Применение методов геносистематики для решения вопросов таксономии и изучения биоразнообразия прокариот
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
На правах рукописи
Турова Татьяна Павловна ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ГЕНОСИСТЕМАТИКИ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ВОПРОСОВ ТАКСОНОМИИ И ИЗУЧЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ ПРОКАРИОТ 03.00.07 – микробиология Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2009 2
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, Дедыш Светлана Николаевна доктор биологических наук, профессор, Синеокий Сергей Павлович доктор биологических наук, Троицкий Алексей Викторович
Ведущая организация: Институт физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Защита диссертации состоится “ “ 2009 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.
7, корп. 2.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Диссертация в виде научного доклада разослана “_” 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Геносистематика (или молекулярная систематика) в отличие от традиционной систематики (феносистематики) оценивает родство организмов, исходя из сходства или различия их геномов, т.е. ее можно назвать наукой о разнообразии генотипов организмов. Развитие геносистематики происходило параллельно с развитием биохимии, а затем молекулярной биологии и было связано с прогрессом в понимании процессов изменчивости информационных макромолекул (семантид) и влияния этих процессов на фенотипические признаки организмов. Основы молекулярной cистематики были заложены в конце 50-х годов прошлого века независимо двумя группами ученых под руководством А.Н.Белозерского и К.Ли, обнаружившими корреляцию нуклеотидного состава ДНК с положением организмов в системе, - сначала у бактерий, а затем и у эукариот. В начале 60-х годов Э. Цукеркандлем и Л. Полингом было впервые заявлено о возможности использования анализа последовательностей, т. е. первичной структуры клеточных макромолекул - носителей информации, для филогенетической классификации живых организмов. Значительную роль в развитии теоретических основ молекулярной филогенетики сыграла концепция «молекулярных часов», выдвинутая этими же авторами в 1965 г., и теория нейтральности молекулярной эволюции, разработанная в конце 60-х годов М.Кимурой, а также Дж. Кингом и Т.Джуксом. В конце 70х - начале 80-х годов работы ученых группы К.Везе дали начало направлению, которое впоследствии получило название «рибосомной» филогенетики и сыграло особую роль в систематике микроорганизмов.
Применение молекулярно-биологического подхода для изучения эволюции живых организмов выявило его принципиальное преимущество по сравнению с традиционным фенотипическим подходом: оно открыло возможность сравнения отдаленных организмов, которые могут совсем не иметь общих фенотипических признаков. Таким образом, появилась возможность с помощью единой методологии осуществлять построение всеобъемлющих филогенетических схем, что, несомненно, приближает исследователей к созданию наиболее естественной системы живых организмов, т.е. опирающейся на их филогенетические взаимоотношения, возникшие в процессе их эволюции.
Развитие молекулярной систематики в микробиологии оказалось особенно успешным в силу ряда особенностей прокариотных организмов. С одной стороны, по сравнению с систематикой эукариот, успехи микробиологов в филогенетике нельзя было назвать значительными. Последовательное введение в систематику эукариот эволюционных принципов позволило создать стройные непротиворечивые системы, опирающиеся на реальные филогенетические взаимоотношения организмов, и в этом смысле являющиеся естественными. Вместе с тем, все попытки конструирования сколько-нибудь детализованной эволюционной схемы прокариот, исходя из которой можно было бы приблизиться к созданию их естественной системы, в рамках традиционной фенотипической систематики оставались безуспешными, в результате чего даже была поставлена под сомнение сама такая возможность.
Это заставляло микробиологов стремиться воспользоваться теми принципиально новыми возможностями решения таксономических проблем, которые предоставляла молекулярная систематика. С другой стороны, менее сложная по сравнению с эукариотами организация генома прокариот позволяла использовать их в качестве преимущественных объектов геносистематики.
Уже первые попытки использования молекулярно-биологических методов позволили решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов. С развитием геносистематики, расширением круга используемых ею методов и накоплением экспериментальных данных, касающихся различных таксономических групп бактерий, вклад ее в решение общих кардинальных проблем систематики прокариот начал быстро возрастать.
Вместе с тем появились и новые проблемы, связанные главным образом с противоречиями, иногда весьма значительными, между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа. В некоторых случаях эти противоречия объяснялись несовершенством знаний, как в отношении фенотипа, так и в отношении генотипа, поэтому в результате более тщательных исследований удавалось устранить их причины. Однако, по-видимому, существуют не только случайные, но и объективные противоречия, обусловленные естественными закономерностями эволюционных взаимоотношений микроорганизмов.
Изучение этих закономерностей, а также степени их влияния на построение естественной системы прокариот является ключевой проблемой современной молекулярной систематики.
Целью работы являлось проведение сравнительного анализа генетических структур различных групп прокариот c помощью комплекса молекулярно-биологических методов и использование результатов этого анализа для решения частных и общих проблем таксономии, филогении и экологии прокариот.
Задачи работы.
1) Определить сходство тотальных геномов бактерий с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации, а также провести статистический анализ полученных результатов и литературных данных;
2) Оценить возможность создания универсальной системы формальных (количественных) критериев родства бактерий и ее использования в таксономии прокариот;
3) Провести сравнительный анализ первичной и вторичной структуры генов 16S рибосомных РНК представителей различных таксономических групп прокариот и определение филогенетического положения изучаемых микроорганизмов на общем дереве прокариот;
4) Применить результаты филогенетического анализа генов 16S рРНК для решения конкретных проблем идентификации вновь выделенных штаммов бактерий, описания новых таксонов бактерий, а также изучения биоразнообразия прокариотных сообществ различного происхождения;
5) Определить нуклеотидные и транслированные белковые последовательности некоторых структурных функциональных генов, детерминирующих различные процессы метаболизма прокариот, и изучить возможность использования сравнительного анализа полученных данных для решения проблем таксономии, эволюции и экологии прокариот;
Научная новизна и теоретическая значимость работы. В данной работе на основании обобщения обширного экспериментального материала, касающегося изучения сходства генетических структур представителей различных групп прокариот, осуществлен анализ возможностей, предоставляемых молекулярной систематикой для решения кардинальных проблем таксономии и эволюции прокариот. Для этого в рамках работы:
- проведен анализ распределения уровней сходства геномов (определенных с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации) бактерий, представляющих практически весь таксономический спектр, что позволило установить бимодальный характер соответствующих графиков распределения.
Обсуждено значение результатов анализа для создания концепции вида у бактерий.
- предложено использование порядка Haloanaerobiales в качестве эталонного таксона при проведении таксономических исследований бактерий.
На основании изучения филогенетического положения всего порядка и родственных взаимоотношений внутри него представлены ориентировочные количественные критерии определения рангов таксонов бактерий от вида до семейства.
- разработаны новые сиcтемы олигонуклеотидных праймеров для избирательной амплификации генов 16S рРНК архей, а также новые системы специфических праймеров для амплификации структурных генов нитрогеназы (nifH) и генов больших субъединиц (cbbL и cbbM) рибулезо-1,5 биcфосфаткарбоксилазы (РБФК).
- с использованием сиквенс–анализа генов 16S рРНК проведено описание новых таксонов бактерий и архей, в том числе, 3 порядков, 4 семейств, 35 родов и 96 видов.
- в геноме сульфатвосстанавливающей бактерии Desulfotomaculum kuznetsovii впервые у бактерий выявлено существование двух копий генов 16S рРНК, значительно (более 8% дивергенции) различающихся между собой за счет сверхдлинных вставок в концевых вариабельных участках последовательностей, и обсуждена возможность влияния обнаруженного феномена на проведение исследований по «рибосомной» филогенетике.
- в геномах ряда бактерий выявлены, отсеквенированы и проанализированы структурные гены, детерминирующие различные особенности метаболизма. Обсуждена возможность использования результатов этого анализа для решения проблем таксономии и эволюции исследованных физиологических групп бактерий.
- с применением сиквенс-анализа как рибосомных, так и функциональных генов осуществлены молекулярно-экологические исследования филогенетического разнообразия прокариот в ряде природных мест обитания.
Практическая значимость работы.
Разработан и применен в конкретных исследованиях метод ускоренной идентификации бактерий с помощью молекулярной гибридизации ДНК, защищенный авторским свидетельством № 649751 (1979 год).
Для выявления генов 16S рРНК у архебактерий, структурных нитрогеназных генов у архебактерий и бактерий, а также генов рибулозо бисфосфаткарбоксилазы у бактерий разработаны новые системы олигонуклеотидных праймеров, пригодных для использования в экспериментальных филогенетических исследованиях;
С помощью комплекса методов геносистематики проведена идентификация ряда новых штаммов бактерий, относящихся к различным таксономическим группам, в том числе, возбудителей заболеваний человека и животных, имеющих большое значение для медицинской микробиологии, а также штаммов, перспективных для использования в промышленности и сельском хозяйстве.
