Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных
На правах рукописи
МАРКУШЕВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ФЕНОЛА И ЕГО ХЛОРИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 03.02.03 – «Микробиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Уфа – 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН
Научный консультант:
Еникеева Светлана Ахметовна доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Вахитов Венер Абсатарович доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна доктор биологических наук, профессор Кураков Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН
Защита состоится «_»_2011 г. в _часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Автореферат разослан «_»_2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Лукманова К.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Известно, что в современной биосфере микроорганизмы играют важную роль в вовлечении синтетических производных в естественный обмен веществ и энергии. Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которых они выполняют процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Именно поэтому в настоящее время применение микроорганизмов рассматривается как основа наиболее выгодных способов поддержания качества окружающей среды.
Существенную роль в конверсии синтетических органических соединений играют бактерии. Это связано с тем, что важной особенностью бактериальных клеток является их высокая приспособляемость к изменяющимся факторам среды, из-за которой они приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии большое число антропогенных производных, включая и опасные по отношению к другим живым системам.
Значительную часть стойких токсичных экотоксикантов составляют хлорорганические производные, входящие в категорию крупнотоннажных продуктов, производимых для нужд сельского хозяйства, химической, лакокрасочной, деревообрабатывающей промышленности, целлюлозно бумажного производства, нефтеперерабатывающей и коксохимической отраслей. Источниками эмиссии поллютантов этой группы являются зоны производства, сточные воды и отходы, а также термические установки по их сжиганию, часто производящие еще более токсичные полихлордиоксины (Винокуров С.В. и др., 1995;
Майстренко В.Н., Клюев Н.А., 2004;
Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Реальную опасность представляют собой и места складирования. Например, к настоящему времени на территории «Уфахимпром» – накоплено 412,14 тыс.м3 отходов в 8 шламонакопителях и тонн высокотоксичных отходов (в т.ч. хлорфенолов), условия хранения которых по оценкам специалистов не соответствуют санитарным и экологическим нормам (Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010). Появление в окружающей среде токсикантов связано также с недостаточным качеством очистки промышленных стоков. По сведениям о работе очистных сооружений, приведенным в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2001 году», из биологических очистных сооружений в проектном режиме функционировали 19, остальные – работали неэффективно. Даже в ситуации, когда сброс стоков в поверхностные водные объекты снизился, в водной среде обнаруживаются все химические соединения, которые вырабатываются заводами химического профиля. В питьевой воде г. Уфы идентифицировано более 100 химических соединений-загрязнителей, в т.ч. фенол, бензол, безапирен, ряд пестицидов, включая 2,4-Д, ДДТ, изомеры гексациклогексана, летучие галогенсодержащие углеводороды, 1,2-дихлорэтан, диоксины. Суммарное содержание опасных веществ в отдельные периоды года достигает критических значений (Винокуров С.В. и др., 1995;
Ильин В.Г. и др., 1995).
Критические концентрации загрязнителей ароматического ряда обнаружены в Стерлитамаке, Кемерово, Славгороде, Перми, Дзержинске, Чапаевске, Волгограде и Павлодаре. В связи с высоким уровнем объемов накопленных отходов хлорорганического синтеза в 2010 году была организована инвентаризация и учет опасных объектов РФ с целью разработки мер по ликвидации экологического ущерба и определением механизмов их реализации, включая пилотные проекты отработки технологий утилизации загрязнителей (Хизбуллин Ф.Ф. и др., 2011).
Вместе с тем, анализ работ по проблеме утилизации синтетических соединений, показывает, что, несмотря на то, что современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные производные характеризуется выраженным практическим интересом к изучению микроорганизмов-деструкторов, число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии фенола и его производных, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus и Sphingomonas (Козловский C. и др., 1993;
Lang E. et al., 1996;
Prieto M. et al, 2002;
Rehfuss М. et al, 2005;
Gouda М., 2007;
Agarry S. et al., 2008;
Liu Y. et al., 2008;
Wang C., 2008;
Wasi S. et al., 2008;
Плотникова Е., 2010).
В настоящее время отсутствие системных исследований микробных деструкторов является сдерживающим фактором развития безопасных и экономически выгодных технологий для решений частных задач рационального использования и охраны природных ресурсов. Следует подчеркнуть, что биотехнологии примерно в 50 раз дешевле традиционных методов, при этом конверсию загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ, что позволяет исключить вторичную контаминацию среды.
Кроме этого, появляется возможность решения проблемы уничтожения значительных объемов накопленных отходов и невостребованных препаратов.
Вместе с тем, изучение микроорганизмов, способных ассимилировать молекулы экотоксикантов, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений микробиологии, раскрывающим новые особенности роли микробов в круговороте веществ. Это направление связано с исследованием теоретических основ жизнедеятельности микроорганизмов в техносфере. Оно охватывает вопросы биоразнообразия, генетической изменчивости, механизмов метаболических взаимоотношений с факторами трансформированной среды, раскрывает процессы адаптации и (микро)эволюции живых систем в условиях сильного антропогенного пресса, включая и случаи прямого их уничтожения.
Познание и освоение потенциала прокариот, обладающих особыми свойствами, а именно, способностью осуществлять контроль над содержанием загрязнителей в окружающей среде и представляющих собой в этом смысле ценный микробиологический ресурс, – важная часть исследований современной биологии в целом.
Цель работы Выявление новых природных бактерий-деструкторов фенола и его хлорированных производных, их сравнительный анализ и определение возможности практического применения.
Задачи исследования 1 Выделить новые бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы.
2 Идентифицировать штаммы-деструкторы в соответствии с культурально морфологическими, физиолого-биохимическими и молекулярными критериями систематики.
3 Исследовать пути метаболизма молекул ксенобиотиков и получить количественные и качественные характеристики процессов их конверсии.
4 Изучить роль экстрахромосомных элементов в генетическом контроле этапов ассимиляции хлорароматических производных.
5 Выявить уровень гомологии ДНК геномов изучаемых штаммов с ранее изученными генетическими системами конверсии хлорфеноксикислот бактерий.
6 Определить возможности практического применения вновь выделенных штаммов - деструкторов.
Научная новизна исследования Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4 дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5 трихлорфеноксиуксусной кислот.
Филогенетическое положение штаммов определено в соответствии с результатами исследования культурально-морфологических, физиолого биохимических признаков, сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК и белкового профилирования. Согласно филогенетической обособленности штаммы Citrobacter sp. 36 4CPA, Stenotrophomonas sp. 33Т и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.
Впервые выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.
Впервые установлено, что бактерии родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas выполняют оригинальные реакции ассимиляции хлорфеноксикислот с образованием феноксиуксусной кислоты с последующим раскрытием ароматического кольца.
Выявлено, что генетические системы, детерминирующие метаболизм хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas, располагаются на плазмидах.
Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением олигонуклеотидных праймеров установлено, что системы генетического контроля катаболизма молекул хлорфеноксикислот имеют существенные отличия от известных кластеров tfd- и tft-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia AC1100.
Теоретическое и практическое значение работы Получены новые данные о разнообразии природных штаммов деструкторов фенола и его хлорированных производных. Данные о деструкторах внесены в Консолидированный каталог культур микроорганизмов Российских немедицинских коллекций (Сonsolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L.V. Kalakoutskii Vol. I.
Bacteria, 2001.Р. 3915-4077. Режим доступа: http://www.vkm.ru/eCatalogue.htm/).
Последовательности генов 16S рРНК вновь выделенных штаммов депонированы в международную базу нуклеотидных последовательностей данных GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022, DQ333356).
Установлены оригинальные пути ассимиляции моноароматических галогенидов и локализованы генетические элементы их контроля.
Показана принципиальная возможность применения новых штаммов деструкторов в области защиты среды обитания человека.
Сведения о деструкторах, культуры деструкторов, а также их генетические элементы доступны для использования в научных и практических целях.
Результаты работы используются в образовательном процессе в курсах общебиологических дисциплин БГПУ им. М.Акмуллы и УГАТУ (биология, микробиология, экология, биохимия, генетика и биотехнология), а также при подготовке спецкурсов для магистров и бакалавров.
Практические рекомендации Штаммы-деструкторы рекомендуются для очистки водной среды и почвы в условиях предприятий нефтехимического профиля.
Штаммы-деструкторы Bacillus subtilis (Патент РФ № 1742226), Arthrobacter globiformis (Патент РФ № 2076523), Agrobacterium tumefaciens (Патент РФ № 2077575) и Serratia marcescens (Патент РФ № 2074254) рекомендуются для ремедиации объектов окружающей среды с целью утилизации фенолов в стоках нефтехимических предприятий Северного промузла Республики Башкортостан.
Штаммы-деструкторы Bacillus cereus (Патент РФ № 2129605), и Gluconobacter oxydans (Патент РФ №2130067) рекомендуются для утилизации фенолов и его хлорированных производных в почве.
Генетические ресурсы штаммов-деструкторов рекомендуются для создания новых штаммов с заданными свойствами in vitro (Патенты РФ №№ 2064501, 2130074 и 2125263).
Основные положения, выносимые на защиту 1 В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют бактерии деструкторы фенола и его хлорированных производных.
2 Деструкторами хлорфеноксикислот являются представители родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.
3 Ассимиляция хлорфеноксикислот у культур деструкторов происходит через процессы дегалогенирования ароматического кольца с последующим его раскрытием.
4 Штаммы-деструкторы обладают оригинальными генетическими кластерами, детерминирующими катаболизм молекул хлорфеноксикислот и их можно применить для создания новых штаммов-деструкторов in vitro.
