Х-сцепленная умственная отсталость у детей: клинико-генетическая и эпигенетическая характеристика

На правах рукописи

Воинова Виктория Юрьевна Х-СЦЕПЛЕННАЯ УМСТВЕННАЯ ОТСТАЛОСТЬ У ДЕТЕЙ:

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 14.01.08 – Педиатрия 03.02.07 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва – 2011 2

Работа выполнена в ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Новиков Петр Васильевич доктор биологических наук, профессор Ворсанова Светлана Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мухина Юлия Григорьевна ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России доктор медицинских наук, профессор Козлова Светлана Ивановна ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России доктор медицинских наук Демикова Наталия Сергеевна ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится « 2012 г. в 13 часов на заседании » диссертационного совета Д-208.043.01 в ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России (125412, Москва, улица Талдомская, дом 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Землянская З.К.

кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема нарушений нервно-психического развития у детей носит медико-социальный характер в связи с высокой распространённостью патологии. Частота умеренной и тяжелой умственной отсталости (IQ менее 50) в популяции составляет 0,3 – 0,5 %, а при учете легких форм (IQ равен от 50 до 70) она достигает 1,5 – 3 % [Stevenson et al., 2000;

Leonard, Wen, 2002]. В Российской Федерации доля детей–инвалидов вследствие нервно-психических расстройств составляет 22,5 % [Шарапова и др., 2007]. Принято считать, что от 25 до 45 % всех случаев умственной отсталости - это генетически обусловленные состояния [Вельтищев, 2000;

Frints, 2002;

Ropers, Hamel, 2005]. В настоящее время известно более тысячи наследственных болезней, сопровождающихся недоразвитием интеллекта, среди которых особое место занимают заболевания, сцепленные с хромосомой Х [McKusick, 2000].

Х-сцепленная умственная отсталость (XLMR- X-linked mental retardation) представляет собой клинически и генетически гетерогенную группу наследственных заболеваний, обусловленных мутациями, локализованными на хромосоме Х, приводящими к нарушению интеллектуального развития. Суммарная частота данных заболеваний варьирует от 1:1000 до 1,8:1000 в общей популяции [Chiurazzi et al., 2001;

Ropers, 2008]. Х-сцепленная умственная отсталость ведет к глубокой инвалидности вследствие тяжелого поражения центральной нервной системы.

До настоящего времени не исследован удельный вес XLMR среди болезней детского возраста, приводящих к нарушению интеллекта. Несмотря на большое число работ, посвящённых клиническим аспектам патологии, недостаточно разработаны критерии её дифференциальной диагностики среди недифференцированных форм умственной отсталости. Следует отметить, что лишь ограниченному числу Х сцепленных форм умственной отсталости свойственны чётко очерченные симптомокомплексы, что ведёт к трудностям их идентификации. Так, клинический диагноз наиболее частой формы XLMR (1:2500 – 1:6000 мальчиков) - синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х (FRAXA), подтверждается молекулярными методами только в 3,8 % случаев [Stevenson, Schwartz, 2009]. Это отчасти связано с отсутствием корректных количественных методов для оценки экспрессивности клинических признаков синдрома FRAXA. Создание систем оценки клинических симптомов этого и других заболеваний позволит не только повышать эффективность диагностики, но и выявлять корреляцию генотипа и фенотипа, а также прогнозировать на их основе тяжесть течения заболевания у детей.

Одной из причин трудностей исследования X-сцепленной умственной отсталости является её генетическая гетерогенность. Группа заболеваний, классифицируемых как Х-сцепленная умственная отсталость, насчитывает более моногенных нозологических форм. Идентифицировано около 100 генов хромосомы Х, мутации в которых ведут к нарушениям интеллекта [Ворсанова и др., 2008;

Gecz et al., 2009].

Внедрение в практику новейших технологий - метафазной сравнительной геномной гибридизации и серийной сравнительной геномной гибридизации, позволило выявить микроделеции и микродупликации хромосомы Х не менее чем в 13% случаев недифференцированной Х-сцепленной умственной отсталости [Юров и др., 2010;

Froyen et al., 2007;

Bauters et al., 2008a]. Открытие того факта, что XLMR может быть обусловлена нарушением дозы Х-сцепленных генов, вызванным микроаномалиями хромосомы Х [Gecz et al., 2009;

Vandewalle et al., 2009], расширило границы понятия «Х сцепленная умственная отсталость», позволило выделить новые нозологические формы, как, например, синдром микродупликации Xq28 [Van Esch et al., 2005]. Однако взаимосвязь субмикроскопических аномалий хромосомы Х с определённым фенотипом остается сложной для интерпретации и недостаточно изученной [Bauters et al., 2008a].

Исследования, выполненные в последние годы, указывают на связь Х-сцепленных заболеваний, сопровождающихся умственной отсталостью, с эпигенетическим феноменом неравной инактивации хромосомы Х [Юров и др., 2007;

Migeon, 2008;

rstavik, 2009]. Однако остается малоизученным значение анализа инактивации хромосомы Х для диагностики асимптоматического носительства XLMR и повышения эффективности медико-генетического консультирования семей с целью предупреждения повторного рождения больных детей.

Отсутствие достаточных сведений о патогенезе заболеваний данной группы затрудняет разработку способов их терапевтической коррекции. Создание генно инженерных форм ферментов для их клинического применения, например при мукополисахаридозе II типа, открыли новую эру ферментозамещающей терапии наследственных болезней [Семячкина, Новиков, 2004;

Muenzer et al., 2011].

Обнаружение нарушений процессов клеточной биоэнергетики при ряде форм XLMR повысило эффективность симптоматической коррекции, в частности синдрома Ретта [Ellaway et al., 2001;

Харабадзе и др., 2002].

Таким образом, становится очевидным, что на современном этапе развития медицинской генетики и педиатрии необходимы комплексные клинико-генетические исследования для решения проблем диагностики Х-сцепленных форм умственной отсталости, адекватного прогноза течения заболеваний, эффективного медико генетического консультирования и поиска путей терапевтической коррекции соматических и нервно-психических расстройств при данной патологии.

Разработать систему ранней диагностики, медико Цель исследования.

генетического консультирования и подходов к терапевтической коррекции Х сцепленных форм умственной отсталости у детей на основе молекулярно-генетического и молекулярно-цитогенетического анализа клинического полиморфизма различных форм патологии и исследования инактивации хромосомы Х.

Задачи исследования:

1. Установить удельный вес Х-сцепленной умственной отсталости среди заболеваний, сопровождающихся нарушениями нервно-психического развития детей по данным специализированных клиник.

2. Разработать клинические критерии диагностики Х-сцепленных форм умственной отсталости, на основе которых создать шкалы количественной балльной оценки тяжести клинических признаков для наиболее частых форм патологии (синдромы Ретта и умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х).

3. Определить спектр мутаций Х-сцепленных генов (MECP2 и FMR1) и аномалий хромосомы Х и оценить их вклад в развитие Х-сцепленных форм умственной отсталости у детей.

4. Определить роль инактивации хромосомы Х в клиническом полиморфизме Х сцепленных форм умственной отсталости и её значение для повышения эффективности диагностики и медико-генетического консультирования семей с данной патологией.

5. На основе анализа клинико-генетического полиморфизма Х-сцепленной умственной отсталости и вклада генетических и эпигенетических (тип и позиция мутации, особенности Х-инактивации) факторов в формирование ее фенотипических проявлений разработать систему прогнозирования тяжести течения заболеваний у детей.

6. Разработать алгоритм диагностики Х-сцепленных заболеваний, сопровождающихся умственной отсталостью, среди ее недифференцированных форм.

7. Оценить эффективность дифференцированных комплексов терапевтической коррекции нарушений соматического статуса и нервно-психического развития при различных формах Х-сцепленной умственной отсталости у детей – при синдромах Хантера, Ретта, умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, адренолейкодистрофии.

Научная новизна. Впервые определен удельный вес (6,54%) Х-сцепленных форм умственной отсталости в структуре заболеваний, сопровождающихся нарушениями психического развития, по данным специализированных клиник.

Научно обоснована разработка оригинальных шкал для объективной количественной оценки тяжести клинических проявлений у детей с частыми формами Х-сцепленной умственной отсталости (синдромы Ретта и умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х).

Показано, что эпигенетический феномен неравной инактивации хромосомы Х отражает процесс селекции клеток у гетерозигот по Х-сцепленным мутациям, который является одним из общих звеньев патогенеза заболеваний данной группы.

Определен вклад неравной инактивации хромосомы Х в клинический полиморфизм различных заболеваний и установлена её роль как значимого диагностического маркёра Х-сцепленной умственной отсталости.

Научно обоснована система прогнозирования тяжести течения заболевания у детей с X-сцепленными формами умственной отсталости, основанная на анализе вклада генетических и эпигенетических факторов (типа и позиции мутации, особенностей инактивации хромосомы Х) в развитие клинических проявлений различных заболеваний данной группы.

Практическая значимость. Разработана система балльной количественной оценки тяжести течения Х-сцепленных заболеваний, сопровождающихся умственной отсталостью, которая может использоваться для выявления корреляции генотипа и фенотипа и оценки эффективности методов терапевтической коррекции этой патологии.

Внедрение анализа инактивации хромосомы Х значительно повысило эффективность диагностики Х-сцепленной умственной отсталости и выявления её асимптоматического носительства при медико-генетическом консультировании семей с данной патологией.

Разработан алгоритм диагностики Х-сцепленной умственной отсталости, включающий постадийное применение клинико-генеалогического анализа, молекулярно-генетических исследований мутаций генов хромосомы Х, комплекса молекулярно-цитогенетических методов диагностики том числе методов (в флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), метафазной и серийной сравнительной геномной гибридизации) и анализа инактивации хромосомы Х. Разработанный алгоритм значительно повышает эффективность выявления Х-сцепленной умственной отсталости среди её недифференцированных форм.

