Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генетических маркеров для диагно стики герпесвирусных инфекций человека

На правах рукописи

Суслопаров Михаил Александрович КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНО СТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА 03.00.06 –вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Кольцово – 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Госу дарственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Феде ральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополу чия человека Минздравсоцразвития России Научный руководитель (или консультант) Официальные оппоненты доктор биологических наук Беклемишев А. Б.

доктор биологических наук, профессор Рябчикова Е. И.

доктор медицинских наук, профессор Кожевников В. С.

Ведущая организация ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (ГУ НИИВ) РАМН. РАМН (Москва)

Защита состоится 26 сентября 2008 года в _ часов на заседании диссер тационного совета Д.208.020.01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу:

ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской об ласти, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан _ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л.И.Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Герпесвирусные инфекции занимают одно из первых мест по распространенно сти, сложности диагностики и лечения среди инфекционных заболеваний. Клинические симптомы этих инфекций перекрываются с множеством других заболеваний, поэтому большое значение придается разработке диагностических систем, позволяющих диффе ренцировать инфекционный агент с высокой степенью специфичности. Сложность имму нодиагностики герпесвирусных инфекций обусловлена так же значительным серологиче ским перекрестом не только внутри семейства, но и с другими вирусами.

Семейство Herpesviridae включает 8 видов герпесвирусов человека и состоит из трех подсемейств:

-, - и - herpesvirinae. Наиболее существенное социальное и эпиде миологическое значение имеют шесть агентов - вирусы простого герпеса 1 и 2-го типа (ВПГ-1 ВПГ-2);

вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая (ВВО);

цитомегаловирус (ЦМВ);

вирус герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6);

и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Вирус герпеса человека 7-го типа (ВГЧ-7), и вирус саркомы Капоши или вирус герпеса человека 8-го типа (ВГЧ-8) открыты сравнительно недавно и этиопатогенетическое значение этих инфекций изучено не достаточно. Данная работа посвящена исследованию первых 6-ти видов герпесвирусов человека.

Социально-экономический ущерб, наносимый -герпесвирусами, трудно пере оценить. Среди заболеваний, вызванных инфекцией вирусом простого герпеса, наиболь шее значение имеет генитальный герпес, заболеваемость которым в разных странах дос тигает 80 – 200 случаев на 100 тыс. населения, и этот показатель продолжает расти. По данным официальной статистики, в России показатель заболеваемости генитальным гер песом составляет 8-9 случаев на 100 тыс. населения, что, очевидно, не соответствует ис тинному положению и, прежде всего, связано с недостаточным клинико-диагностическим обследованием больных. В США, по данным CDC, 45 миллионов людей старше 12 лет, или 1 из 5 подростков и взрослых заражаются ВПГ-2. Начиная с конца 1970-х годов, ко личество людей с генитальным герпесом в этой стране увеличилось на 30%. Вероятно, при соответствующем уровне диагностики и статистических оценок, сходные показатели могут быть зарегистрированы в России. Не менее значительный ущерб здоровью наносит и окулярный герпес. Около половины случаев поражения роговицы и слепоты, вызванной инфекционными болезнями, связывают с герпетической инфекцией. Тяжелейшей герпесвирусной инфекцией является энцефалит, требующий экспресс-диагностики и не отложной помощи, частота которого увеличилась вдвое в последние 5-10 лет.

В настоящее время практически во всех развитых странах Запада существует вакцинопрофилактика детей против ветряной оспы. До введения VARIVAX вакцины в Соединенных Штатах Америки регистрировалось около 4 млн. случаев ветряной оспы в год (количество, эквивалентное числу новорожденных), что ежегодно приводило к 8 000 12 000 случаям госпитализации и, по крайней мере, к 100 смертельным случаям. В России вакцинация против ВВО отсутствует.

Возрастающая угроза биотерроризма требует разработки дифференциальной экс пресс-диагностики -герпесвирусов, которая позволит дифференцировать натуральную и ветряную оспу на ранних этапах клинических проявлений.

Сероэпидемиологические исследования -герпесвирусных инфекций показыва ют, что цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции от развитых, промышленных сообществ до различных групп аборигенов. Инфекция ЦМВ превалирует среди детей и подростков развивающихся стран, и в нижних социально экономических слоях экономически-развитых стран. Социально-экономическое значение этой инфекции прежде всего связывают с поражением герминативного эпителия у мужчин и женщин. У мужчин такие поражения приводят к полиплоидии сперматозоидов и к бес плодию. Оценка распространенности инфекции ЦМВ среди здоровых семейных пар в Юго-Западной Азии, обращающихся за медицинской помощью по поводу бесплодия ко леблется от 25,3% до 92%. Чрезвычайно актуально выявление острой инфекции у бере менных женщин, т.к. почти все случаи мертворождения инфекционной природы связыва ют с этой инфекцией. Не менее важно выявление инфекции ЦМВ во время беременности в связи с угрозой тератогенного эффекта. Широкое распространение ЦМВ среди людей, опубликованные данные о его связи с атеросклерозом и другими болезнями, диктуют не обходимость разработки более совершенных видов диагностики и детального изучения его роли в патогенезе этих заболеваний.

Вирус герпеса человека 6 типа исследуется сравнительно недавно, и эпидемиоло гия этой инфекции изучена недостаточно. Значительное количество работ посвящено роли ВГЧ-6 в патогенезе рассеянного склероза и других заболеваниях нервной системы. Опуб ликован ряд работ, показывающих вовлечение этой вирусной инфекции в формирование синдрома хронической усталости. Инфекция герпесвирусом 6 типа проявляется в младен честве в виде внезапной экзантемы, это - наиболее изученное проявление болезни. Разра ботка высокоспецифичной диагностики -герпесвирусных инфекций чрезвычайно акту альна ввиду их широкой распространенности и слабой изученности.

Инфекция вирусом Эпштейна-Барр (подсемейство – герпесвирусов) прежде все го ассоциируется с инфекционным мононуклеозом, лимфомой Биркита, носоглоточной (назофарингеальной) карциномой и лимфопролиферативными болезнями иммуносупрес сивных лиц. В большинстве случаев инфекция ВЭБ протекает без видимых проявлений болезни. Среди взрослого населения планеты у 80-90% здоровых лиц регистрируется се рологическое подтверждение инфекции вирусом ВЭБ в прошлом. Для вируса Эпштейна Барр, как и для других герпесвирусов человека, характерна скрытая (латентная) форма инфекции. В настоящее время значительно возросло количество онкозаболеваний, этиоло гическим агентом которых определен вирус Эпштейна-Барр. Все эти обстоятельства де лают разработку диагностики – герпесвирусных инфекций важной и актуальной.

В России для выявления антител к герпесвирусам в крови пациентов до наших исследований использовался твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе нативных антигенов. Анализ состояния разработок диагностических тестов для выявления антител к герпесвирусам в сыворотках больных показал, что принципиально важным в этой области является поиск и выбор высоко специфичных антигенов, прежде всего, по лученных методами генной инженерии.

Цель и задачи исследования Целью настоящего исследования было конструирование видоспецифичных ре комбинантных антигенов и выявление генетических маркеров герпесвирусов 1-6 типов для диагностики соответствующих герпесвирусных инфекций человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе анализа литературных данных выбрать иммунодоминантные бел ки герпесвирусов 1-6 типов человека для конструирования на их основе видоспецифич ных рекомбинантных антигенов.

2. С помощью компьютерного анализа аминокислотных последовательностей выбранных белков-антигенов герпесвирусов определить в их структуре потенциальные антигенные детерминанты и кодирующие их участки соответствующих генов, а также по добрать олигонуклеотиды-праймеры и оптимальные условия ПЦР для амплификации вы бранных районов генов исследуемых герпесвирусов.

3. Амплифицировать и клонировать выбранные районы геномов референсных штаммов герпесвирусов 1-6 типов человека в клетках E.coli в составе плазмидных экс прессирующих векторов. Наработать, очистить и оценить пригодность для диагностики полученных рекомбинантных антигенов:

• разработать вариант экспрессирующего плазмидного вектора, кодирующего шестигистидиновый тракт (6His), формирующий на С-конце целевого рекомбинантного белка аффинную мишень для очистки белка на металлохелатных сорбентах, • клонировать выбранные фрагменты геномных ДНК исследуемых герпесви русов в клетках E.coli в составе экспрессирующего вектора и получить штаммы продуценты соответствующих видоспецифичных рекомбинантных антигенов, • подобрать оптимальные условия очистки рекомбинантных белков-антигенов и наработать их в препаративных количествах, • используя стандартные панели сывороток и сыворотки от больных герпес вирусными инфекциями, оценить возможность использования полученных рекомбинант ных антигенов для выявления в сыворотках больных иммуноглобулинов, специфичных к соответствующим типам герпесвирусов, • разработать панель сывороток человека для выявления иммуноглобулинов, специфичных к цитомегаловирусу, • получить флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным антигенам ци томегаловируса.

4. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гено мов герпесвирусов 1-6 типов человека, депонированных в международных электронных базах данных, с целью выявления специфичных для них генетических маркёров:

• выявить районы геномов, перспективные для использования в качестве ге нетических маркеров соответствующих типов герпесвирусов, • с учетом вариабельности выбранных генетических районов герпесвирусов разработать олигонуклеотиды-праймеры, условия и кинетику амплификации методом ПЦР выбранных генетических маркеров, • создать лабораторные варианты и апробировать разработанные способы об наружения геномных ДНК герпесвирусов 1-6 типов методом ПЦР на коллекции референс штаммов герпесвирусов человека, а также на клиническом материале от больных.

Научная новизна В ходе работы впервые проведена комплексная оценка иммунодоминантных рай онов вирионных белков герпесвирусов человека 1-6 типов. Выявлены потенциальные ан тигенные детерминанты в иммунодоминантных районах белков шести типов герпесвиру сов человека. Сконструирован плазмидный вектор, обеспечивающий экспрессию клони рованных в его составе чужеродных генов с образованием белков, содержащих дополни тельную шестигистидиновую последовательность в С-концевой области цепи, позволяю щую осуществлять аффинную очистку белка на металлохелатных сорбентах. Необходи мость создания такого вектора была обусловлена отсутствием в то время конструкций, формирующих на С-конце 6His мишень для очистки полноразмерной копии белка. Су ществовали только конструкции, обеспечивающие экспрессию генов с образованием бел ков, имеющих аффинную мишень на N-конце.