Личный вклад соискателя.
В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в формировании тематики и направления конкретных молекулярно-биологических исследований;
в выборе конкретных объектов и планировании экспериментальных подходов по их изучению;
в поиске и разработке необходимых для проведения исследований методологических приемов;
в получении экспериментальных данных с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации;
в проведении компьютерного анализа результатов секвенирования последовательностей различных генов;
в анализе, обсуждении и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад соискателя заключался в непосредственном участии в молекулярно-биологической части исследования – постановке задачи, проведении анализа полученных экспериментальных результатов, их обсуждении и окончательном литературном оформлении.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. На основании использования комплекса молекулярно биологических методов возможно создание системы объективных количественных критериев родства прокариотных микроорганизмов.
2. Порядок Haloanaerobiales может быть использован в систематике бактерий в качестве эталонного таксона.
3. Несоответствие результатов фенотипического и филогенетического анализов может быть обусловлено особенностями эволюции прокариот.
4. Мультикопийность рибосомных генов в геноме одного прокариотного микроорганизма может влиять на результаты «рибосомной» филогенетики.
5. Филогенетический анализ последовательностей структурных генов, детерминирующих процессы метаболизма прокариот, может быть успешно использован в качестве дополнительного подхода к изучению таксономии и эволюции прокариот, уточняющего результаты «рибосомной» филогенетики.
Публикация материалов работы. По теме диссертации опубликовано 173 статьи в реферируемых российских и международных журналах, в том числе, 166 экспериментальных работ и 7 научных обзоров, а также получено авторское свидетельство.
Апробация работы. Материалы работы были доложены на следующих научных мероприятиях:
FEMS Symposium “Evolution of Prokaryotes”, Munich, Germany, 1984;
VII Съезд Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985;
International Conference “Thermophiles’98” Le Quartz -Brest, France, 1998;
IXth International Congress of bacteriology, 1999, Sydney, Australia;
III Internacional Congress “Extremophiles -2000”, Hamburg, Germany 2000;
Halophiles 2001, Sevilla, Spain, 2001;
Конференция «Биотехнологии – 2001». Пущино, Россия, 2001;
Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках». Санкт-Петербург, Россия, 2001;
9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, 2002;
1-я Международная научно-практическая конференция «Биоразнообразие и сохранение генофонда флоры, фауны и народонаселения Центрально-Азиатского региона, Кызыл, Россия, 2002;
1st FEMS Congress of European microbiologist, Ljubljana, Slovenia, 2003;
International Conference Thermophiles 2003. Exeter, UK, 2003;
8th International Symposium on Biogeochemistry of Wetlands. Gent, Belgium, 2003;
Всероссийский симпозиум «Автотрофные микроорганизмы». Москва, Россия, 2005;
1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, 2005;
3-й Московский Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития".
Москва, Россия, 2005;
11th International Symposium on Microbial Ecology (ISME 11), Vienna, Austria, 2006;
11th IWA World Congress jn Anaerobic Digestion, Queensland, Austraila, 2007, 7th International. Symposium for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, 2008.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа в форме научного доклада изложена на страницах и включает общую характеристику работы и экспериментальную часть, состоящую из описания основных результатов в трех частях, заключения и выводов. Работа содержит рисунков и таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Методы исследования.
Объектами исследования служили культуры микроорганизмов, выделенные российскими исследователями и полученные нами из различных учреждений микробиологического профиля, а также пробы, полученные из природных источников.
Выделение ДНК. Для выделения и очистки препаратов суммарной клеточной ДНК, используемых в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации, применяли стандартные методики: для живых культур микроорганизмов по Marmur (1962), для фиксированных спиртом культур по Arrighi et al. (1968). Для выделения препаратов ДНК, используемых в сиквенс-анализе, применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Birnboim & Doly (1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США) (Булыгина и соавт., 2002).
Анализ ДНК. Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре плавления ДНК и рассчитывали по формуле Owen et al. (1969). Молекулярную гибридизацию тотальной ДНК на нитроцеллюлезных мембранных фильтрах проводили по методике Denhardt (1966).
Выбор олигонуклеотидных праймеров и амплификация ДНК. Для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена 16S рРНК в большинстве экспериментов была использована универсальная праймерная система и соответствующие условия реакции (Edwards et al., 1989). Однако для избирательной амплификации генов 16S рРНК архей была использована специально разработанная нами праймерная система [76]. Кроме того, нами были специально разработаны универсальные праймерные системы и соответствующие условия реакции для амплификации структурных генов нитрогеназы (nifH) [65], генов больших субъединиц (cbbL и cbbM) рибулезо бисфосфаткарбоксилазы [101] и генов алкан-монооксигеназы (AlkB) [157].
Поиск нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих соответствующие функции метаболизма прокариот различных таксономических групп, был проведен в международном банке данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Процедуры выравнивания нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW v 1. (Thompson et al., 1994). Построение консенсусной последовательности и поиск в ней консервативных участков осуществляли с помощью специально разработанной компьютерной программы Consens (Марусина А.И., неопубликованные данные).
Для амплификации генов FMO-белка (fmo) использовали ранее разработанные праймерную систему и условия реакции (Alexander et al., 2002).
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Фотографирование полученных данных проводили при помощи системы видеодокументации BioDocII, производство Biometra, Германия.
Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps Promega, США, согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование ДНК. Продукты ПЦР либо клонировали в клетках Escherichia coli с последующим секвенированием, либо сразу использовали для циклического секвенирования. Реакции секвенирования проводили в обоих направлениях с использованием прямых и обратных праймеров. Первоначально секвенирование проводили по методу Sanger et al. (1977) с использованием набора «Silver Sequencing» (Promega, США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Электрофорез проводили на приборах Macrophore, (Pharmacia, Швеция) и SQ3 Sequencer, (Hoefer, США), при толщине полиакриламидного геля 0,19 мм. В последующем секвенирование проводили с помощью автоматического прибора (Applied Biosystems), в этом случае использовали набор DyeDeoxy Terminator cycle sequencing согласно рекомендациям производителя.
Методы филогенетического анализа (построение деревьев). Для предварительного анализа секвенированных последовательностей анализируемых генов использовали данные и программное обеспечение баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и Ribosomal Database Project (RDP) (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование, множественное выравнивание и трансляцию нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью редактора последовательностей BIOEDIT (http://www.jwbrown.mbio.ncsu.edu).
Для построения филогенетических деревьев использовали различные методы:
невзвешенный парно-груповой метод с арифметическим усреднением (UPGMA) (Sokal, Sneath, 1963);
метод максимальной экономии (maximal parsimony) (Felsenstein, 1985), метод максимального правдоподобия (maximum likelihood) (Felsenstein, 1981), метод ближайшего связывания (neighbor-joining) (Saitou & Nei, 1987), метод максимального топологического подобия (Чумаков, Юшманов, 1988). Для построения деревьев использовали пакеты программ GeneBee (Бродский и соавт., 1991), TREECON (Van de Peer & De Watcher, 1994) и PHYLIP (Felsenshtein, 1990). Значимость филогенетических реконструкций оценивали методом бутстрэпа (bootstrap) (Felsenshtein, 1985), обычно с использованием 100 репликаций для анализа последовательностей генов 16S рРНК и 1000 репликаций для анализа последовательностей структурных генов.
Расчет относительных частот использования кодонов (RSCU) для структурных генов и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ CodonW (John Peden, http:
//www.molbiol.ox.ac.uk/cu).
Все вновь полученные последовательности различных генов были депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей (GenBank) c присвоением им индивидуальных номеров доступа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЧАСТЬ I. ФОРМАЛИЗАЦИЯ КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ РОДСТВА БАКТЕРИЙ Молекулярная филогенетика определяет сложившиеся в процессе эволюции родственные взаимоотношения организмов, исходя из сравнения генетических текстов (генотипов) и их физических носителей (ДНК, РНК и белков). Она дает возможность исследователям при решении проблем эволюции и систематики организмов исходить не из гипотетических и в значительной степени субъективных представлений о возможных путях возникновения новых форм, а опираться на строго формализованные критерии, сводящиеся к количеству нуклеотидных замен. Для получения таких объективных (количественных) критериев в арсенале геносистематики существует постоянно расширяемый и совершенствуемый набор косвенных и прямых методов оценки сходства генетического материала организмов. К первым относятся определение нуклеотидного состава ДНК, гибридизационный анализ, а также анализ различных электрофоретических профилей (белковых, рестрикции и амплификации ДНК). Ко вторым непосредственное сравнение расшифрованных (секвенированных) аминокислотных последовательностей белков, а также нуклеотидных последовательностей как отдельных генов (главным образом, рибосомных), так и тотального генома (хромосомной и плазмидной ДНК).
