Совершенствование методических подходов к оценке микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста
На правах рукописи
ВОРОШИЛИНА Екатерина Сергеевна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА 03.02.03 — микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Челябинск — 2012 1
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Сергеев Александр Григорьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Семенович доктор медицинских наук, профессор Зурочка Александр Владимирович доктор медицинских наук, профессор Савичева Алевтина Михайловна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, г. Оренбург
Защита состоится « » 2012года в _часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу:
454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Автореферат разослан «» 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, доцент Латюшина Лариса Сергеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования В настоящее время идет активное формирование предиктивной, персонифи цированной медицины, которая позволила бы минимизировать лекарственное вме шательство в организм человека, ограничиться корректируюшими мероприятиями, а при необходимости назначить строго индивидуальную терапию с учетом всех особенностей организма пациента. Смена медицинской парадигмы подразумевает изменение диагностического и клинического подходов к выявлению различных заболеваний, изучение с новых позиций особенностей функционирования орга низма, раннюю, доклиническую диагностику.
Современная клиническая лаборатория позволяет проводить комплекс ные, многофакторные, мультиплексные исследования. Основной проблемой по прежнему остается внедрение таких технологий в практическую медицину, по иск их места среди уже существующих диагностических алгоритмов и создание нормативной базы по их применению.
Одним из примеров такого современного комплексного подхода к изучению микробных сообществ является исследование микробиоценоза влагалища.
В настоящее время влагалище принято рассматривать как экосистему, обла дающую уникальным комплексом механизмов, обеспечивающим его резистент ность по отношению к чужеродным микроорганизмам и обеспечивающим репро дуктивное здоровье женщины. Вагинальная среда контролирует специфическую по составу микрофлору влагалища, а микрофлора, в свою очередь, формирует вагинальную среду (1997;
Буданов П.В., 2005;
Priestlly CFJ, Yamamoto T, 2009).
Совокупность микроорганизмов, обитающих в этой анатомической нише, принято именовать микробиоценозом влагалища, при этом качественный и количественный состав микрофлоры носит индивидуальный характер (Уварова Е.В., 2002;
Vsquez A., 2002;
Verstraelen H., 2009). Нормальная флора влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста представлена преимущественно видами рода Lactoba cillus. Защитная функция лактобацилл реализуется несколькими путями, главным их свойством является способность продуцировать молочную кислоту и перекись водорода (Eschenbach D.A., 1989;
Hawes S.E., 1996). 1Установлено, что некоторые виды лактобацилл обладают пониженной способностью к реализации защитных функций (Hiller S.L.;
1992;
Pavlova S.I., 2002;
Verhelst R., 2005).
Однако в составе микробиоценоза влагалища могут присутствовать и другие бактерии-продуценты молочной кислоты, которые принято расценивать как услов но-патогенные агенты (Megasphaera spp., Leptotrichia spp.), а некоторые однозначно ассоциируют с бактериальным вагинозом (Atopobium vaginae) (Плахова К.И., 2007;
Rodroguez J.M., 1999;
Fredericks D.N., 2005). Кроме перечисленных микроорга низмов в формировании вагинальной микробиоты принимают участие несколько десятков видов условно-патогенных облигатно-анаэробных и факультативно– анаэробных микроорганизмов, количество и роль которых в развитии патологии влагалища оценивают по-разному (Zhou X., 2004). К ассоциантам микробиоценоза влагалища относят генитальные условно-патогенные микоплазмы и грибы рода Candida, которые могут существовать при кислой рН влагалища и не вступают в конкуренцию с лактобациллами (Савичева А.М., 2004;
Babula O., 2003).
Возможности лабораторной оценки микробиоценоза влагалища до настоящего времени были ограничены применением микроскопического, бактериологического методов и ПЦР в качественном варианте. Каждый из этих методов, несмотря на наличие определенных плюсов, имеет значительные недостатки, которые не по зволяют с их помощью проводить комплексный анализ микрофлоры влагалища (Савичева А.М., 2008).
Появление ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР РВ) открыло принципиально новые возможности для комплексной оценки микроб ных сообществ влагалища. Помимо идентификации большинства представителей нормофлоры и условно-патогенных участников вагинального микробиоценоза, данный метод позволяет определить абсолютное количество всех выделенных микроорганизмов и оценить соотношение между нормофлорой и условно-пато генными микроорганизмами (УПМ). ПЦР-РВ позволяет также проводить геноти пирование основных видов вагинальных лактобацилл.
Развитие дисбиотических процессов во влагалище связывают с определенны ми изменениями преимущественно в местном иммунитете, накоплены убедитель ные данные об изменении содержания ряда цитокинов в вагинальном секрете при патологических процессах во влагалище (Witkin S.S., 1987;
Giraldo P., 1999;
Ghosh M., 2009;
King A.E., 2009). Полагают, что эти изменения объясняют трудности лечения хронически протекающих, рецидивирующих вагинальных инфекций.
Накоплены данные о наличии полиморфных аллелей генов, контролирующих экспрессию цитокинов, с которыми связывают изменение реактивности инди видуума (Barton P.T., 2003;
Genc M.R., 2004;
Novak R.M., 2007;
Han J.H., 2010).
Однако подлинные механизмы этих процессов недостаточно изучены, а данные о корреляции между наличием определенных генотипов и изменениями в микробио ценозе влагалища отсутствуют. Определение полиморфизмов генов, отвечающих за экспрессию цитокинов, также возможно проводить с помощью ПЦР-РВ.
Таким образом, возможности метода ПЦР-РВ на современном этапе откры вают перед исследователями ряд перспектив. Становится возможным получение комплексного описания здоровья человека и, в частности, состояния иммунной системы (генетические особенности), количественной оценки экспрессии генов (фенотипические особенности), описания взаимодействия макроорганизма с микроорганизмами, его окружающими (нормофлорой, условно-патогенной и па тогенной флорой), а также проведения генотипирования микроорганизмов.
Широкое распространение технологии ПЦР-РВ на территории России по зволяет считать метод универсальным и активно использовать в рутинной диа гностике, что дает преимущества при внедрении в практику новых пакетов лабо раторных исследований. Сегодня в России уже предлагаются пакеты исследований в формате ПЦР-РВ для оценки условно-патогенной микрофлоры влагалища, для генотипирования отдельных видов лактобацилл, для определения полиморфизмов генов ряда цитокинов. Таким образом, на единой технологической платформе становится возможным проведение комплексного изучения состояния влагалища как целостной экосистемы, в функционировании которой принимают участие как микроорганизмы, так и сам макроорганизм.
Однако внедрение ПЦР-РВ, как любого нового метода, в работу практиче ских лабораторий требует всестороннего анализа возможностей его применения.
Необходим сравнительный анализ диагностической ценности ПЦР-РВ с рутин ными методами лабораторной диагностики, в том числе микроскопическим и бактериологическим. Первоочередной задачей является формирование группы клинически здоровых женщин, так как без определения критериев нормы невоз можно интерпретация результатов у пациенток с инфекционно-воспалительной патологией влагалища. Как правило, именно создание группы нормы требует тщательного отбора. Не менее важно изучение микробиоценоза у пациенток с различной патологией влагалища с учетом данных других лабораторных методов.
Это позволит скорректировать существующие классификации патологических вариантов микробиоценоза влагалища с учетом возможностей ПЦР-РВ.
Таким образом, необходимо обследование различных по возрасту, иммуно инфекционному и репродуктивному статусу групп женщин методом ПЦР-РВ для получения комплексного описания микробиоценоза влагалища и выявления факторов, определяющих его формирование и нормальное функционирование.
Цель исследования:
Разработка критериев оценки результатов комплекса методов лабораторной диагностики микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста, включающих современные технологии молекулярно-биологического анализа.
Задачи работы:
1. Изучить микробиоценоз влагалища с использованием метода ПЦР-РВ у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста вне беремен ности и беременных.
2. Определить видовой состав лактобацилл и их значение в формировании вагинальной микрофлоры у женщин с нормальным и промежуточным состояниями микробиоценоза влагалища.
3. Дать комплексную оценку состояния вагинальной микрофлоры при по мощи ПЦР-РВ у женщин с воспалительными заболеваниями влагалища, связанными с условно-патогенной микрофлорой.
4. Изучить состояние микробиоценоза влагалища у ВИЧ-инфицированных женщин во время и вне беременности.
5. Определить частоту встречаемости полиморфных аллелей генов, от вечающих за экспрессию основных провоспалительных и противовос палительных цитокинов, у женщин с нормоценозом и пограничными состояниями вагинальной микрофлоры.
6. Определить микробные и иммуно-генетические факторы, способствую щие персистенции условно-патогенных микоплазм в составе вагинальной микробиоты у женщин с нормоценозом.
7. Разработать алгоритм диагностики инфекционно-воспалительных забо леваний влагалища, вызванных условно-патогенными микроорганизмами у пациенток репродуктивного возраста, с использованием ПЦР-РВ.
Научная новизна Впервые проведена комплексная оценка качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза с помощью метода ПЦР-РВ у женщин репродуктивного возраста во время и вне беременности. Показано, что различные варианты абсолютного или условного нормоценоза влагалища у практически здоровых женщин во время беременности представляют собой микробные со общества, устойчивые к внешним воздействиям, как по видовому составу, так и по количественному соотношению разных видов микроорганизмов.
По результатам исследования микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ установлено, что в формировании дисбиотических нарушений вагинальной микро флоры у женщин репродуктивного возраста в отсутствие безусловных патогенов ведущая роль принадлежит ассоциациям облигатно-анаэробных микроорганизмов.