На основе обнаруженных уникальных аминокислотных последовательностей в вирионных белках герпесвирусов (ВПГ-1, ВПГ-2, ВВО, ЦМВ, ВГЧ-6 и ВЭБ) разработаны рекомбинантные антигены, специфичные для соответствующих типов герпесвирусов че ловека:

• вирусов простого герпеса 1 и 2 типов: рек-gD-1 (ВПГ-1) и рек-gG-2 (ВПГ-2).

• вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая: рек-gE (ВВО).

• цитомегаловируса человека (ЦМВ): рек-рр150, рек-IE2, рек-р52 и рек-рр65.

• вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6): рек-р100 и рек-р41.

• вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ): рек-р18 и рек-р54.

Продемонстрирована перспективность использования полученных в данной ра боте рекомбинантных белков в качестве специфичных антигенов для выявления антител к соответствующим типам герпесвирусов.

Выявлены новые генетические маркеры герпесвирусов человека 1-6 типов.

Практическая ценность работы Практическая значимость данного исследования состоит в разработке рекомби нантных антигенов, специфичных для герпесвирусов 1-6 типов и перспективных для соз дания на их основе отечественных высокочувствительных диагностических систем удов летворяющих требованиям клинической практики.

С помощью разработанных в рамках данного исследования рекомбинантных ан тигенов рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65 в ЗАО «Медико-биологический союз» (г. Новоси бирск) создана и утверждена в ГИСК им. Л. А. Тарасевича стандартная панель сывороток человека для контроля иммуноферментных диагностических тест-систем, выявляющих IgG к цитомегаловирусу человека. Стандартная панель внесена в Реестр национальных стандартных образцов РФ под номером: ОСО 42-28-360-01.

На основе сконструированных в настоящей работе антигенов ЗАО «Медико биологический союз» (Новосибирск) разработана иммуноферментная тест-система для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. Разработанные ре комбинантные антигены герпесвирусов в настоящее время используются для создания иммуноферментных тест-систем такими отечественными производителями, как: ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) и ЗАО «ИмДи» (Новосибирск).

Получены меченые моноспецифические кроличьи антисыворотки к рекомби нантным антигенам рек-IE2 и рек-рр65 цитомегаловируса, позволяющие выявлять этот вирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ.

Созданы лабораторные варианты тестов для обнаружения герпесвирусов челове ка, основанные на амплификации методом ПЦР выявленных в настоящей работе генети ческих маркёров соответствующих типов герпесвирусов. Показана перспективность соз дания на их основе коммерческих тест-систем. В настоящее время часть их из них исполь зуется в ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) для создания диагностических тест-систем.

Значительная часть разработанных в работе генетических конструкций, олигонуклеотидов защищена патентами Российской Федерации.

Разработанные способы диагностики инфекций, вызываемых герпесвирусами 1- типов, могут быть использованы в клинической диагностической практике, для скрининга донорской крови, которая пока в России не тестируется на присутствие вирусов данной группы, в трансплантологии и для проведения мониторинга различных групп населения во время эпидемиологических обследований.

Положения, выносимые на защиту 1. Сконструированные экспрессирующие плазмидные конструкции, включающие фрагменты генов герпесвирусов человека, обеспечивают биосинтез в клетках E. coli ре комбинантных белков, содержащих иммунодоминантные области антигенов герпесвиру сов 1-6 типов.

2. Использование рекомбинантных антигенов герпесвирусов 1-6 типов в ИФА позво ляет выявлять антитела в сыворотке крови человека, специфичные для соответствующих герпесвирусов.

3. Сконструирован бактериальный (E. coli) экспрессирующий вектор на основе плазмид ной ДНК pUR290-6*his. Отличительными особенностями этой конструкции является ко дирование шестигистидинового тракта (6His), который формирует на С-конце целевого рекомбинантного белка аффинную мишень для очистки полноразмерной копии белка на металлохелатных сорбентах, и биосинтез -галактозидазы, которая в конечной конструк ции укорачивается до небольшого размера и обеспечивает высокий уровень сорбции бел ка на полистирольных планшетах.

4. Флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным белкам рек-рр150, рек-IE2 и рек-рр65 цитомегаловируса позволяют выявлять этот вирус в клинических образцах с по мощью иммунофлуоресцентного анализа in situ.

5. Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека (ОСО 42-28-360-01) позволяет контролировать качество им муноферментных тест-систем, выявляющих специфические IgG к ЦМВ.

6. Олигонуклеотидные праймеры к генам US-6 (ВПГ-1) и UL44 (ВПГ-2), UL36 (ВВО), UL55 (ЦМВ), BKRF1 (ВЭБ) и U11 (ВГЧ-6), используемые в ПЦР, позволяют обнаружи вать геномные ДНК различных штаммов и клинических изолятов соответствующих типов герпесвирусов.

Конкретное участие автора в получении результатов Участие автора при проведении всех исследований по диссертации заключается в личном проведении и участии практически во всех экспериментальных и теоретических работ. А также в научном руководстве и соруководстве исследований по герпесвирусам, выполняемых в лабораториях ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", совместно с сотрудниками других институтов и производственных фирм.

Апробация работы Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конфе ренциях и симпозиумах: Международной конференции " A multidisciplinary approach towards controlling cytomegalovirus disease" (Sweden, Stockholm, 1995), Международной конференции “The 22nd International Herpesvirus Workshop”(La Jolla, California,1997), Юби лейная конференция, посвященная 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва,1997), Международной конференции “CMV 7th International Workhop” (Brighton, UK, 1999), Международной конференции «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium» (Russia, 1999), Российской научно-практической конфе ренции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Россия, 2005).

Публикации По материалам исследований опубликовано 15 статей в реферируемых научных журналах и получено 10 патентов Российской Федерации.

Структура работы Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы материалы и мето ды и главы из 5 разделов, отражающих результаты собственных исследований и их обсу ждения, выводов и приложений. Работа изложена на 416 с, включая 62 таблицы и 127 ри сунков. Список литературы из 657 наименований включает 35 отечественных работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Теоретический анализ иммунодоминантных белков герпесвирусов человека 1-6 типов В настоящее время в ИФА используют денатурированные формы белков, которые обеспечивают высокую однородность сорбции на планшете и стабильность величины оцениваемой оптической плотности. Поэтому этот раздел нашей работы был посвящен выявлению только непрерывных или линейных антигенных детерминант.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с помощью компьютерной программы Alignment Service (v. 4.1.). Для поиска гомологов белков использовали компьютерную систему создания банка образов белковых семейств PROF_PAT 1.0. Теоретический анализ структуры белка осуществляли с использованием программы PC/GENE и разработанных в ГНЦ ВБ «Вектор» программ SALIX и Alignment Service. Нуклеотидные последовательности геномных ДНК и аминокислотные последова тельности белков герпесвирусов человека 1-6 типов, были получены из банка данных GeneBank и анализировались с помощью компьютерной программы ClustalX.

-Герпесвирусы Вирусы простого герпеса 1 и 2 типа По данным литературы, при инфекции максимальное количество иммуноглобу линов крови вырабатывается на структурные белки вируса, и среди этих белков наиболее сильные антигены - гликопротеины gD, gB, gC и gG, кодируемые генами US6, UL27, UL44 и US4, соответственно. Гликопротеины gD-1 и gD-2 достаточно гомологичны между собой, но C-концы этих белков имеют низкую степень гомологии. Показано, что специ фические антитела к ВПГ-1 вырабатываются иммунной системой инфицированного чело века именно к C-концевой линейной части белка. Гликопротеин, gD, играет основную роль в В-клеточном иммунном ответе к ВПГ. Были идентифицированы четыре области gD (I-IV), важные для вирусного морфогенеза. Показано, что мутации в этих областях gD препятствуют появлению полноценного инфекционного вируса. Кроме того, они затраги вают иммунодоминантные районы и препятствуют формированию антигенных эпитопов (рис. 1).

Рис. 1. Схематическое изображение полноразмерной последовательности gD ВПГ. Полно размерная последовательность в вирионах ВПГ. Размер gD-1 - 393 а.о. Размер gD-2 - 392 а.о.

Каждый из них имеет сигнальную последовательность для секреции, имеет три N-сцепленных углевода (круги), три дисульфидных связи (С-С) - штриховая линия. Мутации, ассоциирован ные с функцией, накапливаются в четырех областях (I - IV). Прямоугольниками черного цвета обозначены гипотетические антигенные детерминанты 1-7, по данным литературного анализа.

Учитывая данные литературного анализа, этот гликопротеин мы выбрали в каче стве кандидата на создание рекомбинантного антигена ВПГ-1.

Рис. 2. Профиль гид рофильности gD-1. В прямоугольники взяты 380 388:

области выявленных Ile антигенных детерми Arg нант С-конца белка.

Glu Asp Высота прямоугольни Asp ка пропорциональна Gln Pro- индексу гидрофильно Ser сти детерминанты (по Ser следовательности ги потетических детерми нант указаны в сно сках).

293-298: Ala-Pro-Glu-Asp-Pro 368-375:Thr-Arg-Lys-Ala-Pro-Lys-Arg-Ile Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка gD-1 (ВПГ-1) с помощью программы PC/GENE выявил основные гипотетические линейные антигенные детерминанты (рис. 2). Поэтому для амплификации гена белка gD-1 выбрали только об ласть, кодирующую C-концевую гидрофильную часть этого белка, с 269 по 392 а.о. (раз мер ДНК-фрагмента, включая праймеры, 395 п.н.) и содержащую все 3 антигенных эпито па, предсказанных компьютерным анализом.

Одним из основных антигенов вируса простого герпеса 2 типа является гликопро теин G (gG). Он кодируется геном US4 и представляет собой гликозилированный белок с молекулярной массой 100 кДа и является одним из белков, составляющих оболочку виру са. Как показано в значительном количестве работ, в отличие от других вирусных глико протеинов этот гликопротеин является высоко специфичным антигеном ВПГ-2. Этот ви русный белок не имеет серологического сродства с белками других герпесвирусов челове ка и содержит от 3-х и более антигенных эпитопов (по данным разных авторов), сосредо точенных в С-конце молекулы и обладающих высокой специфичностью по отношению к антителам, специфичным к ВПГ-2.