1. Концепция вида у бактерий.
В микробиологии не существует общепринятой концепции биологического вида, аналогичной используемой зоологами и ботаниками. Согласно классическому определению Э.Майра (называемому также нео-Дарвиновским) "виды представляют собой группы скрещивающихся популяций, которые репродуктивно изолированы от других таких групп" или, иными словами, "вид есть защищенный генофонд" (Майр, 1971, с.40). Трудность применения этой концепции в микробиологии связана с тем, что прокариоты и многие эукариотические микроорганизмы не обладают полом в традиционном смысле и критерий репродуктивной изоляции к ним неприменим. Поэтому выделение видов из общей совокупности бактериальных штаммов в традиционной систематике прокариот оказывается в значительной степени субъективным.
Геносистематика предлагает определять вид, исходя из уровня сходства генетического материала сравниваемых микроорганизмов. В настоящее время принято, что штаммы прокариот относятся к одному виду в том случае, когда нуклеотидные последовательности их геномов гибридизуются, по меньшей мере, на 70% (сходство ДНК), а температуры плавления (Tm(e)) гомодуплексов и гетеродуплексов этих штаммов различаются между собой не более чем на 5% (Wayne et al., 1987;
Stackebrandt et al., 2002). Крайнее значение 70%-го сходства выбрано по той причине, что штаммы, родственные на таком уровне и выше, обычно оказываются сходными и фенотипически по тем признакам, которые используются для идентификации на уровне вида. Несмотря на широкое распространение генотипического определения вида в практических таксономических исследованиях, относительно конкретного значения сходства последовательностей ДНК существует мнение, что оно является случайно выбранным и не должно употребляться догматически (Vandamme et al., 1996;
Rosello-Mora, 2006).
Проведенные в данной работе исследования позволяют прояснить вопрос, действительно ли выбор количественного критерия выделения вида является произвольной, субъективной операцией или отражает какие-либо закономерности процесса генетической дивергенции прокариот? Эти исследования опирались на статистический анализ распределения уровней сходства генетического материала, определенных с помощью количественных показателей одного из наиболее распространенных методов геносистематики – молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (тотальных геномов) с использованием собственных [1-31] и литературных данных. На результаты сравнительного статистического анализа может существенно влиять эффект неслучайности выборки объектов, связанный с предварительной сортировкой штаммов согласно номенклатурному принципу сходства с первоначально выбранным объектом – типовым штаммом, обозначенным в соответствии с принципом приоритета. Вовлечение в анализ значительного количества независимых определений, касающихся штаммов из многих родов различных таксономических групп бактерий, а также неидентифицированных штаммов (атипичных по фенотипическим свойствам либо новых, свежевыделенных из природной среды изолятов) позволяло в значительной степени избежать этого эффекта.
Полученный в результате анализа график распределения значений уровня гибридизации был бимодальным, с выраженным минимумом в области средних значений шкалы геномного сходства, т.е. примерно от 50% до 70% гибридизации (рис.1а). Аналогичный график распределения значений другого показателя - Tm(e) или уровня дивергенции последовательностей ДНК, также был бимодальным, с основным минимумом в области примерно от 4% до 8% (рис.1б). Данные статистической обработки полученных распределений свидетельствуют о достоверности существования отрицательного эксцесса в указанных областях (показатели эксцессии составляли -1.38 + 0.2 и -1.27 + 0. 3000 Частота встречаемости Частота встречаемости 300 1500 250 200 150 100 50 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Уровень гибридизации (% ) б Уровень дивергенции (% ) a вид род семейство и выше вид род семейство и выше Рис. 1. Распределение а) уровней гибридизации ДНК-ДНК (анализированы результаты научных публикаций, полученные при исследовании 54 родов бактерий) и б) уровней дивергенции последовательностей ДНК (анализированы результаты 57 научных публикаций, полученные при исследовании 40 родов бактерий). Верхние графики – общее распределение значений, нижние графики – распределение значений с учетом таксономической принадлежности сравниваемых микроорганизмов соответственно, т.е. превышали ошибку репрезентативности более чем в три раза). При этом было показано, что в область значений выше основного минимума по шкале геномного сходства и, соответственно, ниже основного минимума по шкале дивергенции последовательностей попадают, главным образом, пары организмов, относящиеся к одному виду, а в оставшиеся области на графиках – пары из разных видов, родов и т.д. Проведенный статистический анализ свидетельствовал о том, что степени сходства геномов бактерий дискретны на видовом уровне. При этом генотипическая дискретность соответствует наблюдаемой в природе фенотипической дискретности, позволяющей выделять из спектра эволюционирующих бактериальных форм ограниченные группировки – виды. Таким образом, используемое в таксономии бактерий генотипическое определение вида не является субъективным и произвольным, но, опираясь на естественные закономерности эволюционного процесса прокариот, имеет биологический смысл.
В то же время, статистический анализ распределения значений уровней гибридизации ДНК-ДНК свидетельствует о том, что величины конкретных значений критерия вида, предлагаемые его количественным генотипическим определением, действительно являются произвольно выбранными. Об этом можно судить по трансгрессирующему характеру графика распределения, выражающемся в отсутствии области абсолютного разрыва в распределении и существовании только области минимума значений с относительно широкими границами. Таким образом, несмотря на существование эволюционных закономерностей, поддерживающих границы между видами бактерий, точно обозначить эту границу с помощью количественных критериев сходства геномов, по-видимому, невозможно. Поэтому следует признать, что принятые в генотипическом определении конкретные количественные значения сходства геномов, характеризующие пределы дивергенции вида, имеют не эволюционный, а только таксономический номенклатурный смысл, давая таксономистам официальный, общепринятый операционный критерий в практических исследованиях. Применяя этот критерий в каждом конкретном случае, и соответственно, идентифицируя новый организм как представителя уже существующего вида или выделяя его в новый вид, необходимо учитывать не только имеющиеся в распоряжении таксономиста сведения о фенотипических особенностях организма, но и избегать возможных недоразумений (особенно в медицинской микробиологии), обусловленных требованием функциональности предлагаемой классификации.
1.2. Проблема эквивалентности таксонов бактерий Теория вопроса об эквивалентности таксонов в различных филогенетических группах живых организмов и возможностей решения этого вопроса с помощью методов геносистематики, главным образом, применительно к эукариотам, рассматривалась еще в середине 70-х годов (Антонов, 1974). Решение этой проблемы связывалось с созданием системы количественных критериев оценки рангов таксонов живых организмов, основанных на результатах различных методов сравнения их генетического материала.
Применение такого подхода оказалось особенно плодотворным в систематике прокариот. Результаты, полученные с помощью трех основных методов сравнения генетического материала: определения нуклеотидного состава ДНК, ДНК-ДНК гибридизации и анализа последовательностей 16S рРНК позволили количественно оценить степень генетической дивергенции большинства таксонов прокариот различного ранга. Эти результаты свидетельствовали о неэквивалентности многих традиционных таксонов прокариот, поскольку степень варьирования количественных критериев родства для таксонов одного ранга в различных физиологических группах значительно различалась. Следствием этого явилось начало эры кардинального пересмотра традиционной фенотипической систематики прокариот, которая продолжается до сих пор. При этом все сильнее проявлялось желание систематиков значительно упростить и формализовать проведение таксономических операций на основе использования количественных критериев сходства геномов прокариот.
1.2.1. Cопоставление данных ДНК-ДНК гибридизации и сиквенс анализа генов 16S рибосомных РНК на примере порядка Halanaerobiales (эталонного таксона) Вследствие технических особенностей метода ДНК-ДНК гибридизации степень информативности его результатов очень быстро падает по мере уменьшения степени родства организмов. Поэтому использование этих результатов в таксономии бактерий на внутриродовом уровне уже не является общепринятым.
Рибосомные гены более консервативны по сравнению с основной массой генома, поэтому методы их сравнительного анализа информативны на более высоком таксономическом уровне, чем метод гибридизации ДНК-ДНК. Однако высказывались сомнения в правомерности использования результатов сравнительного анализа данного молекулярного объекта для выявления процессов таксонообразования, и, следовательно, проведения с использованием этих результатов таких таксономических операций, как выделение таксонов и определения их ранга (Головлев, 1987, 1998). Кроме того, для большинства филогенетических групп прокариот было выявлено более или менее резко выраженное расхождение между данными генотипического и фенотипического анализов (полифилетичность высших таксонов), которое, как правило, увеличивалось по мере повышения таксономического ранга, что практически не позволяло провести статистический анализ количественных показателей, аналогичный таковому для метода гибридизации ДНК-ДНК.