5 Генетические детерминанты, контролирующие процессы катаболизма хлорфеноксикислот в клетках бактерий-деструкторов, могут располагаться на плазмидах.
6 Вновь выделенные бактерии-деструкторы рекомендуется использовать в качестве действующих элементов технологий очистки водной среды и почвы от фенола и его хлорированных производных, включая 2,4 дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту.
Апробация работы Результаты исследований докладывались и обсуждались на международных научных мероприятиях, в частности, на Экологическом Конгрессе (Япония, 1990), I Конгрессе европейских микробиологов (Словения, 2000), симпозиумах ELSO (Германия, 2003, Франция, 2004), Сахаровских чтениях (Республика Беларусь, 2006, 2009);
на 1 Международном конгрессе «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), II С. Петербургском международном экологическом форуме (2008);
съездах: ХVI Менделеевском (1998), Всероссийского общества генетиков и селекционеров (2000, 2004, 2008), Биохимического общества (Москва, 2002), Общества биотехнологов (Москва, 2006);
в ходе работы в научно-практических конференций, направленных на решение экологических проблем:
«Экологический императив сельского хозяйства РБ» (Уфа, 1998), «Реновация:
отходы-технологии-доходы» (Уфа, 2004), «Актуальные экологические проблемы» (Уфа, 2007), «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2009), а также в рамках профильных конференций: «Микробиологические методы защиты окружающей среды» (Пущино, 1988), «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), «Наука–Бизнес–Образование» (Пущино, 2005), «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Микробное разнообразие» (Пермь, 2008), «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), «Факторы экспериментальной эволюции» (Киев, 2010). Материалы исследований были обсуждены на межлабораторном научном семинаре Института биологии Уфимского научного центра и расширенном заседании диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Уфа, 2011).
Публикации Основные научные результаты диссертации изложены в 136 печатных работах, в том числе: 14 публикациях, указанных в Перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК Министерства науки и образования РФ, 9 патентах, в 1 работе, депонированной в ВИНИТИ, в монографии, 7 публикациях в научных электронных изданиях, 32 работах в научных сборниках и 72 - в материалах всероссийских и международных конференций.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 62 рисунка и таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Библиография включает 417 источников (89 - отечественных и 318 - зарубежных).
В приложении размещены последовательности нуклеотидов генов 16S рРНК, депонированные в международной базе данных GenBank, описания физико-химических свойств фенола и его хлорированных производных, использованных в исследованиях, акты испытаний, а также сведения о ранее изученных штаммах-деструкторах фенола и его хлорированных производных.
Связь работы с крупными научными программами Работа выполнена в соответствии с планами НИР ИБ УНЦ РАН, а именно, в рамках научно-исследовательских тем «Механизмы деградации хлорароматических соединений у прокариот» (№ гос. регистрации 012 00607440) и «Биоразнообразие природных микроорганизмов-деструкторов хлорароматических производных» (№ гос. регистрации 01200903470).
Исследования поддерживались научно-техническими программами Академии наук Республики Башкортостан, в том числе, «Биотехнология Башкортостана» (1993-1995), «Проблемы физико-химической биологии в области медицины, сельского хозяйства и технологии живых систем в РБ» (1999-2001), РФФИ Агидель № 02-04-97911, а также ГНТП «Экологически безопасные процессы химии и химической технологии» (1992-1993), ГНТП РФ «Приоритетные направления генетики» (1993-1995), ФЦНТП «Исследования науки и техники гражданского назначения» (1999-2001). В настоящее время НИР проводятся при содействии Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (2006-2011).
Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность и признательность коллегам по работе: к.б.н. Журенко Е.Ю., к.х.н. Галкину Е.Г., к.б.н. Коробову В.В., к.б.н.
Жариковой Н.В., к.б.н. Ясакову Т.Р., м.н.с. Анисимовой Л.Г. и сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН к.б.н. Колгановой Т.В. и к.б.н. Кузнецову Б.Б., за сотрудничество, а также коллективу Института биологии УНЦ РАН за многолетнюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.
Автор искренне признателен профессору Kazuhito Itoh (Shimane University, Япония) и профессору Sabine Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия) за образцы штаммов бактерий, любезно предоставленные для сравнительного анализа.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследования являлись штаммы бактерий, выделенные из образцов смешанных микробных популяций почв Северного промышленного узла города Уфы, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства, включая действие ряда высокотоксичных и канцерогенных синтетических производных ароматического ряда.
Штамм Burkholderia sp. M38-VN3-2W был получен от профессора К. Itoh (Shimane University, Япония). Культура Cupriavidus necator JMP предоставлена профессором S. Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия).
Чистые культуры штаммов-деструкторов выделяли по методу Коха (Теппер Е.З. и др., 1976) с небольшими модификациями.
Визуализацию клеток бактерий осуществляли с помощью электронного микроскопа Н-300 фирмы Hitachi (Япония) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия). При АСМ-микроскопии сканирование препаратов на подложке из слюды типа мусковит вели в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантилеверов CSG01 фирмы NT-MDT c радиусом кривизны зонда 10 нм по методике, рекомендованной изготовителем.
Идентификацию изолятов проводили по результатам сравнительного анализа культурально-морфологических, морфометрических и физиолого биохимических признаков в соответствии с критериями дифференциации бактерий, предложенными в 9-м издании руководства «Определитель бактерий Берджи» (1997), а также согласно принципам молекулярного типирования клеток прокариот.
При амплификации гена 16S рРНК использовали универсальные для большинства прокариот олигонуклеотидные праймеры (Edwards U. et al., 1989) и амплификатор Bio-Rad MJMini (США). Определение последовательности гена 16S рРНК производили с применением секвенатора Avant 3150 (Applied Biosystems, США) со стандартным набором реактивов по методикам, рекомендованным производителем.
Для генетического анализа использовали базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank и возможности Ribosomal Database Project.
Выравнивание последовательностей осуществляли с использованием редактора BIOEDIT с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение деревьев осуществляли в формате пакета программы TREECON. Достоверность ветвления филогенетических деревьев просчитывалась в программе MEGA4.
Протеомные профили клеток бактерий были изучены с помощью времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltonic, Германия).
Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z (отношение массы к заряду) от 2000 до 20000. Анализ данных проводился в программном пакете Biotyper 2.0 (Seng P. et al., 2009;
Szabados F. et. al., 2010).
Плазмидный статус штаммов исследовали с применением метода щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис Т. и др., 1984).
Элиминацию плазмид проводили по стандартной методике с небольшими модификациями (Герхард Ф., 1990). В качестве элиминирующего агента применяли этидиум бромид или акридиновый оранжевый.
При конъюгации клеток бактерий пользовались указаниями, изложенными в руководстве «Методы общей бактериологии» (Герхард Ф., 1990). Суспензии клеток донора и реципиента засевали в свежую среду МПБ и проводили наращивание смешанной культуры в течение 8-12 ч при +30°С. По окончании инкубации в суспензию добавляли селективные агенты (2,4-Д и 2,4,5- Т) и инкубировали клетки в течение 1-2 часов в условиях аэрации. Далее клетки рассевали на МПА. Контролем чистоты эксперимента служил посев клеток штаммов донора и реципиента на МПА с селективными агентами.
Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК осуществлялась при модификации стандартного метода (Маниатис Т. и др., 1984). В ходе проверки компетентности проводили трансформацию клеток E.coli HB 101 с применением препарата плазмиды pBR322, несущей ген устойчивости к ампициллину. В качестве контроля чистоты эксперимента выполняли посев клеток без трансформации на среду того же состава.
Фракционирование препаратов ДНК осуществляли путем электрофореза в 1%-м агарозном геле в камере для Bio-Rad Wide mini-sub Cell GT (США) при напряжении электрического поля 6 В/см 25В. После окрашивания фрагментов ДНК гель фотографировали в проходящем УФ-свете при помощи системы документации (Biometra, Германия).
В анализе последовательностей, гомологичных tfd-генам, применяли метод дот-блот гибридизации препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре.
Для этого получали препарат плазмиды pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 методом щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис Т. и др., 1984). Метку в препараты ДНК вводили методом замещения нуклеотидов с использованием набора Nick-Translation System (Promega, США).
При приведении сравнительного анализа tft-генов ДНК-матрицы для ПЦР реакций получали по методике N.L. Huong с коллегами (Huong N.L. et al., 2007) с незначительными модификациями. Амплификацию гена tftA осуществляли с использованием препарата ДНК штамма Burkholderia sp. M38-VN3-2W в качестве положительного контроля (Huong N.L. et al., 2007).
Ферментативный гидролиз препаратов ДНК и ПДРФ-анализ проводили по стандартным методикам с учетом рекомендаций производителя (Fermentas, Литовская Республика). Определение размеров фрагментов ДНК осуществляли относительно набора маркерных фрагментов ДНК фага с использованием программы Gel Analysis.
Для определения чувствительности штаммов к антибиотикам использовали метод диффузии в агар с применением дисков (Лабинская А.С., 1978).
Рост культур осуществляли в термостатированных установках УВМТ-12 250 при 115-120 об/мин. Контроль биомассы выполнялся путем измерения значений оптической плотности клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (Россия) при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2.
Анализ содержания фенола и хлорфенола проводили согласно стандартному фотометрическому методу с применением 4-аминоантипирина (Губен-Вейль И., 1963). Количество фенолов определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения. Содержание хлорфеноксикислот в культуральной жидкости контролировали согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» (Клисенко М.А., 1984). Идентификацию интермедиатов осуществляли на хромато-масс спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360.