Для поиска гомологов белка gG-2 ВПГ-2 среди всех известных белков была по строена база данных образов белков, гомологичных gG-2. Поиск гомологов gG-2 ВПГ-2 в системе PROF_PAT 1.0 выявил 19 аминокислотных последовательностей из банка Swiss Prot: 12 - штаммов ВПГ-2, 7 - штаммов ВПГ-1. При этом последовательности генов, коди рующих gG-1 и gG-2, показывают значительные различия. При степени гомологии не бо лее 40% в банке образов остаются только гомологи gG ВПГ-1,2. Гликопротеины gG-1 и gG-2 содержат 238 и 699 а.о., соответственно. Компьютерный анализ аминокислотной по следовательности белка gG-2 с помощью программы PC/GENE выявил основные гипоте тические линейные антигенные детерминанты (рис.3):

Рис. 3. Профиль гидро фильности gG-2. В пря моугольники взяты об 678 ласти выявленных анти 683:

генных детерминант. Вы Arg сота прямоугольника Ala Gly пропорциональна индек Arg су гидрофильности де Arg Arg терминанты (последова тельности гипотетиче ских детерминант указа ны в сносках).

316- 321: Arg-Pro-Arg-Phe-Arg-Arg 573- 578: Pro-Glu-Asp-Asp-Asp-Ser Уровень гомологии между эпитопами гликопротеинов G у вирусов ВПГ-2 и ВПГ 1 чрезвычайно низок. Это дает нам основание считать, что использование рекомбинантно го аналога С-концевой части белка gG-2 в качестве антигена не вызовет перекрестных се рологических реакций с антителами к ВПГ-1. Поэтому для амплификации гена и после дующего клонирования, с целью получения рекомбинантного антигена мы выбрали район с 438 по 695 а.о. gG2 (US4) ВПГ-2.

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая Гликопротеин gpI или gE (ORF68) обильно продуцируется в инфицированных ВВО клетках. Показано, что gpI самый иммуногенный среди гликопротеинов ВВО, сти мулирующий гуморальный и клеточный иммунитет. Использование этого нативного гли копротеина в качестве антигена показывает его высокую специфичность и очень слабую перекрестную реактивность.

Сравнение аминокислотных последовательностей данного белка разных штам мов, полученных из базы данных SWISSPROT Protein Sequence Database Release, показало полную штаммовую гомологию этих последовательностей и очень низкую гомологию с аналогами этого белка среди других герпесвирусов (менее 50%). Сравнение аминокислот ных последовательностей белка gE пяти штаммов и изолятов ВВО говорит о полной го мологии и очень высокой консервативности этого белка. Это практически уникальный случай среди герпесвирусных гликопротеинов. Анализ вторичной структуры белка позво лил выявить наиболее вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов.

Рис. 4. Профили веро ятных изгибов амино кислотной последова тельности gE, локали зация полярных ами to нокислотных остатков Asp и профиль гидрофиль Glu ности. В прямоуголь Lys Thr ники взяты области Arg предсказанных анти Asn генных детерминант (последовательности гипотетических детер минант указаны в сно 41 to 46 : Asp-Glu-Asp-Lys-Leu-Asp 238 to 243 : Glu-Asn-Thr-Lys-Glu-Asp сках).

С помощью компьютерного анализа в аминокислотной последовательности белка gE нами было выявлено наличие 3-х антигенных эпитопов с линейными детер минантами (рис.4). Поэтому для клонирования и получения рекомбинантного белка на основе gE был выбран фрагмент гена, кодирующий все три эпитопа с 25 по 344 а.о.

-Герпесвирусы Цитомегаловирус человека Анализ данных литературы по антигенному спектру белков цитомегаловируса человека показал, что среди его антигенов белки pp150, IE2, p52 и pp65 являются наиболее перспективными кандидатами для создания на их основе рекомбинантных антигенов. По этому наше внимание было сосредоточено на получении рекомбинантных антигенов на основе этих белков.

Представляемая работа начиналась в начале 90-х годов и первым, созданным ре комбинантным антигеном, был антиген рек-IE2 ЦМВ. К сожалению, в то время в нашей стране отсутствовали возможности компьютерного анализа. Поэтому выбор антигена, иммунодоминантной части и кодирующей его нуклеотидной последовательности был полностью основан на зарубежных литературных данных. В начале 90-х годов значитель ная часть исследователей с получением рекомбинантного IE2 связывала возможность соз дания на его основе высокоспецифичной ранней ИФА-диагностики. Логика таких, в том числе и нашей, работ основывалась на том, что это предранний белок, экспонируемый на мембране зараженной клетки. Предполагалось, что на него в первую очередь будут нара батываться антитела, как на одного из первых белков, презентуемых иммунной системе в ходе развития инфекции ЦМВ. Однако уже после первых работ по получению рекомби нантных форм белка IE2 интерес исследователей, стремящихся создать достоверную ИФА-диагностику, практически полностью пропал к этому антигену. В ходе ЦМВ инфек ции к этому белку, конечно, нарабатываются антитела, но в большинстве случаев их уро вень и время появления недостаточно достоверно связано с фазами инфекции. Мы выбра ли для клонирования всю последовательность гена IE2 (984 п.о.).

Не смотря на слабую серологическую реактивность, свойство IE2, экспонировать ся на мембранах зараженных клеток в ранней фазе инфекции, в настоящее время эффек тивно используется в клинической диагностике острой инфекции ЦМВ. Меченые моно клональные антитела и моноспецифические антисыворотки к нему позволяют с помощью микроскопии выявлять продуктивную инфекцию в той или иной ткани.

Главный матричный фосфопротеин рр150. Компьютерный анализ первичной структуры белка позволил определить локализацию иммунодоминантных областей, спе цифичных для ЦМВ и перспективных для создания на их основе рекомбинантного анало га антигена рр150. Нами было обнаружено три гипотетических антигенных детерминанты, которые отмечены на рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей белка pp150 ЦМВ с аналогичным белком р100 ВГЧ-6 показало, что эти эпитопы расположены в негомологичных районах белка. С целью получения рекомбинантного белка рек-pp для клонирования была выбрана нуклеотидная последовательность гена UL32, кодирую щая гидрофильную область белка 369-760 а.о. (размер ДНК-фрагмента 1176 н.о.) белка.

Рис. 5. Профили распреде ления -спиральных (Alpha) и -складчатых (Beta) струк тур, изгибов полипептидной молекулы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка рp150. Прямо угольниками серого цвета отмечены вероятные области формирования ядер антиген ных эпитопов (последова тельности гипотетических детерминант указаны в сно сках).

369-377 а.о. 714-719 а.о.

Asp-Glu-Glu-Glu-Lys-Arg-Arg-Glu-Arg Glu-Glu-Glu-Asp-Asp-Asp 429-439 а.о.

Asp-Glu-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Glu-Lys ДНК-связывающий белок p52 (ген UL44). Локализацию линейных антигенных детерминант осуществляли в аминокислотной последовательности, полученной из базы данных SWISSPROT (Protein Sequence Database Release 42.0). Анализ вторичной структу ры белка позволил определить три наиболее вероятные области формирования ядер анти генных эпитопов.

Рис. 6. Профили распре деления -спиральных (Alpha) и -складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молеку лы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка р52. Пря моугольниками серого цвета отмечены вероят ные области формирова ния ядер антигенных эпитопов (последова тельности гипотетиче 167-172 а.о. 410-417 а.о.

Lys-Arg-Asn-Val-Lys-Lys Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Ser-Glu-Asp ских детерминант указа ны в сносках).

337-343 а.о.

Gly-Lys-Lys-His-Asp-Arg-Gly В ходе анализа во внимание принимались особенности вторичной структуры ( складчатость окружения, отсутствие явных изгибов полипептидной цепи в гидрофильных петлях и наличие гидрофобного окружения), заряд аминокислотных остатков и гидро фильные свойства (на рис. 6, серым цветом помечены максимально гидрофильные участ ки).

Ag RGD Ag NGS OUT G1 G2 G3 G4 G KCG-COOH ядерная мембрана NH IN ДНК-связывающий сайт Рис. 7. Гипотетическая структура конформации белка р52 на ядерной мембране. Ag1, Ag2 и Ag3 – гипотетические антигенные эпитопы. NGS – сайт гликозилирования, RGD – сайт адгезии.

Спиралевидной линией обозначен трансмембранный участок. G1–G5 – гидрофобные участки бел ка состоящие из глициновых повторов.

В результате были выявлены гипотетические антигенные детерминанты, ядра эпитопов, трансмембранный домен, сайты адгезии, участок связывания ДНК и построена модель конформации белка р52, локализованного на ядерной мембране (рис. 7). Таким образом, выяснилось, что лишь два из трех гипотетических эпитопов способны с наи большей вероятностью быть антигенными детерминантами, т.к. один эпитоп расположен в зоне трансмембранного и ДНК-связывающего домена. При конструировании рекомби нантного антигена рек-p52 было решено клонировать область гена, кодирующую гидро фильную часть белка с 200 по 341 а.о. (размер ДНК-фрагмента 731 п.о.) и содержащую два антигенных эпитопа в своем составе. Выбранная область не содержит гомологий с аналогами ДНК-связывающего белка других типов герпесвирусов.

Матричный белок тегумента рр65. Белок pp65 (белок тегумента вириона, ген UL83) был выбран как следующий кандидат для создания рекомбинантного антигена.

Этот белок считают «маркером патогенности» и он индуцирует синтез специфических ан тител на ранних стадиях продуктивной инфекции.

Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка рр65 ЦМВ выявил наиболее гидрофильные области, и с учетом особенностей вторичной структуры, распределения зарядов и гидрофобности были предсказаны три потенциальные антиген ные детерминанты (рис. 8).

Исходя из полученных данных, область гена белка pp65, кодирующая гидро фильную часть этого белка с 231 по 551 а.о. и содержащая все антигенные эпитопы, пред сказанные компьютерным анализом, была выбрана нами для амплификации методом ПЦР и последующего клонирования составе экспрессирующих векторов в клетках E. coli.

Рис. 8. Профили распре деления -спиральных (Alpha) и -складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молеку лы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка рp65. Пря моугольниками серого цвета отмечены вероят ные области формирова ния ядер антигенных эпитопов (последова тельности гипотетиче ских детерминант указа 404-409 а.о. 538-543 а.о.

ны в сносках).

Ser-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu Lys-Arg-Arg-Arg-His-Arg 465-471 а.о.

Glu-Glu-Asp-Thr-Asp-Glu-Asp Вирус герпеса человека 6 типа Структурный белок p100, или белок тегумента (ген U11) вируса герпеса человека 6 типа является фосфопротеином (обозначается как рр100), активно реагирующим с сыво ротками крови человека при иммунологическом анализе.