Показана целесообразность использования медикаментозных (энерготропные препараты, витамины группы B и антиоксиданты, ферментозамещающая терапия, масло Лоренцо) и немедикаментозных средств (лазеропунктуры) для терапевтической коррекции нарушений соматического статуса и нервно-психического развития детей с различными формами Х-сцепленной умственной отсталости Ретта, (синдромы умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, Хантера и адренолейкодистрофия).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Х-сцепленная умственная отсталость имеет удельный вес среди (XLMR) недифференцированных форм нарушений интеллекта, равный 6,54 % по данным специализированных клиник.

2. Использование разработанных систем балльной количественной оценки тяжести клинических проявлений и современных молекулярно-генетических методов повышает эффективность выявления больных с синдромом умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х (FRAXA) с 3,8% до 40% и синдрома Ретта - с до 89% среди детей с недифференцированными формами нарушений интеллекта.

3. Достоверным лабораторным критерием Х-сцепленной умственной отсталости служит неравная инактивация хромосомы Х. Обнаружение феномена неравной инактивации хромосомы Х повышает эффективность диагностики X-сцепленных форм умственной отсталости, прогнозирования степени тяжести течения заболевания и выявления носительниц Х-сцепленных мутаций в семьях с данной патологией.

4. Установленная зависимость фенотипа детей от генетических (тип и позиция мутации в гене MECP2, число тринуклеотидных повторов в гене FMR1) и эпигенетических факторов (инактивация хромосомы Х) позволяет на их основе прогнозировать тяжесть течения заболеваний.

5. Разработанный в настоящем исследовании диагностический алгоритм, включающий комплекс современных молекулярно-генетических (анализ мутаций Х-сцепленных генов, инактивации хромосомы Х,) и молекулярно-цитогенетических методов исследования (флюоресцентная гибридизация in situ, метафазная и серийная сравнительная геномная гибридизация), позволяет с высокой эффективностью выявлять среди недифференцированных форм нарушений психического развития моногенные формы умственной отсталости и заболевания, X-сцепленной обусловленные субмикроскопическими аномалиями хромосомы Х, в том числе не обнаруживаемые ранее цитогенетическими методами.

6. Внедрение в клиническую практику новых генно-инженерных лекарственных средств улучшает соматический и нервно-психический статус больных с Х-сцепленной формой умственной отсталости - мукополисахаридозом II типа (синдром Хантера).

Решение поставленных задач осуществлялось в отделении наследственных заболеваний с нарушением психики у детей (руководитель – доктор медицинских наук, профессор П.В.Новиков) и лаборатории молекулярной цитогенетики нервно психических заболеваний (руководитель – доктор биологических наук, профессор С.Г.Ворсанова) ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России (директор – доктор медицинских наук, профессор А.Д.Царегородцев), а также в лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний (руководитель – доктор биологических наук, профессор Ю.Б.Юров) Научного центра психического здоровья РАМН (директор – академик РАМН А.С.Тиганов), при поддержке научно образовательного центра Нейробиологической диагностики наследственных психических заболеваний детей и подростков (руководитель – доктор биологических наук Н.Л.Горбачевская) Московского городского психолого-педагогического университета (ректор - академик РАО В.В. Рубцов).

Внедрение в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу ФГБУ педиатрии и детской хирургии» «МНИИ Минздравсоцразвития России, Научного центра психического здоровья РАМН, Московского городского психолого-педагогического университета.

Основные положения работы вошли в Методические рекомендации, утвержденные Минздравсоцразвития России и используются в медико-генетических и лечебно профилактических учреждениях. Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедрах медицинской генетики Российской медицинской академии последипломного образования и клинической психологии раннего детства Московского психолого-педагогического университета, а также при подготовке ординаторов в ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: II, III, IV, V, VII, VII, VIII, IХ и Х конгрессах «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011);

на всемирных конгрессах по синдрому Ретта (Гётеборг, Швеция,1996;

Каруизава, Япония, 2000;

Париж, Франция, 2008;

на Европейском съезде участников проектов INTAS (Киев, Украина, 2007;

на конференциях Европейской цитогенетической ассоциации (ЕСА): (Болонья, Италия, 2003;

Стокгольм, Швеция, 2009;

на конференциях Европейского общества генетики человека (Ницца, Франция, 2007;

Барселона, Испания, 2008;

Амстердам, Голландия, 2011);

на IX, XI, XII и XVI съездах педиатров России (Москва, 2005, 2007, 2008, 2009);

на IV, V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Курск, 2000;

Уфа, 2005;

Ростов-на-Дону, 2010);

на международной конференции по синдрому Ретта (Казань, 2011), а также на многочисленных научных семинарах в различных научно-исследовательских учреждениях России.

Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 7 глав в монографиях, 19 оригинальных и 3 обзорные статьи в рецензируемых отечественных и международных научных журналах, 4 статьи в сборниках, а также 69 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций (всего 102 работы).

Работа изложена на страницах Объем и структура диссертации. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных наблюдений (8 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, который включает 56 работ отечественных и 445 - иностранных авторов.

Работа иллюстрирована 65 рисунками и 73 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В основу работы положено комплексное клинико-генетическое обследование детей с Х-сцепленной умственной отсталостью, выявленных среди 4803 больных с недифференцированными формами нарушений интеллекта.

Таблица 1.

Группы больных с Х-сцепленной умственной отсталостью, исследуемые в работе.

Нозологические формы (номер по каталогу OMIM) Количество Пол детей мальчики девочки Ретта синдром (OMIM 312750) 205 2 Блоха-Сульцбергера синдром (OMIM 308300) 13 0 Айкарди синдром (OMIM 304 050) 1 0 Гольтца синдром (OMIM 305600) 1 0 Умственной отсталости, сцепленной с ломкой 30 27 хромосомой Х синдром – FRAXA (OMIM 300624) Хантера синдром (OMIM 309900) 18 18 Коффина-Лоури синдром (OMIM 303600) 3 3 Опица FG синдром (OMIM 305450) 2 2 Симпсона-Голаби-Бемеля синдром (OMIM 312870) 2 2 Барта синдром (OMIM 302060) 1 1 BRESHECK синдром (OMIM 300404) 1 1 Лоу синдром (OMIM 309000) 4 4 Адренолейкодистрофия (OMIM 300100) 3 3 Менкеса синдром (OMIM 309400) 1 1 Эктодермальная дисплазия гипогидротическая в 4 4 сочетании с умственной отсталостью (OMIM 305100) Аарскога синдром (OMIM 305400) 3 3 Отопалатодигитальный синдром, тип 1(OMIM 311300) 2 2 Отопалатодигитальный синдром, тип 2 (OMIM 1 1 304120) Х-сцепленная спастическая диплегия с умственной 1 1 отсталостью, OMIM 301040) Х-сцепленная спондилоэпиметафизарная дисплазия с 1 1 умственной отсталостью (OMIM 300232) Глухоты – дистонии - оптической атрофии синдром 1 1 (OMIM 304700) Структурные аномалии хромосомы Х 6 3 Несиндромальные формы Х-сцепленной умственной 10 10 отсталости Всего 314 90 Помимо детей было обследовано 396 их родственников (матерей, сибсов и других).

В настоящей работе исследовались Х-сцепленный моногенный синдром, структурные аномалии хромосомы Х и несиндромальные формы умственной отсталости (табл.1).

Больные с синдромальными формами Х-сцепленной умственной отсталости (XLMR) были разделены на две группы. В первую группу (N=81) входили дети с заболеваниями, проявляющимися преимущественно у гемизиготных мальчиков, родственники которых женского пола имеют либо стертые признаки болезни, либо являются асимптоматическими носительницами. Вторая группа (N=223) включала детей с Х-сцепленными синдромами, проявляющимися у гетерозиготных девочек. Для гемизигот (мальчиков) эти заболевания являются летальными.

В работе использовались клинико-генеалогический, функциональные, цитогенетический, молекулярно-цитогенетические и молекулярно-генетические методы, а также проводилась статистическая обработка результатов.

Метод количественной оценки фенотипа для частых форм X-сцепленной умственной отсталости.

Для повышения эффективности клинической диагностики XLMR в ходе исследования были разработаны системы количественной оценки тяжести течения наиболее частых Х-сцепленных форм умственной отсталости: синдромов FRAXA (умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х) и RTT (Ретта). Данные системы представляли собой ранговые шкалы, разработанные на основании анализа фенотипа больных с синдромами FRAXA и RTT, и включали оценку психологического и неврологического статусов, комплекса микроаномалий, признаков поражения соединительной ткани, а также антропометрических показателей. Шкалы построены таким образом, что отсутствию симптома соответствует оценка в 0 баллов, а максимальной степени его выраженности соответствует оценка до 5 баллов в зависимости от анализируемого признака. Для оценки тяжести состояния ребенка проводилось суммирование количества баллов, соответствующих каждому из симптомов. В отличие от использовавшихся ранее [Maes et al., 2000;

Weaving et al., 2003;

Colvin et al., 2004], предлагаемые в настоящей работе шкалы содержат количественную характеристику оптимального числа клинических симптомов частых форм XLMR (всего 25 признаков для RTT и 23 признака для синдрома FRAXA), учитывают не только наличие, но и экспрессивность каждого признака, оценка которой включает максимально возможное число градаций – от 0 до 5 баллов. Это позволяет объективно определять тяжесть состояния ребёнка, его динамику и корректно проводить статистическую обработку данных. Разработанные шкалы использовались нами с целью исследования клинического полиморфизма заболеваний и зависимости фенотипических признаков от генотипа больных.

Молекулярно-генетические методы Молекулярно-генетические методы использовались для диагностики, а также выявления корреляций генотипа и фенотипа.

Определение мутаций гена МЕСР2 проводилось после ПЦР амплификации кодирующего региона МEСР2 с последующим прямым секвенированием при помощи ДНК-секвенатора LICOR 4200.