На практике оказалось возможным получать количественные оценки сходства рибосомных генов для значительной части таксономического спектра, начиная с высших уровней родства – доменов, примерно до уровня видов со средней степенью родства, что соответствует области значений уровней гомологий последовательностей 16S рРНК ниже 97-98% (Stackebrandt, Goebel, 1994;
Stackebrandt, Ebers, 2006). Однако уже многие виды прокариот невозможно различить с помощью этого метода, поскольку они могут иметь практически идентичные последовательности 16S рРНК, но низкий уровень сходства ДНК (до 25%) (Fox et al., 1992;
Stackebrandt, Goebel, 1994).
В данной ситуации правомерно употребление в практических таксономических исследованиях бактерий подхода, использующего результаты изучения таксономии наиболее хорошо изученных (эталонных) таксонов.
Безусловно, выбор конкретных эталонных таксонов для интерпретации количественных результатов сходства геномов различных групп прокариот является весьма субъективным, поскольку систематику ни одного из существующих бактериальных таксонов нельзя признать полностью изученной.
Поскольку наиболее совершенной в настоящее время считается схема классификации семейства Enterobacteriaceae, оно наиболее часто предлагается в качестве эталонного таксона при определении схем взаимоотношений родов внутри других семейств.
На основании суммирования собственных [34-36, 43, 70, обзор 5] и литературных данных нам представляется весьма интересным рассмотрение в качестве эталона для составления классификационных схем прокариот такого таксономического подразделения бактерий как порядок Halanaerobiales (Rainey et al., 1995), объединяющего анаэробных органотрофных бактерий, являющихся обитателями различных суперсоленых экосистем.
В результате анализа генов 16S рРНК было установлено, что галоанаэробы имеют единое происхождение, составляя отдельную филогенетическую ветвь, точка ответвления которой находилась у основания основной филогенетической линии грамположительных бактерий. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК галоанаэробов с другими представителями линии грамположительных бактерий составлял всего лишь 75-80%. Следствием этих исследований и явилось создание нового порядка Halanaerobiales, в результате чего сложилась довольно редкая в бактериальной систематике ситуация, когда при описании таксона столь высокого ранга совпали данные фенотипического и генотипического анализов.
Для построения филогенетических схем и соответственно исследования таксономической структуры порядка Halanaerobiales использовали два основных метода сравнения нуклеотидных последовательностей - тотального генома (молекулярная гибридизация ДНК-ДНК) и генов 16S рибосомной РНК.
Сравнительный анализ филогенетических схем, основанных на данных ДНК ДНК гибридизации и анализа генов 16S рРНК (рис. 2) показал отсутствие принципиальных различий между ними. Принципиальная корреляция между а б Рис. 2. Дендрограммы родственных взаимоотношений представителей порядка Halanaerobiales, основанные на (а) данных ДНК-ДНК гибридизации (шкала показывает % гибридизации ДНК-ДНК) и (б) на данных анализа генов 16S рРНК (для построения деревьев использован UPGMA алгоритм, масштаб соответствует 10 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap” анализа 100 альтернативных деревьев;
значения менее 95% не указаны).
обоими типами схем демонстрировалась неоднократно и при изучении других таксономических групп бактерий. Основные отличия схем были связаны с несовпадением областей информативности обоих методов. При этом обе схемы продемонстрировали значительное филогенетическое разнообразие галоанаэробов, соответствующее их функциональному разнообразию. Данные филогенетического анализа о родственных взаимоотношениях галоанаэробов в основном совпадали с таксономической структурой порядка Halanaerobiales, определенной с помощью фенотипического анализа.
«Рибосомная» филогенетическая схема свидетельствовала о том, что внутри порядка Haloanaerobiales существует два четко различимых кластера (рис.2б). Первый из них включал роды Halanaerobium, Halothermotrix и Halocella, второй - Halobacteroides, Halanaerobacter, Acetohalobium, Sporohalobacter, Orenia и Natroniella. Эти филогенетические кластеры соответствуют таксономическому разделению порядка Halanaerobiales на два семейства, соответственно, Halanarobiaceae и Halobacteroidaceae, основным фенотипическим различием которых является способность к спорообразованию (рис. 2б).
На внутриродовом уровне значительно повышается степень соответствия между данными определения сходства ДНК и сходства генов 16S рРНК. Это можно продемонстрировать на примере самого многочисленного таксона галоанаэробов – типового для семейства Halanaerobiaceae рода Halanaerobium, объединяющего 8 видов, для которых схемы взаимоотношений, основанных на результатах обоих методов, в значительной степени коррелируют (рис. 2а и рис. 2б).
Определение таксономической структуры описанных в настоящее представителей порядка Halanaerobiales дает возможность представить количественные генотипические характеристики, позволяющие устанавливать ранги таксонов в этой группе бактерий (Таблица 1).
Таблица 1. Количественные характеристики таксонов различного ранга внутри порядка Halanaerobiales.
Таксономический уровень Уровень сходства последовательностей (%) Тотальной ДНК Генов 16S рРНК Между семействами Менее 10 79 – Между родами одного семейства 5 – 27 83 – Между видами одного рода 8 – 67 91 - Между штаммами одного вида 71 – 98 99 – Используя порядок Halanaerobiales в качестве эталонного таксона, эти характеристики предлагается применять для определения рангов таксонов и в других группах бактерий.
1.2.2. Корреляция между результатами фенотипического и генотипического определения рангов таксонов бактерий Фенотипическая систематика основана на постулате, что сходство организмов отражает их родственные взаимоотношения, поэтому, чем теснее родство, тем выше степень сходства. Логично предположить, что результаты генотипической систематики, методы которой позволяют непосредственно оценивать сходство генетического материала, а, следовательно, родства организмов, должны, в значительной степени, соответствовать традиционным представлением, основанным на анализе сходства организмов.
Однако в систематике прокариот это оказалось относительно верным лишь на низшем таксономическом уровне (внутри- и межвидовом), поскольку результаты многочисленных экспериментальных исследований с применением различных методов геносистематики свидетельствовали о том, что около 90% традиционно классифицируемых родов прокариот имеют единое происхождение, и в этом смысле являются естественными. Естественность же традиционных таксонов более высокого ранга была подтверждена только в единичных случаях.
В то же время, уже на низших таксономических уровнях, начиная с видового, существуют примеры несоответствия данных фенотипического и генотипического анализов, используемых для проведения таксономических операций. Это обстоятельство привело к довольно широкому использованию в практике таксономических исследований терминов «номенвид» (nomenspecies номенклатурный вид) и «геновид» (genospecies) – понимаемый как группа родственных штаммов, по данным генотипических методов (главным образом, ДНК-ДНК гибридизации) имеющих высокую степень сходства геномов. С введением генотипического количественного определения вида эту степень сходства стали определять как 70%-й уровень гибридизуемости ДНК.
К первой серии конфликтных ситуаций, имеющих большое практическое значение, относятся исследования, согласно результатам которых, в отдельных группах бактерий (главным образом, патогенных для человека и животных, и, следовательно, детально изученных) хорошо дифференцируемые с помощью фенотипических диагностических тестов номенвиды согласно результатам метода ДНК-ДНК гибридизации оказались единым геновидом.
Такая ситуация сложилась, например, для номенвидов родов Brucella (Verger et al., 1985);
Bordetella (Kloos et al., 1981);
Treponema (Miao, Fieldsteel, 1980);
Mycobacterium (Baess, 1979) и Yersinia (Bercovier et al., 1980). Результаты аналогичного собственного исследования [18] представителей последнего рода представлены в таблице 2.
Таблица 2. Уровень ДНК-ДНК гибридизации видов рода Yersinia, вызывающих различные заболевания человека.
Исследуемые штаммы Уровень гибридизации с Y. pestis EV (вакцинный штамм) (%) 92- Y. pseudotuberculosis (10 эталонных вирулентных штаммов) 87- Y. pseudotuberculosis (15 вновь выделенных штаммов различной вирулентности) Y. enterocolityca (3 эталонных вирулентных штамма) В отдельных случаях подобные противоречия снимались посредством изменения классификации, т.е. описанием нового объединенного вида с составлением его уточненного фенотипического диагноза, из которого исключались не имеющие таксономического значения дифференциальные признаки. Однако в большинстве случаев вступает в действие требование приоритета фенотипических данных над генотипическим критерием выделения вида во избежание нарушения функциональности существующей классификации и возможной путаницы в номенклатуре столь важных (как в случае с возбудителями чумы) в медицинском отношении видов. Такой подход может быть оправдан и с эволюционной точки зрения, поскольку вполне вероятно быстрое видообразование при адаптации к принципиально новой экологической нише при незначительном уровне дивергенции геномов, обнаруживаемом с помощью приближенного метода ДНК-ДНК гибридизации.