Показано, что персистенция Ureaplasma spp. и Candida spp. в диагностически значимых количествах характерна для микробиоценоза влагалища с преоблада ющей нормофлорой, в то время как Mycoplasma spp. персистирует в условиях доминирования облигатно-анаэробных микроорганизмов в составе вагинальной микробиоты.
Определена частота встречаемости шести видов лактобацилл, обитающих во влагалище женщин репродуктивного возраста с преобладающей нормофлорой в составе микробиоценоза (на примере популяции г.Екатеринбурга). Установлено, что доминирующими видами являются L.crispatus и L.iners (43,9% и 38,6% соот ветственно).
Впервые определена частота носительства полиморфизмов генов провоспа лительных и противовоспалительных цитокинов у пациенток, состояние микро биоценоза влагалища которых соответствовало критериям абсолютного или условного нормоценоза.
Показана взаимосвязь между видовым составом нормофлоры, наличием условно-патогенных микоплазм в составе вагинальной микробиоты и индиви дуальным генетическим профилем женщин. Установлено, что наличие «про воспалительного генотипа» коррелирует с присутствием L.crispatus в качестве доминирующего вида лактофлоры во влагалище и отсутствием Ureaplasma spp.
в диагностически значимом количестве, а «противовоспалительный генотип» достоверно чаще ассоциируется с присутствием уреаплазм и L.iners в качестве доминирующего вида лактобацилл.
Показано, что микробиоценоз влагалища у ВИЧ-инфицированных женщин репродуктивного возраста как во время, так и вне беременности характеризу ется преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и персистенцией Mycoplasma spp.Установлено, что на фоне антиретровирусной терапии у ВИЧ инфицированных женщин происходит восстановление соотношения между нор мофлорой и условно-патогенными микроорганизмами.
Практическая значимость работы Разработан принципиально новый комплексный подход к диагностике дисбиотических нарушений микрофлоры влагалища на базе единой технологической платформы (ПЦР-РВ).
В результате клинической испытаний набора реагентов «Фемофлор» (производства ООО «НПО ДНК-Технология») для количественной ПЦР в реальном времени показана высокая диагностическая ценность тест-системы для оценки микробиоценоза влагалища у всех категорий женщин репродуктивного возраста.
Пересмотрена классификация состояний микробиоценоза влагалища с учетом возможностей метода ПЦР-РВ.
Разработаны критерии нормы и определены референсные интервалы содержания отдельных групп микроорганизмов в составе вагинальной микрофлоры при оценке вагинального микробиоценоза методом ПЦР-РВ для женщин репродуктивного возраста.
Разработан алгоритм клинико-лабораторного обследования пациенток с патологией влагалища. Определена область применения метода ПЦР РВ в диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища, ассоциированных с условно-патогенной микрофлорой, у женщин репродуктивного возраста.
Разрабатана классификация вариантов лабораторных заключений о состоянии микробиоценоза влагалища при исследовании методом ПЦР-РВ.
Предложен комплексный подход для оценки индивидуальных генетических особенностей функционирования системы цитокинов с учетом разнонаправленности их эффектов.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Определяющей характеристикой нормального микробиоценоза вла галища у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста является количественное соотношение между нормофлорой и облигатными анаэро бами, которое характеризуется присутствие лактобацилл в количестве более 80% от общей бактериальной массы и доминированием среди них L.crispatus.
Состояние абсолютного и условного нормоценоза во время беременности представляет собой устойчивую систему, на которую экзогенные факторы, в том числе и лекарственная терапия, не оказывают существенного влияния.
2. Микроскопическая картина мазка вагинального отделяемого у па циенток с клиническими признаками патологии влагалища в подавляющем большинстве случаев либо неинформативна, либо не позволяет оценить степень тяжести дисбиоза, в то время как с помощью ПЦР-РВ удается установить этиологию патологического процесса более чем в 80% случаев.
3. Установлено, что в формировании дисбиоза вагинальной микро флоры у женщин репродуктивного возраста ведущая роль принадлежит ассоциациям облигатно-анаэробных микроорганизмов, при этом структура и состав микробиоценоза влагалища значительно различаются у пациенток с неспецифическим вагинитом, бактериальным вагинозом и дисбиозом не уточненной этиологии.
4. Видовой состав лактобацилл и количество Ureaplasma spp. в составе вагинального микробиоценоза коррелируют с определенными сочетаниями нормальных и мутантных генов про- и противовоспалительных цитокинов.
Установлено, что отсутствие субъективных признаков патологии влагали ща у пациенток при наличии Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/ мл достоверно чаще сочетается с «противовоспалительным» генотипом организма-хозяина, что может свидетельствовать в пользу относительной толерантности местного иммунитета к персистентной инфекции.
5. Микробиоценоз влагалища ВИЧ-инфицированных женщин ха рактеризует высокая частота дисбиотических нарушений, носительство Mycoplasma spp. и Candida spp. в диагностически значимых количествах при отсутствии клинических признаков патологии влагалища. У ВИЧ инфицированных женщин, получающих антиретровирусную терапию, отме чается увеличение доли нормофлоры и уменьшение количества генитальных микоплазм в составе вагинальной микробиоты.
Внедрение результатов исследования Результаты работы используются в учебном процессе кафедры микробиоло гии, вирусологии и иммунологи, кафедры акушерства и гинекологии педиатриче ского факультета, кафедры клинической лабораторной диагностики и бактерио логии ФПК и ПП ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России.
Метод оценки биоценоза влагалища с помощью количественной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени внедрен в следующих лечебных учреждениях г.Екатеринбурга: ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздравсоцразвития России, ООО «Медико-фармацевтический центр «Гармония», ФБГУ Екатеринбургский клинико-диагностический центр, ООО Медицинский центр «Шанс».
Проведена клиническая апробация тест-системы Фемофлор с целью оценки диагностической чувствительности и специфичности теста для различных групп пациенток. По результатам клинической апробации написана серия статей и раз работан алгоритм интерпретации результатов лабораторного исследования микро биоценоза влагалища с помощью теста «Фемофлор».
По результатам работы разработаны и утверждены методические рекомендации для врачей акушеров-гинекологов, дерматовенерологов и врачей клинической лабораторной диагностики.
Апробация работы Основные результаты работы представлены на: межрегиональной научно практической конференции «Современные технологии и методы лабораторной диагностики в дерматовенерологии» (Екатеринбург, 2008);
всероссийской телекон ференция «Новый способ лабораторной диагностики урогенитальных инфекций.
Проблемы и пути решения» (Москва—Санкт-Петербург—Ростов-на-Дону—Екате ринбург—Новосибирск—Казань—Хабаровск, 2008);
второй междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктив ное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» в рамках Второго Международного медицинского Форума «Индустрия здоровья» (Москва, 2009);
I Конгрессе акушеров-гинекологов Урала с международным участием «Высоко технологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2009);
городской научно-практической конференции «Патология вульвы, влагалища и шейки матки: междисциплинарная проблема» (Екатеринбург, 2010);
городской научно-практической конференции «Бактериаль ный вагиноз — современный подход к диагностике и лечению» (Екатеринбург, 2010);
IV Региональном научном форуме «Дитя и мать», 2010);
VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» (Москва, 2010);
I международной конференции «Инфекции и инфекционный контроль в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2011);
всероссий ской конференции «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медици не» (Москва, 2011);
IV междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Москва, 2011), конгрессе «Мать и Дитя» (Геленджик, 2011).
Публикации По теме диссертации опубликовано 31 научная работа, в том числе 15 публи каций в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, за ключения, выводов, указателя литературы. Работа изложена на 302 страницах, содержит 48 таблиц и 63 рисунка. Объем цитируемой литературы включает наименований, в том числе 90 отечественных и 325 иностранных автора.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Группы обследованных женщин В период с 2002 по 2010 гг. на базе ООО Медико-фармацевтический центр «Гармония» (г.Екатеринбург) и ГБУЗ СО «Свердловский областной центр по про филактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» (г.Екатеринбург) было обследовано 1486 женщин в возрасте от 18 до 45 лет. Применительно к целям и задачам исследования были сформированы три основные группы сравнения в зависимости от клинического статуса, возраста, диагноза, ВИЧ-статуса, данных лабораторных исследований (рисунок 1.).
В группу I вошли 1192 женщины репродуктивного возраста (18-45 лет), которые были разделены на две подгруппы с точки зрения наличия или отсутствия клини ко-лабораторных признаков инфекционно-воспалительной патологии влагалища.
В группу IA были включены 460 клинически здоровых женщин, в том числе женщин вне беременности и 230 — беременных. Критерии включения: отсутствие объективных и субъективных признаков патологии влагалища, нормоценоз по результатам микроскопического исследования, отсутствие облигатно патогенных возбудителей ИППП, сифилиса, ВИЧ-инфекции, отсутствие системной или мест ной антибактериальной терапии в течение 4-х предшествующих обследованию недель. В группу IБ были включены 732 пациентки с клиническими и/или микро скопическими признаками патологии влагалища. Критерии исключения: наличие облигатно патогенных возбудителей ИППП, сифилиса, ВИЧ-инфекции, получение системной или местной антибактериальной терапии в течение 4-х предшествующих обследованию недель.
В группу II вошли 326 беременных женщин, в зависимости от срока геста ции на момент обследования все пациентки были разделены на три подгруппы.