При анализе числа CGG-повторов в промоторе гена FMR1 использовали метод ПЦР с последующим капиллярным электрофорезом в полиакриламидном геле. Для исследования применяли аналитический набор «Fragile X PCR Test» фирмы Abbott Molecular.

В клетках индивидуумов с XLMR и их матерей проводился анализ особенностей инактивации хромосомы Х для оценки влияния данного эпигенетического феномена на фенотип. Анализ Х-инактивации был основан на метил-чувствительной рестрикции фланкирующих последовательностей экспансии тринуклеотидных (CAG)n – повторов интрона 1 гена андрогенового рецептора (AR) с последующим количественным ПЦР анализом участка размером около пн, состоящего из консервативной последовательности с HpaII сайтами и полиморфной последовательности (CAG)n повторов.

Цитогенетический и молекулярно-цитогенетические методы.

Цитогенетический и молекулярно-цитогенетические методы были разработаны в лабораториях молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России [Ворсанова С.Г., 2006] и цитогенетики и геномики психических заболеваний Научного центра психического здоровья РАМН [Yurov Y.B. et al., 1996]. При анализе метафазных хромосом, полученных из культивированных лимфоцитов периферической крови, использовались методы и С-окрашивания. Молекулярно-цитогенетические G исследования ломкости хромосомы Х проводили с помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH) у детей с синдромом умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, используя ДНК пробу pYAM 10-40 [Yurov Y.B. et al., 2002].

Метафазная сравнительная геномная гибридизация (метафазная CGH) проводилась в соответствии с классическим протоколом [Kallioniemi et al.,1992] при модификации, которая касалась увеличения разрешения метафазных хромосом донора (до 750 полос на гаплоидный кариотип), а также использования «прямого» мечения флюорохромами Spectrum Green/FluorX геномной ДНК пациента и Spectrum Orange/Cy3 или Texas Red геномной ДНК донора [Ворсанова и др., 2008;

Юров, 2011]. Для проведения серийной сравнительной геномной гибридизации (серийной CGH) использовался наночип Constitutional Chip® 4.0 фирмы Perkin Elmer, который позволяет сканировать геном с разрешением, равным 0,5 - 1 млн. пн) и имеет более 600 ВАС проб на хромосому Х.

Статистическая обработка данных.

Применялись стандартные методы статистической обработки. Использовалась программа для статистической обработки данных SPSS (Statistical Package for Social Sciences), включающая стандартные методы для медико-биологических исследований.

Поскольку для ряда полученных данных распределение не соответствовало критериям нормального, то в этих случаях использовались непараметрические тесты (критерий Манна–Уитни для двух независимых выборок, коэффициенты корреляции Спирмена и Кендалла) [Бюйль, Цефель, 2005]. При сравнении полученных результатов с контрольной группой различия считались статистически значимыми при уровне достоверности p0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клинические исследования X-сцепленной умственной отсталости.

В настоящей работе было обследовано 4803 ребенка с различными формами умственной отсталости, среди которых выявлено 314 больных с Х-сцепленными заболеваниями, удельный вес XLMR среди обследованных составил 6,54%. Удельный вес наиболее частых форм Х-сцепленной умственной отсталости составил для синдрома Ретта - 4,28% среди девочек, а для синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, - 4,16% среди мальчиков с нарушениями интеллекта. Высокий удельный вес Х-сцепленной умственной отсталости и наиболее часто встречающихся её форм определяет актуальность исследований данной патологии.

Генеалогические исследования в семьях с XLMR.

В процессе обследования был проведен анализ 292 родословных детей с XLMR, включавших сведения о 9619 индивидуумах. Генеалогическое исследование имело наибольшее значение в семьях больных с несиндромальной Х-сцепленной умственной отсталостью (n=10), поскольку Х-сцепленный характер наследования нарушений интеллекта служил единственным критерием, согласно которому в этих семьях была идентифицирована XLMR.

При синдромальной Х-сцепленной умственной отсталости генеалогический анализ проводился отдельно для заболеваний, проявляющихся преимущественно у гемизигот и гетерозигот (табл.2).

Таблица 2.

Результаты генеалогического анализа в семьях с X-сцепленной умственной отсталостью (N=292) Заболевания в семьях с XLMR Удельный вес семейных случаев среди всех проанализированных, абсолютное число, (%) Синдромы, проявляющиеся 2 (0,9%) преимущественно у гетерозигот (N=212), в том числе:

Блоха-Сульцбергера (N=13) 1 (8%) RTT (N=197) 1 (0,5%) Айкарди (N=1) 0 (0%) Гольтца (N=1) 0 (0%) Синдромы, проявляющиеся 12 (17%) преимущественно у гемизигот (N=70), в том числе:

FRAXA (N=25) 5 (20%) Мукополисахаридоз II типа (синдром 1 (6%) Хантера) (N=17) Редкие синдромы (N=28) 6 (21%) Несиндромальные формы Х-сцепленной 10 (100%) умственной отсталости (N=10) Как видно из таблицы 2, генеалогический анализ малоинформативен в диагностике Х-сцепленных синдромов, проявляющихся преимущественно у гетерозигот: только в одной из 197 семей с синдромом Ретта и одной из 13 семей с синдромом Блоха Сульцбергера заболевание встречалось более чем у одного индивидуума, а в остальных было спорадическим. В то же время, генеалогический анализ сыграл значимую роль в диагностике синдромальных форм XLMR, проявляющихся преимущественно у гемизигот: в 12 из 70 (17%) проанализированных родословных заболевание наблюдалось более чем у одного мальчика, т.о. получены доказательства сцепленного с полом наследования заболевания (синдромы FRAXA, FG, Менкеса, Аарскога и др.).

В большинстве родословных генеалогический анализ не был информативен, что привело к необходимости поиска лабораторных критериев диагностики XLMR и выявления её асимптоматических носительниц.

Исследования клинического полиморфизма моногенных форм Х-сцепленной умственной отсталости (XLMR).

Выраженный клинический полиморфизм различных форм XLMR проявлялся в вариабельности клинических признаков у детей с одной и той же нозологической формой, а также в различиях течения заболевания у больных в одной и той же семье. В работе детально исследован клинический полиморфизм при синдромах FRAXA, Блоха Сульцбергера, Ретта, Хантера (мукополисахаридозе II типа) и др. Вариабельность экспрессивности фенотипических признаков, количественно оцененных с использованием разработанной нами клинической шкалы у больных с синдромом Ретта, представлена в таблице 3.

Клинический полиморфизм при XLMR связан с явлениями синдромального смешивания (syndrome lumping) и синдромального расщепления (syndrome splitting) [Stevenson, Schwartz, 2009;

Castrn et al., 2011]. Для явления синдромального смешивания (syndrome lumping) характерно то, что синдромы, описанные под различными названиями и имеющие различные клинические признаки, вызываются повреждениями одного и того же гена, что в частности наблюдалось нами у детей с отопалатодигитальным синдромом I и II типов (OPDI и OPDII). Эти фенотипы являются результатом мутаций одного и того же гена, однако признаки поражения скелета, нервной системы, общая тяжесть состояния и продолжительность жизни у детей с синдромами OPDI и OPDII значительно различались. В исследуемой группе детей наблюдалось также явление синдромального расщепления (syndrome splitting), при котором клинические диагнозы, относящиеся к одной и той же нозологической форме, оказываются результатом мутаций разных генов. Так, у большинства больных с синдромом Ретта выявлялись мутации гена MECP2, за исключением девочки, имевшей вариант RTT с ранним началом судорог, у которой обнаружена мутация гена CDKL5.

Сходство клинических проявлений при мутациях различных генов объясняется общностью патогенетических путей формирования патологии [Nemos еt al., 2009].

Таблица 3.

Количественная оценка экспрессивности клинических признаков у детей с синдромом Ретта (N=205) Признаки Количество детей, получивших оценку в баллах:

0 1 2 3 4 Признаки поражения ЦНС, в том числе:

Нарушения контакта 9 82 99 Расстройства эмоционального общения 16 91 73 Нарушение понимания обращенной 3 72 101 речи Расстройства экспрессивной речи 0 4 44 76 69 Снижение внимания 8 99 87 Нарушение предметно-игровой 1 32 68 деятельности Расстройства оро-моторных функций 38 80 64 Апраксия движений рук 0 46 17 53 Стереотипные движения рук 0 39 112 Спастичность мышц конечностей 97 67 35 Патологические рефлексы 117 39 47 Альтернирующее косоглазие 69 59 63 Бруксизм 12 82 70 Сколиоз 67 61 49 Нарушения вертикализации 45 64 31 41 19 Нарушение ходьбы 4 32 52 46 37 Нарушения преодоления препятствий 7 33 35 (N=134) Судороги 70 64 58 Тремор головы и туловища 18 81 65 Вегетативные расстройства 40 87 Апноэ и гипервентиляция 73 52 44 Изменения параметров физического развития, в том числе:

Снижение массы тела 98 20 16 Уменьшение длины тела 121 19 33 Уменьшение окружности головы 36 26 41 Уменьшение длины стопы 51 29 39 Молекулярно-генетические, молекулярно-цитогенетические исследования и анализ корреляций генотип/фенотип при X-сцепленной умственной отсталости.

Для оценки роли различных генетических факторов в генезе наблюдавшегося клинического полиморфизма при наиболее частых формах XLMR проводились молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические исследования, результаты которых представлены ниже.

Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические исследования и анализ корреляций генотип/фенотип в семьях с синдромом FRAXA.

У детей мужского пола, отобранных из группы больных с недифференцированной умственной отсталостью при использовании шкалы количественной оценки клинических признаков синдрома FRAXA, исследовалось количество CGG-повторов в гене FMR1 (рис.1-А). Экспансия тринуклеотидных повторов была обнаружена в 27 случаях из 68 (40%), что значительно чаще, чем у детей, направляемых на молекулярную диагностику данного заболевания в зарубежных генетических центрах (2 – 3,8%) [Rauch et al., 2006;

Stevenson, Schwartz, 2009].