551-556:

Lys-Glu Lys-Asn Asp-Lys 529-535:

Lys-Asp Leu-Arg Asp-Lys Asp 812-817:

Pro-Glu Glu-Lys Asp-Asp А 610-615: Lys-Lys-Asn-Asp-Arg-Asp 563-568: Lys-Glu-Arg-Asn-Asp-Lys 824-829: Pro-Glu-Glu-Lys-Asp-Asp В-тип А-тип Рис. 9. Теоретические профили распределения -спиральных (Alpha) и -складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофильных областей (Hydro) белка рр100. Прямоугольниками серого цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках).

В ходе компьютерного анализа был идентифицирован ген U11, кодирующий данный белок, и определена его нуклеотидная последовательность для А- и В-типов ВГЧ 6. Анализ также позволил нам предположить, что в аминокислотной последовательности белка p100 имеется 3-х антигенных эпитопа с уникальными линейными детерминантами (рис.9). Для амплификации гена белка p100 выбрали область, кодирующую район белка p100 с 494 по 842 а.о. и содержащую 3 гипотетических антигенных эпитопа.

Белок p41 ВГЧ-6, кодируемый геном U27 (старое название EPLF1), является го мологом белка ICP36, относящегося к семейству фосфорилированных и гликозилирован ных белков, которые кодируются геном UL 44 ЦМВ человека. Иммунохимические иссле дования с сыворотками пациентов с инфекцией герпесвируса 6 типа, показали, что белок p41 активно взаимодействует с вирусспецифическими IgM- и IgG-антителами к ВГЧ-6. В настоящее время он используется в качестве антигена при проведении ИФА. Компьютер ный анализ аминокислотной последовательности белка p41 с помощью программы PC/GENE выявил основные линейные антигенные детерминанты (рис. 10).

Практически ничего неизвестно в литературе об антигенном спектре этого белка.

Поэтому в качестве района для последующего клонирования кодирующей последователь ности и создания рекомбинантного антигена рек-р41 ВГЧ-6 мы выбрали всю последова тельность белка (с 1 по 363 а.о.).

Рис. 10. Профили гидрофильности p 305-309:

ВГЧ-6. В прямо Lys угольники взяты об Asn ласти выявленных Glu антигенных детер Asp минант. Высота пря Glu моугольника про порциональна индек су гидрофильности детерминанты (по следовательности гипотетических де терминант указаны в сносках).

341-346 : Glu-Lys-Glu-Asp-Ser-Glu 284-288 : Lys-Glu-Glu-Ser-Arg -Герпесвирусы Вирус Эпштейна-Барр Известно, что на острых стадиях развития инфекции ВЭБ в сыворотках крови больных обнаруживают IgM-антитела к вирусному капсидному антигену VCA, а также IgG к раннему антигену EA. В большинстве случаев при этом антитела связываются с р (VCA) и р54 (EA-D). Именно эти белки были выбраны для получение рекомбинантных антигенов, содержащих иммунодоминантные фрагменты белков р18 и р54.

Методами компьютерного анализа были выявлены гипотетические антигенные детерминанты на аминокислотных последовательностях белков р18 (VCA) и р54 (EA-D) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) (см. рис. 11 и 12, соответственно).

170-176 : Arg-Gly-Ala-Arg-Lys-Lys-Gln А Б 66-72 : Gly-Val-Pro-Arg-Arg-Gln-Arg 75-81 : Asp-Lys-Arg-Gln-Arg-Ala-Ser Рис. 11. Профиль гидрофильности белка р18 при выборке из 7 – (А) и 5 – (Б) аминокислот ных остатков в эпитопе (координаты: ось абсцисс – длина белка в а.о., ось ординат – индекс гид рофильности). На графике А прямоугольниками выделены области гипотетических антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках).

385-391 : Glu-Ala-Arg-Gln-Lys-Gln-Lys 379-385 : Arg-Lys-Arg-Thr-Ser-Ser-Glu А Б 133-138 : Asp-Lys-Val-Ser-Lys 308-314 : Ser-Glu-Pro-Glu-Asp-Lys-Ser Рис. 12. Профиль гидрофобности белка р54 при выборке из 7 – (А) и 5 – (Б) аминокислотных остатков в эпитопе (координаты: ось абсцисс – длина белка в а.о., ось ординат – индекс гидро фильности). На графике А прямоугольниками выделены области гипотетических антигенных эпи топов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках).

На рис.11А показаны три основные гипотетические детерминанты белка р18 при выборке 7 а.о. При выборке 5 а.о. в этом белке выявлялись и другие гипотетические де терминанты, равномерно представленные в N-концевой части белка (см. рис. 11Б). Поэто му для клонирования иммунодоминантного района была выбрана полная нуклеотидная последовательность гена BFRF3 белка р18. Аналогичным образом были выявлены 4 ос новные гипотетические детерминанты при выборке 7 а.о. (см. рис.12А) белка р54. Следует заметить, что в районе 78 – 391 а.о. были выявлены и другие гипотетические детерминан ты при выборке 5 а.о. (рис.12Б). Фрагмент гена BMRF1, кодирующий этот иммунодоми нантный район, был выбран для клонирования. В обоих белках были выявлены области гидрофобности. Однако уровень гидрофильности этих участков не превышал 0.42-0.68 и поэтому рассматривать их как трансмембранные домены представляется маловероятным.

Сравнение аминокислотных последовательностей со всеми белками других герпесвирусов человека показало отсутствие гомологии выявленных иммунодоминантных районов р18(VCA) и р54(EA) с белками других герпесвирусов. Это позволило нам надеяться, что выбранные районы окажутся уникальными, а рекомбинантные белки будут взаимодейст вовать только со специфическими к ВЭБ антителами.

Клонирование и экспрессия выбранных генов Получение и очистка рекомбинантных белков Иммуноферментный анализ Для получения высокоочищенных рекомбинантных антигенов в нашей лаборато рии, лаборатории герпесвирусов ГНЦ ВБ «Вектор», была сконструирована плазмида для интеграции чужеродных генов, в которой за клонированной последовательностью в рамке считывания следовала последовательность, кодирующая полигистидиновый тракт. Нали чие на С-конце рекомбинантного белка мишени из 6 остатков His позволяет использовать её для выделения с помощью аффинной хроматографии металлохелатные смолы (напри мер, Ni-NTA resin) и получать уровень очистки 90-95%. Наличие в нашей конструкции на С-конце рекомбинантного белка аффинной мишени, в отличие от существовавших в то время коммерческих конструкций, в которых полигистидиновый тракт чаще расположен на N- конце, при выделении на металлохелатной смоле однозначно подтверждало экс прессию гена и биосинтез полноразмерного кодируемого им рекомбинантного белка.

Наша экспрессирующая плазмидная конструкция была сделана на основе плаз миды pUR290. Отличительными особенностями этой конструкции является биосинтез полноразмерной -галактозидазы (которая в конечной конструкции укорачивалась до не большого размера), генетический маркер - ген -лактамазы (bla), определяющий устойчи вость трансформированных плазмидой клеток E. coli к ампициллину, и высокая устойчи вость к рекомбинации при пассировании. Использование этой конструкции приводит к накоплению продукта в нерастворимой форме в виде телец включения (inclusion body) в клетках E.coli. Это существенно повышает выход синтезируемого белка в сравнении с растворимыми формами. В производстве ИФА-тест-систем обычно используют денатури рованные формы белков антигенов. Это позволяет улучшить однородность сорбции белка на планшетах, что приводит к повышению стабильности, важной характеристике для вос произведения результатов, особенно при стандартизации тест-системы в целом. При этом максимальную однородность сорбции показывают гидрофобные белки, полученные в де натурирующих условиях. Во всех наших случаях были получены в составе клеточных включений гидрофобные химерные белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и ан тигена, заканчивающегося 6His-аффинной мишенью. Эти рекомбинантные белки эффек тивно сорбировались на полистирольных планшетах с помощью гидрофобного якоря, представленного коротким фрагментом -галактозидазы, и экспонировали в реакционное пространство гидрофильную часть, т.е. антиген.

Промежуточную плазмидную ДНК pUR290-6*his, кодирующую последователь ность из 6 His, конструировали так, что она располагалась после сайта узнавания эндонук леазой рестрикции SalI. Для этого ДНК pUR290 обрабатывали последовательно эндонук леазой рестрикции HindIII, фрагментом Кленова (достройка до тупоконечного фрагмента) и эндонуклеазой рестрикции SalI, и лигировали с синтетическим адаптером длиной 50 п.

н., обработанным предварительно в следующем порядке: эндонуклеаза рестрикции KpnI, фрагмент Кленова (достройка до тупоконечного фрагмента) и эндонуклеаза рестрикции SalI:

KpnI SalI 5’-ATCAGGTACCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTCGACAGCATCATCTTCT-3’ TAGTCCATGGAATCACTACCACTACCACTACCAGCTGTCGTAGTAGAAGA ***HisHisHisHisHisHis Выросшие колонии клонов проверяли: на присутствие вставки гидролизом эндо нуклеазой рестрикции EcoRI (116 п.н.) и отсутствие сайта эндонуклеазы рестрикции PstI.

Таким образом, был отобран клон, плазмидная ДНК (pUR290-6*his) которого содержала последовательность синтетического адаптера.

-Герпесвирусы Вирус простого герпеса 1 типа Амплифицированный ДНК-фрагмент (ампликон) гена US6 ВПГ-1, полученный с помощью ПЦР, компонентами которой были праймеры, в нуклеотидной последовательно сти которых присутствовали сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI соответственно прямому и обратному праймерам, и ДНК pUR290-6*his обрабатывали последовательно эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI. Затем выделяли в 4% полиакриламидном геле фрагмент гена US6 длиной 372 п.о. и фрагмент вектора длиной 5370 п.о. Концы получен ного фрагмента и вектора лигировали.

Рис. 13. Физическая карта ре комбинантной плазмиды pHSVD1.

Целевая плазмида pHSVD1 получается в результате обработки плазмидной ДНК pUR290-D1-6*his эндонуклеазами рестрикции BamHI, EcoRV, фрагментом Кленова с по следующим лигированием (рис. 13).

После определения первичной структуры клонированного гена методом Макса ма-Гилберта полученные результаты сравнивали с известными литературными данными для различных штаммов ВПГ-1. Нуклеотидная последовательность клонированного гена US6 ВПГ-1 полностью совпадала с аналогичной для этого фрагмента штамма KOS ВПГ- (GeneBank Database, L09245).