В подгруппу IIА были включены 303 женщины, обследованные в I триместре (до 14 недель включительно), в подгруппу IIБ вошли 144 женщины во II триместре (15-28 недель), в подгруппу IIВ —119 беременных в III триместре (29-36 недель).
В том числе 119 беременных были обследованы три раза в течение беременности — в первом, втором и третьем триместрах беременности В группу III вошли 196 ВИЧ-инфицированных пациенток репродуктивного возраста, в том числе 90 вне беременности (группа IIIA) и 106 беременных (группа IIIБ). Критерии исключения: наличие облигатно патогенных возбудителей ИППП, сифилиса, получение системной или местной антибактериальной терапии в тече ние 4-х предшествующих обследованию недель.
Всем пациенткам было проведено микроскопическое исследование вагиналь ного отделяемого, исследование микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ.
Микроскопическое исследование Микроскопию вагинального отделяемого проводили в препаратах, окрашен ных метиленовым синим и по Романовскому-Гимзе. При оценке микроскопиче ской картины принимали во внимание количество и тип эпителиальных клеток, количество лейкоцитов, характер микрофлоры. Состояние микробиоценоза влага лища по результатам микроскопического исследования оценивали в соответствии с классификацией Е.Ф. Кира (2001).
1. Нормоценоз, характеризующийся доминированием лактобациллй, от I II III (18- (n- IA IIIA I N=303 N= N= III II N= N= III N= Рисунок 1. Распределение обследованных женщин по группам (1486 человек) сутствием грамотрицательной микрофлоры, спор и мицелия дрожжеподобных грибов, наличием единичных лейкоцитов и «чистых» эпителиальных клеток, со ответствующих фазе менструального цикла.
2. Промежуточный тип мазка характеризуется умеренным или сниженным количеством лактобацилл, наличием кокков. Обнаруживаются лейкоциты, моно циты, макрофаги, эпителиальные клетки.
3. Дисбиоз влагалища, выражающийся в незначительном количестве или полном отсутствии лактобацилл, обильной полиморфной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой микрофлорой;
наличием «ключевых клеток». Количество лейкоцитов вариабельно, отмечается отсутствие или неза вершенность фагоцитоза.
4. Вагинит (воспалительный тип мазка) — полимикробная картина мазка с большим количеством лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, отмечает ся выраженный фагоцитоз. При обнаружении гонококков, трихомонад, мицелия, псевдогифов, спор выставляется соответствующий этиологический диагноз. В случае отсутствия этиологически значимых микроорганизмов при таком варианте микроскопической картине пациенткам ставят диагноз неспецифического вагинита.
Молекулярно-биологические исследования Оценка микробиоценоза влагалища методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени Материал для исследования микробиоценоза влагалища и генотипирования лактобактерий забирали из заднебокового свода влагалища с помощью урогени тальных зондов.
Для оценки биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ использовали набор реа гентов Фемофлор (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва). Всего было изучено 1807 вагинальных образцов.
Набор реагентов Фемофлор предназначен для выявления ДНК условно-пато генных микроорганизмов, ДНК лактобацилл и геномной ДНК человека (в качестве контроля взятия биологического материала). Данное исследование предназначе но для исследования качественного и количественного состава микробиоценоза урогенитального тракта. Результаты количественной оценки выражали в геном эквивалентах на 1 мл (ГЭ/мл).
Для оценки видового состава нормофлоры провели определение количества Lactobacillus spp. и генотипирование шести видов лактобактерий (L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.johnsonii, L.vaginalis) методом ПЦР-РВ с исполь зованием тест-систем для научного применения (OOO «НПО ДНК-Технология», Москва). Для анализа были отобраны только те пробы, в которых сумма всех выде ленных видов лактобацилл была сопоставима с общим количеством определенных Lactobacillus spp. и составляла не менее 70%. Были исследованы 114 вагинальных проб у женщин репродуктивного возраста, состояние микробиоценоза влагалища которых соответствовало критериям абсолютного и условного нормоценоза.
Определение аллельных вариантов генов, ответственных за продуцирование провоспалительных и противовоспалительных цитокинов Для определения аллельных вариантов генов системы цитокинов получали венозную кровь в вакуумные пробирки с ЭДТА. Типирование полиморфизмов генов, ассоциированных с системой провоспалительных (IL-1, IL-2, IL-6, IL-18, TNF) и противовоспалительных (IL-1RN, IL-4, IL-10) цитокинов, проводили ме тодом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени на реагентах и оборудовании производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Москва).
Для получения ДНК из анализируемого материала использовали комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» или «ПРОБА-РАПИД ГЕНЕТИКА» (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва). Было исследовано образцов ДНК женщин репродуктивного возраста, состояние микробиоценоза влагалища которых соответствовало критериям абсолютного и условного нормо ценозов.
Статистические методы Статистическую обработку данных проводили с помощью статистическо го пакета SPSS Statistics версии 17.0 и свободно распространяемого продукта WINPEPI версия 9.7. Исследуемые выборки не подчиняются закону нормального распределения. В качестве меры центральной тенденции количественных при знаков выбрана медиана (Ме), а в качестве интервальной оценки — верхний и нижний квартили, указанный в виде 5%, 25%,75% и 95% процентилей Визуализацию распределения параметров в группах проводили с помощью соот ветствующих частотных гистограмм. Для качественных переменных рассчитывались аб солютные и относительные (процентные) величины. Минимальный размер выборки был рассчитан с помощью номограммы Альтмана. Для оценки достоверности различий в группах применяли непараметрические критерии: 2, точный критерий Фишера (), критерий Манна Уитни (z), критерий Вилкоксона (Z). Причинно-следственные связи определялись в ходе корреляционного анализа Спирмена (rs). Статистически значимыми считали различия между сравниваемыми рядами с уровнем вероятности 95% (р0,05). При составлении диагности ческой таблицы применялся последовательный анализ, разработанный А. Вальдом. Для расчета чувствительности, специфичности прогностических признаков, прогностической ценности положительного результата теста, отрицательного результата теста выстраивалась четырехпольная таблица с последующим определением показателей.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Алгоритм формирования заключения по результатам исследования микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ В соответствии с алгоритмом по результатам исследования микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ формулировали следующие варианты заключений (рисунок 2):
— Абсолютный нормоценоз — доля нормофлоры более 80% в составе микробиоценоза, Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma spp. менее ГЭ/мл.
— Условный нормоценоз — доля нормофлоры более 80% в составе микро биоценоза, Candida spp., Ureaplasma spp. или Mycoplasma spp. более 104 ГЭ /мл.
— Умеренный дисбиоз — доля нормофлоры от 20 до 80% в составе микро биоценоза.
— Умеренный аэробный дисбиоз — доля факультативных анаэробов более 10%, а облигатных анаэробов менее 10% в составе микробиоценоза.
— Умеренный анаэробный дисбиоз — доля облигатных анаэробов более 10%, а факультативных анаэробов менее 10% в составе микробиоценоза.
— Умеренный аэробно-анаэробный дисбиоз — доля факультативных и об лигатных анаэробов более 10% в составе микробиоценоза.
— Выраженный дисбиоз — доля нормофлоры менее 20% в составе микро биоценоза.
— Выраженный аэробный дисбиоз — доля факультативных анаэробов более 10%, а облигатных анаэробов менее 10% в составе микробиоценоза.
— Выраженный анаэробный дисбиоз — доля облигатных анаэробов более 10%, а факультативных анаэробов менее 10% в составе микробиоценоза.
— Выраженный аэробно-анаэробный дисбиоз — доля факультативных и облигатных анаэробов более 10% в составе микробиоценоза.
Характеристика качественного и количественногосостава микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста Клинически здоровые женщины, включенные в группу IА, были разделены на две равные по численности подгруппы на основании наличия или отсутствия беременности на момент обследования. Такое разделение представлялось необходимым с целью выявления особенностей микробиоценоза влагалища во время беременности.
Микробиоценоз влагалища у клинически здоровых женщин: что есть норма?
При обследовании клинически здоровых женщин репродуктивного возрас та вне беременности (N=230) методом ПЦР-РВ было установлено, что состояние микробиоценоза влагалища соответствовало критериям абсолютного нормоце ноза у 128 (55,7%), условного нормоценоза — у 74 (32,2%) пациенток. Таким Рисунок 2. Алгоритм формирования заключения по результатам лабораторного исследо вания микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ образом, у большинства женщин выявляли варианты микробиоценоза влагалища с сохраненной нормофлорой (Рисунок 3). Условный нормоценоз в 68,9% случаев был обусловлен присутствием Ureaplasma spp. в количестве 104 ГЭ/мл, в 25,7% — Candida spp., в 5,4% одновременно выявляли Ureaplasma spp. и Candida spp.в количестве 104 ГЭ/мл.
3% 3% 100% 9% 90% 33% 80% 32% 70% Выраженный дисбиоз 60% Умеренный дисбиоз 50% Условный нормоценоз 40% 63% Абсолютный нормоценоз 56% 30% 20% 10% 0% Репродуция Беременные (N=230) (N=230) Рисунок 3. Характеристика микробиоценоза влагалища у клинически здоровых женщин — группа «норма» (N=460) Общая бактериальная масса (ОБМ) и количество Lactobacillus spp. у небе ременных женщин репродуктивного возраста колебались в достаточно широких пределах — от 105,4 до 108,5 ГЭ/мл. Тем не менее, доля лактобацилл от общего количества выделенных бактерий у 90% обследованных женщин составляла от 55,5 до 99,9% (медиана равна 99,6). Количество факультативных и облигатных анаэробов отличалось от количества лактобацилл более чем на два порядка, а их доля составляет 0,03 (0,0008—3,1)% и 0,26 (0,006—38,0)% от суммы всех выделенных микроорганизмов соответственно. Наиболее высоких значений до стигает количество двух групп микроорганизмов: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. и Eubacterium spp. У абсолютного большинства женщин эти микроорганизмы обнаруживали в количестве от 102 до 105 ГЭ/мл. При этом у 14,3% женщин количество Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. превышало 105 ГЭ/мл, а у 20,9% женщин были выявлены Eubacterium spp.