Полученные в работе данные указывают на необходимость обследования больных с помощью количественной клинической шкалы, которая позволяет предварительно выявлять большее число пациентов с синдромом FRAXA.

А пн RFU Б пн RFU Рис.1. Анализ количества тринуклеотидных повторов в промоторе гена FMR методом ПЦР с последующим капиллярным электрофорезом. На электрофореграммах продуктов ПЦР определено: А - ~232 CGG-повтора (полная мутация гена FMR1) у ребенка с синдромом FRAXA;

Б - 80 CGG-повторов (премутация гена FMR1) у матери ребенка с синдромом FRAXA.

Рис.2. Молекулярно-цитогенетическое исследование ломкости хромосомы Х методом FISH у больных с синдромом FRAXA. ДНК проба pYAM 10-40 позволяла специфически маркировать хромосому Х (показана красными стрелками), что повышало эффективность исследования ломкого участка fra(X)(q27.3) (показан зелёными стрелками), позволяя анализировать метафазы с неполным количеством хромосом (А) и хромосомы Х в наложении (Б).

У больных дополнительно проводилось молекулярно-цитогенетическое исследование ломкости хромосомы Х методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с помощью ДНК пробы pYAM 10-40, созданной в лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний Научного центра психического здоровья РАМН (рис.2). Во всех проанализированных случаях была обнаружена ломкость участка Xq27. в 3-29 % лимфоцитов периферической крови. Сочетание молекулярно-генетического и молекулярно-цитогенетического методов позволило провести лабораторную диагностику синдрома FRAXA c высокой эффективностью.

Среди обследованных родственников больных с синдромом по FRAXA материнской линии мутации и премутации гена FMR1 были выявлены в 32-х из 38-ми (84%) случаев (рис.1-Б). Поскольку эти индивидуумы имеют высокий риск рождения детей с умственной отсталостью, то необходимо выявление мутаций/премутаций гена FMR1 в семьях детей с синдромом FRAXA.

Проведено сравнение экспрессивности клинических симптомов у больных с мутацией гена FMR1 и детей с умственной отсталостью, у которых мутация не была обнаружена (табл.4). Суммарная оценка и оценка отдельных признаков по клинической шкале у детей с синдромом FRAXA была статистически достоверно выше, чем у больных с недифферецированными формами умственной отсталости (критерий Манна Уитни, p0,001). Установлены статистически значимые различия между двумя группами по экспрессивности следующих признаков: зрительный и тактильный контакт, тахилалия (ускоренный темп речи), специфические стереотипные движения в виде «встряхивания кистей», комплекс лицевых микроаномалий, макроорхизм, аномалии соединительной ткани и увеличение окружности головы (табл.4).

Таблица 4.

Сравнение экспрессивности признаков у детей с синдромом FRAXA и детей с недифференцированной умственной отсталостью Признаки Количество детей, получивших оценку в баллах: p синдром FRAXA недифференцированная умственная отсталость с (N=27) аутизмом (N=41) 01 2 3 4 5 нарушение контакта 6 19 5 0 10 13 8 0 0, отсутствие зрительной 4 9 14 3 9 13 19 0 0,032* реакции нарушение тактильного 3 18 9 16 23 2 0,014* контакта нарушение невербального 1 18 8 3 3 22 16 0 0, общения расстройство 0 17 8 3 1 1 8 16 14 3 0 0, экспрессивной речи умение использовать речь 5 12 7 1 14 14 7 6 0, для общения (исключены дети без речи), ускоренный темп речи 5 9 11 27 6 3 0,001*** (исключены дети без речи) аграмматизмы, речевые 1 2 8 14 14 22 0 0 0,008** персеверации и эхолалии (исключены дети без речи) нарушение внимания 00 4 5 12 9 0 5 8 11 9 8 0, повышение уровня 1 2 3 4 9 11 3 6 5 10 9 8 0, активности гипотония мышц 2 21 6 1 11 27 3 0 0, конечностей стереотипные движения 1 11 18 11 21 9 0,007** рук судороги 21 5 6 0 27 8 60 0, комплекс микроаномалий 0 1 2 3 9 15 0 3 17 14 5 2 0,001*** лица макроорхизм 36 18 25 12 4 0,001*** гиперрастяжимость кожи 4 20 6 17 21 3 0,009** гиперподвижность 33 5 8 11 98 6 7 11 0, суставов плоскостопие 6 12 12 13 18 10 0,031* нарушение осанки 11 13 6 28 10 3 0,006** длина тела 15 5 1 9 27 9 3 2 0, увеличение окружности 16 10 2 2 31 8 2 0 0,024* головы *p0,05 ** p0,01 *** p0, У детей с синдромом FRAXA не встречалось регресса психического развития.

Кроме того, только в родословных детей с синдромом FRAXA, в отличие от родословных больных с недифференцированной умственной отсталостью, наблюдались случаи раннего наступления менопаузы у женщин и синдрома тремора и атаксии у мужчин – заболеваний, ассоциированных с премутацией гена FMR1. Клинические признаки, по которым больные с синдромом FRAXA статистически достоверно отличались, можно считать наиболее специфичными для заболевания и использовать для выявления его среди недифференцированных форм умственной отсталости.

Анализ зависимости фенотипа от наличия мутации либо премутации гена FMR показал, что при наличии премутации гена FMR1 наблюдались когнитивные расстройства и нарушения поведения лёгкой степени, а также синдром тремора и атаксии у мужчин, а у женщин-носительниц премутации - раннее наступление менопаузы, дисфункция яичников и новообразования женских половых органов. Полная мутация у гемизиготных мальчиков вела к клиническим проявлениям синдрома FRAXA, в то время как у гетерозиготных по полной мутации девочек степень нарушений интеллекта широко варьировала.

Выявленная зависимость клинических проявлений от числа CGG-повторов в гене FMR1 могла быть использована для прогнозирования фенотипа.

Молекулярно-генетические исследования и анализ корреляций генотип/фенотип при синдроме Ретта.

Исследование мутаций гена МЕСР2 у детей с RTT осуществлялось методом прямого секвенирования. Анализ кодирующей последовательности гена MECP проведен у 74 детей: в 72 спорадических случаях и у 2 конкордантных по RTT близнецов. Мутации гена MECP2 были обнаружены у 66 из 74 (89%) детей с RTT, что чаще, чем во многих зарубежных исследованиях [Djarmati et al., 2007;

Monnerat et al., 2010]. Это является результатом использования разработанной шкалы количественной оценки фенотипа и выбора адекватного молекулярно-генетического метода.

У большинства детей обнаружены нонсенс мутации - 29 больных (44%);

миссенс мутации определены у 24 пациентов с RTT (36%), мутации со сдвигом рамки считывания составили 12 случаев (19%) и два ребенка (3%) имели делеции внутри рамки считывания (1157del45bp, 1067del 276bp).

Рекуррентные мутации были определены у 47 из 66 детей (71%), наиболее частой была мутация - R255X, которая найдена у 10 из 66 (15%) детей, в том числе у пары конкордантных по синдрому Ретта близнецов. Частоты других рекуррентных мутаций составили 2 из 66 (3%) для R106W, 3/66 (4,5%) для R133C, 8/66 (12%) для T158M, 8/ (12%) для R168X, 7/66 (11%) для R270X, 2/66 (3%) для R294X и 7/66 (11%) для R306C.

Одна из мутаций со сдвигом рамки считывания 806delG, обнаруженная в TRD-домене, была рекуррентной и выявлена у двух девочек с классической формой RTT.

Большинство детей с мутациями в гене MECP2 были женского пола (64 из 66), за исключением двух мальчиков с классическим течением заболевания, у которых определен соматический мозаицизм по мутациям R168X и R270X. У одного из мальчиков (с мутацией R270X) наблюдался тканеспецифический мозаицизм по анеуплоидии хромосомы Х, обнаруженной в 14 % ядер мышечных клеток (кариотип 47,XXY/ 46,ХY).

Анализ корреляций генотип/фенотип показал, что мутации гена МЕСР определены у 56 из 60 (93%) больных с классической и 9 из 13 (69%) детей с атипичными формами заболевания (семи девочек со стертой формой - forme fruste, и двух — с вариантом с частично сохранной речью). Следует отметить, что у детей с врожденной формой RTT (2) и формой с ранним началом судорог (1) МЕСР2 мутаций не было найдено. У девочки с вариантом RTT с ранним началом судорог при исследовании гена CDKL5 обнаружена мутация с.463+1GT, что позволило установить у неё атипичный синдром Ретта, связанный с мутациями гена CDKL5. Данное наблюдение подтверждает, что часть случаев RTT связана с мутациями не только гена MECP2, но и других генов (CDKL5).

Анализ влияния типа мутации в гене MECP2 на тяжесть течения заболевания показал, что суммарная оценка тяжести фенотипа в баллах (44,6 балла) у больных с нонсенс-мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания была статистически достоверно выше, чем у детей с миссенс мутациями (33,8 баллов, t=4,031, p0,001).

Сравнение этих двух групп по экпрессивности отдельных клинических признаков с применением критерия Манна-Уитни продемонстрировало, что у больных первой группы значительнее выражены нарушения эмоционального общения (р0,05), экспрессивной речи (р0,05), вертикализации (р0,05), ходьбы (р0,05), оро-моторных функций (р0,01), более выражены нарушения целенаправленных движений рук (р0,01) и стереотипии (р0,01) (табл. 5).

При исследовании зависимости тяжести отдельных симптомов от типа мутации было обнаружено, что экспрессивность признака была меньшей у детей с миссенс– мутациями. Например, у большинства больных с тяжелой микроцефалией (80%) обнаруживались нонсенс мутации и мутации со сдвигом рамки считывания, и, напротив, у большинства детей без микроцефалии (63%) обнаружены миссенс мутации гена МЕСР2 (рис. 3).

