в фотоэлектрический ответ вносят две компоненты с ~15 мкс и ~250 мкс и соотношением амплитуд 3:2, соответственно (рис. 14, кривая а).

В параллельной кинетике изменения оптического поглощения, компоненты с аналогичными характеристическими временами отражают, соответственно, перенос электрона от CuA на гем b и последующее частичное (~30%) реокисление гема b биядерным центром [Siletsky et al., 2009]. Учитывая распределение электронной плотности от гема b в биядерный центр [Siletsky et al. 2009], электрогенность сопряженного переноса протона в фазе с ~250 мкс соответствует транслокации одного субстратного протона из внутренней водной фазы к биядерному центру на расстояние около 2/3 толщины мембранного диэлектрика. Это означает, что в каталитическом цикле ЦО ba3-типа, перенос первого электрона в окисленное состояние O биядерного центра несопряжен с транслокацией помпируемого протона.

1, c, 40 мМ H2O фотопотенциал, мв b, 4 мМ H2O 0, a, без добавок 0, 0, 0,0 0,5 1,0 100 время, мс Рисунок 14. Свето-индуцированная генерация мембранного потенциала цитохромом ba3.

Реакционная среда содержала буфер 5 мМ Трис-ацетат (pH 8), 40 мкМ Rubpy, 10 мМ анилин. Фотоэлектрические кривые были зарегистрированы на одном и том же образце без добавок (a) и после добавления H2O2 в указанных концентрациях (b и c).

В отличие от канонических цитохромоксидаз, биядерный центр окисленной ЦО ba практически не связывает внешние лиганды и, соответственно, не образует в присутствии H2O2 или при обработке смесью CO/O2 детектируемого количества интермедиатов P или/и F [Siletskiy et al., 1999]. Несмотря на это, при инъекции электрона от Rubpy в присутствии H2O2 наблюдается дополнительная электрогенная фаза (рис. 14, кривые b, c). Однако, в отличие от ЦО аа3-типа, скорость данной компоненты кинетики ba3 оксидазы прямо пропорциональна концентрации перекиси водорода в изученном диапазоне (0.5-80 мМ) с константой скорости второго порядка ~2000 M-1с-1 [Siletskiy et al., 1999]. Это означает, что данная электрогенная компонента индуцирована инъекцией электрона в ЦО и лимитируется скоростью взаимодействия H2O2 с биядерным центром.

Неактивный в окисленном состоянии, биядерный центр ЦО ba3-типа приобретает, таким образом, способность связывать лиганды (переходит в активное состояние) в ответ на восстановление гема b [Siletskiy et al., 1999]. Подобные особенности были отмечены ранее в случае ряда других гемопротеидов, включая двухгемовую пероксидазу из P.denitrificans и cd1 нитрат редуктазу [Hu et al., 1997;

Williams et al., 1997].

Интермедиаты каталитического цикла, разрешаемые при окислении кислородом восстановленной ЦО ba3 из T.thermophilus в режиме одного оборота Поскольку окисленная цитохромоксидаза ba3-типа из T.thermophilus не связывает экзогенные лиганды и не образует состояний частичного восстановления кислорода в биядерном центре, для установления интермедиатов каталитического цикла мы использовали синхронный запуск каталитической реакции во всей популяции фермента с помощью фотолиза комплекса восстановленной ЦО с окисью углерода в присутствии кислорода (т.н. метод “флоу-флэш”, [Gibson et al., 1963]). Кинетика переноса электронов отслеживалась по спектральным изменениям редокс-центров, сопровождающим их редокс-превращения в ходе оксидазной реакции [Siletsky et al., 2007]. Параллельно исследовалась быстрая кинетика электрогенного переноса электронов и протонов в ферменте с помощью “прямого” электрометрического метода [Drachev et al., 1978;

Drachev et al., 1979].

В результате глобальной аппроксимации двумерного массива спектрально кинетических данных, собранных в ходе реакции окисления полностью восстановленной ba3 оксидазы кислородом, были выявлены 4 последовательные перехода в каталитическом цикле фермента с 1~5.3 мкс, 2~13 мкс, 3~30 мкс и 4~750 мкс. Разностные спектры разрешенных кинетических компонент представлены на рисунке 15. В спектре первой кинетической компоненты (рис. 15А), уменьшение поглощения при 615 нм и увеличение поглощения при 595 нм и 560 нм отражают, соответственно, исчезновение несвязанной с лигандом восстановленной формы гема а3 и появление окси-комплекса или т.н. компаунда А (переход RA) [Hill et al., 1983].