Все эксперименты проведены не менее чем в трех повторностях. В ходе обработки данных определялась средняя арифметическая, стандартное отклонение и доверительный интервал. Обработка результатов проводилась с использованием программы Excel 5.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Из образцов почвенной биоты, подвергавшейся воздействию факторов нефтехимического производства, были выделены изоляты, способные к росту в условиях использования фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии.
1. Идентификация микроорганизмов-деструкторов Выявленные культуры были идентифицированы согласно совокупности культурально-морфологических, морфометрических, физиолого биохимических признаков, а также в соответствии с принципами молекулярного типирования прокариот как штаммы Achromobacter xyloxidans 33P, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, Arthrobacter globiformis 17S, Azospirillum irakense 38D, Bacillus cereus 33T, Bacillus subtilis 16, Brenneria salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, Enterobacter asburia 33D, Enterobacter cloacae 34 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pantoea agglomerans 36P, Pseudomonas aeruginosa 36DCP, Pseudomonas fluorescens 39D, Pseudomonas kilonensis 34T, Pseudomonas putida 19S, Raoultella planticola 4CPA, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36T, Rhodococcus rubropertinctus 5D, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.
2 3 6 Рисунок 1 – АСМ – изображения клеток Azospirillum irakense 38D (1), Stenotrophomonas sp. 33Т (2,3), Citrobacter sp. 36 4CPA (4), Rhodococcus rubropertinctus 5D (5), Pseudomonas fluorescens 39D (6), Gluconobacter oxydans 2T (4). Изображения клеток Xanthomonas sp. 33DCP при разрешении 6000Х (7), Gluconobacter oxydans 2T при разрешении 24000Х (8), полученные с использованием электронной микроскопии. Стрелкой обозначены жгутики бактерий.
Основные диагностические морфологические и морфометрические характеристики микробных клеток были получены с использованием методов электронной и АСМ-микроскопии (рис. 1).
В ходе исследования физиолого-биохимических признаков были выявлена устойчивость изолятов 2T, 33 4CPA, 36D, 36T, 22S к антибиотикам (тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину, биомицину) и ионам тяжелых металлов (кобальта, кадмия, серебра). В клетках нескольких культур, в частности, 36 4CPA, 34Т, 22S, 33Т и 33DCP были обнаружены экстрахромосомные элементы.
Сравнительный анализ последовательностей 16S рРНК позволил установить филогенетические кластеры, в которые входили обнаруженные штаммы, и определить наиболее близкие им виды, представленные в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank.
Serratia marcescens 0,02 Raoultella ornithinolytica ATCC Serratia marcescens Raoultella planticola Serratia marcescens Raoultella ornithinolytica JCM Serratia marcescens Raoultella ornithinolytica JCM6096T Serratia marcescens Raoultella ornithinolytica Serratia marcescens Raoultella planticola Serratia marcescens ATCC 13880T 22S (HQ896493) Raoultella ornithinolytica FSK Raoultella planticola ATCC Serratia rubidaea JCM 1240T Raoultella trevisanii ATCC 33558T Serratia ficaria JCM 1241T Raoultella planticola DR Serratia liquefaciens JCM 1245T Raoultella planticola 100 Citrobacter werkmanii CDC 0876-58T Raoultella planticola Citrobacter braakii CDC 080-58T Raoultella planticola DSM 3069T Citrobacter freundii DSM 30039T 33 4CPA (DQ333356) Escherichia coli K- Raoultella terrigena ATCC33257T 100 Citrobacter koseri CDC 8132- Raoultella terrigena SW Citrobacter koseri CDC 3613-63T Raoultella terrigena m Citrobacter amalonaticus CDC 9020- Raoultella terrigena m Citrobacter farmeri CDC 8T 36 4CPA (JF812082) 99 Raoultella terrigena m Citrobacter sedlakii CDC 4696-86T Raoultella planticola JCM 7251T Citrobacter rodentium CDC 1843-73T А Б Рисунок 2 – Филогенетическое положение штаммов 36 4CPA, 22S (А) и 33 4CPA (Б). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" – анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).
В ходе типирования бактерий с учетом молекулярных маркеров было установлено, что культуры 36 4CPA и 22S принадлежат к филогенетической подгруппе энтеробактерий (рис. 2А).
Штамм 36 4CPA был отнесен к филогенетической подгруппе гетерогенного рода Citrobacter. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК штамма 36 4CPA с последовательностями различных видов этой подгруппы составлял 97,6 – 98,8%, что оказалось заметно ниже внутривидового уровня для типовых видов C. koseri и C. farmery (99,4%). Внутри филогенетического кластера, составленного этими видами, штамм 36 4CPA образовывал самостоятельную ветвь (рис. 2А). Согласно полученным данным был сделан вывод о том, что штамм 36 4CPA представляет новый вид филогенетической подгруппы рода Citrobacter и он был обозначен как Citrobacter sp. 36 4CPA.
Штамм 22S входил в кластер, образованный несколькими штаммами Serratia marcescens, включая типовой. Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемого штамма со штаммами кластера Serratia marcescens оказался очень высоким и составил 99,4 – 99,8%. Этот уровень соответствовал внутривидовому для вида S. marcescens (98,8%). Уровень сходства последовательностей с другими видами рода Serratia был заметно ниже – 98,3 98,5% (рис. 2А). Результаты анализа сходства последовательностей генов 16S рРНК позволили отнести изучаемый штамм к роду Serratia и виду marcescens.
Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов 33 4CPA, 36D и 36Т показал, что последовательности генов 16S рРНК этих штаммов идентичны и входят в филогенетический кластер видов рода Raoultella planticola, Raoultella ornithinolytica и Raoultella trevisanii (рис. 2Б).
При этом наиболее близким к ним является типовой штамм вида Raoultella planticola (99.8%) (рис. 2Б). Такой уровень сходства соответствует внутривидовому для R. planticola (99,8%), что позволило однозначно идентифицировать штаммы 33 4СРА, 36D и 36Т как Raoultella planticola.
На основании анализа последовательности 16S рРНК было показано, что штамм 33Т входит в филогенетический кластер рода Stenotrophomonas с уровнем сходства 98 – 99%, что ясно свидетельствовало о том, что штамм 33Т является представителем рода Stenotrophomonas. При этом наиболее близкими видами к штамму 33Т являлись Stenotrophomonas maltophilia LMG 958T и Stenotrophomonas africae LMG 22072 (рис. 3А).
Вместе с тем, принимая во внимание то, что согласно АСМ изображениям у клеток штамма 33Т было обнаружено наличие двух полярно расположенных жгутиков (рис. 1, изображения 2 и 3), в то время как для вида Stenotrophomonas maltophilia описано перитрихиальное жгутикование (Определитель бактерий Берджи, 1997), было сделано заключение о том, что штамм Stenotrophomonas sp. 33Т не может быть классифицирован как Stenotrophomonas maltophilia и близкий к нему Stenotrophomonas africae, и его следует классифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.
Достоверность классификации штамма 33Т была проверена в ходе протеомного фингерпринтинга. По результатам анализа профиля белковых масс было установлено, что штамм Stenotrophomonas sp. 33Т близок к штамму Stenotrophomonas sp. 109 Neb28 NFI. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, составляло 2,005. Это убедительно указывало на то, что штамм 33Т следует идентифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.
Xanthomonas populi LMG 5743-T Xanthomonas arboricola LMG 747T Xanthomonas vesicatoria LMG 911T Xanthomonas hortorum LMG 733T А Б 71 Xanthomonas theicola LMG 8684T 63 Xanthomonas bromi LMG 947T Xanthomonas cucurbitae LMG T Xanthomonas pisi LMG 847T Xanthomonas cynarae DSM 100 Xanthomonas cassavae LMG 673T Xanthomonas campestris 568-T Xanthomonas vesicatoria LMG 911T Xanthomonas vasicola LMG 736T Xanthomonas cucurbitae LMGT 65 Pseudomonas cissicola LMG 2167T 63 Xanthomonas cynarae DSM16794T Xanthomonas codiaei LMG 8678T Xanthomonas populi LMG 5743T Xanthomonas axonopodis LMG 538T Stenotrophomonas rhizophila LMG 22075T 33DCP (HQ891021) St. acidaminiphila LMG 22073T Xanthomonas sacchari LMG 471T Stenotrophomonas humi LMG 23959T Xanthomonas albilineans LMG 494-T 33T (HQ877451) Xanthomonas campestris LMG Stenotrophomonas maltophilia LMG 958T Xanthomonas melonis LMG 8670T Stenotrophomonas africae LMG 71 Xanthomonas hyacinthi LMG 739T 0. 0. Pseudomonas corrugata DSM7228T В Pseudomonas kilonensis DSM13647T Pseudomonas thivervalensis CFBP 11261T 34T (HQ891022) Ps. frederiksbergensis DSM13022T Pseudomonas congelans DSM14939T 100 Pseudomonas tremae CFBP 6111T Pseudomonas chlororaphis DSM19603T Pseudomonas chlororaphis DSM 100 Pseudomonas cedrina CFML 96-198T Pseudomonas cedrina DSM14938T Pseudomonas mohnii IpA-2T Pseudomonas moorei DSM12647T 0. Рисунок 3 – Филогенетическое положение штаммов 33Т (А), 33DCP (Б) и 34Т (В). Масштаб показывает эволюционное расстояние последовательности гена 16S рРНК, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap"–анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).