Таблица 5.

Сравнение экспрессивности клинических признаков у детей с миссенс мутациями (N=24) и детей с нонсенс мутациями, мутациями со сдвигом рамки считывания (N=42) в гене MECP c использованием критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок.

Клинический признак Количество детей, получивших оценку в баллах: p Дети с миссенс Дети с нонсенс мутациями мутациями (N=24) и мутациями со сдвигом рамки считывания (N=42) 01 2 3 4 контакт 1 12 10 1 0 16 22 3 0, эмоциональное общение 10 9 4 1 1 20 13 8 0,032* понимание обращенной 1 11 8 4 0 14 22 6 0, речи экспрессивная речь 01 6 11 2 1 0 0 7 14 19 2 0,023* внимание 1 12 12 1 2 19 18 3 0, предметно-игровая 56 11 2 1 6 16 19 0, деятельность оро-моторные функции 7 13 2 0 7 10 18 7 0,007** апраксия движений рук 0 10 7 7 0 0 3 7 10 22 0, 009** стереотипные движения 06 15 3 0 7 21 14 0,023* рук спастичность мышц 11 11 2 0 17 14 9 2 0, конечностей патологические рефлексы 14 2 6 1 22 10 9 1 0, альтернирующее 9 10 5 0 15 10 13 4 0, косоглазие бруксизм 39 9 3 2 16 13 11 0, сколиоз 78 8 1 11 12 13 6 0, вертикализация 96 4 4 1 0 9 10 5 11 6 1 0,032* ходьба 01 10 2 2 6 0 4 11 4 2 21 0,038* преодоление препятствий 16 4 5 1 3 11 25 0, судороги 69 7 2 12 13 13 4 0, тремор головы и туловища 13 6 5 0 14 10 11 7 0, вегетативные нарушения 5 11 8 7 13 22 0, апноэ и гипервентиляция. 75 10 2 12 11 8 11 0, масса тела 92 1 6 12 8 10 12 0, длина тела 14 5 21 0 18 7 9 8 0, окружность головы 33 9 9 6 5 5 26 0, длина стопы 36 2 6 12 6 7 12 0, * р0,05 ** р0, Нонсенс мутации и мутации со сдвигом 37 рамки считывания 61 Число Миссенс мутации детей с разными типами мутаций,% 39 1 2 3 Оценка микроцефалии в баллах Рис. 3. Соотношения количества детей с нонсенс мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания и миссенс мутациями в зависимости от степени микроцефалии.

Проведен анализ тяжести течения заболевания в зависимости от позиции мутации в гене MECP2 (рис.4). Обнаружено, что наибольшая тяжесть клинических проявлений наблюдается у больных с мутациями, локализованными между 158 и аминокислотными остатками белка MeCP2 (R168X, R255X и R270X), а наименьшая тяжесть течения болезни – у детей с мутациями R106W и R133C, а также мутациями, расположенными ближе к 3-концу гена (R294X, R306C, делециями на 3-конце).

Рис. 4. Оценка зависимости тяжести течения RTT от позиции мутации.

Таким образом, показана зависимость тяжести течения синдрома Ретта от типа и позиции мутации в гене МЕСР2, что важно для понимания генетических основ клинического полиморфизма синдрома Ретта и прогнозирования его течения.

Исследование особенностей инактивации хромосомы Х в семьях детей с Х-сцепленной умственной отсталостью.

Анализ особенностей инактивации хромосомы Х был проведен у индивидуумов женского пола из 150 семей с Х-сцепленными формами умственной отсталости, 25 женщин из 22 семей с недифференцированными нарушениями интеллекта и у 80 здоровых женщин контрольной группы.

пн RFU Рис. 5. Результаты анализа инактивации хромосомы Х методом определения статуса метилирования экспансии (CAG)n повторов гена AR у женщины из семьи с Х сцепленной умственной отсталостью. По оси абсцисс на электрофореграммах указана длина фрагментов ДНК (пн), по оси ординат - интенсивность флюоресцентного сигнала в относительных единицах флюоресценции – relevant fluorescent units (RFU).

Электрофореграмма HpaII+ (вверху) соответствует амплифицированным участкам ДНК, обработанной метилчувствительной рестриктазой, а HpaII– (внизу) соответствует амплифицированным участкам ДНК, необработанной метилчувствительной рестриктазой. Синим цветом выделены амплифицированные фрагменты гена AR.

Красным цветом показан стандарт длины последовательностей ДНК.

Применялся молекулярно-генетический метод, основанный на метил чувствительной рестрикции участка Х-сцепленного гена андрогенового рецептора, включающего полиморфную последовательность тринуклеотидных повторов (ЦАГ)n, число которых в норме широко варьирует, что позволяет различить два аллеля гена андрогенового рецептора у лиц женского пола. Инактивация хромосомы Х определялась как соотношение инактивированных аллелей гена андрогенового рецептора разного родительского происхождения и оценивалась как неравная, если это соотношение превышало 20 (рис. 5, вверху). Чтобы избежать ошибок, связанных с неполной амплификацией и рестрикцией, учитывалась интенсивность аллелей в образцах ДНК, необработанных ферментом (HpaII-) (рис.5, внизу).

Исследования Х-инактивации позволили особо выделить синдром Блоха Сульцбергера, при котором у всех наблюдавшихся нами больных (10 из 10 девочек и из 5 матерей) был обнаружен сдвиг Х-инактивации (рис.6). Полученные результаты подтверждают высказывавшееся ранее мнение о том, что анализ Х-инактивации можно использовать как диагностический критерий данного заболевания [Parrish et al., 1996].

№№ индивидуумов Рис. 6. Результаты исследования сдвига инактивации хромосомы Х у девочек с синдромом Блоха-Сульцбергера.

Результаты анализа инактивации хромосомы Х в исследованных группах семей показаны в таблице 6. В целом при Х-сцепленных синдромах, проявляющихся у гетерозиготных девочек, сдвиг Х-инактивации наблюдался у 45 % больных, а при Х сцепленных заболеваниях, проявляющихся у гемизигот, сдвиг Х-инактивации определён у 46% женщин из семей больных мальчиков (в 7 раз чаще, чем в контроле). Например, при обследовании 19 женщин из семей с синдромом умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, у 8 из них (42%) обнаружен сдвиг Х-инактивации.

Таблица 6.

Удельный вес сдвига инактивации хромосомы Х у женщин из семей с Х-сцепленными формами умственной отсталости Группы обследованных Удельный вес сдвига Достовернос инактивации хромосомы Х среди ть различий индивидуумов женского пола с контролем Абсолютное Относительное p* количество значение индивидуумов женского пола р0, Женщины (матери и другие 30/67 45% родственницы) из семей с Х сцепленными формами умственной отсталости, проявляющимися преимущественно у гемизигот, в том числе:

Синдром FRAXA 8/19 42% Синдром Хантера 2/15 13% Редкие синдромы Х-сцепленной 15/26 58% умственной отсталости Несиндромальная Х-сцепленная 5/7 71% умственная отсталость р0, Девочки с Х-сцепленными формами 38/82 46% умственной отсталости, проявляющимися преимущественно у гетерозигот, в том числе синдромы:

Блоха-Сульцбергера 10/10 100% Айкарди 1/1 100% Гольтца 1/1 100% RTT 26/70 37% Матери девочек с Х-сцепленными p0, 13/66 20% заболеваниями, проявляющимися преимущественно у гетерозигот, в том числе синдромы:

Блоха-Сульцбергера 1/5 20% Айкарди 0/1 0% RTT 12/60 20% Аномалии хромосомы Х 5/5 100% Женщины из семей с p0, 5/22 23% недифференцированными формами умственной отсталости Контрольная группа 5/76 6,5% * — значение р оценивалось при сравнении каждой исследованной группы с контрольной группой методом дисперсионного анализа с использованием критерия Стьюдента.

Х-инактивация была неслучайной также у матерей детей с синдромами Коффина Лоури, Барта, Симпсона – Голаби - Бемеля, Опица FG, отопалатодигитальным синдромом 1 типа и др. Неравная Х-инактивация указывала на носительство этими женщинами Х-сцепленных мутаций и высокий риск повторного рождения у них детей с умственной отсталостью. Наиболее значимым на наш взгляд являлся анализ Х инактивации у женщин в семьях с недифференцированными формами умственной отсталости: у 5 из 22 (23%) женщин из 19 семей был выявлен сдвиг Х-инактивации, что высоковероятно указывало на Х-сцепленный характер наследования патологии.

Необходимо отметить, что 5/76 (6,5 %) женщин контрольной группы также имели сдвиг Х-инактивации. Последних, по-видимому, следует отнести в группу риска носительства Х-сцепленных генетических дефектов.

Полученные данные согласуются с представлениями о том, что неравная инактивация хромосомы Х является одной из характерных эпигенетических особенностей Х сцепленных форм умственной отсталости (Юров и др., 2004;

Plenge et al., 2002). В настоящей работе показано, что исследование Х-инактивации повышает эффективность диагностики XLMR среди недифференцированных форм патологии, позволяет выявлять асимптоматических носительниц Х-сцепленных мутаций.

Результаты исследования показали, что особенности инактивации хромосомы Х значительно влиянют на фенотип гетерозигот по мутациям Х-сцепленных генов. Как видно из рисунка 7, у детей со сдвигом Х-инактивации, наблюдались лёгкие формы синдрома Ретта, а у девочек с равной Х-инактивацией – тяжелые формы.

Рис.7. Зависимость тяжести течения RTT от степени сдвига Х-инактивации.

Показано уменьшение доли детей с тяжелыми и возрастание вклада больных с лёгкими формами RTT при увеличении сдвига Х-инакивации.