В спектре второй кинетической фазы (2~13 мкс, рис. 15Б), уменьшение поглощения при 560 нм вместе с пиком при 612 нм указывает на одновременное окисление гема b и образование состояния P. На этой стадии, также как и в ЦО из митохондрий, молекула O2 расщепляется и принимает суммарно 4 электрона от гема а3, CuB и остатка тирозина 237 (аналог редокс-активного остатка тирозина Y288 в аа оксидазах), образующего ковалентную связь с гистидиновым лигандом CuB.

Рисунок 15. Оптические спектры кинетических компонент в реакции полностью восстановленного цитохрома ba3 с молекулярным кислородом. (А) Первая компонента реакции, 1~5 мкс. (Б) Вторая компонента, 2~13 мкс. (В) Третья компонента, 3~30 мкс.

(Г) Четвертая компонента, 4~740 мкс. Видимая область спектра (alpha) увеличена в 4 раза.

Спектр третьей кинетической компоненты (3~30 мкс, рис. 15В) принципиально отличается от такового в случае ЦО из митохондрий. В оксидазах семейства A данная стадия реакции приводит к образованию из состояния P (максимум при 607 нм) состояния F биядерного центра (максимум при 580 нм), что является результатом переноса протона из внутренней водной фазы в BNC, к связанному с CuB гидроксил-аниону, и сопровождается синхронным переносом электрона от СuA на низкоспиновый гем a. В ba оксидазе, в ходе данной кинетической фазы происходит полное ревосстановление низкоспинового гема b от CuA (увеличение поглощения при 560 нм), однако спектральные изменения полосы поглощения гема а3 отсутствуют (рис. 15В).

Спектр четвертой фазы в разрешенной кинетике цитохромоксидазы ba3 указывает на образование окисленного состояния O (увеличение поглощения в полосе с переносом заряда при 660 нм), а также исчезновение интермедиата гема а3 с пиком ~612 нм и перенос электрона в биядерный центр от гема b (уменьшение поглощения при 612 нм и 560 нм, соответственно) (рис. 15Г). Таким образом, спектральные и кинетические параметры разрешаемых состояний A, P и O оксидазы ba3-типа сходны с таковыми в митохондриальной ЦО. Однако аналог состояния F BNC в кинетике ЦО ba3-типа не обнаруживает характерных спектральных признаков интермедиата F аа3 оксидаз.

Cтадии генерации мембранного потенциала, сопряженные с окислением восстановленной ba3 оксидазы из T.thermophilus кислородом в режиме одного оборота В паралельной кинетике генерации мембранного потенциала в ходе одного каталитического оборота ba3 оксидазы также выделяются 4 компоненты (рис. 16).

Фотоэлектрический ответ начинается с микросекундной лаг-фазы (~5-6 мкс), отражающей электрометрически невидимые процессы высвобождения CO, связывания кислорода и образования состояния A. Вслед за лаг-фазой следуют три компоненты развития мембранного потенциала, соответствующие переносу положительного заряда через мембрану в направлении с N- к P-стороне липосомальной мембраны (рис. 16).

Рисунок 16. Кинетика генерации мембранного потенциала (черная линия) в ходе реакции полностью восстановленной цитохромоксидазы ba3 с кислородом. Через экспериментальную кривую проведена теоретическая (серая линия). Параметры теоретической кривой: k1=190 мс1 (амплитуда=0 мв), k2=90 мс1 (0.69 мв), k3=21.9 мс (4.33 мв), k4=1.84 мс1 (6.55 мв), k5=0.56 мс1 (0.35 мв). Условия: 100 мM HEPES (pH 8), мM глюкоза, 50 мкг/мл каталаза, 120 мкг/мл глюкозоксидаза, 10% CO в смеси с аргоном.

Реакция начиналась через 1.4 с после впрыска 100 мкл насыщенного кислородом буфера.

Вторая фаза электрометрического ответа (~11 мкс) цитохрома ba3 соответствует константе скорости перехода AP в оптических измерениях и составляет ~6% от полной амплитуды ответа. Основная часть кинетики генерации потенциала (около 90%) образуется в третьей (~45 мкс, ~36%) и четвертой (~550 мкс, ~55%) электрогенных фазах, которые относятся, соответственно, к третьему и четвертому переходу в оптических измерениях.

Чтобы определить точное число зарядов, переносимых через мембрану на каждой вычленяемой в ходе измерения одного оборота фермента стадии, мы параллельно исследовали реакцию обратного тока электронов в частично восстановленном ферменте.

Данная реакция представляет собой перенос электрона из BNC во входные редокс-центры после фотолиза окиси углерода в отсуствие кислорода. На рисунке 17 показана кинетика обратного переноса электрона в ba3 оксидазе, зарегистрированная с помощью оптической спектроскопии в полосе поглощения восстановленного гема a3 при 445 нм (черная линия) и с помощью электрометрических измерений (серая линия).