По данным типирования штамма 33DCP с использованием последовательности 16S рДНК было установлено, что штамм принадлежит к филогенетическому кластеру, образованному представителями рода Xanthomonas. Уровень сходства последовательностей 16S рДНК изучаемого штамма и различных видов рода Xanthomonas составлял более 99%. На основании этих данных было сделано заключение, что штамм 33DCP является представителем рода Xanthomonas.
Исследование белковых профилей штамма 33DCP не обнаружило достоверную близость ни с одним бактериальным штаммом, поэтому этот штамм был дифференцирован как штамм нового вида рода Xanthomonas (рис.
3Б).
Из рис. 3В видно, что изолят 34Т принадлежит филогенетически гетерогенному роду Pseudomonas. Уровень гомологии последовательности гена 16S рРНК штамма 34Т и близких ему видов превышал 99%. Наиболее близкими к нему видами являлись P. thivervalensis CFBP 11261T, P. corrugata DSM 7228T и P. kilonensis DSM 13547T.
Анализ профиля белковых масс клеток данного штамма выявил, что онимеет наибольшее сходство со штаммом Pseudomonas kilonensis DSM 13647T HAM. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, равное 2,045, подтверждало достоверность таксономического определения этого штамма. На основании полученных данных штамм 34Т был идентифицирован как Pseudomonas kilonensis 34Т (рис. 3Б).
Согласно совокупности результатов филогенетического анализа было установлено, что в составе смешанных популяций присутствовали 4 штамма рода Pseudomonas, а именно, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, P.
kilonensis 34T и P. putida 19S, 3 штамма рода Raoultella – R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36T и по два деструктора родов Enterobacter – E. asburia 33D и E. cloacae 34 4CPA, а также Bacillus – B. cereus 33T и B. subtilis 16.
Таким образом, было обнаружено, что в составе биоты техногенной экосистемы присутствовали деструкторы фенола и его хлорированных производных нескольких таксонов протеобактерий, а именно родов:
Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.
Данные таксономические группы протеобактерий были представлены штаммами альфа-подкласса (A. irakense 38D и G. oxydans 2T), бета-подкласса (A. xyloxidans 33P) и гамма-подкласса (A. tumefaciens 21SG, B. salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, E. asburia 33D, E. cloacae 34 4CPA, P. agglomerans 36P, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R.
planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T, Xanthomonas sp. 33DCP), а также группой актиномицетов (Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S и R. rubropertinctus 5D). Кроме этого были обнаружены представители бациллярной линии (B.
cereus 33T и B. subtilis 16).
Следует отметить, что ряд исследователей обнаруживал среди деструкторов представителей бактерий родов Achromobacter (Vedler E. et al., 2000;
Quan X. et al, 2004), Bacillus (Gurujeyalakshmi G. et al., 1989;
Козловский C. и др., 1993;
Kim I., Oriel P., 1995;
Gunther K. et al., 1995;
Lang E. et al., 1996.;
Li D.-Y. et al., 2006;
Matafonova G. et al., 2006;
Herrera Y. et al., 2008;
Wang C. et al., 2008;
Liu D.-Y. et al., 2008;
Singh S. et al., 2008;
Tallur P. et al., 2006;
Kirchner U. et al., 2003;
Satchanska G. et al., 2006), Citrobacter (Martinez M.et. al., 2000;
Narde K. et al., 2004) и Rhodococcus (Hensel J. et al., 1983;
Горлатов C. и др., 1989;
Janke D. et al., 1989;
Мальцева O. и др., 1991;
Stoecker M. et al., 1994;
Briglia M. et al., 1996;
Lang E. et al., 1996;
Моисеева O. и др., 1999;
Соляникова И. и др., 1999;
Финкельштейн З. и др., 2000;
Prieto M. et al, 2002;
Ferraroni M. et al, 2003;
Rehfuss M. et al, 2005;
Goswami M. et al, 2005;
MargesinR. et al, 2005;
Плотникова E. и др., 2006;
Pamukoglu M., Kargi F. 2008;
Gouda M. et al., 2007).
Принимая во внимание то, что ранее не были выделены бактерии деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas, следует сделать вывод о том, что способности представителей указанных таксономических групп вовлекать в обмен веществ и энергии галогенсодержащие производные ароматического ряда выявлены впервые на примере вновь выделенных штаммов A. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP A. irakense 38D, B. salcis 38P, E. asburia 33D, E. cloacae 34 4CPA, G. oxydans 2T, P. agglomerans 36P, R.
planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.
2. Сравнительный анализ особенностей конверсии хлорфеноксиуксусных кислот Исследование динамики использования вновь выделенными изолятами фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4 дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве источников углерода и энергии показало, что накопление биомассы культур в модельных системах коррелировало с убыванием субстратов (рис. 4).
Сравнительный анализ значений остаточного содержания фенола, 2,4 ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т обнаружил различия в уровнях утилизации указанных источников питания (Табл. 1).
Наиболее существенное снижение фенола, до 97% – 99%, наблюдалось для культур A. irakense 38D, B. cereus 33T, R. planticola 36T и S. marcescens 22S.
Меньший уровень использования субстрата – до 93% – 95%, был обнаружен для P. kilonensis 34T и Stenotrophomonas sp. 33T.
В периодической культуре 2,4-дихлорфенол активно утилизировали, до 85% – 70%, штаммы Agromyces sp. 34DCP, B. subtilis 16, P. aeruginosa 36DCP и R. planticola 33 4CPA. Вместе с тем, данный субстрат не метаболизировали культуры A. xyloxidans 33P, A. tumefaciens 21SG, B. cereus 33T, B. salcis 38P, G.
oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 36T, R. planticola 36D, R.
rubropertinctus 5D и Stenotrophomonas sp. 33T.
По отношению к 4-ХФУК наиболее активными оказались P. agglomerans 36P (90%), Xanthomonas sp. 33DCP (78%) и P. fluorescens 39D (81%).
Культуры B. cereus 33T, P. fluorescens 39D и Stenotrophomonas sp. 33T утилизировали до 82% – 88% 2,4-Д от начальной концентрации.
0, О п т и ч е с ка я п л о т н о с т ь, О Е О п т и ч е с ка я п л о т н о с т ь, О Е 0, 0, 0,8 0, 0, 0, 0, 0,5 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 1 2 3 4 5 6 7 8 В р е м я ку ль т и ви р о ва н и я, с у т ки В р е м я ку ль т и ви р о ва н и я, с у т ки C it ro b act er s p. 3 6 4 C P A X an t o m o n as s p. 3 3 D C P R ao u lt ella p lan t ico la 3 6 T B acillu s cereu s 3 3 T P s eu d o m o n as aeru gin o s a 3 6 D C P A z o s p irillu m irak en s e 3 8 D R ao u lt ella p lan t ico la 3 3 4 C P A Serrat ia m arces cen s 2 2 S E n t ero b act er as b u ria 3 3 D R ao u lt ella p lan t ico la 3 6 D A ch ro m o b act er xy lo s o xid an s 3 3 P P an t o ea aggllo m eran s 3 6 P St en o t ro p h o m o n as s p. 3 3 T A gro b act eriu m t u m efacien s 2 1 SG 1, О п т и ч е с ка я п л о т н о с т ь, О Е О п т и ч е с ка я п л о т н о с т ь, О Е 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,6 0, 0,5 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 В р е м я ку ль т и ви р о ва н и я, с у т ки В р е м я ку ль т и ви р о ва н и я, с у т ки A gro m y ces s p. 3 4 D C P A rt h ro b act er glo b ifo rm is 1 7 S P s eu d o m o n as k ilo n en s is 3 4 T B acillu s s u b t ilis 1 G lu co n o b act er o xy d an s 2 T P s eu d o m o n as p u t id a 1 9 S R h o d o co ccu s ru b ro p ert in ct u s 5 D P s eu d o m o n as flu o res cen s 3 9 D E n t ero b act er clo acae 3 4 4 C P A Рисунок 4 – Графики динамики зависимости значений оптической плотности клеточной суспензии от времени инкубации штаммов бактерий в условиях использования 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии в периодической культуре. Штаммы сгруппированы по месту обитания.
Таблица 1 – Остаточное содержание субстратов в среде культивирования Концентрация субстрата, % ШТАММ 2,4- 4 Фенол 2,4-Д 2,4,5-Т ДХФ ХФУК Achromobacter xyloxidans 33P 80,3 – 32,8 58,7 36, Agrobacterium tumefaciens 21SG 21,8 – 37,6 34,1 18, Agromyces sp. 34DCP 26,4 27,0 65,2 34,1 33, Arthrobacter globiformis 17S 45,3 53,0 38,2 59,4 16, Azospirillum irakense 38D 2,1 56,0 36,8 37,3 36, Bacillus cereus 33T 1,1 – 62,0 12,4 23, Bacillus subtilis 16 67,1 30,2 29,0 19,8 22, Brenneria salcis 38P 90,3 – 53,3 62,7 – Citrobacter sp. 36 4CPA 84,2 46,4 26,9 34,0 24, Enterobacter asburia 33D 77,5 39,9 38,2 30,3 37, Enterobacter cloacae 34 4CPA 85,4 41,2 45,9 – 40, Gluconobacter oxydans 2T 79,3 – 84,9 31,1 18, Pantoea agglomerans 36P 74,1 31,9 10,1 62,0 26, Pseudomonas aeruginosa 36DCP 15,2 14,3 55,1 62,0 33, Pseudomonas fluorescens 39D 62,7 75,3 19,0 18,4 34, Pseudomonas kilonensis 34T 5,2 – 27,4 51,7 39, Pseudomonas putida 19S 67,0 30,1 62,4 65,0 55, Raoultella planticola 33 4CPA 48,4 27,3 77,0 62,7 50, Raoultella planticola 36D 64,3 – 56,0 67,8 25, Raoultella planticola 36T 3,1 – 29,8 61,4 55, Rhodococcus rubropertinctus 5D 85,1 – 50,4 45,0 60, Serratia marcescens 22S 1,1 56,4 65,4 41,0 33, Stenotrophomonas sp. 33T 8,7 - 58,1 16,3 27, Xanthomonas sp. 33DCP 69,3 95,2 21,4 40,1 35, Наиболее активными по отношению к 2,4,5-Т являлись G. oxydans 2T, A.
tumefaciens 21SG и A. globiformis 17S, утилизировавшие примерно 82%-84% хлорфеноксикислоты. Довольно высокий уровень конверсии 2,4,5-Т показали культуры Citrobacter sp. 36 4CPA (76%) и B. subtilis 16 (78%).
Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что для большинства штаммов была характерна полисубстратная активность, при этом фенол и 4 ХФУК метаболизировали все изоляты, а наиболее трудно подвергался ассимиляции 2,4-ДХФ. Штаммы А. oxidans 33P, A. tumefaciens 21SG, B. cereus 33T, B. salcis 38P, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 36D, R. planticola 36T, R. rubropertinctus 5D и Stenotrophomonas sp. 33T не использовали 2,4-ДХФ в качестве источника углерода и энергии.
Ранее было обнаружены представители рода Achromobacter (Quan X. et al., 2004;
Vedler E. et al., 2000), Arthrobacter (Sandman E. et al., 1988;
Karigar Ch.
et al., 2006;
Margesin R. et al., 2004), Bacillus (Gunther K. et al., 1995;
Kim I.C., Oriel P.J., 1995), Citrobacter (Narde K. et al., 2004;
Martinez M. et al., 2000) и Pseudomonas (Bhat M.A. et al., 1994;
Radjendirane V. et al., 1991;
Friedrich B. et al., 1983;
Herrmann H. et al., 1995) способные к конверсии фенола и его хлорированных производных.
Вместе с тем, сравнивая обсуждаемые данные с исследованиями других авторов, можно сделать вывод о том, что на примере вновь выделенных и исследованных бактерий впервые показана способность к ассимиляции (хлор)ароматических субстратов для некоторых видов бактерий.
В частности, впервые установлена конверсия фенола, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Achromobacter xyloxidans на примере штамма A. xyloxidans 33P, а также метаболизм фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Arthrobacter globiformis на примере штамма A. globiformis 17S.
При изучении представителей бациллярной линии, а именно, штамма B.
subtilis 16 для представителей рода Bacillus впервые обнаружен катаболизм фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т, а на примере B. cereus 33T – установлено участие представителей данного вида в конверсии фенола, 2,4-Д, 4-ХФУК и 2,4,5-Т.
Исследование штамма Сitrobacter sp. 36 4CPA впервые выявило, что штамм данного рода способен катаболизировать фенол, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5 Т.
Для представителей рода Рseudomonas на примере Р. fluorescens 39D описана реализация реакций конверсии 4-ХФУК и 2,4,5-Т, а также деструкция 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида P. putida на примере штамма P. putida 19S. Кроме этого, показана возможность участия штаммов вида P. aeruginosa в ассимиляции 4-ХФУК, 2,4,5-Т и 2,4-ДХФ на примере штамма P. aeruginosa 36DCP и установлена способность P. kilonensis вовлекать в обмен веществ фенол, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т.
На примере вновь выделенного штамма R. rubropertinctus 5D установлено, что 4-ХФУК и 2,4,5-Т доступны для бактерий вида Rhodococcus rubropertinctus.
Таблица 2 – Результаты идентификации метаболитов штаммов-деструкторов Интермедиат Характеристические пики ШТАММ № (метиловый эфир) ионов в масс-спектре m/z, % A. tumefaciens 21SG 2,4-дихлор-6-метил М+ 264 (30), 233 (30), 19 (100), S. marcescens 22S 175 (25), 147 (30), 87 (15), феноксиуксусная кислота (20) Citrobacter sp. 36 4CPA 2,4- М+ 234 (89), 236 (55), 199 (69), G. oxydans 2T 178 (64), 175 (100), 161 (50), дихлорфеноксиуксусная (32), 148 (30), 146 (42) кислота B. subtilis 2,3- М+ 234(20), 199(30), 175(100), 45(60) дихлорфеноксиуксусная кислота B. subtilis 5-оксиметил-2,4- М+ 264(80), 233(10), 191(100) дихлорфеноксиуксусная кислота М+200 (100), 202 (32), 143 (32), Citrobacter sp. 36 4CPA 4-хлор-6 141 (100), 141 (100), 113 (38), метилфеноксиуксусная 111 (58) кислота М+200 (100), 202 (32), 143 (32), A. xyloxidans 33P 4-хлорфеноксиуксусная G. oxydans 2T 141 (100), 141 (100), 113 (38), кислота R. planticola 36D 111 (58) R. planticola 36Т R. planticola 33 4CPA М+ 200(60), 155(100), 141(80), B. subtilis 2-хлорфеноксиуксусная 107(100) кислота A. xyloxidans 33P 4- М+ 196 (45), 137 (10), (100), 107 (10), 92 (10), 77 (10) оксиметилфеноксиуксусная кислота A. xyloxidans 33P феноксиуксусная кислота М+ 166 (50), 107 (120), 77 (80) G. oxydans 2T S. marcescens 22S P. kilonensis 34T R. planticola 36D R. planticola 36Т R. planticola 33 4CPA Stenotrophomonas sp. 33T Xanthomonas sp. 33DCP A. tumefaciens 21SG 2-гидрокси-2- M+ 45 (100), 55 (20), 59 (8), Citrobacter sp. 36 4CPA (5), 115 (6), 129 (20), 125 (2), гексендионовая кислота S. marcescens 22S 188 (0,1) М+ 156 (2), 126 (6), 111 (10), 97 G. oxydans 2T 3-метил-2,6-диоксо-4 (20), 95 (20),85 (21), 83 (21), 71 R. planticola 33 4CPA гексеновая кислота R. planticola 36D (16), 57 (100), 44 (50) R. planticola 36Т P. kilonensis 34T 2-гексеналь М+ 98 (5), 83 (30), 69 (70), Stenotrophomonas sp. 33T (100), 44 (50) Xanthomonas sp. 33DCP В ходе анализа интермедиатов, появлявшихся в культуральной жидкости в условиях использования молекул ксенобиотиков в качестве единственных источников углерода и энергии, были идентифицированы ключевые молекулы конверсии A. tumefaciens 21SG, A. xyloxidans 33P, Citrobacter sp. 36 4CPA, B.
subtilis 16, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP (табл. 2).
В частности, 2,4-дихлорфеноксиукусная кислота была идентифицирована среди метаболитов G. oxydans 2T и Citrobacter sp. 36 4CPA.
Метилированное производное 2,4-дихлорфеноксиукусной кислоты, а именно, 2,4-дихлор-6-метилфеноксиукусная кислота, была выявлена у A.
tumefaciens 21SG и S. marcescens 22S.
Кроме этого, в культуральной жидкости A. xyloxidans 33P, G. oxydans 2T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36Т была обнаружена 4 хлорфеноксиуксусная кислота, а ее метилированное производное, 4-хлор-6 метилфеноксиуксусная кислота, присутствовала в периодической культуре Citrobacter sp. 36 4CPA.
Среди промежуточных продуктов B. subtilis 16 отмечены 5-гидрокси-2,4 дихлорфеноксиукусная, 2-хлорфеноксиукусная и 2,3-дихлорфеноксиукусная кислоты.
В культуральной жидкости нескольких штаммов, а именно, A. xyloxidans 33P, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R.
planticola 36Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp.
33DCP, наблюдались молекулы феноксиуксусной кислоты.
P. kilonensis 34T, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP образовывали 2-гексеналь.
3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислота присутствовала у культур G.
oxydans 2T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36Т, а 2 гидрокси-2-гексендионовая кислота образовывалась в ходе инкубации A.
tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4CPA и S. marcescens 22S.
Присутствие среди метаболитов 2,4-дихлорфеноксиукусной, 4 хлорфеноксиуксусной, феноксиуксусной кислот и их производных позволяет сделать вывод, о том, что изучаемые бактерии способны выполнять реакции конверсии хлорфеноксикислот через последовательное дегалогенирование ароматического кольца до стадии его расщепления (рис. 5).
Следует заметить, что штамм B. subtilis 16, являющийся представителем бациллярной линии грамположительных протеобактерий, реализует реакции гидроксилирования ароматического кольца с последующей миграцией и отрывом ионов хлора.