Вторая довольно обширная серия несовпадения данных фенотипического и генотипического анализов объединяет альтернативные случаи, в которых обнаруживалась значительная генотипическая гетерогенность таксонов, которые в феносистематике признавались гомогенными. Обнаружение таких случаев уже на уровне вида на основании данных ДНК-ДНК гибридизации выражалось в существовании внутри номенвида групп с уровнем гибридизуемости, соответствующим количественному генотипическому определению вида. Такие группы в различных исследованиях обозначались как геномные группы, геномные виды, геномовиды, геновиды или геномовары (Ursing et al., 1995). Существование геномоваров внутри многих видов бактерий различных таксономических групп показано как с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации, так и других методов геносистематики. Исследования такого рода могут быть весьма значимыми для изучения микроэволюционных (происходящих на уровне вида) процессов в бактериальном мире.
К подобным исследованиям относится проведенное нами изучение генотипической гетерогенности вида Acidithiobacillus ferrooxidans [86]. В результате применения полифазного генотипического анализа штаммов вида Acidithiobacillus ferrooxidans различного происхождения (выделенных из различных типов руд и концентратов многих районов мира), с использованием методов пульс-электрофореза хромосомной ДНК, ДНК-ДНК гибридизации и сиквенс-анализа генов 16S рРНК было обнаружено их значительное генетическое разнообразие. Профили рестрикции хромосомной ДНК, полученные с помощью пульс-электрофореза, были строго индивидуальными для каждого штамма, но при этом не позволяли получить адекватных оценок геномного сходства изучаемых штаммов. По уровню гибридизации ДНК-ДНК изученные штаммы разделились на 4 геномовара и 6 значительно дивергировавших штаммов, не вошедших в геномовары (рис 3а). Для штаммов (включая типовой вида A. ferrooxidans), представляющих каждый из обнаруженных геномоваров и отдельных ветвей, были определены почти полные последовательности генов 16S рРНК. Эти последовательности были использованы в сравнительном анализе, включающем аналогичные последовательности всех представителей рода Acidithiobacillus, доступные из базы данных GenBank. В результате проведенного анализа было установлено (рис.3б), что большинство изученных штаммов A. ferrooxidans составляют монофилетический кластер с максимальным уровнем поддержки бутстрэпом (100). К этому же кластеру относился кластер штаммов (включая типовой) другого вида данного рода - A. thiooxidans, что свидетельствовало об общности их происхождения и близком родстве. В то же время, согласно анализу генов 16S рРНК штаммы A. ferrooxidans разделились на 4 филогенетические группы, эквидистантные аналогичной группе, образованной штаммами A. thiooxidans.
Распределение штаммов по филогенетическим группам в общем коррелировало с разделением на геномовары, однако, в одном случае представители двух различных геномоваров вошли в одну филогенетическую группу. Таким образом, была обнаружена значительная, составляющая несколько уровней, филогенетическая гетерогенность штаммов A. ferrooxidans, не проявляющаяся на уровне фенотипа.
При изучении A. ferrooxidans, как и при изучении других генотипически гетерогенных видов, возникает вопрос, является ли это разнообразие штаммов проявлением внутривидовой изменчивости, т.е. результатом микроэволюционных процессов, либо вид A. ferrooxidans представляет собой совокупность нескольких видов? На данном этапе исследований нельзя дать однозначного ответа. Если считать изученные изоляты представителями вида A.
ferrooxidans, то придется признать, что этот вид включает в себя несколько уровней внутривидовых образований, имеющих сходные фенотипы, но различающиеся по уровням сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и тотального генома. В таком случае, несоответствие этого и аналогичного номенвидов бактерий стандартному количественному определению вида является отражением действующих в этих случаях микроэволюционных закономерностей и, следовательно, обнаруживаемое при этом несоответствие данных фенотипического и генотипического анализов не является артефактом, а имеет биологический смысл. Существование генетически гетерогенных, содержащих фенотипически неразличимые геномовары видов бактерий можно предположительно объяснить особенностями процесса видообразования в случаях эволюционно длительного существования их представителей в специфической экологической нише. В таких случаях, нейтральные изменения в нуклеотидных последовательностях, обнаруживаемые с помощью методов геносистематики, не сопровождаются аналогичными изменениями на уровне фенотипа.
С другой стороны, в результате адаптации к изменению условий обитания в экологической нише или освоения новой экологической ниши (для отдельных геномоваров) могут начать накапливаться фенотипические различия, достаточно заметные для присвоения геномовару статуса отдельного вида.
Следовательно, не исключено таксономическое разделение (и уменьшение вследствие этого степени несоответствия данных) гетерогенных видов и придание геномоварам статуса самостоятельных видов, что обычно и происходит по мере обнаружения дифференциальных фенотипических различий между ними. Это может произойти и для некоторых геномоваров и/или филогенетических групп A. ferrooxidans в случае заметного изменения их фенотипических характеристик, аналогично ситуации с видом A. thiooxidans.
Такое изменение статуса геномоваров было произведено, например, в наших более ранних исследованиях, касающихся изучения генетической гетерогенности вида Kurthia zopfii [13]. Внутри данного вида было обнаружено 3 геномовара (уровень ДНК-ДНК гибридизации внутри геномоваров был 60 100%, между геномоварами – 17-42%). В результате только за одним из них (содержащим типовой штамм вида) было оставлено название K. zopfii. Два других были выделены в качестве самостоятельных видов K. gibsonii и K.
sibirica вследствие применения нетрадиционных диагностических тестов, в частности, данных хемосистематики и выявления в результате этого дифференциальных фенотипических признаков для каждого из геномоваров.
Как уже указывалось, в большинстве случаев (до 90%) на родовом уровне Рис. 3. Дендрограммы родственных взаимоотношений штаммов вида A. ferrooxidans основанные на данных а) ДНК-ДНК гибридизации (дерево построено с помощью UPGMA алгоритма, шкала соответсвует уровням геномного сходства) и б) сиквенс-анализа генов 16S рРНК (дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 85).
наблюдается корреляция между данными генотипического и фенотипического анализов. Однако и на этом уровне в экспериментальных исследованиях были обнаружены несоответствия, аналогичные описанным выше для видового уровня. Классическим примером служит ситуация с бактериями родов Escherichia и Shigella, уровень сходства геномов которых соответствует внутривидовому, но номенклатура не изменена по соображениям, аналогичным приведенным для иерсиний. В наших исследованиях случай значительных фенотипических различий при высоком уровне геномного сходства был обнаружен при таксономическом анализе двух штаммов сульфатобразующих бактерий из содовых озер. Один из них, штамм ALG 1, оказался представителем эритробактерий – облигатно аэробных бактерий, синтезирующих бактериохлорофилл a, а другой, штамм AHO 1, – факультативно-автотрофной водород-использующей бактерией.
Филогенетический анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показал принадлежность обоих штаммов к одному подразделению альфа-протеобактерий. Неожиданно оказалось, что оба штамма образуют единый монофилетический кластер с высоким уровнем гомологии последовательностей – 96.5%, занимающий промежуточное положение между родами Rhodobacter и Rhodovulum (рис.4а).
Этот результат затруднил определение таксономического статуса обоих штаммов. С одной стороны – высокий уровень генотипического родства (соответствующий межвидовому, как для других представителей данного подразделения, так и для эталонного порядка Halanaerobiales), а с другой – значительные фенотипические различия, поскольку такие свойства, как водородзависимая автотрофия и наличие бактериохлорофилла, традиционно являются дескрипторами родового уровня, формально не позволяющие отнести данные штаммы к одному роду. Поскольку штамм ALG 1 был описан первым, по совокупности фенотипических и генотипических свойств он был выделен в новый род и вид Roseinatronbacter thiooxidans [46]. Штамм AHO 1, хотя и близкородственный генотипически к R. thiooxidans, вряд ли может быть отнесен к тому же роду согласно требованию приоритета фенотипических данных, позволяющему сохранить функциональность классификации, поэтому его таксономический статус так и остался неопределенным [56]. Объяснением этому и другим подобным случаям (в том числе, и на видовом уровне) могут быть действительно существующие эволюционные закономерности:
ускоренное приобретение представителями близкородственных таксонов новых фенотипических свойств, при сохранении стандартных темпов накопления нейтральных замен в нуклеотидных последовательностях.
Противоположная ситуация наблюдается для таких родов, как Clostridium и Bacillus. Выделение этих родов и определение их таксономического статуса во многом было основано на морфологических (таких, как спорообразование) и физиолого-биохимических (таких, как отношение к кислороду) признаках.
Между тем, такие характеристики могут иметь неопределенное таксономическое значение или быть весьма консервативными на фенотипическом уровне [обзор 4] при значительной дивергенции как детерминирующих их молекулярных структур, так и всего генома.