На рис. 14 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ бел ков из клеточных лизатов различных клонов E. coli. На этом же рисунке представлен аф финно-очищенный химерный белок, синтезирующийся в клетках, несущих плазмиду pHSVD1. Электрофоретическая подвижность химерного белка соответствовала расчетной молекулярной массе 45 кДа.

M 1 2 3 M K Рис. 14. Электрофореграмма клеточных лизатов бактериальных штаммов-продуцентов, несущих 116 плазмиды pUR290-D1 и pHSVD1 со вставками гена US6 и продуцирующих рекомбинантные антигены, 97 kd и штамма, несущего плазмиду pUR290 (без встав ки).

Дорожки:

66 kd М – маркеры молекулярных масс белков (Sigma).

К – контроль бактериальных белков.

45 kd 1 – хроматографически очищенный рекомбинант ный белок рек-gD-1 (указан стрелкой), продуци руемый штаммом, несущим плазмиду pHSVD1.

2 – лизат клеток, несущих плазмиду pHSVD1.

3 – лизат клеток, несущих плазмиду pUR290-D1.

29 kd.

Вирус простого герпеса 2 типа Получали рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую экспрессию фрагмента гена US4 ВПГ-2, кодирующего иммунодоминантную часть gG2 с 438 по а.о. в составе плазмидного вектора, кодирующего фрагмент -галактозидазы (441 а.о.) и 6*His-мишень для аффинной очистки белка. На рис. 15 показана физическая карта полу ченной рекомбинантной плазмиды pHSVG2, обеспечивающей биосинтез рекомбинантно го антигена рек-gG2 ВПГ-2. В отличие от предыдущей конструкции (pHSVD1) в составе клонируемого фрагмента гена US4 оказался сайт EcoRV. В составе LacZ имеется 2 сайта рестриктазы HpaI. В данном случае вместо сайта EcoRV был использован сайт HpaI.

Рис. 15. Физическая карта плазмиды pHSVG2.

На рис. 16 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ белков из клеточных лизатов клонов E. coli. На этом же рисунке представлен аффинно очищенный белок, синтезирующийся в клетках, трансформированных плазмидой pHSVG2. Электрофоретическая подвижность белка соответствовала теоретически расчет ной молекулярной массе 46,3 кДа.

1 2 3 Рис. 16. Электрофореграмма хро матографически очищенного ре комбинантного белка - антигена рек-gG2 ВПГ-2.

Дорожки:

2, 3 – рек-gG2 ВПГ-2 (46,3 кДа).

1,4 – маркер молекулярной массы 50 в кДа (Pharmacia, США).

Секвенирование встроенного фрагмента US4, кодирующего иммунодоминантную часть гликопротеина gG2, показало полное соответствие нуклеотидной последовательно сти аналогичного района гена US4 штамма MS ВПГ-2.

К сожалению, в настоящее время в России и во многих странах отсутствует стан дартные панели сывороток на ВПГ-1 и ВПГ-2. Кроме того, на доступном для нас рынке тест-систем отсутствуют наборы, позволяющие выявлять с помощью ИФА антитела к ВПГ-1 и ВПГ-2. Существуют только тест-системы, выявляющие антитела к вирусам про стого герпеса, не разделяя их по типу.

В рамках проекта «Клинико-диагностические особенности течения генитальной герпетической инфекции в Новосибирске» (утвержден 19.03.2003 Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор», IRB00001360) нами было проведено ПЦР-обследование 238 человек.

Средний возраст больных составил 20–39 лет. Группа состояла из пациентов, обратив шихся по поводу рецидивирующих высыпаний в аногенитальной области, проблем фер тильности и вынашивания беременности. Среди этих пациентов было выбрано 16 человек, у которых в тех или иных клинических пробах (соскоб из цервикального канала, сперма и содержимое морфологических элементов высыпаний) была выявлена ДНК вирусов про стого герпеса 1 и 2 типа (8 пациентов с ДНК ВПГ-1 и 8 пациентов с выявленной ДНК ВПГ-2).

Таблица ИФА анализ сывороток пациентов с рецидивирующим генитальным герпесом на присутст вие специфических IgG-антител к ВПГ-1 и ВПГ-2.

№ сыво- ПЦР ротки Натив 1 ОП/ОПкрит Рекомб 1 ОП/ОПкрит Натив 2 ОП/ОПкрит Реком 2 ОП/ОПкрит 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Отр 0,97 0,63 0,066 0,35 0,137 0, 0,175 0, 2 отр 0,57 0,65 0,064 0,34 0,133 0, 0,102 0, 3 отр 0,53 0,55 0,099 0,52 0,094 0, 0,096 0, 4 отр 0,64 0,51 0,097 0,51 0,111 0, 0,116 0, 5 отр 0,96 0,57 0,107 0,56 0,116 0, 0,173 0, 6 отр 0,81 0,55 0,105 0,55 0,108 0, 0,146 0, 7 отр 1,08 0,41 0,091 0,48 0,085 0, 0,194 0, 8 отр 1,12 0,45 0,094 0,49 0,069 0, 0,201 0, 9 отр 1,09 0,68 0,113 0,59 0,132 0, 0,197 0, 10 отр 0,79 0,64 0,111 0,58 0,138 0, 0,142 0, 11 пол 2 0,612 3,40 0,250 1,32 1,533 8,07 1,497 7, 12 пол 2 0,794 4,41 0,218 1,15 1,344 7,07 1,569 8, 13 пол 2 0,94 0,47 1,606 8,45 1,217 6, 0,170 0, 14 пол 2 0,96 0,69 1,683 8,86 1,416 7, 0,173 0, 15 пол 2 0,87 0,49 2,001 10,53 1,346 7, 0,157 0, 16 пол 2 0,49 0,56 1,000 5,26 0,956 5, 0,089 0, 17 пол 2 1,12 0,24 0,741 3,90 1,143 6, 0,201 0, 18 пол 2 0,206 1,14 0,55 1,305 6,87 1,243 6, 0, 19 пол 1 1,249 6,94 1,189 6,26 0,86 0, 0,164 0, 20 пол 1 2,540 14,11 2,970 15,63 0,214 1,13 0, 0, 21 пол 1 1,375 7,64 1,343 7,07 0,61 0, 0,115 0, 22 пол 1 1,206 6,70 1,403 7,38 0,521 2,74 0,211 1, 23 пол 1 2,470 13,72 2,345 12,34 0,91 0, 0,173 0, 24 пол 1 1,645 9,14 2,410 12,68 0,72 0, 0,136 0, 25 пол 1 1,107 6,15 0,841 4,43 0,49 0, 0,094 0, 26 пол 1 1,940 10,78 2,111 11,11 0,97 0, 0,184 0, ОП 0,210 0,156 0,192 0, Крит.

Примечание: Жирным шрифтом обозначены отрицательные сыворотки.

В активной фазе заболевания у этих больных брали кровь и исследовали сыво ротки в ИФА на наличие специфических IgG-антител с использованием нативных и ре комбинантных антигенов ВПГ-1 и ВПГ-2 (см. табл. 1). В качестве отрицательного контро ля использовали сыворотки крови здоровых доноров, в которых не были выявлены анти тела к ВПГ.

Статистический анализ полученных данных показал, что чувствительность для всех использованных антигенов составила 100 %. Однако специфичность при этом суще ственно различалась для нативных и рекомбинантных антигенов:

специфичность (нативный антиген ВПГ-1) = 15/18*100%= 83%, специфичность (рекомбинантный антиген ВПГ-1) = 16/18*100%= 89%, специфичность (нативный антиген ВПГ-2) = 16/18*100%= 89%, специфичность (рекомбинантный антиген ВПГ-2) =17/18*100%=94%.

В этом исследовании нативные антигены были получены из вирусных референс штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2 (коллекция АТСС, США). Анализ полученных данных с помо щью ИФА показывал соответствие реагирования с одними и теми же сыворотками натив ного и рекомбинантного антигенов ВПГ-1 с высокой степенью специфичности (83 и 89% соответственно). Аналогичные результаты получены и для нативного и рекомбинантного антигенов ВПГ-2 (89 и 94% соответственно). Таким образом, полученные результаты по зволяют сделать вывод о перспективности использования в будущем разработанных ре комбинантных антигенов ВПГ-1 и ВПГ-2 в производстве ИФА-тест-систем для выявления специфических иммуноглобулинов.

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая Выбранный участок гена gE был амплифицирован в ПЦР с матрицы, полученной при выделении суммарной ДНК из клеток Vero, инфицированных ВВО (изолят №4). Раз мер амплифицированного фрагмента составил 946 п.о., что полностью совпало с теорети чески рассчитанной длиной фрагмента.

Нуклеотидная последовательность ампликона была определена методом Сенгера и показала полное соответствие участком гена ORF68 белка gE ВВО. Проведено клониро вание амплифицированного фрагмента гена gE в составе плазмидного вектора в клетках E.coli (рис. 17), как описано ранее, т.е. сразу после амплификации в плазмидный вектор.

Была получена плазмидная конструкция pVZVgE-6his.

Искомые клоны отбирали по наличию биосинтеза рекомбинантного белка с тео ретически рассчитанной электрофоретической подвижностью - 52 kDa (рис. 18, дорожка 2). Таким образом, были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантного белка рек-gE. Уровень биосинтеза белка составил 80-90 мкг/мл. С использованием сорбента Ni NTA-resin проведена аффинная очистка рекомбинантного белка рек-gE из клеточного ли зата штамма-продуцента E. coli.

Pvu II (55) P(LAC) Apa LI (3231) Pvu II (323) Рис. 17. Физическая кар Nco I (876) та плазмиды HpURgE-6his-VZV Cla I (905) pVZVgE-6his.

3670 bp Beta-gal-fusion gE(VZV) Ava I (1417) APr Sal I (1597) Apa LI (1985) 6xHIS Cla I (1635) P(BLA) Eco R I (1659) M 1 2 3 M Рис. 18. Электрофореграмма рек-gE.

Дорожка:

1 – клеточный лизат штамма-продуцента рекомбинантного белка рек-gE до проведе ния индукции.

2 – клеточный лизат штамма-продуцента рекомбинантного белка рек-gE после ин дукции (ИПТГ).

3 – очищенный рекомбинантный белок рек gE (аффинная хроматография и гель фильт рация) М – белковый маркер в кДа (Sigma) К сожалению, качество аффинного сорбента в значительной степени зависит от фирмы-производителя и это, прежде всего, приводит к присутствию разного количества клеточных белков в очищенном препарате. Поэтому 2-м этапом очистки была гель фильтрация на сефакриле S400 в денатурирующих условиях в присутствии 0,1% SDS. Та ким образом, мы достигли уровня очистки более 95% (рис. 18, дорожка 3). В дальнейшем при очистке рекомбинантных антигенов, в том числе и описанных выше, мы всегда ис пользовали двухступенчатый метод.