в количестве более 105 ГЭ/мл.
Обращает на себя внимание тот факт, что Atopobium vaginae, который рас сматривают как маркер бактериального вагиноза наравне с Gardnerella vaginalis, выявляли во влагалище здоровых женщин гораздо реже (у 30,0% женщин этот микроорганизм не обнаружен) и в меньшем количестве (медиана — 102 ГЭ/мл).
Лишь у 5,2% женщин количество Atopobium vaginae было 104 ГЭ/мл и выше. Та ким образом, Atopobium vaginae, следует расценивать как более специфический маркер бактериального вагиноза по сравнению с Gardnerella vaginalis.
В группу клинически здоровых беременных вошли 230 женщин в возрасте 19—33 лет (средний 27 ± 3,2), в том числе 140 женщин в первом триместре (4– недель беременности), 50 во втором триместре (13–28 недель беременности), женщин — в третьем триместре (29–36 недель беременности).
У большинства клинически здоровых беременных выявляли варианты микро биоценоза влагалища с сохраненной долей нормофлоры: абсолютный нормоценоз выявили у 146 (63,5%) женщин, условный нормоценоз — у 76 (33,04%) женщин (Рисунок 2). Дисбиотические нарушения у женщин этой группы диагностировали статистически значимо реже, чем в группе небеременных (у 8 (3,4%) женщин, р=7,5*10,-4). При этом у 7 (3%) беременных состояние биоценоза влагалища соот ветствовало критериям умеренного дисбиоза и только у одной (0,4%) — критериям выраженного дисбиоза.
ОБМ у 90% обследованных беременных женщин находилась в диапазоне от 10 до 108,5 ГЭ/мл, причем Lactobacillus spp. составляли 99,8% от суммы выде 6, ленных бактерий. Количество определяемых групп облигатных и факультативных анаэробов отличалось от количества лактофлоры на 4–5 порядков. Статистически значимо ниже было количество Eubacterium spp. по сравнению с группой небе ременных (р=2,3*10-3). Количества остальных групп микроорганизмов не разли чались у беременных и небеременных женщин. Анализ частоты встречаемости условно-патогенных участников микробиоценоза влагалища в диагностически значимых количествах также продемонстрировал отсутствие значимых разли чий с группой небеременных женщин. Таким образом, выявленные различия в качественном и количественном составе микробиоценоза влагалища между кли нически здоровыми беременными и небеременными женщинами нельзя признать существенными. Это позволяет предполагать, что состав вагинальной микрофлоры у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста значимо не меняется во время беременности.
Вклад отдельных групп микроорганизмов в фо рмировании микробиоценоза влагалища у клинически здоровых женщин Анализ участия группы облигатных анаэробов в формировании вагинального биоценоза выявил следующие закономерности. Микроорганизмы, относящиеся к группам G.vaginalis spp., Eubacterium spp, Mobiluncus spp., Clostridium spp. выяв лены у большинства женщин репродуктивного возраста. При этом более высокие значения характерны для G.vaginalis и Eubacterium spp. Частотное распределение этих микроорганизмов по абсолютному количеству не различалось для беремен ных и небеременных. До 5% небеременных женщин репродуктивного возраста демонстрировали наличие Eubacterium spp. и Gargnerella в количестве 106 ГЭ/мл, другие анаэробы в таких количествах не обнаруживали.
Clostridium spp. и Peptostreptococcus spp. выявляли у большинства женщин репродуктивного возраста в умеренных количествах (102–104 ГЭ/мл). У боль шинства женщин репродуктивного возраста Megashpaera spp. присутствовала в незначительных количествах (102–103 ГЭ/мл).
Atopobium vaginae присутствовал в небольших количествах (102–103 ГЭ/мл), причем у небеременных женщин его обнаруживали в два раза реже, чем у бере менных. У 5% женщин в первом триместре беременности этот микроорганизм определяли в количестве от 104,1 до 104,8 ГЭ/мл, у 16% женщин в первом триместре Atopobium vaginae отсутствовал. По мере прогрессирования беременности увели чивается доля женщин, у которых этот микроорганизм отсутствовал, достигая во втором триместре 19%, а в третьем — 30%. У 79% женщин во втором триместре беременности и у 70% женщин в третьем Atopobium vaginaе присутствовал в ко личествах менее 103 ГЭ/мл.
Микоплазма оказалась редкой находкой как у женщин вне беременности, так и у беременных. У беременных этот микроорганизм выявили в 12% случаев, у большинства из них количество микоплазмы не превышало 102 ГЭ/мл.Обнаружение этого микроорганизма в единичных случаях и в незначительном количестве ха рактеризует микоплазму как редкого участника вагинального биоценоза у кли нически здоровых женщин. Уреаплазмы обнаруживали у женщин обеих групп.
При этом доля женщин, у которых количество уреаплазм было более 104 ГЭ/мл, была значительной, в том числе у 22,8% беременных в первом триместре. Грибы рода Candida присутствовали у большинства обследованных женщин в количе ствах более 103 ГЭ/мл. У 10% небеременных женщин грибы выявляли и в более значительных количествах: 104–105 ГЭ/мл. Аналогичные данные были получены и в группе беременных: в количестве более 104 ГЭ/мл грибы рода Candida были обнаружены у 10,7% женщин в первом триместре, у 9,3% женщин во втором три местре и у 8,1% — в третьем.
Изученные группы микроорганизмов участвуют в формировании вагиналь ного микробиоценоза женщин репродуктивного возраста независимо от того, бе ременна женщина или нет. Проведенное при помощи молекулярно-генетических методов исследование не противоречит существующим представлениям о струк туре вагинальных микробиоценозов, а значительным образом дополняет наши представления о качественном и количественном составе микробиоты. Высокая чувствительность метода позволяет идентифицировать даже незначительные ко личества микроорганизмов, составляющих вагинальный микробиоценоз.
Таким образом, определяющей характеристикой нормального микро биоценоза является количественное взаимоотношение между нормальной флорой (лактобациллами) и условно-патогеными микроорганизмами, которое в репродуктивном возрасте определяется доминированием Lactobacillus spp.
Применение молекулярно-генетических методов для выявления Atopobium vaginae показало, что данный микроорганизм, в отличие от Gardnerella vagi nalis, чрезвычайно редко является компонентом нормального микробиоценоза.
У клинически здоровых женщин всех групп показана незначительная пред ставленность факультативно-анаэробных микроорганизмов (таких как стафи лококки и стрептококки) по сравнению с облигатно-анаэробными микроорга низмами в биоценозе влагалища. У каждой пятой женщины репродуктивного возраста выявляли уреаплазму в количестве более 104 ГЭ/мл. У 10% женщин репродуктивного возраста без клинических признаков дисбиотических про цессов во влагалище были выявлены дрожжеподобные грибы в количествах более 10 4 ГЭ/мл. Учитывая отсутствие каких-либо субъективных или объ ективных признаков инфекционно-воспалительной патологии влагалища, данное состояние можно рассматривать как вариант нормального микробио ценоза. Вопросы стабильности во времени и устойчивости к внешним воз действиям такого микробиоценоза требуют дополнительного исследования.
Состояние микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста с инфекционно-воспалительной патологией влагалища В группу патологии (группа IБ) вошли 732 женщины репродуктивного воз раста, у которых присутствовали субъективные или объективные признаки ин фекционно-воспалительной патологии влагалища и/или выявляли патологический вариант вагинального мазка при микроскопическом исследованнии. В качестве группы сравнения рассматривали 460 клинически здоровых женщин репродук тивного возраста (группа IА).
Субъективными признаками, указывающими на патологию влагалища, счи тали жалобы пациентки на патологические бели, в том числе с запахом, ощуще ния зуда и жжения во влагалище, сухость во влагалище, диспареунию. Жалобы предъявляли 562 (76,8%) обследованных женщин. У 526 (71,8%) пациенток отмечали объективные признаки патологии влагалища: патологические бели, в том числе с запахом, гиперемию слизистой влагалища. У 431 (58,9%) женщины присутствовали как субъективные, так и объективные признаки патологии влагалища. 75 (10,2%) женщин на момент осмотра не имели субъетивных или объективных признаков патологии влагалища, однако при микроскопии у них выявили патологические варианты мазка. На основании исследования микроскопической картины эти пациентки были также отне сены в группу патологии.
По результатам микроскопического исследования мазок, характерный для вагиноза, выявили у 94 (12,8%) женщин;
мазок, характерный для вагинита, имел место у 184 (25,2%) пациенток, в том числе у 72 (9,9%) диагностировали кандидозный вагинит, у 112 (15,3%) — неспецифический вагинит. Промежу точный вариант мазка присутствовал у 341 (46,6%) пациентки. Нормоценоз по результатам микроскопического исследования диагностировали у 113 (15,4%) женщин, эти пациентки были отнесены в группу патологии только на осно вании субъективных и объективных признаков патологии влагалища. Таким образом, только в 22,7% случаев при микроскопическом исследовании была установлена этиология патологического процесса во влагалище: в 12,8% вы явили микроскопическую картину, характерную для бактериального вагиноза, в 9,9% — для кандидозного вагинита. Следовательно, в 77,3% заключения микроскопического исследования не содержат необходимой информации для клинициста, что затрудняет принятие решения относительно дальнейшей тактики ведения пациентки.