Наличие 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты (производного муконата) в культуральной жидкости штаммов A. tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4CPA и S. marcescens 22S указывает на то, что у данных штаммов раскрытие ароматического кольца происходило по орто- пути, для которого при расщеплении ароматического субстрата характерно образование цис, цис-муконата и его производных, в дальнейшем метаболизируемых до O C H 2C O O H Cl Cl Cl O C H 2C O O H O C H 2C O O H O C H 2C O O H O C H 2C O O H Cl Cl Cl Cl H 3C Cl HO B.subtilis Cl Cl Cl C itrobacter sp. 36 4C PA A.tum efaciens 21SG B.subtilis G.oxydans 2T S.m arcescens 22S O C H 2C O O H O C H 2C O O H O C H 2C O O H H 3C Cl B.subtilis Cl Cl R.planticola 36D C itrobacter sp. 36 4C PA R.planticola 36T R.planticola 33 4C PA G.oxydans 2T A chrom obacter sp. 33P O C H 2C O O H O C H 2C O O H R.planticola 36D OH R.planticola 36T A chrom obacter sp. 33P R.planticola 33 4C PA G.oxydans 2T S.m arcescens 22S Stenotrophom onas sp. 33T P.kilonensis 34T COOH COH HO COH COOH COOH O Stenotrophom onas sp. 33T A.tum efaciens 21SG H 3C P.kilonensis 34T S.m arcescens 22S C itrobacter sp. 36 4C PA R.planticola 36D X antom onas sp. 33 D C P R.planticola 36T R.planticola 33-4C PA G.oxydans 2T Рисунок 5 – Схема деградации хлорфеноксикислот вновь выделенных штаммов-деструкторов.
кетоадипата (так называемый -кетоадипатный путь). Такой путь типичен для конверсии (хлор)ароматических соединений у бактерий.
Образование 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеноновой кислоты (кета изомера полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты) указывает на то, что у штаммов G. oxydans 2T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D и R.
planticola 36Т расщепление ароматического кольца происходило не по орто-, а по мета - пути.
Обнаружение 2-гексеналя в качестве интермедиата процесса деградации хлорфеноксиуксусных кислот для штаммов P. kilonensis 34T, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP также свидетельствует в пользу реализации мета - пути конверсии хлорароматиков для этих культур, когда ароматическое кольцо раскрывается таким образом, что образуются муконовые полуальдегиды, дальнейший метаболизм которых, как правило, ведет к образованию пирувата, муравьиной кислоты и ацетальдегида, вступающих затем в основной обмен (цикл Кребса).
Такой характер образования промежуточных продуктов был установлен для ограниченного числа микроорганизмов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Штамм Pseudomonas sp. CBS3 (Klages U., Markus A. and Lingens F., 1981) осуществлял мета - расщепление ароматического кольца ключевого метаболита деградации 4-ХФУК – 3,4 дигидроксифенилуксусной кислоты. Из деструкторов 2,4-Д только у штамма Azotobacter chroococcum (Balajee S., Mahadevan A., 1990) было мета - расщепление, обнаружено которое присутствовало как альтернативный (к -кетоадипатному) путь конверсии субстрата. Для бактерий, выполняющих диссимиляцию 2,4,5-Т, мета - путь ранее описан не был.
Таким образом, на примере A. xyloxidans 33P, G. oxydans 2T, P. kilonensis 34T, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36Т, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP впервые описан мета - путь ассимиляции 2,4,5-Т.
Результаты сравнительного анализа показали, что на примере вновь выделенных штаммов-деструкторов родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas впервые для представителей данных таксонов описаны реакции ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот.
3. Сравнительный анализ генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот 3.1. ПЦР-анализ ДНК геномов штаммов-деструкторов с применением геноспецифических праймеров гена tftA Burkholderia cepacia AC Ранее для Burkholderia cepacia AC1100 были описаны особенности генетического контроля пути деструкции 2,4,5-Т, ключевыми особенностями которого являются отрыв остатка уксусной кислоты и образование 2,4,5 трихлорфенола. Вслед за этим происходило дехлорирование молекулы трихлорфенола и разрыв ароматического кольца. Указанные реакции детерминировали tft-гены, входящие в кластер tftAB.
Конечным продуктом реакций этого пути являлся 3-оксоадипат, который в форме промежуточных метаболитов (ацетил-СоА и сукцинил-СоА) включался в ЦТК (Daubaras D.L. et al., 1995;
Xun L., Wagnon K.B., 1995;
Hbner A. et al., 1998;
Zaborina O. et al., 1998;
Ohtsubo Y. et al., 1999).
Ген tftA кодирует 2,4,5-Т-оксигеназу, которая катализирует первую реакцию метаболизма 2,4,5-Т, приводящую к образованию 2,4,5 трихлорфенола. Для определения в геномах прокариот гомологов tftA-гена было предложено использовать систему геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров (Huong N.L. et al., 2007;
Rice J.F. et al., 2005). С применением этой системы было успешно показано наличие у Burkholderia sp. M38-VN3-2W последовательностей, гомологичных оригинальному гену tftA штамма Burkholderia cepacia AC1100 (Huong N.L. et al., 2007).
Разработанная Huong N.L. система геноспецифичных праймеров была применена для сравнения генетических структур, контролирующих деструкцию 2,4,5-Т в клетках изучаемых штаммов- деструкторов.
На рисунке 6 представлена электрофореграмма, полученная в ходе ПЦР анализа гомологов tftA гена Burkholderia cepacia AC1100.
Рисунок 6 – Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов гомологов гена tftA штаммов Citrobacter sp. 36 4CPA, R. planticola 36T, P. aeruginosa 36DCP.
Условные обозначения:
1 – маркер (Fermentas);
2 – Burkholderia sp. M38-VN3 2W, контроль;
3 – Citrobacter sp. 36 4CPA;
4 – R. planticola 36T;
5 – P. aeruginosa 36DCP;
6 – контроль (матрица – mQ).
По результатам проведенного анализа можно сделать вывод об отсутствии ПЦР-продуктов в случае использования в качестве матриц геномной ДНК исследуемых штаммов, а, следовательно, об отсутствии последовательностей гена tftA в геномах Citrobacter sp. 36 4CPA, R. planticola 36T и P. aeruginosa 36DCP.
Аналогичные результаты были получены для штаммов A. xyloxidans 33P, A. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S, A. irakense 38D, B.
cereus 33T, B. subtilis 16, B. salcis 38P, E. asburia 33D, E. cloacae 34 4CPA, G.
oxydans 2T, P. agglomerans 36P, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R.rubropertinctus 5D, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.
3.2. Дот-блот гибридизация препаратов геномных ДНК штаммов деструкторов и плазмиды pJP4 Cupriavidus necator JMP На примере плазмиды pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 Fukumori F. и Hausinger R. установили, что, несмотря на то, что наличие кластера tfd генов не определяет способность к деструкции 2,4,5-Т, фермент tfdA, кодируемый геном tfdA плазмиды pJP4, способен катализировать конверсию 2,4,5-Т до 2,4,5-трихлорфенола (Fukumori F., Hausinger R.P., 1993).
Известно, что плазмида pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 имеет в своем составе два гомологичных, но не идентичных генных кластера – tfdCIDIEIFI (tfdI-кластер) и tfdDIICIIEIIFII (tfdII-кластер) (Laemmli C.M. et al., 2000;
Itoh K. et al., 2002;
Ledger T. et al., 2006).
С учетом приведенных выше данных был проведен поиск гомологов кластера генов tfdA-F плазмиды pJP4 в геномах исследуемых штаммов.
На рисунке 7 представлены результаты дот-блот гибридизации препаратов геномных ДНК вновь выделенных штаммов с 32P - меченым препаратом плазмиды pJP4.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 К А Б В Рисунок 7 – Результаты дот-блот гибридизации препаратов геномных ДНК штаммов с препаратом 32P ДНК плазмиды pJP4.
Условные обозначения: К-контроль – препарат ДНК Cupriavidus necator JMP134;
А, Б, В – препараты ДНК штаммов A. globiformis 17S (1), B. cereus 33T (2), B. subtilis 16 (3), Citrobacter sp. 36 4CPA (4), G. oxydans 2T (5), P. fluorescens 39D (6), P. kilonensis 34T (7), R. planticola 33 4CPA (8), Stenotrophomonas sp.
33T(9) и Xanthomonas sp. 33DCP (10).
Принимая во внимание то, что такой же результат был обнаружен для препаратов ДНК штаммов A. xyloxidans 33P, Agromyces sp. 34DCP, A.
tumefaciens 21SG, A. irakense 38D, B. salcis 38P, E. asburia 33D, E. cloacae 4CPA, P. agglomerans 36P, P. aeruginosa 36DCP, P. putida 19S, R. rubropertinctus 5D, R. planticola 36D, R. planticola 36T и S. marcescens 22S, становится очевидным факт отсутствия в геномах вновь выделенных бактерий последовательностей, гомологичных модельной плазмиде pJP4.
Следует принять во внимание то, что ранее Smejkal С. с коллегами предпринимали попытку, оказавшуюся безуспешной, амплифицировать консервативные tfd-гены среди членов консорциума с представителями рода Stenotrophomonas, способного деградировать гербициды 4-(2,4 дихлорфенокси)бутиловую кислоту (2,4-DB) и 4-(4-хлор-2 метилфенокси)бутановую кислоту (MCPB) (Smejkal C.W. et al., 2003).
Наблюдения Smejkal С. и соавторов согласуются с полученными в данной работе результатами сравнительного анализа генетических структур вновь выделенного Stenotrophomonas sp. 33Т.
Таким образом, на основе результатов ПЦР-анализа проведенный с использованием геноспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК ДНК гибридизации можно сделать заключение о том, что в геномах исследуемых штаммов отсутствуют кластеры, гомологичные последовательностям tftA и tfdA, кодирующим субъединицу 2,4,5-Т-оксигеназы и 2,4-Д/-кетоглутарат диоксигеназу.