Неудивительно, что в результате применения различных методов геносистематики была обнаружена более значительная степень генетической дивергенции этих родов по сравнению с большинством других родов бактерий.
Первоначально, на основании применения метода каталогов олигонуклеотидов 16S рРНК было предложено признать обнаруженную неэквивалентность этих и большинства других бактериальных родов как свидетельство их различного эволюционного возраста (Stackebrandt, 1988). Однако впоследствии оказалось, что согласно сиквенс-анализу генов 16S рРНК оба этих рода разделились на некоторое количество филогенетических кластеров, причем уровень гомологий последовательностей между представителями каждого из кластеров был относительно невысоким, соответствующим межродовому уровню для других филогенетических групп бактерий (Ash et al., 1991;
Collins et al., 1994). При тщательном анализе фенотипических характеристик представителей обнаруженных кластеров в некоторых случаях удавалось создать комплекс дифференциальных тестов, позволяющих описать тот или иной кластер как самостоятельный род. В качестве примера подобного исследования можно привести проведенное нами изучение таксономии рода Geobacillus [71].
Согласно анализу последовательностей генов 16S рРНК многие термофильные бациллы оказались объединенными в филогенетический кластер 5 (Ash et al., 1991). Кроме близкородственных (уровень гомологий 98.5-99.2%) термофильных бацилл к этому же кластеру, но на более низком уровне родства, относились вид B. thermoglucosidasius и термофильный аспорогенный вид Saccharococcus thermophilus. При исследовании различных высокотемпературных экосистем был выделен ряд новых штаммов термофильных бацилл, которые согласно предварительным фенотипическим исследованиям были близки к видам кластера 5. В результате сравнительного генотипического анализа, включающего определение уровня сходства тотальных ДНК и последовательностей генов 16S рРНК (рис 4б), были описаны несколько новых видов бацилл, принадлежащих к кластеру 5. На основании всего комплекса данных было предложено изменить таксономию рода Bacillus, выделив из него виды (включая вновь описанные) филогенетического кластера 5 в состав нового рода Geobacillus.
Таким образом, и на родовом уровне возможно уменьшение степени несоответствия данных фенотипического и генотипического анализов а б Рис. 4. Альтернативные случаи несоответствия данных фенотипического и генотипического (на основании сиквенса генов 16S рРНК) анализов на родовом уровне. а) Филогенетическое положение алкалофильных сульфат-образующих гетеротрофов Roseinatronobacter thiooxidans ALG 1 и факультативно автотрофного штамма AHO 1 в системе альфа- Proteobacteria и б) Филогенетическая дивергенция рода Bacillus и пересмотр его классификации на примере выделения нового рода Geobacillus (деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 85).
посредством изменения классификации.
В то же время, поскольку различия в степени генетической дивергенции таксонов одного ранга в различных филогенетических линиях, могут быть обусловлены закономерностями эволюции бактерий, систему количественных критериев оценки родства бактерий не следует рассматривать как жестко заданные рамки, ограничивающие таксон. Поэтому применять эту систему для определения рангов таксонов в практических таксономических исследованиях конкретных групп бактерий необходимо только в комплексе с результатами фенотипического анализа, добиваясь маскимального соответствия данных.
ЧАСТЬ 2. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО «РИБОСОМНОЙ» ФИЛОГЕНЕТИКЕ Наиболее дискуссионным в молекулярной филогенетике остается вопрос, насколько адекватно эволюция структур исследуемых макромолекул отражает эволюцию организмов. Выбор конкретного вида биополимера, на анализе структуры которого будут основаны построения эволюционных схем, является критическим моментом филогенетических исследований. Безусловно, что наиболее полную информацию о филогенезе организмов можно получить при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей всего генома, особенно в том смысле, что на этом уровне суммируются и усредняются скорости всех моногенных "молекулярных часов". Такими исследованиями занимается быстро развивающаяся новая наука геномика. Однако поскольку эти исследования технически слишком сложны и трудоемки, в настоящее время в молекулярной филогенетике преимущественно используются методы сравнительного анализа отдельных генов и/или их генопродуктов (моногенные).
Для определения родственных взаимоотношений живых организмов, а в особенности прокариот, наиболее широко распространено использование сравнительного анализа рибосомных генов, кратко называемое «рибосомной» филогенетикой. Основополагающей идеологией «рибосомной» филогенетики является признание рибосомных генов в качестве идеального молекулярного хронометра для реконструкции эволюционной истории и построения «универсального дерева» живых организмов (Woese, 1987;
1998). Выбору рибосомных генов в качестве молекулярных хронометров способствовал и тот факт, что для них давление естественного отбора осуществляется не на белок, ими кодируемый, а непосредственно на первичную структуру самого гена, поскольку его конечным продуктом является РНК-копия. Кроме того, преимущественное использование рибосомных генов в качестве филогенетических маркеров обусловлено их универсальностью, высокой степенью консервативности первичной структуры, функциональной стабильностью, сравнительной легкостью определения их последовательностей (секвенирования) и, наконец, особенностями первичной и вторичной структур, связанными с присутствием в их нуклеотидных последовательностях участков с различной степенью вариабельности.
«Рибосомная» филогенетика предоставила микробиологам чрезвычайно удобный экспериментальный подход – возможность с помощью единой, универсальной методики определять филогенетическое положение любого микроорганизма. Уже расшифровано несколько сотен тысяч последовательностей преимущественного филогенетического маркера рибосомных генов малой субъединицы рибосомы 16S рРНК прокариот, на основании чего созданы постоянно пополняющиеся международные банки данных, доступные через мировую сеть Интернета каждому исследователю.
Неудивительно поэтому, что сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК уже настолько широко используется для идентификации и классификации прокариот, что стал в настоящее время своего рода «скелетом» систематики прокариот и обязательной стадией в конкретных таксономических исследованиях по описанию новых таксонов.
2.1. Использование результатов «рибосомной» филогенетики для описания новых таксонов прокариот Филогенетический анализ, использующий сравнение последовательностей генов 16S рРНК, являясь в настоящее время обязательной частью описания новых таксонов прокариот, в каждом конкретном случае имеет свои индивидуальные особенности. При этом общими для всех исследований этапами процесса является определение положения нового микроорганизма (или группы близкородственных микроорганизмов) на филогенетическом дереве прокариот, а также определение уровня генетической дистанции между новым организмом и представителями известных таксонов с применением количественных критериев оценки степени родства. В качестве дополнительных этапов анализа, подтверждающих монофилетичность и естественность предполагаемых новых таксонов (что для таксонов ранга семейства и выше становится обязательным), проводится определение особенностей вторичной структуры и поиск специфических (сигнатурных) позиций в последовательностях генов 16S рРНК.
Результаты проведенных в данной работе исследований [35-37, 39-40, 43, 46, 49-51, 53-55, 57, 59-61, 63, 68-73, 75, 80-84, 88-90, 92-93, 95-99, 102, 104, 106, 109-111, 113-114, 117-119, 122-124, 130-132-133, 135, 137-140, 142-143, 146, 148, 150-151, 153-156, 158-165] по применению результатов филогенетического анализа генов 16S рРНК для описания новых таксонов прокариот суммированы в таблице 3.
Таблица 3. Новые таксоны, описанные при участии автора с использованием филогенетического анализа генов 16S рРНК.
Филогенетическо Описание новых таксонов е подразделение Порядок (3), Вид (96) Cемейство (5) Род (35) Альфа- Roseinatronobacter R. thiooxidans,R. monicus протеобактерии Methylopila Mp. capsulata, Mp. helvetica Methylarcula M. marina, M. terricola Albibacter А. methylovorans Thelmatospirillum T. siberiense Thioclava T. pacifica Citreicella C. thiooxidans Methylobacterium suomiense,M.
lusitanum, M. dichloromethanicum Paracoccus kondratievae Roseococcus subuntuyensis Бета- Methylobacillus pratensis протеобактерии Spirillum winogradskii, Spirillum kriegii Гамма- Thioalkalimicrobium Tm. aerophilum, Tm. sibericum, Tm.
протеобактерии Thioalkalivibrio cyclicum Tv. versutus, Tv. nitratis, Tv. paradoxus, Tv. denitrificancs,, Tv. thiocyanoxidans, Tv. jannaschii, Tv. nitratireducens, Tv.