Следует подчеркнуть, что не только степень сдвига Х-инактивации, но и его направление влияли на фенотип гетерозигот. При этом, чем выше был процент клеток с активной нормальной хромосомой Х, тем чаще наблюдались лёгкие формы заболеваний вплоть до асимптоматического носительства при 100% сдвиге Х-инактивации. В тех случаях, когда была преимущественно активна хромосома Х с мутацией, наблюдалось развитие выраженных клинических проявлений XLMR у гетерозигот. Полученные результаты указывали на возможность прогнозирования тяжести клинических проявлений у девочек с мутациями Х-сцепленных генов.

Прогнозирование тяжести течения заболевания у детей при Х-сцепленных формах умственной отсталости.

У индивидуумов с мутациями/премутациями гена FMR1 (30 детей и 32 члена их семей) и мутациями гена MECP2 (66 детей) показана возможность прогнозирования особенностей фенотипических проявлений (синдромы FRAXA и RTT).

Система прогнозирования тяжести состояния ребёнка с синдромом Ретта (табл.7) основывается на исследовании следующих показателей: типа, позиции мутации гена MECP2, определенных рекуррентных мутаций, а также особенностей инактивации хромосомы Х. При этом сдвиг Х-инактивации против мутантной хромосомы Х может облегчать течение болезни, а сдвиг Х-инактивации против нормальной хромосомы Х может делать его более тяжёлым.

Таблица 7.

Прогнозирование тяжести течения RTT на основе определения мутации гена MECP2 и анализа инактивации хромосомы Х.

Генетические и Тяжёлое течение заболевания Легкое течение заболевания эпигенетические факторы, определяющие тяжесть течения RTT Тип и позиция мутации • • Нонсенс мутации Миссенс мутации гена MECP2 • • Мутации со сдвигом Делеции на 3’-конце рамки считывания за гена MECP исключением делеций на 3’ конце гена MECP • • Особенности R168X R106W рекуррентных мутаций • • R255X R133C гена MECP2 • • R270X R294X • • T158M R306C • • Особенности Равная инактивация Преимущественная инактивации хромосомы хромосомы Х инактивация хромосомы Х с Х • мутацией гена MECP Преимущественная инактивация хромосомы Х с нормальным аллелем гена MECP Индивидуальный анализ числа CGG-повторов в гене FMR1 и особенностей инактивации хромосомы Х даёт возможность прогнозировать фенотипические признаки больных с синдромом FRAXA и членов их семей. Как видно из таблицы 8, клинические проявления у лиц как мужского, так и женского пола с экспансией тринуклеотидных повторов в гене FMR1 определяются наличием премутации либо полной мутации данного гена. Кроме того, на фенотип женщин влияют особенности инактивации хромосомы Х: снижение интеллекта у женщин с полной мутацией гена FMR пропорционально проценту клеток с активной мутантной хромосомой Х.

Таблица 8.

Прогнозирование фенотипа на основе определения числа CGG-повторов в гене FMR1 и анализа инактивации хромосомы Х Генетические и Фенотип больных Фенотип больных женского эпигенетические факторы, мужского пола пола определяющие фенотип Число CGG-повторов в - Когнитивные Когнитивные нарушения и гене FMR1 от 55 до 200 нарушения и нарушения нарушения поведения Повышен поведения риск развития:

- Повышен риск развития - дисфункции яичников, синдрома FXTAS - синдрома POF (менопауза до (тремора и атаксии) 40-летнего возраста), - эстроген-зависимых опухолей, - синдрома FXTAS Число CGG-повторов в - Синдром умственной - Синдром умственной гене FMR1 более 200 отсталости, сцепленной с отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х ломкой хромосомой Х - Асимптоматическое носительство мутации Особенности инактивации Снижение интеллекта у женщин хромосомы Х с полной мутацией гена FMR пропорционально проценту клеток с активной мутантной хромосомой Х Идентификация аномалий хромосомы Х у детей с недифференцированной умственной отсталостью на основе клинических, цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований.

Применение цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований позволило определить аномалии хромосомы Х у 6 детей с ранее недифференцированной умственной отсталостью (табл.9).

Таблица 9.

Результаты клинических, цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований у детей с недифференцированными формами умственной отсталости.

№/пол Особенности фенотипа Метод Результат Оценка пациен исследования исследования результата та исследования Умственная отсталость, Стандартное Норма 1/муж 46,XY аутизм, гипотония мышц, цитогенетиче микроцефалия, лицевые ское микроаномалии исследование (широкое лицо, эпикант, маленький Метафазная Микродуплика ish cgh рот, крупные ушные сравнительна dup(X)(q28qter)(ISC ция хромосомы раковины), гипоплазия я геномная Х в участке N 2005) гениталий и шалевидная гибридизация Хq ish cgh мошонка, рекуррентные enh(X)(q28qter)(ISC инфекции N 2009) Умственная отсталость, Стандартное Норма 2/муж 46,XY,1phqh аутизм, судороги, гипотония цитогенетиче мышц, микроцефалия, ское задержка физического исследование развития, крупные ушные Серийная 46,XY, 1phqh, arr Микродуплика раковины, маленький рот, сравнительна 14q32.2(101,142,170 ции 14q32.2, врожденный вывих бедра я геномная – 101,318,256)x3, 16p13.3, гибридизация 16p13.3(814,190 – 22q13.1 и Хq 962,809)x3, 22q13. (38,003,877– 38,022,161)x3, Xq28(153,130,000– 153,647,227)x Умственная отсталость, Стандартное Дупликация 3/муж 46,Y,dup(X)(q микроцефалия, судороги, цито- хромосомы Х в q28) лицевые микроаномалии генетическое участке Хq (широкое лицо, эпикант, исследование маленький рот, крупные ушные раковины), крипторхизм, рекуррентные инфекции, смерть в раннем возрасте Умственная отсталость, Стандартное Норма 4/жен 46,ХХ аутизм, микроцефалия, цито низкий рост, микроаномалии генетическое (низкая линия роста волос на исследование лбу, короткая шея, Прометафазн Частичная 46,Х,del(Х)(р21р21) конусовидные пальцы и ый анализ делеция поперечная ладонная короткого борозда), миопический плеча астигматизм, анемия, хромосомы Х нейтропения.

Умственная отсталость, Стандартное Мозаицизм по 5/жен 46,X,i(X)(q10)/ аффективные расстройства, цито- изохромосоме 46,XX детский аутизм и генетическое Х диссоциированная задержка исследование психоречевого развития, Мозаицизм по FISH 46,X,i(X)(q10).ish гипоплазия мозолистого тела изодицентриче idic(X)(p11.2) на МРТ ской (DXZ1++)[30]/46,X хромосоме Х, X.ish(DXZ1x2)[274] обнаруженной nuc ish в 10% клеток Xcen(DXZ1x1)[2]/X cen(DXZ1x2)[998] Синдром Ретта, стертая Стандартное Норма 6/жен 46,XX форма цито генетическое исследование Серийная 46,XX,1phqh, arr Микроделеции сравнительна 14q12 (23,575,187 – 14q12, Xq13.1, я геномная 23,732,133)x1, Xq22.1, Xq гибридизация Xq13.1(70,474,715 – 70,608,113)x1, Xq22.1(100,082, – 100,164,698)x1, Xq28 (153,145,800 – 153,301,421)x У 3 больных субмикроскопические аномалии хромосомы Х были выявлены только с использованием методов высокоразрешающего сканирования генома (рис.8), таких как метафазная сравнительная геномная гибридизация и серийная сравнительная геномная гибридизация в лабораториях молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России и цитогенетики и геномики психических заболеваний НЦПЗ РАМН.

Следует отметить, что у 3 из 6 детей нами установлен синдром микродупликации Хq28, который предположительно является одной из частых причин умственной отсталости у мальчиков и был выделен несколько лет назад благодаря применению высокоразрешающих технологий [Van Esch et al, 2005;

Madrigal et al., 2007].

Соответствие клинических признаков аномалиям, выявленным при использовании метода серийной CGH, требовало проведения биоинформатического анализа [Юров, 2011]. Данный метод способствует поиску генов-кандидатов, изменение количества копий которых ведёт к формированию фенотипических признаков у детей с XLMR и идентификации новых форм патологии.

В настоящей работе было подтверждено, что умственная отсталость, связанная с хромосомой Х, может быть результатом не только генных мутаций, но и изменений количества копий генов хромосомы Х, как указывалось ранее в зарубежных исследованиях [Gecz et al., 2009;

Vandewalle et al., 2009].

Рис.8. Анализ микродупликации Xq28 методом серийной сравнительной геномной гибридизации у больного 2: дупликация Xq28 от 153 130 000-го до 153 647 227-го нуклеотида хромосомы Х – более 500 000 пар нуклеотидов.

Для обеспечения эффективности обнаружения структурных аномалий хромосомы Х, требуется использование комплекса методов: цитогенетического, молекулярно цитогенетических (FISH, метафазной CGH, серийной CGH), исследования инактивации хромосомы Х, биоинформатического анализа. Представленные в настоящей работе данные демонстрируют преимущества использования высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических технологий в диагностике Х-сцепленных форм умственной отсталости по сравнению с традиционными.

Алгоритм диагностики Х-сцепленной умственной отсталости.

Анализ роли мутаций Х-сцепленных генов, структурных микроаномалий хромосомы Х, особенностей Х-инактивации и клинического полиморфизма Х-сцепленных форм умственной отсталости (XLMR) у детей позволил разработать алгоритм диагностики данной группы заболеваний. На рисунке 9 представлен алгоритм диагностики X сцепленной умственной отсталости у мальчиков, который складывается из нескольких этапов.