По результатам исследования методом ПЦР-РВ у 142 (19,3%) пациенток состояние микробиоценоза влагалища соответствовало критериям абсолют ного нормоценоза, у 238 (32,5%) обследованных — условного нормоцено за (рисунок 4). В том числе у 135 (18,4%) выявили условный нормоценоз, ассоциированный с условно-патогенными микоплазмами, у 58 (7,9%) — с Candida spp., у 45 (6,2%) женщин — обусловленный смешанной микоплаз менно-грибковой инфекцией. Критериям умеренного дисбиоза соответство вало состояние микробиоценоза влагалища у 108 (14,8%) пациенток, у (33,4%) женщин диагностировали выраженный дисбиоз. Таким образом, при исследовании микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ в 80,7% случаев был выявлен этиологически значимый микробный фактор развития патоло гического процесса во влагалище.
Рисунок 4. Структура микробиоценоза влагалища по результатам исследования методом ПЦР-РВ у пациенток репродуктивного воз раста вне беременности с патологией влагалища (группа II, N=732) Однако прямое сравнение микроскопического метода и метода ПЦР-РВ невозможно, так как заключения по результатам исследования учитывают различные факторы. При микроскопическом исследовании оценивают ин тенсивность воспалительной реакции во влагалище путем подсчета коли чества лейкоцитов в поле зрения и расчета индекса отношения количества лейкоцитов к количеству эпителиальных клеток в поле зрения, что невоз можно при исследовании в ПЦР-РВ. ПЦР позволяет идентифицировать большинство участников микробиоценоза и оценить их количество и долю в составе биоценоза. При анализе структуры микробиоценоза методом ПЦР-РВ были выявлены значительные различия между пациентками в зависимости от типа микроскопической картины, что потребовало разде лить всех пациенток группы IБ на 5 подгрупп на основании исследования микроскопической картины.
Подгруппа 1 —пациентки с нормоценозом по данным микроскопического исследования и клиникой инфекционно-воспалительной патологии влагалища (N=113).
Подгруппа 2 — пациентки с дисбиозом неуточненной этиологии (N=341).
Подгруппа 3 — пациентки с микроскопической картиной, соответствующей БВ (N=94).
Подгруппа 4 — пациентки с микроскопической картиной, соответствующей НВ (N=112).
Подгруппа 5 — пациентки с микроскопической картиной, соответствующей кандидозному вульвовагиниту (КВ) (N=72).
Различные виды дисбиоза влагалища встречаются у большинства пациенток с клиническими признаками патологии влагалища независимо от типа мазка, при этом наиболее выраженные дисбиотические нарушения по данным ПЦР-РВ до стоверно чаще сопутствуют промежуточному типу мазка (рисунок 5).
100% 4% 10% 90% 13% 23% 8% 36% 80% 15% 70% 68% 60% 18% 61% 60% 50% 42% 40% 24% 30% 20% 32% 23% 22% 22% 22% 10% 0% 0% Нормоценоз Промежуточный Вагиноз (n=94) Неспецифический Кандидозный (n=113) мазок(n=341) вагинит (n=112) вагинит (n=72) Абсолютный нормоценоз Условный нормоценоз Умеренный дисбиоз Выраженный дисбиоз Рисунок 5. Структура микробиоценоза влагалища по результатам ПЦР-РВ у пациенток репродуктивного возраста вне беременности в зависимости от микроскопической картины вагинального отделяемого У пациенток с промежуточным типом мазка (подгруппа 2) субъективные и объективные признаки патологии влагалища встречаются достоверно чаще, чем у женщин с нормоценозом по результатам микроскопии.
У пациенток с нормальной микроскопической картиной (подгруппа 1) наличие субъективных и объективных признаков патологии влагалища может указывать на повышенное количество Ureaplasma spp. и Candida spp. в составе вагинальной микрофлоры (рисунок 6).
3% 100% 10% 4% 8% 36% 80% 33% 60% 18% 60% 40% 24% 59% 20% 22% 22% 0% (n=230) (n=113) (n=341) Рисунок 6. Характеристика микробиоценоза влагалища у женщин группы «патология» с нормальным и промежуточным типом мазка по сравнению с группой «норма» Выявление Mycoplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл коррелировало со понижением доли лактобацилл в составе микробиоценоза влагалища, напротив Ureaplasma spp. и Candida spp. в количестве более 104 ГЭ/мл чаще обнаруживали в составе микробиоценозов с сохраненной долей нормофлоры.
Таким образом, промежуточный тип мазка, а также нормальный тип мазка при наличии клинических проявлений патологии влагалища требуют углубленного исследования микробиоценоза влагалища (рисунок 7).
Рисунок 7. Частота выявления нормофлоры и условно-патогенных микро организмов в диагностически значимых количествах в составе микробио ценоза влагалища у пациенток с неспецифическим вагинитом, вагинозом и в группе «нормы» В группе женщин с установленным вагинозом (подгруппа 3) при диагно стике методом ПЦР-РВ обнаружили повышенные значения общей бактериальной массы, снижение количества лактобацилл по сравнению с клинически здоровыми женщинами (Рисунок 7). У женщин 3-й подгруппы варианты микробиоценоза с сохраненной нормофлорой отсутствовали. В структуре выраженных дисбиозов у этой группе пациенток преобладали процессы, вызванные облигатно-анаэробными микроорганизмами, статистически достоверно чаще выявляли представителей родов Atopobium, Megasphaera и Clostridium spp. по сравнению с группой сравнения и пациентками с вагинитом. Число основных участников микробиоценоза было выше у пациенток с БВ — выявляли до 9 групп микроорганизмов одновременно. Также было статистически значимо выше количество Ureaplasma spp., чем у клинически здоровых женщин, в то время как количество Candida spp. не различалось между группами.
У пациенток с НВ (подгруппа 4) при оценке микробиоценоза влагалища ме тодом ПЦР-РВ в большинстве случаев выявили сохраненную нормофлору при повышенном относительно группы сравнения количестве ОБМ. У 23% женщин с НВ клинические проявления патологии влагалища были обусловлены не дис биотическими нарушениями, а другими причинами, как инфекционного, так и не инфекционного характера. Отмечено более высокое содержание дрожжеподобных грибов по сравнению с другими группами обследованных женщин. Выявленные дисбиотические нарушения были чаще обусловлены присутствием факультатив ных анаэробов, а количество участников дисбиоза было меньше, чем у пациенток с вагинозом.
Исследование вагинальной микробиоты методом ПЦР-РВ у женщин с микро скопической картиной, характерной для КВ, выявило изменения в микробиоценозе у 56 (77,8%) пациенток этой группы. У 44 (61,1%) женщин изменения описывали как условный нормоценоз, у 9 (12,5%) как умеренный дисбиоз. У 3 (4,2%) выявили вы раженный дисбиоз вагинальной микрофлоры. Таким образом, у 60 (83,3%) женщин с КВ выявили варианты микробиоценоза влагалища с сохраненной нормофлорой. У 16 (22,2%) женшин состояние микробиоценоза влагалища оценивали как абсолют ный нормоценоз, тем не менее Candida spp. присутствовала у всех этих женщин, но в количестве менее 104 ГЭ/мл. Условный нормоценоз (выявлен у 61,1%) в большинстве случаев был обусловлен присутствием в составе вагинальной микрофлоры Candida spp.
или Candida spp./Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл. Однако у 14% женщин количество Candida spp. было менее 104 ГЭ/мл, а заключение «условный нормоценоз» было установлено на основании присутствия Ureaplasma spp. в количестве более ГЭ/мл. В целом у 36% женщин с диагностированным микроскопически КВ абсолютное количество Candida spp. в вагинальном отделяемом было менее 104 ГЭ/мл.
Роль условно-патогенных микоплазм и грибов рода Candida в формировании различных вариантов микробиоценоза у женщин с патологией влагалища В обследованной группе женщин методом ПЦР-РВ Candida spp. в количе стве более 104 ГЭ/мл выявили у 152 (20,76%) из 732 женщин. При исследовании количественного и качественного состава микрофлоры у 103 (67,76%) состояние микробиоценоза соответствовало критериям условного нормоценоза, у 15 (9,86%) — выраженного анаэробного дисбиоза, у 3 (2,0%) — выраженного аэробного дисбиоза у 6 (3,94%) — выраженного аэробно-анаэробного дисбиоза. Умеренные дисбиотические нарушения диагностировали у 25 (16,44%) женщин.
При этом у 111 женщин в мазке не обнаруживали дрожжеподобных грибов.
При микроскопии у 4 (3,6%) пациенток был выявлен вариант, соответствующий дисбиозу (с присутствием «ключевых» клеток), у 29 (26,12%) — нормоценозу, у 78 (76,57%) — промежуточному типу мазка. Лейкоциты в количестве до 5 в поле зрения выявили у 85 (78,89%) женщин, от 5 до 10 в поле зрения — у 12 (10,81%), свыше 10 в поле зрения — у 14 (1%) женщин.