Для иммуноферментного анализа специфичных IgG к ВВО использовали белок после двух этапов очистки. ИФА проводили на сыворотках, выделенных от больных, ин фицированных ВВО, с ярко выраженной клинической картиной кожных морфологических элементов, в содержимом которых с помощью ПЦР была выявлена ДНК ВВО. Использо валась и панель предприятия ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) положительных и отри цательных сывороток, собранных от больных с подтвержденным диагнозом и сывороток крови здоровых доноров.

Таблица Выявление IgG-антител к ВВО в ИФА с использованием рек-gE и нативного антигенов ВВО.

Положительные Отрицательные Сыворотки Рек gE (ОП) нативный (ОП) Рек gE (ОП) Нативный (ОП) 1 0.833 2.090 0.143 0. 2 1.346 0.775 0.331 0. 3 1.952 1.947 0.203 0. 4 1.106 2.242 0.333 0. 5 2.701 0.425 0.348 0. 6 3.064 3.164 0.381 0. 7 1.755 2.017 0.179 0. 8 0.838 0.670 0.218 0. 9 0.801 0.495 0.142 0. 10 2.987 0.496 0.312 0. 11 2.817 0.677 0.108 0. 12 1.169 1. 13 2.193 0. 14 1.167 1. 15 3.650 2. 16 3.692 0. 17 2.305 1. 18 2.898 1. 19 3.519 0. 20 1.295 0. 21 2.809 1. 22 1.485 0. 23 1.554 0. 24 1.549 1. 25 3.131 1. 26 1.341 0. Среднее арифме тическое 2.075 1.233 0.245 0. Квадратичное откло- 0.944526 0.700356 0.097655 0. нение Отношение средних Рекомбинантный gE Нативный АГ положитель-ных и 8.46 ± 0.27 3.91 ± 0. отри- цательных ОП – условное значение оптической плотности в оптических единицах (о.е.) на единицу объема (мл) До проведения этого исследования на доступном для нас рынке отсутствовали наборы, выявляющие антитела к ВВО. Всего нами было исследовано 72 сыворотки. В ре зультате было показано, что полученный рекомбинантный белок рек-gE, реагирует с заве домо положительными сыворотками (от больных), а так же выявляет специфические ан титела к ВВО на панели сывороток. Реакция протекает с различной чувствительностью и специфичностью по сравнению с нативным антигеном ВВО, традиционно используемым в такой диагностике. Из табл. 2 видно, что рекомбинантный белок обладает большей чув ствительностью по сравнению с нативным антигеном. Также видно, что рекомбинантный белок увеличивает специфичность выявления положительных и отрицательных сывороток по сравнению с нативным антигеном. Так у положительных сывороток с №№ 5, 9, 10, 20 и 23 ОП в случае нативного антигена была близка к критичному значению и не могла счи таться достоверно положительной. Использование рекомбинантного антигена помогло разрешить эти сыворотки как строго положительные, напротив отрицательные сыворотки с №№ 7 и 8, определенные вначале в присутствии нативного антигена как сомнительно отрицательные, с рекомбинантным антигеном были окончательно определены как строго отрицательные. Допустимый интервал варьирования полученных результатов был рассчи тан с помощью статистического t-критерия (критерия Стьюдента). К сожалению, из-за от сутствия стандартных панелей проведение более обширных серологических исследований оказалось невозможным. Однако, исходя из полученных результатов этого эксперимента, можно сделать вывод, что рекомбинантный антиген рек-gE значительно увеличивает чув ствительность и специфичность при выявлении специфических IgG-антител к ВВО по сравнению с нативным антигеном в сыворотках крови при уровне достоверности 99% и может быть рекомендован к использованию в серодиагностике для их обнаружения.

-Герпесвирусы Цитомегаловирус человека Как описано ранее, первым рекомбинантным антигеном был белок рек-IE (UL122) ЦМВ. Он был получен в виде химерного с полноразмерной -галактозидазой ре комбинантного белка, в котором отсутствовала 6*His аффинная мишень. Встроенная по следовательность этого гена, определенная секвенированием, полностью совпала с после довательностями UL122, взятыми из базы данных GeneBank. Использование белка рек-IE в ИФА как антигена оказалось бесперспективным, т.к. он показывал очень противоречи вые результаты.

T5 promoter/lac operator element T5 promoter/lac operator element T5 transcription start T5 transcription start 6-his 6xHis-tag 6 his - DB APr APr 6his-UL pQE30-DB HCMV pQE-UL32 HCMV 4106 bp 4587 bp Col E1 (ori) Col E1 (ori) Рис. 19. Физические карты рекомбинантных плазмид pQE-UL32HCMV и pQE UL44HCMV, обеспечивающих биосинтез рекомбинантных антигенов рек-р52 и рек-рр150 ЦМВ в клетках E. сoli.

Для получения чистых форм рекомбинантных белков рек-р52 и рек-рр150 (без галактозидазы) фрагменты ДНК клонировали в клетках E.coli в составе плазмидных век торов серии pQE30 (Qiagen, Германия). Эти конструкции (pQE-UL44HCMV(рек-р52) и pQE-UL32HCMV(рек-рр150)) обеспечивали биосинтез чистых форм белков в E. сoli, т.е.

рекомбинантных полипептидов, содержащих иммунодоминантные области белков р52, рр150 ЦМВ и полигистидиновый тракт (6*His) на N-конце (рис. 19).

На рис. 20 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ аффинно-очищенных белков и клеточных лизатов клонов E. сoli, несущих плазмиды pQE UL44HCMV и pQE-UL32HCMV.

Рис. 20. Электрофореграмма исследуемых фрак ций белков. Электрофорез проводили в 10% SDS ПААГ.

Дорожки:

2, 3, 5, 6 – клеточные лизаты бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных антиге нов.

1, 4 – белковый маркер (Sigma).

2, 3 – химерные (с -галактозидазой) белки рек pp150 и рек-p52 соответственно.

5, 6 – «чистые» формы белков рек-pp150 и рек p52 соответственно.

8, 9 – хроматографически очищенные белки рек pp150 и рек-p52 соответственно.

7 – контроль бактериальных белков.

Получив аффинно-очищенные препараты рекомбинантных рек-р52 и рек-рр (как отдельно, так и в комбинациях 1:1, 1:3 и 1:5), проводили исследование их антигенных свойств и диагностического потенциала методом ИФА на сыворотках пациентов.

Таблица Определение абсолютной чувствительности смесей белков рек-рр150:рек-р52, как антигенов ЦМВ к IgG- и IgM-антителам.

Аг-1-1:1 Аг-2-1:0 Аг-3-5:1 Аг-4-3:1 Аг-5-0: ОП для IgG Среднее арифметическое значение отри 201 142 166 193 цательных сывороток 75 65 31 61 Среднее квадратичное отклонение 23 20 9 18 Ошибка репрезентативности Среднее арифметическое значение по 860 609 951 948 ложительных сывороток 428 279 309 451 Среднее квадратичное отклонение 77 50 55 81 Ошибка репрезентативности Отношение средних положительных и 4.27 4.28 4.91 3. 5. отрицательных сывороток Аг-1-1:1 Аг-2-1:0 Аг-3-5:1 Аг-4-3:1 Аг-5-0: ОП для IgM Среднее арифметическое значение ОП 311 373 203 216 отрицательных сывороток 107 133 44 61 Среднее квадратичное отклонение 21 26 8 12 Ошибка репрезентативности Среднее арифметическое значение ОП 635 737 543 457 положительных сывороток 137 143 82 128 Среднее квадратичное отклонение 34 36 20 32 Ошибка репрезентативности Отношение средних положительных и 2.04 1.975 2.11 2. 2. отрицательных сывороток Используя панель ЦМВ-положительных и отрицательных сывороток фирмы «ABBOT» (США) с нашими рекомбинантными антигенами в ИФА, было показано, что до бавление рек-p52 к рек-pp150 повышало специфичность по панели сывороток суммарного антигена как к IgG, так и к IgM ЦМВ. Так, из 48 ЦМВ-положительных сывороток реагиро вали со смесью рек-pp150-рек-p52 все 48, в отличие от 42 сывороток реагировавших толь ко на рек-pp150, а из 38 ЦМВ-отрицательных сывороток не реагировали со смесью рек pp150-рек-p52 все 38, в отличие от 5 из них, реагировавших с рек-pp150. Отношение сред них арифметических ОП (единицы оптической плотности в реакции ИФА) положительных и отрицательных сывороток позволяет оценить степень абсолютной чувствительности ан тигена. Чем выше это отношение, тем выше чувствительность. Абсолютная чувствитель ность IgG к ЦМВ и IgM к ЦМВ приведена в табл. 3. Из нее видно, что максимальной чув ствительностью в ИФА обладает смесь белков рек-рр150 и рек-р52 в соотношении 5:1.

Уровень специфичности оценивался по достоверности различия выборок данных по ОП для положительных и отрицательных сывороток (табл. 4) с помощью статистического t критерия (критерия Стьюдента). Расчеты показали, что самой высокой специфичностью при уровне достоверности 99% также обладает смесь белков рек-рр150:рек-р52 в том же соотношении – 5:1.

Таблица Оценка степени варьирования выборок для положительных и отрицательных сывороток при достоверности 99%.

Для выборки положительных и отрицательных сывороток по IgG Соотношение по белку антигенов рек Аг-1-1:1 Аг-2-1:0 Аг-3-5:1 Аг-4-3:1 Аг-1-1: рр150 и рек-р Среднее арифметическое значение ОП 201 142 166 193 отрицательных сывороток Доверительный интервал среднего ±167.73 ±145.04 ±69.12 ±135.29 ±118. арифметического значения ОП отрица тельных сывороток Среднее арифметическое значение ОП 860 609 951 948 положительных сывороток Доверительный интервал среднего ±874.87 ±569.18 ±630.74 ±919.81 ±499. арифметического значения ОП положи тельных сывороток Для выборки положительных и отрицательных сывороток по IgM Соотношение по белку антигенов рек Аг-1-1:1 Аг-2-1:0 Аг-3-5:1 Аг-4-3:1 Аг-1-1: рр150 и рек-р Среднее арифметическое значение ОП 311 373 203 216 отрицательных сывороток Доверительный интервал среднего ±218.30 ±271.81 ±89.42 ±124.46 ±110. арифметического значения ОП отрица тельных сывороток Среднее арифметическое значение ОП 635 737 543 457 положительных сывороток Доверительный интервал среднего ±291.59 ±304.85 ±174.54 ±273.40 ±313. арифметического значения ОП положи тельных сывороток Таким образом, установлено, что наши рекомбинантные белки реагируют с поли клональными антителами класса G и M, присутствующими в сыворотках пациентов с за болеваниями, вызванными ЦМВ. На основании полученных данных можно сделать вывод о возможности использования смеси рекомбинантных белков рек-p52 и рек-pp150 для се родиагностики ЦМВ-специфичных IgM- и IgG-иммуноглобулинов. Однако следует отме тить ряд выявленных недостатков: некоторую неоднородность результатов, связанную с особенностями сорбции чистых форм белков, а также сравнительно низкий выход реком бинантных белков.