Thioalkalispira hiocyanodenitrificans Ectothiorhodosinus Т. microaerophila Halospina E. mongolicum H. denitrificans Halovibrio denitrificans Thioalkalibacter Thiomicrospira halophila Thiohalospira T. halophilus, T. halophila Thiohalorhabdus Ths. alkaliphila Thr. denitrificans Ectothiorhodospira variabilis Дельта- Desulfovermiculus D. halophilus протеобактерии Geoalkalibacter G. ferrigidriticum Desulfonatronospira D. thiodismutans, D. delicata Desulfacinum subterraneum Desulfurivibrio alkaliphilus Грамположитель Haloanaerobiales, ные бактерии Halanaerobiaceae (клостридиальна Halobacteroidaceae я линия) Halonatronum H. saccharophilum Orenia O. sivashensis Halobacteroides elegans Geobacillus G. subterraneus, G. uzenensis, G.
uralicus, G. gargensis, G. jurassicus Thermovenabulum T. ferriorganovorum Carboxydobrachium C. pacificum С. thermautotrophica, C.
Carboxydocella sporoproducens Anoxynatronum A. sibiricum Tepidibacter T. thalassicus Anaerobranca A. californiensis Alkalibacter A. saccharofermentans Thermincola T. carboxydiphila, T. ferriacetica Tepidimicrobium Tp. ferriphilum Natronobacillus N. azotifigens Thermoanaerobacter siderophilus Thermanaerovibrio velox Desulfotomaculum alkaliphila Heliobacterium sulfidophilum, H.
undosum Heliorestis baculata Amphibacillus fermentum, A. tropicus Bacillus edaphicus, B. mucilaginosus, B.
alkalidiazotrophicus, B. alkalinitrilicus Sulfobacillus sibiricus, S. thermotolerans Alicyclobacillus tolerans Desulfotomaculum salinum Clostridium alkalicellum Thermoanaerobacterium acidotolerans Bacillus alkalidiazotrophicus Clostridium tepidiprofundi Caldicellulosiruptor kronotskyensis, C.
hydrothermalis Carboxydothermus siderophilus Ammonifex thiophilus Грамположитель Nitriliruptorales ные бактерии Nitriliruptoraceae (актиномицетная Nitriliruptor Nitriliruptor alkaliphilus линия) Oscillochloridaceae Зеленые несерные бактерии Зеленые серные Chlorobaculum macestae бактерии Новая Caldithrix C. abyssi филогенетическа я линия бактерий Кренархеи Acidilobales Acidilobaceae Acidilobus А. aceticus, A. saccharovorans Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus fermentans Эвриархеи Methanosarcina lacustris В качестве примера исследований данного раздела можно привести описание новых порядков в доменах бактерий и архей.
2.1.1. Описание нового порядка Nitriliruptorales в актиномицетной линии грамположительных бактерий Из содовых озер была получена стабильная культура бинарного прокариотного консорциума, способного разрушать изобутиронитрил, токсическое органическое соединение, с трудом поддающееся биодеградации.
Хотя доминантным компонентом в этом консорциуме оказался спирилловидный морфотип (идентифицированный впоследствии как представитель относящегося к гамма-протеобактериям рода Marinospirillum), главную роль в разрушении изобутиронитрила играл другой морфотип:
короткие грамположительные неподвижные палочки, выделенные впоследствии в чистую культуру.
Филогенетический анализ, основанный на сравнении генов 16S рРНК [165], позволил поместить использующий нитрилы микроорганизм в класс Actinobacteria в качестве новой независимой линии (рис.5). При этом он формировал единый независимый кластер с несколькими некультивируемыми актинобактериями, найденными в различных природных экосистемах, включая содовые озера. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК внутри этого кластера варьировал от 93.1% до 95.9%. Отметим, что к некоторым группам актинобактерий, таким как родококки, Arthrobacter, Nocardia и Gordonia относятся многие высокоактивные нитрил-гидролизующие штаммы, включая используемые в промышленности. Однако у представителей известных таксонов актинобактерий не было обнаружено последовательностей генов 16S рРНК, сходных с последовательностью нового штамма более чем на 85%. Кроме того, в последовательностях генов 16S нового штамма и близких к Рис. 5. Филогенетическое дерево актинобактерий, основанное на сиквенс-анализе генов 16S рРНК с положением на нем нового микроорганизма (дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 70).
нему клонов были обнаружены сигнатурные позиции, специфически отличающие их от других представителей класса Actinobacteria. В настоящее время класс Actinobacteria состоит из 6 порядков, самым многочисленным и разнообразным из которых является порядок Actinomycetales. Новый организм, являясь по морфологии типичной актинобактерией, филогенетически, по видимому, является потомком примитивных (предковых) актинобактерий, составляя среди современных представителей этого класса независимую линию происхождения.
Таким образом, вновь выделенный штамм может быть признан в качестве первого галоалкалофильного разрушающего нитрилы микроорганизма, составляющего новую линию внутри класса Actinobacteria. Основываясь на уникальных фенотипических особенностях этого организма и его необычном филогенетическом положении на дереве актинобактерий, было предложено описать его как новый род и вид Nitriliruptor alkaliphilus, являющийся типовым для нового семейства Nitriliruptoraceae и нового порядка Nitriliruptorales внутри класса Actinobacteria.
2.1.2. Описание нового порядка Acidilobales в линии кренархей Из кислых термальных озер Камчатки были выделены несколько новых штаммов анаэробных гипертермофильных органотрофных архей, два из которых были описаны в качестве типовых для новых видов нового рода Acidolobus aceticus и A. saccharovorans [59, 105, 166]. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК показал (рис. 6), что новые изоляты составляют единый кластер (с уровнем сходства около 98%) внутри линии Crenarchaeota домена Archaea. Этот кластер был филогенетически связан с другим кластером, объединяющим органотрофых, экстермально термофильных архей рода Caldisphaera. К обоим кластерам, кроме выделенных в чистую культуру штаммов, относились также некультивируемые клоны кренархей (с уровнем сходства 93-97%), представленные в кислых горячих озерах различных географических зон. В последовательностях генов 16S рРНК штаммов и клонов, составляющих оба кластера, были обнаружены специфические сигнатурные позиции, которые отличали как представителей каждого из кластеров, так и их обоих от остальных кренархей (Таблица 4).
Принимая во внимание обособленное положение группы Acidilobus – Caldisphaera на филогенетическом дереве, присутствие общих специфических сигнатурных нуклеотидов в последовательностях генов 16S рРНК, общих фенотипических характеристик, отличающих эту группу от видов порядка Desulfurococcales и других Crenarchaeota, а также их широкое распространение в природных экосистемах было предложено объединить их в новый порядок Acidilobales. Однако, учитывая разделение на два кластера внутри общей группы, существование специфических для каждого кластера сигнатурных Таблица 4. Специфические сигнатурные позиции, отличающие Acidilobus и Caldisphaera от других Crenarchaeota и друг от друга.
Сигнатурные Соответствующие нуклеотиды позиции* Acidilobus Caldisphaera Desulfurococcales, Crenarahaeota Thermoproteales, Sulfolobales 62 U C U U 321:332 C:G C:G A:G A:G 678 C U U U 1056 U C U U 1310-1327 G:C A:U A:U A:U 1335 C C G A,C,G 1393 U U C C * - Нумерация по E.coli Сигнатуры определены по выравниванию 623 последовательностей кренархей и составляют не менее 97% соответствующих нуклеотидов на позиции.
позиций, а также различный интервал оптимальных для роста температур, было предложено описать в новом порядке два семейства: Acidilobaceae, представляющее гипертермофилов рода Acidilobus и близких к ним некультивируемых архей, и Caldisphaeraceae, представляющее экстремальных термофилов рода Caldisphaera, а также близких к ним некультивируемых архей.
2.2. Использование «рибосомной» филогенетики в экологических исследованиях В современной биологии происходит постепенный поворот от преимущественного изучения отдельных организмов к изучению организмов в сообществах, всевозможных связей между членами сообщества и взаимодействия сообщества с окружающей средой. В микробиологии это выражается в значительном увеличении количества исследований биоразнообразия прокариот в различных природных местах обитания, особенно характеризующихся экстремальными условиями. В современных экологических исследованиях сохранился как традиционный подход к изучению микробных сообществ, который был основан на классическом микробиологическом принципе, требующем обязательного выделения и культивирования на специальных питательных средах в лабораторных условиях чистой культуры микроорганизмов, так и принципиально новый подход, называемый молекулярной экологией и не требующий выделения микроорганизмов в чистую культуру. Для обоих подходов преимущественным инструментом является «рибосомная» филогенетика.
Рис. 6. Филогенетическое дерево кренархей, основанное на сиквенс-анализе генов 16S рРНК с положением на нем новых микроорганизмов (дерево построено с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа 100 альтернативных деревьев, значащими признаются значения больше 70).