Жалобы предъявляли 121 из 152 (79,6%) женщин, причем жалобы, характер ные для КВ (зуд, жжение, выделения), отмечали только 30 (19,7%) пациенток. При осмотре гинекологом у 7 (4,6%) женщин фиксировали творожистые выделения, у 86 (56,57%) отмечали гиперемию слизистой влагалища. Таким образом, клиниче ская картина и данные микроскопических исследований не позволяли заподозрить кандидоз у большинства пациенток данной группы.
В то же время у 72 женщин с патологией влагалища в мазках выявляли дрож жеподобные грибы. По результатам ПЦР-РВ только у 41 (56,9%) из них Candida spp. выявлена в диагностически значимом количестве. У 31 женщины (43,1%) Candida spp. была выявлена в количестве менее 104 ГЭ/мл, в том числе у 12 (16,7%) в количестве от 102 до 103 ГЭ/мл, у 19 (26,4%) в количестве от 103,1 до 103,9 ГЭ/мл.
Таким образом, клинические и микроскопические данные не отражают количества Candida spp. в составе вагинального микробиоценоза.
Анализ частоты встречаемости Candida spp., Ureaplasma spp. и Mycoplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл у пациенток с различной долей нормофлоры в составе микробиоценоза выявил ряд закономерностей. Candida spp. и Ureaplasma spp. достоверно чаще выявляли при условии наличия сохраненной нормофлоры (более 80% от суммы выделенных микроорганизмов), что подтверждает представ ления о способности этих микроорганизмов сосуществовать с лактобациллами в кислой среде влагалища. Mycoplasma spp. в 80% случаев присутствовала при сниженной доле нормофлоры. Это связано с тем, что оптимальная рН для роста Mycoplasma spp. составляет 5-6. Остается открытым вопрос относительно того, что первично: развитие дисбиоза влагалища и создание оптимальных условий для существования Mycoplasma spp. или интенсивное размножение последних, способствующее изменению состава вагинальной микрофлоры?
Роль различных видов лактобацилл в формировании микробиоценоза влага лища у женщин с нормоценозом и пограничными состояниями Для оценки роли различных видов Lactobacillus spp. в формировании микро биоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста с сохраненной нормоф лорой были отобраны 114 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 28,7) лет. Состояние микробиоценоза влагалища по результатам ПЦР-РВ у данной группы пациенток соответствовало критериям абсолютного или условного нор моценоза (доля нормофлоры более 80% от ОБМ).
При типировании Lactobacillus spp. одновременно определяли и количество и вид лактобацилл. У большинства женщин выявляли один вид лактобактерий. В случае, если определяли два и более вида лактобацилл, доминирующим считали тот, доля которого была более 50% от общего количества выделенной лактофлоры.
Чаще всего у обследованных женщин в качестве доминирующего вида выявляли L.iners и L.crispatus (50 (43,85%) и 44 (38,59%) из 114 соответственно). При этом у женщин с абсолютным нормоценозом чаще основным видом лактобацилл яв лялась L.crispatus, а у женщин с условным нормоценозом, напротив, преобладала L.iners. Учитывая, что L.iners обладает более слабым защитным потенциалом, это наблюдение представляет интерес для дальнейшего анализа на большем числе наблюдений.
46,58% 46,34% 50,00% 45,00% 35,62% 40,00% 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 12,20% 15,00% 9,59% 6,85% 10,00% 2,44% 1,37% 0,00% 5,00% 0,00% Рисунок 8. Частота выявления различных видов лактобацилл в качестве доминирующего микроорганизма у женщин репродуктивного возраста с нормоценозом (N=114) L.gasseri присутствовала в составе вагинального микробиоценоза у 78 из пациенток (68,42%), в том числе у 64,38% с абсолютным и 75,61% с условным нор моценозом, однако в качестве доминирующего вида она обнаружена у только у (10,52%) женщин (рисунок 8).
L.jensenii обнаружили у 58 (50,87%) женщин, в том числе у 52,05% с абсо лютным и 48,78% с условным нормоценозом. В качестве доминирующего вида ее обнаружили в 7 (6,14%) случаев. Реже всего выявляли L.johnsonii — у 32 (28,07%) из 114 обследованных женщин, в том числе у 27,4% женщин с абсолютным и у 29,72% с условным нормоценозом, кроме того не отмечено ни единого случая доминирования этого вида (рисунок 8).
L.vaginalis составляла большинство лактобацилл, обитающих во влагалище, только у одной женщины (0,9%), причем это была пациентка с абсолютным нормо ценозом. Таким образом, вклад L.vaginalis, L.jensenii и L.johnsonii в формирование вагинальной нормофлоры следует признать несущественным.
При выявлении двух и более видов лактобацилл одновременно в значительных количествах наиболее частыми вариантами сочетаний были ассоциации L.crispatus/ L.iners и L.iners /L.jensenii.
Установлено, что наличие объективных признаков патологии влагалища и патологического варианта мазка при нормоценозе коррелируют с выявлением L.gasseri в качестве доминирующего вида. Обнаружение нормальной микроско пической картины у пациенток с сохранной лактофлорой с высокой долей вероят ности указывает на преобладание L.crispatus в микробиоценозе влагалища.
Для выбора терапии и предсказания эффективности лечения у женщин с сохранной нормофлорой и длительной персистенцией уреаплазм во влагалище, необходимо проводить количественную оценку и типирование лактобацилл.
Таким образом, применение ПЦР-РВ для оценки структуры, качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза у женщин репродуктивного возраста с патологией влагалища в 80,7% случаев позволило установить этиологи чески значимые микробные агенты. Показано, что структура и состав микробио ценоза влагалища значительно различаются у женщин с различными вариантами инфекционно-воспалительной патологии влагалища. Установлено, что выявление микроскопической картины мазка, характерной для дисбиоза (БВ), коррелирует с анаэробным дисбиозом по данным ПЦР-РВ. Проводить углубленное исследование биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ рекомендуется этим пациенткам только при неудачных попытках терапии БВ с применением стандартных схем лечения, рекомендующих приоритетное назначение метронидазола. Следует иметь в виду, что обнаружение A.vaginae, устойчивого к данному препарату, в диагностически значимом количестве у пациенток с БВ требует коррекции лекарственной терапии.
Выявление микроскопической картины, характерной для вагинита (как не специфического, так и ассоциированного с Candida spp.), и промежуточного типа мазка требует углубленного исследования микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ вне зависимости от наличия или отсутствия клинических признаков патологии влагалища с целью уточнения этиологически значимого микробного фактора. Выявление нормальной микроскопической картины у пациенток, име ющих субъективные или объективные признаки патологии влагалища, с учетом полученных данных о роли Ureaplasma spp. и Candida spp. в возникновении забо леваний у этой категории больных также требует дополнительной оценки микро биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ.
У пациенток с клиническими признаками патологии влагалища и нормоце нозом по результатам ПЦР-РВ целесообразно проводить генотипирование лакто бацилл, так как доминирующим видом может быть L.gasseri, защитные свойства которой оценивают как более слабые, по сравнению с L. crispatus. Однако требу ются дальнейшие исследования по установлению роли разных видов Lactobacillus spp. в патологии влагалища.
Особенности микробиоценоза влагалища у беременных женщин С целью выявления особенностей динамики биоценоза влагалища в течение беременности обследовали 119 беременных женщин в возрасте от 20 до 43 лет (средний возраст 29,82 года), состоявших на диспансерном учете по беременно сти в ООО Медико-фармацевтический центр «Гармония» в период с апреля по декабрь 2009 года. Микробиоценоз влагалища методом ПЦР-РВ исследовали у каждой женщины трехкратно, один раз в триместр. Всего было изучено вагинальных образцов.
В случае выявления дисбиоза или условного нормоценоза, ассоциирован ного с Candida spp. или Ureaplasma spp., беременным проводили коррекцию микробиоценоза влагалища. При выявлении абсолютного нормоценоза терапию не проводили.
Исследование вагинальной микрофлоры методом ПЦР-РВ у беременных в первом триместре показало, что у большинства женщин (81,5%) присутствовали варианты биоценоза с высоким (более 80%) содержанием лактофлоры в составе микробиоценоза влагалища. В то же время у 18,5% женщин обнаружили дисбио тические нарушения различной степени выраженности.
Оценка микробиоценоза влагалища у этих женщин во втором и третьем триместрах позволила выявить закономерности, характерные для изменения вла галищной микрофлоры у беременных в зависимости от ее исходного состояния (рисунок 9). При анализе динамики вагинальной биоты у каждой конкретной женщины учитывали тип микробиоценоза в первом, втором, третьем триместрах, присутствие условно-патогенных микроорганизмов в надпороговых количествах, изменение доли нормофлоры в составе биоценоза в течение беременности.
10% 7% 5% 100% 8% 10% 90% 8% 80% 27% 27% 70% 34% 60% 50% 40% 57% 55% 30% 47% 20% 10% 0% I II III Рисунок 9. Изменения микробиоценоза влагалища во время беременности (N=119) Абсолютный нормоценоз в первом триместре выявили у 56 женщин. Обсле дование их во втором и третьем триместре показало, что у 48 (85,71%) из них нормоценоз сохранился до конца беременности. Колебания доли нормофлоры в составе микробиоценоза у женщин этой группы были незначительными (до 10%). Таким образом, наличие абсолютного нормоценоза в первом триместре является хорошим прогностическим признаком, указывающим на высокую вероятность сохранения этого состояния на протяжении всей беременности. Изменения доли нормофлоры в составе микробиоценоза у женщин с диагностированным в первом триместре условным нормоценозом также находились в переделах 10%. При назначении антимикотической и антибактериальной терапии пациенткам этой группы положительной динамики добились в 39,13% случаев. Следовательно, варианты микробиоценоза с высоким со держанием (более 80%) лактофлоры, а именно абсолютный и условный нормоценоз, представляют собой достаточно устойчивую систему, на которую внешние воздействия, в том числе лекарственная терапия, не оказывают выраженного влияния.