Рисунок 17. Кинетика обратного переноса электрона в оксидазе ba3. Оптические изменения полосы поглощения восстановленного гема a3 (445 нм, черный цвет, ось справа) и паралельные электрометрические измерения (серый цвет, ось слева).

Оптические измерения проводились на детергетном растворе фермента. Условия: 7 мкМ ba3 цитохромоксидаза, 0.1% додецил мальтозид, 0.1 M HEPES (pH 7.4), 1 атм. CO, оптический путь 1 см. Условия электрометрических измерений как на рис. 16.

Кинетика изменения поглощения A445 начинается с неразрешаемого скачка, вызванного фотодиссоциацией CO от гема a3 и образованием несвязанного с лигандом восстановленного гема a3. Последующее снижение поглощения с ~40 мкс отражает уход электрона с гема a3. Учитывая соответствующие коэффициенты экстинкции при 445 нм для абсорбционных изменений, вызванных фотолизом CO и окислением гема a3 [Liao et al., 1996], величина фракции окисляющегося гема a3 составляет ~4.2%.

Образующийся параллельно трансмембранный потенциал (рис. 17, серая линия) отражает электрогенное перераспределение электронной плотности между гемом a3 в биядерном центре и CuA. Учитывая фракцию окисляющегося гема a3, амплитуду параллельной электрогенной транслокации заряда и геометрическое расстояние между биядерным центром и CuA, оказывается возможным оценить величину генерации мембранного потенциала в ЦО, соответствующую переносу одного заряда на всю толщину мембранного диэлектрика. Это позволило нам в конечном итоге рассчитать электрогенность отдельных разрешаемых кинетических фаз в реакции полностью восстановленной ЦО с кислородом в режиме одного оборота. Число зарядов, переносимых через мембрану во второй, третьей и четвертой электрогенных компонентах, составило 0.15, 1.0, 1.68 заряда, соответственно [Siletsky et al., 2007].

На рисунке 18 приведена схема интермедиатов каталитического цикла цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus в ходе окисления кислородом восстановленного фермента в режиме одного молекулярного оборота. Сопряженная с образованием состояния P генерация мембранного потенциала в оксидазе ba3, эквивалентна по величине переносу заряда на ~15% толщины мембранного диэлектрика, что составляет около 4 и отражает электрогенное перемещение в биядерный центр протона, необходимого для разрыва кислород-кислородной связи. Донором протона служит, по-видимому, остаток тирозина 237 (аналог редокс-активного остатка тирозина Y288 в аа3 оксидазах), образующий ковалентную связь с гистидиновым лигандом CuB и располагающийся ниже CuB, на соответствующем расстоянии от биядерного центра (рис. 18).

Амплитуда электрогенного переноса зарядов в ba3 оксидазе на стадии, соответствующей во времени переходу PF, эквивалентна транслокации через всю толщину мембранного диэлектрика в точности одного заряда. Образующийся мембранный потенциал обусловлен перемещением электрона от CuA к гему b на 1/ толщины мембранного диэлектрика и сопряженным переносом протона из N-фазы в направление к BNC, на расстояние 0.6-0.7 толщины мембранного диэлектрика (рис. 18, [Siletsky et al. 2007]). Следовательно, в отличие от оксидаз семейства А, трансмембранной перекачки протона на данной стадии каталитического цикла ЦО ba3-типа не происходит.

Отсутствие в спектре соответствующего интермедиата цитохромоксидазы ba3 пика поглощения с максимумом ~580 нм, типичного для интермедиата F в оксидазах aa3-типа, означает то, что ходе данной стадии перенес протона из N-фазы происходит не в биядерный центр, а в его окрестность, не возмущая таким образом электронную структуру гема a3 и не влияя на его спектр [Siletsky et al., 2007]. Одним из наиболее вероятных акцепторов протона является консервативный остаток редокс-активного тирозина (Y237 в оксидазе ba3), который был депротонирован в ходе предшествующей стадии AP (рис.

18).

Рисунок 18. Схема интермедиатов каталитического цикла цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus, разрешаемых в кинетике окисления кислородом в режиме одного оборота.

Ромб и квадрат обозначают гемы b и a3 соответственно;

круги - CuA и CuB. В начальном состоянии (R) все редокс-центры восстановлены. Стадии переноса электрона и протонов обозначены пунктирными стрелками и указывают события, проиходящие на последующем этапе реакции.

Амплитуда электрогенного переноса зарядов в ЦО ba3-типа на стадии, соответствующей во времени FO переходу, в ~1.7 раза выше, чем на предшествующей стадии и близка к таковому для FO перехода каталитического цикла в оксидазах семейства А [Jasaitis et al., 1999;