2.2.1. Филогенетический скрининг микробных изолятов различного происхождения В результате упрощения и ускорения техники сиквенса нуклеиновых кислот и вследствие накопления значительного массива общедоступных данных по структуре последовательностей генов 16S рРНК произошло изменение в методологии традиционного подхода. Это изменение заключается в том, что в настоящее время предварительное исследование выделенных из природных мест обитания чистых культур микроорганизмов различных функциональных групп, производят с помощью сиквенса и анализа генов их 16S рибосомной РНК (Jones, 1998). Такой предварительный филогенетический скрининг позволяет определить направление дальнейших трудоемких микробиологических исследований. Результаты филогенетического скрининга могут варьировать от точной видовой идентификации всех изолятов до обнаружения уникального положения каждого изолята на филогенетическом дереве, что впоследствии может привести к описанию их в качестве первых представителей новых таксонов, как демонстрируется на представленных примерах.
2.2.1.1. Филогенетическое разнообразие органотрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацин Из пластовых вод изучаемого месторождения было выделено более чистых культур аэробных сапротрофных бактерий и на основании сравнения последовательностей 16S рРНК проведен их филогенетический анализ [85].
Согласно результатам этого анализа (рис.7а), оказалось, что культивируемое в аэробных условиях сообщество преимущественно включает представителей двух ветвей линии грамположительных бактерий. Грамположительные изоляты относились к родам Bacillus, Brevibacillus, Rhodococcus, Dietzia, Kocuria, Gordonia, Cellulomonas и Clavibacter. Таким образом, проведенный филогенетический скрининг выделенных штаммов позволил идентифицировать различных коринеформных бактерий (Rhodococcus ruber, Dietzia maris, Kocuria rosea), широко распространенных и в других нефтяных месторождениях, а также бактерий, которых ранее в нефтяных пластах не обнаруживали – Clavibacter michiganansis и Gordonia aichiensis. Это позволило расширить представление о метаболических возможностях и биоразнообразии аэробных микроорганизмов в изучаемой экосистеме.
2.2.1.2. Алкалофильные сахаролитические бактерии Была изучена группа из 13 штаммов сахаролитических алкалофильных облигатно- и факультативно анаэробных бактерий, выделенных из содовых озер Нижнее Белое (Юго-восточное Забайкалье) и Магади (Кения). Согласно анализу генов 16S рибосомной РНК [45] все алкалофилы изучаемой группы б а Рис. 7. Филогенетический скрининг бактериальных изолятов различного происхождения на основе сиквенс анализа генов 16S рРНК а) аэробных грамположительных органотрофов из пластовых вод нефтяного месторождения Дацин (КНР);
б) сахаролитических алкалофильных анаэробных бактерий, выделенных из содовых озер (деревья построены с помощью neighbor-joining алгоритма, масштаб соответствует нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов).
относились к филогенетическому подразделению грамположительных бактерий с низким содержанием ГЦ-пар в ДНК. Вместе с тем, внутри этого подразделения изучаемая группа оказалась филогенетически неоднородной и разделилась на 5 подгрупп, относящихся к различным ветвям грамположительных бактерий (рис. 7б). Организмы первой и второй подгрупп (облигатные анаэробы) оказались близки представителям различных кластеров гетерогенного рода Clostridium (Collins et al., 1994);
третьей и четвертой (факультативные анаэробы) – к представителям подгруппы Bacillus panthotenicus группы 1 филогенетического спектра бацилл (Ash et al., 1991), а пятой (факультативный анаэроб) – к представителям порядка Halanaerobiales (Rainey et al., 1995). Все исследуемые алкалофильные бактерии впоследствии были описаны как новые таксоны. Следует отметить также, что исследованные нами новые организмы не были близки ни к одной из ранее обнаруженных в содовых озерах групп алкалофильных организмов. Таким образом, проведенные нами исследования подтвердили мнение о функциональном и филогенетическом многообразии алкалофильных прокариот, обитающих в содовых озерах. Тот факт, что все изученные алкалофилы, оказались новыми формами микроорганизмов свидетельствует о том, что изучение этого многообразия еще только начинается.
2.2.2. Использование результатов «рибосомной» филогенетики в молекулярной экологии прокариот Принципиальным отличием методов молекулярной экологии является их способность непосредственно изучать генотипическое разнообразие всех представителей определенного природного сообщества без выделения членов сообщества в чистую культуру (Pace, 1996;
Amann, 2000). К настоящему времени в чиcтую культуру выделено и описано около 8000 видов прокариот.
Между тем эксперименты последних лет в области микробной экологии привели к двум взаимосвязанным заключениям: в исходном природном сообществе каждой конкретной экосистемы а) культивируемые микроорганизмы составляют лишь незначительную часть и б) разнообразие культивируемых микроорганизмов не отражает действительного биоразнообразия.
Появление и усовершенствование различных методов молекулярной биологии - гибридизационного анализа, секвенирования, молекулярного клонирования и полимеразной цепной реакции (ПЦР) привело к созданию методологии молекулярной экологии. Эта методология объединена единым принципом – изучение биоразнообразия осуществляется на основании анализа отдельных элементов геномов членов изучаемого сообщества. Поскольку молекулярно-экологический подход не ограничен обязательным принципом «чистой культуры», полученные с его применением результаты могут существенно дополнить и расширить представления о микробном разнообразии, а во многих случаях даже изменить их на основании обнаружения новых, некультивируемых организмов.
Специфическая амплификация и сиквенс-анализ генов 16S рРНК («рибосомная» филогенетика) является наиболее распространенным инструментом молекулярной экологии. Для того чтобы подчеркнуть, что молекулярная экология изучает природные сообщества не на уровне целых организмов, а на уровне отдельных элементов их геномов, предложен термин филотип. Выявление филотипов в природном сообществе не зависит от возможности или невозможности культивирования представленных этими филотипами организмов. Таким образом, использование молекулярных методов в экологических исследованиях позволяет получить филогенетическую информацию об отдельных членах сообщества, даже если они еще не известны микробиологам (“microbiota incognita”). Особенно интересные результаты с применением такого подхода можно получить при изучении микробного биоразнообразия необычных, экстремальных мест обитания.
2.2.2.1. Филогенетическое разнообразие архейного компонента микробных обрастаний на коралловидных постройках в зонах выхода метана в Черном море При изучении некоторых экосистем складывается парадоксальная ситуация, когда известно о протекании в этой системе определенного процесса, доказано, что этот процесс имеет биологическую природу, но остаются неизвестными организмы, осуществляющие этот процесс. Примером такой ситуации является изучение процессов микробного окисления метана (метанотрофии). Микроорганизмы, осуществляющие аэробное окисление метана (аэробные метанотрофы), их видовой состав, метаболизм и экология достаточно хорошо изучены. Однако при изучении морских глубоководных экосистем оказалось, что значительная часть метана потребляется еще в анаэробной зоне, не доходя до слоев воды, обогащенных кислородом. В настоящее время подсчитано, что в этот процесс вовлекается 5-20% от общего количества метана, поступающего в атмосферу. Однако процесс анаэробного окисления метана оказался классическим «черным ящиком» - организм(ы), его осуществляющий(ие), и, соответственно, механизм самого процесса оставались и, несмотря на интенсивные исследования, до сих пор остаются неизвестными.
Согласно одному из гипотетических сценариев этого процесса, он является сопряженным и включает транспорт электронов от метана к сульфату и, возможно, осуществляется несколькими организмами, включая метаногенов (с обратным метаболизмом) и сульфат-восстанавливающих бактерий. В настоящее время наиболее строгим доказательством данной гипотезы является обнаружение с помощью одного из методов молекулярной экологии, FISH технологии, микроконсорциумов, состоящих из архей-метанотрофов (близких к Methanosarcinales) и бактерий-сульфатредукторов, в некоторых обогащенных метаном морских анаэробных экосистемах (Boetius et al., 2000), В нашем исследовании молекулярно-экологический подход был впервые применен для исследования архейного компонента бактериальных обрастаний арагонитовых коралловидных построек в зоне выхода газовых струй (метановых сипов) на глубинах около 200 м в Черном море.
Предварительно была разработана и протестирована система олигонуклеотидных праймеров, позволяющая избирательно амплифицировать и секвенировать гены 16S рРНК архей из природных микробных сообществ [76]. В результате применения этой системы были выявлены и анализированы филотипы архей, представленные в суммарной ДНК изучаемого сообщества [77]. Результаты проведенного нами исследования (рис. 8) свидетельствовали о том, что архейный компонент в исследуемом сообществе представлен только одним филотипом, относящимся к Euryarchaeota, и двумя – к Crenarchaeota.
Филотип эвриархей являлся представителем группы ANME-1, периферически связанной с метаногенами порядков Methanosarcinales и Methanomicrobiales, и составляющей, по мнению описавших ее впервые исследователей (Hinrichs et al., 1999), новый порядок. Исходя из их филогенетического положения, археи группы ANME-1 относят к метаногенам, однако судить об особенностях их метаболизма можно лишь предположительно, поскольку пока эта группа представлена только филотипами, и для нее не выделено ни одного культивируемого вида.