Динамика микробиоценоза влагалища при дисбиотических нарушениях была разнонаправленной. Наибольшие положительные сдвиги наблюдали в группах женщин, имевших в первом триместре беременности умеренный и выраженный дисбиоз. Состояние условного нормоценоза, обусловленного одновременным при сутствием Candida spp. и Ureaplasma spp. в надпороговых количествах, оставалось стабильным на протяжении беременности.
Состояние микробиоценоза влагалища у ВИЧ-инфицированных женщин репродуктивного возраста В исследование были включены 90 небеременных и 106 беременных жен щин в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 27,4 года), состоявшие на учете в ГБУЗ СО «Свердловский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (г.Екатеринбург) и посещавшие врача-гинеко лога в период с декабря 2009 по март 2010 года с целью периодического (один 40% 36% % 35% 35% 1% 28% % 30% 25% 25% 20% 16% 16% 15% 12% 10% 5% 0% + (n=196) (n= 96) Рисунок 10. Структура микробиоценоза влагалища у женщин репро дуктивного возраста в зависимости от наличия или отсутствия ВИЧ инфекции раз в полгода для состоящих на учете в центре) профилактического осмотра. В качестве группы сравнения были отобраны 90 небеременных и 106 беременных ВИЧ-серонегативных женщин по принципу случай-контроль. Подбор группы сравнения производили по следующим параметрам: возраст, отсутствие беремен ности или соответствующий срок гестации на момент обследования, характер жалоб и клинических проявлений, состояние микрофлоры влагалища по данным микроскопического исследования.
Качественный и количественный состав микробиоценоза влагалища у ВИЧ инфицированных женщин репродуктивного возраста имеет значительные отличия от такового у ВИЧ-серонегативных женщин (рисунок 10). По результатам ПЦР РВ только у 15,8% ВИЧ-инфицированных пациенток состояние микробиоценоза влагалища соответствовало критериям абсолютного нормоценоза. Более чем у по ловины женщин обнаружили дисбиотические нарушения микрофлоры влагалища, причем выраженный дисбиоз диагностировали у 36,2% женщин.
Отмечена значительная роль представителей семейства Enterobacteriaceae spp. и Atopobium vaginae в формировании дисбиотических нарушений у ВИЧ инфицированных женщин.
Mycoplasma spp. и Candida spp. в количестве более 104 ГЭ/мл присутствовали у каждой третьей ВИЧ-инфицированной пациентки, такая частота встречаемости молликутов и дрожжеподобных грибов в диагностически значимых количествах может создавать предпосылки для развития воспалительных заболеваний генита лий, обусловленных этими оппортунистическими инфекциями.
Наличие ВИЧ-инфекции является фактором, значительно ухудшающим со стояние микробиоценоза влагалища у беременных. У половины обследованных женщин выявили дисбиоз вагинальной микрофлоры, абсолютный нормоценоз диагностировали только у каждой пятой ВИЧ-инфицированной беременной (ри сунок 11).
100% 90% 24% 80% 70% 76% 60% 50% 40% 56% 30% 20% 44% 10% 0% (n=85) + (n=21) Рисунок 11. Частота выявления дисбиоза влагалища по ре зультатам ПЦР-РВ у ВИЧ-инфицированных беременных в зависимости от получения ВААРТ На фоне приема ВААРТ отмечено достоверное снижение доли дисбиозов влагалища у ВИЧ-инфицированных беременных и уменьшение количества гени тальных микоплазм в составе вагинального микробиоценоза.
Полиморфизм генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и особенности микробиоценоза влагалища Были исследованы образцы ДНК от 85 женщин репродуктивного возраста (18– 45 лет, средний возраст 29,3 года), состояние микробиоценоза влагалища которых соответствовало критериям абсолютного или условного нормоценоза по данным ПЦР-РВ. У обследованных женщин обнаружена высокая частота встречаемости полиморфных аллелей в генах цитокинов IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18 и TNF.
Реже всего выявляли полиморфизмы в генах IL-4R(1902 AG) и TNF(-308 GA):
они присутствовали у 18% пациенток. Чаще других выявляли полиморфизмы в генах IL-2(-330 GT), IL-4(-33 CT), IL-10(-1082 GA), IL-18(-607 CA): две трети обследованных женщин были носителями полиморфных аллелей данных генов. Встречаемость шести полиморфизмов статистически значимо различалась у женщин в зависимости от наличия или отсутствия Ureaplasma spp. в вагинальной микробиоте. 4 полиморфизма (IL-10: —592 AC, IL-4: —33 CT, IL-1B:3953 CT, IL-1R1: Pst11970) чаще присутствовали у женщин с абсолютным нормоценозом, а два полиморфизма (IL-1A: —889 CT и IL-1RN: 11100 msp1) — у женщин с условным нормоценозом, обусловленным Ureaplasma spp. Примечательно, что три полиморфизма определяли в гене IL-1, обладающего провоспалительными свойствами, а три — в генах IL-1RN, IL-4 и IL-10, которые относятся к противо воспалительным цитокинам. По данным литературы носительство данных поли морфизмов коррелирует с повышенной экспрессией соответствующих цитокинов и, как следствие, усилением провоспалительного или противовоспалительного потенциала иммунной системы (Asensi V., 2003;
Lopez-Maderuelo D, 2003;
Rivera Chavez F.A., 2003;
Rieth H., 2004;
Causi S., 2007).
С учетом полученных данных был предложен комплексный подход (по двум (IL-1B и IL-1RN) и по шести генам (IL-10, IL-4, IL-1BT, IL-1R1, IL-1A и IL-1RN)) для оценки индивидуального генетического профиля с учетом разнонаправлен ности эффектов определяемых цитокинов и потенциального взаимодействия всех определяемых аллельных вариантов генов. Заключение о наличии «провос палительного» генотипа ставили в случае преобладания полиморфизмов в генах провоспалительных цитокинов (IL-1A, IL-1B и IL-1R1), «противовоспалительного генотипа» — в случае преобладания полиморфизмов в генах противовоспали тельных цитокинов (IL-1RN, IL-4, IL-10). Сбалансированным генотипом считали вариант, в котором полиморфизмы перечисленных генов либо отсутствовали со всем, либо количество полиморфизмов в генах про- и противовоспалительных цитокинов было одинаковым.
Установлено, что наличие «провоспалительного генотипа» коррелирует с отсутствием Ureaplasma spp. в вагинальном микробиоценозе, а «противовоспа лительный генотип» достоверно чаще ассоциируется с присутствием уреаплазм во влагалище при сохранной нормофлоре.
У женщин, имеющих полиморфизмы в генах провоспалительных цитокинов («провоспалительный» генотип), более чем в 80% случаев состояние влагалищной микрофлоры характеризуется как абсолютный нормоценоз, в то время как в группе пациенток с «противовоспалительным» генотипом достоверно чаще во влагалищ ном микробиоценозе присутствует Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл.
Отсутствие субъективных признаков патологии влагалища у пациенток при наличии Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл достоверно чаще со четалось с «противовоспалительным» генотипом организма-хозяина, что может свидетельствовать в пользу относительной толерантности местного иммунитета к персистентной инфекции (рисунок 12).
100% 8,3% 90% 46,7% 80% 70% 66,7% 60% 50% 33,3% 40% 30% 20% 25,0% 20,0% 10% 0% Рисунок 12. Структура индивидуальных генотипов у пациенток с условным нормоценозом, обусловленным Ureaplasma spp., в зависимости от наличия субъективных признаков патологии влагалища (n=38) В группе пациенток, состояние микробиоценоза влагалища которых соот ветствовало критериям условного нормоценоза (доля лактобацилл более 80%, Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл), субъективные признаки патологии влагалища достоверно чаще имели место у носителей «сбалансированного» ге нотипа, когда количество полиморфизмов в генах про- и противовоспалительных цитокинов было одинаковым.
Установлено, что видовой состав лактобацилл коррелирует с определенным индивидуальным генетическим профилем. Выявлена связь между присутстви ем L.crispatus во влагалище и носительством генотипа АА гена IL-10(-592АС).
Кроме того, наличие «провоспалительного» генотипа коррелирует с присутствием L.crispatus в качестве доминирующего вида лактофлоры во влагалище, а «противо воспалительный» и сбалансированный генотипы достоверно чаще ассоциируются с L.iners в качестве доминирующего вида лактобацилл.
Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что видовое разнообразие вагинальных лактобацилл связано с генетически детерминирован ными иммунологическими факторами. Индивидуальный генетический профиль определяет уровень продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в вагинальном отделяемом, что может создавать благоприятные условия для преобладания тех или иных видов лактобацилл. С учетом сведений о наличие корреляции между носительством «провоспалительного» генотипа и наличием абсолютного нормоценоза следует предполагать, что более устойчивый вариант нормофлоры формируется у женщин в условиях определенного провоспали тельного потенциала вагинального отделяемого и наличия L.crispatus в качестве доминирующего вида лактобацилл.
ВЫВОДЫ 1. Нормальный микробиоценоз влагалища у женщин репродуктивного возраста характеризуется присутствием лактофлоры в количестве более 80% от общей бактериальной массы и доминированием среди лактобацилл определенного вида — Lactobacillus crispatus.