Недифференцированные формы умственной отсталости у мальчиков Клинико-генеалогический анализ А В Синдромальные и Б Синдромальная XLMR несиндромальные Недифференцированная формы умственная отсталость Несиндромальная умственной XLMR Исследования мутаций генов отсталости, XLMR у пробандов Цитогенетические, молекулярные, связанные с молекулярно-цитогенетические, мутациями биохимические исследования Обнаружена мутация Мутаций не аутосомных генов, Х-сцепленного гена обнаружено структурными или Аномалий не обнаружено количественными аномалиями и Определены Исследование несбалансированных микроанома микроаномалии микроаномалий хромосом у лиями аутосом, хромосомы Х пробандов методами CGH и ArrayCGH метаболические болезни и другие Аномалий не определено Исследования Х-инактивации у матерей пробандов Отсутствие сдвига Х-инактивации у Обнаружен сдвиг Х матери при нормальном фенотипе инактивации у матери Умственная отсталость у ребёнка остаётся У ребёнка подтверждена недифференцированной XLMR Рис.9. Алгоритм диагностики Х-сцепленных форм умственной отсталости среди мальчиков с недифференцированными фомами нарушений интеллекта. Буквами А, Б, и В обозначены три возможных направления диагностического поиска.

Первым этапом обследования мальчика с генетически обусловленной недифференцированной умственной отсталостью является клинико-генеалогическое исследование. После его проведения может быть установлен диагноз Х-сцепленного синдрома (А). В случаях изолированной умственной отсталости у ребенка при её сцепленным с полом наследовании можно установить диагноз несиндромальной XLMR (Б). Возможна также клиническая диагностика наследственных заболеваний, связанных с мутациями аутосомных генов и других заболеваний, не являющихся Х-сцепленными.

Однако после клинико-генеалогического исследования остаётся большая группа детей с недифференцированными формами нарушений интеллекта (В), что требует расширения диагностического поиска.

При выявлении типичной клинической картины Х-сцепленного синдрома (обозначено буквой А на рис. 9) необходимо исследование мутаций соответствующего гена хромосомы Х. Если мутация определена, то диагноз следует считать подтверждённым, и рекомендуется обследовать мать больного на носительство данной мутации. Если мутаций в гене не обнаружено, а фенотип указывает на определённую синдромальную форму XLMR, то осуществляется переход к следующему этапу исследованию инактивации хромосомы Х у матери пробанда. Выявление сдвига Х инактивации у матери подтверждает диагноз XLMR у ребенка и носительство XLMR матерью. Если сдвиг Х-инактивации не обнаружен при нормальном фенотипе женщины, то можно сделать вывод о возникновении Х-сцепленного синдрома у ребенка в результате de novo мутации и низком риске его повторения в семье.

В связи с тем, что у ребенка с несиндромальными формами умственной отсталости, сцепленной с полом, исследование мутаций во всех идентифицированных в настоящее время генах несиндромальной представляется крайне сложным и XLMR дорогостоящим, рекомендуется сразу проводить исследование инактивации хромосомы Х у матери больного (обозначено буквой Б на рис.9). Обнаружение сдвига Х инактивации позволит подтвердить диагноз XLMR у ребёнка и её носительство у матери, а также сделает более оправданным чрезвычайно трудоёмкий и дорогой поиск мутаций генов несиндромальной XLMR.

Среди форм умственной отсталости у мальчиков, которые остались недифференцированными после клинико-генеалогического исследования, диагностика XLMR осуществляется методом исключения (обозначено буквой В на рис.9): у части больных при цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследованиях могут быть обнаружены хромосомные аномалии, у другой части – наследственные метаболические болезни. У оставшихся мальчиков необходимо использовать методы метафазной CGH либо серийной CGH для выявления микроделеций и микродупликаций хромосом.

Если умственная отсталость остаётся недифференцированной после применения перечисленных выше методов, следует использовать анализ инактивации хромосомы Х.

При этом, обнаружение сдвига Х инактивации у матерей мальчиков позволит предположить Х-сцепленный характер патологии. К исследованию Х-инактивации при недифференцированной умственной отсталости у мальчиков можно прибегнуть сразу, минуя другие методы (пунктирная линия на рис. 9).

При обследовании девочек с недифференцированной умственной отсталостью алгоритм выявления XLMR, в целом, такой же, как у мальчиков, однако, исследования Х-инактивации должны проводиться как у больных девочек, так и их матерей.

Интерпретация результатов исследования Х-инактивации у девочек с нарушениями интеллекта более сложна и требует учета её особенностей у ребенка и матери.

Анализ эффективности методов терапевтической коррекции у детей с некоторыми формами Х-сцепленной умственной отсталости.

У 18 больных с синдромом FRAXA оценивалась эффективность стимуляции лазеропунктуры психического развития методом с помощью квантового терапевтического аппарата с использованием инфракрасного «РИКТА-01» широкополосного (= 0,83-0,96 нм) лазерного излучения мощностью на выходе световода 2 мВ. Динамика коэффициента психического развития у детей за год, в течение которого было проведено 4 курса лазеропунктуры, значительно различалась: у из 18 (17%) больных наблюдалось увеличение коэффициента психического развития на более чем 10 баллов (значительное улучшение), у 13 детей (72%) оно составило менее 10 баллов (незначительное улучшение), у 2 (11%) – изменений не было отмечено. В целом, положительная динамика коэффициента психического развития у детей основной группы (6,7±2,9) была статистически достоверно выше, чем в контроле (3,6±2,0;

p0,05).

При синдроме Ретта использование симптоматической терапии с включением (коэнзим корректоров нарушений клеточной биоэнергетики Q10, L-карнитин, никотинамид, рибофлавин, тиамин, липоевая кислота, биотин, аскорбиновая кислота, витамин Е) позволило достигнуть стабилизации и некоторого улучшения состояния из 44 больных (77%). В частности, уменьшились проявления аутизма, повысилась психическая активность, а также социализация поведения у 32 из 44 детей (72%), активизировалась речевая деятельность у больных улучшились 34 (77%), эмоциональные реакции у 32 (72%), целенаправленные движения рук – у 18 (41%), уменьшились проявления фокальной дистонии у 29 (66%), появились новые моторные навыки (ходьба, сидение) у 22 (50%), уменьшились вегетативные расстройства в конечностях у 31 ребёнка (71%), а также снизилась продолжительность и интенсивность стереотипных движений рук у 19 больных (48%). Вместе с тем, у 10 детей с RTT заболевание продолжало прогрессировать, несмотря на проводимую терапию.

В связи с появившимися в последние годы возможностями лечения больных с мукополисахаридозом II типа с помощью ферментозамещающей терапии, нами предпринята попытка оценить её эффективность. Установлено, что у 3 больных с МПСII длительное применение (2 – 3 года) генно-инженерного фермента элапразы позволило достигнуть улучшения соматического статуса: значительного увеличения темпов физического развития, уменьшения размеров печени и селезёнки, увеличения амплитуды движений в крупных суставах (рис. 10).

Б А Рис.10. Эффективность ферментозамещающей терапии у больного с мукополисахаридозом II типа: А - Динамика длины тела ребенка с момента рождения до возраста 11 лет (на графике – линия чёрного цвета);

красной стрелкой показан момент начала введения препарата Элапраза. Б – Увеличение объема движений в крупных суставах за 3 года терапии.

Однако значительного улучшения нервно-психического развития детей не произошло, хотя у них наблюдалось повышение познавательной активности, увеличение физиологического альфа-ритма и уменьшение патологического тета-ритма на электроэнцефалограмме.

Таким образом, проблема лечения больных с различными формами XLMR остаётся малоразработанной, что требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ.

1. Установлен удельный вес больных с Х-сцепленной умственной отсталостью среди детей с нарушениями нервно-психического развития, который составил 6,54% по данным специализированных клиник.

2. Разработанные шкалы количественной оценки фенотипа в баллах для наиболее частых форм X-сцепленной умственной отсталости - синдромов Ретта (RTT) и умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х (FARXA), вместе с современными молекулярно-генетическими методами повышают эффективность диагностики RTT с 70 до 89% и синдрома FRAXA – с 3,8 до 40%.

3. Определён спектр мутаций гена МЕСР2 у детей с клиническим диагнозом синдрома Ретта, наиболее частыми из которых являются нонсенс мутации (43%), 36% составляют миссенс мутации и 21% - делеции данного гена. Показано, что классическая форма синдрома Ретта в редких случаях (2 из 205 детей) может встречаться у мальчиков, у которых обнаружены нонсенс мутации R270X и R168X.

4. У 40% мальчиков с клиническим диагнозом синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х (синдром FRAXA) в промоторе гена FMR обнаружено увеличенное число CGG-повторов до более 200 (полная мутация), и установлена взаимосвязь между наличием мутации гена FMR1 и экспрессией ломкости участка fra(X)(q27.3). У 84% обследованных родственников больных обнаружена премутация либо полная мутация гена FMR1, что указывает на необходимость выявления экспансии тринуклеотидных повторов в промоторе данного гена у членов семей детей с синдромом FRAXA.

5. Среди детей с Х-сцепленной умственной отсталостью в 2% (6 из 314) случаев обнаружены микроаномалии хромосомы Х, для выявления которых необходимо применение высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов (метафазной и серийной сравнительной геномной гибридизации и флюоресцентной in situ гибридизации).

6. Показано, что эпигенетический феномен неравной инактивации хромосомы Х является характерной особенностью Х-сцепленной умственной отсталости.

Установлена повышенная частота неравной инактивации хромосомы Х у женщин из семей мальчиков с Х-сцепленными формами умственной отсталости, характерными для гемизигот (45%), и у девочек с Х-сцепленными формами умственной отсталости, характерными для гетерозигот (46%), по сравнению с контрольной группой здоровых лиц женского пола (6,5%).

7. Исследование инактивации хромосомы Х повышает эффективность выявления гетерозиготных носительниц Х-сцепленных мутаций в семьях детей с Х-сцепленной умственной отсталостью с 17% до 46 %, по сравнению с использованием только клинико-генеалогического метода. На основе анализа инактивации хромосомы Х предполагаемое носительство X-сцепленной умственной отсталости определено у 23% женщин из семей больных с недифференцированной умственной отсталостью.