Приведенные данные делают очевидным то, что генетические системы, детерминирующие процессы деструкции 2,4,5-Т у изучаемых штаммов деструкторов, являются оригинальными.
Следует отметить, что результаты исследований генетических особенностей вновь выделенных штаммов хорошо согласуются со сведениями об особенностях метаболизма хлорированных ароматических производных, которые были описаны выше в данной работе для A. xyloxidans 33P, A.
tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S, A. irakense 38D, B.
cereus 33T, B. subtilis 16, B. salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, E. asburia 33D, E.
cloacae 34 4CPA, G. oxydans 2T, P. agglomerans 36P, P. aeruginosa 36DCP, P.
fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R. planticola 33 4CPA, R.
planticola 36D, R. planticola 36T, R. rubropertinctus 5D, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP, указывающими на то, что изучаемые штаммы выполняют оригинальные каталитические реакции конверсии моноароматических галогенидов.
Приведенный выше анализ детерминант деструкции хлорированных ароматических кислот, свидетельствует в пользу того, что генетические системы контроля катаболизма хлорированных ароматических соединений у вновь обнаруженных штаммов родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas отличаются от известных и обнаружены впервые.
4. Структурно-функциональные особенности плазмид штаммов деструкторов 4.1 Сравнительный анализ плазмид деструкторов Ранее было показано, что генетические системы катаболизма синтетических соединений, множественной устойчивости к антибиотикам, устойчивости к тяжелым металлам могут располагаться на плазмидах (El-Deeb A.B., 2001;
Ledger T. et al., 2006;
Ye J. et al., 2010). Плазмиды обеспечивают подвижность экологически важных групп генов как внутри клетки (между хромосомой и плазмидой), так и между разными видами через механизмы горизонтального переноса.
Одним из наиболее изученных примеров плазмид, несущих кластеры генов катаболизма ксенобиотиков, является плазмида pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 (Trefault N. et al., 2004).
Анализ плазмидного статуса вновь выделенных культур показал, что штаммы-деструкторы Citrobacter sp. 36 4CPA, R. planticola 33 4CPA, R.
planticola 36D, R. planticola 36Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33Т, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP обладают плазмидами На рисунке 8 приведены результаты фракционирования плазмидной ДНК штаммов Stenotrophomonas sp. 33Т, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.
– Рисунок 8 Электрофореграмма плазмидной ДНК штаммов Stenotrophomonas sp. 33Т, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.
Условные обозначения:
1 – маркер HindIII фрагменты ДНК фага с указанием размеров;
2 – препарат плазмиды Xanthomonas sp.
33DCP;
3 – препарат плазмиды P. kilonensis 34Т;
4 – препарат плазмиды Stenotrophomonas sp. 33Т.
По результатам электрофоретического анализа было сделано заключение о том, что клетки штаммов Stenotrophomonas sp. 33Т, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP несут плазмиды, которые были обозначены как pST33T, pPK34T и pXS33, соответственно.
С помощью ПДРФ-анализа было установлено, что размер плазмид pST33T Stenotrophomonas sp. и pPK34T P. kilonensis 34Т 33Т составляет около 27 т.п.н., а плазмиды pXS33 Xanthomonas sp. 33DCP – около 46 т.п.н.
В клетках R. planticola 33 4 CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36Т были обнаружены плазмиды, обозначенные как pRP33 4CPA, pRP36D и pRP36Т, соответственно (рис. 9).
A B 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 C 1 2 3 4 5 6 7 Условные обозначения:
1,2 – маркер – PstI- и HindIII фрагменты ДНК фага, с указанием размеров;
3,5,7– препараты плазмид pRP33 4CPA, pRP36D и pRP36T;
4,6,8– фрагменты плазмид pRP33 4CPA, р36D и р36T после рестрикции.
Рисунок 9 – Результаты электрофоретического фракционирования BamHI фрагментов (A), HindIII-фрагментов (B) и PstI-фрагментов (C) препаратов плазмид pRP33 4CPA, pRP36D и pRP36T.
Рамками показана область рестрикционного полиморфизма плазмид.
Проведенный RFLP-анализ показал, что все три плазмиды имеют BamHI-, HindIII- и PstI-сайты рестрикции, при этом у плазмид pRP33 4CPA и pRP36Т обнаруживались идентичные профили фрагментов ДНК, в то время как в структуре pRP36D имелись существенные отличия (рис. 9).
На основании полученных данных были определены размеры плазмид:
pRP33 4CPA и pRP36Т – около 110 т.п.н., а плазмиды pRP36D – около 127 т.п.н.
Клетки Citrobacter sp. 36 4CPA и S. marcescens 22S несли плазмиды рАН 36 4CPA и pSM 22S, размеры которых составляли 5,2 т.п.н. и 48 т.п.н., соответственно.
С целью локализации кластеров генов, детерминирующих деградацию хлорфеноксикислот, был использован метод элиминации плазмид, индуцированной обработкой клеток микроорганизмов ДНК – тропными агентами. В ходе сравнительных исследований было установлено, что с потерей плазмид клетки Citrobacter sp. 36 4CPA, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33Т, P.
kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP утрачивали способность использовать 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии.
Эти данные свидетельствуют о том, что детерминанты, контролирующие катаболизм хлорфеноксиуксусных кислот Citrobacter sp. 36 4CPA, P. kilonensis 34Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33Т и Xanthomonas sp. 33DCP, располагаются на плазмидах.
На основе полученных характеристик плазмиды рАН 36 4CPA, pSM 22S, pRP33 4CPA, pRP36D, pRP36Т, pST33T, pPK34T и pXS33 классифицированы как новые D-плазмиды бактерий.
4.2. Горизонтальный перенос плазмид и экспрессия функций катаболизма хлорфеноксикислот в других бактериальных хозяевах Результаты изучения способности плазмид pRP33 4CPA, pRP36D и pRP36Т к трансферу и экспрессии катаболических функций в различных хозяевах приведены таблице 3.
Из данных таблицы 3 следует, что конъюгативный перенос плазмид pRP33 4CPA и pRP36D в клетки родственного штамма R. planticola 36Т в модельной системе показал, что все трансконъюганты экспрессировали генотипы, соответствующие донорским плазмидам.
Сходный результат был получен и с использованием плазмид pRP33 4CPA, pRP36D, pRP36T для штамма G. oxydans 2T.
В тоже время переход плазмид pRP33 4CPA, pRP36D, pRP36T в клетки штаммов Citrobacter sp. 36 4CPA и S. marcescens 22S не наблюдался.
Обнаруженные данные свидетельствовали в пользу возможности трансфера катаболических плазмид pRP33 4CPA, pRP36D и pRP36T в клетки других штаммов путем конъюгации.
Следует отметить, что экспрессия катаболических генов деградации хлорфеноксиуксусных кислот и функций устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов в новом хозяине осуществлялась в полном объеме.
Таблица 3 – Результаты анализа конъюгативного переноса плазмид RP33 4CPA, pRP36D и pRP36Т в условиях чистой культуры Генотип ШТАММ- ШТАММ- Наличие трансформированных РЕЦИПИЕНТ ДОНОР трансконьюгантов клеток R. planticola kan+ tfd+, tft+, tcp+ + 4CPA R. planticola bio+cad+ 36Т R. planticola 36D + tfd+, tft+, tcp+ R. planticola 4CPA Citrobacter sp.
R. planticola 36D 36 4CPA R. planticola 36Т R. planticola 4CPA S. marcescens R. planticola 36D 22S R. planticola 36Т tet+ cob+, cad+ R. planticola + tfd+, tft+, tcp+ 4CPA cat+ cad+ G. oxydans 2T R. planticola 36D + tfd+, tft+, tcp+ tet+ arg+ R. planticola 36Т + tfd+, tft+, tcp+ Условные обозначения детерминант устойчивости:
- к антибиотикам: tet+ – к тетрациклину;
cat+ – хлорамфениколу;
kan+ – канамицину;
bio+ - биомицину;
к ионам тяжелых металлов: cob+ – к Co2+;
cad+ – Cd2+;
arg+ – Ag+.
В ходе работы была также проверена возможность передачи обнаруженных плазмид путем трансформации.
Из данных, приведенных в таблице 4, видно, что трансформированные клетки штамма E.coli HB 101 с приобретением плазмид рАН 36 4CPA и pSM22S приобретали способность к конверсии селективных ксенобиотиков, а именно, 2,4-Д и 2,4,5-Т.
Из данных табл. 4, также следует, что клетки штамма R. planticola 4CPA с приобретением плазмиды рАН 36 4CPA приобретали способность к конверсии 2,4-Д и 2,4,5-Т.
Таблица 4 – Результаты тестирования катаболической активности штаммов при трансформации рАН 36 4CPA и pSM22S СРЕДА М с добавлением ШТАММ ПЛАЗМИДА РЕЦИПИЕНТ 2,4-Д 2,4,5-Т рАН 36 4CPA + + pSM22S + + E.coli HB отсутствует (контроль) рАН 36 4CPA + + R. planticola 33 4CPA отсутствует (контроль) Условные обозначения: (+) - наличие роста, (–) - отсутствие роста Обретение способности использовать хлорфеноксиуксусные кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии означает, что свойство деструкции ксенобиотиков может быть реализовано в различных бактериальных хозяевах в случаях трансфера плазмид.
Полученные результаты указывают на возможность передачи среди бактериальных членов популяций генетических кластеров, контролирующих реакции катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, расположенных на плазмидах рАН 36 4CPA Citrobacter sp. 36 4CPA и pSM22S S. marcescens 22S (путем трансформации) и на плазмидах pRP33 4CPA, pRP36D и pRP36T штаммов R. planticola (путем конъюгации).