Использование сочетания рекомбинантных рек-р52 и рек-рр150 улучшило ситуа цию с выявлением IgG и особенно IgM к ЦМВ, но всё же в некоторых случаях такая смесь оказалась малоэффективной. Поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на по лучение рекомбинантного рек-рр65, который сегодня считают «маркером патогенности», и который индуцирует синтез специфических антител на ранних стадиях продуктивной инфекции.

Выбранный участок гена UL83, кодирующий гидрофильную часть этого белка с 231 по 551 а.о., клонировали в составе плазмидного вектора pUR290-6*his в клетках E.coli (рис. 21). На рис. 22 представлен очищенный аффинной хроматографией химерный белок, синтезирующийся в клетках, несущих плазмидой pUL83HCMV.

ORI P(LAC) Beta-gal fragment Рис. 21. Физическая карта плазмиды pUL-83 HCMV Beta-gal-fusion pUL83HCMV.

3700 bp pp AP r 6xHIS P(BLA) М1 2 3М Рис. 22.. Электрофореграмма исследуемых фракций лизатов клеток E. coli штамма-продуцента рекомби нантного рек-рр65. Электрофорез проводили в 10% SDS-ПААГ. Дорожки:

1 – лизат клеток после индукции.

2 – хроматографически очищенный рекомбинантный белок рек-рр65.

3 – лизат клеток без индукции.

20 М – маркер молекулярного веса в кДа (Pharmacia, США).

Параллельно были получены аналогичные плазмидные конструкции с фрагмен тами генов UL32 и UL44 (рис. 23), ранее клонированных в pQE и кодирующие иммунодо минантные участки белков рр150 и р52 соответственно. Уменьшение размеров фрагмента -галактозидазы осуществляли делецией этого гена по сайтам рестриктаз EcoRV и HpaI соответственно для UL32 и UL44.

P(LAC) P(LAC) beta-gal-DB-6his pUL-44 HCMV pUL-32 HCMV 3403 bp 4582 bp DB AP r Beta-gal-LP-6his AP r 6-His P(BLA) P(BLA) 6-His LP Рис. 23. Физические карты плазмид pUL32HCMV и pUL44HCMV, обеспечивающих био синтез рекомбинантных антигенов рек-р52 и рек-рр150 ЦМВ в клетках E. coli.

Чтобы окончательно убедиться в том, что варианты наших антигенов с фрагмен том -галактозидазы (химерные) эффективнее в ИФА (за счет лучшей сорбции на поли стироле) по сравнению с «чистыми» формами рекомбинантных белков, мы сравнивали эти две формы рекомбинантного рек-рр150, как наиболее реагирующего, на стандартной панели сывороток от пациентов с инфекцией ЦМВ. В табл. 5 приведены данные сравне ния двух форм (химерной и «чистой») рек-рр150 на аттестованной панели. Статистиче ский анализ полученных данных показал:

С (для рек-рр150- химерный) = (15/16)*100% = 93,75%, С (для рек-рр150- «чистый») = (12/16)*100% = 75%.

Чувствительность по панели = (Р/20)*100%:

Ч (для рек-рр150- химерный) = (20/20)*100% = 100%, Ч (для рек-рр150- «чистый») = (19/20)*100% = 95%.

Из выше приведенных данных, очевидно, что чувствительность и специфичность «химерной» формы выше «чистой» формы антигена рек-рр150. Эти результаты убеждают в необходимости продолжения исследований по созданию и в дальнейшем рекомбинант ных антигенов по разработанной нами стратегии.

В итоге были получены 3 штамма E. сoli, продуцирующие рекомбинантные анти гены ЦМВ. На рис. 24 приведены результаты электрофоретического разделения в SDS ПААГ аффинно-очищенных химерных белков рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65, синтези рующихся в клетках, несущих плазмиды: pUL32HCMV, pUL44HCMV и pUL83HCMV.

Таблица Результаты сравнительного испытания двух форм рек-рр150 в ИФА на панели сывороток содержащих IgG, специфические к ЦМВ.

рек рек-pр150 (хи- pр Аттестация № сыворотки. мерный вари- ОП/ОП крит. («чис- ОП/ОПкрит.

сыворотки ант, fusion) тая» форма) 1 2 3 4 1 0,112 0,626 0,123 0,769 отр 2 0,11 0,615 0,143 отр 0, 3 0,076 0,425 0,086 0,538 отр 4 0,147 0,821 0,106 0,663 отр 5 0,118 0,659 0,149 отр 0, 6 0,16 0,115 0,719 отр 0, 7 0,143 0,799 0,173 отр 1, 8 0,117 0,654 0,146 отр 0, 9 0,069 0,385 0,126 0,788 отр 10 0,096 0,536 0,097 0,606 отр 11 0,101 0,564 0,051 0,319 отр 12 0,098 0,547 0,034 0,213 отр 13 0,127 0,709 0,017 0,106 отр 14 0,115 0,642 0,013 0,081 отр 15 0,111 0,620 0,019 0,119 отр 16 0,122 0,682 0,049 0,306 отр 17 1,659 9,268 1,546 9,663 пол 18 1,623 9,067 1,865 11,656 пол 19 2,108 11,777 1,498 9,363 пол 20 2,19 12,235 2,04 12,750 пол 21 1,707 9,536 1,542 9,638 пол 1 2 3 4 22 2,301 12,855 2 12,500 пол 23 2,132 11,911 1,654 10,338 пол 24 1,875 10,475 1,458 9,113 пол 25 1,294 7,229 1,299 8,119 пол 26 1,235 6,899 1,364 8,525 пол 27 0,488 2,726 0,266 пол 1, 28 0,714 3,989 0,554 3,463 пол 29 1,826 10,201 0,998 6,238 пол 30 1,356 7,575 0,657 4,106 пол 31 0,88 4,916 0,357 2,231 пол 32 0,805 4,497 0,892 5,575 пол 33 1,283 7,168 0,897 5,606 пол 34 1,223 6,832 1,009 6,306 пол 35 1,247 6,966 0,675 4,219 пол 36 0,507 2,832 0,639 3,994 пол ОПкрит. 0,179 0, Примечание: жирным шрифтом выделены данные для «серой» зоны.

Специфичность по панели = (N/16)*100%:

М1 2 3М Рис. 24. Электрофореграмма фракций хроматографически очищенных реком бинантных белков-антигенов ЦМВ.

Электрофорез проводили в 10% SDS ПААГ.

67 Дорожки: 1 – рек-рр150;

2- рек-рр65 и 3- рек-р52.

М – маркер молекулярного веса в кДа (Pharmacia, США).

Для оценки антигенных свойств полученных рекомбинантных белков рек-рр65 и рек-рр150 использовали разработанную с нашим участием и аттестованную ГИСК им.

Л.А. Тарасевича панель положительных и отрицательных сывороток к ЦМВ (табл. 6).

ИФА было показано, что сам по себе рекомбинантный рек-pp65 не мог являться достаточ ным критерием в качестве антигена для выявления антител, специфичных к ЦМВ, но в дополнении с рекомбинантным антигеном рек-pp150 значительно увеличивал чувстви тельность выявления таких сывороток. Как упоминалось выше, отношение средних ариф метических ОП положительных и отрицательных сывороток позволяет оценить степень абсолютной чувствительности антигена. Чем выше это отношение, тем выше чувстви тельность. В табл. 6 мы видим, что смесь белков рек-рр150-рек-рр65 имеет более высокий показатель этого отношения, а значит и большую чувствительность. Уровень специфич ности оценивали по количеству выявляемых сывороток в стандартной панели. Он показал такое же значение как для рек-рр150, так и смеси рек-рр150-рек-рр65, т.е. все отрицатель ные сыворотки остались отрицательными, а положительные - положительными.

Зная, что антитела к рр65 чаще всего появляются именно при острой фазе инфек ции, мы провели сравнительный анализ (табл. 7) сывороток больных, перенесших транс плантацию почки, двумя методами – с помощью ИФА, в котором использовали антигены рек-pp150, рек-pp52 и рек-pp65 для обнаружения ЦМВ-специфичных IgM, и ПЦР.

Таблица Данные ОП в ИФА по панели аттестованных сывороток для ЦМВ.

Панель Отрицательные сыворотки Положительные сыворотки АГ рек- рек-рр65 рек- рек- рек-pр65 рек рр150 рр150- pр150 рр150 рек-рр65 рек-рр 1 2 3 4 5 6 1 0.350 0.160 0.411 2.255 0.162 2. 2 0.447 0.217 0.434 1.586 0.342 1. 3 0.169 0.133 0.215 1.600 0.217 1. 4 0.254 0.131 0.289 2.094 0.193 2. 5 0.517 0.158 0.442 0.952 0.276 0. 6 0.376 0.201 0.388 1.394 0.487 1. 7 0.263 0.167 0.306 1.996 0.228 2. 8 0.226 0.104 0.345 1.491 0.622 1. 9 0.302 0.136 0.317 1.778 0.503 2. 10 0.212 0.115 0.357 1.131 0.269 1. 11 0.136 0.125 0.166 2.212 0.253 2. 12 0.260 0.126 0.261 0.732 0.186 0. 13 0.389 0.133 0.270 0.651 0.162 0. 14 0.359 0.138 0.261 1.172 0.195 1. 15 0.158 0.133 0.308 0.671 0.204 0. 16 0.281 0.179 0.271 1.132 0.262 1. 17 0.679 0.188 0. 18 1.359 0.538 1. 19 0.832 0.238 1. 20 1.238 0.336 1. 21 0.721 0.235 0. Среднее зна- 0.294 0.147 0.315 1.318 0.290 1. чение Квадратичное 0.11 0.03 0.08 0.528 0.134 0. отклонение Отношения средних, поло- 4.487 ± 0. рек-рр жительных и отрицательных рек-рр150-рек-рр65 4.745 ± 0. При использовании в ИФА только рек-рр150 выявлены 5 положительных сыво роток, однако в варианте с добавлением к первому рек-р52 и рек-рр65 количество таких сывороток увеличилось до 7. Таким образом, уже из этих результатов видно, что сероди агностика острой инфекции не может быть достоверно проведена с применением только одного антигена из ряда рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

Вероятно, что при разных течениях заболевания в острой фазе у разных пациен тов присутствуют в крови антитела к каждому из трех этих белков, но с разными титрами.