2. Состояние абсолютного и условного нормоценоза влагалища во время беременности представляет собой устойчивую систему, на которую экзогенные факторы, в том числе и лекарственная терапия, не оказывают существенного влияния.
3. У большинства пациенток с клиническими признаками инфекци онно-воспалительной патологии влагалища различные изменения вагинальной микрофлоры встречаются независимо от варианта микроскопической картины, при этом наиболее выраженные нарушения по данным ПЦР-РВ достоверно чаще встречаются у пациенток, у которых микроскопическая картина вагинального отделяемого соответствует критериям промежуточного мазка и мазка, характерного для дисбиоза.
4. У пациенток с бактериальным вагинозом дисбиоз вагинальной микрофлоры характеризуется доминированием представителей облигатно-анаэробной микрофлоры и высокой частотой встречаемости Atopobium vaginae и генитальных микоплазм в диагностически значимых количествах.
5. Наличие клинических признаков инфекционно-воспалительной патологии влагалища у пациенток с нормальной микроскопической картиной вагинального отделяемого в большинстве случаев указывает на повышение количества Ureaplasma spp. и Candida spp. в составе вагинальной микрофлоры при сохраненной нормофлоре.
6. Микробиоценоз влагалища ВИЧ-инфицированных женщин характери зуется высокой частотой дисбиотических нарушений, носительством Mycoplasma spp. и Candida spp. в диагностически значимых количе ствах при отсутствии клинических признаков патологии влагалища.
У ВИЧ-инфицированных женщин, получающих антиретровирусную терапию, отмечается увеличение доли нормофлоры и снижением ко личества генитальных микоплазм в составе вагинальной микробиоты.
7. Носительство провоспалительного генотипа у женщин коррелирует с доминированием Lactobacillus crispatus и отсутствием условно патогенных микоплазм в составе вагинального микробиоценоза, в то время как носительство противовоспалительного генотипа коррелирует с доминированием Lactobacillus iners и присутствием Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл в составе вагинальной микрофлоры.
8. Комплексная оценка вагинального микробиоценоза с помощью метода ПЦР-РВ позволяет существенно улучшить качество диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста, выработать индивидуальный подход при назначении ле карственной терапии, максимально способствующий сохранению репродуктивного здоровья пациентки.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Углубленное исследование микробиоценоза влагалища с помощью ПЦР-РВ (Фемофлор) может быть рекомендовано пациенткам репродуктив ного возраста с клиническими признаками инфекционно-воспалительной патологии влагалища при отсутствии облигатных патогенов.
2. Применение ПЦР-РВ для оценки микробиоценоза влагалища оправ дано при проведении контроля излеченности инфекционно-воспалитель ных заболеваний влагалища, ассоциированных как с условно-патогенной микрофлорой, так и с облигатными патогенами, так как позволяет оценить эффективность проведенной терапии и степень восстановления нормофлоры в составе вагинальной микробиоты.
3. Оценку микробиоценоза влагалища с помощью метода ПЦР-РВ целесообразно проводить всем женщинам на этапе предгравидарной подго товки. Учитывая, что возможности медикаментозной терапии вагинальных инфекций во время беременности значительно ограничены, рекомендуется проводить коррекцию дисбиотических и пограничных состояний микро биоценоза влагалища на преконцепционном этапе.
4. Для профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища, ассоциированных с оппортунистической бактериальной микро флорой, у ВИЧ-инфицированных женщин репродуктивногог возраста реко мендуется проводить оценку микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ.
5. В случае, если у пациентки присутствуют клинические признаки инфекционно-воспалительной патологии влагалища, а по данным ПЦР-РВ состояние микробиоценоза влагалища соответствует критериям абсолют ного нормоценоза, рекомендуется проводить генотипирование вагинальных лактобацилл методом ПЦР-РВ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Анисимов, К.Ю. Частота обнаружения возбудителей инфекций, пере дающихся половым путем, у беременных с ВИЧ-инфекцией и родивших ся у них детей. / К.Ю. Анисимов, Е.С. Ворошилина, Ж.Н. Отинова, Н.В.
Шептуха// Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы».
— Санкт-Петербург. — 2002.— Т.6.— №1.— С.86.
2. Ворошилина, Е.С. ПЦР-диагностика возбудителей внутриутробных инфекций у ВИЧ-инфицированных беременных. / Е.С. Ворошилина, А.В. Горленко // Сборник материалов научно-практической конференции «Генодиагностика и терапия инфекций, передаваемых половым путем».
— Екатеринбург.— 2003.— С.53–54.
3. Ворошилина, Е.С. Клинико-иммунологические особенности течения беременности при ВИЧ-инфекции. /Е.С. Ворошилина, А.В. Горленко// Материалы научно-практического форума «Мать и дитя». — Москва.— 2005. — С. 154.
4. Ворошилина, Е.С. Генитальные микоплазмы: критерии назначения антибиотиков. / Е.С. Ворошилина, Е.Э. Плотко, В.Н. Хаютин// Материалы научно-практического форума «Мать и дитя». — Москва.— 2006. — С.
49.
5. Ворошилина, Е.С. Лабораторные критерии назначения антибиотиков при лечении урогенитального микоплазмоза. / Е.С. Ворошилина, Е.Э.
Плотко, В.Н. Хаютин //Уральский медицинский журнал. — 2006. — №2.
— С. 63–65.
6. Ворошилина, Е.С. Количественная оценка биоценоза влагалища у беременных женщин методом ПЦР в реальном времени. / Е.С. Вороши лина, А.А. Кротова, Л.В. Хаютин // «Акушерство, гинекология и перина талогия» Материалы 4 съезда акушеров-гинекологов России. —Москва.
— 2008. —С. 45.
7. Ворошилина, Е.С. Опыт применения тест-системы Фемофлор для оценки вагинальной микробиоты у беременных женщин. / Е.С. Воро шилина, Л.В. Хаютин, А.А. Кротова // Материалы научно-практической конференции «Новый способ лабораторной диагностики урогенитальных инфекций. Проблемы и пути решения». —Москва. — 2008. —С.78.
8. Voroshilina, E.S. Correlation between CD4 rate and prevalence of CMV infection in HIV-positive pregnant women. / E.S. Voroshilina// Materials of ХVII International AIDs conference. —Mexico city. — 2008. — Abstract number: CDB0085.
9. Voroshilina, E.S. Prevalence of chlamydia, mycoplasma, CMV and HSV infection in HIV-positive pregnant women in Ekaterinburg, Russia. / E.S.
Voroshilina// Materials of ХVII International AIDs conference. — Mexico city. — 2008. —
Abstract
number: CDC0104.
10. Ворошилина, Е.С. Эффективность выявления и лечения генитальных микоплазм на этапе предгравидарной подготовки. / Е.С. Ворошилина, Е.Э. Плотко, В.Н. Хаютин// Сборник материалов конференции «Дерма товенерология — итоги первого этапа реформирования и перспективы развития». —Екатеринбург, —2008. —С. 93.
11. Ворошилина, Е.С. Частота обнаружени. A.vaginae у беременных жен щин с бактериальным вагинозом. / Е.С. Ворошилина, Е.Э. Плотко, Л.В.
Хаютин, А.А. Кротова // Материалы «Всероссийской научно-практиче ской конференции «Амбулаторно-поликлиническая практика — плат форма женского здоровья». —Москва. —2009. — С. 256.
12. Ворошилина, Е.С. Характеристика урогенитального биоценоза у женщин в первом триместре беременности с помощью ПЦР в реальном времени. / Е.С. Ворошилина, А.А. Кротова, Е.Э. Плотко, Л.В. Хаютин// Вестник последипломного медицинского образования.
—2009. —№1 — С. 48–49.
13. Плотко, Е.Э. Репродуктивное поведение женщины и состояние биоценоза влагалища./ Е.Э. Плотко, Е.С. Ворошилина, Л.В. Хаютин, Е.И. Абакумова, Л.В. Тумбинская, А.Е. Донников //Уральский медицинский журнал. — 2009.— № 10(54). — С. 150–154.
14. Ворошилина, Е.С. Применение молекулярных методов диагностики для профилактики инфекционной патологии у беременных женщин.
/Е.С. Ворошилина, Е.Э. Плотко, Л.В. Хаютин// Вестник уральской медицинской академической науки. — 2009.— № 4 (27). —. С. 114–116.
15. Ворошилина, Е.С. Качественный и количественный состав микро биоценоза влагалища беременных женщин./ Е.С. Ворошилина, А.Е.
Донников, Л.В. Тумбинская, С.М. Муллабаева, М.К. Меджидова, Н.М.
Касабулатов// Специальный выпуск «Проблемы репродукции», матери алы 4 международного конгресса по репродуктивной медицине. — 2010.
—С. 67–68.
16. Ворошилина, Е.С. ВИЧ-инфекция, репродуктивный выбор и состояние биоценоза влагалища у беременных в I триместре./ Е.С.
Ворошилина, С.А. Ежова, Е.Э. Плотко, Л.В. Тумбинская, А.Е. Донни ков, Л.В. Хаютин // Уральский медицинский журнал. — 2010. — № 5(70). — С. 160–166.
17. Ворошилина, Е.С. Биоценоз влагалища с точки зрения количественной ПЦР: состояние во время беременности./ Е.С.
Ворошилина, Л.В. Тумбинская, А.Е. Донников, Е.Э. Плотко, Л.В.
Хаютин // Уральский медицинский журнал. —2010. — №3(68). — С.
103–105.