5. Результаты изучения возможности практического применения штаммов- деструкторов Результаты исследований, приведенные выше, указывают на целесообразность практического применения вновь выделенных штаммов, в частности, для очистки объектов, загрязненных фенолом и его галогенсодержащими производными, а также для создания in vitro новых штаммов, способных изменять свойства молекул хлорфеноксикислот в сторону их детоксикации и снижения устойчивости в окружающей среде.
5.1. Использование штаммов-деструкторов для ремедиации окружающей среды Перспективы использования штаммов-деструкторов в целях улучшения качества очистки промышленных стоков от фенолов были определены в ходе исследований, направленных на снижение содержания фенолов в стоках предприятий нефтехимического профиля.
В результате испытаний штаммов в условиях реальных сточных вод, характерных для нефтехимического производства Северного промышленного узла РБ, было обнаружено, что культуры A. globiformis 17S, B. cereus 34T, B.
subtilis 16, G. oxydans 2T и S. marcescens 22S способны эффективно снижать концентрацию фенола и его производных в условиях загрязненной водной среды и почвы.
Культура A. globiformis 17S проявила активность в условиях комплекса загрязнений сточных вод производства дубильных экстрактов ОАО «Дубитель» и ОАО «Ново-Уфимский НПЗ» (табл. 5).
Таблица 5 – Результаты анализа содержания фенолов в стоках ОАО «Новоуфимский НПЗ» и ОАО «Дубитель» при применении культуры A.
globiformis 17S ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ (СУТКИ) Пробы сточных вод Пробы сточных вод нефтехимического производства дубильных ХАРАКТЕРИСТИКА СТОКОВ производства ОАО экстрактов ОАО «Новоуфимский НПЗ» «Дубитель» 0 1 3 0 3 Содержание фенолов в 0,096 0,064 0,008 0,750 0,155 0, сточных водах, мг/л Содержание фенолов 100 33,3 11,6 100 20,6 9, от контроля, % Степень очистки, % 0 66,7 88,4 0 79,4 90, Заметное изменение содержания фенолов в сточных водах при использовании A. globiformis 17S наблюдалось после 3-х суток обработки.
Степень очистки сточных вод, достигаемая при применении штамма A.
globiformis 17S, составляла для стоков нефтехимического производства 88,4%, а производства дубильных экстрактов – 90,7%.
Культура B. subtilis 16 проявила активность в условиях сточных вод нефтехимического производства ОАО «Уфахимпром».
Таблица 6 – Результаты анализа содержания фенолов в стоках нефтехимического производства ОАО «Уфахимпром» при применении культуры B. subtilis ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ (СУТКИ) Пробы сточной воды ХАРАКТЕРИСТИКА Пробы сточной воды с добавлением СТОКОВ питательных солей 0 2 5 0 2 Содержание фенолов, 30,4 10,2 0,01 30,4 3,2 0, мг/л Содержание фенолов 100 33,6 0,03 100 10,5 0, от контроля, % 0 66,4 99,7 0 89,5 99, Степень очистки, % Из результатов, приведенных в таблице 6, видно, что степень очистки сточных вод от фенолов в течение 48 часов составила 66,4%, а к 5-м суткам экспозиции содержание фенолов падало более чем на 99%. Существенно улучшало эффективность процессов очистки добавление питательных солей.
Так, в течение 48 часов в условиях использования питательных солей уровень очистки в случае применения штамма B. subtilis 16 достигал 89,5%, а к концу срока (5 дней) стоки были освобождены от фенолов более чем на 99,9%.
Культура S. marcescens 22S была активна в реальных условиях сточных вод нефтехимического производства и производства дубильных экстрактов.
Таблица 7 – Результаты анализа содержания фенолов в стоках ОАО «Новоуфимский НПЗ» и ОАО «Дубитель» при применении культуры S.
marcescens 22S ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ (СУТКИ) Пробы сточных вод Пробы сточных вод ОАО ХАРАКТЕРИСТИКА СТОКОВ ОАО «Новоуфимский НПЗ» «Дубитель» 0 1 3 7 0 Содержание фенолов, 0,099 0,036 0,024 0,011 0,75 0, мг/л Степень очистки, % 0 63,5 76,7 88,4 0 87, Степень очистки сточных вод от фенолов, достигаемая при использовании штамма S. marcescens 22S, в течение 3 суток для стоков производства дубильных экстрактов составляла 87,3%, а при применении к стокам нефтехимического производства составляла 75,7% на 3-и сутки и 88,6% на 7-е сутки обработки (табл. 7).
Деградацию 2,4,5-Т в почве осуществляли культуры B. cereus 34T и G.
oxydans 2T.
Существенное изменение содержания 2,4,5-Т наблюдалось после 10– дней обработки почвы B. cereus 34T. Через 5 суток инкубации количество 2,4,5 Т уменьшалось на 35,8%, далее к 14-м суткам – примерно на 50% и впоследствии оставалось на этом уровне (табл. 8). Степень очистки почвы, достигаемая при использовании штамма G. oxydans 2T, составляла соответственно: 27,4% на 21-е сутки культивирования, 31,9% на 30-е сутки и около 66,5% на 48-е сутки.
Таблица 8 – Результаты анализа содержания 2,4,5-Т в почве при применении культуры B. cereus 34T и G. oxydans 2T ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ ПОЧВЫ, СУТКИ ХАРАКТЕРИСТИКА 1 5 10 14 21 30 ПОЧВЫ культура B. cereus 34T Содержание 2,4,5-Т 100 64,2 58,0 50,3 50,0 не опр. не опр.
в почве, мг/г Степень очистки 0 35,8 42,0 49,7 50,0 не опр. не опр.
к контролю, % культура G. oxydans 2T Содержание 2,4,5-Т в 100 95,0 87,6 85,0 72,6 68,1 33, почве, мг/г Степень очистки к 0 5,0 12,4 15,0 27,4 31,9 66, контролю, % Приведенное выше показывает, что применение культур B. cereus 34T и G. oxydans 2Т является перспективным для очистки почвы от 2,4,5-Т.
5.2. Использование штамма Bacillus subtilis 16 для создания штамма деструктора с заданными свойствами in vitro Создание рекомбинантного штамма-деструктора проводили путем клонирования детерминант деградации 2,4-Д штамма Bacillus subtilis 16 в составе вектора pBR322 в клетках E.coli HB101.
Рекомбинантные клетки Е.coli селектировали на жидкой среде М9, содержащей 2,4-Д в качестве единственного источника углерода и энергии.
Сравнительный анализ содержания 2,4-Д и продуктов ее деградации в пробах культуральной жидкости E.coli pMK 16 показал, что количество 2,4-Д к 14 суткам инкубации снижалось на 88,9%. Для штамма B. subtilis 16 к 14-м суткам инкубации концентрация 2,4-Д в культуральной жидкости снижалась примерно на 78% от начального уровня.
С использованием метода газо-жидкостной хроматографии и хромато масс-спектрометрии проведено сравнение продуктов метаболизма 2,4-Д, накапливаемых в культуральной жидкости B. subtilis 16, E.coli pBR322 и E.coli pMK16, и обнаружено их сходство, а именно, в качестве интермедиата штаммы образовывали 5-оксиметил-2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту.
Приведенные данные указывают на то, что штаммы E.coli pMK 16 и штамм B. subtilis 16 обладают соизмеримой деструктивной способностью в отношении 2,4-Д и образуют одинаковые интермедиаты конверсии.
Анализ структуры рекомбинантной плазмиды штамма E.coli рМК показал, что плазмида штамма E.coli рМК16 имеет размер 8,8 т.п.н. и состоит из векторной молекулы pBR 322 (А) и двух BamHI-фрагментов, размер которых составляет 3,1 т.п.н. (В) и 1,3 т.п.н. (С).
Новый рекомбинантный клон Е.coli с генотипом 2,4-Д+, был обозначен как штамм Е.coli рМК16.
На основе приведенных сведений, демонстрирующих примеры практического использования новых штаммов-деструкторов, становится возможным сформулировать область их применения в целом, а именно:
очистка/доочистка сточных вод предприятий химического и нефтехимического профиля от фенола и его хлорированных производных;
детоксикация и очистка почвы от фенола и его хлорированных производных в случаях локального загрязнения;
создание новых штаммов-деструкторов с заданными свойствами in vitro.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Присутствие в окружающей среде стойких синтетических соединений ароматического ряда создает одну из трудноразрешимых проблем в области поддержания качества среды обитания человека.
К настоящему времени сформировано представление о том, микроорганизмы, обладающие специфическими катаболическими способностями в отношении ксенобиотиков, могут использоваться для защиты и очистки среды в качестве действующих элементов биологических технологий нового поколения.
Вместе с тем, анализ результатов экспериментальных работ в области биоконверсии экотоксикантов обнаруживает слабую исследованность фундаментальных вопросов, связанных с описанием свойств отдельных культур, утилизирующих поллютанты, а также недостаточность знаний об организации и функционировании их консорциумов. Проявляется также неполное понимание сути механизмов биохимических превращений молекул загрязнителей, недостаточны сведения об особенностях генетического строения деструкторов.
В ходе настоящей работы из смешанных популяций почвенной биоты, подвергавшейся длительному воздействию техногенных факторов, были выделены новые бактериальные культуры, способные к ассимиляции фенола и его галогенидов.