8. Установлена зависимость экспрессивности клинических признаков при Х сцепленных заболеваниях с умственной отсталостью от генетических и эпигенетических факторов: от типа и позиции мутаций гена МЕСР2 при синдроме Ретта;

от наличия экспансии тринуклеотидных повторов в промоторе гена FMR1 при синдроме FRAXA;

от степени и направления сдвига инактивации хромосомы Х у гетерозигот при различных формах X-сцепленной умственной отсталости.

9. Разработанный алгоритм диагностики X-сцепленной умственной отсталости основан на постадийном применении клинико-генеалогического анализа, молекулярно генетических исследований мутаций генов хромосомы Х, комплекса молекулярно цитогенетических методов диагностики, анализа инактивации хромосомы Х.

10. Внедрение ферментозамещающей терапии (препарат Элапраза) у больных с мукополисахаридозом II типа (синдром Хантера) позволяет достичь улучшения соматического статуса и психического развития. При синдромах умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х, Ретта, адренолейкодистрофии эффективность терапевтической коррекции остается низкой.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для эффективной диагностики Х-сцепленной умственной отсталости у детей рекомендуется использовать разработанный алгоритм, который предусматривает клинико-генеалогический анализ, молекулярно-генетические исследования мутаций генов хромосомы Х, молекулярно-цитогенетические методы (флуоресцентную гибридизацию in situ, метафазную сравнительную геномную гибридизацию, серийную сравнительную геномную гибридизацию), анализ инактивации хромосомы Х.

2. Для частых форм XLMR (синдромы Ретта и умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х) рекомендуется использовать разработанные клинические шкалы, которые включают количественную оценку экспрессивности неврологических, психологических, соматических признаков данных заболеваний.

Предложенные шкалы необходимы для исследования зависимости тяжести течения заболеваний от генотипа больных, а также могут использоваться для оценки динамики клинических проявлений при применении различных способов терапевтической коррекции.

3. Для повышения эффективности медико-генетического прогноза у женщин из семей с Х-сцепленной умственной отсталостью рекомендуется исследование инактивации хромосомы Х. Обнаружение неравной Х-инактивации указывает на наличие Х сцепленных мутаций и может быть использовано для выявления асимптоматических носительниц Х-сцепленной умственной отсталости.

4. Для прогнозирования тяжести фенотипических проявлений у детей с X сцепленными формами умственной отсталости рекомендуется проведение анализа мутаций Х-сцепленных генов и определение особенностей инактивации хромосомы Х. Обнаруженные нонсенс мутации гена MECP2 и мутации со сдвигом рамки считывания, рекуррентные мутации - R168X, R255X, R270X, T158M, а также сдвиг Х-инактивации, способствующий экспрессии мутантного аллеля, ведут к тяжелому течению синдрома Ретта. Более лёгкое течение заболевания наблюдается при миссенс мутациях, рекуррентных мутациях - R106W, R133C, R294X и R306C, а также при сдвиге Х-инактивации, способствующем экспрессии нормального аллеля.

При премутации гена FMR1 (число CGG-повторов от 54 до 200) наблюдаются когнитивные расстройства и нарушение поведения, наступление менопаузы у носительниц до возраста 40 лет и синдром тремора и атаксии. При числе CGG повторов более 200 наблюдается синдром FRAXA. У лиц женского пола тяжесть течения синдрома FRAXA зависит от особенностей инактивации хромосомы Х:

выраженные клинические проявления наблюдаются при сдвиге Х-инактивации, способствующем экспрессии мутантного аллеля, умеренные проявления – при равной Х-инактивации, отсутствие симптомов - при сдвиге Х-инактивации, способствующем экспрессии нормального аллеля.

5. Патогенетически обоснованной терапией мукополисахаридоза II типа (синдрома Хантера) является длительная (годы) ферментозамещающая терапия (элапраза 0, мг/кг внутривенно 1 раз в неделю). При синдроме Ретта для уменьшения прогрессирования заболевания рекомендуется прием энерготропных препаратов (L карнитин - 30-50 мг/кг/сут, коэнзим Q10 30-60 мг/сут), витаминов группы B (рибофлавин - 20-30 мг/сут, тиамин - 20-30 мг/сут, никотинамид - 20-30 мг/сут) и антиоксидантов (витамин E - 50-100 мг/сут) 3 курса в год продолжительностью по месяца. При синдроме FRAXA для стимуляции психического развития и коррекции поведения рекомендуется лазеропунктура (7-8 сеансов продолжительностью минут частотой 3 раза в неделю, 3-4 курса в год) и L-ацетилкарнитин длительно (месяцы) в дозе 250-500 мг/сут. При адренолейкодистрофии необходим длительный (годы) приём масла Лоренцо в дозе 2 мл/кг/сут.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Kazantseva L.Z., Novikov P.V., Ulas1 V.Y., Klembovsky A.I. Clinico-biochemical variants of Rett 1.

syndrome in children. // Abstr. of World Congress on Rett Syndrome. – Sweden, 1996. – P.94.

Vorsanova S.G., Demidova I.A., Ulas1 V.Y., Kzantseva L.Z., Vechova N.V., Soloviev I.V., Yurov 2.

Yu.B. Molecular-cytogenetic and cytogenetic investigations of Rett syndrome in children. // Abstr.

of World Congress on Rett Syndrome. – Sweden, 1996. – P.112.

Vorsanova S.G., Demidova I.A., Ulas1 V.Yu., Soloviev I.V., Kazantzeva L.Z., Yurov 3.

Yu.B.Cytogenetic and molecular-cytogenetic investigation of Rett syndrome: analysis of 31 cases.

// Neuroreport. - 1996. – Vol. 8(1). – P.187-9.

Ulas1 V.U., Kazantseva L.Z., Klembovsky A.I., Nikolayeva E.A. The structure and function of 4.

mitochondria in children with Rett syndrome. // Abstr. of 7th internat. congress of inborn errors of metabolism. – Vienna, Austria, 1997. - P.55.

Ворсанова C.Г., Демидова И.А., Улас1 В.Ю., Соловьев И.В., Кравец В.С., Казанцева Л.З., 5.

Юров И.Ю. Цитогенетическая и молекулярно- цитогенетическая диагностика синдрома Ретта у детей. // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С.Корсакова. – 1998. - № 4. – С.

53 – 56.

Автор носила фамилию Улас (Ulas) до 2005 года.

Ворсанова С.Г., Улас1 В.Ю., Демидова И.А., Кравец В.С., Юров Ю.Б. Современные 6.

представления о синдроме Ретта: клинические, цитогенетические и молекулярные исследования. // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С.Корсакова. – 1999. - № 3. – С.

61 – 69.

Ulas1 V.Y., Nikolaeva E.A., Klembovski A.I., Suchorukov V.S., Kazantseva L.Z. Mitochondrial 7.

disturbancies in children with Rett syndrome. // Abstr. of 4th European meeting on mitochondrial pathology. – Cambridge, 1999. – P.224.

Vorsanova S.G., Demidova I.A., Ulas1 V.Y., Beresheva A.K., Kolotii A.D., Sharonin V.O., Kravetz 8.

V.S., Soloviev I.V., Yurov Y.B. Cytogenetic and molecular-cytogenetic studies of Rett syndrome (RTT): retrospective analysis of russian cochort of RRT patients. // Abstr. of World congress on Rett syndrome. – Karuizawa, Nagano, Japan, 2000. - P.48.

Gratchev V.V., Ilina E.S., Gorbachevskaya N.L., Bashina V.M., Ulas1 V.Y., Vorsanova S.G., 9.

Yurov Y.B. The case of classical Rett syndrome Phenotype in male. // Abstr. of World congress on Rett syndrome. – Karuizawa, Nagano, Japan, 2000. - P.35.

10. Ulas1 V.Yu., Voinova V.M., Il’in L.B., Troitskaya L.A., Dobrynina E.V., Kazantseva L.Z.

Application of laser therapy in treating inherited forms of psychoverbal retardation in children. // Low-Level Laser Therapy. - 2000. –Vol. 22. - P. 113 – 118.

11. Харабадзе М.Н., Тозлиян Е.В., Улас1 В.Ю., Казанцева Л.З., Сухоруков В.С. Цитохимическая диагностика и лечение нарушений клеточного энергообмена при синдроме Ретта у детей. // Материалы VIII Росийского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2001. – С.449.

12. Харабадзе М.Н., Улас1 В.Ю., Сухоруков В.С., Казанцева Л.З. Митохондриальная недостаточность при синдроме Ретта и опыт ее лекарственной коррекции. // Материалы всероссийского рабочего совещания «Митохондрии в патологии» - Пущино, 2001. – С.162 164.

13. Улас1 В.Ю. Синдром Ретта. / Наследственные нарушения нервно-психического развития детей. Руководство для врачей под ред. профессора П.А.Темина, профессора Л.З.Казанцевой.

– М.: Медицина, 2001. – С.359-366.

14. Казанцева Л.З., Улас1 В.Ю., Курбатов М.Б., Семячкина С.В., Шаронин В.О., Сухоруков В.С., Тозлиян Е.В., Грачев В.В., Горбачевская Н.Л. Синдром Ретта у мальчика. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2001. - №3. – С.25-30.

15. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Ulas1 V.Y., Demidova I.A., Sharonin V.O., Kolotii A.D., Gorbatchevskaia N.L., Beresheva A.K., Soloviev I.V. Cytogenetic and molecular-cytogenetic studies of Rett syndrome (RTT): a retrospective analysis of a Russian cohort of RTT patients (the investigation of 57 girls and three boys). // Brain Dev. - 2001. – Vol.23. - Suppl 1. – P.S196-S201.