Поэтому только совместное использование всех трех белков в качестве антигенов в ИФА позволит эффективно выявлять характерные для разных фаз инфекции ЦМВ специфичные антитела.

Таблица Результаты обследования пациентов, перенесших трансплантацию почки. Наличие вируса опреде ляли методом ПЦР. Рек-pp150, рек-р52, рек-рр65 и рек-рр150/рек-рр65/рек-р52 – ИФА, где в каче стве антигена использовали соответствующий рекомбинантный белок. Культ. АГ – ИФА, где ан тигеном служил нативный вирус ЦМВ (штамм AD-169).

ПЦР Рек-рр150 Рек-р52 Рек-рр65 Рек-рр150/рек- Культ. АГ рр65/рек-р 1 +++ ++ + +/- +++ 2 - - - - - 3 ++ + +/- ++ ++ +/ 4 +/- + - - ++ +/ 5 + + - + ++ 6 - - - - - 7 - - - - - 8 - - - - - 9 - +/- + +/- + 10 + - ++ ++ + +/ 11 - - - - - 12 ++ + - - + 13 - - - - - 14 - - - - - 15 +/- - +/- - - Вирус герпеса человека 6 типа ПЦР-фрагмент ДНК, соответствующий размеру 1051 п.о. и кодирующий имму нодоминантную часть белка р100, был клонирован в клетках E.coli в плазмидном экспрес сирующем векторе pU11HHV6 (рис.25).

На рис.26. приведена картина электрофоретического разделения белков в SDS ПААГ из клеточных лизатов клонов E. coli. На этом же рисунке представлен аффинно очищенный химерный белок, синтезирующийся в клетках, несущих плазмиду pUHHV6.

Электрофоретическая подвижность химерного белка соответствует расчетной молекуляр ной массе 82,5 кДа.

Рис. 25. Физическая карта плазмиды pU11HHV6.

1 2 3 205 кДа Рис. 26. Электрофореграмма 116 кДа рек-р100.

97 кДа Дорожки:

1 – клеточный лизат штамма 66 кДа продуцента после индукции IPTG.

43 кДа 2 – очищенный рекомбинант ный белок рек-р100.

3 – клеточный лизат до прове дения индукции.

4 – белковый маркер (Sigma).

29 кДа Рекомбинантный белок рек-p41 ВГЧ-6, кодируемый геном U27, получали клони рованием ПЦР-фрагмента 1125 п.о. в экспрессирующем векторе pUR290-6*his в клетках E. coli. Окончательный вариант плазмиды получали делетированием последовательности гена LacZ по сайту EcoRV, т.к. в составе встраиваемого фрагмента гена U27 находится сайт HpaI. Окончательно была получена конструкция pU27HHV6 (рис. 27).

Pvu II (55) Replication Origin P(LAC) Apa LI (4086) Pvu II (323) Hpa I (657) Рис. 27. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pU27HHV-6.

Cla I (1055) RVpURp41-6his 4525 bp Hpa I (1281) APr Beta-gal-fusion Apa LI (2840) P(BLA) Eco R I (2514) Cla I (2490) p Hpa I (1956) 6xHIS Sal I (2452) 1 2 3 Рис. 28. Электрофореграмма лиза тов клеток E.coli (штамм BMH) 94 кДа Дорожки:

1 – клеточный лизат бактери 67 кДа ального штамма-продуцента.

43 кДа 2 – хроматографически очищен ный рекомбинантный белок рек р41.

3 – контроль бактериальных бел 30 кДа ков – клеточный лизат E. coli.

4 – белковый маркер (Sigma).

20,1 кДа Экспрессию целевого гена U27 ВГЧ-6 проверяли по наличию рекомбинантного белка 82,4 кДа, выделяемого с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin из клеток E.coli, несущих плазмиду pU27HHV6 (рис. 28, дорожка 2). Были отобраны клоны, использованные в дальнейшем в качестве штаммов-продуцентов рекомбинантного анти гена рек-р41 ВГЧ-6.

Полученные рекомбинантные белки рек-р100 и рек-р41 использовали в качестве антигенов для выявления специфических IgG к ВГЧ-6 методом ИФА в сыворотках крови больных и здоровых людей.

Таблица Результаты выявления IgG, специфичных к ВГЧ-6, у различных групп населения Новосибирской области.

Выявлены IgG к ВГЧ- Пациенты (группы обсле- Количество пациентов Количество % дуемых) Матери (беременные) 153 110 71, Новорожденные (до 1мес.) 153 108 70, Онкологические больные 52 49 94, Больные после трансплан- 16 10 тации почки Доноры крови 247 173 Поскольку однозначных данных по эпидемиологии ВГЧ-6 нет, в табл. 8 пред ставлены произвольно выбранные группы населения Новосибирской области. Получен ные результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными. Среди до норов крови нами было выявлено 70% серопозитивных лиц. По литературным данным, их число в процентном отношении колеблется от 64,5 до 67,4%. Однако у доноров крови За падной Африки и Карибских островов доля серопозитивных доноров значительно выше – 98%. Наши результаты также совпадают с литературными данными по серопозитивности онкологических больных: 94,2% и 95%, соответственно. Достаточно хорошее совпадение получено для реципиентов почек– соответственно 63% и 66%. Выявлены отличия в полу ченных данных для беременных женщин 71,9% против литературных: от 20% до 100%.

Это связано с тем, что в литературе приводятся результаты обследований, которые широ ко различаются географией проживания обследуемого населения. Так, процент серопози тивных беременных в Марокко – 20%, в странах к югу от Сахары 50–90%, во Франции – 70%. Следует отметить, что высокую специфичность выявления IgG к ВГЧ-6 подтвержда ет хорошее совпадение результатов анализа IgG у матерей (рожениц) и их новорожденных детей – 98,7%: у новорожденных выявляются материнские антитела к ВГЧ-6. Несовпаде ния были зарегистрированы только в двух случаях, при этом матери были серопозитив ными, тогда как у детей IgG-антитела не были выявлены.

Таким образом, в настоящей работе с использованием литературных данных и данных по теоретической структуре антигенных эпитопов белков p100 и р41 были выбра ны последовательности ДНК генов U11 и U27, кодирующих иммунодоминантные части белков p100 и р41. Полученные в реакции амплификации фрагменты ДНК генов U11 и U27, кодирующие выбранные последовательности, клонировали в составе экспрессирую щих векторов, которые обеспечили продукцию рекомбинантных белков рек-р100 и рек р41. Установлено также, что рекомбинантные антигены рек-р100 и рек-р41 реагируют с поликлональными антителами класса G, содержащимися в сыворотках инфицированных пациентов и здоровых доноров. На основании полученных данных можно сделать вывод о возможности использования полученных рекомбинантных белков в качестве антигенов при иммуноферментном анализе для выявления иммуноглобулинов класса G, специфич ных к ВГЧ-6.

К сожалению, ситуация по серологическому мониторингу в отношении активно сти ВГЧ-6 в мире оставляет желать лучшего. Поэтому только в случае внезапной экзанте мы детей в возрасте до 1 года можно получить однозначный серологический ответ. Все остальные варианты инфекции ВГЧ-6, например рассеянный склероз, синдром хрониче ской усталости и т.п., до сих пор являются гипотетическими, и роль этого вируса в их па тогенезе неоднозначна. Это создает значительные трудности в оценке диагностических возможностей и наших рекомбинантных антигенов рек-р100 и рек-р41, но никак не уменьшает ценность нашего исследования.

-Герпесвирусы Вирус Эпштейна-Барр Для клонирования фрагмента, кодирующего иммунодоминантный район белка р18, был выбран полноразмерный ген BFRF3. А для клонирования фрагмента гена BMRF1, кодирующего иммунодоминантный район белка р54, был выбран участок с 78 по 391 а.о.

Pvu II (55) Pvu II (55) P(LAC) P(LAC) Apa LI (3261) Pvu II (323) Pvu II (323) Apa LI (2814) Beta-gal HpUR290-6his-p HpUR-p18-6his Beta-gal 3700 bp 3253 bp p p Ava I (1385) Xma I (1385) APr Cla I (1218) Sma I (1387) Eco R I (1242) Apa LI (2015) Sal I (1627) APr P(BLA) Cla I (1665) P(BLA) Apa LI (1568) Eco R I (1689) Рис. 29. Физические карты плазмид HpUR-p18-6his и HpUR-p54-6his, экспрессирую щие фрагменты ДНК, кодирующие выбранные районы белков р18 и р Были получены экспрессирующие плазмиды HpUR-p18-6his и HpUR-p54-6his (рис. 29). Отбор штаммов-продуцентов E.coli проводили по наличию синтезируемого бел ка. Электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков совпала с рассчитанной теоретически. На рис. 30 показаны хроматографически очищенные рекомбинантные белки рек-р18 (VCA) и рек-р54 (EA).

1 2 Рис. 30. Электрофореграмма хромато графически очищенных рекомбинант ных белков ВЭБ.

94 кД а Дорожки:

1- рек-р54(EA), 67 кД а 2- рек-р18(VCA), 3- маркеры молекулярной массы (Sigma).

43 кД а 20 кД а Определение первичных структур ДНК клонированных генов показало, что пер вичные структуры, клонированных генов полностью совпали с аналогичными последова тельностями, депонированными в мировых базах данных.

В рамках проекта «Разработка рекомбинантных антигенов и генетических марке ров для диагностики герпесвирусов» (утвержден 03.06.2003 Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор», IRB00001360) разработанные антигены использовали для ИФА сывороток из крови больных и здоровых людей. Было проведено исследование на выявление марке ров острой стадии ВЭБ-инфекции - IgG к ЕА ВЭБ (рек-р54) и IgM к VCA ВЭБ (рек-р18). В табл. 9 приведены данные обследования пациентов.

Таблица Результаты обследования пациентов на наличие острой стадии инфекции ВЭБ методами ИФА и ПЦР.